Electroforesis o cataforesisElectroforesis o cataforesis

• Es el movimiento de moléculas o partículas Es el movimiento de moléculas o partículas cargadas en un campo eléctrico cargadas en un campo eléctrico

• Se puede realizar con propósitos analíticos de Se puede realizar con propósitos analíticos de identificación o para caracterización física de identificación o para caracterización física de los componentes de una muestra o para su los componentes de una muestra o para su separación preparativa.separación preparativa.

• Se usa para analizar y separa moléculas (ej. Se usa para analizar y separa moléculas (ej. proteínas) o para depositar recubrimientos, proteínas) o para depositar recubrimientos, como en los elementos usados en los tubos de como en los elementos usados en los tubos de electrones.electrones.

Electroforesis o cataforesisElectroforesis o cataforesis

• La migración electroforética de una molécula La migración electroforética de una molécula puede realizarse dentro de cualquier medio puede realizarse dentro de cualquier medio pero generalmente es una matriz.pero generalmente es una matriz.

• Si el fluido es el que se pone en movimiento, Si el fluido es el que se pone en movimiento, por ejemplo a través de un diafragma fijo, se le por ejemplo a través de un diafragma fijo, se le llama electroósmosis. llama electroósmosis.

Movimiento de moléculas en la Movimiento de moléculas en la electroforesiselectroforesis

• Las moléculas siempre se mueven hacia el Las moléculas siempre se mueven hacia el electrodo de polaridad opuesta a la carga electrodo de polaridad opuesta a la carga neta de la molécula (los cationes se mueven neta de la molécula (los cationes se mueven hacia el cátodo y los aniones hacia el hacia el cátodo y los aniones hacia el ánodo).ánodo).

• El medio necesita estar amortiguado al pH El medio necesita estar amortiguado al pH que produce la dirección y taza apropiada que produce la dirección y taza apropiada de migración.de migración.

ElectroforesisElectroforesis

cátodo

ánodo

–

– –

–

+

–

–+ +

(–)

(+)

Movilidad y pIMovilidad y pI

• Las movilidades de las proteínas se Las movilidades de las proteínas se incrementan proporcionalmente al incrementan proporcionalmente al alejamiento de sus puntos isoeléctricos ya alejamiento de sus puntos isoeléctricos ya que se incremente su carga neta.que se incremente su carga neta.

• Los ácidos nucleicos y las proteínas en Los ácidos nucleicos y las proteínas en presencia de SDS presentan movilidades presencia de SDS presentan movilidades más altas en un rango de pH arriba de la más altas en un rango de pH arriba de la neutralidad.neutralidad.

Factores que afectan la movilidad Factores que afectan la movilidad electroforéticaelectroforética

• Composición del solventeComposición del solvente– Presencia de detergentesPresencia de detergentes

• TemperaturaTemperatura• Fuerza iónicaFuerza iónica

– Ejemplos: la estabilidad de los ácidos nucleicos Ejemplos: la estabilidad de los ácidos nucleicos depende de los iones Nadepende de los iones Na++

– Las proteínas se agregar a bajas fuerzas iónicasLas proteínas se agregar a bajas fuerzas iónicas

– Altas fuerzas iónicas pueden sobrepasar la disipación Altas fuerzas iónicas pueden sobrepasar la disipación de calor de Joule del aparato de electroforesisde calor de Joule del aparato de electroforesis

InvenciónInvención

• El primer aparato sofisticado de El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937en 1937

• Desarrolló la “moving boundary”, que se Desarrolló la “moving boundary”, que se convertiría en la electroforesis zonal y la convertiría en la electroforesis zonal y la utilizó para separar proteínas del suero. utilizó para separar proteínas del suero.

Arne Wilhelm Kaurin Tiselius Arne Wilhelm Kaurin Tiselius (1902-71)(1902-71)

• Tesis (1930): The moving-boundary Tesis (1930): The moving-boundary method of studying the method of studying the electrophoresis of proteins" electrophoresis of proteins" (publicado en Nova Acta Regiae (publicado en Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis, Societatis Scientiarum Upsaliensis, Ser. IV, Ser. IV, 77, No. 4), No. 4)

• (1937) A new apparatus for (1937) A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal electrophoretic analysis of colloidal mixtures. Transactions of the mixtures. Transactions of the Faraday Society, Faraday Society, 3333 524. 524.

Tubo de TiseliusTubo de Tiselius

Fronteras iniciales

Ánodo

Amortiguador

Límite o frontera descendente

Moléculas de proteína

Límite o frontera ascendente

Cátodo

+ –

DesarrolloDesarrollo

• La electroforesis se desarrollo La electroforesis se desarrollo completamente de los años 40s a los 50s.completamente de los años 40s a los 50s.

• Se utilizó para separar moléculas que van Se utilizó para separar moléculas que van desde las proteínas más grandes, desde las proteínas más grandes, aminoácidos y hasta iones inorgánicos.aminoácidos y hasta iones inorgánicos.

Aplicaciones Aplicaciones

• BioquímicaBioquímica

• Química clínica, forense, de alimentos Química clínica, forense, de alimentos

• Toxicología Toxicología

• Farmacia, farmacología Farmacia, farmacología

• Enzimología, inmunología Enzimología, inmunología

• Microbiología, Microbiología,

• Botánica, citología, Botánica, citología,

• Biología Molecular, etc. Biología Molecular, etc.

Electroforesis zonalElectroforesis zonal

• Empleando geles de sílice o de acetato de Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta pueden determinar diferencias de carga neta entre proteínas (carga total/masa). entre proteínas (carga total/masa).

• Este método se denomina electroforesis Este método se denomina electroforesis zonal. zonal.

• Además de la electroforesis zonal, se desarrollaron Además de la electroforesis zonal, se desarrollaron dos otros tipos:dos otros tipos:– Isoelectoenfoque e isotacoforesis. Isoelectoenfoque e isotacoforesis.

• Estos tres métodos se basan en propiedades físicas Estos tres métodos se basan en propiedades físicas diferentes.diferentes.

• Es posible hacer tres análisis separados sobre una Es posible hacer tres análisis separados sobre una misma muestra o los métodos se pueden combinar.misma muestra o los métodos se pueden combinar.

Diversificación de soportesDiversificación de soportes

• Los soportes o matrices sobre los que se ha Los soportes o matrices sobre los que se ha realizado la electroforesis se ha diversificado realizado la electroforesis se ha diversificado durante el tiempo de desarrollo de la durante el tiempo de desarrollo de la electroforesis.electroforesis.

• Se ha observado que diferentes matrices dan Se ha observado que diferentes matrices dan diferentes ventajas para diferentes tipos de diferentes ventajas para diferentes tipos de muestras.muestras.

• Algunas matrices utilizadas han sido geles de Algunas matrices utilizadas han sido geles de polímeros, papeles o capilares.polímeros, papeles o capilares.

PapelPapel

• Fue el primer soporte usado en las técnicas Fue el primer soporte usado en las técnicas de electroforesis desarrolladas para separar de electroforesis desarrolladas para separar compuestos (Tiselius, 1937).compuestos (Tiselius, 1937).

• Es fácil de usar porque no se requiere Es fácil de usar porque no se requiere preparación de la matriz.preparación de la matriz.

• Es limitada su capacidad resolutiva.Es limitada su capacidad resolutiva.• En 1957, Kohn usó acetato de celulosa En 1957, Kohn usó acetato de celulosa

como medio de soporte.como medio de soporte.

Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957.

AlmidónAlmidón

• Smithies usó un gel de almidón como Smithies usó un gel de almidón como medio para electroforesis en 1955.medio para electroforesis en 1955.

Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.

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CapilaresCapilares

• Jorgenson y Lukacs utilizaron capilares Jorgenson y Lukacs utilizaron capilares como matrices para la electroforesis a como matrices para la electroforesis a principios de los 1980's.principios de los 1980's.

Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.

Poliacrilamida Poliacrilamida

• En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y Weintraub utilizaron geles de Weintraub utilizaron geles de poliacrilamida. poliacrilamida.

Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.), 1959. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711, 1959.

Velocidad de migraciónVelocidad de migración

• Es proporcional a la relación entre las Es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. cargas de la proteína y su masa.

• Cuanto mayor carga por unidad de Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. masa más rápida será la migración.

V =EQ

F

V, velocidadE, campo eléctricoQ, carga netaF, coeficiente de fricción

Movilidad = V = QE F

=

Velocidad y movilidad de las Velocidad y movilidad de las moléculas en una electroforesismoléculas en una electroforesis

Poliacrilamida Poliacrilamida

• Los geles de poliacrilamida se forman Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente formador de por acción de un agente formador de enlaces cruzados (“cross-linking”), la enlaces cruzados (“cross-linking”), la bis-acrilamida.bis-acrilamida.

Reacción de polimerizaciónReacción de polimerización

• La reacción se desencadena por la presencia de un La reacción se desencadena por la presencia de un iniciador y se continua con ayuda de un iniciador y se continua con ayuda de un catalizador. catalizador. – El iniciador es el ion persulfato (SEl iniciador es el ion persulfato (S22OO88

--) que se añade en ) que se añade en forma de persulfato amónico (APS). forma de persulfato amónico (APS).

– Como catalizador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-Como catalizador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilendiamina).tetrametilendiamina).

– En algunas situaciones, como por ejemplo en el En algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean otros puede interferir con la electroforesis se emplean otros sistemas catalizador-iniciador.sistemas catalizador-iniciador.

Oxígeno y polimerizaciónOxígeno y polimerización

• El oxígeno es un inhibidor de la polimerización de El oxígeno es un inhibidor de la polimerización de la acrilamida, por lo quela acrilamida, por lo que

• Las soluciones de acrilamida se desgasifican para Las soluciones de acrilamida se desgasifican para que la polimerización sea completa y a con buena que la polimerización sea completa y a con buena velocidad.velocidad.

• Además, durante la polimerización se libera calor Además, durante la polimerización se libera calor (reacción exotérmica), lo que podría provocar la (reacción exotérmica), lo que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel.formación de burbujas en el seno del gel.

• La velocidad de polimerización es La velocidad de polimerización es proporcional a la concentración de proporcional a la concentración de persulfato (iniciador) y TEMED persulfato (iniciador) y TEMED (catalizador) adicionados.(catalizador) adicionados.

• La porosidad del gel la determina las proporciones La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamidarelativas de poliacrilamida y bis-acrilamida

• Es menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida Es menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se use. se use.

• El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel. el rango de separación del gel.

• Los geles se denominan en función del % de Los geles se denominan en función del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. acrilamida/bisacrilamida que contienen.

• La mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a La mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a 15%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es 15%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño.mejor para separar proteínas de gran tamaño.

Radicales libres en la Radicales libres en la polimerización de la acrilamidapolimerización de la acrilamida

SS22OO88==

SOSO44..

PersulfatoPersulfato Sulfato radical libreSulfato radical libre

SOSO44..

CHCH22 CHCH CC NHNH22

OO

==

==

AcrilamidaAcrilamida Acrilamida radical libreAcrilamida radical libre

CHCH22 CHCH NHNH22CC..

OO

==

++

Enlace acrilamida - bisacrilamidaEnlace acrilamida - bisacrilamida

CH2 C OCH2

CH2 CH

CH2 CH2

CH2CH2

CH2

CH2CH2

CC

CC

C

O

O

O

Estructura de la poliacrilamidaEstructura de la poliacrilamida

Ventajas de los geles de Ventajas de los geles de poliacrilamidapoliacrilamida

• Químicamente inertes, Químicamente inertes,

• Transparentes Transparentes

• Estables en un amplio rango de pH, Estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica. temperatura y fuerza iónica.

CH2

CH2

CH2

CH2

(CH2)n

(CH2)n

(CH2)n

N

%T = a + bm

X 100%

%C =a + b

X 100%b

a = acrilamida (g)b = N,N’-metilenbisacrilamidam = volumen final (ml)

Relaciones %T y %CRelaciones %T y %C

• C, es crítica si es menor a 10 los geles son C, es crítica si es menor a 10 los geles son rígidos y opacos si excede 100 en geles con 5 rígidos y opacos si excede 100 en geles con 5 % de acrilamida son pastosos y se rompen.% de acrilamida son pastosos y se rompen.

• Geles elásticos y completamente transparentes Geles elásticos y completamente transparentes se obtienen con C de 30 y con acrilamida se obtienen con C de 30 y con acrilamida superior al 3%superior al 3%

• No hay gelificación si la acrilamida es No hay gelificación si la acrilamida es menor al 2% y la Bis menor a 0.5%.menor al 2% y la Bis menor a 0.5%.

• Para que los geles sean elásticos la Para que los geles sean elásticos la concentración de bisacrilamida debe concentración de bisacrilamida debe disminuir. Puede usarse la fórmula :disminuir. Puede usarse la fórmula :

C = 6.5 - 0.3TC = 6.5 - 0.3T

en un rango de 5-20% de acrilamidaen un rango de 5-20% de acrilamida

• Las proteínas presentan una carga Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando propiedad de desplazarse cuando encuentran en un campo eléctrico. encuentran en un campo eléctrico.

Electroforesis nativaElectroforesis nativa

• Las proteínas se someten a una migración sin Las proteínas se someten a una migración sin desnaturalización. desnaturalización.

• Las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño Las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y de su forma. y de su forma.

• Se mantienen, en ciertos casos, las interacciones entre Se mantienen, en ciertos casos, las interacciones entre subunidades y entre proteínas. subunidades y entre proteínas.

• Los sistemas amortiguadores (tampón) usados son : Los sistemas amortiguadores (tampón) usados son : – tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5),

– tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y

– tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

Electroforesis desnaturalizanteElectroforesis desnaturalizante

• Somete a las proteínas a migración Somete a las proteínas a migración asegurando su desnaturalización completa asegurando su desnaturalización completa (pérdida de la estructura tridimensional). (pérdida de la estructura tridimensional).

• La migración es proporcional a la carga y al La migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. tamaño de la molécula pero no a su forma.

• El agente desnaturalizante más empleado es El agente desnaturalizante más empleado es el detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.el detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.

Sistemas de amortiguadoresSistemas de amortiguadores

• Se puede realizar empleando sistemas de uno o más Se puede realizar empleando sistemas de uno o más amortiguadores de pH, se habla entonces de sistemas amortiguadores de pH, se habla entonces de sistemas amortiguadores continuos o discontinuos. amortiguadores continuos o discontinuos.

• En los sistemas discontinuos el amortiguador del primer En los sistemas discontinuos el amortiguador del primer gel asegura la migración de todas las proteínas en el frente gel asegura la migración de todas las proteínas en el frente de migración, provocando la acumulación de todas las que de migración, provocando la acumulación de todas las que se han cargado en el pozo. se han cargado en el pozo.

• La separación realmente comienza a partir del momento en La separación realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migración alcanza la frontera del el que el frente de migración alcanza la frontera del segundo tampón. segundo tampón.

PAGEPAGE

• La electroforesis de proteínas en geles en una La electroforesis de proteínas en geles en una matriz de poliacrilamida es denominada matriz de poliacrilamida es denominada electroforesis en poliacrilamida o PAGE, electroforesis en poliacrilamida o PAGE, (“PolyAcrilamide Gel Electrophoresis”). (“PolyAcrilamide Gel Electrophoresis”).

• Es una de las técnicas más ampliamente usada Es una de las técnicas más ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. para caracterizar mezclas complejas de proteínas.

• Es un método conveniente, rápido y económico a Es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra, pues se requieren sólo nivel de muestra, pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína. cantidades del orden de microgramos de proteína.

PAGE -SDSPAGE -SDS

• Su nombre significa Electroforesis en geles Su nombre significa Electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS (“SDS-polyacrilamide gel presencia de SDS (“SDS-polyacrilamide gel electrophoresis”). electrophoresis”).

• PAGE-SDS es la electroforesis de proteínas PAGE-SDS es la electroforesis de proteínas más ampliamente usada.más ampliamente usada.

• Descrita por Laemmli (1970, Nature, Descrita por Laemmli (1970, Nature, 277:680)277:680)

PAGE -SDSPAGE -SDS

• Electroforesis desnaturalizante Electroforesis desnaturalizante

• Las muestras se desnaturalizan por calor en Las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes: presencia de agentes desnaturalizantes: – beta-mercaptoetanol, destruye los puentes beta-mercaptoetanol, destruye los puentes

disulfuro, disulfuro, – SDS, desnaturaliza y recubre a la proteína y se SDS, desnaturaliza y recubre a la proteína y se

separan como cadenas polipeptídicas aisladas.separan como cadenas polipeptídicas aisladas.

PAGE -SDSPAGE -SDS

• Se emplea un sistema de dos tampones Se emplea un sistema de dos tampones (discontinuo). (discontinuo). – PPermite la separación de volúmenes ermite la separación de volúmenes

relativamente grandes de muestra sin pérdida de relativamente grandes de muestra sin pérdida de resolución. resolución.

– La concentración se produce por isotacoforesis La concentración se produce por isotacoforesis de la muestra en el primer gel ('stacking'). de la muestra en el primer gel ('stacking').

PAGE -SDSPAGE -SDS

• El efecto de estrechamiento de las bandas se basa El efecto de estrechamiento de las bandas se basa en que: en que: – los iones glicinato, cargados negativamente de manera los iones glicinato, cargados negativamente de manera

incompleta (en el amortiguador superior) tienen una incompleta (en el amortiguador superior) tienen una movilidad electroforética inferior que los complejos de movilidad electroforética inferior que los complejos de proteínas-SDS, proteínas-SDS,

– Estos complejos, a la vez, tienen menor movilidad que Estos complejos, a la vez, tienen menor movilidad que

los iones Cllos iones Cl-- del amotiguador de muestra en el gel de del amotiguador de muestra en el gel de compactación (“stacking”). compactación (“stacking”).

PAGE -SDSPAGE -SDS• Cuando se someten las proteínas a el campo Cuando se someten las proteínas a el campo

eléctrico todas las especies deben migrar a la eléctrico todas las especies deben migrar a la misma velocidad para mantener el circuito misma velocidad para mantener el circuito eléctrico. eléctrico.

• Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la misma velocidad que los iones Clmisma velocidad que los iones Cl-- si hay una si hay una región de con un gradiente de alto voltaje. región de con un gradiente de alto voltaje.

• El gradiente es inversamente proporcional a la El gradiente es inversamente proporcional a la conductividad que es a su vez proporcional a la conductividad que es a su vez proporcional a la concentración. concentración.

PAGE -SDSPAGE -SDS

• El resultado es que las tres especies de interés ajustan sus El resultado es que las tres especies de interés ajustan sus

concentraciones de forma que [Clconcentraciones de forma que [Cl--] > [proteína-SDS] > ] > [proteína-SDS] >

[glicinato[glicinato--]. ].

• Como sólo hay una pequeña concentración de proteína-SDS Como sólo hay una pequeña concentración de proteína-SDS este complejo se concentra en una banda muy delgada entre este complejo se concentra en una banda muy delgada entre

las fronteras de migración del Cllas fronteras de migración del Cl-- y del glicinato y del glicinato--. .

• Cuando el glicinatoCuando el glicinato-- alcanza el borde del gel de separación alcanza el borde del gel de separación adquiere una carga mayor en el nuevo medio, debido al pH adquiere una carga mayor en el nuevo medio, debido al pH superior, e incrementa su movilidad. superior, e incrementa su movilidad.

• A partir de ese momento la interfase entre el glicinatoA partir de ese momento la interfase entre el glicinato -- y el y el

ClCl-- deja atrás a los complejos de proteína-SDS que se deja atrás a los complejos de proteína-SDS que se desplazarán a su propia velocidad.desplazarán a su propia velocidad.

SDSSDS

• Otros nombres, Dodecilsulfato de sodio, lauril-Otros nombres, Dodecilsulfato de sodio, lauril-sulfato de sodio.sulfato de sodio.

• Detergente aniónico Detergente aniónico • DesnaturalizanteDesnaturalizante• Se une a las cadenas polipeptídicas con una Se une a las cadenas polipeptídicas con una

relación de 1.4 g de SDS por g de proteína, relación de 1.4 g de SDS por g de proteína, aproximadamente una molécula de SDS por cada aproximadamente una molécula de SDS por cada dos aminoácidos de la cadena.dos aminoácidos de la cadena.

SDSSDS

• La unión masiva de moléculas de SDS bloquea la La unión masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la molécula de proteína carga propia de la molécula de proteína

• Le confiere al complejo una carga neta negativa Le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa. proporcional a su masa.

• Todas las proteínas acomplejadas con SDS viajan Todas las proteínas acomplejadas con SDS viajan hacia el ánodo. hacia el ánodo.

SDSSDS

• La separación de los complejos SDS-proteína esLa separación de los complejos SDS-proteína es– proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas

tienen la misma carga por unidad de masa. tienen la misma carga por unidad de masa.

• Se puede determinar el peso molecular aparente de Se puede determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón cualquier proteína por comparación con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos.de proteínas de pesos moleculares conocidos.

• Las movilidades de las proteínas en los geles de Las movilidades de las proteínas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.de su peso molecular.

Inicio de la PAGE discontinuaInicio de la PAGE discontinua

Reserva de amortiguadorTris-glicina, pH 8.3

MuestraTris-HCl, pH 6.8

Gel de compactación Tris-HCl, pH 6.8

Gel de resolución Tris-HCl, pH 8.8

Reserva de amortiguadorTris-glicina, pH 8.3

Al inicio de la electroforesis, las muestras se colocan en un pozo. El volumen puede ser variable en cada muestra aunque la cantidad de proteína debe ser constante.

-

+

Compactación (“stacking”)Compactación (“stacking”)

El primer gel o gel de compactación (“stacking”) es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH más ácido que el segundo gel.

Las proteínas se focalizan (compactan) formando una banda delgada

Frontera Glicina/cloruro

Separación en el gel resolutivo.Separación en el gel resolutivo.

El segundo gel, o gel de resolución, es el que realmente separa a las proteínas. Presenta un poro menor y un pH de 8.8.

Proteínas fraccionadas en el gel de separación

Relación entre la movilidad electroforética y la masa Relación entre la movilidad electroforética y la masa molecular (PAGE-SDS)molecular (PAGE-SDS)

0 2 4 6 8 10 12

Log

arit

mo

de la

Mas

a m

olec

ular

Movilidad electroforética (cm)

0

20

304050

100

200

0 0.16 0.33 0.5 0.66 0.8 1

Movilidad relativa

kDa

Geles en gradienteGeles en gradiente

• El uso de geles de poliacrilamida que tienen un El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de gradiente creciente de concentración de acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño de poro, gradiente decreciente en el tamaño de poro, pueden tener ventajas sobre los geles de pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. concentraciones uniformes de acrilamida.

Características de los geles en Características de los geles en gradiente.gradiente.

• Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el 30% de acrilamida en gradientes lineales o cóncavos. 30% de acrilamida en gradientes lineales o cóncavos.

• El rango a emplear dependerá del tamaño de las proteínas El rango a emplear dependerá del tamaño de las proteínas a separar. a separar.

• En un gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza En un gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza una zona donde el tamaño de poro impide cualquier una zona donde el tamaño de poro impide cualquier avance. avance.

• Una vez se alcanza el “límite de poro” no se produce una Una vez se alcanza el “límite de poro” no se produce una migración apreciable aunque no se detiene completamente. migración apreciable aunque no se detiene completamente.

Ventajas Ventajas

• Resuelve mejor las bandas pues las Resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones muy estrechas. concentra en regiones muy estrechas.

• Incrementa el rango de pesos moleculares Incrementa el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentración comparado con los de una concentración fija.fija.

Preparación de gradientesPreparación de gradientes

• Los geles en gradiente se preparan mezclando las Los geles en gradiente se preparan mezclando las soluciones de acrilamida de las concentraciones soluciones de acrilamida de las concentraciones extremas en un formador de gradientes. extremas en un formador de gradientes.

• Se suele adoptar la inclusión en la solución de Se suele adoptar la inclusión en la solución de polimerización de glicerol o sacarosa para polimerización de glicerol o sacarosa para aumentar la densidad de las soluciones y evitar las aumentar la densidad de las soluciones y evitar las mezclas en el proceso de preparación del mezclas en el proceso de preparación del gradiente.gradiente.

Formadores de gradientesFormadores de gradientes

Cóncavos Lineales

Estructura de la AgarosaEstructura de la Agarosa

Tipos de EFTipos de EF

• Electroforesis el geles en gradienteElectroforesis el geles en gradiente• Electroforesis Anódica (proteínas acidicas o Electroforesis Anódica (proteínas acidicas o

neutras)neutras)• Electroforesis catódica (proteínas básica)Electroforesis catódica (proteínas básica)• PAGE-SDSPAGE-SDS

– Websert y Osborn (fosfato)Websert y Osborn (fosfato)– (O’Farrel)(O’Farrel)– Anderson y AndersonAnderson y Anderson

IsolectroenfoqueIsolectroenfoque

• Denominada electroenfoque o isofocalización Denominada electroenfoque o isofocalización • Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un

gradiente de pH. gradiente de pH. • Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se

separan en un medio en el que existe una diferencia de separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH hasta que encuentran su pH potencial y un gradiente de pH hasta que encuentran su pH isoeléctrico. isoeléctrico.

• La región del ánodo (+) es ácida y la del cátodo (-) es La región del ánodo (+) es ácida y la del cátodo (-) es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tengan su punto que las moléculas que se han de separar tengan su punto isoléctrico dentro del rango. isoléctrico dentro del rango.

Movilidad en un gradiente de pHMovilidad en un gradiente de pH

• Las sustancias que se encuentran inicialmente en regiones Las sustancias que se encuentran inicialmente en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migrarán hacia el cátodo, positivamente y migrarán hacia el cátodo,

• Las que se encuentren en medios con pH más bajos que su Las que se encuentren en medios con pH más bajos que su pI tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo. pI tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo.

• Al alcanzar la región donde el pH coincidirá con su pI, Al alcanzar la región donde el pH coincidirá con su pI, tendrán una carga neta nula (forma un zwiterion) y se tendrán una carga neta nula (forma un zwiterion) y se detendrán. detendrán.

• De esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en De esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su pI con el pH (se estrechas bandas donde coincide su pI con el pH (se focalizan). focalizan).

• En esta técnica el punto de aplicación suele no ser crítico En esta técnica el punto de aplicación suele no ser crítico pues las moléculas siempre se desplazarán hacia la región pues las moléculas siempre se desplazarán hacia la región de su pI (aunque existen excepciones). de su pI (aunque existen excepciones).

• La capacidad de resolución es de 0.01 unidades de pH.La capacidad de resolución es de 0.01 unidades de pH.

• El gradiente de pH estable entre los electrodos se consigue El gradiente de pH estable entre los electrodos se consigue usando una mezcla de anfolitos (anfolinas) de bajo peso usando una mezcla de anfolitos (anfolinas) de bajo peso molecular cuyos pI cubren un rango preestablecido de pH. molecular cuyos pI cubren un rango preestablecido de pH.

• Los anfolitos suelen ser ácidos poliamino policarboxílicos Los anfolitos suelen ser ácidos poliamino policarboxílicos alifáticos sintéticos y son comercializados en mezclas que alifáticos sintéticos y son comercializados en mezclas que cubren determinados rangos de pH.cubren determinados rangos de pH.

Detecciones específicasDetecciones específicas

• CarbohidratosCarbohidratos

• Transferencia electroforéticaTransferencia electroforética

• Tinción de PlataTinción de Plata