ELECTROFORESISELECTROFORESIS

Movimiento de partículas cargadas por

acción de un campo eléctrico

MOVILIDAD ELECTROFORÉTICAMOVILIDAD ELECTROFORÉTICA

v (cm/seg) = v (cm/seg) = mmee.E.E

mmee = v/E = = v/E = d/t.Ed/t.E

Estado estacionario:Estado estacionario:

q.E = f.v(f: coef. de fricción)

q.E = 6r.vq.E = 6rme.E

mme =e = q / 6 q / 6rr

FACTORES QUE AFECTAN LA FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISELECTROFORESIS

DESARROLLOELECTROFORETICO

CAMPO ELECTRICOVoltaje

PotenciaIntensidadResistencia

Temperatura

ELECTROFORESIS: ELECTROFORESIS: FACTORES ELÉCTRICOSFACTORES ELÉCTRICOS

F = q.Efuerza electromotriz = trabajo

E = I.R

P = dW/dt

P = E.dq/dt = E.Itrabajo por unidad de tiempo =

POTENCIA

Desarrollo electroforético:

• Voltaje constante

• Corriente constante

• Potencia constante

ELECTROFORESISEfecto del sobrecalentamientoEfecto del sobrecalentamiento

P = dH/dtenergía convertida en calor

En un sistema de resistencia R:

P = I2.R = I.V

Causas de sobrecalentamiento:

I

V

R o C

EFECTOSEFECTOS:: me

R• difusión C I corrientes convectivas

• desnaturalización pérdida de actividad enzimática o inmunológica

• otras

FACTORES QUE AFECTAN LA FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISELECTROFORESIS

DESARROLLOELECTROFORETICO

CAMPO ELECTRICOVoltaje

PotenciaIntensidadResistencia

Temperatura

BUFFERpH

Fuerza Iónica

Interacciones iónicasInteracciones iónicasELECTROFORESIS: Efecto de la fuerza ELECTROFORESIS: Efecto de la fuerza

iónica de la solución reguladoraiónica de la solución reguladora

• Estado estacionario: atmósfera iónica esférica

• Cuando se aplica E: deformación de la simetría esférica con desplazamiento del centro de carga de la atmósfera iónica.

• Efecto de arrastre, la atmósfera iónica se mueve en dirección opuesta a la del ion central. Reducción de la carga neta efectiva.

me (1/)1/2

ELECTROFORESISELECTROFORESISEFECTO DE LA FUERZA IÓNICA EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA DE LA SOLUCIÓN REGULADORADE LA SOLUCIÓN REGULADORA

Fuerza iónica baja:Fuerza iónica baja:

C I permite > V < tiempo < difusión

• capacidad buffer

modificaciones de pH

Fuerza iónica alta:Fuerza iónica alta:

disolución difusión capacidad buffer C I debe aplicarse

< V > tiempo

µ 0,02 - 0,1 M

ELECTROFORESISELECTROFORESISEfecto del pH de la solución reguladoraEfecto del pH de la solución reguladora

• Modificación de la carga eléctrica de las proteínas

• Sentido de la electroforesis

LIMITACIONES:LIMITACIONES:• Cambios en la solubilidad de los

compuestos• Desnaturalización de proteínas• Alteración de las propiedades

inmunológicas y/o enzimáticas

FACTORES QUE AFECTAN LA FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISELECTROFORESIS

DESARROLLOELECTROFORETICO

CAMPO ELECTRICOVoltaje

PotenciaIntensidadResistencia

Temperatura

BUFFERpH

Fuerza Iónica

MEDIO SOPORTEAdsorción

ElectroendósmosisTamiz Molecular

MEDIOS SOPORTE: Materiales insolubles en sistemas acuosos, utilizados para disminuir las corrientes convectivasEFECTOS QUE INTRODUCEN EN LOS PROCESOS ELECTROFORETICOS• Adsorción en el medio• Inhomogeneidad de la matriz del material• Electroendósmosis• Difusión• Efecto tamiz molecular

CONSIDERACIONES PARA SU ELECCION• Poder resolutivo • Limitación de la magnitud del campo eléctrico • Facilidad de manipulación, tinción y decoloración • Posibilidad de valoración cuantitativa de los resultados • Costo

MEDIOS SOPORTE PARA ELECTROFORESIS Membranas de acetato de celulosa Geles: almidón, agar, agarosa, poliacrilamida Otros: Papel, Sephadex, polvo de celulosa, sílica gel, óxido de Al

ElectroendósmosisElectroendósmosisFormación de doble capa eléctricaFormación de doble capa eléctrica

E = 0:• Asociación anión-contraión,

ambos hidratados.

E 0: • Aniones inmóviles.

• Desplazamiento de cationes hidratados.

• Efecto: flujo neto de líquido que se desplaza hacia el cátodo

MEMBRANAS DE ACETATO DE CELULOSAMEMBRANAS DE ACETATO DE CELULOSA

ESTRUCTURAESTRUCTURA Inerte. Frágil y sensible a solventes

FACTORES DIFERENCIALESFACTORES DIFERENCIALES• Longitud de la cadena de celulosa• Grado de acetilación (1- 40 %)• Tamaño y distribución de los poros• Volumen de los poros comparados con la matriz sólida (20-85%) • Agentes hidratantes y grado de hidratación del acetato de celulosa • Compuestos residuales del proceso de acetilación

CONDICIONES DE TRABAJOCONDICIONES DE TRABAJO• Proceso de humectación previo para permitir que los poros sean

lubricados por la solución buffer (equilibrio)

UTILIDADUTILIDAD• Buenas separaciones a bajo voltaje y en tiempos cortos • Posibilidad de revelados diferenciales • Puede ser transparentizado blanqueado o disuelto para el análisis por

densitometría o eluido de las fracciones

FACTORES QUE AFECTAN LA FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESISELECTROFORESIS

DESARROLLOELECTROFORETICO

CAMPO ELECTRICOVoltaje

PotenciaIntensidadResistencia

Temperatura

BUFFERpH

Fuerza Iónica

MEDIO SOPORTEAdsorción

ElectroendósmosisTamiz Molecular

MUESTRAS

DESARROLLO ELECTROFORÉTICODESARROLLO ELECTROFORÉTICO

DESARROLLO ELECTROFORETICO

DETECCIONFijación

Tinción generalTinción específica

Actividad enzimáticaActividad inmunológica

Detección de marcación previaWestern blot

MuestrasMedio soporte

BufferCondiciones eléctricas

ELECTROFORESIS: TINCIONESELECTROFORESIS: TINCIONES

COLORANTE ESPECIFICIDADSENSIBILIDAD

COMENTARIOS

Amido Black o NegroAmido 10B o Amido Schwartz

Tinción generalSensibilidad: 1 g/banda

Mejora con fijación previa .Diferente grado de unión según laproteína.

Coomassie Blue R-250 Tinción generalSensibilidad: 0,2-0,5 g/banda

Diferente grado de unión según laproteína. Tinción estable.Apropiado para densitometría.

Xylene Cyanine Brilliant G oCoomassie Blue G-250

Tinción generalAumenta la sensibilidad x3 en TCAdespués de la tinción

Apropiado para densitometría.

Verde Lisamine Tinción general

Rojo Ponceau 2S Tinción general. Sensibilidad:alreddor de 0,5 g/banda

Tinción más uniforme con todaslas proteínas séricas.

Tinciones con plata ycombinaciones con otros colorantes

Sensibilidad: 100 veces > tincionesgenerales

Laborioso. Varios protocolos.Polisacáridos y DNA.No reaccionan todas las proteínas.

DENSITÓMETRODENSITÓMETRO

Zona Prealbúmina

Zona Albúmina

Zona Alfa 1

Zona Alfa 2

Zona Beta 1

Zona Beta 2

Zona Gamma

DENSITOMETRÍA DENSITOMETRÍA CORRESPONDIENTE A CORRESPONDIENTE A

EUPROTEINEMIAEUPROTEINEMIA

PROTEINASPROTEINASCOMPONENTES DE FRACCIONES ELECTROFORÉTICASCOMPONENTES DE FRACCIONES ELECTROFORÉTICAS

ZONA PREALBÚMINAZONA PREALBÚMINAPREALBÚMINA (TTR, transtiretina: 54.000; 4,7): transporta tiroxina y

triyodotironinaPROTEÍNA LIGANTE DE RETINOL (RBP: 21.000): en complejo con prealbúmina

transporta vitamina AIndicadores de malnutrición y enfermedad hepática.

ZONA ALBÚMINAZONA ALBÚMINAALBÚMINA (66.000; 4-5,8): Gran capacidad de transporte por la elevada

concentración y la cantidad de cargas negativas: une bilirrubina, ácidos grasos, hormonas (tiroxina, triyodotironina, cortisol, aldosterona, drogas, calcio).Mantenimiento de la presión oncótica del plasma. Indicador de estado nutricional.

MOVILIDAD ALFA 1MOVILIDAD ALFA 11-ANTITRIPSINA (AAT: 55.000; 4,8): Reactante de fase aguda con actividad

antiproteasa (actúa contra quimotripsina, calicreína, renina, uroquinasa, plasmina, elastasa y colagenasa). Constituye casi el 90% de la banda proteica de la zona.

1-GLICOPROTEINA ACIDA (40.000; 2,7-4,0): Asociada con inflamación.1-FETOPROTEINA (69.000): Mayoritaria en la circulación fetal. En el adulto,

marcador de carcinoma hepatocelular.1-LIPOPROTEINA (HDL, 200.000): Transportadora de lípidos (Apo A).

MOVILIDAD ALFA 2:MOVILIDAD ALFA 2:HAPTOGLOBINA (Hp: 80.000-400.000): Transportadora de oxihemoglobina

en plasma. Proteína de fase aguda. 2-MACROGLOBULINA (AMG: 800.000; 5,4): En forma de AMG-complejos

con proteasas (plasmina, pepsina, tripsina, quimotripsina) impide la proteolisis de compuestos de gran tamaño.

CERULOPLASMINA (CER: 134.000; 4,4): Transportadora de cobre, cataliza procesos oxidativos. Proteína de fase aguda.

VLDL-LIPOPROTEÍNA: relación con TG endógenos (zona pre-beta).

MOVILIDAD BETA 1:MOVILIDAD BETA 1:TRANSFERRINA (SIDEROFILINA: 77.000; 5,7): Transportadora de hierro (es

capaz de unir otros iones metálicos).HEMOPEXINA (57.000): Une hemo.-LIPOPROTEINA (LDL, 3.000.000): Transportadora de lípidos.C4 (206.000): Factor del sistema de complemento. Proteína de fase aguda.

MOVILIDAD BETA 2:MOVILIDAD BETA 2:FIBRINOGENO 340.000; 5,5): Proteína de fase aguda. Precursor del coágulo

de fibrina.2-MICROGLOBULINA (11.800): Cadena liviana de los antígenos de

histocompatibilidad de leucocitos. Marcador de insuficiencia funcional renal.

C3 (180.000): Factor de complemento. Proteína de fase aguda.

MOVILIDAD GAMMAMOVILIDAD GAMMA

PROTEINOGRAMASPROTEINOGRAMASNormal - Inmunoglobulinas monoclonales Hiperinmunoglobulinemia policlonal - Fase

aguda