ENZIMASENZIMASBioquimica UDCABioquimica UDCA

Las enzimas son proteínasLas enzimas son proteínas

Catalizan reacciones químicas necesarias para la sobrevivencia celular

Sin las enzimas los procesos biológicos serían tan lentos que las células no podrían existir.

Las enzimas pueden actuar dentro de la célula , fuera de ésta, y en el tubo de ensayo.

E + SE + S ES ESEP EP E + P E + P

E E E E

La enzima disminuye la energía La enzima disminuye la energía de activaciónde activación

Tiempo de la reacción

E + S

E + P

Sin enzimaCon enzima

• La Ea de la hidrólisis de la urea baja de 30 a 11 kcal/mol con la acción de las enzimas, acelerando la reacción 1014 x

• El aumento de temperatura necesario para producir la reacción no catalizada seria de 529ºC

Enzima - CatalizadorEnzima - CatalizadorTanto la enzima como el catalizador

aceleran la velocidad de una reacción química.

Una enzima puede transformar 1000 moléculas de sustrato/ segundo

Las enzimas tienen 3 propiedades que los catalizadores NO tienen◦ Especificidad por el sustrato◦ Se inactivan por desnaturación◦ Pueden ser reguladas

Las enzimas se unen a los reactivos (sustratos) reduciendo la energía de activación

Cada enzima tiene una forma única con un sitio o centro activo en el que se une al sustrato

Después de la reacción, enzimas y productos se separan.

Las moléculas enzimáticas no han cambiado después de participar en la reacción

Las enzimas cumplen su papel catalítico gracias a:• Fijación estereoquímicamente complementaria

del substrato• Transformación catalítica del mismo

En ambas funciones participan:

• Cadenas laterales de los aminoácidos• Grupos o moléculas no proteicas:

Grupos prostéticos Iones metálicos Cofactores

Los siguientes hechos: Especificidad de la reacción enzimática Carácter heterogéneo de la catálisis enzimática

Nos llevan a postular la existencia de un Centro Activo en la molécula de enzima, capaz de:

Fijar específicamente al substrato Transformarlo catalíticamente.

Enzima

Sitio activoSitio activo

SustratoSustrato

La unión del sustrato es muy La unión del sustrato es muy específicaespecífica

Complementariedad geométrica

Complementariedad de cargas, uniones iónicas

Modelos:

Encaje inducido

Llave – cerradura.

Estado de transición

Teorías de la acción enzimática, 1

Modelo de Llave y CerraduraModelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer) (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.

Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera insuficiente al no explicar algunos fenómenos de la inhibición enzimática

Teorías de la acción enzimática, 2

Modelo de Ajuste InducidoModelo de Ajuste Inducido (Koshland) (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración en su estructura por el hecho físico de la unión.

Está mucho más de acuerdo con todos los datos experimentales conocidos hasta el momento.

Clasificación y nomenclatura de enzimas

Nombre común (sustrato+”asa”): Hexokinasa

Clasificación y nomenclatura

ATP : hexosa fosfotransferasa

Nombre sistemático:

Donador Aceptor

Grupo transferido

Tipo de reacción catalizada

Número Enzyme Commission:Grupos químicos

EC 2. 7. 1. 1Enzyme Comission Grupo Subgrupo No. Enzima

EC 1.x OxidorreductasasEC 2.x TransferasasEC 3.x HidrolasasEC 4.x LiasasEC 5.x IsomerasasEC 6.x Ligasas

Clasificación de enzimas por Grupos

Clasificación y nomenclatura

Cinética Enzimática

Cinética Enzimática La cinética enzimática es el análisis cuantitativo del efecto de

cada uno de los factores que intervienen en la actividad enzimática, que se evalúa a través de la velocidad de la reacción catalizada.

Las variables más importantes son:

• Concentración de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o activadores)

• pH

• Temperatura

Baja concentración de sustrato

ALTA concentración de sustratoSATURACION

v

[s]

Efecto de la concentración de substrato

..

.. . . . .

dt

t

s

p[ ]

Concepto de velocidad inicial

d[P]v = , t 0

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzimapara fijar substrato; una vez que están ocupadostodos, por mucho que aumente la concentraciónde substrato, la velocidad permanecerá constantetendiendo a un valor asintótico

Relación entre Km y VmaxRelación entre Km y VmaxMichaelis y MentenMichaelis y Menten

Concentración de Sustrato [S]

Vel

oci

dad

de

la r

eacc

ión

(v)

Km

Vmax

Vmax/2

La Km es la concentración de sustrato donde se obtiene la mitad de la Vmax

Concentración de Sustrato [S]

Vel

oci

dad

de

la r

eacc

ión

(v)

Km

Vmax

Vmax/2

A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustratoA menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato

Representación directa

s

0 20 40 60 80 100

v

0

20

40

60

80

100

Km

Vmax

vV s

K sm x

m

1 1 1v

KV s V

m

m x m x

-1/Km

1/Vmax

Representación Lineweaver-BurkeRepresentación Lineweaver-Burke

Definición Actividad Definición Actividad Enzimática Enzimática Es el número de moles de sustrato que

reaccionan para formar producto, por mol de enzima y por unidad de tiempo. Esto supone que la enzima está plenamente saturada con sustrato y por tanto que la reacción se efectúa con su máxima rapidez

El índice de recambio muestra la eficiencia impresionante de la catálisis enzimática

Efecto del pH en la ENZIMAEfecto del pH en la ENZIMA

Cada enzima tiene un pH óptimo para su actividadCada enzima tiene un pH óptimo para su actividadEl pH afecta las interacciones iónicasEl pH afecta las interacciones iónicas

1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:- Grupos disociables de la enzima- Grupos disociables del substrato

2. Sobre la transformación catalítica del substrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

Efecto del pH

Efecto de la temperatura en la ENZIMAEfecto de la temperatura en la ENZIMA

Cada enzima tiene una temperatura óptima.Cada enzima tiene una temperatura óptima.

Temperatura

15º 40º 75º

Aumento de la velocidad

Desnaturación por calor

CoenzimasCoenzimasLas coenzimas son pequeñas Las coenzimas son pequeñas

moléculas orgánicas, que se unen a moléculas orgánicas, que se unen a la enzima.la enzima.

Las coenzimas colaboran en la Las coenzimas colaboran en la reacción enzimática recibiendo reacción enzimática recibiendo transitoriamente algún grupo transitoriamente algún grupo químico: Hquímico: H+ + , OH, CH, OH, CH33 . .

La enzima sin la coenzima recibe el La enzima sin la coenzima recibe el nombre de APOENZIMAnombre de APOENZIMA

El NAD es una coenzima aceptora de HEl NAD es una coenzima aceptora de H

Sustrato oxidado

Algunas enzimas requieren metales para Algunas enzimas requieren metales para mejorar su actividad mejorar su actividad

Isoenzimas o IsozimasIsoenzimas o IsozimasSon formas moleculares diferentes de

una misma enzimaCatalizan la misma reacciónEjemplo: Lactato deshidrogenasaLactato + NAD ==== Piruvato + NADHM4, M3H1, M2H2, M1H3 y H4

Se diferencian por su movilidad electroforética

Usadas en clínica: sueros normales y sueros con alguna patología

Inhibición enzimática

Inhibidor:

Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través deinteracciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo

II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

Inhibición enzimática isostérica

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva

Inhibición Competitiva

Inhibidores CompetitivosInhibidores Competitivos

Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima

Se une solo a la enzima libreV máx no se altera y K M cambia

Inhibición competitivaInhibición competitivaInhibición competitivaInhibición competitiva

Al aumentar la cantidad Al aumentar la cantidad de SUSTRATO el de SUSTRATO el inhibidor competitivo es inhibidor competitivo es desplazado y se forma desplazado y se forma productoproducto

E ES

EI

I

S

E + P

Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente excluyentes- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:

Ki = [E] [I]

[EI]

KmSin

inhibidor

Kmcon

inhibidor

Sin inhibidor

Con inhibidor

El inhibidor competitivo aumenta la Km

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/Km

-1/(Km(1 + i/Ki))

1/Vmax

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

Ejemplo Inhibidor Ejemplo Inhibidor CompetitivoCompetitivoÁcido succínico + FAD == ácido

fumárico + FADH2 El inhibidor competitivo es el ácido malónico

Es un análogo estructuralmente parecido al ácido succínico

Ácido Fólico y Ácido Fólico y SulfanilamidaSulfanilamidaLa sulfanilamida es un análogo estructural

del ácido p - aminobenzoico (PABA)PABA es el punto de partida para la

síntesis de ácido fólico en las bacteriasEl ácido fólico es una vitamina esencial

para la proliferación (división) bacterianaSulfanilamida se usa en el tratamiento

algunas infecciones

Metotrexato y DihidrofolatoMetotrexato y DihidrofolatoEl ácido fólico en sus formas de dihidro y

tetrahidrofolato es coenzima de la reacción catalizada por la dihidrofolato reductasa

Esta reacción es parte del metabolismo de los nucleótidos para la síntesis de DNA

Metotrexato se usa en la terapia de algunos cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA

Inhibidor competitivoInhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustratosu estructura es similar a la del sustrato

No se forma producto

Inhibición No Competitiva

Inhibidor No CompetitivoInhibidor No Competitivo

Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima

Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato

Por acción del inhibidor disminuye la Vm pero el valor de Km no se altera

Inhibición NO Inhibición NO competitivacompetitivaInhibición NO Inhibición NO competitivacompetitiva

Inhibidor NO competitivoInhibidor NO competitivoEl inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un

sitio diferente del sitio activo

E ES

EI

I

S

E + PI

ESI

SInhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

Inhibición Anticompetitiva o Incompetitiva

Inhibidor IncompetitivoInhibidor Incompetitivo

En este tipo de inhibición el inhibidor se une a otro lugar diferente del centro activo pero solo después de que el sustrato lo haya hecho al centro activo y, por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera, aunque todo el sustrato esté saturando la enzima y toda la enzima esté como complejo ES, el inhibidor puede enlazarse produciendo un complejo inactivo ESI. No permite formación de producto.

Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y, por tanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima, disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI no conduce a productos y Vm disminuye.

Inhibidor IncompetitivoInhibidor Incompetitivo

Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima

Se une sólo al complejo enzima-sustrato

Los efectos que tiene: disminuye el valor de Km y también el de Vmáx

E ESS

E + PI

ESI

InhibiciónAnticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;el complejo ESI no es productivo

Inhibición Irreversible

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki,

sino por una constante de velocidad ki:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Inhibidores IrreversiblesInhibidores Irreversibles

Producen inactivación permanente de la actividad enzimática

Se interfiere con el normal desarrollo de una reacción o vía metabólica

Ejemplos: p-cloromercuribenzoato, yodoacetato, diisopropilfluorfosfato

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Inhibición enzimática alosterica

Enzimas Alostéricas Enzimas Alostéricas regulablesregulablesSon enzimas cuya estructura proteica está

formada de varias subunidadesNo se rigen por la cinética de M - MAdemás del sitio o centro activo tienen sitios

alostéricos o de regulaciónSitio activo/sustratos; Sitio alostérico/moduladores o reguladoresLa relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea

Enzimas alostéricasEnzimas alostéricas Las enzimas alostéricas

presentan estructura cuaternaria.

Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molécula de sustrato

La unión del sustrato es cooperativa

la curva de velocidad presenta una forma sigmoidal

Moduladores AlostéricosModuladores AlostéricosTambién reciben el nombre de efectores

y pueden ser positivos o negativosSe unen al sitio alostérico que puede

estar en la misma subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidades regulatorias

Su unión produce un cambio conformacional que afecta al sitio activo

Pueden unirse de forma covalente y no covalente

Efectores no Efectores no covalentescovalentes

El sustrato mismo es el principal efector no covalente, se une de manera transitoria cuando las condiciones así lo permitan de igual forma se puede separar.

Efectores Efectores covalentescovalentesEl principal efector covalente es el grupo fosfato PO4. . Se une fuerte y de manera permanente a la enzima por medio de reacción química catalizada por otra enzima

Fosforilación / desfosforilación

La unión del grupo fosfato a una enzima se denomina fosforilación. Lo hace por medio de enzimas denominadas Kinasas (quinasas o cinasas).

El grupo fosfato se puede separar de la enzima por medio de otra enzima denominada Fosfatasa, el proceso se denomina desfosforilación.

RESUMENRESUMEN