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Estudio de la velocidad de las reaccionescatalizadas por enzimas.

Proporciona informacin acerca del mecanismo dela reaccin cataltica y de la especifidad del enzima.

La medida de la velocidad se realiza siempre en lascondiciones ptimas de pH, temperatura, presenciade cofactores, etc, y se utilizan concentracionessaturantes de sustrato.

En estas condiciones, la velocidad de reaccinobservada es Vmax.

La velocidad puede

determinarse bienmidiendo la aparicinde los productos o ladesaparicin de los

reactivos.

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A medida que la reaccin transcurre, la velocidadde acumulacin del producto va disminuyendoporque se va consumiendo el sustrato de lareaccin. Para evitar esta complicacin seprocede a medir la velocidad inicial de lareaccin (v0).

En estas condicionesno es necesarioconsiderar lareaccin inversa, yaque la cantidad de

producto formada estan pequea que lareaccin inversaapenas ocurre.

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Para estudiar la cintica enzimtica se mide elefecto de la concentracin inicial de sustrato

sobre la velocidad inicial de la reaccin,manteniendo la cantidad de enzima constante.

Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial esdirectamente proporcional a la concentracin de

sustrato

primer orden. A altas [S]0, el enzima se

encuentra saturada porel sustrato, y la

velocidad ya nodepende de [S]0 y lavelocidad es mxima(Vmax) orden cero.

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A fines del siglo XIX comenzaron a realizarseestudios del efecto de la concentracininicial del sustrato sobre la actividad

enzimtica. Ya en 1882 se introdujo el concepto del

complejo enzima-sustrato comointermediario del proceso de catlisisenzimtica.

En 1913, Leonor Michaelis y Maud Mentendesarrollaron esta teora y propusieron unaecuacin de velocidad que explica elcomportamiento cintico de los enzimas.

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Mecanismo en 2 etapas: Primero se forma elcomplejo E-S y luego el complejo da lugar a la

formacin del P, liberando la E. k1, k2 y k3: ctes cinticas individuales de cada

proceso

v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES]

v3 = k3 [ES]

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Slo vlido cuando:

[S] [E]

Estado estacionario, o sea que la [ES] = cte.

Un sustrato S, un producto P y una enzima E

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EPESSEkkk

211,

)()( 211 ESkkSEkdt

ESd

)(11 ESkSEkdt

dS

SEkESkkdt

dE

121 )(

Ecuaciones de balance:

ESkdt

dP2

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)(0 ESEE

)()()( 2101 ESkkSESEkdt

ESd

La enzima puede estar en forma libre (E) o

combinada (ES).

Ecuacin de conservacin:

Suponiendo:Estado cuasiestacionario: d(ES)/dt = 0

E0/S0 suficientemente pequeo

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Sk

kk

SEkvESk

dt

dP

dt

dSv

1

21

022

m

mx

KS

SVv

Ecuacin de Michaelis-Menten

02EkV

mx

1

21

k

kkK

m

Velocidad mxima

Constante de

Michaelis-Menten

Parmetroscinticos

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Vmx es la velocidad mxima a concentraciones de Ssaturantes.

KM representa la constante de disociacin (laafinidad del complejo enzima-sustrato (ES) por elsustrato). Valores bajos indican mayor afinidad.

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1) Lineweaver-Burk

2) Eadie-Hofstee

3) Hanes-Woolf

mxmx

m

VSV

K

v

111

mxV

S

rKr

m

mxmx

1

V

KS

Vr

Sm

Otras formas de representacin grfica

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Hay enzimas que no obedecen la ecuacin deMichaelis-Menten. Se dice que su cintica no esMichaeliana.

Ej: enzimas alostricas, cuya grfica v frente a [S] noes una hiprbola, sino una sigmoide. Pequeasvariaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a laKM) provocan grandes variaciones en la velocidad dereaccin.

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Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos detransformacin enzimtica de un sustrato en un

nico producto.

Sin embargo, la mayora de las reacciones enzimticasimplican a ms de un sustrato.

S + E ES EP E + P

- Por ejemplo:

A + B P + Q

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Adenilato ciclasa

Citrato sintasa

Alcohol-DH

Malato-DH

Ribitol-DH

Lactato-DH

Coenzima-A transferasa

Glutamato-alanina transaminasa

Glucosa oxidasa etc. ....

Estudio cintico:

A) Velocidad inicial

B) Depender la velocidad de la reaccin de uno solo de los

reactantes (Resto saturacin).

Reaccin orden cero con respecto todos los substratos menos uno

SK

SVv

``max

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a) En cuanto al nmero de sustratos y productos:

Reaccin Nombre

A -----> P Uni-Uni

A + B -----> P Bi-Uni

A + B + C -----> P + Q Ter-Bi

A + B -----> P + Q Bi-Bi

b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los

productos:

* Reacciones secuenciales:

- al azar- ordenadas

* Reacciones de desplazamiento:

- Ping-Pong

Nomenclatura

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De acuerdo con la simbologa de Cleland, el progreso de la

reaccin se simboliza por una lnea horizontal.

El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser

bastante complicado a la hora de representar los esquemas de

las reacciones

A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero elque ms xito ha tenido ha sido el propuesto porCleland.

La entrada de sustratos y la salida de productos se representan

porflechas verticales que indican la direccin de entrada o

salida de la reaccin.

- Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos

concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos

y se forman 2 productos:

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E EEA E

A P

EB

B Q

E EEA EAB

A B

EQ

P Q

EPQ

Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong

Secuencial: Bi-Bi ordenada

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Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi:

A + B --- P + Q-Mecanismos secuenciales

- al azar

- ordenadas

- Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento

Reacciones enzimticas de dos sustratos y dos productos

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A) Mecanismos secuenciales,Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se

libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo

ternario EAB o EBA debe formarse como requisitoindispensable antes de que se produzca la formacin de

productos.

La formacin del complejo ternario es independiente del

orden de unin de los sustratos.Este tipo de reaccines se denominan

reacciones secuenciales al azar,

La formacin del complejo ternario debe producirse en un

orden determinado para que el complejo sea productivodesde el punto de vista cataltico.

Este tipo de reaccin se denomina

reacciones secuenciales ordenadas).

A li d d l t d i t ti t d ti

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Analicemos, desde el punto de vista esquemtico, estos dos tipos

de reacciones secuenciales.

Hagmoslo primero de acuerdo con un esquema clsico:

E + A EA

E + B EB

EAB EPQ

EQ E + Q

EP E + P

B

A

P

Q

Bi-Bi al azar

E + A EA + B EAB EPQ EQ + P E + Q

Bi-Bi ordenado

Utilicemos ahora la simbologa o nomenclat ra de Cleland

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Utilicemos ahora la simbologa o nomenclatura de Cleland:

Bi-Bi al azar

E E

A BEA

B A

EB

EAB

Q

QP

P

EP

EQ

EBA

EPQ

EQP

Bi-Bi ordenada

E EEA EAB

A B

EQ

P Q

EPQ

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E EEA

A B

EQ

P Q

- Un caso especial, es el siguiente:

- Este mecanismo se conoce como Mecanismo de Theorell-Chance, y en realidad es

un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB niEPQ

La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrmeroque contiene zinc en

el centro activo y que cataliza la oxidacin de etanol) por el coenzima

nicotinamina adenina dinucltido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido

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B) Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento

E + A EA E+ P +B EB EQ E + Q

- Este tipo de mecanismo es muy comn en las reacciones en las

que un grupo qumico se transfiere desde el sustrato A al B, es

decir en reacciones de transferencias.

En este tipo de mecanismo, tras la unin del primer sustrato se

libera uno de los productos, en una reaccin parcial en la que segenera una forma modificada de la enzima.

(acil enzimas, fosforil enzimas)

Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formacin delsegundo producto con regeneracin de la forma nativa de la

enzima.

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* Utilizando la simbologa de Cleland, en el caso de reacciones

Ping-Pong, tenemos:

E EEA E

A P

EB

B Q

Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong,o tetra-Uni Ping Pong

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Mecanismo Enzima

Bi-Bi al azar Adenilato quinasa (EC 2.2.4.3)

Creatin quinasa (EC 2.7.3.2)

Citrato sintasa (EC 4.1.3.7)

Bi-Bi ordenado Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1)

Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37)

Ribitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.56)

Lactato deshidrogenasa (EC1.1.1.27)

Bi-Bi Ping Pong Coenzima-A transferasa (EC 2.7.8.7)

Glutamato-alanina transaminasa (EC 2.6.1.2)

Glucosa oxidasa (EC 1 1 3 4)