ESCLEROSIS MULTIPLEBANDAS OLIGOCLONALES EN LCR

Bioq. María Josefina Boero

Hospital Italiano de Buenos Aires

“Es una enfermedad inflamatoria, desmielinizante, neurodegenerativa

de curso crónico del SNC”

Esclerosis Múltiple

INFLAMACIÓN

DESMIELINIZACION GLIOSIS

…………

DOCTOR, ¿ CUÁL ES LA CAUSA DE LA EM?

Esclerosis Múltiple (EM) • Se piensa en un mecanismo autoinmune: “Debido a la destrucción selectiva de la capa de mielina y de las fibras nerviosas, y secundariamente un daño neuronal progresivo”

• Se caracteriza por la ocurrencia sucesiva de focos de desmielinización diseminados en tiempo y espacio en varias áreas del SNC, incluidos la región periventricular, la médula espinal, el tronco encefálico, el cerebro y el nervio óptico.

EM: Epidemiología

• La enfermedad suele comenzar entre los 20 y 40 años, con un pico máximo a los 30 años

• Es más frecuente en mujeres (2:1) y en caucásicos

• No se conoce las razones de la variación de prevalencia en el mundo, pero piensan que los factores genéticos y ambientales podrían ser la causa

EM: Distribución mundial

The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.

En el Mundo….

• Argentina es un país con una prevalencia de 18/100000, lo que significa que hay 5500-6500 casos. Con 2.24 nuevos casos /año.

• La prevalencia más alta de la enfermedad (30 /100000) se encuentra en el norte de Europa, sur de Australia y centro de Norte América.

En Argentina….

EM: Factores de riesgo

Se asocia a pacientes que presentan ciertos antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad HLA-DR2

En estos individuos la exposición a ciertos factores (infecciones virales, polisacáridos bacterianos, súper antígenos, toxinas) resultarían en la activación y proliferación del sistema inmune.

Factor genético…

Factor ambientales…

Fisiopatología

EM: Fisiopatología

EM: Fisiopatología

The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.

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Factores genéticos y ambientales

Factores locales: infección viral, stress metabólico

Citoquinas proinflamatorias pueden aumentar la

expresión de moléculas en la superficie de LT y CPA

MBP, MOG, glicoproteína asociada a mielina, proteína proteolipídica,β- cristalina, fosfodiesterasas y S-100

Down-regulation

Injuria inmunológica mediada por Ac y activación del complementoInjuria mediada por células

Up-regulation

Injuria mediada por citoquinas

Digestión de Ag de superficie de mielina por macrófagos

Injuria directa de oligodendrocitos por CD8+ y CD4+

Axones desnudos

•Resolución de la rta inflamatoria

•Remielinización espontanea

•Propagación de los canales de Na de los nódulos de Ranvier

En algunas lesiones la presencia de inmunoglobulinas y activación del complemento sugieren que los Ac tienen un rol en el desarrollo de la lesión.

Se observa una distrofia primaria de los oligodendrocitos.

Finalmente, en otras lesiones un borde de oligodendrocitos necróticos se ven adyacentes al borde de la placa activa.

EM: Fisiopatología

The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.

EM: Fisiopatología

La placa es una zona bien demarcada caracterizada por la pérdida de mielina, con preservación del axón y formación de cicatrices astrociticas.

La injuria irreversible axonal y la escasa población de oligodendrocitos progenitores resulta en la pérdida progresiva de la función neurológica.

El marco patológico de la enfermedad es la PLACA DESMIELINIZADA

Manifestaciones clínicas

Debilidad de las extremidades

• Pérdida de fuerza• Fatiga• Descoordinación en los movimientos• Espasticidad

Neuritis óptica

• Disminución de la agudeza visual• Visión borrosa

Síntomas sensitivos

• Parestesias• Hiperestesia

Alteraciones cognitivas

• Pérdida de memoria a corto plazo, depresión• Falta de atención• Dificultad para resolver problemas • Lentificación del procesamiento de la información• Alteración del juicio• Labilidad emocional

Otros síntomas• Disfagia• Disartria• Disnea• Espasticidad • Disfunción sexual• Estreñimiento

EM: Patrones clínicos

Tiempo

Dis

capaci

dad

EM RECURRENTE-REMITENTE: 85%

EM SECUNDARIAMENTE PROGRESIVA: 50%

EM PRIMARIAMENTE PROGRESIVA: 10%

EM PROGRESIVA RECURRENTE: 5%

Diagnóstico

• Nuevos criterios para el diagnóstico de EM se han publicado como resultado de la formación de un comité internacional

• Objetivo: simplificar la clasificación y acortar el intervalo entre presentación y diagnóstico

• Se requiere la presencia de hallazgos clínicos y paraclínicos ( RMN, potenciales evocados y análisis del LCR)

EM: Diagnóstico

Arch Neurol. 2005;62:865-870

La RMN es sensible pero no específica para el diagnóstico de EM una cantidad de otras enfermedades pueden mimetizar con EM, ya sea clínicamente como a través de neuroimágenes.

Los Potenciales evocados no son específicos, ya que las anomalías en las respuestas provocadas ocurren en un gran número de enfermedades neurológicas que tienen alteradas las vías que se estudian (vías visuales, auditivas, somato sensitivas o motoras).

Los estudios en LCR tienen la ventaja de una mayor especificidad puesto que en población normal, no es frecuente hallar anormalidades de las inmunoglobulinas en este líquido biológico.

EM: Diagnóstico

Diagnóstico Diferencial de EM

INFECCIOSAS • Enfermedad de lyme• Sífilis meningovascular• Mielopatías por HIV o HTLV-1

AUTOINMUNES • LES • Sjögren• Sarcoidosis• Wegener

VASCULARES • Malformaciones vasculares de la espina dorsal• Vasculitis primaria

NEOPLASIAS • Linfomas o gliomas• Tumores de la espina dorsal• Síndrome paraneoplásicos

DEGENERATIVAS • Ataxia espinocerebelar

ENDOCRINAS/METABÓLICAS • Hipotiroidismo• Deficiencia de vit. E o B12

GENÉTICAS • Leuecodistrofia metacromática

Laboratorio

• Las proteínas totales en LCR es el indicador más sensible de patología en el SNC

• El rango normal de proteínas es de 15-45 mg/dl. Niños y añosos pueden tener rangos mayores

• Muchas enfermedades pueden aumentar la permeabilidad de la BHE llevando a un aumento de las proteínas

Estudio del LCR: Proteínas

Arch Neurol. 2005;62:865-870

Estas enfermedades incluyen:

Bacterianas, virales y otras formas de meningitis

Infiltración neoplásica de meninges

Tumores cerebrales y espinales

Polineuropatías

Hernia de disco

Infarto cerebral, hemorragias

La albúmina, al no ser sintetizada en el SNC, sirve como un indicador de referencia para monitorear permeabilidad.

La concentración de IgG debe tomar en consideración el

estado de la barrera, para poder distinguir entre aumentos por síntesis intratecal y pasaje de proteínas plasmáticas.

Arch Neurol. 2005;62:865-870

Estudio del LCR: Proteínas

Se recomienda el uso del cosciente Alb LCR/ Alb suero, en lugar de PT, para evaluar disfunción de la BHE.

Aspecto: Cristal de roca Leucocitos: normales ( Pleocitosis leve con predominio linfocitario) Glucosa: Normal Proteínas totales: Normal o liger. aumentado IgG LCR/IgG suero: elevada en el 90% de los casos

La respuesta inmune humoral a los antígenos de mielina se refleja en un aumento de la concentración de IgG y la síntesis de bandas oligoclonales(BO)

EM: Estudio del LCR

EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR

Presencia de BOC en LCR y no en suero, indica síntesis intratecal de IgG

No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC

Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG.

El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado

Condiciones que presentan BOC (+) en LCR:

Enfermedad Incidencia de BOC % Pruebas sugeridas

EM 98 RMN

PESS 100 Acs anti-sarampión

Neurosifilis 95 Acs anti-treponémica

Neuro-SIDA 80 Acs anti-HIV

Neuro-Lyme 80 Acs anti-borrelia

Neuro-LES 50 Factor antinuclear

Neuro-Behçet 20 C’3 PMN en LCR

Ataxia-telangiectasia 60 IgA sérica

Meningitis-uveítis de Harada 60 PCR sérica

Adrenoleucodistrofia 100 Ácidos grasos de cadena larga

Neuro-sarcoidosis < 5 Test de Kveim

Encefalitis aguda (<7 días) <5 Acs antivirales

Meningitis aguda (<7 días) <5 Lactato en LCR, PCR

Neoplasias <5 TAC

E. J. Thompsom, The National Hospital for Neurology y Nerusurgery Queen Square.

EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR

Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis intratecal de IgG

No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC

Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG

El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado

El valor de este cosciente en un LCR normal es 0.5

IgG LCR/ IgG suero Alb LCR/ Alb suero

Estudio del LCR: Indice IgG

EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR

Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis intratecal de IgG

No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC

Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG

El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado

EM: Toma de muestra

Se deben extraer 3-5 ml de LCR

Se debe tomar al mismo tiempo una muestra de sangre

Conservación de la muestra:

1 semana: 2 a 8 °C -20 °C

Las proteínas son separadas de acuerdo a su pI en un gradiente estable y continuo de pH

La carga de superficie de la molécula (anfotérica) se mantiene cambiando de acuerdo a su curva de titulación, hasta alcanzar una posición de equilibrio a lo largo del gradiente de pH

Esa posición de equilibrio la alcanza donde el pH es igual al pI de la molécula

Es decir, que en IEF las proteínas son continuamente desaceleradas hacia una zona de equilibrio donde la carga neta es cero( pH=pI)

Esta técnica requiere crear y mantener en el gel un gradiente continuo de pH, lo que se logra por el pasaje de la corriente eléctrica a través de una solución de compuestos anfotéricos, cuya característica principal es que tienen pI muy cercanos, abarcando un dado rango de pH

EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación

Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría. La concentración de IgG debe ser la misma en ambas

NO se debe concentrar el LCR

Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa para separar las proteínas

Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-IgG marcado con peroxidasa para detectar BOC de IgG

EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación

Concentración de IgG en LCR

LCR SUERO

> 20 mg/L Diluir para obtener una conc. de 20 mg/L de

IgG

Diluir para obtener una conc. de 20 mg/L de IgG

10-20 mg/L Sin diluir Diluir para obtener una conc. de IgG identica a la

del LCR

< 10 mg/L Diluir para obtener una conc. de IgG identica a la

del LCR

Similares concentraciones de IgG para suero y LCR nos aseguran corridas óptimas

EM: Preparación de las muestras

Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría. La concentración de IgG debe ser la misma en ambas

NO se debe concentrar el LCR

Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa para separar las proteínas

Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-IgG marcado con peroxidasa para detectar BOC de IgG

EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación

• Es una técnica de equilibrio y por lo tanto los resultados no dependen del modo de aplicación o del tiempo de operación

• Se mide un parámetro intrínseco fisicoquímico de la proteína (pI)

• Permite la resolución excelente de proteínas que difieren en 0.02 unidades de pH en sus pI, que pueden ser excelentemente separadas en bandas muy finas debido al efecto de focalizado

Ventajas

EM: Isoelectroenfoque

• Sólo sustancias anfotéricas pueden ser separadas

• Los anfolitos y los péptidos son reactivos a los mismos colorantes, por ello se deben usar coloraciones específicas

• Péptidos cortos no focalizan ya que son isoeléctricos en casi todo el rango de pH(4-8)

Limitaciones

EM: Isoelectroenfoque

Clin Chem 2000;48:1578

IEF/PAGE Tinción con plata vs IEF/Inmunofijación

Resultado PAGE/IEF con Tinción

Ag

IEF con Inmunofijación

Positivo verdadero 14 33

Falso positivo 12 2

Sensibilidad y especificidad de IEF para EM

Origen N° total de pacientes

N° total de pacientes con EM

Sensibilidad,%

Kostulas et al 1114 58 100

McLean et al 1007 82 95

Ohman et al 558 112 96

Especificidad %

Beer et al 189 98 87

Paolino et al 44 26 86

La presencia de BOC está fuertemente Relacionada (>95%) con EM

Clin Chem 2000;48:1578

Patrón 1: Normal (no BO en LCR ni en suero)

Patrón 2: Esclerosis Múltiple (si BO en LCR, no en suero)

Patrón 3: Enfermedad sistémica (algunas bandas en LCR y adicionales en concordancia con suero)

Patrón 4: Inflamación sistémica (patrón de bandas idéntico en LCR y suero)

Patrón 5: Gammopatía monoclonal (patrón monoclonal en espejo en LCR y suero)

Interpretación de IEF

Normal

IgG síntesis local

IgG síntesis local

Síntesis no local

Síntesis no localBanda monoclonal “splitted” en varias bandas en IEF

Interpretación de IEF5 PATRONES

La presencia de una banda solitaria en LCR debe ser interpretada en conjunto con hallazgos clínicos y en suero.

Su presencia está asociada a linfoma, pero también es observada en sujetos normales y no excluyen el diagnóstico de EM.

En series de pacientes seguidos por 6 años las dos terceras partes de los pacientes revertían el patrón, pero aproximadamente 1/3 desarrollaban una respuesta intratecal con diagnóstico de EM o síndromes desmielinizantes. Sin embargo, en la mayoría de los series la banda única es poco común.

Interpretación de una única banda en LCR

Ejemplos de los perfiles

Patrón 1

Patron 2

Síntesis localEM

Ejemplos de los perfiles

Monoclonalcomponente

Ejemplos de los perfiles

Patron 3

Síntesis sistémica+localPatrón « mayor que »

bandas adicionales

bandas adicionales

Patron 4

Bandas Idénticas« En espejo »

Ejemplos de los perfiles

Ejemplos de los perfiles

PATRON 5

Bandas Monoclonales

LCRSUERO

1 2 3 4 5 6 97 8

CN CPLCR SUERO

HYDRAGEL 9 ISOFOCUSING sebia

LCRSUERO

CONTROL DE CALIDAD

Control externo

Control interno

• Hay controles externos de calidad (CAP)

• Se utilizan como controles internos de calidad, las muestras mandadas por el CAP, también pueden ser usadas muestras de pacientes validadas clínicamente por un médico

CONTROL DE CALIDAD

Control externo

Control interno

• Hay controles externos de calidad (CAP)

• Se utilizan como controles internos de calidad, las muestras mandadas por el CAP, también pueden ser usadas muestras de pacientes validadas clínicamente por un médico

Conclusión

Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple

1- El análisis del LCR es una parte integral del diagnóstico de EM

2- El único análisis informativo es el establecimiento cualitativo de IgG en LCR, utilizando IEF seguido de una técnica de detección inmune( fijación o blotting). Esta es la técnica declarada “gold-standard” por la FDA

3- El análisis cualitativo debe ser realizado en LCR sin concentrar y debe ser comparado directamente con un suero corrido simultáneamente en el mismo ensayo

Arch Neurol. 2005;62:865-870

4- Corridas óptimas usan similares concentraciones de

IgG para suero y LCR

5- Controles positivos y negativos deben ser corridos en cada set de muestras y el gel debe ser desechado si no se ven bien las bandas en los controles

6- El informe del LCR debe ser realizado en términos de los 5 patrones reconocidos

Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple

Arch Neurol. 2005;62:865-870

7- La interpretación debe ser realizada por una persona experta en la técnica utilizada

8- Considerar una nueva punción en el caso de una alta sospecha clínica pero resultados negativos del LCR, o solo mostrando una banda

9- El análisis cuantitativo de IgG es un buen complemento informativo, pero no se considera un substituto al análisis cualitativo, el cual posee la más alta especificidad y sensibilidad

Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple

Arch Neurol. 2005;62:865-870

10- Cuando se realice el dosaje de IgG en LCR, fórmulas no lineales deben ser usadas para medir integridad de la BEH, midiendo la relación de albúmina en LCR/Albúmina en suero

11- Los laboratorios que realicen de rutina la búsqueda de Bandas Oligoclonales en LCR deben poseer controles internos y externos de calidad para asegurar un alto standard de confiabilidad y desempeño

Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple

Arch Neurol. 2005;62:865-870

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BIBLIOGRAFIA

MUCHAS GRACIAS….