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Estructura genética y fitogeografía de poblaciones colombianas de Lippia alba

(Mill.) N.E. Brown (Verbenaceae)

José Omar Cardona Montoya

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias, Escuela de posgrados en Ciencias Agrarias

Palmira, Colombia

2014

Estructura genética y fitogeografía de poblaciones colombianas de Lippia alba

(Mill.) N.E. Brown (Verbenaceae)

José Omar Cardona Montoya

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Doctor en Ciencias Agrarias Línea de investigación Mejoramiento Genético Vegetal

Director (a):

Director: PhD. Jaime Eduardo Muñoz Flórez

Co-director:

Joel Tupac Otero Ospina

Línea de investigación: Mejoramiento Genético Vegetal

Grupo de investigación en diversidad biológica

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias, Escuela de posgrados en Ciencias Agrarias

Palmira, Colombia

2014

A los PhD que hicieron posible este logro

El error es exclusivo de los que construyen, porque solo los que hacen se equivocan

Agradecimientos

El autor expresa su agradecimiento a(l): MSc. Paula Rugeles Silva PhD Jaime Eduardo Muñoz Flórez director de tesis. Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia por su aporte en recursos al proyecto. Grupo de investigación en diversidad biológica de la Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, e integrantes de los laboratorios de Biología molecular y Fitoquímica de la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira:

Resumen y Abstract IX

Resumen

Prontoalivio -Lippia alba, Verbenaceae- es un recurso fitogenético propio, promisorio por

sus entidades químicas bioactivas. Objetivo Principal: usar y sustentar marcadores que

combinen el significado adaptativo con la capacidad de discriminación entre individuos.

Se relacionaron variables climáticas de origen y de sitio de muestreo (ecomarcadores)

con marcadores genéticos (moleculares-RAM y fitoquímicos), usando SAS/STAT9.2,

DIVA-GIS5.2, WARDMLM y GenAlEx6.5. Los resultados mostraron la existencia de

variabilidad inter/intraespecífica y diferencias en el control genético para caracteres,

posiblemente adaptativos. La DG intrapoblacional (WP) fue significativamente mayor que

entre poblaciones (AP), detectando un proceso común el cual está estructurando las

poblaciones estudiadas. La prueba de diferenciación entre poblaciones mostró la menor

variación haplotípica entre poblaciones (Est.Var.AP=0,141) con remanente (95%)

distribuida dentro de la población (Est.Var.WP=2,46). El valor FST fue 0,054 (p<0,001),

indicando diferenciación genética pequeña entre regiones. La variabilidad química entre

poblaciones [AP=0.033] fue baja con un FST=0.023 P(rand≥data=0.070) y proporción 2%.

Los valores obtenidos de Fst muestra un estructura moderada entre las subpoblaciones

(FST=0.023 p≤0.07), sustentando el flujo génico mantenido por la especie en las dos

regiones estudiadas.

Palabras clave: estimativos de Comunalidad final-We, Patrones espaciales, diversidad

genética de Nei, variabilidad química, Estrategia WARDMLM.SAS, RAM

X Título de la tesis o trabajo de investigación

Abstract

Bushy Matgrass (Lippia alba, Verbenaceae) is a plant genetic resource itself, promising

for their bioactive chemical entities. Main Objective: use and support markers that

combine adaptive significance with the ability to discriminate between individuals.

Climatic variables source and sampling site (ecomarcadores) with genetic markers

(molecular-RAM and phytochemicals) were correlated using SAS/STAT9.2, DIVA-GIS5.2,

WARDMLM and GenAlEx6.5. The results show the existence of inter / intra variability and

differences in the genetic control characters, possibly adaptive. Intrapopulational DG

(WP) was significantly higher than among populations (AP), detecting a common process

which is structuring the populations studied. Differentiation test populations haplotype

showed the least variation among populations (Est.Var.AP = 0.141) with the remaining

(95%) distributed within the population (Est.Var.WP = 2.46). The FST value was 0.054 (p

<0.001), indicating little genetic differentiation between regions. The chemical variability

between populations [AP = 0.033] was low FST = 0.023 with P (rand ≥ data = 0.070) and

proportion 2%. The values of Fst shows a moderate structure among subpopulations

(FST = 0.023 p ≤ 0.07), supporting gene flow maintained by the species in the two

regions studied.

Keywords: Final estimates Commonality, Spatial patterns, Nei's genetic diversity,

chemical variability, Strategy WARDMLM.SAS, RAM

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ......................................................................................................................... IX

Lista de figuras ............................................................................................................. XIII

Lista de tablas .............................................................................................................. XV

Introducción .................................................................................................................. 17

1. Capítulo 1 ................................................................................................................ 21 1.1 Marcadores ecológicos tipificantes de morfotipos de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown en dos ecosistemas colombianos .................................................................. 21

1.1.1 Introducción ........................................................................................ 21 1.1.2 Metodología ........................................................................................ 24 1.1.3 Resultados .......................................................................................... 29

2. Capítulo 2 ................................................................................................................ 41 2.1 Diversidad molecular de accesiones colombianas de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown 41


3. Capítulo 3 ................................................................................................................ 65 3.1 Variabilidad fitoquímica entre accesiones colombianas de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown ............................................................................................................... 65


4. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 79 4.1 Conclusiones ................................................................................................. 79 4.2 Recomendaciones ......................................................................................... 83

A. Anexo A: matriz de factores de criterio para 40 variables ecoambientales tomadas en 59 accesiones colectadas en dos zonas ecológicas contrastantes BhT

y BsT .............................................................................................................................. 84

A. Anexo A: (Continuación)....................................................................................... 85

A. Anexo A: (Continuación)....................................................................................... 85

XII Título de la tesis o trabajo de investigación

A. Anexo A: (Continuación). ......................................................................................86

A. Anexo A: (Continuación). ......................................................................................87

C. Anexo C: lista de accesiones con datos de colecta .............................................92

D. Anexo D: frecuencias alélicas y genotípicas por cebador y por locus ...............95

E. Anexo E: bandas por individuo para siete cebadores RAM .............................. 111

E. Anexo E: (continuación) .......................................................................................... 121

F. Anexo F: matriz de distancias genéticas para a) región Chicamocha, b) región Sumapaz… ................................................................................................................... 124

G. Anexo G: protocolo usado para cualificación de metabolitos secundarios. Laboratorio fitoquímica Universidad Nacional-Palmira ............................................ 127

Bibliografía ................................................................................................................... 129

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág. Figura 1-1: Respuesta biológica de la planta, utilizable como biomarcador-bioindicador......…………...............................................……………………………………..23 Figura 1-2: Grupo de variables con valor de peso (Estimativos de Comunalidad Final-ECF), usadas por el procedimiento FACTOR para conformar la matriz de Marcadores Ecológicos-ME…………………………………..31 Figura 1-3: Dendograma generado por 11 factores considerados determinantes de la estructura ecológica de L. alba en dos regiones colombianas……..32 Figura 1-4: Autocorrelaciones para 14 Lags (=distancia entre clases) y residuales usando el modelo ARIMA AR(1)………………………………………………35 Figura 1-5: Variograma ajustado experimental, con valores: experimental teórico y robusto…………………………………………………………………………….…37 Figura 1-6: Semivariograma ajustado (línea) para la región Sumapaz…………….…38 Figura 1-7: Semivariograma experimental ajustado (línea). para la región Chicamocha……………………………………………………………….…..40 Figura 2-1: Patrón de bandas generadas por el cebador ACA_...................................51 Figura 2-2: Patrón de bandas generadas por el cebador CA_.....................................52 Figura 2-3: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) para 19 loci del cebador (RAM) ACA_.....................................................................................................................56 Figura 2-4: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 14 loci del cebador (RAM) AG_.........................................................................................................56 Figura 2-5: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 19 loci del cebador (RAM) CA_.........................................................................................................57 Figura 2-6: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 9 loci del cebador (RAM) CGA_.................................................................................................57

XIV Título de la tesis o trabajo de investigación

Figura 2-7: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 8 loci del cebador (RAM) CCA_.......................................................................................................58 Figura 2-8: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 11 loci del cebador (RAM) TG_...................................................................................................58 Figura 2-9: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 14 loci del cebador (RAM) GT_..........................................................................................................59 Figura 2-10: Diversidad genética promedio general (Hi=0,2467) y por cebador RAM en 59 accesiones de Lippia alba colectadas en dos zonas agroecológicas colombianas………………………………………………………………...60 Figura 2-11: Estructura jerárquica de dos poblaciones colombianas de L. alba con base en polimorfismos generados por siete cebadores RAM………………62 Figura 2-12: Región Chicamocha. Análisis de coordenadas principales-PCoA- basado en polimorfismos RAM y distancia genética de Nei&Li………………………….62 Figura 2-13: Región Sumapaz. Análisis de coordenadas principales-PCoA- basado en polimorfismos RAM y distancia genética de Nei&Li………………………….63 Figura 2-14: Estructura espacial combinada para las dos subpoblaciones (Chicamocha y Sumapaz)…………………………………………………………………..63 Figura 2-15: Estructura espacial para cada población, Chicamocha y Sumapaz……64 Figura 2-16: Correlograma (Omega=97.136) para la estructura espacial de la población Sumapaz, [0.001 P(Omega-rand≥Omega-data]………………………..64 Figura 2-17: Correlograma (Omega=28.488) para la estructura espacial de la población Chicamocha mostrando una población no estructurada……………….64 Figura 3-1: Biplot para presencia/ausencia de ms en 59 accesiones de Lippia alba…………………………………………………………………………………76 Figura 3-2: Grupos fitoquímicos con base en AFPM de SAS/STATv9.0 para datos netos de laboratorio……………………………………………………….…….77 Figura 3-3: Biplot para factores con valores de probabilidad máxima [FPM] de presencia de ms en 59 accesiones colombianas de Lippia alba…………………………………………………………………………………78 Figura 3-4: Clúster para presencia de siete metabolitos secundarios en una muestra de 59 accesiones colombianas de Lippia alba…………………………81

Contenido XV

Lista de tablas

Pág. Tabla 1-1: Autocorrelación espacial (Índices: Global de Moran y Geary)………………..28 Tabla 1-2: Varianza explicada por cada Factor, correspondiente al Valor Propio (o Eigenvalue) para variables………………………………………………….29 Tabla 1-3: Estimativo de Comunalidad Final-ECF- total y para variables……………… 30 Tabla 1-4: Salida (Output) de autocorrelaciones para 14 Lags…………………………….34 Tabla 1-5: Valores de los variogramas teórico y ajustado (robusto) para 14 observaciones…………………………………………………………………….…..36 Tabla 1-6: Índices y estimativos de diversidad……………………………………..……40 Tabla 2-1: Pasos del termociclador……………………………………………………..……47 Tabla 2-2: Parámetros (número efectivo de alelos-Ae y Heterocigocidad Esperada-He) y variables (Polimorfismos-Pj y alelos por locus)………………………………………………………………………… ….48 Tabla 2-3: Valores de Coeficiente de Simpson determinantes de la variabilidad genética………………………………………………………………… ….49 Tabla 2-4: Valores de diversidad genética intraespecífica…………………………… …..50 Tabla 2-5: Alelos únicos y alelos raros hallados en la muestra de 59 accesiones de L. alba colectadas en dos zonas (Chicamocha y Sumapaz-Colombia)…………… …53

Tabla 2-6: Estadígrafos para siete cebadores RAM para 59 colectas de L. alba…… ….55

Tabla 2-7: Número de loci, polimorfismos y valores de Diversidad Genética-DG………55

Tabla 2-8: Análisis molecular de varianza-AMOVA- y valor de FPT para 58 accesiones colombianas de L. alba………………………………………………………….61 Tabla 2-9: Valores porcentuales………………………………………………………………61

XVI Título de la tesis o trabajo de investigación

Tabla 3-1: Estimativos de Varianza [Est.Var.] para el tamizaje fitoquímico de 58 accesiones colombianas de L. alba, usando el Programa GenAlex v6.5…………72

Tabla 3-2: Número final de grupos y de individuos por grupo [Peso-Proporción] obtenidos con la estrategia WARDMLM.SAS………………………………………………73 Tabla 3-3: Proporción de individuos con valor [1] de presencia de siete tipos de

metabolito secundario en dos tipos de solvente, ordenados por tipo de solvente (a)

Cloroformo y (b) Etanol......................................................................................................74

Introducción

La biodiversidad de especies de plantas tropicales, junto con la diversidad química encontrada en cada individuo, lleva a la conclusión de que las especies tropicales son quizá la fuente más valiosa de nuevas entidades químicas bioactivas (Berier et al., s.f.). Determinando la diversidad genética, química, y por factores ambientales de la población colombiana de Lippia alba (Prontoalivio) y cuantificándola, es posible proponer planes y programas de conservación de la variabilidad actual y/o incrementarla (con regeneración por semilla, somaclonalmente, introducciones, otros), si es requerida. Los biomarcadores/bioindicadores ecológicos, con base en factores edafoclimáticas, índices y estimativos de diversidad; cumplen un rol definitivo en la valoración de comunidades y poblaciones de L. alba. El uso combinado de marcadores moleculares, fitoquímicos y ecológicos permitirá estructurar, con alto nivel de confiabilidad, la(s) población(es) actuale(s) de L. alba en Colombia. Este documento sustenta el diseño y uso de marcadores ecológicos que combinen el significado adaptativo con la capacidad de discriminación entre individuos. La tribu Verbenaceae se compone de los complejos: a) sensu Verbena/Glandularia con 170 especies, y b) Lantana/Lippia/Aloysia con 200–400 especies (Yuan et al., 2009). Inferencias filogenéticas sugieren a Suramérica como lugar de origen de las Verbenaceae con aproximadamente seis eventos de colonización, los cuales dieron origen a las especies presentes en el viejo mundo (Marx et al., 2010). El análisis filogenético realizado por Marx et al. (2010) mostró ocho clades reconocidos como tribus (Casselieae, Citharexyleae, Duranteae, Lantaneae, Nerosportoneae, Petreae, Priveae, Verbeneae). Lantaneae y Verbeneae forman un clade, con aproximadamente 2/3 de las especies en el clade Verbeneae. Marcadores Ecológicos-ME Son vectores con base en variables sintéticas (obtenidos como Componentes Principales-CP o Factores) de respuestas generadas a partir de tres componentes básicos: Biomarcadores, Bioinidicadores e indicadores ecológicos. Biomarcador: cualquier respuesta biológica frente a un factor ambiental al nivel sub-individual, medida dentro del organismo o en sus productos (pubescencia, espinas, ceras, aceites esenciales, etc.) indicando una alteración respecto a su estado normal que no puede ser detectado a partir del organismo en su conjunto. De este modo, los biomarcadores se restringen a determinaciones bioquímicas, fisiológicas, histológicas, morfológicas (incluyendo aspecto, pigmentación, malformaciones, etc.) del estado general excluyendo los efectos sobre el comportamiento (Kosakivska, 2008). De hecho, los patrones de adaptación fisiológica pueden ser clasificados dentro del tema de estrategias ecológicas (Boschker y Middelburg, 2002; Vestergaard et al., 2003; Shugart, 2006; Kosakivska, 2008). Bioindicador: es un organismo que aporta información sobre las condiciones ambientales de su hábitat mediante su presencia, ausencia y comportamiento. Los

18 Título de la tesis o trabajo de investigación

efectos fisiológicos no se incluyen en la definición de bioindicador (Boschker y Middelburg, 2002; Vestergaard et al., 2003; Shugart, 2006; Kosakivska, 2008). Indicador ecológico: trata parámetros que describen la estructura y la función de los ecosistemas: diversidad de especies, dinámica de poblaciones, cinética del ciclo de nutrientes, tasa de respiración/productividad, etc. (Shugart, 2006).

Diversidad genética y estructura de poblaciones naturales de Lippia spp. La estructura genética de poblaciones naturales del género Lippia spp. ha sido escasamente estudiada (Montanari et al., 2004; Viccini et al., 2004-2006; Dias et al., 2005-2006; Suárez et al., 2007-2008; Yamamoto et al., 2008; Martínez et al., 2008). Análisis previos utilizando marcadores RAPD fueron efectivos para comprender la diversidad genética de especies de Lippia spp. y contribuyeron a entender su adaptación al ambiente, conservación e implicaciones taxonómicas (Viccini et al., 2004; Pereira et al., 2006). Viccini et al., (2004), evaluaron el grado de diversidad genética en nueve especies de Lippia spp. (L. corymbosa, L. diamantinensis, L. filifolia, L. florida, L. hermannioides, L. lupulina, L. rotundifolia, L. rosella y L. sidoides) del sudoeste de Brasil. La distancia genética interespecífica promedio fue similar para todas las especies y más alta que las distancias intraespecíficas. Las especies con presencia limitada, mostraron diversidad interespecífica más baja. El dendograma por el método UPGMA mostró grupos mayores con una clara diferenciación entre especies (Viccini et al., 2004). En 2012, Santos et al., aislaron y caracterizaron ocho loci de microsatélites (SSR) polimórficos en dos poblaciones brasileras de Lippia alba, los cuales mostraron potencial informativo de moderado alto para estudios genéticos. Siete de ocho secuencias SSR revelaron múltiples bandas típicas de especies poliploides sugiriendo genomas tetraploides en Lippia alba. El índice de diversidad de Shannon (H) fueron 2.013 y 1.989, respectivamente. La heterocigocidad esperada (He) tuvo rango entre 0.407 y 0.718, con media de 0.564 para la población A; y de 0.234 a 0.704 con media 0.503 en la población B. Suárez et al. (2007) llevaron a cabo un estudio piloto en Lippia origanoides, L. alba, y L. citriodora para observar polimorfismos intra e inter-específicos en cuatro regiones del cpDNA, de ITS del ADN ribosomal y 50 loci ISSR. Tres de cuatro regiones del cpDNA (petA-psbE, tnrL-trnF and trnL intron) y la región ITS mostraron mayormente variación interespecífica. Diez y siete regiones ISSR de 50 loci analizados mostraron polimorfismos, inter e intraespecíficos. La divergencia de secuencias entre pares de especies en la región del plastidio, mostró rangos de 0.4% a 1%, mientras que la divergencia en secuencias de regiones ITS fue cerca del 5%. Los resultados obtenidos sugieren que las regiones ITS, tal como han sido reportadas para otros géneros de plantas, puede convertirse en una región de elección para estudios de genética de poblaciones en este tipo de especies. Los valores de diversidad genética descrita por Suárez et al. (2008) en Lippia origanoides (plantas alógama Verbenaceae relacionada) fueron: P=86.21%, para porcentaje de loci polimórficos; I=0.453, para índice de diversidad de Shannon; y HB=0.484 para Heterocigocidad panmitica promedio.

Variabilidad química de aceites esenciales en Lippia alba La composición química del aceite esencial de L. alba depende sensiblemente del origen geográfico de la planta, las condiciones de su cultivo, la edad y la parte de la planta empleada para la extracción, y de algunos otros factores geobotánicos (Stashenko et al.,

Capítulo 2 19

2003). La mayoría de estudios en L. alba son determinaciones genotípicas (Montanari et al., 2004; Viccini et al., 2004-2006; Dias et al., 2005-2006; Suárez et al., 2007-2008; Yamamoto et al., 2008; Martínez et al., 2008; Santos et al., 2012), caracterizaciones bioquímicas [quimiotipificación] (Fischer et al., 2004; Hennebelle et al., 2006) y de morfología externa (Montanari et al., 2004; Hennebelle, 2007). Individuos de L. alba de la región nororiental de Colombia mostró ser un quimiotipo nuevo, no descrito previamente en la literatura, conteniendo la carvona [40-57%] como componente mayoritario en los aceites, seguido de limoneno [24-37%], biciclosesquifelandreno [2-22%] piperitenona [1-2%], piperitona [0.8-1.2%] y el β-burboneno [0.6-1.5%]. El componente principal (en las fracciones volátiles) fue limoneno [27-77%], seguido por la carvona [14-30%], biciclosesquifelandreno [1-33%] y el β-burboneno [0.5-6.5%] (Stashenko et al., 2003). El análisis de aceites esenciales obtenidos de hojas de muestras de Guayana Francesa, Martinica y Guadalupe, mostraron siete quimiotipos diferentes (Hennebelle et al., 2006), existiendo una posible conexión entre quimiotipos y morfotipos (Hennebelle et al., 2006). La interacción GxE de 10 genotipos de cuatro composiciones químicas (quimiotipos) de L. alba de tres regiones del estado de Sao Paulo (SP), Brasil, tuvieron un rango amplio de producción de hoja, mientras que el rendimiento de aceites esencial tuvo una alta y uniforme determinación genotípica. Variación no cualitativa fue detectada para composición química, y la variación cuantitativa fue de baja magnitud. Genotipos Linalol y limoneno/la carvona fueron invariablemente más productivos para rendimiento de aceite que los genotipos citral y mirceno/canfor (Yamamoto et al., 2008). La variación de aceite esencial de Lippia junelliana de 16 sitios diferentes de medio oeste Argentino mostró ocho compuestos como componente importante en los aceites (Juliani et al., 2002). De acuerdo con estos componentes, cuatro quimiotipos silvestres se han detectado. El quimiotipo primero contenía altos niveles de ocimenone (54-76%) con cantidades más bajas de mirceno (10%). El segundo se componía de grandes cantidades de dihidrocarvona (59-80%). Los principales componentes se encuentran en la tercero, quimiotipo limoneno (10-40%) y piperitenona (10-40%) y la cuarta contenía quimiotipo limoneno (41%) y óxido de piperitenona (26%) (Riccardi et al., 2000; Juliani et al., 2002). Las especies de L. alba (Miller) N.E. Brown se caracteriza por una gran variabilidad en morfología y composición química del aceite esencial (Oliveira et al., 2006). Tavares et al. (2005), presentan datos sobre la variación cuantitativa de los principales componentes volátiles de la producción de linalol en un quimiotipo de L. alba. El contenido de [alpha]-pineno, (Z)-3-hexenilo y [alpha]-gurjunene fue mayor en plantas madre cultivadas en el suelo que en las plántulas crecieron en medio MS, mientras que el contenido de sabineno, mirceno, 1,8 -cineol y p-menta-l, 5,8-trieno fue menor. La adición de 0.2.3 μM de IAA en el medio fue significativamente mayor para sabineno y el contenido mirceno. La adición de 0,92 μM de cinetina aumentó significativamente el 3 (S) - (+)-nivel linalol (Tavares et al., 2005). En Colombia, Camargo y López (2008) y Palacio y López (2008) evaluaron la respuesta de L. alba a la disponibilidad de agua; y nitrógeno (Hernández et al., s.f.; Antolinez y López, 2008). Las variaciones cuantitativas de los principales componentes volátiles de la producción de linalol en quimiotipo L. alba están asociadas con factores nutricionales y ambientales (Hernández et al., s.f.; Tavares et al., 2005; Camargo y López, 2008; Palacio y López, 2008; Antolinez y López, 2008). La composición química y la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales en L. alba las investigó Oliveira et al. (2006) con en el fin de relacionarlas a sus usos tradicionales. El análisis de los aceites esenciales que permitió la identificación de dos especies de Lippia alba, una como quimiotipo mirceno-citral (15% y 37,1%,


respectivamente) y Lippia alba f. intermedia como un quimiotipo citral (22,1%). Los aceites esenciales de ambas especies fueron activos contra todos los microorganismos probados (bacterias y hongos) mediante el ensayo de halos de inhibición con rango desde 1,1 hasta 5,0 cm; probablemente debido a su alto contenido de monoterpenos oxigenados (51,0% y 40,1%, respectivamente), representada principalmente por aldehídos y alcoholes. Los datos químicos y farmacológicos de L. alba obtenido por Oliveira et al. (2006) estuvieron de acuerdo con la encuesta etnobotánica. En Colombia, EL Centro de Investigaciones en Biomoléculas-CIBIMOL- de la Universidad Industrial de Santander ha realizado entre otros, estudios valorativos en enfermedades tropicales, de bioactividad y principios activos de Lippia alba como antimicrobial (Bueno y Stashenko, 2009); antiviral [Ocazionez et al. (2010) en virus del dengue; Meneses et al., (2009) en virus de la fiebre amarilla], antifúngica (Mesa et al., 2009) en Candida y Aspergillus (Montiel et al., 2007), en bacterias [Bueno et al., (2009) en M. tuberculosis]; anti-protozoario (Escobar et al., 2010). Una lista completa de reportes la ubica en http://tux.uis.edu.co/quimica/ investigacion /centros/cibimol. La apuesta en la presente investigación fue determinar la estructura genética y fitogeográfica de Lippia alba de tal forma que permitiera una aproximación a la estructuración poblacional de la especie en Colombia. Esta se logró mediante: a. Marcadores ecológicos los cuales combinaron el significado adaptativo con la capacidad de discriminación entre individuos, b. Marcadores moleculares RAM, determinantes de la estructura y diversidad genética de la muestra de trabajo, y c. Estimativos de la variabilidad química de las 59 accesiones de Lippia alba incluidas en la prueba.

http://tux.uis.edu.co/quimica/%20investigacion%20/centros/cibimol

Capítulo 2 21

1. Capítulo 1

1.1 Marcadores ecológicos tipificantes de morfotipos de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown en dos ecosistemas colombianos

1.1.1 Introducción

Familia Verbenaceae. Comprende cerca de 1035 especies y 36 géneros con distribución pantrópica (Gupta et al., 2001; Dias et al., 2007; Lou-Nita Le Roux On: http://www. plantzafrica.com/index html). El género Lippia (Verbenaceae) incluye cerca de 200 especies la mayoría distribuidas en la región neotropical (Gupta et al., 2001; Jarvis et al., 2006; Suárez et al., 2007; Manica-Cattani et al., 2009), principalmente presente en las Antillas mayores (Hennebelle et al., 2006; 2007; 2008). De hecho, la zona geográfica de su origen es desconocido (En: http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs /html/taxon.pl?22367). Su área más probable de origen es de México a Argentina y en las Antillas. La especie se distribuye desde Norte América semiseptemtrional (Gupta et al., 2001), México, y por el Caribe (Haití, Cuba, República Dominicana, Jamaica e islas Leeward) hasta Argentina y la Amazonia, también se encuentra en Suráfrica, India (Gupta et al., 2001) y Australia. Se presenta en regiones secas de América Latina desde México hasta Paraguay, Brasil, Uruguay, Argentina y Colombia (Vit et al., 2002; Arango, 2004; UNCTAD, 2005). Lippia alba [prontoalivio (Colombia), erva-cidreira (Brasil), juanilama (Costa Rica), salvia morada (Argentina), bushy matgrass, Bushy Lippia Oaxaca lemon verbana, melissa] es una de las más importantes plantas medicinales usadas, entre otros, por pobladores brasileros (Castro et al., 2002; Zoghbi et al., 1998; UNCTAD, 2005). Es mayormente aprovechada por sus propiedades somáticas, sedativas, antidepresivas y analgésicas (Gupta et al., 2001; Schroeder et al., 2004; UNCTAD, 2005). El aceite esencial de L. alba tiene además usos como estomático, antiespasmódico, digestivo, anti-hemorroides y anti-asmático (Vit et al., 2002; Schroeder et al., 2004; UNCTAD, 2005) y en el control de insectos en granos almacenados (Gupta et al., 2001). Como sinónimos para L. alba (Mill.) N.E.Br. están: Lantana alba Mill., Lippia geminata Kunth., Lantana germinata (Kunth.) Spreng. (Seaforth y Tikasingh, s.f.). Lippia alba es una especie promisoria de importancia económica y con posible uso sustentable por calidad de sus aceites esenciales (Gupta et al., 2001). La potencialidad de este recurso ha sido valorado ampliamente por investigadores locales (Duque, 1985;

http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs


Duran et al., 2007; Linares, 2007; Martínez, 2008; Antolinez, 2008; Stashenko et al., 2004; Suárez et al., 2007) y extranjeros (Vieira y Skolupa, 1993; Vieira, 1999; Zoghbi et al., 1998; Gupta et al., 2001; Jaramillo y Manos, 2001; Castro et al., 2002; Fischer et al., 2004; Schroeder et al., 2004; Montanari, 2004; Viccini et al., 2004; Tavares et al., 2005; Dias et al., 2005; Zucchi et al., 2005; Hennebelle et al., 2006; Oliveira et al., 2006; Pereira et al., 2006; Ramalho et al., 2006; Dias et al., 2007; Hennebelle et al., 2007; Godínez y Volpato, 2008; Hennebelle et al., 2008; Yamamoto et al., 2008; Figueiredo et al., 2008; Manica et al., 2009; Sousa et al., 2009; Vera et al., 2010; Pierre et al., 2011).

Marcadores Ecológicos-ME. Son vectores con base en variables sintéticas (obtenidos como Componentes Principales-CP o Factores) de respuestas generadas a partir de tres componentes básicos: Biomarcadores, Bioindicadores e indicadores ecológicos. Biomarcador: cualquier respuesta biológica frente a un factor ambiental al nivel sub-individual, medida dentro del organismo o en sus productos (pubescencia, espinas, ceras, aceites esenciales, etc.) indicando una alteración respecto a su estado normal que no puede ser detectado a partir del organismo en su conjunto. De este modo, los biomarcadores se restringen a determinaciones bioquímicas, fisiológicas, histológicas, morfológicas (incluyendo aspecto, pigmentación, malformaciones, etc.) del estado general excluyendo los efectos sobre el comportamiento (Kosakivska, 2008). De hecho, los patrones de adaptación fisiológica pueden ser clasificados dentro del tema de estrategias ecológicas (Boschker y Middelburg, 2002; Vestergaard et al., 2003; Shugart, 2006; Kosakivska, 2008). Bioindicador: es un organismo que aporta información sobre las condiciones ambientales de su hábitat mediante su presencia, ausencia y comportamiento. Los efectos fisiológicos no se incluyen en la definición de bioindicador (Boschker y Middelburg, 2002; Vestergaard et al., 2003; Shugart, 2006; Kosakivska, 2008). Indicador ecológico: trata parámetros que describen la estructura y la función de los ecosistemas: diversidad de especies, dinámica de poblaciones, cinética del ciclo de nutrientes, tasa de respiración/productividad, etc. (Shugart, 2006). Biomarcadores-BM (respuestas biológicas). Entendido como medidas funcionales de exposición al estrés ambiental normalmente se expresan a niveles de organización biológica inferiores al de organismo (Shugart, 2006), son una variación xenobiótica en componentes o procesos estructurales o funcionales celulares o bioquímicos medibles en un sistema biológico o una muestra (Shugart, 2006). Los tiempos de respuesta y niveles de organización biológica (Figura 1-1) están directamente correlacionados para factores genéticos > bioquímicos > histopatológicos > inmunológicos > bioenergéticos. Estos pueden ser conformados mediante: (i) bioensayos (DL50, Bioacumulación), (ii) análisis bioquímicos (SPME), marcadores moleculares (RAPD, AFLP, otros posibles), (iii) análisis fisiológicos (Tasas e índices), (iv) pruebas genéticas (Aloenzimas, microsatélites), (v) respuesta inmunológica (ELISA), (vi) histopatología (neoplasmas), (vii) anormalidades morfológicas (asimetrías fluctuantes), (viii) comportamiento (actividad) y (ix) bioenergética (crecimiento, reproducción) (En: https://www.researchgate.net/publication/ 24147541Biomarkersinaquaticplantsselectionandutility). En estudios de ecología microbiana (rizósfera, filósfera) los biomarcadores pueden proveer información tanto microbiana (identificando microorganismos específicos) como de biomasa, en los que el marcador puede presentarse en cantidad detectable y relativamente constante en el organismo de interés. Para Boschker y Middelburg (2002) los biomarcadores son compuestos que tienen especificidad biológica en el sentido que son producidos únicamente por un limitado grupo de organismos. Vestergaard et al. (2003) han

https://www.researchgate.net/publication/%2024147541Biomarkersinaquaticplantsselectionandutility

https://www.researchgate.net/publication/%2024147541Biomarkersinaquaticplantsselectionandutility

Capítulo 2 23

implementado el uso de marcadores moleculares, celulares, genéticos y ecológicos para comprender la decoloración del coral en cuatro océanos del planeta. Bioindicadores-BI (indicadores biológicos). El principal objetivo del uso de los BI es permitir una comparación entre sitios dentro y entre polígonos, zonas agroecológicas y Zonobiomas. Un bioindicador comparativamente más alto, evidencia condiciones extremas o de estrés biótico o abiótico. Los Bioinidicadores son importantes (Doran y Parkin, 1994; Zhang y Zhang, 2009) ya que la expresión fenotípica (F=G+A+GA) y respuesta química de la biota a un ambiente está íntimamente influenciada por los factores bióticos y abióticos.

Figura 1-1: Respuesta biológica de la planta, utilizable como biomarcador-bioindicador. Fuente: https://www.researchgate.net/publication/24147541Biomar kersinaquaticplantsselectionandut ility.

Es importante identificar componentes que den respuesta rápida a cambios en el comportamiento de un individuo. Los Indicadores Biológicos-IB- o Bioindicadores muestran un gran potencial como tipificadores de un individuo, debido a su carácter integrador, y su mayor sensibilidad y velocidad de respuesta frente a cambios en el sistema. Con ello se consigue anticiparse a cambios y perturbaciones irreversibles que se pueden dar en ambiente dado, ya que éste no muestra su verdadero estado de degradación o cambio hasta que alcanza un nivel importante de afección (a diferencia del agua y el aire) (http://www.cricyt.edu.ar/ enciclopedia/terminos/Bioindic.htm). Para la Selección de los Bioindicadores se debe tener en cuenta: Tipo de estudio, se requiere de un BI de exposición o de efecto general o específico o su combinación, especie y velocidad de respuesta requerida (Vgr. Especies amenazadas).

https://www.researchgate.net/publication/24147541Biomar%20kersinaquaticplantsselectionandut%20ility

https://www.researchgate.net/publication/24147541Biomar%20kersinaquaticplantsselectionandut%20ility

http://www.cricyt.edu.ar/%20enciclopedia/terminos/Bioindic.htm


El presente caso de estudio requirió de un tipo adecuado de bioindicadores para evaluar

el efecto ambiental en la expresión-respuesta fenotípica y química de los individuos de L.

alba presentes en cada área de estudio. Actualmente, metodologías analíticas y

programas (software) especializados permiten crear Marcadores Ecológicos-ME- a partir

de Estimativos de Comunalidad. Con base en las hipótesis planteadas, el presente

estudio hace un análisis determinístico consistente en encontrar, usar y sustentar

(determinar) Marcadores Ecológicos que combinen el significado adaptativo con la

capacidad de discriminación entre individuos; en el presente caso fueron valorados los

contenidos de aceites esenciales-ae- marcadores RAM y factores ambientales, los cuales

se asumen, están implícitos en los indicadores de biodiversidad.

1.1.2 Metodología

El presente documento propone, usa y sustenta parámetros a considerar como

Marcadores Ecológicos-ME- a un solo nivel de organización biológica no usualmente

considerado en estudios de biomarcadores para evaluar el efecto ambiental sobre las

características, presencia y distribución en Colombia de la especie Lippia alba. Los

biomarcadores utilizados fueron: Bioquímicos. Siete metabolitos secundarios.

Moleculares. Expresión génica (alelos comunes a una población) a partir de marcadores

moleculares RAM, otros autores han usado AFLP y regiones ITS (Suárez et al., 2007).

Del suelo. El nitrógeno potencialmente mineralizable, pH, N, P y K extraíbles, capacidad

intercambio catiónico, granulometría, tipo de arcillas. Ambientales. Tmax. (Temperatura

Máxima), Tmin. (Temperatura Mínima), HR%, Presión (hPa), UV, DU; y zonificación

agroecológica (En: http://humboldt.org.co/using/ecosistemas /colombia/ ecosistemas.php.

Se propone el uso de marcadores ecológicos, dado que los biomarcadores ecológicos

definen/determinan cambios morfofisiológicos y en composición y contenido de

compuestos fitoquímicos mostrando respuestas por biodisponibilidad (exposición),

mecanismo de acción (efecto) y respuesta (susceptibilidad) detectados en plantas por

efectos antrópicos / antropogénicos (Ernst & Peterson, 1994; Ernst, 1999).

Los Biomarcadores-Bioindicadores tienen la capacidad de predecir cambios a niveles altos de complejidad biológica (población, comunidad, ecosistema), se han propuesto como herramientas de diagnóstico precoz de la salud del medio ambiente. Permite cuantificar cambios (bioquímicos, fisiológicos; respuestas histológicas, morfológicas y de comportamiento), a nivel individual o sub-individual asociados a la exposición a un factor de estrés biótico/abiótico (estrés climático, herbivoría, otros). Su principal valor radica en evidenciar efectos tempranos de un factor de estrés, situaciones extremas o simplemente contrastar valores de variabilidad biológica (Kurian et al., 2007; Pérez et al., 2008; Bozo et al., 2007). Zona de estudio. La selección de la zona de estudio se hizo con base en: a) una caracterización preliminar para seleccionar los Zonobiomas problema y los sitios de referencia. Colecta de datos históricos referentes a aspectos socioeconómicos y de parámetros ambientales (físicos químicos y biológicos y b) Se realizó un estudio piloto y/o búsqueda de reportes bibliográficos, estableciendo la línea base en función de datos

http://humboldt.org.co/using/ecosistemas%20/colombia/%20ecosistemas.php

Capítulo 2 25

existentes en la literatura; principalmente en relación a Lippia alba como potencial especie centinela y sus respuestas biológicas.

Características de la zona de estudio. La Región Andina,-las más representativa y

densamente poblada de Colombia,-contiene ~30000 especies de plantas vasculares relativamente desconocidas incluyendo subespecies endémicas, equivalente a >60% de las especies reportadas para Colombia e incluye especies reportadas en el borde étono amazónico. Las características más importantes de la región Andina es que más del 60% de los hábitats naturales originales de la Región han sido destruidos por la agricultura y el sobrepastoreo. Es la región con mayor intercambio y uso de biomasa y el mayor número de estudios y colectas de L. alba. Contiene el mayor número de Zonobiomas y agroecosistemas dentro de Zonobioma; incluyendo y los ecosistemas de Bs-T y Bh-T. Para efectos de selección de la Región de estudio, se consideraron los ecosistemas Bs-T y Bh-T, dado que los remanentes de Bs-T contienen familias de plantas similares a los hallados en Bh-T (IAVH, 1998).

Zonobioma Tropical Alterhídrico Bs-T colombiano. En Colombia el Bosque seco

Tropical se distribuía originalmente en las regiones de la llanura Caribe y valles interandinos de los ríos Magdalena y Cauca entre los 0 y 1000 metros de altitud y en jurisdicción de los departamentos del Valle del Cauca, Tolima, Huila, Cundinamarca, Antioquía, Sucre, Bolívar, Cesar, Magdalena, Atlántico y sur de la Guajira (IAVH, 1998). También se encontraban enclaves de menor extensión con esta vegetación en las Islas de San Andrés y Providencia, en la región norte de la península de la Guajira, Santa Marta (Magdalena), en Gamarra (Cesar), Cañón de río Chicamocha (Santander), Convención y Ocaña, alrededores de Cúcuta (Norte de Santander), Cañón del Dagua (Valle del Cauca), Villa Vieja (Huila) y Valle del río Patía (Cauca) (IAVH, 1998). Aunque no se dispone de información exacta de la extensión de la cobertura original del Bosque seco Tropical en Colombia, se estima que cubre la mayor parte de las todas las regiones y localidades anteriormente nombradas y las cuales abarcan una extensión de más de 8’146.000 hectáreas. Esta información fue generada a partir de mapas de formaciones vegetales de Colombia. Según la clasificación propuesta por Hernández (1990), para las condiciones de Colombia, el Bosque seco Tropical corresponde al zonobioma Tropical Alterhídrico que se desarrolla en tierras baja. Este zonobioma abarca siete provincias biogeográficas de acuerdo a la clasificación dada por Hernández et al. (1992) (IAVH, 1998).

Especie vegetal centinela=Lippia alba (En: www.monografias.com › Biología). En

teoría toda las taxas son Bioindicadores. Las características deseables son:

Especies con línea base de estudios previos e importancia económica o ecológica

Abundancia relativa de la especie no necesariamente diferente entre zonas agroecológicas. Debe ser tal que permita analizar la variabilidad sin provocar efectos deletéreos en la población. Uso de BI no destructivos

Características biológicas. Tipo de propagación, ciclo biológico etapas de desarrollo fenológico, otros posibles como estacionalidad.

Permanencia alta refleja las condiciones ambientales de su hábitat restringido. Se requiere conocer los patones de migración, mutación, deriva otros. Efecto fundador.

Requerimientos nutricionales y ambientales

Estado fisiológico. Nutricional hormonal y de contenidos de ms bioprotectantes.

http://www.google.com.co/url?url=http://www.monografias.com/Biologia/index.shtml&rct=j&sa=X&ei=i0nVTvSQH-bl0QGqqbDrAQ&ved=0CCoQ6QUoADAB&q=especies+centinella+biomarcadores+bioindicadores&usg=AFQjCNETLALXQYddMnvMiRNsywcJxE9u6w


Ecosistemas presentes en el sitio de muestreo Identificación del ecosistema a partir del sitio de muestreo localizado con GPS. La fuente de información de los ecosistemas se hace a partir de http://humboldt.org.co/using/ ecosistemas /colombia/ecosistemas.php. con datos homologados con los sistemas de clasificación de: Etter (1998), Hernández y Sánchez (1992), Holdrige (1957), Ideam (1996), Stutz et al., (1996) y UNESCO (1972). El libro de datos debe contener: Código del ecosistema y zonobioma al que pertenece, Nombre del ecosistema, Descripción (del ecosistema), Flora predominante y Bioma (En: http://humboldt.org.co/using/ ecosistemas /colombia/ ecosistemas.php. Bases de datos. Tres sub-matrices forman parte de la matriz general que conforma el libro de campo y laboratorio de accesiones de Lippia alba (de esta investigación).

1. Factores climáticos de sitios de colecta, variables físico-químicas de suelos y de ecosistemas Andinos colombianos,

2. Matriz binaria de presencia/ausencia de metabolitos secundarios-ms- por accesión,

3. Matriz binaria de presencia/ausencia de bandas de ADN de accesiones de L. alba a partir de marcadores RAM.

Universo/Población/Muestra. Para el estudio se dispuso de ~80 muestras, con al

menos dos replicaciones de individuos de L. alba colectados, que incluye afectados y no

afectados por herbivoría y/o enfermedades colectados en dos zonas ecológicas

contrastantes Bh-T. y Bs-T.; con base en mapas y polígonos de búsqueda usando el

método de Patrones Espaciales de Jarvis et. al., (2006). El muestreo incluye una base

con datos de campo conteniendo; datos del individuo, de localidad y muestras (botánica,

ADN, química y propagación). Para el muestreo se ha considerado: Listado de

marcadores, especificidad y sensibilidad del biomarcador, dificultad de muestreo, cinética

de la formación del biomarcador y estabilidad del biomarcador.

Metodología analítica usada. En cuanto a las metodologías analíticas habitualmente utilizadas en la cuantificación de estos (Biomarcadores) se destacan aquellos procedimientos que no implican tiempos de análisis muy largos. En general, toda propuesta metodológica generadora de información sustentable (En: http://www.berrilur. net/index.php?option=comcontent&view=article&id=17&Itemid=17) es válida. Los Marcadores Ecológicos fueron creados mediante Patrones Espaciales (Jarvis et al., 2007) usando los procedimientos: CLUSTER, TREE, PRINCOMP, MIXED, DISTANCE, ARIMA, VARIOGRAM y FACTOR de SAS/STATv9.2; y DIVA-GIS. El enfoque temporal (En: disi.unal.edu.co/~lctorress /PSist/ PenSis05.pdf), consistió en muestreo de los sitios una sola vez, determinando que factores pueden modular el Bioindicador-BI y amplificar o reducir las respuestas; mediante combinación de enfoque espacial y respuestas específicas. Si el BI muestra un patrón de variación continua que corresponda a gradientes hay una fuerte evidencia de relación causal (Altieri y Nicholls, 2007). La temporalidad (de algunas variables) fue ajustada usando el programa DIVA-GIS. Para el análisis de Componentes Principales-CP- se tomó como base la matriz de correlaciones dado que disponía de variables multi-escala. Para la selección de CP, se tomó el criterio de valor propio mayor a 1. De hecho, existen dos criterios de selección de CP; uno con base en la proporción de variabilidad expresada en la prueba con valores aceptables

http://humboldt.org.co/using/%20ecosistemas%20/colombia/ecosistemas.php

http://humboldt.org.co/using/%20ecosistemas%20/colombia/ecosistemas.php

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Capítulo 2 27

≥0.05; y a otra con base en el peso del valor propio (Eigenvalue) el cual debe ser ≥1. Las variables sintéticas (con base en la matriz de correlaciones) generadas por el análisis de CP, fueron usados por la estrategia WARD-MLM para la conformación final de grupos; así como también para los análisis con SAS/GI y, DIVA-GIS. Variables usadas para crear los Marcadores Ecológicos-ME. Las variables tomadas para generar los marcadores ecológicos fueron: 1) Edáficos. Materia orgánica del suelo, el nitrógeno potencialmente mineralizable, pH, N, P y K extraíbles, Capacidad intercambio catiónico, Granulometría, otros reportados en la metodología; 2) De localización. Región, altitud y coordenadas decimal norte/oeste (Georreferenciación); 3) Climáticos. HRmax/min, Temp. Max/Min. Velocidad del viento máx./min, hPa máx./min, UVmax/min, DUmax/min; 4) Ecosistema(s). Clasificación de zonas agroecológicas (Código, Nombre, Descripción, Bioma, modelo climático, cobertura vegetal) tomadas de: http://hermes. humboldt.org. co// ecosistemas /andes/ y DIVA-GIS. La matriz de datos de campo (del Anexo B) estuvo conformada por: 1) datos de localización (región, altitud, CDN y CDO), 2) ecosistemas (código, Bioma, modelo climático, cobertura vegetal), 3) datos de clima (Tmax/min, HRmax/min, Vel.Vient.max/min, hPamax/min, UVmax/min, DUmax/min) y 4) datos de suelo (pH, CO, N, Ca, K, Mg, Na Al, CCE, CIC, P Cu, Fe, Mn, Zn, B, Ar, L, A, Textura) y estimativos e índices de diversidad (Brillouin, Menhinick, Shannon, Simpson, Chao-1, Chao-2; Jacknife-1, Jacknife-2, ACE). Variograma para variables espaciales. Los semivariogramas experimentales se construyeron mediante el procedimiento ‘VARIOGRAM’ del paquete estadístico SAS (SAS-Institute, 2002). Variograma es la varianza menos la covarianza en función de la distancia entre dos puntos. El Variograma al estar definido únicamente por la varianza no tiene ninguna dependencia del tiempo; únicamente del incremento sobre la distancia en el espacio (h) de los puntos de medición. Es decir, el conocimiento del Variograma permite siempre evaluar la varianza del estimador. Esta condición es privilegiada cuando se analizan datos espaciales variados. El Variograma es la herramienta matemática usada tradicionalmente para representar, en este caso, la variabilidad ambiental de una medición. Los parámetros de los semivariogramas se muestran en la Tabla 1-6. Los semivariogramas teóricos fueron ajustados a los semivariogramas experimentales a través de la transformación logarítmica de las propiedades medidas, lo cual sugiere que este orden de magnitud es más apropiado que con los valores reales de las propiedades Con los variogramas ajustados a un modelo matemático (Santalla et. al., En: http:// www. secforestales.org/buscador/pdf/4CFE05-324.pdf), es posible elaborar mapas de gradiente continuo de ocupación para la especie. Estos (mapas) se obtienen con el método de Kriging (Olea, 1991), herramienta Geoestadística que utiliza la estructura espacial de los datos para estimar los valores de las variables en lugares no muestreados. Los estimadores de Kriging se caracterizan por generar una predicción insesgada donde la varianza del error de predicción es la mínima posible (En: http://www.secforestales.org/buscador/pdf/4CFE05-324.pdf). Índices de Moran (I)- y Geary (C). La herramienta Autocorrelación espacial (I de Moran global) mide la autocorrelación espacial basada en las ubicaciones y los valores de las entidades simultáneamente. Dado un conjunto de entidades y un atributo asociado, evalúa si el patrón expresado está agrupado, disperso o es aleatorio. La herramienta calcula el valor del Índice I de Moran y una puntuación z y un valor P para evaluar la significancia de ese índice. Los valores P son aproximaciones numéricas del área debajo

http://help.arcgis.com/es/arcgisdesktop/10.0/help/005p/005p0000000n000000.htm

http://help.arcgis.com/es/arcgisdesktop/10.0/help/005p/005p0000000n000000.htm

http://help.arcgis.com/es/arcgisdesktop/10.0/help/005p/005p00000006000000.htm

http://help.arcgis.com/es/arcgisdesktop/10.0/help/005p/005p00000006000000.htm


de la curva de una distribución conocida, limitada por la estadística de prueba (En: http://help.arcgis.com/es/arcgisdesktop/ 10.0/help/index. html#//005p0000000t000000). Ver Tabla 1-1. Autocorrelación (AE), Dependencia (DE) y Heterogeneidad Espacial (HE). La autocorrelación espacial (AE) es la concentración o dispersión de los valores de una variable en un mapa (Mur, 1992; Vilalta, 2004). Es decir, refleja el grado en que objetos en una unidad geográfica son similares a otros –objetos-- en unidades geográficas próximas. La dependencia espacial (DE) se produce cuando “el valor de la variable dependiente en una unidad espacial es parcialmente función del valor de la misma variable en unidades vecinas”. Esto significa que, la autocorrelación es sustantiva y no existe un factor de aleatoriedad. En el análisis de datos agregados geográficamente es frecuente encontrar que los valores de las variables estén autocorrelacionados espacialmente o sean espacialmente dependientes. En síntesis, la AE hace simultáneamente referencia a un fenómeno y técnica estadística y la DE a la explicación teórica (Vilalta, 2004). La HE se refiere a la variación de las relaciones entre las variables en el espacio. En términos teóricos, la heterogeneidad espacial se debe una variación real y substantiva que evidencia la existencia y la validez del contexto geográfico en la definición de un comportamiento social. Un ejemplo sería cuando la población de cierta clase social apoyara a un partido político en una ciudad o región, mientras que en otra ciudad o región la población de la misma o muy similar clase social apoyara a un partido opuesto. La HE se puede presentar debido a (1) simplemente un problema estadístico por consecuencia de la heterocedasticidad en un modelo de regresión, o bien (2) al igual que la DE por la existencia de una variación espacial sustantiva de la variable en cuestión; en este último caso igualmente el problema de la heterocedasticidad estará presente (Vilalta, 2004). Tabla 1-1: Autocorrelación espacial (Índices: global de Moran y Geary).

Geary Moran Interpretación

0<c<1 i>0 Existe autocorrelación, los datos están agrupados

c=1 i=0 Los datos están agrupados

c>1 i<0 Autocorrelación negativa

Diversidad de la especie. Se realiza usando GIS Arc-View 3.2 sobre los mapas continuos obtenidos para la especie en aplicación de los variogramas. Se entiende por diversidad (de la especie) la cuantificación numérica del grado de riqueza y abundancia de una especie en un territorio. Para el cálculo se usó el índice de: Brillouin, Menhinick, Shannon, Simpson; y los estimativos: Chao-1, Chao-2; Jacknife-1, Jacknife-2, ACE, usando DIVA-GIS. Características del producto. El Estimativo Final de Comunalidad-EFC (o Estimativos de Comunalidad Final-ECF) es la suma de cuadrados promedio de n factores de criterio Ecuación 1-1. La estrategia: -Transforma variables heterogéneas en (otras) continuas neutras, -Genera un valor (de peso) diferencial a cada incluida en el análisis y -Calcula ECF o EFC total y por variable de respuesta. A mayor número de variables, menor número de Factores de criterio.

EFC=1/nFactores *Σ Factori2 (1-1)

http://help.arcgis.com/es/arcgisdesktop/%2010.0/help/

Capítulo 2 29

1.1.3 Resultados

Análisis de Componentes Principales-ACP conformante de la matriz de Marcadores Ecológicos-ME.

Once vectores propios (Eigenvectors) con valor propio (Eigenvalue) ≥1 permitieron ecotipificar los 59 morfotipos de Lippia alba conformantes de la muestra final de trabajo. Los valores propios generados por el análisis mostraron 11 Componentes Principales-CP-explicando el 87.56% de la varianza total hallada en la muestra de trabajo. La varianza explicada por cada factor estuvo en el rango 1.08- 15.08 (Tabla 1-2). Los Estimativos de Comunalidad final variaron entre 0.55 y 0.99 y el valor final fue 42.9 (Tabla 1-2). Los R2 de las variables con cada Factor lograron el valor máximo de 1. Los coeficientes estimados por regresión, los valores de R2 de las variables con cada Factor y los respectivos coeficientes estandarizados para cada variable dentro de cada Factor se muestran en el Anexo A. La varianza explicada por cada factor o varianza del factor, expresado como la proporción entre la suma de cuadrados de los pesos de cada factor y el número de Factores, se muestran en la Tabla 1-2.

Tabla 1-2: Varianza explicada por cada Factor, correspondiente al Valor Propio (o Eigenvalue) para cada variable incluida en la prueba.

Eigenvalue Difference Proportion Cumulative

1 15.0850356 9.2837434 0.3079 0.3079

2 5.8012922 1.4231263 0.1184 0.4263

3 4.3781659 0.5384658 0.0894 0.5156

4 3.8397002 0.2952782 0.0784 0.5940

5 3.5444219 0.7541372 0.0723 0.6663

6 2.7902847 0.8761632 0.0569 0.7232

7 1.9141216 0.3145248 0.0391 0.7623

8 1.5995967 0.1197086 0.0326 0.7950

9 1.4798882 0.0944603 0.0302 0.8252

10 1.3854279 0.2993993 0.0283 0.8534

11 1.0860286 0.1579186 0.0222 0.8756

Cuarenta de 46 variables fueron retenidas por los 11 Factores para crear los marcadores ecológicos (Tabla 1-2 y Figura 1-2). Los valores de Comunalidad Final permite la conformación de al menos tres grupos de variables: uno de 0.90 a 1.0, otro de 0.81 a 0.899 y un tercero de 0.53 a 0.798. Región y los índices y estimativos de diversidad destacaron los valores más altos. Las únicas variables agrupadas fueron las de diversidad. Las demás variables estuvieron repartidas por todo el rango. Zn, Mn, Na y Cu y Textura destacan por sus valores más bajos de 0.7. Las demás variables tuvieron valores entre 0.8 y 0.977 (Tabla 1-3).


La Tabla 1-3 y la Figura 1-2 presentan las comunalidades obtenidas para cada una de las variables. Variables con valores altos de comunalidad >0.90, explican en mayor proporción la varianza según su participación en los factores o componentes resultantes en el análisis, mientras que variables que presenten valores bajos (< 0.60) participan en menor medida en la explicación de dicha varianza. Los criterios de clasificación de los valores de comunalidad son arbitrarios y su rango de escala debe sustentarse. Aquí, proponemos tres grupos. Tabla 1-3: Estimativo de Comunalidad Final-ECF- total y para variables.

No. Variable EFC

(ECF) No. Variable

EFC (ECF)

1 Región (Sumapaz-Chicamocha) 0.9977 8 Cobertura vegetal 0.9077

42 Índice de Margalef 0.9977 38 Ar=contenido de arcilla en suelo

0.8985

44 Índice de Shannon 0.9977 31 CIC=Capacidad de intercambio catiónico

0.8954

45 Índice de Simpson 0.9977 15 hPa máx.=Presión atmosférica máxima

0.8856

46 Índice de Brillouin 0.9977 6 Bioma=Tipo de bioma 0.8831

47 Estimativo de Chao-1 0.9977 16 hPa min= Presión atmosférica mínima

0.8823

48 Estimativo de Chao-2 0.9977 7 Modelo climático 0.8782

49 Estimativo de Jacknife-1 0.9977 27 Mg=contenido de magnesio en suelo

0.8676

50 Estimativo de Jacknife-2 0.9977 37 B=contenido de boro en suelo

0.8622

43 Estimativo de Menhinick 0.9973 9 Temp. Máx.=Temperatura ambiental máxima

0.8539

3 CDN=Coordenada Decimal Norte

0.9922 26 K=contenido de potasio en suelo

0.8368

4 CDO=Coordenada Decimal Oeste

0.9858 22 pH= acidez del suelo 0.8097

30 CICE=Capacidad de Intercambio efectivo de cationes en suelo

0.9548 2 Altitud= altitud sobre el nivel del mar

0.7979

24 Nitrógeno 0.9449 29 Al=contenido de Aluminio en suelo

0.7963

40 Arena 0.9418 20 Du min.=Columna de ozono mínima

0.7793

23 CO=Carbono orgánico 0.9361 39 L=fracción de limo 0.7793

12 HR min=Humedad relativa mínima

0.9338 34 Fe=fracción de hierro en suelo

0.77

5 Código de clima 0.9313 32 P=fracción de fósforo en suelo

0.7495

25 Ca=Calcio en suelo 0.9236 14 Vel.Viento min. 0.7067

10 Temp. Min=Temperatura mínima 0.9231 36 Zn=fracción de cinc 0.6784

18 UV min=Radiación ultravioleta 0.9207 35 Mn=fracción de manganeso 0.6424

13 Vel. Viento máx.=Velocidad del viento máxima

0.9195 41 Textura=textura de la muestra de suelo

0.6365

11 HR máx.=Humedad relativa máxima

0.9168 28 Na=fracción de sodio en suelo

0.5514

17 UV máx.=Radiación ultravioleta máxima

0.9147 33 Cu=fracción de cobre en suelo

0.5301

19 DU máx.=Columna de ozono máxima

0.9081

Capítulo 2 31

Figura 1-2: Grupo de variables con valor de peso (Estimativos de Comunalidad Final-ECF), usadas por el procedimiento FACTOR para conformar la matriz de Marcadores Ecológicos-ME.

Matrices de Marcadores Ecológicos-ME. Los Anexos A y B muestran las matrices de ME agrupado con base en Vectores Propios (Eigenvalue) y Factores. Los valores fueron estimados usando el procedimiento FACTOR de SAS/STATv9.2; y las variables con una solo tipo de respuesta reportadas por el LOG, fueron eliminadas del editor para maximizar la potencia del análisis. Los valores de la tabla representan el peso de cada variable dentro del factor. En síntesis, estas dos matrices representan la línea base (de datos) de los Marcadores Ecológicos. Agrupamiento. La Figura 1-3 muestra el agrupamiento generado por los 11 Factores. Se usó el Método Ward (Ward, 1963; Franco et al., 2010) con el procedimiento Cluster de SAS/STATv9.2. Dos grandes grupos conforman el conglomerado final. Agrupamiento por variables ambientales; faltando agregar las variables derivadas de los marcadores genéticos (moleculares y fitoquímicos). Aparecen dos grandes grupos con accesiones intercaladas de las dos regiones. No hay una separación por región. Hay accesiones muy cercanas entre si y otras muy distantes, un indicador de variabilidad entre accesiones. Se sustenta el método Ward (Hu et al., 2000; Grun & Atieno, 2007) ya que este forma parte de la estrategia WARD-MLM de Franco et al. (2007; 2010) usado para la conformación final de grupos (Franco et al., 2010). Adicionalmente los agrupamientos conformados por la metodología, están más cerca de la realidad, ya que los individuos están muy relacionados ya que su distribución en Colombia es de carácter antropológico por madres y abuelas quienes lo han distribuido y llevado a casi todas las regiones colombianas. Se

EFC (ECF)


denotan máximo cuatro subgrupos, los cuales deben ser coincidentes con los agrupamientos generados por los factores genéticos (moleculares y fitoquímicos) y por la gran matriz final que incluye todos los marcadores. Figura 1-3: Dendograma generado por 11 factores considerados determinantes de la estructura ecológica de L. alba en dos regiones colombianas.

Discusión principal Un número relativamente pequeño de Factores (11 de 40), explicaron la variabilidad presente en la muestra de trabajo. Todas las variables ambientales acompañantes de cada accesión (datos crudos) fueron traducidas a variables sintéticas (Factores), dado su neutralidad y carácter cuantitativo continuo, lo cual optimiza los procedimientos de clasificación. Se usaron dos vías de análisis los procedimientos PRINCOMP y FACTOR de SASv9, estimado CP y Factores respectivamente, con base en matrices de correlaciones (para datos multiunidades) y con matrices de varianza-covarianza para datos con igual unidad de medición. Las pruebas de calidad para la metodología analítica usadas sustentan la calidad del procedimiento empleado (potencia de la prueba). Para mayor confiabilidad de los datos climáticos, los valores máximos y mínimos fueron ajustados usando el paquete DIVA-GIS. La matriz resultante fue usada por la estrategia WARD-MLM/SAS-STATv9.2 para conformar los posibles grupos. La salida (output) del ACP del Anexo A reporta la matriz de Factores (Factor Pattern) y la varianza explicada por cada Factor de criterio. Respecto al número de variables efectivas, teóricamente se espera un numero bajo de variables predictoras pobres. Con excepción del valor para Sodio y Cobre en suelo, las proporciones presentadas por cada variable, no son valores críticos pues están por encima de 0.50. El análisis sugiere buscar nuevas variables y probar su efectividad. Las variables pobremente explicadas (por los 11 factores) debe ser sustituidas por otras más potentes o simplemente excluirlas de futuras pruebas. Y las variables potentes, pueden

Capítulo 2 33

conformar a futuro el grupo de variables canónicas. Los análisis canónicos, no incluidos en este estudio, son determinantes de variables predictoras potentes. Los valores reportados para variables climáticas fueron ajustados en espacio y tiempo usando DIVA-GIS. Muchas otras variables ambientales pueden conformar la matriz de marcadores ecológicos; de hecho, es importante incluir variables de tipo fisiológico, microbiológico de suelo, de fauna y demás posibles. Para estas (nuevas variables), los análisis de CP las valoran y define su inclusión/exclusión como marcadores ecológicos. Los factores obtenidos en la prueba son válidos dado que están compuestos por valores propios acorde a la cantidad y calidad del vector propio resultante.

Los estimativos de comunalidad final explican la variabilidad de una variable X dentro del grupo de Factores comunes. Por tanto, sus valores oscilarán entre cero y uno, es decir, entre la posibilidad de que los factores comunes no expliquen nada de la variabilidad de una variable o que por el contrario ésta quede totalmente explicada por los factores comunes. Los Criterios de selección de número de

Factores se explican en la metodología. Patrones de variación espacial de L. alba Autocorrelación-AE, Dependencia-DE- y Heterogeneidad Espacial-HE Índices Ecológicos-IE. El coeficiente I de Morán-AE- para todas las observaciones mostró un patrón espacial completamente aleatorio con una muy leve tendencia a la dispersión (I=-0.0086799 y Neihborg Lag Distance=0.2798). En cada unidad geográfica (o región) el I de Morán (AE) mostró patrones completamente aleatorios con una muy leve tendencia a la concentración (I=0.020662478) en la Región del Sumapaz; y tendencia muy leve a la dispersión (I=-0.0042829) en (la Región del) Chicamocha. Los procedimientos VARIOGRAM y ARIMA de SAS/STATv9.2 de las Figuras 1-4 y 1-5 muestran los valores de autocorrelación, verificando el patrón completamente aleatorio del Índice Morán (0.0086799) e índice de Geary (1.19833). Tabla 1-4. Discusión. Para la estadística I de Moran, la hipótesis nula establece que el atributo que se analiza está distribuido en forma aleatoria entre las entidades del área de estudio. Es decir, los procesos espaciales que promueven el patrón de valores observado constituyen una opción aleatoria.


Tabla 1-4: Salida (output) de autocorrelaciones para 14 Lags (=distancia entre clases) y residuales usando el modelo ARIMA AR(1).

Lag Covariance Correlation -1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Std Error

0 1.942956 1.00000 | |***********************| 0.000000

1 0.528674 0.27210 | . |***** | 0.130189

2 0.027139 0.01397 | . | . | 0.139495

3 -0.044471 -.02289 | . | . | 0.139519

4 0.081036 0.04171 | . |* . | 0.139582

5 0.210145 0.10816 | . |** . | 0.139794

6 0.231860 0.11933 | . |** . | 0.141205

7 0.244222 0.12570 | . |*** . | 0.142904

8 -0.090658 -.04666 | . *| . | 0.144766

9 0.102379 0.05269 | . |* . | 0.145020

10 0.057306 0.02949 | . |* . | 0.145344

11 0.314054 0.16164 | . |*** . | 0.145446

12 0.074161 0.03817 | . |* . | 0.148459

13 0.199074 0.10246 | . |** . | 0.148625

14 -0.023888 -.01229 | . | . | 0.149818

Autocorrelation Check for White Noise

To Chi- Pr >

Lag Square DF ChiSq --------------------Autocorrelations--------------------

6 6.50 6 0.3695 0.272 0.014 -0.023 0.042 0.108 0.119 12 10.08 12 0.6088 0.126 -0.047 0.053 0.029 0.162 0.038

Maximum Likelihood Estimation

Standard Approx

Parameter Estimate Error t Value Pr > |t| Lag

MU 2.04177 0.30719 6.65 <.0001 0 AR1,1 0.43659 0.15887 2.75 0.0060 1

Capítulo 2 35

Figura 1-4: Autocorrelaciones para 14 Lags (=distancia entre clases) y residuales usando el modelo ARIMA AR(1).

Discusión Cada colecta mostró valores residuales puntuales individuales (Figura 1-4). Alrededor del 90% de las observaciones están dentro del rango de no diferencias entre ellas para los marcadores ecológicos con diferencias no significativas o dentro de un rango normal aceptable (UCL=3.02/LCL=2.93). Las observaciones cercanas a los límites superior e inferior indican la presencia de al menos 4 observaciones con características muy particulares. Este resultado demuestra una variabilidad ecológica relativamente baja pero significativa; la cual puede verificarse determinando índices ecológicos los cuales sustentarán los resultados del presente análisis. Usando información ecológica y geográfica es posible predecir patrones explicando la estructura genética espacial de poblaciones naturales. Los procedimientos Variogram y Kriging reportan patrones completamente aleatorios (SAS/STATv9.2). Existe autocorrelación cuando los valores de objetos cercanamente geográficos son más similares que los objetos lejanos. Por ejemplo, una cuadrícula de altitud tiene una elevada autocorrelación espacial. La opción de autocorrelación en DIVA-GIS calcula esta relación mediante el uso de dos estadísticas comunes, Geary y Moran. Se puede calcular la autocorrelación de un archivo de cuadrículas o de un archivo de puntos (DIVA-GIS Manual, 2004 En: www.diva-gis.org/docs/DIVA-GIS5_manual.pdf.). La funcionalidad de autocorrelación espacial implementada en DIVA-GIS está basada en el software “Rookcase” creado por Sawada (1999). El conocimiento de la estructura del patrón espacial en una población es de gran utilidad para la formulación de los modelos ajustados de análisis espacial (Zas et al., 2008). En estudios genéticos poblacionales, los efectos de la autocorrelación espacial afectan la estimación de los componentes de varianza y parámetros genéticos derivados. La

- 5 . 0

- 2 . 5

0

2 . 5

5 . 0

7 . 5

X= . 0 4

UCL = 3 . 0 2

L CL = - 2 . 9 3

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

R

e

s

i

d

u

a

l

F

o

r

e

c

a

s

t

Ob s e r v a c i o n

3 L i mi t s

F o r n = 1 :


gravedad de estos efectos varía en función de la intensidad y escala del patrón espacial (Zas et al., 2008). Estructura espacial de la variación genética de la muestra de L. alba La estructura espacial de la variación genética de la muestra de L. alba en Colombia se muestra en la Figura 1-5. Se presenta su estructura espacial con base en 40 variables ambientales tomadas en 59 accesiones de Lippia alba en dos regiones colombianas (Sumapaz o Región 0 y Chicamocha o Región 1). La estructura espacial se analizó a partir de los semivariogramas residuales, los cuales sintetizan la dependencia espacial de los residuos del modelo estadístico, mediante la representación de la variación de la similitud entre individuos (o accesiones) en función de distancias conocidas (Tabla 1-5). Tabla 1-5: Salida (output) original de valores de los variogramas teórico y ajustado (robusto) para 14 observaciones.

Lag Class Value(in number of Average Lag)

Observación Units Class Distance for class

Variogram Robust

Variogram

1 1 59 0.00000 0.00000 0.00000

2 0 39 0.00656 0.27378 0.18000

3 1 71 0.02826 0.59868 0.32153

4 2 54 0.06142 1,08926 0.75056

5 3 69 0.09173 1,096653 1,34748

6 4 94 0.11954 0.47256 0.35351

7 5 50 0.15111 1,48825 0.86429

8 6 60 0.18182 0.57958 0.61786

9 7 61 0.21094 0.70233 0.55948

10 8 38 0.23914 0.70327 0.40211

11 9 35 0.27190 0.93320 0.74633

12 10 39 0.30351 1,82804 1,22908

13 11 43 0.33079 0.83882 0.66747

14 12 22 0.35944 3,22711 2,06658

Capítulo 2 37

Figura 1-5: Variograma ajustado experimental, con valores: experimental teórico y robusto.

Los rangos (distancias) son similares para todas las localidades, dentro del tamaño modal de las áreas de estudio. Esto destaca la importancia de los suelos, el cual es normalmente homogéneo dentro de una serie de suelos: la variabilidad espacial de los sitios de muestreo es dependiente del espacio dentro de los límites de la fuente de variación identificada en este caso como es el tipo de suelo. Entre regiones, el patrón de variación espacial es demasiado complejo, hasta el punto de no encontrarse correlación espacial entre los puntos y las distancias muestreadas. Sus semivariogramas experimentales fueron ajustados al semivariograma esférico el cual ajusta mejor los datos a distancias relativamente cortas entre 200 y 400 metros aproximadamente, los cuales corresponden con los rangos ajustados de los semivariogramas de la tabla 1. Aunque estas distancias son más cortas que la máxima distancia muestreada (1000 m) es posible que la variabilidad espacial a distancias cortas haya sido subestimada.

Los bajos valores de pepita nos indican que una fracción de la varianza ha sido detectada por el modelo, debido a errores de medida. El análisis del Variograma permitió estimar las distancias óptimas de muestreo para las propiedades medidas tanto en la Región 0 como en la Región 1, ver Tabla 2. Los variogramas muestran la relación entre la varianza del conjunto de medidas a cada distancia medida y la distancia de muestreo. El cambio de la varianza de una distancia (nivel de muestreo) a otra nos indica la distancia de muestreo más eficiente (distancia óptima de muestreo). Región 0 (Sumapaz)

La distancia del Rango o Alcance a0 fue 0.302, el patrón Nuggets o efecto pepita (cn=0.15) fue pequeño, la varianza del parche (co) y la varianza total fueron 1.80 y 1.95


respectivamente. En la Figura 1-6 se muestran los tres parámetros que caracterizan la estructura espacial: el rango (ao=0.3005) que es la distancia a la que se pierde la dependencia espacial e indica la escala del patrón, el Nuggets (cn) o semivarianza a distancia cero que representa la varianza debida a errores de muestreo y/o ocasionada por la dependencia espacial a escalas inferiores a las muestreadas, y la varianza del parche (co) que refleja la intensidad de la dependencia espacial. La asíntota o sill (cn+co) es un estimador de la varianza total de la variable. La intensidad del patrón espacial viene dada por el cociente entre la varianza del parche y la asíntota (co/(co+cn))= 0.92307692. Figura 1-6: Semivariograma ajustado (línea). Se indican los tres parámetros caracterizantes de la estructura espacial: el rango (ao=0.305); nugget (cn); Varianza mayor (co) y la intensidad del patrón espacial Sill= (cn+co) o varianza total, para la región Sumapaz.

Discusión. Para la Región del Sumapaz o Región 0, el Variograma sugiere que los puntos (de registro) separados por distancias cortas están correlacionados y la correlación decrece a medida que la distancia entre puntos se incrementa. Esto puede verse en el incremento en el Variograma hasta una distancia residual cercana a 0.3005. En el presente estudio las variables (incluida en la prueba) están correlacionadas espacialmente, debido a que el Variograma aparece decreciente a lo largo de las distancias residuales (Lag) posterior al Rango a0, indicando una variabilidad espacial alta. Región 1 (Chicamocha) La distancia a0 fue 0.2, el patrón nugget (cn=0.1) fue pequeño, la varianza de parche (co) fue de 0.3 y la varianza total de 0.4. En la Figura 1-7 se muestran los tres parámetros que caracterizan la estructura espacial: el rango (ao=0.68) que es la distancia a la que se pierde la dependencia espacial e indica la escala del patrón, el nugget (cn) o semivarianza a distancia cero que representa la varianza debida a errores de muestreo y/o ocasionada por la dependencia espacial a escalas inferiores a las muestreadas, y la varianza del parche (co) que refleja la intensidad de la dependencia espacial. La asíntota o sill (cn+co) es un estimador de la varianza total de la variable. La intensidad del patrón

Pr i n c i p a l Co mp o n e n t An a l y s i s

Va r i o g r a m

0 . 1

0 . 2

0 . 3

0 . 4

0 . 5

0 . 6

0 . 7

0 . 8

0 . 9

1 . 0

1 . 1

1 . 2

1 . 3

1 . 4

1 . 5

1 . 6

1 . 7

1 . 8

1 . 9

2 . 0

Av e r a g e L a g Di s t a n c e f o r Cl a s s

0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 1 0 0 . 1 2 0 . 1 4 0 . 1 6 0 . 1 8 0 . 2 0 0 . 2 2 0 . 2 4 0 . 2 6 0 . 2 8 0 . 3 0 0 . 3 2 0 . 3 4 0 . 3 6 0 . 3 8 0 . 4 0 0 . 4 2 0 . 4 4 0 . 4 6 0 . 4 8

Rango

a0

Nugget

cn

Varianza del parche

co Sill

(cn+co)

Capítulo 2 39

espacial dada por la relación entre la varianza del parche y la asíntota (co/(co+cn)) fue igual a 0.75. Figura 1-7: Semivariograma experimental ajustado (línea). Se indican los tres parámetros caracterizantes de la estructura espacial: el rango (ao=0.2); nugget (cn=0.1); Varianza de parche (co=0.4) y la intensidad del patrón espacial Sill=(cn+co), para la región Chicamocha.

Discusión La meseta tuvo un valor relativamente bajo de a0=0.2 comparado con la Región 0 (Sumapaz). El alcance fue de 0.2 y la varianza neta fue de 0.3. La intensidad del Patrón espacial fue de 0.75. La forma general de la línea sugiere variabilidad ambiental alta, es decir, la presencia de dos o ecosistemas en áreas relativamente pequeñas. Para la Región del Chicamocha o Región 1, el Variograma sugiere que los puntos (de registro) separados por distancias cortas están correlacionados y la correlación decrece a medida que la distancia entre puntos se incrementa. Esto puede verse en el incremento en el Variograma hasta una distancia residual cercana a 0.3005. En el presente estudio las variables (incluida en la prueba) están correlacionadas espacialmente, debido a que el Variograma aparece decreciente a lo largo de las distancias residuales (Lag) posterior al Rango a0. Índices de diversidad (Tabla 1-6) El software DIVA-GIS generó el siguiente resumen para las 59 colectas incluidas en la muestra de trabajo. El índice de Margalef en este estudio reporta el número de individuos diferentes al interior de la muestra de trabajo compuesto por 59 accesiones (o entradas). El índice de Simpson expresa la probabilidad de que dos individuos al azar dentro del grupo de colectas, sean distintos. El valor de 1 indica baja diversidad.

Pr i n c i p a l Co mp o n e n t An a l y s i s

Va r i o g r a m

0

1

2

3

Av e r a g e L a g Di s t a n c e f o r Cl a s s

0 . 0 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 5 0 . 6 0 . 7 0 . 8 0 . 9 1 . 0 1 . 1


Tabla 1-6: Índices y estimativos de diversidad obtenidos como máximo indicador de variación ambiental.

Diversidad Índice Valor

Margalef 14.224

Menhinick 7.681

Shannon 4.078

Simpson 1.000

Brillouin 3.128

Estimativos Índice Valor

Chao-1 1779.500

Chao-2 921.875

Jacknife-1

117.000

Jacknife-2

173.983

ACE -1.000

Capítulo 2 41

2. Capítulo 2

2.1 Diversidad molecular de accesiones colombianas de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown

2.1.1 Introducción

Lippia alba: taxa, descripción botánica y diseminación

Taxón: Lippia alba (Mill.) N. E. Br. ex Britton & P. Wilson. Nombres comunes: [prontoalivio (Colombia), erva-cidreira (Brasil), juanilama (Costa Rica), salvia morada (Argentina), bushy matgrass, Bushy Lippia Oaxaca lemon verbana, melissa] (En: http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html taxon). La mayor parte de la Verbenaceae se compone de dos grupos ricos en especies: el complejo sensu Verbena/Glandularia con 170 especies, y el complejo Lantana/Lippia/Aloysia con 200–400 especies (Yuan et al., 2009). Es un arbusto aromático de 1-1,15 metros de altura, con ramas largas, delgadas y dispuestas en ángulo; hojas opuestas o en grupos de tres, de 1-3 centímetros de largo, oblongo-elípticas de obtusas a redondeadas, bordes aserrados, superficies cubiertas de vellosidades, venas prominentes, inflorescencias en capitulo o espigas de 2 centímetros de largo, flores nectaríferas tubulares de 4.5 mm*1.5 mm, blancas, rosadas o púrpura suave (Seaforth y Tikasingh, 2008; Castro et al., 2002; Muñoz et al., 2007; En: http://aplicaciones2.colombiaaprende.edu.co/concursos/ expediciones botanicas/ fotos/ 5721351.jpg; Caetano et al., 2011). La reproducción sexual presenta características de especie alógama, típico en verbenáceas silvestres (Suárez et al., 2008; Caetano et al., 2011). En L. alba, anormalidades postmeióticas afectan la formación de granos de polen viables y es determinante de viabilidad y germinación baja de las semillas, presentando problemas importantes en su reproducción sexual (Muñoz et al., 2006; Caetano et al., 2011; Herrera et al., 2013). Su forma asexual de reproducción es fácil, rápida y exitosa (estenopropagación). Como sinónimos para L. alba (Mill.) N.E.Br. están: Lantana alba Mill., Lippia geminata Kunth., Lantana germinata (Kunth.) Spreng. (Linares, 2007; Seaforth y Tikasingh, 2008). Es usada como ingrediente natural en cosmetología (aromaterapia) e industria farmacéutica (Wezel, 2003; Montanari et al., 2004; Trujillo, 2004; UNCTAD, 2005; Seaforth and Tikasingh, 2008). Es una de las plantas medicinales más importantes

http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/paper.pl?language=en&chapter=scient

http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/

http://aplicaciones2.colombiaaprende.edu.co/concursos/%20expediciones%20botanicas/%20fotos/%205721351.jpg

http://aplicaciones2.colombiaaprende.edu.co/concursos/%20expediciones%20botanicas/%20fotos/%205721351.jpg


utilizadas, entre otros, por pobladores brasileros (Castro et al., 2002; UNCTAD, 2005; Oliveira et al., 2006); especialmente aprovechada por sus propiedades somáticas, sedativas, antidepresivas y analgésicas (Schroeder et al., 2004; UNCTAD, 2005; Hennebelle et al., 2007). El aceite esencial de L. alba tiene además usos como estomático, antiespasmódico, digestivo, anti-hemorroides y anti-asmático (Vit et al., 2002; Schroeder et al., 2004; UNCTAD, 2005; Hennebelle et al., 2008). Lippia alba y L. origanoides han sido las Verbenáceas más ampliamente reportadas (Stashenko et al; 2003-2004; Jarvis et al., 2006; Hennebelle et al., 2006; Vera et al., 2010; Jaramillo et al., 2010) como promisorias por los componentes de sus aceites esenciales (Borneol, camfor, 1,8- cineole, citronellol, geranial, linalool, myrcene, neral, piperitona, sabineno, 2-undecanona, - muuroleno, - cariofileno, - cubebeno, - elemeno, -cadineno). In vitro, las dos especies han demostrado efecto antimicrobiano en humanos (Vera, 2007; Cardona, 2008-2009; Camacho et al., 2010) y en plantas (Álvarez, 2008; Erazo 2010; Guerrero, 2010). No obstante, la cantidad de componentes principales de sus aceites esenciales varían con el sitio de colecta, con diferenciaciones importantes especialmente en las cantidades de p-cymene, -terpinene, thymol, carvacrol, butyl hydroxy anisole (Jarvis et al., 2006; Duran, 2007; Vega et al., 2013).

Rango de distribución natural. El clade Verbeneae se distribuye primariamente en Latinoamérica donde ocurre en un rango amplio de ecosistemas, con un segundo centro de origen en África (Marx et al., 2010). Inferencias filogenéticas sugieren a Suramérica como lugar de origen de las Verbenaceae con aproximadamente seis eventos de colonización, los cuales dieron origen a las especies presentes en el viejo mundo (Marx et al., 2010). El análisis filogenético realizado por Marx et al. (2010) mostró ocho clades reconocidos como tribus (Casselieae, Citharexyleae, Duranteae, Lantaneae, Nerosportoneae, Petreae, Priveae, Verbeneae). Lantaneae y Verbeneae forman un clade con aproximadamente 2/3 de las especies en el clade Verbeneae. Su área más probable de origen va de México a Argentina y en las Antillas (Vit et al., 2002; Arango, 2004; UNCTAD, 2005). La especie se distribuye desde Norteamérica (Ver: conservation status in U.S. & Canada in NatureServe Explorer database) Centro-Sur de E.U.A.: Estados Unidos de América- Texas; Norte de Mexico: Mexico - Baja California, San Luis Potosi, Sinaloa, Tamaulipas, Zacatecas; Sur de Mexico: Mexico- Campeche, Chiapas, Colima, Guanajuato, Guerrero, Jalisco, Mexico, Michoacán, Nayarit, Oaxaca, Tabasco, Veracruz, Yucatán. En Suramérica por el Caribe: Islas Caimán; Cuba; Republica Dominicana; Haití; Jamaica; Puerto Rico; Trinidad & Tobago; Mesoamérica: Belice; Costa Rica; El Salvador; Guatemala; Honduras; Nicaragua; Panamá. Norte de Sur America: Guayana Francesa; Guyana; Surinam; Venezuela. Brasil: Brasil - Amazonas, Bahía, Ceará, Goiás, Maranhao, Mato Grosso, Minas Gerais, Para, Paraná, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro, Rondonia, Santa Catarina, Sao Paulo. Sur América occidental: Colombia; Ecuador - Bolívar, Guayas, Los Ríos, Morona-Santiago, Napo; Perú - Amazonas, Huánuco, La Libertad, Lambayeque, Lima, Loreto, Pasco, Piura, San Martin, Ucayali. Sur de Sur América: Argentina - Buenos Aires, Chaco, Corrientes, Entre Ríos, Formosa, Jujuy, Misiones, Santa Fe; Paraguay (En: http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?22367). También se encuentra en Suráfrica (Cicció y Ocampo, 2006), India (Gurdip et al., 1999) y Australia (En: http://biocahe. ala.org.au/occurrences/search?q=lsid:urn:lsid:biodiversity.org.au:apni. taxon: 313500#.).

http://www.natureserve.org/explorer/servlet/NatureServe?searchSciOrCommonName=Lippia%20alba

http://www.natureserve.org/explorer/index.htm

http://botany.csdl.tamu.edu/FLORA/cgi/plants?type=boolean&query=Lippia%20alba&rform=full

http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?22367

Capítulo 2 43

Registros biológicos de L. alba en Colombia. No existe un registro fitogeográfico de L. alba para Colombia. Los herbarios colombianos reportan 37 colectas en 18 departamentos de Colombia. El Herbario de la Universidad de (1) Antioquia-HUA- agenda un ejemplar de L. alba con código 61260 [2008-07-22]. El Herbario Nacional Colombiano-COL, registra 21 colectas de L. alba en: (2) Santander [Puente Nacional (Morales A.L. sn), Suaita (Fernández J.L. 21249), Bucaramanga (Jaramillo C., 1). Bucaramanga, Suaita y Bolívar (Durán et al., 2007), Curití, San Gil, Jordán, Valle de San José, Aratoca y Pescadero] (En: Informe anual Técnico CENIVAM, 2005), (3) Cundinamarca [Arbeláez (Salama, A.M. 15, La Vega; Salama A.M. 141), Anolaima], (4) Tolima [Flandes y Venadillo], (5) Boyacá [Cubará], (6) Antioquia [Puerto Berrio], (7) Arauca [Saravena, Bolívar, Turbaco y Colorado], (8) Valle del Cauca [Cali y Palmira], (9) Quindío [Armenia], (10) Cesar [Sn. Martin] (Durán et al., 2007), (11) Bolívar [entre Sincelejo y Colosó (R. Romero-Castañeda 9295)], (12) Amazonas [Trapecio Amazónico, entre Puerto Nariño y Loretoyacú, a orillas del río Amazonas (J. M. Duque-Jaramillo 2418)], (13) Guajira [Nazareth (R. Romero-Castañeda 4450), Urbilla, cauce del arroyo en la salida hacia Ipapure (Carlos Saravia & Donald Jonson 314)], (14) Magdalena [Municipio de Santa Marta, alrededores de Pueblito, altitud 400 m. (R. Romero-Castañeda 8040)] (García-Barriga, 1975; Linares, 2007). El Herbario Amazónico Colombiano-COAH- muestra seis registros para L. alba en (15) Putumayo [Mocoa y Puerto Leguízamo], (16) Caquetá [Florencia], (17) Meta [Mesetas] y (18) Vaupés [Morichal] (En: http://www.sinchi. org.co/herbariov/ genera_ indice.php). Más 59 accesiones de Lippia alba colectadas en diferentes localidades de dos zonas agroecológicas colombianas: Región I (Sumapaz) y Región II (Chicamocha). Estas accesiones forman parte de una colección transitoria (año 2013) establecida en el Centro Experimental de la Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira-CEUNP. Descripción citogenética de Lippia alba. La caracterización citogenética hecha por Dias et al. (2007), Pierre et al. (2010), y Sousa et al., (2011) revela para L. alba un número variable cromosomas originado por diploidía y poliploidía (Sousa et al., 2011) con 2n=30 cromosomas para el quimiotipo citral, mientras que individuos la carvona mostró 2n=60. Los individuos del quimiotipo linalool revelaron el mismo rango de numero de cromosomas, de 2n=12 a 2n=60, en diferentes células del mismo individuo, con 2n=44 como el cariotipo más frecuente hallado (Pierre et al., 2011). Dias et al. (2007) detectaron mediante FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) seis sitios 45S rDNA y dos sitios 5S rDNA, y un análisis meiótico reveló condición cromosómica normal. El número de cromosomas y la presencia de dos sitios 5S rDNA sugirió un origen poliploide, reportado por Pierre et al. en 2010 y Sousa et al. (2011) en Brasil, al hallar diferentes citotipos (diferentes niveles de ploidía e individuos mixoploídes). La mayor parte de la variación genética del quimiotipo linalool lo describe Pierre et al. (2010) como una consecuencia de la mixoploidía presente en la especie. La reproducción sexual entre los quimiotipos es poco probable, sugiriendo aislamiento reproductivo (Pierre et al., 2011). Las características citogenéticas de L. alba pueden ser marcadores útiles en diferenciación de especies (Dias et al., 2007), estudios de conservación (Pierre et al., 2011; Sousa et al., 2011; Santos et al., 2012) y planes-programas de mejoramiento (Santos et al., 2012). Marcadores moleculares para estudios de diversidad y estructura genética en plantas. Marcadores moleculares AFLP desarrollados por Vos et al., en 1995 (Beebe et al., 2001; Larson et al., 2004; Wolf et al., 2004; Grassi et al., 2005; Tero et al., 2005; Ramalho et al., 2006; Assogbadjo et al., 2006), loci de alloenzimas (Huh et al., 1999; Culley and Wolfe, 2001; Mariot et al., 2002; Zhang et al., 2002; Wang et al., 2004;


González et al., 2004; Kang et al., 2005), ISSR (Wang et al., 2003; Xiao et al., 2004; Sheng et al., 2005; Xie et al., 2005; Ge et al., 2005), ITS del ADN ribosomal (Jaramillo and Manos, 2001; Ortiz et al., 2005; Suarez et al., 2007), marcadores del ADN del cloroplasto (cpDNA) (Suárez et al., 2007), RAPD (Wadt et al., 2004; Wang et al., 2003; del Rio and Bamberg, 2003; Verma et al., 2004; Zhang et al., 2002; Ortiz et al., 2005; Zucchi et al., 2005), SSR (Zhang et al., 2002; El-Mouei et al., 2011) y Random Amplified Microsatellite-RAM (Muñóz et al., 2008); han sido usados para investigar los niveles de variaciones morfométricas, variación genética y estructura genética dentro y entre poblaciones de especies vegetales promisorias (Assogbadjo et al., 2006). Los resultados obtenidos con los marcadores moleculares han permitido: (i) proponer estrategias para conservación y manejo sustentable de algunas especies (ii) determinar evolución bioquímica, deriva genética, cruzamientos y flujo génico entre poblaciones, (iii) identificar reservorios potenciales de diversidad de plantas dentro de ecosistemas, (iv) Identificar factores causantes de cambios en cantidad de variación entre poblaciones y localidades de centros de diversidad genética (Wang et al., 2003), (v) identificar factores que juegan papel importante en la distribución geográfica de la diversidad genética (Wang et al., 2004), (vi) Identificar implicaciones de la estructura genética de una población en prácticas de restauración (Sheng et al., 2005), (vii) identificar relaciones entre distancias genéticas y espaciales y (viii) proponer hipótesis acerca del efecto de aislamiento por distancia como función de restricción de flujo vía dispersión de semilla (Wolf et al., 2004). La técnica RAM ha sido evaluada en Physalis peruviana (Bonilla et al., 2008), Rubus spp (Morillo et al., 2005), Psidium guajava (Sanabria et al., 2006), Heliconia spp. (Arcos et al. 2004), Beauveria bassiana (Marmolejo et al., 2008) y Bos taurus raza Hartón del Valle (Piedrahita et al., 2007). En uchuva, Bonilla et al., (2008) hallaron diversidad genética alta y accesiones de fruto rojo genéticamente diferenciados y una región geográfica con variabilidad alta. Muñoz et al., (2008) diferenciaron las especies R. glaucus, R. robustus y R. urticifolius, detectando duplicados y variabilidad genética alta en R. glaucus. Los cebadores RAM fueron altamente polimórficos en guayaba y encontraron variabilidad alta en el valle geográfico del Rio Cauca-Colombia (Sanabria et al., 2006). En el orden Zingiberales, Arcos et al., (2004) diferenciaron familias, algunos subgéneros y variantes intra/entre especie. Diversidad genética y estructura de poblaciones naturales de Lippia spp. La estructura genética de poblaciones naturales del género Lippia ha sido escasamente estudiada (Montanari et al., 2004; Viccini et al., 2004-2006; Dias et al., 2005-2006; Suárez et al., 2007-2008; Yamamoto et al., 2008; Martínez et al., 2008). Análisis previos utilizando marcadores RAPD fueron efectivos para comprender la diversidad genética de especies de Lippia spp. y contribuyeron a entender su adaptación al ambiente, conservación e implicaciones taxonómicas (Viccini et al., 2004; Pereira et al., 2006). Viccini et al., (2004), evaluaron el grado de diversidad genética en nueve especies de Lippia (L. corymbosa, L. diamantinensis, L. filifolia, L. florida, L. hermannioides, L. lupulina, L. rotundifolia, L. rosella y L. sidoides) del sudoeste de Brasil. La distancia genética interespecífica promedio fue similar para todas las especies y más alta que las distancias intraespecíficas. Las especies con presencia limitada, mostraron diversidad interespecífica más baja. El dendograma por el método UPGMA mostró grupos mayores con una clara diferenciación entre especies (Viccini et al., 2004). En 2012, Santos et al., aislaron y caracterizaron ocho loci de microsatélites (SSR) polimórficos en dos poblaciones brasileras de Lippia alba, los cuales mostraron potencial informativo de moderado alto para estudios genéticos. Siete de ocho secuencias SSR revelaron múltiples bandas típicas de especies poliploides sugiriendo genomas tetraploides en L.

Capítulo 2 45

alba. El índice de diversidad de Shannon (H) fueron 2.013 y 1.989, respectivamente. La heterocigocidad esperada (He) tuvo rango entre 0.407 y 0.718, con media de 0.564 para la población A; y de 0.234 a 0.704 con media 0.503 en la población B. Suárez et al. (2007) llevaron a cabo un estudio piloto en Lippia origanoides, L. alba, y L. citriodora para observar polimorfismos intra e inter-específicos en cuatro regiones del cpDNA, de ITS del ADN ribosomal y 50 loci ISSR. Tres de cuatro regiones del cpDNA (petA-psbE, tnrL-trnF and trnL intron) y la región ITS mostraron mayormente variación interespecífica. Diez y siete regiones ISSR de 50 loci analizados mostraron polimorfismos, inter e intraespecíficos. La divergencia de secuencias entre pares de especies en la región del plastidio, mostró rangos de 0.4% a 1%, mientras que la divergencia en secuencias de regiones ITS fue cerca del 5%. Los resultados obtenidos sugieren que las regiones ITS, tal como han sido reportadas para otros géneros de plantas, puede convertirse en una región de elección para estudios de genética de poblaciones en este tipo de especies. Los valores de diversidad genética descrita por Suárez et al. (2008) en Lippia origanoides (plantas alógama Verbenaceae relacionada) fueron: P=86.21%, para porcentaje de loci polimórficos; I=0.453, para índice de diversidad de Shannon; y HB=0.484 para Heterocigocidad panmitica promedio.

2.1.2 Metodología

Material vegetal. En este trabajo fueron analizados 59 accesiones de Lippia alba colectadas en diferentes localidades de dos zonas agroecológicas: Región I (Sumapaz 4.3124166N, -74.493694W) y Región II (Chicamocha 6.5683333N, -73.1400277W). Cada accesión representa una planta individual propagada por estaca. Estas accesiones forman parte de la colección in vivo-ex situ del Banco de germoplasma de la Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira. La lista de accesiones con sus respectivos datos de colecta se muestra en el Anexo C.

Protocolo para extracción de ADN. Se utilizó el protocolo A-2X desarrollado por Vega & Chacón (2011). El protocolo de extracción de ADN para especies aromáticas llamado A-2X consta del siguiente Buffer y reactivos:

i. Buffer A-2X: 2% CTAB w/v, 1.5 M NaCl, 20mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH:8 y 1% β-mercapto (adicionado justo antes de usar)

ii. Cloroformo: Isomil alcohol (24:1) v/v iii. Isopropanol a -20ºC (Idem: 2-propanol) iv. Gdm+ -solución salina: a) Guanidina Hidrocloride (Gdm HCl) Solución 2M o 4M

Guanidina diluida en agua destilada o b) Guanidina Tiocianato (Gdm SCN) solución: 2M o 4M

v. Etanol al 90% y 70% vi. Buffer TE bajo en sales (10 mM Tris + 1 mM EDTA) pH≥8.0, como solubilizante-

antidegradante del ADN, y vii. RNasa en TE buffer a [1µg/µL].


Pasos:

1. Se maceraron 100-200 mg de tejido en nitrógeno líquido en un mortero esterilizado; y se creó un banco de tejido a -20ºC y -40ºC, depositado en el Laboratorio de Genética de la Universidad Nacional-Palmira.

En cámara de flujo

2. Inmediatamente se transfirió--el tejido macerado en polvo—a un (tubo) Eppendorf (con capacidad de 2 mL) conteniendo 800 µL de Buffer A-2X,

3. Se homogenizó la muestra suavemente por inversión y se incubó por 30’ a 65ºC. Agitándose cada cinco minutos (5’),

4. Se adicionó 800µL de Cloroformo: Alcohol Isoamílico (24:1). Mezclando la muestra vigorosamente; usando Vortex hasta obtener una emulsión. Se centrifugó a 14400 xg (gravedades) por 10 minutos (10’),

5. Se transfirió el sobrenadante a un tubo Eppendorf de 2mL. Se adicionó 200 µL de Isopropanol a -20ºC y se mezcló suavemente por inversión.

Fuera de la cámara de flujo

6. Se adicionó 1 µL de Gdm+. Mezclando rápidamente por inversión durante cinco minutos (5’)

7. Se transfirió todo el contenido (mínimo 700 µL) de la muestra a una columna de Silica (EconoSpinTM All-in-1 Min Spin Columns Epoch BioLabs) y se centrifugó a 10.000 xg (gravedades) durante cinco minutos (5’). Descartando el centrifugado contenido en la base-recipiente de la columna. Repitiendo este paso hasta que drenó completamente,

8. Se lavó la membrana con 500 µL de Etanol al 90% y se centrifugó a 10.000 xg (gravedades) durante cinco minutos (5’). Descartando el (liquido) centrifugado del tubo colector. Repitiendo la acción usando Etanol del 70%.

9. Se centrifugó la columna a 10.0000 xg durante 10 minutos o hasta que la membrana quedó totalmente seca,

10. Se adicionó 100 µL de TE Buffer pH≥8.0 precalentado a 65ºC por cinco minutos, directamente en el centro de la membrana. Se incubó a 65ºC por cinco minutos y se centrifugó a 10.000 xg por 1 minuto para colectar el fluido en el tubo colector, con el ADN,

11. Se repitió el paso 10, pero el tiempo de incubación se redujo a 3 minutos, 12. (Opcional) se adicionan 2 µL de RNasa e incube a 37ºC por 15 minutos.

LA CALIDAD DEL ADN SE REVISÓ EN UN GEL DE AGAROSA AL 0.8%

Amplificación y evaluación de marcadores RAM. El ADN total fue extraído a partir de100-200 mg. de tejido foliar fresco de cada accesión por el método A-2X (Vega y Chacón, 2011). La calidad y la concentración del ADN fue evaluada en un gel de agarosa 0.8%. La integridad del ADN fue confirmado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de 0.8% de agarosa en buffer TBE. Técnica RAM. Se realizó la PCR para los cebadores ACA-AG-CA-CCA-TG-CT-CGA-GT. Los productos PCR fueron visualizados en geles de poliacrilamida (37:1) al 7% a 160 voltios por una hora y se hizo tinción con Bromuro de Etidio. La mezcla para la PCR fue: ADN 10.0 ng/µL + Buffer TAQ 10X 2.50 µL +MgCl2 2.50 µL 25 mM+ DNTP [4.00 µL] +

Capítulo 2 47

Cebador [1.00 µL] + Agua 11.80 µL + TAQ Polimerasa 0.15 µL. Los pasos del termociclador se describen a continuación: Tabla 2-1: Pasos del termociclador

Paso Tº t (tiempo) Etapas

1 95 5 minutos Desnaturalización

2 95 30 segundos Desnaturalización

3 TH* 45 segundos Hibridación

4 72 2 minutos Extensión

5 37 veces desde el paso 2

6 72 7 minutos Extensión

7 16 30 minutos

Primer TH*

ACA-AG-CA 50

CCA-TG-CT 55

GT-CCA 58

TH*= Tiempo de Hibridación

Análisis de datos. Se caracterizaron las bandas por presencia/ausencia en cada accesión (introducción) y los datos fueron consignados en una matriz binaria de 1/0. Las frecuencias alélicas y genotípicas (observadas y esperadas); y los valores de Diversidad Genética por locus (hj=1-p2-q2) y promedio (Hi=Σhj/n) de Nei [D] (1987), fueron calculadas usando el Programa TFPGA v1.3 (bajado de la red el 15-04-2013). La discriminación potencial de cada cebador (o grado de variabilidad genética en la población) fue expresado por el Coeficiente de Simpson (H=Σ(1- Σpi

2)/n), donde pi es la frecuencia del iesimo alelo y n corresponde al número de loci detectados por cada cebador (Manica-Cattani et al., 2009). Para todos los pares de genotipos, los valores de similaridad genética fueron calculados usando el coeficiente de Dice-Nei (Kosman y Leonard, 2005), el cual excluye 0-0 como indicador de similaridad (Manica-Cattani et al., 2009) y de Ward (1963). Usando matrices de similaridad genética, un dendograma fue construido acorde a peso de los pares de grupos usando UPGMA (Manica-Cattani et al., 2009) y el Programa Ward-MLM (Franco et al., 2005; Silva et al., 2010). La relación entre datos químicos y genéticos fue determinado mediante un AMOVA y análisis canónico (Manica-Cattani et al., 2009). Los datos fueron analizados usando los programas SAS/STATv.9.2 y GenAlEx (En: http://biology. anu.edu.au/GenAlEx/ Download.html). El programa propuesto por Franco et al., (1998), utiliza la estrategia en dos pasos WARD-MLM para agrupamiento de observaciones utilizando variables continuas y categóricas simultáneamente. El programa está dividido en tres bloques de acuerdo a los tres pasos sugeridos para la clasificación: WARD-MLM1.SAS (calcula la matriz de similaridades y distancias de Gower); WARD-MLM2.SAS (calcula y grafica el logaritmo de máxima verosimilitud para número probable de grupos) y WARD-MLM3.SAS (define el número de grupos).


2.1.3 Resultados

Diversidad y variabilidad genética entre accesiones de Lippia alba

La Heterocigocidad promedio esperada-He (Heterocigocidad media o Diversidad genética de Nei) para la muestra de trabajo tuvo un valor medio (0.0 ≤ He=0.2467 ≤ 0.5). Los valores de Diversidad Molecular-DM-estuvieron en el rango de 0.1219 a 0.3425 para siete marcadores RAM (Tabla 2-2). Con base en la frecuencia de variantes (Numero efectivo de alelos [Ae] y Heterocigocidad esperada [He], la diversidad genética por locus (hj=1-p2-q2) tuvo valores máximos (cercanos a 0.5) en los cebadores ACA-AG-CGA-CCA. Las frecuencias alélicas y genotípicas (observada y esperada) por cebador y por locus (dado cebador), se reportan en el Anexo D y el número efectivo de alelos (o número de alelos esperados en cada locus) se muestra en la Tabla 2-2. Con base en el número de variantes (polimorfismo [Pj], proporción de loci polimórficos [P], abundancia de variantes alélicas [A] y promedio de alelos por locus [n]), los siete cebadores generaron 13.43±4.43 loci, con una proporción de loci polimórficos P=91.48% dada su frecuencia alélica Pj=q≤0.95/0.99 (Tabla 2-2). Amplificaron siete (de ocho) cebadores generando bandas consistentes y reproducibles en 94 loci, con 45±9.52 bandas por individuo (Anexo D). Se detectaron tres alelos dominantes únicos y cinco (alelos dominantes) raros con frecuencia p≤0.05 (Tabla 2-2). Tabla 2-2: Parámetros (número efectivo de alelos-Ae y Heterocigocidad Esperada-He) y variables (Polimorfismos-Pj y alelos por locus) para medir la diversidad genética de Lippia alba con base en frecuencia y número de variantes.

Loci

Número Cebador Ae He No. Loci

Polimórficos Monomórficos n

1 ACA 0,1960 0,3339 19 19 0 26,420

2 AG 0,1427 0,3425 14 14 0 37,070

3 CA 0,0638 0,1219 19 13 6 49,310

4 CGA 1,3930 0,1718 9 8 1 11,890

5 CCA 6,6881 0,3317 8 8 0 23,620

6 TG 4,7730 0,2483 11 10 1 22,450

7 GT 1,9180 0,1768 14 14 0 11,000

2,1678 0,2467 94 86 8 25,9657

El grado de variabilidad genética fue alta (H=0.7356). La discriminación potencial de cada cebador expresado por el Coeficiente de Simpson [H=Σ(1- Σpi

2)/n] mostró valores entre 0.2991 en el cebador AG, hasta 0.9632 en el cebador TG (Tabla 2-3).

Capítulo 2 49

Tabla 2-3: Valores de Coeficiente de Simpson determinantes de la variabilidad genética.

Loci H

Cebador Secuencia No. Loci Polimórficos Monomórficos Índice de Simpson

1 ACA 19 19 0 0,7656

2 AG 14 14 0 0,5634

3 CA 19 13 6 0,2991

4 CGA 9 8 1 0,9270

5 CCA 8 8 0 0,8001

6 TG 11 10 1 0,9632

7 GT 14 14 0 0,8136

94 86 8 0,7331

No obstante, para especies como L. alba y L. origanoides, estos valores (H=0.484 usando ITS) son comunes en Colombia (Suárez et al., 2007-2008). De otro lado, Manica-Cattani et al. (2009) hallaron variabilidad genética alta entre accesiones de L. alba colectadas al sur de Brasil, con valores promedio de 0.565 para ISSR y 0.625 para RAPD. En la muestra de trabajo las frecuencias alélicas mostraron todos los valores posibles dentro del rango, un factor que puede considerarse característico de los RAM; diferente a las frecuencias obtenidas por Manica-Cattani et al. (2009), con valores extremos altos (>0.90) y bajos (<0.10) en accesiones de Brasil con el mismo tipo (dominante) de marcador (RAPD e ISSR). De hecho, el poder discriminante de los RAM ha sido valorada en recursos fitogenéticos locales incluyendo heliconias (Arcos et al., 2004), árboles nativos de Psidium guajava (Muñoz et al., 2008; Sanabria et al., 2006), Rubus spp (Muñoz et al., 2008), uchuva (Bonilla et al., 2008), y más recientemente en la caracterización del Banco Colombiano de germoplasma de maíz (En: R.D. Rojas-Pantoja ‘Evaluación de la diversidad genética en las razas criollas e indígenas de maíz en Colombia mediante marcadores moleculares tipo RAM’ Trabajo de grado UN-Palmira). Variabilidad y diversidad genética dentro de (intraespecífica) accesión La Diversidad genética de Nei [D=0.2722], dentro de accesión fue también de valor medio sin ser significativamente mayor que el valor de DG entre accesiones [D=0.2467]. Los valores respectivos de Diversidad Molecular-DM-estuvieron en el rango de 0.000 a 0.4776 para siete marcadores RAM (Tabla 2-4). Siete cebadores amplificaron generando bandas robustas y visibles (Tabla 2-4). Con excepción del cebador GT (100% monomórfico; DG=0.0000) los cebadores mostraron valores de DG (dentro de accesión) más altos que los mostrados por DG entre accesiones, es decir, los indicadores de diversidad y variabilidad genética fueron mayores dentro de accesiones, que entre accesiones.


Tabla 2-4: Valores de diversidad genética intraespecífica.

Loci

Primer Secuencia No. loci Polimórficos Monomórficos Hi

1 ACA 19 19 0 0.3603

2 AG 14 14 0 0.4298

3 CA 19 13 6 0.4776

4 CGA 9 8 1 0.1765

5 CCA 8 8 0 0.3252

6 TG 11 10 1 0.1363

7 GT 14 14 0 0

94 86 8 0.2722

El valor de Diversidad Molecular-DM-para la muestra fue medio, en la escala de 0 a 0.5 de Diversidad Genética-DG- de Nei (1978) para marcadores RAM. Discusión principal. El valor de Diversidad Molecular-DM-para la muestra fue intermedio (0,24), en la escala de 0 a 0.5 de DG de Nei (1978) para marcadores RAM. Valores DM≤0.332 se consideran medio, como el resultado obtenido. No obstante, para especies naturalizadas como L. alba y L. origanoides, valores bajos (H=0.484) son comunes en Colombia (Suárez et al., 2007-2008). En Lippia origanoides, una especies relacionada del mismo género, Vega y Chacón en 2008 identificaron cuatro poblaciones de (en la Región Andina de Colombia) estructuradas genéticamente (Ht = 0.32; I = 0.48). En 2013, Vega et al. obtuvieron valores relativamente altos de DG (0,35≤Hs≤0,37) para L. origanoides en dos regiones colombianas (Magdalena medio y Chicamocha) con una diferenciación genética baja, la cual varió de 0.07 a 0.17 entre poblaciones. En poblaciones brasileras de L. alba, Manica-Cattani et al. (2009) hallaron variabilidad genética alta entre accesiones de L. alba colectadas al sur de Brasil, con valores promedio de 0.565 para ISSR y 0.625 para RAPD. Santos et al., (2012) obtuvieron valores de heterocigocidad esperada (He) entre 0.407 y 0.718, con media de 0.564 para una población A; y de 0.234 a 0.704 con media 0.503 en una población B usando SSR (Santos et al., 2012). Los grados de variabilidad genética en la población (H) se presentan en la Tabla 2-3. En la muestra de trabajo las frecuencias alélicas mostraron todos los valores posibles dentro del rango, un factor que puede considerarse característico de los RAM, similar a los obtenidos por Vega y Chacón (2008) y Vega et al. (2013) en la región del Chicamocha-Colombia, usando AFLP; diferente a las frecuencias obtenidas por Manica-Cattani et al. (2009), con valores extremos altos (>0.90) y bajos (<0.10) en accesiones de Brasil con el mismo tipo (dominante) de marcador (RAPD e ISSR). De hecho, el poder discriminante de los RAM ha sido valorada en recursos fitogenéticos locales incluyendo heliconias (Arcos et al., 2004), árboles nativos de Psidium guajava (Muñoz et al., 2008; Sanabria et al., 2006), Rubus spp (Muñoz et. al., (2008), uchuva (Bonilla et al., 2008), y más recientemente en la caracterización del Banco Colombiano de Maíz (J. E Muñoz, cita textual). Los dos grupos de individuos estudiados revelan un proceso de estructuración genética de sus poblaciones. El AMOVA (Tabla 2-8) y el estadístico FST=0,054 (p<0,001)

Capítulo 2 51

detectaron que las poblaciones estudiadas aquí se están estructurando genéticamente. Análisis de Coordenadas Principales-ACP, AMOVA y análisis Bayesiano conducidos por Suárez et al. (2008) revelaron un bajo nivel de diferenciación genética entre dos localidades dentro del Cañón del Chicamocha-Colombia, sugiriendo una sola población de Lippia origanoides. Los niveles de DG en esta población, expresado con base en porcentaje de loci polimórficos (P=86.21%), el índice de diversidad de Shannon (I=0.453) y la Heterocigocidad panmitica promedia (HB=0.484), es comparable con los niveles de DG de otras Verbenáceas alógamas relacionadas (Suárez et al., 2008).

La muestra inicial de colectas en esta prueba fue 83 individuos; esta se redujo al hallare únicamente 59 individuos con características diferenciables. Cuatro factores ‘pueden’ estar afectando la DG de la muestra de L. alba en Colombia: a) la especie muestra anormalidades postmeióticas-afectando la formación de granos de polen viables y es determinante de viabilidad y germinación baja de las semillas (Muñoz et al., 2006), presentando problemas importantes en su reproducción sexual (En: http://www.bdigital.unal.edu.co/ 4959/1/memoria10a%C3%B1os UNmaestriarfn palmira. 2011.pdf.), b) su forma particular de diseminación, en el que se presenta un aspecto socio-cultural de dispersión por adultos mayores de grupos culturales y étnicos (Antropocoria) originado por sus propiedades medicinales (etnobotánica), c) su estenopropagación (o propagación vegetativa fácil y rápida) por esquejes y estacas de todo tipo de madera y d) régimen extractivo alto sin reemplazo. Más, dispersión restringida de semilla y/o distancias cortas de movimiento de polen, propuestos por Suárez et al. (2008) para L. origanoides, una Verbenaceae con características similares a L. alba. Cebadores (primers) RAM. Ocho cebadores RAM fueron evaluados en el ADN total de cada accesión. De ocho, siete produjeron patrones de bandas robustas y reproducibles de intensidad mediana y alta (Figuras 2-1/2). Los cebadores seleccionados--y usados para amplificar el ADN de todas las accesiones--rindieron un total de 2655 fragmentos. El número y tipo de cebador usado en la prueba fue criterio del laboratorio de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, con base en su efectividad en la caracterización de: a) recursos fitogenéticos locales [Physalis peruviana (Muñoz et al., 2008; Bonilla et al., 2008), Rubus spp, Psidium guajava (Muñoz et al., 2008; Sanabria et al., 2006) y Heliconia spp. (Arcos et al. 2004; Muñoz et al., 2008)]; b) fitopatógenos [Beauveria bassiana (Marmolejo et al., 2008; Muñoz et al., 2008)] y c) recursos zoogenéticos autóctonos [Bos taurus raza Hartón del Valle (Piedrahita et al., 2007; Muñoz et al., 2008)]. Figura 2-1: Patrón de bandas generadas por el cebador ACA_

Figura 2-2: Patrón de bandas generadas por el cebador CA_

http://www.bdigital.unal.edu.co/%204959/1/memoria10a%C3%B1os%20UNmaestriarfn%20palmira.%202011.pdf

http://www.bdigital.unal.edu.co/%204959/1/memoria10a%C3%B1os%20UNmaestriarfn%20palmira.%202011.pdf


Los microsatélies son (marcadores) versátiles en aplicaciones ecológicas (Selkoe & Toonen, 2006). Pueden ser usados para estimar parámetros de interés ecológico como tasa de migración, tamaño de población, cuello de botella, parentesco. Son de particular interés en ecología debido a que permite discernimientos a escala muy fina, sobre interrogantes ecológicos, siendo además neutros y se ajustan a los principios de herencia mendeliana. Ventajas: a) fácil preparación de la muestra, generan mucha información (altas tasas de mutación resultando en altos contenidos de diversidad alélica). A pesar de sus bondades tienen varios retos y supuestos que complican su análisis (Selkoe & Toonen, 2006). Los mecanismos de mutación no son claros, presentan alelos idénticos en secuencia con diferente linaje (descendencia) (Homeoplásia), y problemas con la amplificación (altas tasas de mutación con múltiples versiones (alelos) y error en lectura de alelos. Ocurren muchos pasos entre la extracción de ADN y la conformación de la base de datos. Un error de genotipado de 1% puede llevar a un sustancial número de genotipos multilocus incorrecto en una serie grande de datos. Las fuentes de error incluye: amplificación pobre, error interpretativo (banda fantasma), interpretación incorrecta del patrón de bandas, contaminación o error en la entrada de datos (Selkoe & Toonen, 2006).

Capítulo 2 53

Bandas únicas y alelos raros. Los cebadores (RAM) detectaron tres alelos dominantes únicos y cinco-alelos dominantes-raros con frecuencia p≤0.05 (Tabla 2-5). Los alelos únicos se ubicaron en los loci CA_17/18/19 de la accesión 341 con frecuencia p=0.0085. Los alelos raros (p≤0.05) se mostraron en el locus ACA_14, accesiones 310-312-320-322; locus ACA_17, accesiones 349-353-357; locus ACA-17, accesiones 174-187-189-201-357; locus CGA_8, accesiones 174-187-322; locus CGA_9, accesiones 174-187; locus CCA_3, accesiones 344/5-‘Daza’. El cálculo de frecuencias genotípicas/alélicas reportó diez alelos únicos con frecuencia q≤0.1302 y cinco alelos raros recesivos. Los alelos únicos se localizaron todos en el cebador CA, locus 1 a 10 de la accesión 341. Los-alelos-raros fueron estimados en el cebador AG, locus 6 y 10 de las accesiones 340-354-366-370-‘Daza’; locus 7 de las accesiones 340-354-366-‘Daza’; Locus 9 de las accesiones 340-366-370-‘Daza’; locus 12 de las accesiones 366-367-377-378-‘Daza’; con frecuencia q≤0.30. La presencia de alelos raros en un genotipo sugiere el comportamiento de efecto dosis: a mayor presencia de alelos raros, menor % de energía germinativa en su progenie Murillo, 2000). La heterocigocidad es uno de los mecanismos más eficientes de una población para lograr mantener alelos raros, evitando su extinción (Murillo, 2000). Individuos con He alta tienden a producir progenies menos viables (fitness). Valores extremos de He presentan un menor nivel de adaptabilidad (Murillo, 2000). Alta VG y presencia de alelos raros, indican la necesidad de grandes colecciones de germoplasma para representar la DG total de una especie (Igic et al., 2006). En programas de conservación y mejoramiento se debe utilizar el grado de heterocigocidad como un criterio para ubicación espacial de individuos (Murillo, 2000). Plantas con alelos raros tienen más probabilidad de aparearse que aquellas con alelos comunes (Igic, 2006). No obstante, los alelos raros poseen una influencia mayor en las estimaciones de riqueza alélica, que en la de heterocigocidad. Tabla 2-5: Alelos únicos y alelos raros hallados en la muestra de 59 accesiones de L. alba colectadas en dos zonas (Chicamocha y Sumapaz-Colombia).

Alelos únicos hallados con frecuencias p≤0,0085

Locus Frecuencias genotípicas Frecuencia

alélica hj= (1-p2-

q2) Accesión

CA_17

Genotipos AA Aa Aa TOTAL

P q 0,0169

341

Freq gen (esp) p2 2pq q2 1

Individuos 1 58 59

Freq gen (obs) 0,0169 0,9831 0,0085 0,9915

CA_18


P q 0,0169


Individuos 1 58 59

Freq gen (obs) 0,0169 0,9831 0,0085 0,9915

CA_19


P q 0,0169


Individuos 1 58 59

Freq gen (obs) 0,0169 0,9831 0,0085 0,9915


Alelos raros con frecuencia p ≤ 0.05

ACA_14


P q 0,0666 310-312- 320-322


Individuos 4 55 59

Freq gen (obs) 0,0678 0,9322 0,0345 0,9655

ACA_17


P q 0,0502 349-353-357


Individuos 3 56 59

Freq gen (obs) 0,0508 0,9492 0,0258 0,9742

ACA_19


P q 0,0829 174-187-189-201-357


Individuos 5 54 59

Freq gen (obs) 0,0847 0,9153 0,0433 0,9567

CGA_8


P q 0,0502 174-187-322


Individuos 3 56 59

Freq gen (obs) 0,0508 0,9492 0,0258 0,9742

CGA_9


P q 0,0336 174-187


Individuos 2 57 59

Freq gen (obs) 0,0339 0,9661 0,0171 0,9829

CCA_3


P q 0,0502 344-345-Daza


Individuos 3 56 59

Freq gen (obs) 0,0508 0,9492 1 0,0258 0,9742

Diversidad genética-Dg. El valor de Dg fue 0.2467, con un significado de valor medio en la escala de 0 a 5. Para su estimación, las dos colectas (Chicamocha y Sumapaz) fueron combinadas para su análisis. Se calculó Diversidad genética-Dg-por locus (hj) y por accesión (H) más los estadígrafos específicos: tamaño promedio de muestra (n), Numero efectivo de alelos (Ae) Proporción de loci polimórficos (P), Heterocigocidad esperada (He) y Heterocigocidad promedia por locus (H). La Tabla 2-6 muestra los estadígrafos por locus para siete cebadores. Ochenta y seis de 94 loci fueron polimórficos. El número de loci por cebador fue ACA=CA>AG=GT>TG>CGA>CCA y la proporción de loci polimórficos fue alta (0.907). El Anexo 2 y las Figuras 8 a 15 detalla el número de loci y valores de DG, expresado como hj (cuando esta se estima) para cada cebador. Los promedios para los estadígrafos específicos fueron: nx=25,97; Aex=2,4062; Px=0,9260; Hox=0,4008; Hex=0,3595; y la Dgx=0,2467. Adicionalmente, se estimaron cuatro estadígrafos específicos con base en número de alelos por locus dentro de accesión; los valores se reportan en las ‘últimas cuatro columnas de la Tabla 2-6.

Capítulo 2 55

Tabla 2-6: Estadígrafos para siete cebadores RAM para 59 colectas de L. alba.

No. loci

Media 13,43

Error típico 1,67

Mediana 14,00

Moda 19,00

Desviación estándar 4,43

Varianza de la muestra 19,62

Curtosis -1,50

Coeficiente de asimetría 0,23

Rango 11,00

Mínimo 8,00

Máximo 19,00

Suma 94,00

Cuenta 7,00

Mayor (1) 19,00

Menor(1) 8,00

Nivel de confianza (95,0%) 4,10

Tabla 2-7: Número de loci, polimorfismos y valores de Diversidad Genética-DG. Estadígrafos específicos (n=número promedio de alelos/locus, Ae=número efectivo de alelos, P=proporción de loci polimórficos, Ho=Heterocigocidad observada, He=Heterocigocidad esperada). Y, estadígrafos por accesión (P=Proporción de accesiones multilocus, H=Heterocigocidad promedio por accesión), más número de accesiones multiloci y mono locus.

DG (Nei, 1987)

LOCI ENTRE DENTRO ACCESIONES

Primer Sec. No. loci

Poli Mono DG N Ae P Ho He Hi P H multi Mono

1 ACA 19 19 0 0,3339 26,42 3,7245 1,0000 0,4478 0,7315 0,3603 0,9831 0,7656 58 1

2 AG 14 14 0 0,3425 37,07 0,1427 1,0000 0,6283 0,4994 0,4298 0,9661 0,5634 57 2

3 CA 19 13 6 0,1219 49,32 0.0638 0,6842 0,8359 0,1755 0,4776 1,0000 0,2991 59 0

4 CGA 9 8 1 0,1718 11,89 1,3930 0,8889 0,2015 0,9202 0,1765 0,7966 0,9270 47 12

5 CCA 8 8 0 0,3317 23,63 6,6881 1,0000 0,1250 0,9813 0,3252 0,9322 0,8001 55 4

6 TG 11 10 1 0,2483 22,45 0,4339 0,9091 0,3806 -1,3048

0,1363 1,0000 0,9632 59 0

7 GT 14 14 0 0,1768 11,00 2,0549 1,0000 0,1864 0,5134 0,0000 0,0000 0,8136 0 59


Figura 2-3: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) para 19 loci del cebador (RAM) ACA_. Este primer reveló 19 loci y 502 bandas en 59 individuos evaluados. Las frecuencias alélicas estuvieron en el rango de 0.0502 a 0.5, la DG media (expresada como hj) tuvo valor bajo (0,3339) ubicándose en el límite superior del intervalo bajo (<=0.33), con mínima=0.0502 en el locus ACA_17 y máxima=0.5 en el locus ACA_8.

Figura 2-4: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 14 loci del cebador (RAM) AG_. Este primer reveló 14 loci y 519 bandas en 59 individuos evaluados. Las frecuencias alélicas estuvieron en el rango de 0.1462 a 0.5, la DG media tuvo valor bajo (0,3425) ubicándose en el límite superior del rango bajo (<=0.33), con mínima=0.14662 en el locus AG_14 y máxima=0.50 en el locus AG_5.

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55

hj=

(1-p

2-q

2)

Cebador

Cebador GA_

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

1 5 9 13172125293337414549535761656973

hj=

1-p

2-q

2

Ceabdor ACA_

Series1

Capítulo 2 57

Figura 2-5: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 19 loci del cebador (RAM) CA_. Este primer reveló 19 loci y 937 bandas en 59 individuos evaluados. Las frecuencias alélicas estuvieron en el rango de 0.000 a 0.2265, la DG media -expresada como hj- tuvo el valor más bajo (0,1219) de la clase baja (<=0.33), con mínima=0.0000 en el locus CA_11-16 y máxima=0.2265 en el locus CA_1-10.

Figura 2-6: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 9 loci del cebador (RAM) CGA_. Este primer reveló 9 loci y 107 bandas en 59 individuos evaluados. Las frecuencias alélicas estuvieron en el rango de 0.000 a 0.4945, la DG media-expresada como hj-tuvo valor bajo (0,1718) en la clase baja (<=0.33), con mínima=0.0000 en el locus CGA_6 y máxima=0.4945 en el locus CA_7.

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73

hj=

(1-p

2-q

2)

Cebador CA_

Cebador CA_

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35

HJ=

(1-p

2-q

2)

Cebador CGA_

Cebador CGA


Figura 2-7: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 8 loci del cebador (RAM) CCA_. Este primer reveló 8 loci y 189 bandas en 59 individuos evaluados. Las frecuencias alélicas estuvieron en el rango de 0.0502 a 0.4973, la diversidad genética media -expresada como hj- tuvo el valor bajo (0,3317) ubicándose en el límite superior del intervalo bajo (<=0.33), con mínima=0.0502 en el locus CCA_3 y máxima=0.4973 en el locus CcA_5.

Figura 2-8: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 11 loci del cebador (RAM) TG_. Este primer reveló 11 loci y 247 bandas en 59 individuos evaluados. Las frecuencias alélicas estuvieron en el rango de 0.0 a 0.4755, la diversidad genética media -expresada como hj- tuvo valor bajo (0,2483) en el intervalo bajo (<=0.33), con mínima=0.0 en el locus TG_8 y máxima=0.4755 en el locus TG_7.

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31

hj=

(1-p

2-q

2)

Cebador CCA_

Cebador CCA_

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43

hj=

(1-p

2-q

2)

Cebadores TG_1-11

Cebador TG

Capítulo 2 59

Figura 2-9: Diversidad genética (hj=1-p2-q2) individual para 14 loci del cebador (RAM) GT_. El cebador reveló 14 loci y 154 bandas en 59 individuos evaluados. La frecuencia alélica única fue 0,1768, la diversidad genética media-hj-tuvo valor bajo (0,1768) ubicándose en el rango bajo (<=0.33), con valor único para todos los loci de 0,1768.

Figura 2-10: Diversidad genética promedio general (Hi=0,2467) y por cebador RAM en 59 accesiones de Lippia alba colectadas en dos zonas agroecológicas colombianas.

0,0000

0,0200

0,0400

0,0600

0,0800

0,1000

0,1200

0,1400

0,1600

0,1800

0,2000

1 3 5 7 9 1113151719212325272931333537394143454749515355

hj=

(1-p

2-q

2)

Cebadores 1 a 14

Cebador GT

ACA AG CA CGA CCA TG GT Hi

Hi 0,3339 0,3425 0,1219 0,1718 0,3317 0,2483 0,1768 0,2467

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0,3500

0,4000

hj=

(1-p

2-q

2)


Discusión Todos los cebadores detectaron diversidad y estructura genética baja en la muestra de trabajo. Los siete cebadores mostraron valores de hj cercanos a cero, excepto el cebador AG (hj=0,1466). Cinco de los siete (71,4%) primers tuvieron valores de hj cercanos a 0,5 como valor máximo. El cebador AG obtuvo el rango más alto de hj con min.=0,1466 y máx.=0,5; y el cebador CA el intervalo más bajo con min.=0,0 y máx.=0,2265. El primer GT fue neutro con un hj=0,1768. De hecho, los marcadores RAM estuvieron por debajo de los valores hj obtenidos por Montanari et al., (2004); Viccini et al., (2004-2006); Dias et al., (2005-2006); Pereira et al., (2006); Yamamoto et al., (2008); y Manica-Cattani et al. (2009), sugiriendo la presencia de mayor DG (0,62 con ISSR y 0,589 con RAPD) y menor variabilidad genética-VG en Brasil, usando marcadores (también) dominantes en poblaciones brasileras de L. alba.

Estructura genética (poblacional) La Dg dentro de poblaciones (WP) fue significativamente mayor que entre poblaciones (AP), detectando un proceso común el cual está estructurando (generando una estructura genética en) las poblaciones estudiadas. La diferenciación poblacional (o estructural) fue determinada usando un AMOVA y el estadístico FST. La prueba de diferenciación entre poblaciones usando el AMOVA mostró la menor variación haplotípica entre poblaciones (Est.Var.AP=0,141) con remanente (95%) distribuida dentro de la población (Est.Var.WP=2,46). El valor FST fue 0,054 (p<0,001), indicando diferenciación genética pequeña entre regiones. El mayor aporte a la respuesta obtenida por la prueba lo generó la fuente de variación entre poblaciones-AP (MS=6,381); no obstante, su estimativo de varianza fue apenas el 5% de la varianza total estimada (Tabla 2-8).

Tabla 2-8: Análisis molecular de varianza-AMOVA- y valor de FPT para 58 accesiones colombianas de L. alba.

Source df SS MS Est. Var. Proportion

Among Pops 1 6,381 6,381 0,141 5%

Within Pops 56 137,744 2,460 2,460 95%

Total 57 144,125 2,601 100%

Stat Value P(rand >= data)

PhiPT 0,054 0,001

PhiPT max 0,948

Phi'PT 0,057

Los resultados del análisis molecular de varianza con base en la matriz binaria de distancias para cálculo de PhiPT mostraron los valores porcentuales siguientes:

Capítulo 2 61

Tabla 2-9: Valores porcentuales por cebador dentro (WI) y entre (AI)

Cebador Entre(AI) Dentro (WI)

ACA 46% 54%

AG 3% 97%

CA 0% 100%

CGA 36% 64%

CCA 57% 43%

TG 22% 78%

GT 21% 79%

Full 23% 77%

Estructura jerárquica Se examinó la estructura jerárquica usando un análisis de conglomerados (UPGMA) y PCoA de las dos regiones y diferenciación genética entre poblaciones a partir de un AMOVA (Tabla 7). La matriz de similaridad entre los dos grupos basado en el coeficiente de Nei&Li se muestra en el Anexos E y F. El clúster (Figura 16) y el PCoA (Figuras 17 y 18) mostraron la existencia de diferentes conglomerados geográficos en cada subpoblación. El nivel de diferenciación entre las dos poblaciones fue relativamente bajo pero significativo; igual resultado obtuvo Martínez (2008) en L. origanoides, una especie relacionada, en la región del Chicamocha-Colombia. Figura 2-11: Estructura jerárquica de dos poblaciones colombianas de L. alba con base en polimorfismos generados por siete cebadores RAM.

A

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r

a

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D

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Na me o f Ob s e r v a t i o n o r Cl u s t e r

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0

0

3

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2

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0

1

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1 3 3

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9

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7

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3

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6

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6

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3

7

9

3

6

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3

7

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7

0

3

7

7

3

5

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3

5

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3

1

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3

1

3

3

1

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6

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1

1

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3

1

7

4

1

8

7

1

8

9

2

0

1

3

4

1


Figura 2-12: Región Chicamocha. Análisis de coordenadas principales-PCoA-basado en polimorfismos RAM y distancia genética de Nei&Li. Tres coordenadas explicaron el 80.49% de la variación hallada por la prueba.

Figura 2-13: Región Sumapaz. Análisis de coordenadas principales-PCoA-basado en polimorfismos RAM y distancia genética de Nei&Li. Tres coordenadas explicaron el 72,8% de la respuesta obtenida por la prueba.

Estructura espacial. La estructura espacial a través de poblaciones (combinada), con valor Omega (Ω=89.096) y de probabilidad [P(rand>=data)] para el correlograma combinado fue significativo. La relación entre distancias geográficas y las distancias de Nei usando Mantel fue significativa (p≤0.001), indicando aislamiento por distancia entre

123

4

5 67

8

9

1011

121314

15 1617

18

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21

22

23

Co

ord

. 2

Coord. 1

Principal Coordinates (PCoA)

Series1

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8

9

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18 19

20212223

2425

262728

293031

3233

34

35

Co

ord

. 2

Coord. 1

Principal Coordinates (PCoA)

Series1

Capítulo 2 63

las subpoblaciones (Figura 2-14/5). Examinando la relación entre distancias geográficas y distancias genéticas, fue significativa para Sumapaz (p≤0.04) y no significativa para Chicamocha (p≥0.23); indicando aislamiento por distancia en Sumapaz y lo opuesto, (no aislamiento por distancia) en Chicamocha. Las Figuras 2-14/5 muestran la estructura espacial entre (Figura 2-14) y de cada población (Figuras 2-16/7). El correlograma (Omega=97.136) para la sub-población Sumapaz mostró estructura espacial significativa [0.001 P(Omega-rand≥Omega-data]. El correlograma (Omega=28.488) para la estructura espacial de la población Chicamocha no fue significativa [0.098 P(Omega-rand≥Omega-data. El análisis de la estructura espacial global muestra que la subpoblación Sumapaz está estructurada, mientas que Chicamocha no. Figura 2-14: Estructura espacial combinada para las dos subpoblaciones (Chicamocha y Sumapaz).

Figura 2-15: Estructura espacial para cada población, Chicamocha y Sumapaz.

-0,400

-0,200

0,000

0,200

0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5

r

Distance Class (End Point)

Combined Spatial Structure Analysis

r

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0,000

0,500

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

r


Spatial Structure Analysis for each Population

GD Chicamocha

GD (2) Sumapaz


Figura 2-16: Correlograma (Omega=97.136) para la estructura espacial de la población Sumapaz, [0.001 P(Omega-rand≥Omega-data], mostrando ser una población estructurada.

Figura 2-17: Correlograma (Omega=28.488) para la estructura espacial de la población Chicamocha no significativo [0.001 P(Omega-rand≥Omega-data], mostrando una población no estructurada.

Discusión La estructura genética poblacional se determinó usando los estadígrafos específicos F, AMOVA, PCoA y Mantel. El análisis de Mantel agrupó los individuos por sus características o proximidad geográfica. Los análisis de autocorrelación espacial mostraron un patrón consistente de aislamiento por distancia con un moderado pero significativo nivel de estructura espacial. Los resultados obtenidos sugieren atender lo propuesto por Suárez et al. (2008) quienes refieren muestrear este tipo de Verbenaceae a distancias mayores a 1.2 km obteniendo genotipos diferentes, lo que ayudaría a preservar los niveles de DG. Las causas de este patrón espacial son desconocidas y puede estar asociado, entre otros a dispersión restringida de semilla y/o distancias cortas de movimiento de polen (Suárez et al., 2008).

-0,500

0,000

0,500

0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5

r


Results of Spatial Structure Analysis

r

U

L

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0,500

0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5

r


Results of Spatial Structure Analysis

r

U

L

Capítulo 2 65

3. Capítulo 3

3.1 Variabilidad fitoquímica entre accesiones colombianas de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown

3.1.1 Introducción

Aceites esenciales/metabolitos secundarios en plantas Los aceites esenciales son líquidos aceitosos aromáticos olorosos [a veces semi-líquido o sólido], obtenidos a partir de material vegetal [flores, brotes, semillas, hojas, ramas, cortezas, hierbas, maderas, frutos y raíces] (UNCTAD, 2005). Dependiendo del tipo y calidad, los aceites esenciales pueden ser utilizados en diferentes industrias. Se aplican principalmente en la industria alimentaria como aromatizantes, la industria del perfume-fragancias, y la farmacéutica, para agregar sabor y/u olor a medicamentos. Su uso en el servicio de salud se denomina "aromaterapia" (UNCTAD, 2005). En plantas, la producción de metabolitos secundarios-ms-es de origen genético y cumplen funciones de atracción/ repulsión (Viccini et al., 2004; Pereira et al., 2006). No obstante, su expresión está determinada por condiciones pre-existentes en su hábitat (presencia/ausencia de: fitófagos, otras especies vegetales, componentes biofísicos, otros posibles). Estos ms están siendo activamente usados como bioprotectantes con acción _cida [sufijo] sustentables, en actuales sistemas de producción agrícola alrededor del mundo (Das & Das, 2005). La presencia, el rendimiento y la composición de los metabolitos secundarios en las plantas, incluyendo los componentes volátiles y los que ocurren en los aceites esenciales, pueden verse afectados de varias maneras, desde su formación en la planta hasta su aislamiento final (Figueiredo et al., 2008). El conocimiento de los factores que determinan la variabilidad química y el rendimiento en cada especie son muy importantes (Figueiredo et al., 2008), en los que se incluyen las: (a) variaciones fisiológicas; (b) condiciones del medio ambiente; (c) variaciones geográficas; (d) factores genéticos y su evolución; (e) política y condiciones socioculturales y también (f) cantidad de material vegetal / espacio (Riccardi et al., 2000; Jarvis et al., 2006; Figueiredo et al., 2008; Palacio y López, 2008).

Orden Lamiales El potencial fitoquímico de las Lamiales ha sido revaluado en: Eusteralis deccanensis, la cual posee el quimiotipo patchoulene (Thoppil, 2000), Clerodendron infortunatum L. (Verbenaceae) es usado como pesticida, siendo un componente de jardines en Barak-Assam NE-India (Das and Das, 2005), Aegiphila filipens (Verbenaceae) and Lippia dulcis [Verbenaceae] (Arango, 2004) la cual es usada en medicina tradicional colombiana, actualmente se prueba como ingrediente en pasta dental (Pino-Benítez y Valois, 2004), Lippia scaberrima en histoquimica (Combrinck et al., 2007); y Lippia


alba por propiedades antioxidantes y neurosedativa de polifenoles e iridiodeos (Hennebelle et al., 2007); la decocción filtrada de Phyla scaberrima (Juss. ex Pers) Moldenke y Stachytarpheta jamaicensis (L.) Vahl; han sido usadas en tratamientos antipatológicos y alteraciones del ciclo menstrual en humanos (Godínez y Volpoto, 2008).

Composición del aceite esencial de Lippia alba Su aceite esencial tiene un relativo alto contenido de la carvona, entre 30 y 35% (Castro et al., 2002). Esto lo convierte en un interesante sustituto de otros aceites esenciales que contienen este mismo componente. Otro componente químico importante de L. alba es el limoneno, componiendo más del 25% del aceite esencial (UNCTAD, 2005). En L. alba, los metabolitos secundarios son flavonoides, alcaloides y principalmente los aceites esenciales producidos por glándulas epidermales en células del mesófilo. En investigaciones recientes, los principales compuestos del aceite esencial observados en hojas son: terpinene, p-cymene, caryophylene, myrcene, geraniol, and neral (Castro et al., 2002.; Jarvis et al., 2006; Blanco et al., 2007; Celis et al., 2007; Mesa et al., 2009; Escobar et al., 2010). Variabilidad química en plantas Las plantas que viven en hábitats tropicales han tenido que desarrollar variedad de defensas para protegerse de las enfermedades virales, agentes patógenos, insectos y mamíferos predadores (Berier et al., s.f.). La biodiversidad de especies de plantas tropicales, junto con la diversidad química encontrada en cada planta, nos lleva a la conclusión de que las plantas tropicales son quizás la fuente más valiosa de nuevas entidades químicas bioactivas (Berier et al., s.f.). En términos de los componentes fitoquímicos sólo cinco grupos se han definido para más de 100 variedades con base en consideraciones de carácter regional y organolépticas (Verma et al., 2004).

Variabilidad química de aceites esenciales en Lippia alba La composición química del aceite esencial de L. alba depende sensiblemente del origen geográfico de la planta, las condiciones de su cultivo, la edad y la parte de la planta empleada para la extracción, y de algunos otros factores geobotánicos (Stashenko et al., 2003). La mayoría de estudios en L. alba son determinaciones genotípicas (Montanari et al., 2004; Viccini et al., 2004-2006; Dias et al., 2005-2006; Suárez et al., 2007-2008; Yamamoto et al., 2008; Martínez et al., 2008), caracterizaciones bioquímicas [quimiotipificación] (Fischer et al., 2004; Hennebelle et al., 2006) y de morfología externa (Montanari et al., 2004; Hennebelle, 2007). Individuos de L. alba de la región nororiental de Colombia mostró ser un quimiotipo nuevo, no descrito previamente en la literatura, conteniendo la carvona [40-57%] como componente mayoritario en los aceites, seguido de limoneno [24-37%], biciclosesquifelandreno [2-22%] piperitenona [1-2%], piperitona [0.8-1.2%] y el β-burboneno [0.6-1.5%]. El componente principal (en las fracciones volátiles) fue limoneno [27-77%], seguido por la carvona [14-30%], biciclosesquifelandreno [1-33%] y el β-burboneno [0.5-6.5%] (Stashenko et al., 2003). El análisis de aceites esenciales obtenidos de hojas de muestras de Guayana Francesa, Martinica y Guadalupe, mostraron siete quimiotipos diferentes (Hennebelle et al, 2006), existiendo una posible conexión entre quimiotipos y morfotipos (Hennebelle et al., 2006). La interacción GxE de 10 genotipos de cuatro composiciones químicas (quimiotipos) de L. alba de tres regiones del estado de Sao Paulo (SP), Brasil, tuvieron un rango amplio de producción de hoja, mientras que el rendimiento de aceites esencial tuvo una alta y uniforme determinación genotípica. Variación no cualitativa fue detectada

Capítulo 2 67

para composición química, y la variación cuantitativa fue de baja magnitud. Genotipos Linalol y limoneno/la carvona fueron invariablemente más productivos para rendimiento de aceite que los genotipos citral y mirceno/canfor (Yamamoto et al., 2008). La variación de aceite esencial de Lippia junelliana de 16 sitios diferentes de medio oeste Argentino mostró ocho compuestos como componente importante en los aceites (Juliani et al., 2002). De acuerdo con estos componentes, cuatro quimiotipos silvestres se han detectado. El quimiotipo primero contenía altos niveles de ocimenone (54-76%) con cantidades más bajas de mirceno (10%). El segundo se componía de grandes cantidades de dihidrocarvona (59-80%). Los principales componentes se encuentran en la tercero, quimiotipo limoneno (10-40%) y piperitenona (10-40%) y la cuarta contenía quimiotipo limoneno (41%) y óxido de piperitenona (26%) (Riccardi et al., 2000; Juliani et al., 2002). Las especies de L. alba (Miller) N.E. Brown se caracterizan por una gran variabilidad en morfología y composición química del aceite esencial (Oliveira et al., 2006). Tavares, et al. (2005), presentan datos sobre la variación cuantitativa de los principales componentes volátiles de la producción de linalol en un quimiotipo de L. alba. El contenido de [alpha]-pineno, (Z)-3-hexenilo y [alpha]-gurjunene fue mayor en las plantas madre cultivadas en el suelo que en las plántulas crecieron en medio MS, mientras que el contenido de sabineno, mirceno, 1,8 -cineol y p-menta-l, 5,8-trieno fue menor. La adición de 0.2.3 μM de IAA en el medio fue significativamente mayor para sabineno y el contenido mirceno. La adición de 0,92 μM de cinetina aumentó significativamente el 3 (S) - (+)-nivel linalol (Tavares et al., 2005). En Colombia, Camargo y López (2008) y Palacio y López (2008) evaluaron la respuesta de L. alba a la disponibilidad de agua; y nitrógeno (Hernández et al., s.f.; Antolinez y López, 2008). Las variaciones cuantitativas de los principales componentes volátiles de la producción de linalol en quimiotipo L. alba están asociadas con factores nutricionales y ambientales (Hernández et al., s.f.; Tavares et al., 2005; Camargo y López, 2008; Palacio y López, 2008; Antolinez y López, 2008). La composición química y la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales en L. alba las investigó Oliveira et al., (2006) con en el fin de relacionarlas a sus usos tradicionales. El análisis de los aceites esenciales que permitió la identificación de dos especies de Lippia alba, una como quimiotipo mirceno-citral (15% y 37,1%, respectivamente) y Lippia alba f. intermedia como un quimiotipo citral (22,1%). Los aceites esenciales de ambas especies fueron activos contra todos los microorganismos probados (bacterias y hongos) mediante el ensayo de halos de inhibición con rango desde 1,1 hasta 5,0 cm; probablemente debido a su alto contenido de monoterpenos oxigenados (51,0% y 40,1%, respectivamente), representada principalmente por aldehídos y alcoholes. Los datos químicos y farmacológicos de L. alba obtenido por Oliveira et al., (2006) estuvieron de acuerdo con la encuesta etnobotánica. En Colombia, EL Centro de Investigaciones en Biomoléculas-CIBIMOL- de la Universidad Industrial de Santander ha realizado, entre otros, estudios valorativos en enfermedades tropicales, de bioactividad y principios activos de Lippia alba como antimicrobial (Bueno y Stashenko, 2009); antiviral [Ocazionez et al. (2010) en virus del dengue; Meneses et al., (2009) en virus de la fiebre amarilla], antifúngica (Mesa et al., 2009) en Candida y Aspergillus (Montiel et al.,2007), en bacterias [Bueno et al., (2009) en M. tuberculosis]; anti-protozoario (Escobar et al. 2010). Una lista completa de reportes la ubica en http://tux.uis.edu.co/quimica/ investigacion/centros/cibimol. La apuesta en la presente investigación fue determinar la variabilidad química de 59 accesiones de Lippia alba de tal forma que permitiera una aproximación a la estructuración poblacional de la especie en Colombia. Se logró, mediante la

http://tux.uis.edu.co/quimica/%20investigacion/centros/cibimol


construcción de una matriz de datos químicos que permitió: a) determinar variabilidad química y b) conformar una base de datos compatible con datos moleculares y ecológicos que determinó la estructura genética y espacial de la población colombiana de L. alba.

3.1.2 Metodología

Material vegetal. Muestras de 200 gramos de tejido (excepto raíces) de 59 accesiones de L. alba colectadas en dos zonas agroecológicas de la Región Andina colombiana (Chicamocha y Sumapaz), conformantes del Banco de Lippia alba del CEUNP. Las 59 accesiones forman parte del Banco in vivo ex situ de Lippia alba del Centro Experimental Universidad Nacional-Sede Palmira (CEUNP). Para el estudio, se consideraron los ecosistemas Bs-T (Bosque seco Tropical) y Bh-T (Bosque húmedo Tropical), dado que los remanentes de Bs-T contienen familias de plantas similares a los hallados en Bh-T (IAVH, 1998). Se prospectaron dos agroecosistemas contrastantes, Cañón del rio Chicamocha y Cañón del rio Sumapaz; regiones con máximo número de estudios y colectas de L. alba, conteniendo el mayor número de Zonobiomas y agroecosistemas dentro de zonobioma; incluyendo y los ecosistemas de Bs-T y Bh-T. Tamizaje fitoquímico (García, 2003; García et al., 2003; García, 2006; Baldizán et al., 2006) y estimativos de varianza (Peakall & Smouse, 2006). Pruebas colorimétricas [por duplicado] con etanol y cloroformo como solventes, valoraron la presencia (1)-ausencia (0) de siete grupos de metabolitos secundarios contenidos en la muestra de trabajo, usando el protocolo, equipos y apoyo técnico del Recurso Humano (Anexo G) adscrito al Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira [diciembre de 2012/enero de 2013]. Los estimativos de varianza entre y dentro de poblaciones e individuos se estimaron usando el algoritmo desarrollado por Peakall & Smouse (2006). Para dar respuesta a la pregunta de investigación, se aplicó el Programa GenAlEx (Peakall & Smouse, 2006) a la matriz de datos de laboratorio (de presencia/ausencia de metabolitos) a partir de pruebas duales con etanol y cloroformo como solventes, para valorar la presencia (1)-ausencia (0) de siete metabolitos secundarios [1. derivados de cumarinas, 2. esteroides y terpenoides, 3. flavonoides, 4. glicósidos cardiotónicos, 5. saponinas, 6. heterósidos y 7. taninos] en 59 accesiones colombianas de Lippia alba. Las pruebas se desarrollaron entre diciembre de 2012 y enero de 2013, bajo la supervisión del equipo de trabajo, usando el protocolo (Anexo G) desarrollado por el Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira. Metodologías analíticas. Cuatro metodologías analíticas y dos tipos de datos fueron usadas para establecer grupos y origen (genético, ambiental o genético-ambiental) de la variabilidad química en la muestra de trabajo. Se utilizaron dos grupos de procedimientos, Grupo I (DISTANCE, CLUSTER-TREE) y Grupo II (FACTOR, PRINQUAL-BIPLOT) de SAS/STATv9.0; la estrategia WARDMLM.SAS y el Programa GenAlEx (Peakall & Smouse, (2006). Paso I preliminar: Los datos crudos fueron procesados usando el procedimiento DISTANCE+CLUSTER+TREE de SAS/STAT v9.0 para hallar los posibles grupos químicos. Paso II. La matriz de datos de laboratorio (Anexo 1) fue procesada con los procedimientos PRINQUAL y FACTOR de SAS/STAT v9.0 para obtener un número óptimo de Factores Comunes (variables sintéticas continuas), conformante de la matriz ultima para el análisis final conjunto (ecológicos, químicos y moleculares). Una matriz final homologada mediante Factores Comunes y únicos, fue procesada para determinar el análisis concluyente y número de grupos. Adicionalmente, se usó la estrategia WARDMLM.SAS para identificar

Capítulo 2 69

número posible de grupos químicos, más un Biplot con PRINQUAL-FACTOR de SAS/STAT. La base de la investigación fue el Análisis de Factores con Probabilidad Máximas-AFPM. El AFPM calcula estimativos de comunalidad preferentes con valores de probabilidad máxima (o máxima probabilidad). La forma computacional más simple y eficiente del Análisis Factor(ial) es el AFPM, el cual es obtenido por la misma vía como los ACP, con el uso de la opción PRIORS=MAX de SAS/STATV9.0, en presencia de matrices singulares. La forma usual del análisis es:

proc factor data= SAS-data-set method=principal scree mineigen=0 priors=max outstat=<libname>; run;

El Cuadrado de la Correlación Múltiple (CCM) de cada variable con todas las demás variables fue usado como Estimativo de Comunalidad Preferente [o más importante] (En: SAS/STATv9.0); y es la base para la conformación final de grupos. El grupo de metodologías analíticas usadas, son procedimientos accequibles en diferentes paquetes estadísticos, la dificultad radica en el Programa estadístico a elegir y la construcción de una macro que los una. En el presente estudio se usó el lenguaje IML de SAS/STATv9.0. Interpretación del análisis. La matriz de datos generado por la prueba fueron analizados usando el algoritmo desarrollado por el Programa GenAlex v.6.5 (Peakall & Smouse, 2006) para datos binarios (1/0). La matriz de datos estuvo conformada por 58 accesiones (35 de la Región I=Sumapaz y 23 de la Región II= Chicamocha). Los resultados del análisis de varianza se obtienen a partir de una matriz de distancia para el cálculo de estadísticos F con base en las formulas:

Fst = AP / (WI + AI + AP) = AP / TOT

Fis = AI / (WI + AI)

Fit = (AI + AP) / (WI + AI + AP) = (AI + AP) / TOT. Coeficiente de endogamia

Nm = [(1 / Fst) - 1] / 4 Numero efectivo de migrantes por generación

AP es el Estimativo de varianza entre Poblaciones, WI es la varianza entre Individuos y WP es el Estimativo de varianza dentro de Poblaciones; por su sigla en inglés. Los estadígrafos a considerar en el análisis son los estadígrafos de F de la Tabla RD1. Los valores de Fmax/F’st corresponden al rango de valores mostrados a través de 14 tipos de metabolitos secundarios [ms] valorados con dos tipos de solventes, cloroformo y etanol.

3.1.3 Resultados

Posibles grupos fitoquímicos presentes en la muestra. El análisis para estimar varianzas a partir de los datos fitoquímicos se muestra en la Tabla 3-1. La variabilidad química dentro de individuo [WI=2.060] tuvo indicador alto y entre poblaciones [AP=0.033], bajo; entre individuos mostró valor cero [AI=0.000]. AP fue la fuente de variación con mayor peso en la respuesta dada por el ANAVA [MS=2.567]. La variabilidad entre poblaciones [AP=0.033] fue baja con un FST=0.023 P(rand≥data=0.070) y proporción 2%. No obstante, el estimativo de varianza con


mayor proporción ocurrió dentro de individuos [WI=98%]; es decir, la mayor variabilidad se dio dentro de individuo. Los valores máximos y mínimos para FST fueron 0.597 y 0.038 respectivamente. Análisis genético con base en variables químicas. El índice de fijación promedio (Fst) para todas las poblaciones fue de 0.023 con un rango que fluctuó entre 0.038 y 0.597 (p≥0.07). La diferenciación genética entre poblaciones (Fst) generado por la prueba indica que químicamente las frecuencias alélicas son muy parecidas (Fst=0.023) en las dos subpoblaciones; es decir, no ha habido diferenciación (Hs=Ht); mostrando mucho flujo génico y poca deriva génica, corroborando que el flujo génico ha sido el proceso evolutivo determinante (Nm=10.82). El coeficiente de endogamia (o de coancestro) debida a apareamientos no aleatorios dentro de poblaciones, mostró un exceso de heterocigosis (Fis= -0.46) en las poblaciones, como una posible selección a favor de las heterocigotos. Tabla 3-1: Estimativos de Varianza [Est.Var.] para el tamizaje fitoquímico de 58

accesiones colombianas de L. alba, usando el Programa GenAlex v6.5.

Source Df SS MS Est. Var. Proporción

Among Pops 1 2.567 2.567 0.033 2%

Among Indiv 56 42.493 0.759 0.000 0%

Within Indiv 58 119.500 2.060 2.060 98%

Total 115 164.560 2.093 100%

F-Statistics Value P(rand >= data)

Fst 0.023 0.070

Fis -0.462 1.000

Fit -0.429 1.000

Fst max 0.597

F'st 0.038

Nm 10.819

Discusión principal El grado de diferenciación fitoquímico (por ms) entre poblaciones fue 0.033. Es decir, las dos poblaciones son muy similares debido probablemente a su forma particular de diseminación en Colombia (Antropocoria). No obstante, ese 2% indica una porción mínima de individuos con grado máximo de diferenciación genética a causa de su carácter alógama y viabilidad baja de semilla; de hecho, los resultados evidencian reproducción sexual y diferenciación entre poblaciones debido muy probablemente a alogamia más factores ambientales locales. Los estimativos de varianza: a) entre regiones, indican poblaciones similares. Los individuos presentes en cada región son sub-poblaciones; b) entre individuos, muestran quimiotipos no diferenciables. Entre regiones la diferencia es apenas del 2%, indicando la presencia de una población fragmentada (o sub-poblaciones) en las regiones evaluadas. El estimativo de varianza dentro de individuo, indica variabilidad alta (98%) para contenidos de ms causado por respuesta fisiológica/ambiental. El grado de diferenciación para contenido de ms (de origen genético) entre y dentro de individuos, tuvieron valores negativos (Tabla 1). Lo que significa que, químicamente los

Capítulo 2 71

individuos fueron muy parecidos debidos probablemente a su baja capacidad de reproducción sexual y su forma de propagación-diseminación (Antropocoria=Diseminación activa de material reproductivo, debido a la acción humana). Los posibles grupos químicos se visualizan en el Biplot de la Figura 1. El rango de valores de F nuestra la posibilidad: a) de identificar al menos un morfotipo especial y b) discriminante de los ms en la conformación final de grupos. Existen elementos multiplicadores interrelacionados que pueden intervenir en esta variabilidad, como: determinantes genéticos, ambientales, de herbivoría y patógenos. L. alba presenta una amplia individualidad genética, mostrando Expresividad variable causado por caracteres poligénicos. Determinantes genéticos que intervienen en la respuesta química de L. alba a las condiciones ambientales. Las variantes interindividuales determinan el rango amplio de adaptabilidad de la especie a condiciones ambientales en todo el rango altitudinal colombiano. Esta variación en el genoma es causa de la respuesta a la presencia de ms. L. alba muestra variabilidad interindividual para contenido de ms dependiente de múltiples factores derivados de la expresión de la variabilidad biológica interindividual. Respuestas específicas (obtenidas de la prueba) para:

Número grupos químicos presentes en la muestra de trabajo. La estrategia WARDMLM.SAS determinó la presencia de nueve grupos fitoquímicos. La Tabla 3-2 y el Anexo 1 muestran el número final de grupos fitoquímicos generados por la estrategia WARDMLM.SAS, con base en la matriz de datos de laboratorio. La matriz de datos crudos (de presencia-ausencia) muestran nueve grupos fitoquímicos así: Grupo I (Accesiones 189-359-360-362/3/4/5); Grupo II (174-201/2-209-373/4/5/6/7/8/9); Grupo III (300/1/2/3/4/5); Grupo IV (346-348/9-350/1/2/3/4/356/7); Grupo V (CEUN-308-310/1/2/3/4-320-322); Grupo VI (3-4-5); Grupo VII (369-370); Grupo VIII (187-366/7); Grupo IX (340/1/2/3/4/5-347). No obstante, el Biplot de la Figura 1 sugiere un grupo químico predominante mayoritario [en Colombia] y la presencia de al menos tres accesiones con características químicas individuales; esto lo demuestra las presencias/ausencias de ms en las accesiones 201, 213 y 341; las cuales desplazaron, el centroide hacia la derecha y parte inferior del Biplot. La localización de estas accesiones dentro del Biplot indica características químicas propias y distintas al resto de accesiones incluidas en la prueba. Este resultado sugiere la ‘posible’ colecta de individuos propagados (sexualmente) por semilla; su verificación se realizó mediante marcadores moleculares RAM. Tabla 3-2: Número final de grupos y de individuos por grupo [Peso-Proporción]

obtenidos con la estrategia WARDMLM.SAS.

Grupo Frecuencia Peso Proporción

1 7 7.0000 0.118644

2 10 10.0000 0.169492

3 6 6.0000 0.101695

4 11 11.0000 0.186441

5 9 9.0000 0.152442

6 4 4.0000 0.067797

7 3 3.0000 0.050847

8 3 3.0000 0.050847

9 6 6.0000 0.101695


Las frecuencia destacadas fueron, en su orden: Taninos>Esteroides&Terpenoides> Flavonoides; la menor frecuencia estuvo en Heterósidos y Glicósidos cardiotónicos. Los siete tipos de ms (Tabla 3) valorados colorimétricamente en dos solventes mostraron frecuencias altas para Taninos (Cloroformo-[C]=0.8136 y Etanol [E]=0.6949), Esteroides&Terpenoides (C=0.8305 y E=0.6271) y Flavonoides (C=0.6271 y E=0.7458); y bajas para Heterósidos (C=0.0169 y E=0.000) y Glicósidos cardiotónicos [C=0.0508 y E=0.0508]. Los derivados de cumarinas y saponinas mostraron valores intermedios; Los glicósidos y heterósidos fueron excepcionalmente bajos, 0.05 y 0.01 respectivamente. En general, las frecuencias [por tipo de solvente] fueron relativamente mayores para cloroformo, con excepción hecha para flavonoides. En Saponinas, Esteroides y Taninos, las frecuencias conjuntas (cloroformo y etanol) mostraron valores con diferencias significativas entre solventes. Los valores de frecuencia fueron: C=0.3729 y E=0.1356 para Saponina; C=0.8305 y E=0.6271 para Esteroides y C=0.8136 y E=0.6949 para Taninos. En cumarinas, glicósidos y heterósidos las frecuencias fueron iguales (Tabla 3). Los restantes ms tuvieron frecuencias sin diferencias significativas entre solventes, verificadas todas estadísticamente. En una escala arbitraria, frecuencias menores de 0.3, se consideran bajas; entre 0.31 y 0.6, aceptable; entre 0.6 y 1.0 buenas. Lo valores [de frecuencia] generados por el análisis dice: Esteroides, flavonoides y taninos, bien; Saponinas, apenas aceptable en el solvente cloroformo. Cumarinas, Glicósidos y heterósidos, bajas. Tabla 3-3: Proporción de individuos con valor [1] de presencia de siete tipos de

metabolito secundario en dos tipos de solvente, ordenados por tipo de solvente:

Cloroformo* y Etanol**.

Metabolitos Cloroformo* Etanol

Esteroides & Terpenoides

0.8305 0.6271

Taninos 0.8136 0.6949

Flavonoides 0.6271 0.7458

Saponina espumídica 0.3729 0.1356

Derivados de Cumarinas 0.1186 0.1186

Glicósidos cardiotónicos 0.0508 0.0508

Heterósidos Cianogénicos

0.0169 0.0000

Ordenado por etanol

Metabolitos Cloroformo Etanol**

Flavonoides 0.6271 0.7458

Taninos 0.8136 0.6949

Esteroides & Terpenoides

0.8305 0.6271

Saponina espumídica 0.3729 0.1356

Derivados de Cumarinas 0.1186 0.1186

Glicósidos cardiotónicos 0.0508 0.0508

Heterósidos Cianogénicos

0.0169 0.0000

Capítulo 2 73

Discusión El tamizaje fitoquímico demostró la ausencia de alcaloides en Lippia alba (Hernández et al., s.f.; Morataya et al., 2006; Medina-López et al., 2011). Con valores cero para alcaloides, la estrategia WARDMLM.SAS definió un número final de nueve grupos fitoquímicos. La sustentación técnica para el número de grupos la definió la estrategia en el paso III, generando una lista con los log-Likelihood correspondientes a cada uno de los posibles números de grupos y el gráfico logL versus número de grupos. Los valores altos de frecuencia fitoquímica de taninos, esteroides & terpenoides y flavonoides define los quimiotipos presentes en Colombia. Algunas de las propiedades medicinales de Lippia alba se deben en efecto al alto contenido de terpenos livianos como 1,8-cineol, limoneno, b-mirceno (Riccardi et al., 2000). La actividad antioxidante y/o actividad antimicrobiana son atribuibles a los flavonoides y fenoles/taninos (Martínez et al., 2002; Núñez et al., 2008; Escamillas et al., 2009; López M.T. En: http://doymaforma.com el 04/05/2013). La variabilidad fitoquímica hallada en la muestra de trabajo llevó a clasificarla en los nueve grupos fitoquímicos detallados en el Anexo 1. Los valores bajos de frecuencia fitoquímica revelan la existencia de otros posibles quimiotipos para Colombia. Valores contrastantes (altos y bajos) de frecuencia fitoquímicos, indican la presencia de un grupo mayoritario o quimiotipo predominante en Colombia. La estrategia WARDMLM.SAS muestra tres grupos mayoritarios y es más discriminante que el Biplot. No invalida la información generada por el Biplot, sino que realiza un análisis más discriminante (detallado). Los resultados obtenidos por las diferentes pruebas apuntan a que la variabilidad fitoquímica de la muestra de L. alba, es del tipo fisiológica-ambiental y no existen factores epigenéticos involucrados. Los análisis genéticos con marcadores RAM lo demuestran. El resultado sugiere que cloroformo fue mejor solvente, sin poder ser demostrado técnicamente en este documento. En el tamizaje fitoquímico de las 59 muestras, se utilizaron estándares conocidos para comparar los posibles metabolitos presentes en las muestras, muchos de los cuales corresponden a los reportados para Colombia en la literatura, presentando frecuencias altas esperadas. No obstante, por su carácter cualitativo, se requieren ajustes para validación de lecturas de cada método de caracterización de extractos, como tablas colorimétricas, espectrofotómetros y otros posibles, que permita construir escalas colorimétricas. Análisis con base en datos de laboratorio procesados mediante Análisis de Factores con Probabilidad Máxima-AFPM. El clúster con el método Ward y la distancia de Gower, se aproxima mucho más al Biplot de la Figura 3-1 y al clúster generado por los marcadores moleculares RAM. Dos grandes grupos, uno conformado por las accesiones 187-356-340-454-370-367-369-341 y el segundo gran grupo conformado por tres subgrupos (Figura 3-2). La accesión 341 formó completamente independiente. El clúster muestra que son químicamente iguales entre sí: las accesiones (1- 351); (356-359-360-378); (362/3/4/5-374/5); (4-320); (174-189-373); (202-209-217-300-302/3/4/5-377); (301-346-344), sin estar asociado a región. El Biplot generado por FC se muestra en la Figura 3-2. Las características del Biplot-FC, son ampliamente distintas a la mostrada por el Biplot de la Figura 3-3, y mucho más discriminante. El más confiable es que se asemeje a los reportados por los marcadores moleculares.

http://doymaforma.com/


Figura 3-1: Biplot para presencia/ausencia de ms en 59 accesiones de Lippia alba

El procedimiento AFPM (Análisis de Factores con Probabilidad Máxima) usó la opción

PRIORS=MAX en presencia de matrices con correlación singular; los valores propios

de la matriz reducida de correlaciones (Total=10.2698937, Promedio=0.51349468)

definió 11 factores con el criterio de retenibles explicando el 1.1464 de la variación

hallada en la prueba. La matriz de 11 factores incluyendo región, altitud y

Capítulo 2 75

coordenadas (Norte y Occidente) decimales; se muestra en el Anexo 3 y forma parte

de la matriz final de marcadores conjuntos que definieron la estructura genética y

fitogeográfica de muestras de Lippia alba usada en la prueba. Esta salida (output)

generada por el AFPM se considera la matriz de marcadores fitoquímicos, a partir de

la cual se generó el respectivo Biplot y el clúster Fitoquímico. El Biplot y el clúster

generado por los AFPM se muestran en la Figura 2 y Tabla 4.

Figura 3-2: Grupos fitoquímicos con base en AFPM de SAS/STATv9.0 para datos

netos de laboratorio


Figura 3-3: Biplot para factores con valores de probabilidad máxima [FPM] de

presencia de ms en 59 accesiones colombianas de Lippia alba, incluyendo datos de

localidad [región, altitud, coordenadas].

Discusión Los factores con probabilidad máxima conformaron un agrupamiento diferente usando el mismo procedimiento analítico (o metodología analítica). Este agrupamiento se acerca mucho más a lo explicado por el Biplot de la Figura 1 con base en datos crudos (de laboratorio). El Biplot y el clúster muestra cuatro tendencias mayores; y separa los quimiotipos en dos grandes grupos: región Sumapaz y Región Chicamocha. Se quiso aquí mostrar las homologías dentro de región y posible división en dos sub-poblaciones, dada por condiciones ambientales. De hecho los

Capítulo 2 77

grupos químicos finales, los determino la estrategia wardmlm.sas al inicio, teniendo en cuenta región, altitud, y coordenadas, determino para la Región 1 (Chicamocha), cuatro grupos; para la Región 0 (Sumapaz): cinco grupos. Lo que el clúster muestra es la variabilidad WI dentro y entre sub-poblaciones. Las dos sub-poblaciones fueron inducidas con base en datos de localización y los valores de Est.Var. obtenidos por el ANAVA. Existe un factor de peso en la prueba, es el factor ambiental que predomina en Lippia alba y ha sido sustentado por varios autores incluyendo Stashenko et al. (2003). La variabilidad química neta, se definió plenamente en la Tabla 3-1. Metodología analítica sustentable para estructurar poblaciones tipo Lippia alba Matriz de Factores compatible con datos moleculares y ecológicos. La matriz final de factores se presenta en el Anexo A. Los datos para la matriz final fueron ordenados alfabéticamente por Factores: ecológicos + fitoquímicos + moleculares; es decir, la matriz final es la sumatoria del número de factores de probabilidad máxima obtenidos por cada tipo de marcador. En el presente estudio, el AFPM para datos fitoquímicos de laboratorio genero 11 Factores. Los cuales se suman a la matriz de factores ecológicos. Cualquiera de las matrices debe llevar datos de localización; este estudio incluyó: región, altitud y coordenadas decimal norte y occidente. Los requisitos fundamentales para la macro, es la inclusión de al menos una variable continua. Las matrices van una a continuación de otra y lleva su propia nomenclatura iniciando con el acrónimo ACC, luego va cada una de las variables. Para datos ecológicos antecede la letra E a cada Factor finalizado ordinalmente, es decir, EFactor1 [Ecological Factor1] y así sucesivamente. Los individuos [ACC] van ordenados en la columna A; a partir de la columna B, se colocan las variables de localización [región, altitud, coordenadas, otros posibles no usados en esta prueba]. El orden de las matrices y factores dentro de cada matiz es arbitrario. El termino FACTORn debe ir completo, debido a que así es como lo presenta la salida SAS (output). No hay restricción de uso de mayúsculas o minúsculas. La sustentación de la metodología analítica para estructurar poblaciones tipo L. alba se hace en la Tesis doctoral ‘Estructura genética y fitogeográfica de dos sub-poblaciones colombianas de Lippia alba’. Se desarrolló una macro en IML permite estimar DG, Est. Var. y patrones espaciales tomados a partir de datos químicos, ambientales y moleculares como base. El Análisis de Factores de Probabilidad Máxima) además de eliminar variables que no dan respuestas, permite obtener estimativos de comunalidad final y conservar al menos tres variables continuas de localización individual (altitud, coordenadas norte y oeste); e incluir marcadores moleculares como patrón base en estudios poblacionales. Una macro en lenguaje matricial IML permitió conformar patrones espaciales (incluyendo datos de localización) con base en la combinación de al menos dos grupos de datos (químicos, fisiológicos, ecológicos, otros posibles) más datos moleculares como patrón base; admitió: a) estimar componentes de varianza, conformar grupos y definir patrones de distribución espacial. La macro en lenguaje IML se agrega en formato digital, para uso por otros investigadores. Una matriz de factores moleculares (sine qua non); mas una matriz de factores ambientales; mas una matriz de factores fitoquímicos; incluyendo una matriz de factores fisiológicos, son ideales para definir patrones espaciales de distribución de especies promisoria nativas y naturalizadas. Una CANCORR preliminar indicaría las variables fisiológicas: Tasa de asimilación neta-TAN, Coeficiente de Área Foliar-CAF, Área foliar Específica-AFE, Tasa de Crecimiento Relativo-TCR; como variables predictoras potentes y de fácil estimación.


Figura 3-4: Clúster para presencia de siete metabolitos secundarios en una muestra de 59 accesiones colombianas de Lippia alba, con base en Análisis de Factores con Probabilidad Máxima [AFPM], incluyendo datos de localidad.

4. Conclusiones y recomendaciones

4.1 Conclusiones

4.1.1 Marcadores ecológicos: conclusión principal El análisis sugiere reportar la matriz n=40 variables * p=11 CP (Factores o marcadores) como la matriz de factores (de peso) o ‘Marcadores Ecológicos’. Los Estimativos de Comunalidad Final-ECF- por variable y por Factor generados en la prueba, son determinantes de la presencia (permanencia y/o supervivencia) de individuos en los sitios de muestreo.

Conclusiones específicas El análisis de Patrones Espaciales permitió definir los atributos estructurales y funcionales de los ecosistemas. Cuando analizamos datos espaciales, es de gran importancia describir los patrones espaciales de una variable medida. Para el Factor 1 en cada una de las dos regiones de las Figuras 2-16 y 2-17 sugiere dos regiones contrastantes (Chicamocha y Sumapaz); en que las accesiones separadas por distancias cortas no están correlacionadas. Los biomas Andino, Sub-andino y Basal, actualmente el http://hermes.humboldt.org.co//ecosistemas/andes/ los describe como ecosistemas transformados y áreas con cultivos mixtos de autoconsumo, causado por las necesidades de supervivencia de sus pobladores. Se concluye que la autocorrelación espacial marca una pauta importante en ensayos genéticos de especies promisorias nativas y naturalizadas y facilita el diagnóstico del requisito de independencia. La exploración de la estructura espacial (de los residuos) utilizando los semivariogramas residuales debería ser una práctica rutinaria a añadir a los diagnósticos comunes de los otros requisitos del análisis. El conocimiento de los niveles y distribución de la diversidad genética en poblaciones naturales de plantas garantiza la representación de la variabilidad genética de las poblaciones naturales amenazadas. Parece claro que la estimación de los niveles de variación genética debe ser un cometido inherente a su actividad. Muchas veces el material acumulado en bancos de semillas carece de esta información básica, lo cual puede resultar en colecciones genéticamente poco representativas que, aunque sean numéricamente muy abundantes, tienen una utilidad muy limitada de cara a eventuales reforzamientos o reintroducciones poblacionales (Vilches et al., 2004).

http://hermes.humboldt.org.co/ecosistemas/andes/


4.1.2 Marcadores moleculares: conclusión principal El resultado obtenido aquí y por Suárez et al., (2007-2008), Vega y Chacón (2008) y Vega et al. (2013) permite afirmar que el territorio colombiano forma parte del centro de diversidad genética o de distribución natural primario de la especie. Sustentando la tesis de distribución de la especies, dado que sus centros de origen están asociados con valores altos de DG y VG y albergan poblaciones de parientes silvestres (En: http://www.biodiversidad.gob.mx/genes/ centrosOrigen/ Gossypium /2doInforme /Segundo% 20informe % 20 Gossypium . pdf). La muestra de trabajo usada en la prueba, reporta valores intermedios de DG= 0.2467/0.2722 y distribución-adaptación amplia en Colombia (0-2800 msnm) con valores H=0.7234/0.7331 altos, sugiriendo para este estudio, la presencia de dos subpoblaciones en proceso de estructuración genética. Las investigaciones realizadas por Montanari et al., (2004); Viccini et al., (2004-2006); Dias et al., (2005-2006); Pereira et al., (2006); Yamamoto et al., (2008) y Manica-Cattani et al. (2009), indican la presencia de mayor variabilidad genética-VG en Brasil comparado con los resultados obtenidos en esta investigación. Este resultado propone un amplio centro de origen y distribución primario de la especie que incluye el norte de Suramérica.

Conclusiones específicas El uso de un marcador molecular tipo, es igual a sustentar el prototipo de distancia e índices, y es comparable al arquetipo de un programa y marca de un equipo determinado. En todos los casos, lo importante es lograr un resultado final limpio, es decir, una salida (output) sustentable. Los RAM son marcadores dominantes igual que RAPD e ISSR y han sido usados por otros autores, siendo efectivos valorando RG nativos y promisorios en Colombia y Brasil, mostrando poder discriminante alto, generando resultados válidos y sustentables. En el presente estudio, la potencia de los RAM fue valorada mediante marcadores químicos y ecológicos, incluidos en la prueba. Y, fueron tan efectivos en L. alba como lo fueron en otras especies vegetales nativas y naturalizadas. Lippia alba como recurso fitogenético (promisorio naturalizado en Colombia) fue susceptible de ser analizada mediante RAM. El poder discriminante de RAM fue efectivo en L. alba sustentado por los resultados generados en otros estudios en la especie (L. alba) y en RG promisorios. Generaron patrones de bandeo claras y su análisis comparativo con otros marcadores (químicos y ecológicos) muestran homología en los resultados. Adicionalmente, el cálculo de DG de Nei fue limpio y claro, evidenciando resultados obtenidos por otros autores con otro tipo de marcadores dominantes. Una medida de la eficiencia relativa de un Marcador Molecular no ha sido desarrollada plenamente. Los análisis comparativos con otro tipo de marcadores (químicos y ecológicos) usados en la prueba, han determinado su poder discriminante alto y se ofrece aquí como alternativa analítica de la DG en L. alba. Los marcadores moleculares-MM-son efectivos pero la lectura de bandas y tipo de distancia a usar en los agrupamientos inducen subjetividad al procedimiento. El uso combinado de marcadores tipo, son idóneos para estructurar poblaciones de especies vegetales (promisorias) del tipo Verbenaceae y minimiza la subjetividad generada por la técnica de lectura de bandas y tipo de distancia a usar. La combinación de datos

http://www.biodiversidad.gob.mx/genes/%20centrosOrigen/%20Gossypium%20/2doInforme%20/Segundo%25%2020informe%20%25%2020%20Gossypium%20.%20pdf

http://www.biodiversidad.gob.mx/genes/%20centrosOrigen/%20Gossypium%20/2doInforme%20/Segundo%25%2020informe%20%25%2020%20Gossypium%20.%20pdf

Anexo B. Nombrar el anexo B de acuerdo con su contenido 81

Ecológicos-Moleculares-Químicos-E*M*Q (usando de coordenadas) y la variabilidad química presente en cada individuo, optimizó (redefinió y configuró mejor) los agrupamientos; que analizando cada marcador en forma individual. Un análisis factorial simple determina la potencia de los efectos simples (E, M, Q) y/o de las interacciones generadas por cada marcador y se convierte en una herramienta válida en el procedimiento. La hipótesis de estructura genética moderada para la muestra (de referencia) tiene como sustento la variación geográfica. Como se hipotetizó, se detectaron niveles moderados de DG entre individuos. De hecho, los estimativos de DG aquí reportados son indirectamente comparables a estimaciones previas hechas por otros autores [Suárez et al. (2007); Montanari et al., (2004); Viccini et al., (2004-2006); Dias et al., (2005-2006); Pereira et al., (2006); Yamamoto et al., (2008); y Manica-Cattani et al. (2009)], debido al tipo de marcador usado. Valores altos de DG fueron detectados con niveles altos de alelos por locus y niveles altos de polimorfismos en alelos a través de individuos. Niveles intermedios de DG indican aislamientos recientes, impidiendo el desarrollo de una estructura genética fuerte de cada subpoblación; o flujo génico bajo o inexistente entre individuos dentro de cada región. El AMOVA indicó una DG mayor dentro que entre individuos, revelando ausencia o frecuencias bajas de alelos únicos y raros. Las posibles barreras son de tipo biológico con impacto negativo en la composición génica de L. alba. Los resultados indican además que los reservorios genéticos no son diferentes. La pérdida de la DG ha tenido un impacto negativo enorme en el potencial evolutivo de la especie. En términos generales, los niveles intermedios de DG es explicada por: i) su forma particular de diseminación (Antropocoria-etnobotánica-estenopropagación), ii) capacidad baja de propagación sexual por fertilidad baja de la semilla. Este tipo de diseminación determina el número bajo de alelos únicos y (alelos) raros; y iii) el régimen extractivo sin reemplazo el cual está afectando mayormente la DG. A pesar de los factores limitantes, el análisis mostró un valor remanentes de DG el cual revela que la especie mantiene valores de incipientes de DG debido a polinización cruzada y producción de semilla. Los resultados sugieren en todos los casos: a) intercambio de semilla genética, b) bancos de germoplasma de mínimos individuos con máxima DG, c) Inducir DG.

4.1.3 Marcadores químicos: conclusión principal

No se observaron valores altos de Estimativos de Varianza [Est.Var.] que conduzcan a establecer Diversidad Genética-DG- entre poblaciones e individuos, a partir de datos fitoquímicos. Los resultados generados por la prueba apuntan a la presencia de dos sub-poblaciones, delimitadas (cada una) por condiciones ambientales locales. Los valores obtenidos de Fst muestra un estructura moderada entre las subpoblaciones (Fst=0.023 p≤0.07), sustentando el flujo génico mantenido por la especie en las dos regiones estudiadas y muy probablemente para Colombia. El valor alto de WI indica la posible presencia de individuos con variantes químicas importantes. Las Verbenaceae tienden a variaciones fitoquímicas, particularmente Lippia alba, en la que no se observa diferencias morfológicas entre distintas procedencias (Riccardi et al., 2000). Estas variaciones fitoquímicas dentro de una misma especie


botánica, producen cambios en la composición química, aun en plantas localizadas a distancias cortas (Riccardi et al., 2000). Las accesiones 201, 213 y 341 se muestran como variantes fitoquímicas importantes, conclusión soportada por los análisis moleculares con marcadores RAM usados en la prueba (En: Diversidad molecular de 59 accesiones de Lippia alba detectado mediante marcadores RAM). La cuantificación de ms por espectrometría y cromatogramas son ideales. No obstante, la construcción de una matriz de presencias/ausencias permitió su unión a matrices de datos moleculares con marcadores RAM, para la clasificación y conformación final de grupos y la potencialización del análisis de diversidad molecular de la muestra de trabajo.

Conclusiones específicas

La variabilidad biológica puede ser de origen epigenéticos, genético, ambiental, genético-ambiental, de respuesta a la herbivoría o daño mecánico y latrogénica (por agentes contaminantes especialmente químicos). Asumiendo, que la Variabilidad Individual [WI] debe ser menor que la variabilidad entre individuos [AI]; estimar la variabilidad biológica individual [WI] y la variabilidad biológica máxima total [WT], permitió obtener valores de referencia poblacionales y establecer valores de variabilidad para la muestra de trabajo. Las variables de localización [incluyendo las ambientales] explican en gran proporción, la variabilidad fitoquímica de L. alba. La muestra de trabajo reportó rango muy amplio de adaptabilidad, desde 0 en Buenaventura-Valle, hasta 2800 metros altitudinales en el departamento del Cauca; revelado por el valor de variabilidad fitoquímica intra alta (del 98%) hallada en la prueba (WI=.2.060). Los índices (Fst-Fit-Fis) muestran una estructura moderada de las subpoblaciones, sustentado el flujo génico mantenido por la especie y un exceso de heterocigosis, como posible selección a favor de los heterocigotos. Las características fitoquímicas de las sub-poblaciones estudiadas corresponden a las

reportadas por un grupo significativo de autores colombianos; con variantes fitoquímicas

importantes y valor también importante de Estimativo de Varianza [Est. Var.]. El examen

de los aceites esenciales de la muestra de trabajo mostró que los componentes

terpénicos livianos son mayoritarios, que junto a taninos y flavonoides se constituyeron

en marcadores fitoquímicos. En consecuencia, a) la muestra de trabajo corresponde a los

quimiotipos ya documentados por otros autores para Colombia y muy probablemente

otros no reportados aun; lo cual valida los datos de laboratorio obtenidos; y b) la similitud

observada en la muestra determina el parentesco fitoquímico de las accesiones lo que

permite la conformación de un gran grupo químico dominado por Taninos-terpenoides-

flavonoides.

Por lo extenso del análisis y la posible inclusión de muchos datos crudos, una macro en IML u otro programa, permite conformar patrones espaciales (incluyendo datos de localización). La combinación de al menos dos grupos de datos (químicos, fisiológicos, ecológicos, otros posibles) más datos moleculares como patrón base; permite estimar componentes de varianza, conformar grupos y definir patrones de distribución espacial. Una matriz de factores moleculares es sine qua non. .


4.2 Recomendaciones

Los biomarcadores ideales a usar serian: Bioquímicos. Tipo, cantidad y calidad de aceites esenciales y sus respectivos metabolitos secundarios obtenidos por espectrometría; Morfofisiológicos. Respuestas fisiológicas (tasas e índices fisiológicos: TAN, RAF, AFE, IAF, TCR), morfológicas (acumulación y distribución de biomasa) y citohistológicas (caracterizaciones citogenéticas) a partir del banco in vivo ex situ. Más un grupo básico de descriptores para Verbenaceae ajustado a L. alba.

4.2.1 Para Marcadores Ecológicos La Bioprospección de Lippia alba en Colombia, en búsqueda de nuevas entidades químicas bioactivas, debe hacerse en todo el país a distancias aproximadas de 1-1,2 kilómetros entre sitios de muestreo, usando el software DIVA-GIS. Se recomienda el uso de marcadores ecológicos, con base en patrones espaciales, debido a la gran variabilidad intraespecífica (a nivel individual) hallada en Lippia alba, causada por su sensibilidad alta de la especie a factores bióticos y abióticos.

4.2.2 Para Marcadores Moleculares Establecer un protocolo-guía o software para lectura de bandas RAM, que maximice el potencial valorativo de los marcadores RAM. Ello permitirá eliminar la subjetividad generada por su valoración visual por parte del investigador.

4.2.3 Para Marcadores Químicos

Usar espectrometría acoplada a gases-masas y cromatogramas, genera variables cuantitativas exactas.

A. Anexo A: matriz de factores de criterio para 40 variables ecoambientales tomadas en 59 accesiones colectadas en dos zonas ecológicas contrastantes BhT y BsT

Factor Pattern Var Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 reg -0.63693 0.26969 0.29482 -0.17759 0.26503 0.39903 alt 0.11124 0.31066 0.03107 -0.51297 0.20078 0.40438 CDN -0.83564 0.14638 0.24144 -0.24843 0.02384 0.21444 CDO -0.75653 0.18538 0.18821 -0.37049 -0.05141 0.17041 cod 0.52480 0.13609 -0.07706 -0.33220 0.12606 -0.06986 bio -0.50530 0.72538 0.00150 -0.16163 0.17702 -0.07946 clim -0.31270 0.70769 -0.12573 0.02134 0.11986 -0.22941 coveg 0.08237 0.18211 0.08977 -0.26121 0.27773 -0.01795 Tmax -0.32545 -0.43351 -0.21541 0.41575 -0.48590 -0.20641 Tmin -0.55359 -0.11443 -0.42458 0.43523 -0.30413 -0.24430 HRmax 0.76037 0.01744 0.07326 -0.10778 0.31055 -0.09810 HRmin 0.74706 0.10746 0.02030 -0.08087 0.35612 -0.10745 VVmax 0.38858 -0.43666 0.55103 -0.42039 -0.09532 0.08406 VVmin -0.05062 -0.33437 0.43766 -0.49954 0.17049 0.12532 hPamax 0.43366 0.44430 -0.52018 0.16683 0.28800 -0.24524 hPamin 0.71088 0.21316 -0.44227 0.00094 0.19406 -0.10491 UVmax -0.01910 0.60626 -0.53159 0.12041 0.25897 0.21776 Uvmin -0.13113 0.72756 -0.46183 0.18781 0.33828 0.06325 DUmax 0.70567 -0.49422 -0.08785 -0.02675 0.13426 0.04246 DUmin 0.17610 -0.66272 0.10660 0.06867 0.35738 -0.18323 pH -0.25017 -0.05462 0.44263 0.26311 0.51992 -0.38488 CO 0.29290 0.13573 -0.01649 0.26488 -0.37599 0.62949 N 0.37223 0.14989 0.10679 0.32084 0.17745 0.66543 Ca 0.25028 0.37821 0.63555 0.40803 0.01300 0.05146 K 0.13547 0.35810 0.42481 0.31899 0.34823 0.15891 Mg 0.33035 0.30937 0.41240 0.27427 -0.30774 -0.00873 Na 0.05570 -0.00195 0.00491 0.19168 0.20466 -0.18957 AI 0.07687 0.29395 -0.39033 -0.24267 -0.19007 0.30817 CICE 0.22492 0.46669 0.62761 0.39352 -0.19658 -0.04594 CIC 0.43930 0.29293 -0.07992 0.23197 -0.44284 0.54011 P -0.06903 -0.05282 0.21153 0.33185 0.29469 -0.32943 Cu 0.33770 -0.04230 0.26865 0.08720 0.04379 0.21604 Fe 0.22498 0.05507 -0.22486 -0.55107 -0.18642 0.04346 MN 0.35280 0.22199 -0.05238 -0.23328 -0.14001 -0.23449 Zn 0.21948 0.12743 -0.03842 0.24235 -0.26222 -0.12918 B -0.07206 0.44519 0.55208 0.24247 -0.07863 -0.07559 Ar 0.08317 0.47896 0.09216 -0.42364 -0.36096 -0.44938 Li 0.43146 0.33308 0.22937 -0.14603 -0.47338 -0.22612 A -0.30284 -0.47236 -0.19820 0.33729 0.45149 0.39327 tex -0.05693 0.51097 0.19993 -0.16053 0.03013 -0.34437


A. Anexo A: (Continuación).

Factor7 Factor8 Factor9 Factor10 Factor11 Factor12 reg -0.14323 0.15417 -0.06818 0.28557 0.01939 0.02644 alt 0.12713 0.08757 0.44189 -0.11557 -0.19125 0.06443 CDN 0.18387 0.04343 0.04707 0.13673 -0.14146 0.09833 CDO 0.30362 0.01440 0.12041 0.01755 -0.21707 0.09446 cod 0.59365 -0.18643 -0.15515 0.17536 0.07650 -0.21674 bio -0.08116 -0.00589 -0.17607 -0.10041 -0.01073 -0.00563 clim -0.30875 0.00399 -0.21928 -0.22920 0.07312 -0.04972 coveg 0.75004 -0.17323 -0.14793 0.32317 0.04538 -0.05566 Tmax 0.04060 0.01851 0.03524 0.13956 0.19993 0.01090 Tmin 0.24123 -0.02104 -0.05156 0.12768 0.11913 -0.01217 HRmax -0.22230 -0.09601 -0.11660 0.07777 -0.03102 0.36396 HRmin -0.19249 -0.16493 -0.11854 0.12306 -0.12911 0.31811 VVmax -0.19527 0.01336 0.01188 -0.19178 -0.00923 -0.07450 VVmin 0.04865 0.04219 -0.21837 -0.22212 0.11365 -0.09921 hPamax 0.14431 0.04681 -0.13073 -0.12915 -0.07385 -0.08973 hPamin -0.00104 0.05059 0.15332 -0.20895 -0.02104 -0.18310 UVmax 0.23068 0.12982 0.22325 0.11213 -0.02789 -0.07218 Uvmin 0.02946 0.05886 -0.01355 -0.01024 0.01303 -0.09557 DUmax 0.18460 -0.00091 0.31889 0.09109 -0.02262 -0.04850 DUmin 0.23769 -0.18154 -0.14114 0.16842 -0.02053 0.03761 pH 0.11517 -0.07386 -0.04402 -0.13938 -0.10313 -0.13481 CO 0.20430 -0.17634 -0.12265 -0.17124 -0.25433 0.04182 N -0.25729 0.07742 -0.22248 0.18839 0.07558 -0.11963 Ca -0.05585 -0.08889 -0.23220 0.03101 -0.15606 -0.17020

Factor Pattern

Factor7 Factor8 Factor9 Factor10 Factor11 Factor12 K -0.18549 0.15234 0.13400 0.13290 0.46388 -0.03170 Mg 0.35262 -0.07964 0.21921 -0.13082 0.31261 0.19282 Na -0.18464 -0.05765 0.62123 0.05061 -0.13661 -0.02376 AI -0.11109 -0.32936 0.07225 0.19036 0.23139 0.38317 CICE 0.20487 -0.19002 -0.01448 -0.12146 -0.07674 -0.02338 CIC 0.00098 -0.11939 -0.02024 -0.14405 -0.13316 -0.01170 P 0.11695 0.46571 0.11101 -0.09829 -0.23987 0.30666 Cu -0.04172 0.49333 0.07131 0.42940 0.18509 -0.10155 Fe 0.02652 0.44203 -0.15936 -0.29069 0.19882 0.01714 MN 0.35061 0.34398 -0.16859 -0.16328 0.22188 0.23365 Zn 0.05151 0.38660 -0.30646 0.28893 -0.35767 0.27929 B 0.35409 0.03144 0.19108 -0.21181 0.16610 0.17760 Ar -0.17071 -0.19493 0.04293 0.25849 -0.05815 -0.04533 Li -0.03480 0.27013 0.11168 0.13218 -0.13136 -0.23525 A 0.13751 -0.06555 -0.08800 -0.24746 0.10110 0.16942 tex -0.29067 -0.31720 0.04922 0.07443 0.13180 0.11200



Acc Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 377 -1.67980 -1.35553 -0.06415 0.22741 0.55299 0.48287 201 -1.62821 -1.33242 -0.07855 0.21672 0.62778 0.45920 374 -1.49460 -0.88057 0.34551 0.20091 0.32897 -0.04969 369 -1.46919 0.66354 0.30452 0.03121 0.71820 0.30560 379 -1.45315 -0.76288 0.38434 0.30435 -0.00680 0.24594 375 -1.37931 -1.68720 -0.64990 -0.54035 -0.13079 0.74902 378 -1.36084 -0.69123 0.60924 0.33690 0.52172 -0.02266 202 -1.27381 -0.76218 0.24555 -0.56197 -0.59816 -0.38679 189 -1.12543 0.76419 -0.35486 -1.12883 0.59656 -0.43425 187 -1.12480 0.87522 -0.74503 -1.51338 -1.11500 0.81152 364 -1.04030 0.75922 -0.66261 -1.43527 -0.94206 0.57315 174 -0.99939 -0.76250 0.55936 -0.48771 0.89699 0.20130 209 -0.98844 0.12166 0.10906 -1.50070 0.69486 -0.61307 367 -0.98506 1.00906 0.12520 -0.56886 -0.38617 0.30848 365 -0.94711 1.38011 0.62558 -0.60272 -0.25158 -0.15907 217 -0.90904 -0.20570 0.00124 -1.07655 1.01280 -0.23684 349 -0.86355 -0.55623 -0.54649 1.30663 0.46482 -0.54457 363 -0.65292 1.19100 0.42607 -0.49735 0.19866 0.33533 366 -0.59868 1.59497 1.14794 -0.42534 0.03332 -0.15762 362 -0.49846 1.59909 1.11626 0.02067 -0.10017 0.34818 370 -0.47206 2.43611 3.27122 1.36537 0.44903 -0.04249 373 -0.44006 -0.02008 1.49836 1.95171 -0.94339 2.49263 350 -0.42672 -0.03577 0.10143 1.67509 -0.28700 -0.60195 346 -0.39542 -0.16631 -1.60341 -0.04002 -1.69543 -0.63404 357 -0.29271 -0.00811 -0.23733 0.84538 -0.63977 -1.41033 351 -0.23047 -0.14938 -0.71269 1.16400 -1.13214 0.82508 360 -0.22148 1.68023 0.52072 -1.16143 0.29236 -0.07975 359 -0.20525 1.62129 -2.03360 -1.30460 -0.94121 2.47736 356 -0.17787 -1.34636 -0.93442 0.54372 1.44184 -1.06034 358 -0.15115 0.00996 0.11505 1.99691 -1.02783 -0.93880 340 -0.09755 -0.35487 0.02882 1.10652 -0.18105 -1.57769 348 -0.05537 0.11705 -0.40836 0.80834 -1.76579 -0.57525 342 -0.01732 -0.57909 -0.52330 0.79076 0.39627 -1.67129 352 0.17097 -1.06479 -0.84816 -0.43908 1.45772 -0.63486 341 0.27705 -0.69798 -0.70261 1.64618 -0.60677 1.04252 344 0.46348 -0.25296 0.08013 0.68401 0.69871 -0.91670 301 0.47495 -2.39598 0.20683 -1.22516 0.26676 0.03738 4 0.54198 0.37820 -1.28608 0.58113 1.40539 -1.41163 347 0.72169 0.56001 -0.67106 1.19786 -2.35487 -1.61240 345 0.74278 1.02856 -0.10198 0.96193 -1.54075 -0.25535 5 0.76570 1.08908 -0.61997 0.08054 1.87687 -0.31952 3 0.81037 -0.22484 -1.43103 1.50137 -0.10286 1.54766 311 0.82555 0.05762 -1.57817 -0.58061 0.98641 -0.27044 320 0.86234 -0.17121 -0.73747 -2.07011 0.78187 -0.50472

1 0.86652 0.41304 -1.27785 0.80167 0.81286 1.76078


Acc Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 354 0.89192 0.51997 0.73313 -0.38211 0.22257 -1.56237 322 0.89519 0.25755 -0.84130 0.56618 -0.17792 -0.21452 308 1.11707 -0.58714 1.55236 -1.27922 -1.16226 -0.24947 300 1.12044 -1.28598 1.21911 -0.80069 -1.42566 0.06982 353 1.24115 0.10136 0.74659 0.35773 1.33992 -0.90510


314 1.29008 -0.64731 -0.98013 0.36023 -0.16930 2.26389 302 1.31495 -1.23645 1.48543 -0.94595 -0.55121 -0.05406 304 1.32934 -1.46233 1.01397 -0.64385 -0.35973 1.47004 305 1.33323 -1.14608 1.34043 -0.98478 -0.99615 0.42378 310 1.33948 1.30870 -1.73584 -1.15155 -0.35944 0.19883 303 1.41566 -0.97882 1.81162 -0.90179 -0.89986 -0.17613 313 1.57585 0.69720 -0.33120 -0.30804 0.28945 -0.25835 312 1.61804 1.03229 -0.22415 -0.40916 0.15214 -1.23867 2 1.64973 0.54201 1.19662 1.33570 3.33329 2.35042 377 1.01999 0.45236 0.13569 0.85640 0.13790 0.34502 201 1.00042 0.39484 0.08388 0.90432 0.06869 0.53103 374 0.63799 -0.39054 0.15678 1.09576 -0.20075 0.31838 369 0.48906 -0.09798 -0.13283 -0.96599 -0.33050 0.19292 379 0.96241 -0.17290 0.10075 0.82361 0.20584 0.93185 375 0.30397 -0.45495 0.24022 1.09901 0.31229 -0.07203 378 0.52727 -1.05247 1.32574 1.00107 -0.06728 0.23608 202 0.66189 1.56117 0.34168 2.31233 0.48152 -0.64636 189 -0.50901 -0.43750 -0.38231 -0.08238 0.14583 0.05591 187 -0.68377 0.66061 0.17140 -0.35688 0.27637 -1.00444 364 -0.68204 0.46261 -0.44778 -0.29872 0.22123 -0.88834 174 0.24063 0.38816 0.04708 1.66197 -0.26592 0.88359 209 -0.54863 0.08911 -0.08482 -0.50074 -0.35706 -0.05034 367 -0.53752 0.33786 -0.24716 -0.50866 -0.98591 -0.27676 365 -0.78962 -0.45033 0.07307 -0.26634 -0.39644 -0.68369 217 -0.09885 0.53066 -0.41239 -0.51298 -0.20640 -0.19926 349 -0.31831 -0.47524 -0.26242 -1.47330 1.30138 -0.04062 363 0.24166 1.25140 -0.49288 -1.41614 -0.07240 -0.14432 366 -0.63351 0.49128 -0.05850 -0.56910 -1.32045 -0.39867 362 0.21168 0.23754 -0.33917 -0.47785 -1.48699 -0.63620 370 1.23948 0.64848 2.24230 -0.83949 2.65115 0.57714 373 1.84869 -0.83578 -1.10927 0.08277 -1.15542 0.87166 350 -0.13335 -0.47312 0.22054 -1.26360 0.49088 -0.18075 346 -1.02825 0.19502 -0.22156 0.29630 1.00062 -1.41390 357 -1.30247 -1.91571 -0.52289 0.31048 0.32066 -0.87829 351 -0.45638 0.43387 -0.24120 -0.71624 0.84475 -1.17534 360 -0.80655 -0.16941 -0.89244 -0.12173 -1.75975 0.29957 359 -1.43019 -1.96913 0.20826 0.75345 0.57450 2.57904 356 -0.59749 -0.37178 -1.29168 -0.73158 -0.11404 0.71787 358 -0.56192 -0.43226 -0.60189 -0.06283 -0.46007 -0.23064 340 -0.57144 -0.40179 0.18405 0.13991 0.47744 -1.16371 348 -0.20378 1.07095 -0.07382 -0.28123 1.85172 -0.16480 342 -1.20195 -0.47205 2.21662 0.16537 -0.21157 -0.46944

352 -0.38669 1.17219 -1.91839 -2.03676 0.55498 0.83813


Acc Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 341 -0.05486 -0.46978 -0.89102 -1.20749 -0.09742 -0.57270 344 -0.24739 -0.75462 -0.14423 -0.36304 0.12394 0.89414 301 -0.20645 1.24866 -0.07836 -1.76246 0.66677 0.98901 4 -1.08566 -0.32395 3.36086 0.26511 -1.29875 0.42839 347 -0.49582 2.82596 -1.83799 2.05780 -2.04263 1.67288 345 -0.42232 -0.12727 -0.49050 -0.37856 1.28027 2.50961 5 -0.18920 -0.33014 1.09603 -0.98611 -1.17457 1.14961 3 0.83205 -0.09908 0.89292 -0.67268 -1.06015 -0.65383


311 1.27688 0.45368 -0.29199 0.81623 -0.60351 0.90651 320 1.37470 0.24592 -0.35284 -1.02073 1.35150 -1.68462 1 1.96763 -0.53414 0.03955 -0.44525 -0.93252 -1.83256 354 0.87802 -2.62205 -1.72458 0.95088 0.55558 -1.24095 322 0.40441 1.18466 2.06129 0.44843 -1.43309 -1.17527 308 0.58200 -1.35119 -0.54545 0.80616 0.04681 -2.48010 300 -0.27984 0.52548 0.85661 -0.30093 0.85473 0.97092 353 0.86649 -1.71047 -2.40938 0.65864 -1.16978 0.54678 314 0.10499 0.44138 0.28840 -0.80795 -0.57859 -1.09311 302 -0.77284 0.46279 0.94884 -0.14845 -1.35922 0.27409 304 -0.82839 -0.33320 0.48896 -0.66430 -0.50287 0.84968 305 -0.54219 -1.29977 0.52896 -0.62013 0.68633 0.69830 310 0.97869 -1.81894 0.80132 1.64609 1.90831 1.16596 303 -0.67853 -0.19846 0.72055 0.07066 -1.40257 -0.00303 313 1.37040 1.46108 0.40883 1.75652 0.51099 -1.02666 312 2.80577 1.67796 -0.42623 -0.68651 1.07959 1.04967 2 -3.54193 1.64031 -1.31522 2.56785 2.06406 -1.00302


B. Anexo B. Patrón de Factores de criterio por accesión incluyendo coordenadas decimal (Norte y Oeste). Accesión CDN CDO Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 312 4.27242 -74.4425 -1.04920 1.54774 0.24963 -0.43272 -0.71864 1.26262 314 4.19217 -74.4850 -1.04113 -0.12411 -0.12511 -0.89208 2.40806 0.69615 313 4.25847 -74.4745 -1.03023 1.16690 0.23714 -0.67355 -0.13495 0.79716 304 4.31750 -74.5160 -1.01925 -0.74804 1.88535 -0.78538 1.27175 -0.18656 303 4.32053 -74.5150 -1.01466 -0.21632 2.43835 -0.25742 -0.04871 -0.98510 305 4.31331 -74.5181 -1.01196 -0.43887 2.09910 -0.57237 0.33364 -0.92286 302 4.31203 -74.5000 -1.00193 -0.54091 2.19504 -0.51102 -0.09648 -0.75299 300 4.31242 -74.4937 -0.96849 -0.65377 1.92206 -0.29616 0.31350 -1.27788 353 4.29685 -74.6423 -0.96453 0.56688 0.81696 0.30590 -0.79661 1.62813 310 4.28214 -74.4099 -0.92386 1.59418 -0.96358 -1.72525 0.14498 0.09870 3 4.30997 -74.5261 -0.91719 0.01630 -1.10360 0.15036 2.08708 1.17454 347 4.30059 -74.8054 -0.88714 0.65328 -0.83011 1.07380 -0.04090 -2.33040 322 4.31475 -74.3893 -0.88217 0.46392 -0.60045 -0.01026 0.21306 0.24465 308 4.27697 -74.5261 -0.87427 0.04192 2.12347 -0.39708 -0.02718 -0.88644 311 4.27256 -74.4122 -0.85084 0.18527 -0.96384 -1.31903 -0.41556 1.28395 301 4.31700 -74.4997 -0.84011 -2.02132 1.10341 -1.11297 -0.29008 -0.00206 1 4.31331 -74.5181 -0.82326 0.67832 -0.91958 -0.41301 1.97310 2.28105 354 4.28744 -74.6581 -0.80594 0.83361 0.71017 0.23113 -1.33146 0.28003 320 4.24689 -74.4433 -0.80525 0.08562 0.09248 -1.95899 -1.02639 0.77571 4 4.27697 -74.5444 -0.79870 0.30190 -1.38708 0.01473 -1.49660 0.72605 345 4.28527 -74.8771 -0.78660 1.19995 -0.34389 0.93383 0.57234 -1.19403 341 4.39761 -74.8270 -0.77343 -0.57696 -0.72551 0.87218 1.76646 0.16003 344 4.33510 -74.8557 -0.76987 -0.14088 -0.07901 0.62802 -0.80918 0.56277 Accesión CDN CDO Factor7 Factor8 Factor9 Factor10 Factor11 312 4.27242 -74.4425 2.85861 0.00887 -1.02652 -0.82059 1.02284 314 4.19217 -74.4850 -0.50390 1.02155 -0.59874 0.29064 -0.87399 313 4.25847 -74.4745 2.33980 0.64797 0.54485 0.82780 -0.86171 304 4.31750 -74.5160 -1.44634 0.68537 -0.17287 0.48673 0.51074 303 4.32053 -74.5150 -0.65819 0.27496 0.26613 1.03380 -0.43812 305 4.31331 -74.5181 -1.06073 -0.04320 0.83230 -0.81553 0.72730 302 4.31203 -74.5000 -0.57365 0.99628 -0.10720 1.23748 -0.22035 300 4.31242 -74.4937 0.34576 1.06162 0.30835 -0.48616 0.89926 353 4.29685 -74.6423 -0.48057 -2.96687 -0.42529 1.07444 0.76381 310 4.28214 -74.4099 0.66847 -0.73576 2.90089 -1.09191 1.35687 3 4.30997 -74.5261 -0.25437 0.68192 0.13619 0.41607 -0.87422 347 4.30059 -74.8054 2.74298 -0.40789 -1.46515 3.06394 1.68145 322 4.31475 -74.3893 0.81332 1.76813 0.59999 1.50486 -1.73050 308 4.27697 -74.5261 0.41546 -1.66235 0.94208 -1.06617 -2.20408 311 4.27256 -74.4122 1.15322 -0.29624 0.05939 0.53514 0.50984


B. Anexo B. (Continuación) Accesión CDN CDO Factor7 Factor8 Factor9 Factor10 Factor11 301 4.31700 -74.4997 -0.09492 1.15951 -1.50937 -0.95925 1.00971 1 4.31331 -74.5181 0.06824 -0.42333 -0.09998 -0.43899 -2.12879 354 4.28744 -74.6581 0.04871 -3.23976 1.03552 -0.74654 -0.73027 320 4.24689 -74.4433 0.99922 -0.12997 -0.46834 -2.33848 -1.21383 4 4.27697 -74.5444 -1.35950 2.13445 1.87560 2.05910 -0.25603 345 4.28527 -74.8771 0.03780 -0.18593 -0.18455 -0.21925 2.46534 341 4.39761 -74.8270 -0.73105 -0.45643 -0.89911 -0.46932 -0.24535 344 4.33510 -74.8557 -0.83337 -0.31715 0.06045 0.10897 0.96999 Accesión CDN CDO Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 5 4.28267 -74.4116 -0.71999 1.12104 -0.70055 -0.39298 -0.98052 1.61343 352 4.30427 -74.6327 -0.70685 -1.07043 -0.52958 -0.76041 -1.02435 0.82938 342 4.40009 -74.8265 -0.67525 -0.69773 -0.80114 0.80655 -1.33627 -0.28519 356 4.26807 -74.7026 -0.66800 -1.50378 -0.96801 0.13153 -1.13658 0.85033 340 4.39766 -74.8274 -0.61439 -0.45258 -0.47245 1.44011 -1.03308 -0.51754 358 4.25201 -74.7197 -0.59534 -0.09827 -0.62691 2.11326 0.13676 -0.88940 348 4.30694 -74.7180 -0.59029 0.01140 -0.71033 1.00586 0.27106 -1.63148 357 4.25591 -74.7157 -0.52992 -0.24981 -0.81292 1.17228 -0.91065 -1.31652 351 4.37797 -74.6739 -0.51997 -0.30169 -0.98783 0.83938 1.43306 -0.80129 346 4.27328 -74.7528 -0.51547 -0.47765 -1.63618 -0.08081 0.00641 -2.15609 350 4.36664 -74.6999 -0.45759 -0.27193 -0.67140 1.82847 -0.11891 -0.10081 349 4.33670 -74.7078 -0.34377 -0.96841 -1.22486 1.32244 -0.48136 0.28450 359 5.85631 -73.6810 0.98135 1.44930 -1.46884 -2.26795 2.05016 -1.13427 373 7.03761 -73.1763 0.99336 0.23629 1.19650 1.66508 3.35732 1.19222 360 6.50125 -73.2308 1.06187 1.55697 0.37906 -0.80847 -0.66898 -0.41181 217 6.54047 -73.3701 1.12776 -0.48925 0.07832 -0.86847 -0.85966 0.45362 375 7.21694 -73.0012 1.15135 -1.97941 -0.26543 -0.77531 0.54204 -0.01835 174 7.04219 -73.1718 1.15191 -0.96978 0.60255 -0.35674 -0.34935 0.66130 362 6.50158 -73.2354 1.15902 1.46107 0.60095 0.47245 0.17217 0.09351 363 6.50053 -73.2149 1.16692 0.99630 0.17470 -0.16984 -0.02309 0.19263 209 6.85619 -73.2481 1.19367 -0.19961 0.12437 -0.98527 -1.23299 -0.18086 366 6.57208 -73.1500 1.19944 1.39595 0.61866 0.24538 -0.49304 -0.46301 202 7.00878 -73.1699 1.20760 -1.06105 0.27228 -0.09404 -0.23172 -0.62372 Accesión CDN CDO Factor7 Factor8 Factor9 Factor10 Factor11 5 4.28267 -74.4116 -1.60205 1.00455 -0.14868 0.74980 0.54935 352 4.30427 -74.6327 -0.46305 0.09667 -2.84046 -0.59500 1.44273 342 4.40009 -74.8265 -0.93018 1.26736 1.46897 0.86252 -0.71086 356 4.26807 -74.7026 -0.95716 -0.69260 -0.99738 0.17232 1.27514 340 4.39766 -74.8274 -0.07877 -0.12004 0.52412 -0.34150 -0.83233 358 4.25201 -74.7197 -0.23640 -0.81296 -0.25900 0.39777 -0.31736 348 4.30694 -74.7180 1.24582 0.65757 -0.29699 -1.21995 0.32873 357 4.25591 -74.7157 -1.08022 -1.54353 0.85865 -0.34690 -0.74948 351 4.37797 -74.6739 -0.03827 0.44970 -0.70142 -0.88271 -0.94392 346 4.27328 -74.7528 0.50165 -0.03606 0.28090 -1.09556 -0.65076 350 4.36664 -74.6999 -0.62582 0.11889 -0.30564 -0.83775 -0.36046 349 4.33670 -74.7078 -0.83831 0.14361 -0.49797 -1.76018 0.16526 359 5.85631 -73.6810 -1.82401 -0.50612 1.66319 0.09770 2.70417


Accesión CDN CDO Factor7 Factor8 Factor9 Factor10 Factor11 373 7.03761 -73.1763 0.11735 -1.62467 -0.33730 0.69428 0.60308 217 6.50125 -73.2308 -0.95756 -0.78641 -1.02893 1.37065 -0.23623

217 6.54047 -73.3701 -0.12501 0.18002 -0.91162 -0.06564 -0.21079 375 7.21694 -73.0012 0.45193 -0.30602 1.28092 -0.24501 0.36946 174 7.04219 -73.1718 0.56236 -0.02626 0.54458 1.28537 0.62133 362 6.50158 -73.2354 -0.30790 -0.18072 -0.99451 0.66337 -1.08077 363 6.50053 -73.2149 0.12387 0.60277 -1.82312 -0.40980 -0.25285 209 6.85619 -73.2481 -0.51693 0.09922 -0.54667 -0.02756 -0.33612 366 6.57208 -73.1500 -0.60766 0.18762 -1.14768 1.12051 -1.12590 202 7.00878 -73.1699 2.48462 0.36461 0.82301 0.68112 -0.47512 Accesión CDN CDO Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 378 7.00553 -73.1693 1.24149 -0.99640 0.28617 0.60335 -0.13857 0.70918 364 6.56658 -73.1484 1.24477 0.38232 -0.56185 -1.21050 0.25049 -1.43962 367 6.57622 -73.1517 1.25367 0.65232 -0.18417 -0.23455 0.04344 -0.69391 189 6.50078 -73.2328 1.26119 0.29670 -0.55815 -0.82036 -1.04311 -0.22479 379 7.00803 -73.1696 1.26271 -1.09382 0.12899 0.52726 0.31508 0.48112 374 7.02361 -73.1673 1.26369 -1.24332 0.08310 0.43012 -0.08721 0.47473 201 7.00717 -73.1781 1.27873 -1.73889 -0.16571 0.14216 0.23224 0.97641 365 6.56833 -73.1400 1.28227 1.05913 0.12591 0.09353 -0.48500 -0.81155 187 6.59894 -73.1566 1.29372 0.45553 -0.66101 -1.27732 0.42673 -1.58000 377 7.00900 -73.1792 1.29629 -1.77558 -0.16340 0.17894 0.27218 0.91599 370 6.64981 -73.1693 1.30391 2.53625 1.96484 2.90501 -0.53828 1.37173 369 6.62675 -73.1646 1.40012 0.15422 -0.29708 0.32719 -0.18766 0.74692 Accesión CDN CDO Factor7 Factor8 Factor9 Factor10 Factor11 378 7.00553 -73.1693 -0.12465 -0.13420 1.77532 0.54464 -0.24083 364 6.56658 -73.1484 0.05654 0.11345 -0.54979 -0.77324 -0.45289 367 6.57622 -73.1517 -0.45092 0.09847 -0.84266 0.26961 -0.51527 189 6.50078 -73.2328 -0.50153 -0.48194 -0.08922 -0.28540 0.01734 379 7.00803 -73.1696 0.73824 -0.40199 0.71575 -0.03071 0.75107 374 7.02361 -73.1673 0.50307 -0.59964 0.86301 0.46949 -0.00021 201 7.00717 -73.1781 0.93333 -0.00834 0.41450 0.23931 0.46037 365 6.56833 -73.1400 -0.82989 -0.14130 -0.06655 -0.01402 -0.82634 187 6.59894 -73.1566 0.11742 0.62710 -0.31233 -0.93820 -0.75248 377 7.00900 -73.1792 0.98507 0.06559 0.40128 0.10330 0.27033 370 6.64981 -73.1693 0.23121 2.77867 1.19359 -2.50946 1.58669 369 6.62675 -73.1646 -0.45117 -0.02877 -0.71445 -0.52997 -0.21400


C. Anexo C: lista de accesiones con datos de colecta

Acc Reg. alt gn mn sn go mo so cdn cdo cod bio cli cob tmax

300 0 1223,00 4,00 18,00 44,70 74,00 29,00 37,30 4,312416667 -74,493694444 33,00 1,00 1,00 15,00 35,00

301 0 1259,00 4,00 19,00 1,20 74,00 29,00 58,80 4,317000000 -74,499666667 33,00 1,00 1,00 15,00 35,00

302 0 1151,00 4,00 18,00 43,30 74,00 30,00 0,00 4,312027778 -74,500000000 33,00 1,00 1,00 15,00 27,00

303 0 1393,00 4,00 19,00 13,90 74,00 30,00 53,90 4,320527778 -74,514972222 33,00 1,00 1,00 15,00 28,70

304 0 1350,00 4,00 19,00 3,00 74,00 30,00 57,60 4,317500000 -74,516000000 33,00 1,00 1,00 15,00 29,00

305 0 1272,00 4,00 18,00 47,90 74,00 31,00 5,00 4,313305556 -74,518055556 33,00 1,00 1,00 15,00 30,00

308 0 816,00 4,00 16,00 37,10 74,00 31,00 34,00 4,276972222 -74,526111111 110,00 2,00 3,00 42,00 31,00

310 0 1296,00 4,00 16,00 55,70 74,00 24,00 35,70 4,282138889 -74,409916667 110,00 2,00 3,00 42,00 28,80

311 0 1365,00 4,00 16,00 21,20 74,00 24,00 43,80 4,272555556 -74,412166667 110,00 2,00 3,00 42,00 29,50

312 0 1176,00 4,00 16,00 20,70 74,00 26,00 33,10 4,272416667 -74,442527778 110,00 2,00 3,00 42,00 30,00

313 0 1077,00 4,00 15,00 30,50 74,00 28,00 28,30 4,258472222 -74,474527778 110,00 2,00 3,00 42,00 28,90

314 0 944,00 4,00 11,00 31,80 74,00 29,00 6,10 4,192166667 -74,485027778 33,00 1,00 1,00 15,00 27,60

320 0 1449,00 4,00 14,00 48,80 74,00 26,00 35,80 4,246888889 -74,443277778 110,00 2,00 3,00 42,00 29,10

322 0 1361,00 4,00 18,00 53,10 74,00 23,00 21,40 4,314750000 -74,389277778 33,00 1,00 1,00 15,00 30,00

340 0 264,00 4,00 23,00 51,59 74,00 49,00 38,53 4,397663889 -74,827369444 14,00 2,00 4,00 13,00 35,50

341 0 262,00 4,00 23,00 51,41 74,00 49,00 37,08 4,397613889 -74,826966667 14,00 2,00 4,00 13,00 33,80

342 0 260,00 4,00 24,00 0,31 74,00 49,00 35,52 4,400086111 -74,826533333 14,00 2,00 4,00 13,00 33,40

344 0 249,00 4,00 20,00 6,36 74,00 51,00 20,47 4,335100000 -74,855686111 16,00 2,00 4,00 26,00 29,00

345 0 296,00 4,00 17,00 6,97 74,00 52,00 37,41 4,285269444 -74,877058333 14,00 2,00 4,00 13,00 30,60

346 0 284,00 4,00 16,00 23,82 74,00 45,00 9,96 4,273283333 -74,752766667 14,00 2,00 4,00 13,00 35,40

347 0 283,00 4,00 18,00 2,13 74,00 48,00 19,59 4,300591667 -74,805441667 14,00 2,00 4,00 13,00 37,80

348 0 311,00 4,00 18,00 24,99 74,00 43,00 4,95 4,306941667 -74,718041667 14,00 2,00 4,00 13,00 39,20

349 0 316,00 4,00 20,00 12,13 74,00 42,00 28,23 4,336702778 -74,707841667 14,00 2,00 4,00 13,00 34,70

350 0 374,00 4,00 21,00 59,92 74,00 41,00 59,58 4,366644444 -74,699883333 14,00 2,00 4,00 13,00 35,00

351 0 392,00 4,00 22,00 40,69 74,00 40,00 26,02 4,377969444 -74,673894444 14,00 2,00 4,00 13,00 35,60

352 0 327,00 4,00 18,00 15,36 74,00 37,00 57,82 4,304266667 -74,632727778 14,00 2,00 4,00 13,00 27,20

353 0 326,00 4,00 17,00 48,65 74,00 38,00 32,37 4,296847222 -74,642325000 110,00 2,00 3,00 42,00 27,60

354 0 341,00 4,00 17,00 14,79 74,00 39,00 29,22 4,287441667 -74,658116667 110,00 2,00 3,00 42,00 29,80

356 0 397,00 4,00 16,00 5,04 74,00 42,00 9,33 4,268066667 -74,702591667 14,00 2,00 4,00 13,00 34,20

357 0 285,00 4,00 15,00 21,28 74,00 42,00 56,59 4,255911111 -74,715719444 14,00 2,00 4,00 13,00 35,50

358 0 275,00 4,00 15,00 7,22 74,00 43,00 10,97 4,252005556 -74,719713889 14,00 2,00 4,00 13,00 39,00

1 0 1650,00 4,00 18,00 47,90 74,00 31,00 5,00 4,313305556 -74,518055556 110,00 2,00 3,00 42,00 27,90

3 0 1470,00 4,00 18,00 35,90 74,00 31,00 34,00 4,309972222 -74,526111111 33,00 1,00 1,00 15,00 33,80

4 0 1570,00 4,00 16,00 37,10 74,00 32,00 39,70 4,276972222 -74,544361111 14,00 2,00 4,00 13,00 33,00

5 0 1830,00 4,00 16,00 57,60 74,00 24,00 41,60 4,282666667 -74,411555556 22,00 3,00 5,00 23,00

24,00

Localización [Acc= Accesión; Reg.= Región (0=Chicamocha, 1=Sumapaz); alt.=Altitud; gn=Grados Norte; mn=minutos norte; sn=segundos norte; go=grados oeste; mo=minutos oeste; so=segundos oeste; cdn=coordenada decimal norte; cdo=coordenada

decimal oeste]. Ecosistemas (IAVH, 1998) [cod=código de clima; bio= ecosistema; cli= clima; cob= cobertura]; Clima [tmax= temp. Máxima.


C: Anexo C (Continuación)

tmin Hrmax Hrmin Vvmax Vvmin hPamax hPamin Uvmax Uvmin Dumax Dumin pH CO N Ca K

24,00 70,00 52,00 15,00 8,00 1012,00 1011,00 15,20 13,90 259,40 242,30 5,05 2,37 0,21 14,91 0,72

24,00 70,00 52,00 15,00 8,00 1012,00 1011,00 15,20 13,90 259,40 242,30 7,73 1,50 0,13 7,42 0,20

20,00 68,00 66,00 15,00 8,00 1012,00 1011,00 15,20 13,90 259,40 242,30 6,67 2,93 0,25 17,25 0,29

21,00 70,00 69,00 15,00 8,00 1012,00 1011,00 15,20 13,90 259,40 242,30 6,73 3,88 0,33 22,44 0,64

21,00 73,00 68,00 15,00 8,00 1012,00 1011,00 15,20 13,90 259,40 242,30 5,61 5,96 0,51 14,81 0,43

22,00 71,00 70,00 15,00 8,00 1012,00 1011,00 15,20 13,90 259,40 242,30 5,56 2,34 0,20 19,38 0,54

22,00 56,00 51,00 15,00 8,00 1012,00 1011,00 15,20 13,90 259,40 242,30 6,73 3,88 0,33 22,44 0,64

28,00 67,00 65,00 7,00 5,00 1014,00 1013,00 17,20 16,00 258,50 240,70 4,64 2,83 0,24 7,21 1,69

27,90 65,00 63,00 8,00 6,00 1014,00 1013,00 17,00 15,50 258,50 240,70 5,13 1,98 0,17 6,83 0,15

30,00 71,00 70,00 8,00 6,00 1014,00 1013,00 17,00 15,50 258,50 240,70 7,33 3,00 0,26 19,64 1,34

28,80 69,00 67,00 8,00 6,00 1014,00 1013,00 17,00 15,50 258,50 240,70 6,00 2,96 0,26 18,34 1,27

27,10 59,00 55,00 10,00 8,00 1014,00 1013,00 16,80 15,30 258,50 240,90 5,45 7,98 0,69 11,58 0,92

29,00 58,00 56,00 12,00 10,00 1014,00 1013,00 16,80 15,30 258,50 240,90 6,78 1,09 0,09 7,10 0,62

28,00 52,00 51,00 7,00 5,00 1014,00 1013,00 17,20 16,00 258,50 240,70 6,67 2,93 0,25 17,25 0,29

35,20 49,00 48,00 9,00 6,00 1013,00 1012,00 16,10 15,10 255,90 243,40 8,13 1,04 0,09 19,19 2,68

33,70 52,00 48,00 9,00 6,00 1013,00 1012,00 16,10 15,10 255,90 243,40 6,09 6,71 0,58 17,45 0,77

32,80 56,00 53,00 9,00 6,00 1013,00 1012,00 16,10 15,10 255,90 243,40 7,13 0,80 0,07 9,09 1,67

28,50 70,00 69,00 9,00 6,00 1013,00 1012,00 16,10 15,10 255,90 243,40 7,00 2,12 0,18 14,73 1,16

30,20 66,00 63,00 6,00 5,00 1013,00 1011,00 16,10 15,20 247,40 238,30 4,80 4,83 0,42 18,59 1,79

35,20 45,00 44,00 6,00 5,00 1013,00 1011,00 16,10 15,20 247,40 238,30 4,86 1,92 0,17 5,37 0,17

36,20 63,00 61,00 8,00 5,00 1014,00 1011,00 16,10 15,20 249,40 238,10 5,60 2,59 0,22 17,24 0,33

36,50 54,00 38,00 8,00 7,00 1013,00 1011,00 16,30 15,40 249,40 238,10 5,05 2,47 0,21 14,91 0,72

34,60 44,00 42,00 8,00 7,00 1013,00 1011,00 16,30 15,40 249,40 238,10 7,67 0,96 0,08 13,06 2,05

34,60 48,00 43,00 8,00 7,00 1013,00 1011,00 16,30 15,40 249,40 238,10 7,40 1,94 0,17 24,01 0,50

35,40 41,00 38,00 8,00 7,00 1013,00 1011,00 16,30 15,40 249,40 238,10 5,61 5,96 0,51 14,81 0,43

26,50 69,00 62,00 9,00 8,00 1014,00 1011,00 15,80 15,50 250,00 247,30 7,73 1,50 0,13 7,51 0,20

27,30 88,00 87,00 9,00 8,00 1014,00 1011,00 15,80 15,50 250,00 247,30 7,88 4,18 0,36 27,02 1,06

29,60 70,00 68,00 9,00 8,00 1014,00 1011,00 15,80 15,50 250,00 247,30 7,68 1,93 0,17 27,83 1,10

33,40 72,00 70,00 9,00 8,00 1014,00 1011,00 15,80 15,50 250,00 247,30 7,71 0,76 0,07 6,62 0,16

33,10 58,00 53,00 8,00 4,00 1013,00 1011,00 15,80 14,90 249,00 239,10 7,84 1,14 0,10 23,96 0,46

34,80 53,00 50,00 8,00 4,00 1013,00 1011,00 15,80 14,90 249,00 239,10 7,88 4,18 0,36 27,02 1,06

27,00 48,00 47,00 7,00 5,00 1014,00 1013,00 17,20 16,00 258,30 240,80 6,50 6,17 0,83 16,50 0,76

31,20 56,00 53,00 7,00 5,00 1014,00 1013,00 17,20 16,00 258,30 240,80 6,20 6,71 0,58 16,80 0,77

31,00 76,00 75,00 7,00 5,00 1014,00 1013,00 17,20 16,00 258,30 240,80 7,30 0,80 0,07 9,08 1,67

22,00 78,00 77,00 7,00 5,00 1014,00 1013,00 17,20 16,00 258,30 240,80 6,80 2,12 0,18 14,30 1,16

Tmin=temperatura mínima; Hrmax=Humedad relativa máxima; Hrmin=Humedad relativa mínima; Vvmax=Velocidad del viento máxima; Vvmin=velocidad del viento mínima; hPamax=hPamin=; Uvmax=; Uvmin=; Dumax=; Dumin= Suelo [pH= acidez; CO=

Carbono orgánico; N=nitrógeno; Ca=Calcio; K=Potasio…]


C. Anexo C: (Continuación)

Mg Na AI CICE CIC P Cu Fe Mn Zn B Ar L A text Margalef Menhinick

4,95 0,05 0,16 20,79 26,33 109,73 3,52 262,25 46,09 18,48 0,66 13,04 31,34 55,62 3,00 0,49 0,391

0,39 0,11 0,00 8,21 5,26 108,18 1,37 618,98 56,42 13,15 0,27 5,04 13,34 81,62 1,00 0,49 0,391

2,29 0,32 0,00 20,16 24,19 116,00 3,09 208,58 17,74 43,46 0,57 15,04 35,34 49,62 2,00 0,49 0,391

3,66 0,07 0,00 26,81 18,74 116,00 2,13 69,63 18,64 14,69 0,44 21,04 39,34 39,62 2,00 0,49 0,391

1,03 0,25 0,00 16,52 40,22 67,67 4,23 194,06 21,33 10,71 0,67 4,71 21,67 73,62 3,00 0,49 0,391

6,45 0,09 0,00 26,46 28,34 11,95 1,98 192,91 34,70 6,06 0,42 15,04 23,34 61,62 3,00 0,49 0,391

3,66 0,07 0,00 26,81 18,74 16,00 2,13 69,63 18,64 14,69 0,44 21,04 39,34 39,62 2,00 0,49 0,391

5,49 0,09 2,86 17,34 29,93 24,46 1,79 277,54 56,74 15,98 0,34 25,04 23,34 51,62 4,00 0,49 0,391

0,98 0,07 0,26 8,29 11,48 116,00 1,44 189,92 39,62 122,36 0,37 9,04 17,34 73,62 3,00 0,49 0,391

4,72 0,11 0,00 25,80 16,46 116,00 1,52 389,12 247,46 39,37 1,07 13,04 35,34 51,62 2,00 0,49 0,391

3,94 0,18 0,00 23,75 25,46 116,00 8,93 363,25 47,71 16,26 0,48 21,04 29,34 49,62 2,00 0,49 0,391

1,76 0,26 0,25 14,76 50,42 39,02 4,23 290,54 5,60 28,37 0,31 3,04 21,34 75,62 1,00 0,49 0,391

1,64 0,12 0,00 9,47 9,59 30,67 0,77 480,66 82,36 2,58 0,39 11,04 27,34 61,62 3,00 0,49 0,391

2,29 0,32 0,00 20,16 24,19 116,00 3,09 208,58 17,74 43,46 0,57 15,04 35,34 49,62 2,00 0,49 0,391

2,70 0,09 0,00 24,66 10,55 116,00 1,34 4,94 4,32 8,67 0,31 17,04 27,34 55,62 3,00 0,49 0,391

2,90 0,06 0,00 21,19 42,36 74,66 1,09 68,78 14,09 18,58 0,33 1,04 19,34 79,62 1,00 0,49 0,391

1,38 1,01 0,00 13,15 12,22 116,00 0,82 20,35 8,42 5,04 0,39 15,04 25,34 59,62 3,00 0,49 0,391

2,83 0,11 0,00 18,83 13,38 116,00 1,01 21,43 8,55 11,47 0,91 9,04 23,34 67,62 3,00 0,49 0,391

6,68 0,10 0,55 27,70 44,49 116,00 2,47 184,73 116,13 38,59 0,78 22,71 19,67 57,62 4,00 0,49 0,391

0,66 0,06 0,30 6,56 14,41 20,94 0,44 306,04 9,62 2,34 0,33 14,71 35,67 49,62 2,00 0,49 0,391

2,72 0,07 0,00 20,37 27,04 116,00 3,13 208,56 62,59 342,52 0,49 21,04 41,34 37,62 2,00 0,49 0,391

4,95 0,05 0,16 20,79 26,33 109,73 3,52 262,25 46,09 18,48 0,66 13,04 31,34 55,62 3,00 0,49 0,391

2,44 0,06 0,00 17,61 13,16 116,00 0,35 18,19 4,21 3,13 0,50 5,04 7,34 87,62 3,00 0,49 0,391

4,41 0,30 0,00 29,23 21,78 116,00 1,04 19,70 6,53 24,42 0,74 7,04 17,34 75,62 3,00 0,49 0,391

1,03 0,25 0,00 16,52 40,22 67,67 4,23 194,06 21,33 10,71 0,67 4,71 21,67 73,62 3,00 0,49 0,391

0,39 0,11 0,00 8,21 5,26 108,18 1,37 618,98 56,42 13,15 0,27 5,04 13,34 81,62 1,00 0,49 0,391

2,25 0,07 0,00 30,40 19,67 116,00 1,05 27,79 5,74 51,80 0,60 11,04 27,34 61,62 3,00 0,49 0,391

2,42 0,13 0,00 31,47 23,52 16,00 1,13 109,81 36,73 5,99 0,89 31,04 23,34 45,62 4,00 0,49 0,391

0,42 0,10 0,00 7,29 4,53 116,00 0,38 8,95 2,95 6,99 0,18 5,04 15,34 79,62 1,00 0,49 0,391

0,96 0,07 0,00 25,45 11,50 16,00 0,51 7,51 6,93 2,07 0,37 21,04 19,34 59,62 4,00 0,49 0,391

2,25 0,07 0,00 30,40 19,67 116,00 1,05 27,79 5,74 51,80 0,60 11,04 27,34 61,62 3,00 0,49 0,391

2,91 0,06 0,00 21,19 42,36 74,66 1,09 68,78 14,09 18,58 0,33 1,04 19,34 79,62 1,00 0,49 0,391

2,90 0,06 0,00 21,19 42,36 77,40 1,09 68,78 14,09 18,58 0,33 3,00 21,00 79,00 1,00 0,49 0,391

1,38 1,01 0,00 13,15 12,22 116,00 0,82 20,35 8,24 5,04 0,39 17,00 24,00 58,00 3,00 0,49 0,391

2,83 0,11 0,00 18,40 13,38 116,00 1,01 21,43 8,54 11,47 0,91 9,04 22,00 67,00 3,00 0,49 0,391

Suelo [Mg= magnesio; Na=sodio; Al=aluminio; CICE=capacidad de intercambio catiónico efectivo; CIC= Capacidad de intercambio catiónico; P=Fósforo; Cu=Cobre; Fe= Hierro; Mn= Manganeso; Zn=Cinc; B=Boro; Ar=Arcilla; L=Limo; A=Arena;

text= textura; Índices de Biodiversidad [Margalef=Indice de equitatividad de Margalef; Menhinick= Indice de riqueza de especies; Shannon= Índice de diversidad de especies; Brillouin= Indice de diversidad; Chai-1=estimado de diversidad especies

de una muestra; Chao-2= estimado de diversidad de especies total; Jacknife-1/2=distribución muestral de un estadígrafo.

D. Anexo D: frecuencias alélicas y genotípicas por cebador y por locus

Cebador ACA_

Locus

Frecuencias genotípicas Frecuencias alélicas hj= (1-p2-q2)

ACA_1

Genotipos AA Aa aa TOTAL

p q 0,2356


Individuos 15 44 59

Freq gen (obs) 0,2542 0,7458 1,0000 0,1364 0,8636

ACA_2


p q 0,2212


Individuos 14 45 59

Freq gen (obs) 0,2373 0,7627 1,0000 0,1267 0,8733

ACA_3


p q 0,4377


Individuos 32 27 59

Freq gen (obs) 0,5424 0,4576 1,0000 0,3235 0,6765

ACA_4


p q 0,4544


Individuos 34 25 59

Freq gen (obs) 0,5763 0,4237 1,0000 0,3491 0,6509


Locus Frecuencias genotípicas Frecuencias alélicas hj= (1-p2-q2)

ACA_5


p q 0.4691


Individuos 36 23 59

Freq gen (obs) 0.6102 0.3898 0.3756 0.6244

ACA_6


p q 0.4907


Individuos 48 11 59

Freq gen (obs) 0.8136 0.1864 0.5682 0.4318

ACA_7


p q 0.3771


Individuos 26 33 59

Freq gen (obs) 0.4407 0.5593 0.2521 0.7479

ACA_8


p q 0.5000


Individuos 44 15 59

Freq gen (obs) 0.7458 0.2542 0.4958 0.5042

ACA_9


p q 0.4092


Individuos 29 30 59

Freq gen (obs) 0.4915 0.5085 0.2869 0.7131

ACA_10


p q 0.4653


Individuos 51 8 59

Freq gen (obs) 0.8644 0.1356 0.6318 0.3682

ACA_11


p q 0.2212


Individuos 14 45 59

Freq gen (obs) 0.2373 0.7627 0.1267 0.8733

ACA_12


p q 0.4952


Individuos 47 12 59

Freq gen (obs) 0.7966 0.2034 0.5490 0.4510


Locus Frecuencias genotípicas Frecuencias alélicas hj= (1-p2-q2)

ACA_13


p q 0.4377


Individuos 32 27 59

Freq gen (obs) 0.5424 0.4576 0.3235 0.6765

ACA_14


p q 0.0666


Individuos 4 55 59

Freq gen (obs) 0.0678 0.9322 0.0345 0.9655

ACA_15


p q 0.1616


Individuos 10 49 59

Freq gen (obs) 0.1695 0.8305 0.0887 0.9113

ACA_16


p q 0.4909


Individuos 40 19 59

Freq gen (obs) 0.6780 0.3220 0.4325 0.5675

ACA_17


p q 0.0502


Individuos 3 56 59

Freq gen (obs) 0.0508 0.9492 0.0258 0.9742

ACA_18


p q 0.2774


Individuos 18 41 59

Freq gen (obs) 0.3051 0.6949 0.1664 0.8336

ACA_19


p q 0.0829


Individuos 5 54 59

Freq gen (obs) 0.0847 0.9153 0.0433 0.9567


Cebador AG_

Locus Frecuencias genotípicas Freq alélica hj= (1-p2-q2)

AG_1


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

AG_2


p q 0.2637


Individuos 17 42 59

Freq gen (obs) 0.2881 0.7119 1.0000 0.1563 0.8437

AG_3


p q 0.2212


Individuos 14 45 59

Freq gen (obs) 0.2373 0.7627 1.0000 0.1267 0.8733

AG_4


p q 0.4620


Individuos 35 24 59

Freq gen (obs) 0.5932 0.4068 1.0000 0.3622 0.6378

AG_5


p q 0.5000


Individuos 44 15 59

Freq gen (obs) 0.7458 0.2542 0.4958 0.5042

AG_6


p q 0.4127


Individuos 54 5 59

Freq gen (obs) 0.9153 0.0847 0.7089 0.2911

AG_7


p q 0.3852


Individuos 55 4 59

Freq gen (obs) 0.9322 0.0678 0.7396 0.2604



AG_8


p q 0.4516


Individuos 52 7 59

Freq gen (obs) 0.8814 0.1186 0.6556 0.3444

AG_9


p q 0.3493


Individuos 56 3 59

Freq gen (obs) 0.9492 0.0508 0.7745 0.2255

AG_10


p q 0.3852


Individuos 55 4 59

Freq gen (obs) 0.9322 0.0678 0.7396 0.2604

AG_11


p q 0.4516


Individuos 52 7 59

Freq gen (obs) 0.8814 0.1186 0.6556 0.3444

AG_12


p q 0.4127


Individuos 54 5 59

Freq gen (obs) 0.9153 0.0847 0.7089 0.2911

AG_13


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

AG_14


p q 0.1462


Individuos 9 50 59

Freq gen (obs) 0.1525 0.8475 0.0794 0.9206


Cebador CA_


CA_1


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 1.0000 0.8698 0.1302

CA_2


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 1.0000 0.8698 0.1302

CA_3


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) #¡DIV/0! 0.0169 #¡DIV/0! 0.8698 0.1302

CA_4


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 1.0000 0.8698 0.1302

CA_5


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 0.8698 0.1302

CA_6


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 0.8698 0.1302

CA_7


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 0.8698 0.1302


Cebador CA_ (Continuación)


CA_8


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 0.8698 0.1302

CA_9


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 0.8698 0.1302

CA_10


p q 0.2265


Individuos 58 1 59

Freq gen (obs) 0.9831 0.0169 0.8698 0.1302

CA_11


p q 0.0000


Individuos 59 0 59

Freq gen (obs) 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000

CA_12


p q 0.0000


Individuos 59 0 59

Freq gen (obs) 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000

CA_13


p q 0.0000


Individuos 59 0 59

Freq gen (obs) 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000

CA_14


p q 0.0000


Individuos 59 0 59

Freq gen (obs) 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000


Cebador CA_ (Continuación)


CA_15


p q 0.0000


Individuos 59 0 59

Freq gen (obs) 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000

CA_16


p q 0.0000


Individuos 59 0 59

Freq gen (obs) 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000

CA_17


p q 0.0169


Individuos 1 58 59

Freq gen (obs) 0.0169 0.9831 0.0085 0.9915

CA_18


p q 0.0169


Individuos 1 58 59

Freq gen (obs) 0.0169 0.9831 0.0085 0.9915

CA_19


p q 0.0169


Individuos 1 58 59

Freq gen (obs) 0.0169 0.9831 0.0085 0.9915


Cebador CGA_


CGA_1


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 1.0000 0.0980 0.9020

CGA_2


p q 0.2356


Individuos 15 44 59

Freq gen (obs) 0.2542 0.7458 1.0000 0.1364 0.8636

CGA_3


p q 0.1149


Individuos 7 52 59

Freq gen (obs) 0.1186 0.8814 1.0000 0.0612 0.9388

CGA_4


p q 0.2637


Individuos 17 42 59

Freq gen (obs) 0.2881 0.7119 1.0000 0.1563 0.8437

CGA_5


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

CGA_6


p q 0.0000


Individuos 0 59 59

Freq gen (obs) 0.0000 1.0000 0.0000 1.0000

CGA_7


p q 0.4945


Individuos 41 18 59

Freq gen (obs) 0.6949 0.3051 0.4477 0.5523


Cebador CGA_ (Continuación)


CGA_8


p q 0.0502


Individuos 3 56 59

Freq gen (obs) 0.0508 0.9492 0.0258 0.9742

CGA_9


p q 0.0336


Individuos 2 57 59

Freq gen (obs) 0.0339 0.9661 0.0171 0.9829

Cebador CCA_

Locus Frecuencias genotípicas Freq alélica hj= (1-p2-

q2)

CCA_1


p q 0.3296


Individuos 22 37 59

Freq gen (obs) 0.3729 0.6271 1.0000 0.2081 0.7919

CCA_2


p q 0.2637


Individuos 17 42 59

Freq gen (obs) 0.2881 0.7119 1.0000 0.1563 0.8437

CCA_3


p q 0.0502


Individuos 3 56 59

Freq gen (obs) 0.0508 0.9492 1.0000 0.0258 0.9742

CCA_4


p q 0.3540


Individuos 24 35 59

Freq gen (obs) 0.4068 0.5932 1.0000 0.2298 0.7702


Cebador CCA_ (Continuación)

Locus Frecuencias genotípicas Freq alélica hj= (1-p2-

q2)

CCA_5


p q 0.4973


Individuos 42 17 59

Freq gen (obs) 0.7119 0.2881 0.4632 0.5368

CCA_6


p q 0.3419


Individuos 23 36 59

Freq gen (obs) 0.3898 0.6102 0.2189 0.7811

CCA_7


p q 0.3882


Individuos 27 32 59

Freq gen (obs) 0.4576 0.5424 0.2635 0.7365

CCA_8


p q 0.4286


Individuos 31 28 59

Freq gen (obs) 0.5254 0.4746 0.3111 0.6889


Cebador TG_

Locus Frecuencias genotípica Freq alélica hj= (1-p2-q2)

TG_1


p q 0.2066


Individuos 13 46 59

Freq gen (obs) 0.2203 0.7797 1.0000 0.1170 0.8830

TG_2


p q 0.1918


Individuos 12 47 59

Freq gen (obs) 0.2034 0.7966 1.0000 0.1075 0.8925

TG_3


p q 0.1918


Individuos 12 47 59

Freq gen (obs) 0.2034 0.7966 1.0000 0.1075 0.8925

TG_4


p q 0.1918


Individuos 12 47 59

Freq gen (obs) 0.2034 0.7966 1.0000 0.1075 0.8925

TG_5


p q 0.2066


Individuos 13 46 59

Freq gen (obs) 0.2203 0.7797 0.1170 0.8830


Cebador TG_ (Continuación)

Locus Frecuencias genotípica Freq alélica hj= (1-p2-q2)

TG_6


p q 0.2066


Individuos 13 46 59

Freq gen (obs) 0.2203 0.7797 0.1170 0.8830

TG_7


p q 0.4755


Individuos 37 22 59

Freq gen (obs) 0.6271 0.3729 0.3894 0.6106

TG_8


p q 0.0000


Individuos 59 0 59

Freq gen (obs) 1.0000 0.0000 1.0000 0.0000

TG_9


p q 0.4377


Individuos 32 27 59

Freq gen (obs) 0.5424 0.4576 0.3235 0.6765

TG_10


p q 0.4463


Individuos 33 26 59

Freq gen (obs) 0.5593 0.4407 0.3362 0.6638

TG_11


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020


Cebador GT_


GT_1


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 1.0000 0.0980 0.9020

GT_2


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 1.0000 0.0980 0.9020

GT_3


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 1.0000 0.0980 0.9020

GT_4


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 1.0000 0.0980 0.9020

GT_5


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020


Cebador GT_ (Continuación)

Locus Frecuencias genotípicas Freq alelica hj= (1-p2-q2)

GT_8


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

GT_9


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

GT_10


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

GT_11


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

GT_12


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

GT_13


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

GT_14


p q 0.1768


Individuos 11 48 59

Freq gen (obs) 0.1864 0.8136 0.0980 0.9020

E. Anexo E: bandas por individuo para siete cebadores RAM

Accesión ACA_1 ACA_2 ACA_3 ACA_4 ACA_5 ACA_6 ACA_7 ACA_8 ACA_9 ACA_10 ACA_11 ACA_12 ACA_13 ACA_14 ACA_15 174 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 187 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 189 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 201 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 202 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 209 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 217 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 300 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 301 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 302 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 303 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 304 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 305 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 308 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 310 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 311 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 312 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 313 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 314 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 320 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 322 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0


Accesión ACA_1 ACA_2 ACA_3 ACA_4 ACA_5 ACA_6 ACA_7 ACA_8 ACA_9 ACA_10 ACA_11 ACA_12 ACA_13 ACA_14 ACA_15 341 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 342 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 344 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 345 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 346 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 347 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 348 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 349 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 350 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 351 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 352 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 353 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 354 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 356 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 357 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 358 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 359 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 360 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 362 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 363 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 364 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 365 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 366 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 367 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 369 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 370 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 373 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 374 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 375 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 377 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 378 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 379 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 2 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0


Accesión ACA_1 ACA_2 ACA_3 ACA_4 ACA_5 ACA_6 ACA_7 ACA_8 ACA_9 ACA_10 ACA_11 ACA_12 ACA_13 ACA_14 ACA_15 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 5 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 Accesión ACA_16 ACA_17 ACA_18 ACA_19 AG_1 AG_2 AG_3 AG_4 AG_5 AG_6 AG_7 AG_8 AG_9 AG_10 AG_11 AG_12 AG_13

174 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 187 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 189 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 201 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 202 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 209 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 217 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 300 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 301 9 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 302 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 303 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 304 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 305 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 308 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 310 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 311 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 312 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 313 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 314 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 320 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 322 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 340 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 341 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 342 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 344 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 345 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 346 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 347 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 348 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 349 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 350 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 351 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0


Accesión ACA_16 ACA_17 ACA_18 ACA_19 AG_1 AG_2 AG_3 AG_4 AG_5 AG_6 AG_7 AG_8 AG_9 AG_10 AG_11 AG_12 AG_13 353 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 354 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 356 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 357 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 358 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 359 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 360 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 362 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 363 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 364 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 365 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 366 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 367 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 369 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 370 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 373 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 374 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 375 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 377 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 378 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 379 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 2 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 3 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 4 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 5 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Accesión AG_14 CA_1 CA_2 CA_3 CA_4 CA_5 CA_6 CA_7 CA_8 CA_9 CA_10 CA_17 CA_18 CA_19 CGA_1 CGA_2 CGA_3 CGA_4

174 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 187 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 189 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 201 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 202 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 209 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 217 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0


Accesión AG_14 CA_1 CA_2 CA_3 CA_4 CA_5 CA_6 CA_7 CA_8 CA_9 CA_10 CA_17 CA_18 CA_19 CGA_1 CGA_2 CGA_3 CGA_4 301 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 302 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 303 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 304 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 305 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 308 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 310 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 311 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 312 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 313 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 314 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 320 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 322 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 340 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 341 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 342 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 344 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 345 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 346 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 347 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 348 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 349 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 350 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 351 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 352 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 353 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 354 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 356 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 357 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 358 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 359 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 360 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 362 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 363 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 364 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0


Accesión AG_14 CA_1 CA_2 CA_3 CA_4 CA_5 CA_6 CA_7 CA_8 CA_9 CA_10 CA_17 CA_18 CA_19 CGA_1 CGA_2 CGA_3 CGA_4 366 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 367 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 369 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 370 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 373 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 374 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 375 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 377 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 378 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 379 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 4 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 5 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Accesión CGA_5 CGA_7 CGA_9 CCA_1 CCA_2 CCA_3 CCA_4 CCA_5 CCA_6 CCA_7 CCA_8 CCA_9 CCA_10 TG_1 TG_2 TG_3 TG_4

174 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 187 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 189 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 201 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 202 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 209 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 217 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 300 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 301 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 302 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 303 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 304 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 305 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 308 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 310 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 311 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 312 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 313 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1


Accesión CGA_5 CGA_7 CGA_9 CCA_1 CCA_2 CCA_3 CCA_4 CCA_5 CCA_6 CCA_7 CCA_8 CCA_9 CCA_10 TG_1 TG_2 TG_3 TG_4 320 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 322 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 340 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 341 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 342 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 344 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 345 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 346 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 347 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 348 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 349 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 350 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 351 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 352 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 353 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 354 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 356 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 357 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 358 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 359 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 360 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 362 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 363 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 364 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 365 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 366 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 367 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 369 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 370 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 373 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 374 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 375 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 377 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 378 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0


Accesión CGA_5 CGA_7 CGA_9 CCA_1 CCA_2 CCA_3 CCA_4 CCA_5 CCA_6 CCA_7 CCA_8 CCA_9 CCA_10 TG_1 TG_2 TG_3 TG_4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 5 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0

Accesión TG_5 TG_6 TG_7 TG_9 TG_10 TG_11 NN_1 NN_2 NN_3 NN_4 NN_5 NN_6 NN_7 NN_8 NN_9 NN_10 NN_11 NN_12 NN_13

174 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

187 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

189 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

201 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

202 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

209 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

217 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

300 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

301 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

302 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

303 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

304 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Accesión TG_5 TG_6 TG_7 TG_9 TG_10 TG_11 GT_1 GT_2 GT_3 GT_4 GT_5 GT_6 GT_7 GT_8 GT_9 GT_10 GT_11 GT_12 GT_13

305 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

308 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

310 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

311 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

312 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

313 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

314 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

320 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

322 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

340 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

341 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

342 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

344 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

345 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

346 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



348 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

349 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

350 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

351 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

352 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

353 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

354 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

356 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

357 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

358 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

359 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

360 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

362 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

363 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

364 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

365 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

366 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

367 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

369 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

370 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

373 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

374 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

375 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

377 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

378 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

379 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

5 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


E. Anexo E. matriz de distancias geográficas para a) región

Chicamocha, b) Región Sumapaz

1 23

CHICAMOCHA

D

Geographic Distancie

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 0,000

1

0,444 0,000

2

0,545 0,124 0,000

3

0,036 0,409 0,509 0,000

4

0,033 0,410 0,512 0,008 0,000

5

0,201 0,273 0,356 0,166 0,171 0,000

6

0,539 0,221 0,143 0,505 0,509 0,339 0,000

7

1,291 0,909 0,785 1,256 1,261 1,090 0,751 0,000

8

0,544 0,123 0,002 0,509 0,511 0,355 0,145 0,787 0,000

9

0,544 0,125 0,003 0,509 0,511 0,355 0,140 0,784 0,005 0,000

10

0,543 0,114 0,018 0,508 0,510 0,357 0,160 0,795 0,016 0,020 0,000

11

0,476 0,033 0,107 0,442 0,443 0,306 0,223 0,888 0,105 0,109 0,094 0,000

12

0,475 0,035 0,115 0,440 0,441 0,307 0,232 0,894 0,113 0,116 0,101 0,009 0,000

13

0,471 0,028 0,109 0,436 0,437 0,301 0,222 0,891 0,107 0,111 0,097 0,006 0,011 0,000

14

0,466 0,023 0,111 0,432 0,433 0,296 0,221 0,894 0,109 0,112 0,099 0,010 0,014 0,004 0,000

15

0,416 0,029 0,143 0,381 0,382 0,244 0,223 0,928 0,142 0,144 0,136 0,062 0,063 0,057 0,052 0,000

16

0,392 0,052 0,162 0,357 0,359 0,221 0,229 0,944 0,161 0,162 0,156 0,086 0,087 0,080 0,076 0,024 0,000

17

0,006 0,439 0,540 0,030 0,030 0,195 0,534 1,285 0,539 0,539 0,538 0,472 0,471 0,466 0,462 0,411 0,388 0,000

18

0,019 0,425 0,527 0,020 0,015 0,186 0,524 1,275 0,526 0,526 0,525 0,457 0,456 0,452 0,448 0,397 0,374 0,017 0,000

19

0,244 0,637 0,753 0,274 0,268 0,437 0,771 1,521 0,752 0,753 0,748 0,667 0,663 0,662 0,658 0,612 0,592 0,251 0,255 0,000

20

0,034 0,411 0,511 0,002 0,009 0,168 0,506 1,257 0,510 0,511 0,510 0,443 0,442 0,438 0,434 0,383 0,359 0,029 0,019 0,274 0,000

21

0,037 0,407 0,509 0,009 0,003 0,169 0,507 1,258 0,508 0,508 0,507 0,439 0,438 0,434 0,430 0,379 0,356 0,033 0,018 0,270 0,011 0,000

22

0,034 0,409 0,511 0,009 0,001 0,171 0,509 1,260 0,510 0,511 0,510 0,442 0,441 0,436 0,432 0,381 0,358 0,030 0,016 0,268 0,010 0,003 0,000 23


E. Anexo E: (continuación)

1 35

SUMAPAZ D(2)


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

0,000

0,008 0,00

0

0,006 0,00

5 0,000

0,023 0,01

6 0,017 0,00

0

0,023 0,01

6 0,017 0,00

3 0,00

0

0,024 0,01

9 0,018 0,00

8 0,00

5 0,00

0

0,048 0,04

8 0,044 0,04

5 0,04

2 0,03

7 0,00

0

0,089 0,09

6 0,095 0,11

2 0,11

2 0,11

3 0,11

6 0,00

0

0,091 0,09

8 0,096 0,11

3 0,11

3 0,11

3 0,11

4 0,01

0 0,00

0

0,065 0,07

2 0,070 0,08

7 0,08

6 0,08

6 0,08

4 0,03

4 0,03

0 0,00

0

0,057 0,06

4 0,059 0,07

4 0,07

2 0,07

0 0,05

5 0,06

9 0,06

4 0,03

5 0,00

0

0,121 0,12

6 0,121 0,13

2 0,12

9 0,12

6 0,09

4 0,11

7 0,10

8 0,09

1 0,06

7 0,00

0

0,083 0,09

0 0,086 0,10

3 0,10

1 0,10

0 0,08

8 0,04

9 0,04

0 0,02

6 0,03

3 0,06

9 0,00

0

0,104 0,11

0 0,111 0,12

6 0,12

7 0,12

9 0,14

2 0,03

9 0,04

8 0,06

8 0,10

2 0,15

6 0,08

7 0,00

0

0,344 0,33

7 0,338 0,32

2 0,32

2 0,32

1 0,32

5 0,43

3 0,43

4 0,40

5 0,37

9 0,39

9 0,41

3 0,44

6 0,00

0

0,344 0,33

7 0,338 0,32

1 0,32

1 0,32

0 0,32

4 0,43

3 0,43

3 0,40

4 0,37

9 0,39

9 0,41

2 0,44

5 0,00

0 0,00

0

0,344 0,33

7 0,338 0,32

2 0,32

1 0,32

0 0,32

5 0,43

3 0,43

4 0,40

5 0,37

9 0,40

0 0,41

3 0,44

6 0,00

3 0,00

3 0,00

0

0,363 0,35

6 0,356 0,34

1 0,34

0 0,33

8 0,33

5 0,44

9 0,44

8 0,41

8 0,38

9 0,39

7 0,42

2 0,46

7 0,06

9 0,06

9 0,07

1 0,00

0

0,384 0,37

9 0,378 0,36

4 0,36

2 0,36

0 0,35

1 0,46

7 0,46

5 0,43

5 0,40

3 0,40

3 0,43

5 0,48

9 0,12

3 0,12

3 0,12

5 0,05

4 0,00

0


1 35 SUMAPAZ D(2)


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

0,224 0,21

9 0,218 0,20

4 0,20

2 0,20

0 0,19

4 0,30

9 0,30

8 0,27

8 0,24

8 0,26

0 0,28

1 0,32

9 0,14

2 0,14

2 0,14

3 0,14

0 0,16

0 0,04

8 0,08

8 0,00

0

0,216 0,20

9 0,209 0,19

4 0,19

3 0,19

1 0,19

1 0,30

3 0,30

3 0,27

3 0,24

6 0,26

6 0,27

9 0,31

9 0,13

4 0,13

4 0,13

5 0,14

8 0,17

7 0,07

8 0,10

4 0,03

1 0,00

0

0,213 0,20

6 0,207 0,19

1 0,19

0 0,18

9 0,19

6 0,30

2 0,30

3 0,27

4 0,25

0 0,27

7 0,28

3 0,31

5 0,13

1 0,13

1 0,13

1 0,15

9 0,19

5 0,10

7 0,12

5 0,06

2 0,03

1

0,192 0,18

5 0,186 0,16

9 0,16

9 0,16

9 0,17

9 0,28

1 0,28

2 0,25

4 0,23

2 0,26

5 0,26

5 0,29

2 0,15

5 0,15

4 0,15

4 0,18

7 0,22

3 0,13

1 0,15

3 0,08

4 0,05

3

0,139 0,13

4 0,133 0,11

9 0,11

7 0,11

5 0,11

0 0,22

4 0,22

3 0,19

3 0,16

5 0,18

5 0,19

8 0,24

4 0,21

6 0,21

6 0,21

6 0,22

5 0,24

5 0,12

4 0,17

3 0,08

5 0,08

2

0,149 0,14

4 0,143 0,13

0 0,12

8 0,12

5 0,11

8 0,23

3 0,23

1 0,20

1 0,17

2 0,18

9 0,20

5 0,25

4 0,21

1 0,21

0 0,21

1 0,21

7 0,23

5 0,11

3 0,16

3 0,07

6 0,07

7

0,166 0,16

1 0,160 0,14

7 0,14

5 0,14

2 0,13

2 0,24

8 0,24

6 0,21

6 0,18

6 0,19

8 0,21

9 0,27

0 0,20

2 0,20

2 0,20

3 0,20

3 0,21

9 0,09

6 0,14

8 0,06

3 0,07

0

0,214 0,20

9 0,207 0,19

5 0,19

3 0,19

0 0,17

7 0,29

3 0,29

0 0,26

0 0,22

8 0,23

0 0,26

0 0,31

7 0,18

0 0,18

0 0,18

1 0,16

7 0,17

5 0,05

0 0,10

8 0,04

2 0,06

9

0,229 0,22

5 0,223 0,21

1 0,20

9 0,20

6 0,19

1 0,30

7 0,30

4 0,27

4 0,24

1 0,23

9 0,27

3 0,33

2 0,18

0 0,18

0 0,18

2 0,16

1 0,16

4 0,04

1 0,10

0 0,05

1 0,08

1

0,234 0,22

9 0,228 0,21

6 0,21

4 0,21

1 0,19

5 0,31

1 0,30

8 0,27

8 0,24

5 0,24

2 0,27

6 0,33

6 0,18

1 0,18

1 0,18

3 0,15

9 0,16

1 0,03

9 0,09

9 0,05

5 0,08

6

0,024 0,01

9 0,018 0,00

8 0,00

5 0,00

0 0,03

7 0,11

3 0,11

3 0,08

6 0,07

0 0,12

6 0,10

0 0,12

9 0,32

1 0,32

0 0,32

0 0,33

8 0,36

0 0,23

8 0,28

8 0,20

0 0,19

1

0,033 0,02

7 0,026 0,01

5 0,01

3 0,00

9 0,03

3 0,11

9 0,12

0 0,09

2 0,07

3 0,12

5 0,10

4 0,13

7 0,31

4 0,31

3 0,31

4 0,33

1 0,35

2 0,23

0 0,27

9 0,19

2 0,18

4

0,062 0,06

0 0,057 0,05

3 0,04

9 0,04

5 0,01

8 0,13

5 0,13

2 0,10

2 0,07

2 0,10

3 0,10

5 0,16

0 0,30

8 0,30

7 0,30

8 0,31

7 0,33

3 0,20

8 0,26

2 0,17

6 0,17

4

0,087 0,09

5 0,093 0,11

0 0,11

0 0,11

1 0,11

5 0,00

2 0,01

0 0,03

3 0,06

7 0,11

7 0,04

8 0,03

9 0,43

1 0,43

1 0,43

1 0,44

7 0,46

6 0,34

1 0,39

4 0,30

7 0,30

1


1

SUMAPAZ D(2)


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

20

21

22

23

0,000

24

0,028 0,000

25

0,092 0,084 0,000

26

0,090 0,087 0,012 0,000

27

0,090 0,092 0,030 0,018 0,000

28

0,099 0,114 0,079 0,067 0,049 0,000

29

0,112 0,129 0,096 0,084 0,066 0,018 0,000

30

0,116 0,134 0,101 0,089 0,071 0,023 0,006 0,000

31

0,189 0,169 0,115 0,125 0,142 0,190 0,206 0,211 0,000

32

0,183 0,163 0,107 0,117 0,134 0,181 0,197 0,202 0,009 0,000

33

0,180 0,164 0,092 0,100 0,114 0,158 0,173 0,177 0,045 0,038 0,000

34

0,300 0,279 0,222 0,231 0,247 0,291 0,305 0,310 0,111 0,118 0,133 0,000 35


F. Anexo F: matriz de distancias genéticas para a) región Chicamocha, b) región Sumapaz

1 23 1 23 1 23

CHICAMOCHA D

Binary Distancie Pop1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 0

1

3 0

2

6 7 0

3

12 9 6 0

4

25 26 25 27 0

5

32 29 26 20 9 0

6

22 23 22 26 3 12 0

7

37 40 37 39 20 25 23 0

8

36 37 34 36 15 22 18 7 0

9

37 40 35 37 20 25 21 8 9 0

10

38 41 34 36 19 20 22 7 10 7 0

11

35 38 33 37 24 27 23 6 11 6 9 0

12

32 35 32 36 19 26 18 9 10 7 8 5 0

13

48 51 48 50 27 34 30 11 14 15 16 15 16 0

14

38 41 38 40 17 24 20 9 10 9 8 11 6 12 0

15

33 36 33 35 14 21 17 6 9 8 5 10 5 15 5 0

16

39 40 39 39 18 23 21 12 7 10 13 16 13 13 11 12 0

17

22 25 22 24 29 36 32 21 24 23 20 25 20 26 18 17 25 0

18

37 40 35 37 16 21 19 8 9 6 5 8 5 15 5 4 12 19 0

19

37 38 35 35 18 21 21 8 9 6 5 8 5 15 5 4 10 19 2 0

20

38 41 40 42 15 24 18 17 18 15 16 19 14 18 10 11 17 26 11 13 0

21

35 38 33 35 16 21 19 10 9 8 7 12 9 15 7 6 12 19 6 6 15 0

22

33 34 33 33 14 19 17 12 7 8 9 12 11 19 11 10 8 25 8 6 15 8 0 23


SUMAPAZ D(2) Binary

Distancie Pop1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

0

1

6 0

2

3 7 0

3

6 4 5 0

4

18 16 17 16 0

5

38 40 37 40 34 0

6

40 38 39 40 34 10 0

7

42 42 41 40 32 16 14 0

8

45 45 42 41 31 13 21 13 0

9

29 29 28 27 23 25 31 25 22 0

10

28 26 27 26 20 24 30 28 25 7 0

11

26 26 27 24 18 28 34 28 23 9 6 0

12

24 20 23 20 22 34 36 34 29 15 12 10 0

13

32 30 29 26 20 28 36 28 23 9 6 8 14 0

14

27 27 28 25 33 43 41 35 42 24 21 19 23 21 0

15

46 42 47 42 34 44 48 48 41 29 24 26 30 24 41 0

16

24 20 25 22 30 40 34 40 41 23 18 18 18 22 15 30 0

17

37 35 40 37 41 31 27 29 30 44 41 37 35 43 38 47 25 0

18

35 37 38 35 43 27 27 25 28 40 37 35 39 39 32 51 25 10 0

19

23 23 26 23 31 43 41 41 44 28 25 23 25 27 20 33 9 22 18 0

20

19 19 22 17 25 41 39 35 38 22 21 17 21 23 16 37 9 26 22 10 0

21

18 20 21 18 26 38 38 34 37 21 22 16 20 24 17 38 10 25 21 9 3 0

22

19 19 22 19 27 39 39 35 40 24 23 17 21 25 18 37 9 24 22 8 6 3 0

23

20 18 23 18 28 40 38 36 37 21 18 16 20 20 13 32 6 27 23 9 5 6 7 0

24

26 24 29 24 22 36 32 34 35 19 16 14 22 18 23 26 14 33 33 15 15 16 17 10 0

25

21 19 22 17 23 45 41 37 38 26 29 23 23 29 24 39 17 32 26 14 12 11 14 13 19 0

26

22 24 21 22 32 46 44 44 43 29 34 30 28 36 31 44 18 35 31 15 17 16 15 20 24 11 0

27

27 27 28 27 37 47 43 45 48 32 35 31 29 39 22 45 19 34 34 16 20 17 18 21 23 16 11 0

28

22 20 23 20 32 42 40 44 41 25 22 22 22 26 19 36 10 33 27 13 13 14 15 8 16 13 14 15 0

29

22 24 23 22 32 42 42 44 43 27 28 24 24 32 23 44 16 33 29 17 13 10 11 16 24 15 12 13 10 0

30

22 24 19 20 28 44 44 42 41 25 26 28 26 28 23 44 20 39 29 17 19 18 21 18 24 11 12 15 12 14 0

31

21 21 18 17 23 43 43 39 36 22 25 23 21 27 24 43 21 40 34 22 18 17 20 19 25 10 13 14 13 13 5 0

32

17 21 16 17 25 39 39 35 38 22 25 25 23 27 22 41 19 36 30 18 18 15 16 17 25 14 15 18 17 15 7 8 0

33

21 19 20 17 25 33 37 39 34 18 15 19 19 17 18 33 13 38 32 20 14 15 18 11 19 20 25 26 11 17 19 18 22 0

34

27 31 26 29 35 45 43 43 48 32 35 33 31 39 20 55 29 44 38 28 28 25 26 29 35 22 21 14 21 19 15 14 14 28 0 35

G. Anexo G: protocolo usado para cualificación de metabolitos secundarios. Laboratorio fitoquímica Universidad Nacional-Palmira

Protocolo Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Nacional de Colombia-Sede

Palmira. Pruebas duales con etanol y cloroformo como solventes, para valorar la

presencia (1)-ausencia (0) de siete metabolitos secundarios [1. derivados de cumarinas,

2. esteroides y terpenoides, 3. flavonoides, 4. glicósidos cardiotónicos, 5. saponinas, 6.

heterósidos y 7. taninos].

Lavar el material vegetal,

En mortero, macere ˜20 gramos de tejido en 20 ml de etanol,

Filtre en embudo (de vidrio) tapado con lana de vidrio y recoja el filtrado en un Erlenmeyer. Deje escurrir bien,

Al residuo agregue 20 ml de cloroformo y macere bien,

Filtre y recoja el filtrado en embudo de separación. Agregue 10 ml de agua destilada. Agite y deje reposar. Si no hay buena separación agregue ˜5 ml de solución saturada de cloruro de sodio. Agite y deje reposar,

Separe la capa (de cloroformo) inferior en un Erlenmeyer y séquela con sulfato de sodio anhidro,

Decante la solución,

Guarde la fracción etanólica y la clorofórmica para las pruebas de:

Alcaloides. En un tubo de ensayo vierta 1 ml de solución etanólica y otro, 1 ml de solución clorofórmica. A cada tubo agregue 1 ml de HCl al 5%. Si se forma precipitado, filtre. Agregue a cada fracción 2-3 gotas de: a) Borchardat (precipitado), b) Dragendorff (precipitado), Wagner (precipitado). En cada caso la presencia de precipitado indica REACCIÓN POSITIVA.

Derivados de Coumarinas. A 0.2 ml de solución etanólica-SE y 0.2 ml de solución clorofórmica-SC, agregue a cada una 3 gotas de éter etílico y agite. En un papel filtro aplique 2 gotas separadas de la solución etérea etanólica y dos gotas de la solución etérea clorofórmica, de manera que forme 4 manchas de 1 cm de diámetro aprox. sin que se toquen entre sí. A una mancha de cada solución, agregue 1 gota de NaOH 1N. Deje secar. Exponga las manchas a la luz ultravioleta. La aparición de fluorescencia en la mancha indica REACCIÓN POSITIVA.


Esteroide y triterpenoides. En beaker de 50 ml agregue 0.3 ml de extracto etanólico. Evapore el solvente (en baño maría). Deje enfriar. Agregue 0.5 ml de CHHCl3. Agite. Vierta el contenido en un vidrio de reloj que contraste con el fondo blanco. Agregue 1-2 gotas de anhídrido acético y 1-2 gotas de H2SO4 concentrado. La aparición de colores verdes, azules, púrpura, rojo, indican REACCIÓN POSITIVA. Tome 0.2 ml de extracto clorofórmico inicial, vierta en un vidrio de reloj, y siga el procedimiento anterior.

Flavonoides. Evapore 0.5 ml de extracto etanólico y 0.5 de extracto clorofórmico. el residuo disuélvalo en 1 ml de metanol. Adicione 2 gotas de HCl concentrado y un trocito de cinta de Mg. Deje hasta que se consuma todo el Mg. El surgimiento de una coloración rosada, naranja, roja azulosa, violeta, verde, azul; indican PRUEBA POSITIVA.

Glicósidos cardiotónicos. Evapore por separado en un beaker de 50 ml del extracto etanólico y 0.5 ml del extracto clorofórmico. A los residuos agregue 1 ml de metanol. Separe cada solución en dos porciones y realice las siguientes pruebas:

A. Reactivo de Kedde. Agregue 2-3 gotas de este reactivo a dos de las soluciones. Un color azul violeta, indica REACCIÓN POSITIVA.

B. A las soluciones restantes, adicione 3 gotas de una solución recién preparada de nitroprusiato de sodio al 5% y 3 gotas de NaOH 2N. La coloración violeta intensa indica REACCIÓN POSITIVA.

Saponina espumídica. En un tubo de ensayo, disuelva 1 ml de extracto etanólico en 15 ml de agua destilada. Agitar vigorosamente por unos minutos. Si la fase espumosa permanece estable por las de media hora, el resultado se considera POSITIVO.

Heterósidos cianogénicos. En un Erlenmeyer de 125 ml coloque 10 gramos de material vegetal (fresco) picado, agregue 10 ml de agua destilada y 1 ml de H2SO4 concentrado. Tapar con u tapón de corcho en el cual está suspendida una tira de papel reactivo de picrato de sodio, de modo que no quede en contacto con las paredes del fresco ni con el material. Calentar a baño maría por 15 minutos. Si el papel toma color marrón rojizo, indica PRUEBA POSITIVA de HCN.

Taninos. A 0.3 ml de cada una de las soluciones a analizar se agregan dos gotas de

solución de cloruro férrico al 2%. Si hay cambio de coloración o aparición de un

precipitado, la prueba es POSITIVA.

Bibliografía

A Altieri M A, C I Nicholls. 2007. Conversión agroecológica de sistemas convencionales de

producción: teoría, estratégias y evaluación. Ecosistemas 16 (1). Enero 2007. http://www. revistaecosistemas. net/articulo. asp?Id=457.

Álvarez V. 2008. Caracterización química y evaluación de la actividad inhibitoria de aceite esencial de un quimiotipo de Lippia Origanoides H.B.K sobre el desarrollo micelial y la formación de esclerocios de Sclerotium cepivorum BERK. Trabajo de grado Ingeniería Agronómica, Universidad Nacional De Colombia - Sede Palmira.

Antolinez-Delgado C. A, N. Rodríguez-López. 2008. PLASTICIDAD FENOTÍPICA EN Lippia alba Y Lippia origanoides (VERBENACEAE): RESPUESTA A LA DISPONIBILIDAD DE NITRÓGENO. Acta biol. Colomb., Vol. 13 No. 1, 2008 53 – 64.

Antolinez-Delgado C A, N Rodríguez-López. 2008. Plasticidad fenotípica en Lippia alba y Lippia origanoides (Verbenaceae): respuesta a la disponibilidad de nitrógeno. Acta biol. Colomb., Vol. 13 No. 1, 2008 53 – 64.

ArangoA Altieri-Caro S. 2004. EthnobotanA Altieriical studies in the Central Andes (Colombia): Knowledge distribution of plants use

according to informant´s characteristics. Lyona. Vol 7(2). Arcos, A. L.; Mondragón, A. J.; Muñoz, J. E., Botero, S. 2004. Colecta y caracterización

molecular con marcadores tipo RAM (Microsatélites aleatorios) de heliconias y especies relacionadas, p 346-347. En: Congreso Colombiano de Botánica: Botánica, Diversidad y Cultura, 2, Popayán, Noviembre. Memorias.

Assogbadjo A. E, T. Kyndt, B. Sinsin, G. Gheysen, Van Damme P. 2006. Patterns of Genetic and Morphometric Diversity in Baobab (Adansonia digitata) Populations across Different Climatic Zones of Benin (West Africa) Annals of Botany 2006 97(5):819-830.

B Baldizán A, C Domínguez, DE García, E. Chacón, L Aguilar. Metabolitos secundarios y

patrón de selección de dietas en el bosque deciduo tropical de los llanos centrales venezolanos. Rev Zoot Trop, Vol 24, No 3, 2006, pp 213-232.

Beebe S, J Rengifo, E Gaitán, M C Duque, J Tohme. J. 2001. Diversity and Origin of Andean Landraces of Common Bean Crop Sci. 41:854-862.

Berier D E, J C Thomas, S R King s.f. Haman Pharmaceuticals: Integrating Indigenous Knowledge, Tropical Medicinal Plants, Medicine, Modern Science and Reciprocity into a Novel Drug Discovery Approach. Shaman Pharmaceuticals, Inc. 213 East Grand Ave. South San Francisco, CA 94080. En: http://www.nestsci.org/ Science/Special/ feature11.html.

Blanco KM, A.J. Agudelo, J.R. Martínez, E. E. Stashenko, Estudio comparativo de los aceites esenciales de Lippia alba Mill N.E. Brown cultivada con tres tipos de compostaje, Scientia et Technica, 2007, año XIII, 33, 231-233.

http://www/

http://www.nestsci.org/%20Science/Special/

http://www.nestsci.org/%20Science/Special/


Bonilla M. L.; Espinosa K.; Posso A. M.; Vásquez, H.; Muñoz, J. E. 2008. Caracterización molecular de 43 accesiones de uchuva de seis departamentos de Colombia. Acta Agron (Palmira) 57(2): 109-115.

Boschker H T S, J J Middelberg. 2002. Stable isotopes and biomarkers in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology 40 (2002) 85-95.

Bozo L, M Fernández, M López, R Reyes y P Suárez. 2007. Biomarcadores de contaminación química en comunidades microbianas. Interciencia Jan 2007, vol. 32 nº 1.

Bueno J.G, E. Stashenko, Antimycobacterial natural products an opportunity for the Colombia biodiversity, Revista Española de Quimioterapia, 2009, Sometido.

Bueno J.G., J.R. Martínez, E. Stashenko, W. Ribón, Anti-tubercular activity of some aromatic and medicinal plants, grown in Colombia, Biomédica, 2009, 29 (1), 51-60.

C Camargo A.A., N. Rodríguez López. Expresión fenotípica de la asignación de biomasa en

Lippia origanoides y Lippia alba: Repuestas a la disponibilidad de agua en el suelo, Acta Biológica Colombiana, 2008, 13 (3), 133-148.

Caetano C M, D Y Cañar, E Muñoz (Eds). 2011. 10 AÑOS DE LA MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS, LÍNEA DE INVESTIGACIÓN EN RECURSOS FITOGENÉTICOS NEOTROPICALES. CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO DE LA BIOLOGIA FLORAL Y REPRODUCCIÓN SEXUAL DE “PRONTO ALIVIO”, Lippia alba (Mill). N. E. Browne ex Britton & Wilson. Verbenaceae. ISBN “Coordinadores editoriales. MEMORIAS. En: (En: http://www.bdigital.unal.edu. co/ 4959/ 1/ memoria10a%C3%B1os UNmaestriarfnpalmira.2011.pdf.)

Camacho A M, D A Andrade, S M Ledesma. 2010. Evaluación del efecto antifúngico del empleo de aceite esencial y extractos de Lippia alba en sus quimiotipos (Valle, Costa Rica, Cítrica) y Tomillo (Thymus vulgaris) sobre Stromatinia cepivora (Berk) Wetzel en condiciones del Valle del Cauca Colombia. Trabajo de grado Ingeniería Agroindustrial, Universidad Nacional De Colombia - Sede Palmira.

Cardona J. 2008. Evaluación de la actividad antifúngica de extractos orgánicos de Lippia alba y Lippia dulcis Colombia. Trabajo de grado Ingeniería Agronómica, Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.

Cardona J. 2009. Evaluación in vitro de la actividad inhibitoria Stromatinia cepivorum Berk de extractos orgánicos de Lippia alba, Lippia origanoides y Phyla dulcis. Ingeniería Agronómica, Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.

Castro, D.M.; Ming, L.C.; Marques, M.O.M. (2002). Biomass production and chemical composition of Lippia alba (Mill.) N. E. Brown Britt & Wilson in leaves on different plant parts in different seasons. Acta Hort. (ISHS) 569, 111-115.

Celis CN, P. Escobar, J.H. Isaza Martínez, E. Stashenko, J.R. Martínez, Estudio comparativo de la composición química y la actividad biológica de los aceites esenciales de Lippia alba, Lippia origanoides y Phyla dulcis, especies de la familia Verbenaceae, Scientia et Technica, 2007, año XIII, 33,103-105.

Cicció J F, R A Ocampo. 2006. Variación anual de la composición química del aceite esencial de Lippia alba (Verbenaceae). Lankesteriana 6(3). P149-152 (2006).

Combrinck S, G. W Du Plooy, R. I. McCrindle, B. M. Botha. 2007. Morphology and

Histochemistry of the Glandular Trichomes of Lippia scaberrima (Verbenaceae). Ann Bot (Lond). 2007 Apr 27; 17468110 (P,S,E,B,D).

http://lib.bioinfo.pl/auth:Combrinck,S

http://lib.bioinfo.pl/auth:Du%20Plooy,GW

http://lib.bioinfo.pl/auth:McCrindle,RI

http://lib.bioinfo.pl/auth:Botha,BM

http://lib.bioinfo.pl/pmid:17468110


Bibliografía 131

Culley T.M., Wolfe A.D. 2001. Population genetic structure of the cleistogamous plant

species Viola pubescens Aiton (Violaceae), as indicated by Allozyme and ISSR molecular markers. Heredity 86:545-556.

D Das T, A.K. Das. 2005. Inventorying plant biodiversity in hmegardens: a case study in

Barack Valley, ssam, North East India. Current Science 89, 1, 155-163. del Rio, AH, and JB Bamberg. 2006. Genetic equivalence of putative duplicate

germplasm collections held at CIP and US potato genebanks. Am J. Potato Res 83:279-285.

Dias-Brandão A, L F Viccini, S M Recco-Pimentel. 2005. Meiotic analysis of two putative polyploid species of Verbenaceae from Brazil. Caryologia 58, 315-9. Contact: Recco-Pimentel, Shirlei Maria; Univ Estadual Campinas, UNICAMP, Inst Biol, Dept Biol Celular, CP 6109, BR-13083863 Campinas, SP, Brazil.

Dias-Brandão A, L F Viccini, F R. Gonçalves-Salimena, A L Laforga-Vanzela and S M Recco-Pimentel. 2007. Cytogenetic characterization of Lippia alba and Lantana camara (Verbenaceae) from Brazil. Journal of Plant Research. Volume 120, Number 2 / marzo de 2007.

Doran J W y Parkin B T 1994. Defining Soil Quality for a Sustainable Environment. Soil Science Society of America, Inc. Special Publication. Number 35. Madison, Wisconsin, USA.

Dray S. 2011. A New Perspective about Moran’s Coefficient: Spatial Autocorrelations as a Linear Regression Problem. Geographical Analysis. Vol. 43, Issue 2, Pages 127-141.April 2011.

Duque-Villegas A. 1985. ENCUESTA NACIONAL DE PLANTAS MEDICINALES Y AROMÁTICAS UNA APROXIMACIÓN AL MERCADO DE LAS PMyA EN COLOMBIA 1. Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt.

Duran D C, L A Monsalve, J R Martínez, E E Stashenko. 2007. ESTUDIO COMPARATIVO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE ACEITES ESENCIALES DE Lippia alba PROVENIENTES DE DIFERENTES REGIONES DE COLOMBIA, Y EFECTO DEL TIEMPO DE DESTILACIÓN SOBRE LA COMPOSICIÓN DEL ACEITE. Scientia et Technica Año XIII, No 33, Mayo de 2007. UTP. ISSN 0122-1701 435.

E El-Mouei R, W Choumane, F Dway, 2011. Molecular characterization and genetic

diversity in genus Citrus in Syria. Int. J. Agric. Biol., 13: 351–356 Erazo L A. 2010. Evaluación in vivo de la actividad inhibitoria sobre Sclerotium

cepivorum, por medio del aceite esencial de Lippia origanoides, en el cultivo de la cebolla (Alium cepa L) Trabajo de grado Ingeniería Agronómica, Universidad Nacional De Colombia - Sede Palmira.

Ernst W H O, P J Peterson. 1994. The role of biomarkers in environmental assessment .4. terrestrial plants. Ecotoxicology 3, 180-192.

Ernst W H O. 1999. Biomarkers in plants. In: Peakall, D.B., Walker, C.H., Migula, P. (eds.), Biomarkers: A Pragmatic Basis for Remediation of Severe Pollution in Eastern Europe. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 135-151.

Escobar P; S M Leal, LV Herrera; J R Martínez; E Stashenko. Chemical composition and antiprotozoal activities of Colombian Lippia spp essential oils and their major components. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2010, 105, 184-190.

http://www.springerlink.com/content/108924/?p=fd567cfaa5b9480d9920513e3ddac32a&pi=0

http://www.springerlink.com/content/t618211q8356/?p=fd567cfaa5b9480d9920513e3ddac32a&pi=0

http://www.springerlink.com/content/t618211q8356/?p=fd567cfaa5b9480d9920513e3ddac32a&pi=0


Espinosa G. 2009. Diseño y aplicación de una metodología de evaluación de riesgo ecológico para fauna terrestre. Investigación ambiental. Ciencia y política pública. Toxicología Ambiental, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. En: http://www.revista. ne.gob.mx/thesis/view/1.

F Figueiredo A C, J G Barroso, L G Pedro, J J C Scheffer. 2008. Factors affecting

secondary metabolite production in plants: volatile components and essential oils. Flavour and Fragrance Journal, Volume 23 Issue 4, Pages 213–226.

Fischer U, R Lopez, E Poell, S Vetter, J Novak, C M Franz. 2004. Two chemotypes within Lippia alba populations in Guatemala. Flavour and Fragrance Journal 19, 333-5. Contact: Novak, Johannes; Inst Appl Bot, Univ Vet Med, Vet Pl 1, A-1210, Vienna, Austria.

Franco J, J Crossa, S Taba, H A Shands. A sampling strategy for conserving genetic diversity when forming core subsets. Crop Science, v.45, p.1035-1044, 2005.

G García DE. Evaluación de los principales factores que influyen en la composición

fitoquímica de Morus alba (Linn.). Tesis de Maestría, Estación experimental de Pastos y Forrajes “Indio Hatuey”, Cuba. 97 pp.

García DE, MG Medina, C Dominguez, A Baldizán, J Humbría, L. Cova. Evaluación química de especies de leguminosas con potencial forrajero en el Estado de Tujillo, Venezuea. Rev Zoot Trop, 24 (4): 401-415. 2006.

Godínez D, G Volpato, 2008. Plantas medicinales que se venden en el mercado El Rio, Camaguey, Cuba. Rev Mex de Biodiverv 79: 243-259.

González J., Cruz-Angón A., Flores-Palacios A., Vovides A.P. 2004. Diversity and genetic Structure of the Mexican Endemic Epiphyte Tillandsia achyrostachis E. Morr. Ex Backer var. achyrostachis (Bromeliaceae). Annals of Botany 94:545-551.

Grassi F., Cazzaniga E., Minuto L., Peccenini S., Barberis G., Basso B. 2005. Evaluation of biodiversity and conservation strategies in Pancrayum maritimum L. for the Northern Tyrrhenian Sea. Springer Netherlands. Vol 14 Number 9: 2159-2169.

Guerrero A. 2010. Evaluación de los extractos de aceites esenciales de Lippia origanoides, en el control de hongos fitopatógenos en el cultivo de Ají Cayena (Capsicum frutescens)en campo. Trabajo de grado Ingeniería Agronómica, Universidad Nacional de Colombia – Sede Palmira.

Gupta S K, S P S Khanuja, S Kumar. 2001. In vitro micropropagation of Lippia alba. Current Science, Vol. 81, No. 2, 25 jul. 2001.

H Hennebelle T, S Sahpaz, C Dermont, J H Bailleul. 2006. The essential oil of Lippia alba:

analysis of samples from French overseas departments and review of previous works. Chem Biodivers.2006 Oct; 3(10):1116-25.

Hennebelle T, S Sahpaz, B Gressier, H Joseph, F Bailleul. 2007. Antioxidant and neurosedative properties of polyphenols and iridoids from Lippia alba. Phytother Res. 2007 Aug 17.

Hennebelle T, S Sahpaz, H Joseph, F Bailleul. 2008. Ethnopharmacology of Lippia alba. France. J. Ethnopharmacology, 2008 Mar 5; 116(2): 211-222.

Hernández C. 1990. La selva en Colombia. En Selva y Futuro, Eds. C. Hernández, J. Carrizosa. Sello Editorial, Bogotá. pp. 13-40.

http://www3.interscience.wiley.com/journal/4029/home

http://www3.interscience.wiley.com/journal/120081447/issue

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sahpaz%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dermont%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Joseph%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bailleul%20F%22%5BAuthor%5D

http://lib.bioinfo.pl/auth:Sahpaz,S

http://lib.bioinfo.pl/auth:Gressier,B

http://lib.bioinfo.pl/auth:Joseph,H

http://lib.bioinfo.pl/auth:Bailleul,F



Bibliografía 133

Hernández C, G Hurtado, Q Ortiz, C Walscbulger, 1992. Unidades biogeográficas de Colombia. En Diversidad biológica de Iberoamérica, Compilado por. G. Halffter. Mexico. pp.

Hernández-V H, C Bonilla-C, M. Sánchez-O. Efecto de la fertilización nitrogenada en la producción de biomasa y calidad de aceite esencial en Lippia alba (Miller), Pronto alivio. S.f.

Herrera A M, C E Carranza, M I Chacón-Sánchez. 2013. Establishment of propagation methods for growing promising aromatic plant species of the Lippia (Verbenaceae) and Tagetes (Asteraceae) genera in Colombia. Agron. colomb. vol.31 no.1 Bogotá ene./abr. 2013.

Huh M.K., Lee H.Y., Huh H.W. 1999. Genetic diversity and population structure of Gleditsia japonica var. koraiensis in Korea. Bot. Bull. Acad. Sin. (1999) 40:159-164.

Hyne RV, W A Maher. 2003. Invertebrate biomarkers: links to toxicosis that predict population decline. Ecotoxicology and Environmental Safety, 54, 306-374.

I IAVH (Instituto Alexander von Humboldt). 1998. Bosque seco Tropical (Bs-T) en

Colombia. Programa de Inventario de la biodiversidad Grupo de Exploraciones y Monitoreo Ambiental GEMA. IAVH 1998.

IAVH. 2004. Informe anual 2003. Proyecto Conservación y Uso Sostenible de la Biodiversidad de los Andes Colombianos Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt. 107 p.

Igic B, L Bohs, J R Kohn. 2006. Ancient polymorphism reveals unidirectional breeding system shifts. PNAS january 31, 2006. Vol. 103 no. 5 1359-1363.

J Jaramillo M A, P S Manos. 2001. Phylogeny and patterns of floral diversity in the genus

Piper (Piperaceae). American Journal of Botany 88(4): 706–716. Jaramillo B E, E Stashenko, J R Martínez. 2010.Composición química volátil de Satureja

brownei (Sw.) Briq. Revista Cubana de Plantas Medicinales 15(1) 52-63. Jarvis A, M J Paternina Quijano, A Arcos, H J Rodríguez, C Nagles, N Melo. 2006.

Evaluación Rápida de la Adaptación al Medioambiente de plantas promisorias medicinales. En: II Segundo Congreso Internacional de Plantas Medicinales y Aromáticas Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira. Octubre 19, 20 y 21 de 2006.

Juliani, H.R. (Jr.), A.R. Koroch, H.R. Juliani, V.S.Trippi and J.A. Zygadlo. 2002 Intraspecific variation in leaf oils of Lippia junelliana (Mold.) Tronc. Biochemical Systematics and Ecology 30: 163 –170.

K Kang M., Jiang M., Huang H. 2005. Genetic Diversity in Fragmented Populations of

Berchemelia wilsonii var. pubipetiolata (Rhamnaceae) Annals of Botany 95:1145-1151. doi: 10.1093/aob/mci125, available online at www.aob.oupjournals.org.

Kosakivska V. 2008. Biomarkers of plants with different types of ecological strategies. General and Applied Plant Physiology. Vol XXIV, Special Issue, No. 1-2, 2008.

Kosman E, K. J. Leonard. 2005. Similarity coefficients for molecular markers in studies of genetic relationships between individuals for haploid, diploid, and polyploid species. Molecular Ecology (2005) 14, 415– 424

Kurian S, Y Grigoryev, S Head, D Campbell, T Mondala and D R. Salomon, 2007. Applying genomics to organ transplantation medicine in both discovery and

http://www.aob.oupjournals.org/


validation of biomarkers. Published in final edited form as: Int Immunopharmacol. 2007 December 20; 7(14): 1948–1960.

L Larson S.R., Jones T.A., Jensen K.B. 2004. Population structure in Pseudoroegneria

spicata (Poaceae: Triticeae) modeled by Bayesian clustering of AFLP genotype. America Journal of Botany. 2004; 91:1789-1801.

Linares J. 2007. Lippia alba(P. Mill.) N.E. Br. ex Britt. & Wilson. http://www.siac.net.Co/sib/catalogoespecies/especie.do?idBuscar=89&method=displayAAT.

M Manica-Cattani M F, J Zacaria, G Pauletti, L Atti-Serafini, S Echeverrigaray. 2009.

Genetic variation among South Brazilian accesions of Lippia alba Mill. (Verbenaceae) detected by ISSR and RAPD markers. Braz. J. Biol., 69(3): 375-380. 2009.

Mariot A., Di Stasi L.C., dos Reis M.S. 2002. Genetic Diversity in Natural Populations of Piper cernuum. The Journal of Heredity: 93(5).

Marmolejo D F, R Mejía, I Hurtado, A M Posso, J E Muñoz. 2008. Caracterización molecular de 15 aislamientos de Beauveria bassiana asociaos con Cosmopolites y Metamasius en plátano y banano en tres regiones de Colombia. Acta Agron. Vol. 57 no.3.199-204.

Martínez F. 2008. “Diversidad y relaciones genéticas de plantas promisorias de jardín del género Lippia en el Departamento de Santander, Colombia”. GIEFIVET-UIS. Producción científica. Proyectos de investigación finalizados. En: http://cenivam. uis.edu.co /cenivam/productos/proinvesfinalizados.html

Martínez-Núñez F O, G A Castillo Villamizar, M.I. Chacón S.2008. Genetic diversity within and among wild and garden aromatic species 6 of the genera Lippia, Aloysia and Phyla in several locations in northeastern Colombia, Plant Systematics and Evolution.

Marx H E, N O’Leary, Y-W Yuan, P W-Irwing, D C Tak, M E Múlgura, R G Olmstead. 2010. A molecular phylogeny and classification of verbenaceae. American Journal of Botany 97(10): 1647-1663.

Medina-López LA, JJ Araya-Barrantes, G Tamayo-Castillo, RM Romero. Comparación de metodologías de extracción para limoneno y carvona en Lippia alba usando cromatografía de gases. Ciencia y Tecnología, 27(1y 2): 1-13,2011. ISSN: 0378-0524.

Meneses R, R. Ocazionez, J.R. Martínez, E. Stashenko, Inhibitory effect of essential oils obtained from plants grown in Colombia on yellow fever virus replication in vitro. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 2009, 8 (8), http://www.ann-clinmicrob.com/content/8/1/8.

Mesa Arango AC, J. Montiel Ramos, B. Zapata, D.C. Durán García, L. Betancur Galvis, E. Stashenko, Citral and carvone chemotypes from the essential oils of Colombian Lippia alba (Mill.) N.E. Brown: composition, cytotoxicity and antifungal activity, Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 2009, 104 (6), 878-884.

Mohammadi S. A, B. M. Prasanna. 2003. Analysis of Genetic Diversity in Crop Plants—Salient Statistical Tools and Considerations. Crop Sci. 43:1235-1248.

Montanari R.M, L. A. Sousa, M.N. Leite, A.D.F. Coelho, L.F. Viccini, M.B. Stefanini. 2004. Phenotypical plasticity of the external morphology in Lippia alba (Mill.) N. E. Br. ex Britt & Wilson in response to level of luminosity and fertilization. Revista Brasileira de Plantas Medicinais 6, 96-101.

http://www.siac/

http://www.ann-clinmicrob.com/content/8/1/8

http://www.ann-clinmicrob.com/content/8/1/8

Bibliografía 135

Montiel J, A.C. Mesa Arango, D.C. Durán García, J.G. Bueno, L.A. Betancur Galvis, E. Stashenko, Evaluación de la actividad anti-candida y anti-aspergillus de aceites esenciales de Lippia alba (Miller) N.E Brown y su asociación con sus componentes mayoritarios Scientia et Technica, 2007, año XIII, 33, 243-246.

Morataya-Morales MA. Caracterización farmacopéica de cuatro plantas nativas de Guatemala Albahaca (Ocimum micranton), Orégano (Lippia graveolens), Salvia sija (Lippia alba) y Salviyá (Lippia chiapaensis). Tesis para optar al título de Química Farmaceútica. Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. 2006.

Muñoz A M, C.M Caetano, F A Vallejo, M S Sánchez. 2006. Comportamento meiótico y descripción morfológica Del pólen de prontoalivio. Acta Agron (Colombia) Vol. 55(2).

Muñoz A M, F A Vallejo, M Sanchez. 2007. Morfología y anatomia de lãs flores y semillas de pronto alivio. Acta Agron. (Colombia) Vol. 56(1) 2007, p7-11.

Muñoz J E. 2008. Microsatélites amplificados al azar (RAM) en estudios de diversidad genética vegetal. Acta Agron. Vol. 57, No. 4 (2008).

Mur-Lacambra J. 1992. Contrastes de autocorrelación espacial. Un estudio de Monte Carlo ESTADISTICA ESPAÑOLA. Vol. 34, Núm. 130, 1992, págs. 285 a 307.

Murillo O, R Salazar. 2000. Relation between the degree of heterozygosity and seed characteristics of Alnus acuminata. II Simposio sobre avances en la producción de semillas forestales en América Latina. Memorias Santo Domingo DO. p. 105-108. Turrialba Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE) CR. 2000.

N Núñez María B., Sánchez Edit G., Bela Alberto, Aguado María I.. DETERMINACIÓN DE

METABOLITOS SECUNDARIOS EN LIPPIA ALBA (MILL.) Y LIPPIA TURBINATA (GRISEB.) Universidad Nacional del Nordeste. Secretaria General de Ciencia y Tecnología. Comunicaciones Científicas y Técnicas. 2008.

O Ocazionez R E; Rocio Meneses; Flor Ángela Torres; Elena Stashenko. Virucidal activity

of Colombian Lippia essential oils on dengue virus replication in vitro. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2010, 105, 304-309.

Oliveira D R, G G Leitão, S S Santos, H R Bizzo, D L Celuta, S. Alviano, D S Alviano, S G Leitão. 2006. Ethnopharmacological study of two Lippia species from Oriximiná, Brazil. Journal of Ethnopharmacology Volume 108, Issue 1, 3 November 2006, Pages 103-108.

Ortiz–D J., Martínez-M C., Correal E., Simón B., Cenis J.L. 2005. Genetic Structure of Atriplex halimus Populations in the Mediterranean Basin. Annals of Botany 95:827-834.doi: 10.1093/aob/mci086, available online at www.aob.oupjournals.org.

P Palacio K, N. Rodríguez López, Plasticidad fenotípica de dos poblaciones de Lippia alba

(Verbenaceae) sometidas a déficit hídrico bajo dos condiciones lumínicas, Acta Biológica Colombiana, 2008, 13 (1), 187-198.

Pascual A N T, K M S Uzuki, F S Almeida, MK Leda, S Odré, S Silva. 2006. Evaluation of the RAPD profiles from different body parts of Euglossa pleosticta Dressler male bees (Hymenoptera: Apidae, Euglossina) Neotrop Entomol (on line). 2006. Vol. 35, no. 6, pp.811-817. ISSN 1519-566X.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/03788741

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235084%232006%23998919998%23634971%23FLA%23&_cdi=5084&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=cb07b9e30d0f43845e4be68f9cbe27df



Peakal R, P E Smouse. GenAlEx6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update. BIOINFORMATICS APPLICATION NOTE. Vol 28 no. 19 2012, pages 2537-2539. doi:10.1093/bioinformatics/bts460.

Pereira Peixoto P. H, F R Gonçalves-Salimena, M de Oliveira Santos, L Da Silva Garcia, P. M de Oliveira Pierre, L. F. Viccini, W. Campos Otoni. 2006. IN VITRO PROPAGATION OF ENDANGERED LIPPIA FILIFOLIA MART. AND SCHAUER EX SCHAUER. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 42(6):558-561. 2006.

Pérez E, P Garrido, M Laca. 2008. Indicadores microbiológicos como marcadores de la contaminación y recuperación de suelos contaminados con queroseno. Ecosistemas 17(3):133-138.

Piedrahita A M, A Posso, J E Muñoz, L A Álvarez, 2008. Variabilidad genética de Hartón del Valle mediante RAM. Act Agron Vol 57 no. 1, pp71-76.

Pierre P M O, S M Sousa, L C Davide, M A Machado, L F Viccini. 2011. Karotype analysis, DNA content and molecular screening in Lippia alba (Verbenaceae). An Acad Bras Cienc 83: 993–1005.

Pineda-Tenor D, R Jiménez L, R Ramos-Corral, D Lamuño-Sánchez, J A Recio-Montealegre, F J García García, R M Gómez-Serranillos. 2011. Variabilidad Biológica-VB y de Valores de Referencia de Cambio-VRC para una Población Geriátrica en Pruebas Frecuentes del Laboratorio Clínico y Hematológico. Sociedad Española de Dirección y Gestión de los Laboratorios Clínicos. XV Reunión. Toledo 30-31 de marzo de 2011. Resumen-10.

Pino-Benítez N, H. Valois. 2004. Consevation of Biological and cultural Biodiversity in the Andes and the Amazon basin-Ethnobotany, resource use and Zoology. Lyona, Volume 7(2) pages 61-69.

Q R Ramalho R. 2006. Genetic diversity based on AFLP molecular markers and indicator for

the establishment of core collection for pumpkin (Cucurbita moscata) for north-esta Brasil. PhD Thesis Universidad Estadual de Norte Fluminenexe (UENF) Campus dos Goytecazes, RJ, Brasil.

Riccardi G A L, A I A Riccardi, A L Bandoni. Fitoquímica de Verbenaceae (Lippias y Aloysias) del Nordeste argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Comunicaciones Científicas y Técnicas. 2000.

S Sanabria H L, M A García, J E Muñóz, H A Díaz. 2006. Caracterización molecular con

marcadores RAM de árboles nativos de Psidium guajava (guayaba) en el Valle del Cauca. Tesis de Maestría en Ciencias, Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira.

Santos FR, Lima PF, Priolli RH, Siqueira WJ, Colombo CA. Isolation and characteristics of eight novel polymorphic microsatellite loci in Lippia alba (Verbenaceae). Am J Bot. 2012 Aug; 99(8):e301-3. doi: 10.3732/ajb.1100578. Epub 2012 Jul 26.

Schroeder M A, A E López, G C Martínez. 2004. Resultados preliminares del análisis foliar de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, Pluchea sagittalis (Lamb.) Cab., Petiveria alliaceae L. y Ocimum salloi Benth. Universidad Nacional del Nordeste. Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004. Resumen: A-035.

Seaforth, C. and T. Tikasingh. 2008. A study for the development of a handbook of selected Caribbean herbs for industry. Technical Centre for Agriculture and Rural

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22837413

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22837413

Bibliografía 137

Cooperation (CTA); Inter- American Institute for Cooperation on Agriculture (II CA). Wageningen, The Netherlands; St. Augustine, Trinidad.

Selkoe K A, R J Toonen. 2006. Microsatellite for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters, (2006) 9: 615-629.

Sheng Y, Zheng W, Pei K, MA K. 2005. Genetic Variation Within and Among Populations of a Dominant Desert Tree Haloxylon ammodendron (Amaranthaceae) in China. Annals of Botany. 96:245-252.

Shugart L R, J F McCarthy, R S. Halbrook. 2006. Biological Markers of environmental and ecological Contamination: An Overview. Risk Analysis. Volume 12 Issue 3, Pages 353-360.

Silva P D, T C Bastos, L S Azevedo, A T Amaral, A B Passos, R Rodrigues, F Matta. 2010. Quantification of the diversity among common bean accessions using Ward-MLM strategy. Pesq. Agropec.bras. Brasilia vol 45 no. 10 p 1124-1132.

Singh G, S K Pardey, P A Leclecq, J Sperkova. 1999. Estudies on Essential Oils. Part 15. GS/MS Analysis of Chemical Constitutiens of leaf oil of Lippia alba (Mill.) from North India. Journal of Essential Oil Research. Vol. 11, issue 2, 1999.

Sousa S M P, S Silva, G A Torres, L F Viccini. 2009. Chromosome banding and essential oils composition of Brazilian accessions of Lippia alba (Verbenaceae). BIOLOGIA Volume 64, Number 4, 711-715.

Sousa S M, G A Torres, L F Viccini. 2012. Kariological studies in Brazilian species of Lippia L. (Verbenaceae). An Acad Bras Cienc (2002). Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004. Resumen: A-035.

Stashenko E E, B E Jaramillo, J R Martínez. 2003. Comparación de la composición química y de la actividad antioxidante in vitro de los metabolitos secundarios volátiles de plantas de la familia Verbenaceae. Rev. Acad. Colomb. Cienc. 27 (105): 579-597, 2003.

Stashenko E E, B E Jaramillo, J. R. Martínez. 2004. Comparison of different extraction methods for the analysis of volatile secondary metabolites of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, grown in Colombia, and evaluation of its in vitro antioxidant activity, J. Chromatogram. A, 1025, 93-103 (2004).

Suárez A R, F O Martínez, G A Castillo, M I Chacón. 2007. Molecular Characterization of Aromatic Species of the Genus Lippia from the Colombian Neotropics. Proceedings of the International Symposium on Medicinal Nutraceutical Plants. Ed. A.K. Yadak. Acta Hort. 756, ISHS 2007.

Suárez González A R, F O Martínez-Núñez, G A Castillo-Villamizar, M I Chacón. 2007. Molecular characterization of aromatic species of the genus Lippia from the Colombian Neotropics, Acta Horticulturae (ISHS), 756, 129-138.

Suárez-González A R, G A Castillo-Villamizar, M I Chacón. 2008. Genetic diversity and spatial genetic structure within a population of an aromatic shrub, Lippia origanoides (Verbenaceae), in the Chicamocha Canyon, northeastern Colombia, Genetics Research, 90 (6), 455-465.

Sawada, M. 1999. ROOKCASE: An Excel 97/2000 Visual Basic (VB) Add-in for Exploring Global and Local Spatial Autocorrelation. Bulletin of the Ecological Society of America, 80(4):231-234.

T Tarpley L, A.L. Duran, T.H. Kebron, W. Summer. 2005. Biomarkers metabolites capturing

the metabolite variance present in a rice plant developmental period. BMC Plant Biol. 2005; 5:8.


Tavares E S, L S Juliao, D Lopez, H R Bizzo, C L S Lage, S G Leiao. 2005. Análise do óleo escencial de folhas de três quimiotipos de Lippia alba (Mill.) N.E. Br. (Verbenaceae) cultivados em condições semelhantes. Revista Brasilera de Farmacognosia 15(1):1-5,Jan./Mar. 2005.

Tero N., Aspi J., Siikamäki P., Jäkäläniemi A. 2005. Local genetic population structure in an endangered plant species, Silene tatarica (Caryophyllaceae). Heredity 94, 478-487.

Thoppil J E. 2000. Essential oil analysis of Eusterialis deccanensis Panigrahi (Lamiaceae). Boll Chim Farm Jul-Aug; 139(4): 194-5.

Trujillo L. 2004. Useful plants in indigenous Bribri and Cábecar farms, Talamanca, Costa Rica. Thesis Mag. Sci., CATIE, Turrialba, Costa Rica. 85 p.

U UNCTAD. 2005. Market Brief in the European Union for selected natural ingredients

derived from native species, Lippia alba (Prontoalivio, Erva cidreira, juanilama, Melissa). This publication was developed in the context of the UNCTAD / BioTrade Facilitation. Programme, funded by the Governments of the Netherlands and Switzerland.

V Vasseur P, C Cossu-Leguille. 2003. Biomarkers and community indices as

complementary tools for environmental safety. Environmental International 28, 711-717.

Vega N E, M I Chacón. 2011. Isolation of high-quality DNA in 16 aromatic and medicinal Colombian species using silica-based extraction columns. Agron. colom. 29(3), 349-357. 2011.

Vega N E. 2011. Estructura Poblacional de Lippia origanoides H.B.K. en el Cañón del Rio Chicamocha (Boyacá & Santander, COL). Universidad Nacional de Colombia Facultad de Agronomía Bogotá, Colombia. 2011. Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias Agrarias.

Vega N.E. and M.I. Chacón-Sánchez. 2012. Genetic structure along an altitudinal gradient in Lippia origanoides, a promising aromatic plant species restricted to semiarid areas in northern South America. Ecol. Evol. 2(11), 2669-2681.

Vega N E; W A Delgado and M I Chacón. 2013. Genetic structure and essential oil diversity of the aromatic shrub Lippia origanoides Kunth (Verbenaceae) in two populations from northern Colombia. Agron. colomb. [online]. 2013, vol.31, n.1, pp. 5-17. ISSN 0120-9965.

Vera J R, P F Pastrana, K Fernández, A Viña. 2007. Actividad antimicrobiana in vitro de volátiles y no volátiles de Lippia alba y extractos organicos acuosos de Justicia pectoralis cultivados en diferentes pisos t{ermicos del departamento del Tolima. Sciencia et Technica. Año XIII, no. 33, mayo 2007.

Vera P A, J A Olivera, B E Jaramillo, E Stashenko. 2010. Efecto protector Del aceite esencial de Lippia Alba (Mil.) N.E. Brown sobre toxicidad Del mercuriocromo em raices de Allium cepa L. Revista Cubana de Plantas Medicinales 15(1) 27-37.

Verma A, N. Kumar, SA Ranade. 2004. Genetic diversity amongst landraces of a dioecious vegetatively propagated plant, Betelvine (Piper betle L.). J. Biosci. 2004 Sep; 29(3):319-28.

Vit P, Silva, B, Meléndez, P. 2002. Lippia alba N.E.Br. Ficha botánica de interés apícola en Venezuela, No. 2 Cidrón. REVISTA DE LA FACULTAD DE FARMACIA Vol. 43, 2002.

Bibliografía 139

Vera P A, J A Olivera, B E Jaramillo, E Stashenko. 2010. Efecto protector Del aceite esencial de Lippia Alba (Mil.) N.E. Brown sobre toxicidad del mercuriocromo em raices de Allium cepa L. Revista Cubana de Plantas Medicinales 15(1) 27-37.

Verma A, N. Kumar, SA Ranade. 2004. Genetic diversity amongst landraces of a dioecious vegetatively propagated plant, Betelvine (Piper betle L.). J. Biosci. 2004 Sep; 29(3):319-28.

Vestergaard O, O Hoegh-Guldberg, U Unluata. 2003. UNDERSTANDING CORAL BLEACHING ACROSS FOUR OCEANS-addressing CBD’s Specific Workplan on Coral Bleaching. Convention of Biological Diversity (CBD), SBSTTA 8, 10-14 March 2003, Montreal, Extended Abstract.

Viccini L. F, D. C. Souza da Costa, M. A. Machado and A. L. Campos. 2004. Genetic diversity among nine species of Lippia (Verbenaceae) based on RAPD Markers. Plant Systematics and Evolution. Volume 246, Numbers 1-2 / abril de 2004.

Viccini L F, P M O Pierre, M M Praça, D C Souza da Costa, E da Costa Romanel, S M de Sousa, P H Peixoto, P. Salimena, F R Gonçalves, F R Gonçalves Salimena. 2006. Chromosome numbers in the genus Lippia (Verbenaceae). Revista: Plant Systematics and Evolution, 2006; 256 (1-4) Página(s):171-178 ISSN:03782697.

Vieira R F, L A Skolupa. 1993. Brazilian medicinal plants genebank. Acta Hort. 330:51-58. Vieira R F. 1999. Conservation of Medicinal and Aromatic Plants in Brazil. J. Janick (ed.),

ASHS Pess, Alexandria, VA. Vilalta y Perdomo C.J. 2004. Sobre Cómo Enseñar Autocorrelación Espacial. Tecnológico

de Monterrey, Campus Ciudad de México. Tecnológico de Monterrey, Campus Ciudad de México, y candidato a investigador nacional en el SNI desde 2004.

Vilches Blas, Alicia Roca, José Naranjo, Bernardo Navarro, David Bramwell y Juli Caujapé-Castells. Estructura espacial de la variación genética de Erysimum albescens (cruciferae) en gran Canaria: implicaciones para la conservación ex situ en bancos de germoplasma. Bot. Macaronésica 25: 15:30 (2004). ISSN 0211-715015.

Vit P, B Silva, P Meléndez. 2002. Lippia alba N.E.Br. Ficha botánica de interés apícola en Venezuela, No. 2 Cidrón. REVISTA DE LA FACULTAD DE FARMACIA Vol. 43, 2002.

W Wang D, J. Shi, S R. Carlson, P, B. Cregan, R W. Ward and B.W. Diers. 2003. A loew-

cost, High-Throughput Polyacrylamide Gel Electrophoresis System for Genotyping with Microsatellite DNA Markers. Crop Scie. 43:1828-1832 (2003).

Wezel A. 2003. Plant species diversity at homegardens in humed and semiarid Cuba and its importance for self-sufficiency of households. Deutscher Trompetag 2003. Gottingen, October 8-10, 2003.

Wolf P.G., Doche B., Giely L., Taborlet P. 2004. Genetic Structure of Rhododendron ferrugineum at a Wide Range of Spatial Scales. Journal of Heredity: 95(4):301-308.

X Xiao, L-Q, Xue-Jun Ge, Xun Gong1, Gang Hao, Si-Xiang Zheng. 2004. ISSR Variation in

the Endemic and Endangered Plant Cycas guizhouensis (Cycadaceae). Annals of Botany 94: 133±138.

Xie G-W., Wang D-L., Yuan Y-M., Ge X-J. 2005. Populations Genetic Structure of Monimopetalum chinese (Clesteceraceae) an Endangered Endemic Species of Eastern China. Annals of Botany 95:773-777. doi: 10.1093/aob/mci087, available online at www.aob.oupjournals.org

http://www.springerlink.com/content/104878/?p=5e78693b0dad490b975e02863bb4491d&pi=0

http://www.springerlink.com/content/5mbtfhexh47f/?p=5e78693b0dad490b975e02863bb4491d&pi=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/AA?a=Pierre%2c+P+M+O&donde=otras&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/AA?a=Pra%e7a%2c+M+M&donde=otras&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/AA?a=Costa%2c+D+C+Souza+da&donde=otras&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/AA?a=Romanel%2c+E+da+Costa&donde=otras&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/AA?a=Sousa%2c+S+M+de&donde=otras&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/AA?a=Peixoto%2c+P+H+Pereira&donde=otras&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/AA?a=Salimena%2c+F+R+Gon%e7alves&donde=otras&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/AA?a=Salimena%2c+F+R+Gon%e7alves&donde=otras&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/GetSumario?r=/W/10603/03782697_1.htm&zfr=0

http://europa.sim.ucm.es/compludoc/GetSumario?r=/W/10603/03782697_1.htm&zfr=0



Y Yamamoto P Y, C A Colombo, J A Azevedo Filho, A L Lourencao, M O Mayo Marques, G

D da Silva Morais, A F Chiorato, A L Melo Martins, W J Siqueira. 2008. Perfomance of ginger grass (Lippia alba) for traits related to the production of essential oil. Sci. Agric. (Piracicaba, Braz.), v.65, n.5, p.481-489, Sept./Oct. 2008.

Yuan, Y.-W., Chang Liu, Hannah E. Marx, Richard G. Olmstead. An empirical demonstration of using pentatricopeptide repeat (PPR) genes as plant phylogenetic tools: Phylogeny of Verbenaceae and the Verbena complex. Mol. Phylogenet. Evol. (2009), doi:10.1016/j.ympev.2009.08.029.

Zas-Arregui R, P Martíns Garbín y R de la Mata Pombo. 2008. AUTOCORRELACIÓN

ESPACIAL: UN PROBLEMA COMÚN...MENTE OLVIDADO. Cuad. Soc. Esp. Cienc. For. 24: 139-145 (2008).

Zhang X, F C Leung, D K O Chan, Y Wu. 2002. Comparative Analysis of Allozyme, Random Amplified Polymorphic DNA and Microsatellite Polymorphism on Chinese Native Chickens. Poultry Science 81: 1093-1098.

Zhang S, X Zhanga, 2009. Efect of two composted plant pesticide reissues, incorporated with Thrichoderma viride, on root-knot nematode in Balloon flower. Agr Sce in China. Vol 8 Issue 4, April 2009, pages 447-454.

Zoghbi G D, E H A Andrade, A S Santos, M H L Silva, J G S Maia. 1998. Essential oils of Lippia alba (Mill.) NE Br growing wild in the Brazilian Amazon. Flavour and Fragrance Journal 13:47-48.

Zucchi M I, J B Pinheiro, L J Chaves, A S G Coelho, M A Couto, L K Morais, R Venkosvsky. 2005. Estrutura genética e fluxo génico em populações naturais de cagaita. Pesq. Agropec. Bras vol 40 no 10.

Estructura genética y fitogeografía de poblaciones ... · La biodiversidad de especies de plantas...

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