Bol. San. Veg. Plagas, 34: 45-51, 2008

Estudio de la actividad biológica de 5 proteínas Cry de Bacillusthuringiensis en una población española de Spodoptera exigua(Hübner)

P. HERNÁNDEZ-MARTÍNEZ, B. ESCRICHE

La actividad tóxica de 5 proteínas Cry de Bacillus thuringiensis se analizó en unapoblación española de Spodoptera exigua. Los ensayos se realizaron aplicando las pro-

teínas Cry en la superficie de la dieta artificial, empleando 2 concentraciones diferentespara cada una de ellas. Los datos de mortalidad obtenidos para cada proteína se compa-raon con los valores publicados en la literatura. Las proteínas Cry I Ca, CrylDa y CrylFafueron las más tóxicas, mientras que las proteínas Cry I Ab y Cry 1 Ac fueron sólo par-cialmente tóxicas. Por lo tanto, es importante el empleo de formulaciones que contenganlas proteínas más tóxicas para el control eficaz de esta plaga.

P. HERNÁNDEZ-MARTÍNEZ, B. ESCRICHE. DeparIaMent de Genética, Universitat de Valén-cia, 46100 Burjassot (Valencia), España.

Palabras clave: gardama verde, rosquilla verde, control biológico, delta-endotoxina,toxicidad.

INTRODUCCIÓN

Spodoptera exigua (Hübner, 1808) es uninsecto polffago y de hábitos gregarios queataca a diversos cultivos herbáceos. En zonasdel sur de España se presenta con alta inci-dencia, causando pérdidas económicasimportantes en cultivos de invernadero(tomate, judía verde, pimiento) y en cultivosextensivos como el algodón (BELDA el al.,1994; GUIMARAES el al., 1995; SMAGGHE elal., 2000). El uso de insecticidas químicos haprovocado la aparición de resistencia enalgunas especies de insectos plaga, ademásde un fuerte impacto medio ambiental(TORRES-V1LA el al., 1998). El uso de insec-ticidas biológicos como los formulados deBacillus thuringiensis (Bt) son una alternati-va a los insecticidas químicos y, actualmen-te, representan más del 90% de los bioinsec-ticidas comercializados. La información que

existe sobre los preparados de Bt es, enmuchos casos, limitada y son consideradoscomo distintas formulaciones de un mismoprincipio activo, del cual se proporciona elporcentaje en la etiqueta. La realidad es máscompleja pues la toxicidad y especificidadde una cepa concreta de B. thuringiensis sedebe a los tipos de proteínas Cry que pro-duzca y en qué proporciones estén presentes.Cada cepa de B. thuringiensis produce gene-ralmente más de una proteína Cry, de talforma que se puede considerar que la mate-ria activa de un formulado Bt consiste en unamezcla de derivados de un principio activo,de tal forma que cada cepa se puede consi-derar un material con especificidades únicas(CERÓN, 2001).

En este trabajo se estudia la susceptibili-dad a 5 proteínas Cry de B. thuringiensis deuna población española de S. exigua (ALM),estimando qué proteínas son las más activas

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y comparando los datos obtenidos para estapoblación con otros anteriormente publica-dos para otras poblaciones de S. exigua.

MATERIAL Y MÉTODOS

InsectosEl ensayo se realizó con una colonia de

laboratorio de S. exigua (ALM), la cual fueproporcionada por A. Torres, Universidad deAlmería, (Almería, España). Se recogió encampos Almería y se mantuvo en el labora-torio durante al menos dos años sin estarexpuesta a proteínas Cry de B. thuringiensiso a cualquier otro insecticida. La colonia semantuvo con dieta artificial (MoAR et al.,1995) y en condiciones de laboratorio: 25 ±3°C, 70 ± 5% de humedad relativa y un foto-periodo 16/8 h (luz/oscuridad).

Proteínas CryLas proteínas CrylAc, Cry I Ca, CrylDa

y CrylFa se obtuvieron a partir de cepasrecombinantes de B. thuringiensis EG11070,EG 1081, EG7300 EG11069 , respectiva-mente (Ecogen Inc., Langhorne, PA). Lapurificación del cristal proteico, solubiliza-ción, activación de la protoxina con tripsinay la cuantificación del fragmento activo serealizó como describió ESTELA et al. (2004).Cry I Ab se obtuvo a partir de una ceparecombinante de Eschericha coli GG094-208 (cedida por R. A. de Maagd). La purifi-cación de los cuerpos de inclusión, solubili-zación, activación con tripsina y la cuantifi-cación se llevó a cabo como describió SAY-

YED et al. (2005).El tamaño y la pureza de los fragmentos

activos obtenidos tras la activación de cadaproteína se analizó mediante geles de polla-crilamida (12% SDS-PAGE). Las proteínasactivas se mantuvieron a -20°C hasta su uso.

BioensayosLa susceptibilidad a 5 proteínas Cry se

analizó empleando larvas de dos días deedad (48 ± 3 h). Para cada proteína Cry seemplearon 2 concentraciones diferentes en

Cuadro 1 Proteínas Cry de B. thuringiensis yconcentraciones empleadas en el ensayo de

actividad en larvas de la colonia ALM de S. exigua.

Proteína Cry Concentración (ng/cm2)

Cl C2

CrylAb 46 3750

CrylAc 1250 2500

Cry 1 Ca 16 250

Cry 1 Da 0,7 180

CrylFa 15 1250

cada ensayo (Cuadro 1). Estas concentracio-nes se determinaron a partir de resultadosobtenidos en un estudio realizado previa-mente por HERNÁNDEZ-MARTÍNEZ et al.(2008). Los ensayos se realizaron emplean-do la técnica de contaminación en superficieen placas de cultivo celular de 24 pocillos de2 cm 2 (FERRÉ et al., 1991). Un volumen de50 ti! por pocillo se añadió sobre la dieta encada pocillo y a continuación las placas sedejaron secar en una campana de flujo lami-nar al menos durante 2 horas. Una vez secala superficie se transfirió una larva por poci-llo. Los ensayos se repitieron 3 veces paracada proteína Cry y por cada concentraciónse emplearon 48 larvas. Los controles decada repetición se realizaron con agua desti-lada. Las placas del bioensayo se mantuvie-ron en cámaras de crecimiento de insectoscon una temperatura de 25 ± 3°C, una hume-dad relativa del 70 ± 5% y un fotoperiodo de16-8 h (luz/oscuridad). Los datos de mortali-dad se obtuvieron a los 5 días. Las orugas seconsideraron muertas si no eran capaces demoverse cuando se les tocaba suavementecon la punta de un pincel.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La mortalidad observada en los ensayosde susceptibilidad en S. exigua mostró unarelación directa con la concentración emple-ada para las diferentes proteínas Cry activa-das de B. thuringiensis (Cuadro 2). Los con-troles, en los cuales no se expusieron las lar-vas a las proteínas Cry, mostraron una mor-talidad media de un 7%.

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Cuadro 2. Mortalidad corregida de las larvas de S. exigua expuestas a proteínas Cry empleando dos concentra-ciones (C1 y C2) descritas en el Cuadro 1 para cada una de ellas.

Proteína Cry Concentración NI % Mortalidad ± SD

C I 144 14± 1,2Cry I Ab

C2 144 36 ± 5,4

C I 144 32 ± 2,1Cry I Ac

C2 144 42 ± 1,7

C I 144 22 ± 2,5CrylCa

C2 144 49 ± 1.1

C I 144 40 ± 0.8Cry I Da

C2 144 ± 0,8

C I 144 41 ± 1,4Cry I Fa

C2 144 55 ± 2.1

I N: Número total de larvas

El porcentaje de mortalidad obtenidopara cada proteína y concentración se mues-tra en el Cuadro 2. La concentración menorescogida (C1) para cada proteína causó deun 14% a un 41% de mortalidad, mientrasque la concentración mayor (C2) causó deun 36% a un 70% de mortalidad. Las morta-lidades observadas para la concentracióninferior (C1) se ajustan a las esperadas(aproximadamente un 25 %), basándonos enlos datos previos publicados (HERNÁNDEZ-MARTÍNEZ et al., 2008), sin embargo lapoblación ALM resultó, en general, menossusceptible para las concentraciones mayo-res (C2), en las que se esperaba un 75% demortalidad.

Las proteínas con mayor actividad insec-ticida contra la colonia ALM de S. exigua(Cuadro 2 y Figura 1) fueron Cry 1 Ca,CrylDa y CrylFa, mientras que las proteínasCry I Ab y Cry I Ac poseen una actividadinsecticida mínima contra S. exigua.

La susceptibilidad en diferentes coloniasde laboratorio de S. exigua frente a diferen-tes proteínas Cry de B. thuringiensis ha sidoestudiada en numerosos artículos (HoNEE etal., 1990; MACINTOSH eta!., 1990; MOAR etal., 1990; V1SSER et al., 1990; CHAMBERS etal., 1991; MOAR eta!., 1995; DE MAAGD etal., 1996; Luo eta!., 1998; ABDUL-RAUF andELLAR, 1999; DE MAAGD eta!., 2000; HERRE-RO eta!., 2001; GILLIAND eta!., 2002). Sinembargo, la información obtenida en los

estudios realizados es fragmentada, ya que lamayoría de ellos sólo estudian la susceptibi-lidad para un número reducido de estas pro-teínas Cry (de 2 a 4 proteínas). Esto dificul-ta que los resultados puedan ser fácilmentecomparados, ya que la variabilidad puededeberse a variaciones en la metodología(método de bioensayo empleado, fuente yobtención de las proteínas Cry, entre otros),pero también a la variación de susceptibili-dad intraespecífica (empleo de diferentespoblaciones de S. exigua). Pese a todas estasvariaciones, que pueden estar influyendo enlos resultados cuantitativos finales, analizan-do cualitativamente los valores del presenteestudio junto con los descritos en la biblio-grafía se puede concluir que las proteínasCrylCa, CrylDa y CrylFa son activas con-tra S. exigua, mientras que Cry 1 Ab yCrylAc son poco activas. No obstante, estono implica que las proteínas activas seanigual de efectivas entre ellas, y adicional-mente, se observan algunas variaciones deefectividad entre las poblaciones. Así, en unestudio que se realizó en paralelo para dospoblaciones de laboratorio de S. exigua(HERNÁNDEZ-MARTÍNEZ et al., 2008) seobservó que el patrón de toxicidad era simi-lar, pero se encontraron diferencias significa-tivas a nivel de valor de CL 50 para las prote-ínas CrylAb y CrylDa.

La mayor parte de estudios se han reali-zado empleando poblaciones mantenidas

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Figura l. Patrón de susceptibilidad, para 5 proteínas Cry, observado para dos colonias de procedencia española ALM yMUR. Los paneles A y B muestran los porcentajes de mortalidad obtenidos para las concentraciones Cl y C2,

respectivamente (descritas en el Cuadrol).

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largos periodos de tiempo en el laboratorio.Estas poblaciones pueden ser sólo parcial-mente representativas de la susceptibilidady variabilidad de las poblaciones de campo.El primer trabajo que incluyó un estudio devariación de la susceptibilidad empleandoproteínas Cry de B. thuringiensis entrediferentes poblaciones de campo de S. exi-gua, fue descrito por LUTTRELL et al.(1999). En este trabajo se describen dife-rencias en el valor de CL50 de unas 17veces para la proteína CrylAc. En un tra-bajo posterior (HERNÁNDEZ-MARTÍNEZ elal., 2008) se estudió la susceptibilidadfrente a 9 proteínas Cry de B. thuringiensiscomparando 3 colonias de S. exigua: 2 delaboratorio y una colonia autóctona espa-ñola (MUR). Este último trabajo se realizóen paralelo al expuesto en el presente tra-bajo con la colonia ALM. El patrón de sus-ceptibilidad para las 2 colonias españolas(MUR y ALM) fue similar tanto emplean-do altas como a bajas concentraciones deproteínas Cry (Figura 1), y resulta muysimilar al obtenido con otras colonias delaboratorio, aunque parece observarse unamenor susceptibilidad para la colonia ALMfrente a las 5 proteínas Cry analizadas. Lasimilitud de susceptibilidad a proteínas Cryentre poblaciones de campo o de laborato-rio de un mismo insecto ha sido descritaanteriormente para especies como, Heliot-his virescens (Fabricius, 1977), Helicover-pa zea (Boddie, 1850) y Spodoptera frugi-perda (Smith, 1797) (LUTRELL el al.,1999), y sigue siendo básicamente asumidaen la mayor parte de los casos. Sin embar-go según los datos aquí presentados para S.exigua, y otros publicados para Trichoplu-sia ni (Hübner, 1803) (IRACHETA el al.,2000), Plutella xylostella (Linnaeus, 1758)(GONZÁLEZ-CABRERA et al., 2001) y S. fru-giperda (MONNERAT et al., 2006) se mues-

tra la existencia de cierta variabilidad intra-específica silvestre, tal y como ocurre conlos insecticidas convencionales de síntesisquímica.

El empleo de productos basados en B.thuringiensis resulta esencial para el controlintegrado de plagas de lepidópteros en Espa-ña, sobretodo en cultivos de invernadero.Dada la importancia de S. exigua y su difícilcontrol, nuestro estudio muestra que sepodría conseguir mayor eficacia utilizandopreparados que contengan mayoritariamentelas proteínas CrylCa, CrylDa y CrylFa. Elcontenido en proteínas Cry del cristal para-espora] muestra una cierta relación con elserovar de B. thuringiensis al que pertenece(MARTÍNEZ y CABALLERO, 2002). Los pro-ductos comercializados en España se basanfundamentalmente en preparados de B. thu-ringiensis serovar kurstaki, cuyo contenidofundamental en general son proteínas de lafamilia Cry 1 A (MARTÍNEZ y CABALLERO,2002), las cuales hemos mostrado que sonpoco efectivas frente a S. exigua. Nuestrotrabajo sugiere que se debe continuar lainvestigación para localizar cepas de B. thu-ringiensis que tengan una actividad superiora las actualmente empleadas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido realizado gracias a lafinanciación recibida a través de los proyec-tos concedidos por la Generalitat Valenciana(GVO4B-165 y GVARVIV2007-090), y delMinisterio de Ciencia y Tecnología(AGL2003-09282-0O3). Patricia Hernán-dez-Martínez posee una beca predoctoral(BES- 2004- 34469 para su financiación yBaltasar Escriche ha sido financiado por elprograma Ramón y Cajal. Agradecemos aJuan Ferré Manzanero por la revisión delmanuscrito.

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ABSTRACT

HERNÁNDEZ-MARTNEZ P., B. ESCR1CHE. 2008. Study of the biological activity of 5Cry proteins from Bacillus thuringiensis against one population of Spodoptera exigua(Hübner). Bol. San. Veg. Plagas, 34: 45-51.

The toxic activity of 5 Cry proteins of Bacillus thuringiensis was tested against oneSpanish colony of Spodoptera exigua. The assays were done by adding over the surfaceof an artificial diet the different Cry proteins, using two different concentrations of eachone. The mortality data obtained for each protein were compared with previous mortali-ty data published in the literature. CrylDa, CrylCa and CrylFa proteins were the mosttoxic, while CrylAb and CrylAc were partially toxic. Therefore, in order to get an effec-tive control against this insect pest it is important to use products which contain the toxicproteins.

Key words: beet armyworm, biological control, delta-endotoxin, toxicity.

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(Recepción: 22 noviembre 2007)(Aceptación: 20 febrero 2008)