ESTUDIO DE LA RELACIÓN PARÁSITO-HOSPEDADOR EN ...
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA ESTUDIO DE LA RELACIÓN PARÁSITO-HOSPEDADOR EN TRYPANOSOMATIDES DE PLANTAS (Phytomonas Donovan 1909). Trabajo Especial de Grado presentado por la Br. Amaranta L. Gómez Arreaza como requisito parcial para optar al Título de Licenciada en Biología. Tutora: Luisana Avilán. Cotutor: Ananías Escalante Mérida, Junio del 2002 UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
ESTUDIO DE LA RELACIÓN PARÁSITO-HOSPEDADOR EN
TRYPANOSOMATIDES DE PLANTAS
(Phytomonas Donovan 1909).
Trabajo Especial de Grado presentado por
la Br. Amaranta L. Gómez Arreaza
como requisito parcial para optar al Título
de Licenciada en Biología.
Tutora: Luisana Avilán.
Cotutor: Ananías Escalante
Mérida, Junio del 2002
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
ESTUDIO DE LA RELACIÓN PARÁSITO-HOSPEDADOR EN
TRYPANOSOMATIDES DE PLANTAS (Phytomonas).
Trabajo Especial de Grado presentado por
la Br. Amaranta L. Gómez Arreaza
como requisito parcial para optar al Título
de Licenciada en Biología.
Tutora: Luisana Avilán.
Mérida, Junio del 2002
Trabajo Especial de Grado financiado por los proyectos G-97000634 del FONACIT
y C-1121-02-03-F del CDCHT-ULA.
A Tomek, mi fundamento
RESUMEN
El presente estudio pretende indagar sobre la relación parásito-hospedador en plantas
con látex portadoras de Trypanosomatides del género Phytomonas. Para ello se planteó la
búsqueda de proteínas asociadas a defensa, tales como proteasas, inhibidores de proteasas y
lectinas en el látex de plantas que puedan encontrarse en la localidad de Mérida y sus
alrededores, tanto infectadas como libres de flagelados. Se encontró que hay al menos tres
especies de plantas en la localidad de Mérida capaces de portar Phytomonas: la
Asclepiadaceae Asclepias curassavica y las Euphorbiaceas Chamaesyce hirta var. hirta y C.
hirta var. procumbens. La búsqueda de las proteínas antes mencionadas se realizó en la fase
acuosa del látex de estas dos últimas especies. Las dos variedades de C. hirta mostraron la
presencia de proteasas (mediante zimografías) y lectinas hemoaglutinantes de eritrocitos de
conejo (en ensayos de hemoaglutinación) y la variedad procumbens evidenció la presencia
de sustancias capaces de inhibir la actividad de una proteasa exógena (plasmina humana). En
ningún caso se observaron diferencias en la actividad de estas proteínas entre las plantas
infectadas y las libres de flagelados. La variedad procumbens mostró patrones diferenciales
asociados a la infección en cuanto a la proporción de fase acuosa del látex y a los patrones de
proteínas totales evidenciados por SDS-PAGE bajo condiciones desnaturalizantes. Además
se amplificó la secuencia parcial del gen que codifica para la GAPDH glicosomal por PCR
en las Phytomonas aisladas de las dos variedades de C. hirta como aporte para posteriores
estudios evolutivos de estos organismos que permitan poner a prueba la hipótesis
filogenética que separa a los aislados de Phytomonas de acuerdo con su tropismo por
diferentes tejidos en plantas.
Palabras clave: Phytomonas, látex, proteasas, lectinas, Euphorbiacea.
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN.............................................................................................
1. Trypanosomatides de plantas...............................................................................
1.1. Ubicación taxonómica...........................................................................
1.2. Problemas taxonómicos del género.......................................................
1.3. Distribución geográfica..........................................................................
1.4. Ciclo de vida..........................................................................................
1.5. Especies de Phytomonas........................................................................
1.6. Vectores.................................................................................................
1.7. Plantas hospederas.................................................................................
1.8. Evolución...............................................................................................
1.9. Patogénesis y Phytomonas en plantas laticíferas...................................
2. Relación parásito hospedador..................................................................................
2.1. Defensa en plantas.................................................................................
2.2. Proteínas asociadas a la defensa..............…..........................................
2.2.1. Proteasas.......…..........................................................................
2.2.2. Inhibidores de proteasas.............…............................................
2.2.3. Lectinas en plantas................….................................................
II. OBJETIVOS......................................................................................................
III. HIPÓTESIS.......................................................................................................
IV. MATERIALES Y MÉTODOS..........................................................................
MATERIALES..................................................................................................
1. Acidos nucleicos....................................................................................
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2. Proteínas.................................................................................................
3. Inhibidores de proteasas.........................................................................
4. Azúcares para ensayos de inhibición de hemoaglutinación...................
5. Tampones y soluciones..........................................................................
6. Equipos..................................................................................................
MÉTODOS........................................................................................................
1. Búsqueda de plantas con látex que sirven como hospederos de
Phytomonas en un gradiente altitudinal de al menos 1000m en la
Cuenca media del Rio Chama.................................................................
1.1. Búsqueda e identificación de plantas portadoras de flagelados............
1.1.1. Area de estudio...........................................................................
1.1.2. Búsqueda de plantas portadoras de flagelados...........................
1.2. Identificación de los flagelados del género Phytomonas en las plantas
portadoras de trypanosomatides.............................................................
1.2.1. Extracción de ADN....................................................................
1.2.2. PCR género específico para Phytomonas (PCR-PSL)...............
1.2.3. Prueba de inhibición (PCR-PSK)...............................................
1.2.4. Geles de agarosa.........................................................................
1.3. Búsqueda de especies de plantas que puedan encontrarse tanto
infectadas como no infectadas por Phytomonas....................................
2. Estudio de la relación parásito hospedador mediante la búsqueda de
proteínas solubles del látex asociadas a la defensa de la planta.............
2.1.Comparación de la proporción de la fase acuosa del látex en plantas
infectadas y no infectadas.......................................................................
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2.2. Búsqueda de proteínas solubles del látex...............................................
2.2.1. Tratamiento del látex..................................................................
2.2.2. Electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida..........................
2.3. Búsqueda de proteasas solubles del látex..............................................
2.3.1. Zimografías................................................................................
2.3.2. Determinación del mecanismo de acción de las proteasas.........
2.3.3. Detección de actividad proteasa de la fase acuosa del látex en
placas de agarosa-gelatina..........................................................
2.4. Búsqueda de inhibidores de una serínproteasa exógena en el látex de
plantas infectadas y no infectadas...........................................................
2.5. Búsqueda de lectinas presentes en el látex............................................
2.5.1. Ensayos de hemoaglutinación....................................................
2.5.2. Ensayos de inhibición de hemoaglutinación..............................
3. Prueba de la hipótesis filogenética que separa a los aislados de
Phytomonas de acuerdo con su tropismo por diferentes tejidos de
plantas, utilizando un nuevo marcador genético.....................................
3.1. Aislados de Phytomonas........................................................................
3.1.1. Tratamiento de las muestras de los distintos aislados................
3.2. Marcadores genéticos.............................................................................
3.3. Amplificación por PCR..........................................................................
V. RESULTADOS.................................................................................................
1. Plantas con látex que sirven como hospederas de Phytomonas encontradas en el
área de estudio..............................................................……...................................
1.1. Especies de plantas portadoras de Phytomonas.....................................
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1.2. Pruebas de PCR-PSL.............................................................................
1.3. Plantas que pueden encontrarse tanto infectadas como libres de
Phytomonas......................................................................................................
2. Estudio de la relación parásito hospedador.............................................................
2.1. Comparación de la proporción de la fase acuosa del látex en plantas
infectadas y no infectadas con Phytomonas.....................................................
2.2. Comparación de la concentración de proteínas en la fase acuosa del
látex de plantas infectadas y no infectadas.......................................................
2.2.1. Comparación de patrones de proteínas solubles en la fase
bacuosa del látex entre plantas infectadas y no infectadas con
Phytomonas……………………………………………………………...
2.3. Proteasas solubles del látex....................................................................
2.3.1. Determinación del mecanismo de acción de las proteasas
encontradas................................................................................................
2.4. Detección de actividad proteasa en placas de agarosa-gelatina.............
2.5. Inhibidores de una serínproteasa exógena (plasmina humana) en el
látex de plantas infectadas y no infectadas con Phytomonas...........................
2.6. Ensayos de hemoaglutinación con látex de plantas infectadas y no
infectadas con Phytomonas..............................................................................
2.6.1. Ensayos de inhibición de hemoaglutinación con distintos
azúcares………………………………………………………………….
3. Avances de la investigación para poner a prueba la hipótesis filogenética que
separa a los aislados de Phytomonas de acuerdo con su tropismo por diferentes
tejidos de plantas....................................................................................................
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3.1. Pruebas de PCR-PSL realizadas a los aislados internacionales
reunidos………………………………………………………………………
3.2. Amplificados obtenidos por PCR-ND4.................................................
3.3. Amplificados obtenidos por PCR-GAPDH...........................................
VI. DISCUSIÓN......................................................................................................
VII. CONCLUSIONES.............................................................................................
VIII. PERSPECTIVAS..............................................................................................
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Estadios morfológicos de los trypanosomatides……………………………
Tabla 2: Especies de Phytomonas reconocidas actualmente…………………………
Tabla 3: Insectos del Orden Hemiptera asociados a plantas infectadas con
flageelados…………………………………………………………………
Tabla 4: Familias de plantas portadoras de Phytomonas……………………………..
Tabla 5: Familias de enzimas proteolíticas…………………………………………...
Tabla 6: Datos de proteasas de Euphorbias, euphorbaínas…………………………...
Tabla 7: Familias de inhibidores de proteasas en plantas…………………………….
Tabla 8: Cantidad de plantas con látex examinadas en cada zona del área de estudio
explorada y especies en las que se encontraron Phytomonas……………...
Tabla 9: Efecto de los distintos inhibidores de proteasas ensayados sobre las
proteasas encontradas en las variedades hirta y procumbens de la especie
Chamaesyce hirta………………………………………………………….
Tabla 10: Capacidad de inhibicción de hemoaglutinación de los azúcares ensayados
sobre las aglutininas presentes en la fase acuosa del látex de dos
variedades de Chamaesyce hirta…………………………………………..
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Variedad morfológica de Phytomonas serpens cepa 9 T………………….
Figura 2: Arbol consenso de la familia Trypanosomatidae obtenido por máxima
verosimilitud, basado en la secuencia del gen que codifica para el ARN
de la subunidad pequeña del ribosoma…………………………………….
Figura 3: Chamaesyce hirta var. hirta………………………………………………..
Figura 4: Chamaesyce hirta var. procumbens……………………………………….
Figura 5: Inflorescencia de Asclepias curassavica………………………………….
Figura 6: Gel de agarosa 2,5 % con productos de PCR-PSL………………………...
Figura 7: Gel de agarosa 2,5 % con productos de PCR-PSL y PCR-PSK…………...
Figura 8: Gel de agarosa 2 % con productos de PCR-PSL y PCR-PSK……………..
Figura 9: % Fracción acuosa del látex (Fal) en plantas infectadas (I) y no
infectadas (NI) de Chamaesuce hirta var. procumbens……………………
Figura 10: Variación del % de la fracción acuosa del látex (Fal) en función del
tiempo, en plantas de Chamaesyce hirta var. procumbens infectadas y no
infectadas con Phytomonas………………………………………………...
Figura 11: Concentración de proteínas totales en la fase acuosa del látex de plantas
infectadas y no infectadas con Phytomonas de las variedades hirta y
procumbens de Chamaesyce hirta…………………………………………
Figura 12: Gel de SDS-poliacrilamida 12 % con muestras de látex de Chamaesyce
hirta var. hirta infectada y no infectada con Phytomonas…………………
Figura 13: Geles de SDS-poliacrilamida 12 % con muestras de látex de
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Chamaesyce hirta var. procumbens infectadas y no infectadas con
Phytomonas………………………………………………………………...
Figura 14: Zimogramas con muestras de Chamaesyce hirta var. procumbens
realizados con distintos sustratos y a diferentes condiciones de pH………
Figura 15: Zimogramas en geles SDS-PAGE 12%, gelatina 0,2 %, incubados 3 h. a
pH 7,5……………………………………………………………………...
Figura 16: Zimogramas en geles SDS-PAGE 12%, gelatina 0,2 %, con muestras de
látex de dos variedades de Chamaesyce hirta incubados con y sin
inhibidores de proteasas……………………………………………………
Figura 17: Zimogramas en geles SDS-PAGE 12%, gelatina 0,2 %, con muestras de
látex Chamaesyce hirta var. hirta incubados con y sin PMSF…………….
Figura 18: Placa agarosa-gelatina con muestras de Chamaesyce hirta var. hirta y
var. procumbens……………………………………………………………
Figura 19: Variación del % de inhibición de la actividad plasmina respecto a la
concentración de proteínas totales de la fase acuosa del látex de plantas
de Chamaesyce hirta var. procumbens infectadas y no infectadas con
Phytomonas………………………………………………………………...
Figura 20: Capacidad hemoaglutinante de la fase acuosa del látex de Chamaesyce
hirta………………………………………………………………………...
Figura 21: Gel de agarosa 2,5 % con resultados del PCR-PSL de los aislados
internacionales acopiados………………………………………………….
Figura 22: Gel de agarosa 1,5 % con muestras de PCR-ND4………………………..
Figura 23: Geles de agarosa con muestras de los amplificados por PCR-GAPDH…
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ABREVIATURAS
Abs. absorbancia
ADN ácido desoxi-ribonucleico
ADNc ADN complementario
ADNk ADN del kinetoplasto
ARN ácido ribonucleico
Asp aspartato
BSA albúmina de suero bovino (bovine serum albumin)
cm centímetros
Cys cisteína
DEPC dietilpirocarbonato
DFP di-isopropil-fluorofosfato
DMSO dimetilsulfóxido
dNTP desoxi-ribonucleósido trifosfato
EDTA ácido etilen diamino tetra-acético (ethylenediamine tetracetic acid)
G gravedad
GAPDH gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa
Glu glutamato
h. horas
His histidina
kb kilobases (1000 bases)
kDa kilodalton
M metros
min. minutos
msnm metros sobre el nivel del mar
p/v peso sobre volumen
pb pares de bases
PCR reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)
ph/v peso húmedo sobre volumen
PM peso molecular
PMSF fluoruro de fenil-metil sulfonil (Phenyl-methyl-sulphonyl-fluoride)
Ser serina
SDS dodecil sulfato de sodio (Sodium dodecyl sulphate)
SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS- polyacrilamide gel
electrophoresis)
SK estreptoquinasa
SL gen Spliced Leader
Ta Temperatura de alineamiento
Tyr tirosina
v/v volumen sobre volumen
Zn cinc
I. INTRODUCCIÓN.
En el presente trabajo nos proponemos contribuir en algunos aspectos del estudio de la
relación parásito-hospedador en el sistema que forman trypanosomatides de plantas del
género Phytomonas con plantas laticíferas que se encuentran en la localidad de Mérida. Para
cumplir con nuestro propósito es conveniente formarnos una idea general de quiénes son los
trypanosomatides de plantas, organismos relativamente poco estudiados a nivel mundial y
muy poco estudiados en Venezuela, a ellos les dedicaremos la primera parte de la
introducción. Por otra parte, puesto que enfocaremos nuestro estudio en evaluar algunos
aspectos de la respuesta química de las plantas a estos trypanosomatides, será necesario
revisar algunos conceptos y teorías respecto a los mecanismos de defensa en plantas, los que
desarrollaremos en una segunda parte de la introducción.
Conviene señalar que este estudio es parte de una línea de investigación reciente en el
laboratorio donde se lleva a cabo, por lo que de alguna manera tiene un carácter exploratorio,
es por esto que más que enfocarse en un único aspecto puntual a desarrollar en profundidad,
toca una serie de aspectos diversos de modo relativamente superficial que esperemos
preparen el terreno para el desarrollo de futuros trabajos más puntuales dentro del área.
1. Trypanosomatides de plantas.
En la segunda mitad del siglo XIX los trypanosomatides, aunque llamados de diversas
formas, ya habían sido encontrados en gusanos, insectos y vertebrados. A principios del
siglo XX, ya eran bien conocidos como agentes etiológicos de diversas enfermedades en
humanos y animales tales como: la enfermedad del sueño, kala-azar, úlcera oriental, surra y
nagana (Camargo 1999). Sin embargo, no fue sino hasta 1909 que por casualidad se
encontraron trypanosomatides en plantas.
El Dr. Alexander Lafont, quien dirigía el Laboratorio de Bacteriología en la isla
Mauricio, se encontraba investigando las propiedades curativas del látex de Euphorbia
pilulifera (= E. hirta) en la trypanosomiasis equina (surra). Al examinar el látex al
microscopio, su ayudante David, encontró flagelados con gran movilidad y luego de fijar
y estudiar detenidamente las muestras, Lafont decide llamar a estos flagelados
Leptomonas davidi, asignándoles a uno de los géneros existentes dentro de la familia
Trypanosomatidae para la fecha, con el epíteto específico en honor a su técnico
(Camargo 1999, Dollet 1984).
En los siguientes 20 años se hicieron numerosos reportes de flagelados, encontrándose en
unas cuatro docenas de diferentes especies de plantas y en los cinco continentes, además
de hallarse repetidas veces en las mismas especies de plantas de distintas regiones
geográficas (Camargo 1999).
Debido a su morfología y organización celular, estos protozoarios uniflagelados eran
claramente identificados dentro de la familia Trypanosomatidae, sin embargo, distintos
autores caracterizaron a estos flagelados dentro de géneros diversos como: Leptomonas,
Herpetomonas, Trypanosoma o Leishmania. Es Donovan en 1909, quien sugiere la
creación de un nuevo género (Phytomonas) para designar a los trypanosomatides
presentes en hospederos de naturaleza vegetal, debido a que según él su morfología era
marcadamente diferente de la de otros géneros (Camargo 1999, Dollet 1984). Este nuevo
género Phytomonas no fue muy popular entre los investigadores y se comienza a utilizar
apenas en 1927, siendo entre los años ‘70 y ‘80 del siglo XX, cuando realmente gana
aceptación a pesar de que actualmente se considera que el criterio del hospedero no es
suficiente para justificar al género, pues se han encontrado flagelados de géneros
usualmente monogenéticos (con un sólo hospedador) de insectos que ocasionalmente
pueden habitar en plantas (Conchon et al. 1989, Dollet 1984).
Al margen de la controversia sobre el género, los trypanosomatides de plantas una vez
descubiertos, aunque cada vez más reportados, fueron relativamente poco estudiados a
excepción de algunos pocos trabajos de médicos y veterinarios que investigaban la
posibilidad de que las plantas funcionaran como reservorios naturales de los agentes
causantes de las trypanosomiasis y leishmaniasis, hipótesis atractiva a la luz de los
conocimientos que se manejaban a principios del siglo XX (Dollet 1984, Jankevicius
1988). Los primeros trabajos fitopatológicos los realiza Holmes en 1925, quien establece
la no patogenicidad de los flagelados en una Asclepiadaceae (Dollet 1984), luego Aragão
en 1927 realiza el primer reporte de presencia de parásitos en una Euphorbiaceae de
interés económico: Manihot palmata (yuca o mandioca). Posteriormente Stahel en 1930
describe al flagelado Leptomonas leptovasorum en la savia de plantas de café (Coffea
liberica) con necrosis de floema en Surinam, lo que constituye la primera patología
asociada a flagelados de plantas (Jankevicius 1988). Sin embargo, no es sino hasta 1976
cuando los fitopatólogos realmente dirigen su atención hacia estos parásitos al descubrirse
simultáneamente la asociación de los flagelados de plantas con dos enfermedades en
palmas de cultivo: el “hartrot” de coco (Cocos nucifera) y la marchitez sorpresiva en
palma aceitera (Elaeis guineensis) (Dollet 1984).
En los últimos años ha aumentado el interés en el estudio de estos organismos debido, en
gran parte, a la creciente importancia de los cultivos de palma en Suramérica, los cuales
se ven seriamente afectados por la patología asociada a estos flagelados, limitando así el
rendimiento económico de éstos (Dollet 1993). Por otra parte, la cantidad de plantas de
interés comercial afectados en mayor o menor grado por estos flagelados va en aumento,
además del tomate (Lycopersicon esculentum) reportado originalmente por Gibbs (1957)
se han sumado la granada (Punica granatum), el durazno (Prunus persica), cítricos como
la mandarina (Citrus reticulata) y la bergamota (Citrus bergamia) reportados por
Conchon et al. (1989), la naranja (Citrus aurantium) y la uva (Vitis vinifera) reportados
por Carrara et al. (1992), el maíz (Zea mays) reportado por Jankevicius et al. (1993) y la
planta ornamental Alpinia purpurata reportada por Hunt (Muller et al. 1994).
1.1. Ubicación taxonómica.
Los flagelados de plantas se encuentran ubicados taxonómicamente dentro del Phyllum
Protozoa, Subphyllum Mastigophora, Orden Kinetoplastida y Familia Trypanosomatidae
(Molyneux & Ashford 1983).
El Orden Kinetoplastida contiene a las familias Bodonidae y Trypanosomatidae, la
primera contiene tanto organismos de vida libre como ecto y endo parásitos mientras que
la segunda sólo contiene organismos parásitos obligados (Vickerman 1994). Los
organismos que pertenecen a este Orden se caracterizan por poseer algunas
peculiaridades en su organización celular, tales como: la modificación del ADN
mitocondrial considerablemente amplificado y organizado en una red de miles de
moléculas de ADN circular de dos tipos, maxicírculos (20-40 kb) y minicírculos (0,65-
2,5 kb), concatenadas entre sí, que adquiere propiedades de tinción particulares y se
denomina kinetoplasto (Vickerman 1994, Feagin 2000); la presencia de una organela
particular denominada glicosoma que consiste en un peroxisoma modificado que
contiene parte de las enzimas de la vía glicolítica además de otras enzimas involucradas
en la síntesis de pirimidinas, fijación de dióxido de carbono, β-oxidación de ácidos
grasos y síntesis de lípidos (Vickerman 1994, Michels et al. 2000); el poseer un aparato
flagelar característico asociado a una bolsa flagelar a través de la cual se da el
intercambio de sustancias con el ambiente (endo y exocitosis); la particular organización
del genoma nuclear que consiste de numerosos cromosomas los que contienen unidades
de transcripción policistrónicas cuyos transcritos son procesados mediante un mecanismo
especial denominado transplicing, entre otros (Vickerman 1994).
Los Trypanosomatides constituyen, después de los nemátodos, el grupo de
parásitos eucariotas con más amplio espectro de hospederos. Si bien son mejor
conocidos como agentes etiológicos de importantes enfermedades en el hombre y
animales domésticos (las trypanosomiasis y leishmaniasis) también se encuentran en
una gran variedad de organismos. Los trypanosomas (Trypanosoma spp.) viven en la
sangre y ocasionalmente en otros fluidos y tejidos de todas las clases de vertebrados y
usualmente sobrellevan un desarrollo cíclico en un vector artrópodo o sanguijuela. Las
leishmanias (Leishmania spp.) parasitan el sistema fagocítico mononuclear de
mamíferos y lagartos, y son transmitidos cíclicamente por flebótomos. Pero además de
estos dos géneros digenéticos, es decir, que requieren de dos hospederos diferentes
para completar su ciclo de vida, se encuentran varios géneros (Crithidia,
Blastocrithidia, Herpetomonass, Rhynchoidomonas) que están completa o ampliamente
compuestos por parásitos monogenéticos (con un solo hospedero) del tracto digestivo y
órganos asociados, de una amplia variedad de insectos. El género monogenético
Leptomonas contiene especies hospederas de insectos pero también puede encontrarse
como parásito intracelular de protozoarios ciliados. Finalmente se encuentra el género
Phytomonas, compuesto por parásitos digenéticos de angiospermas con un vector del
Orden Hemiptera. Pese a habitar esta amplia variedad de hospederos existen grupos
aún no conquistados por los trypanosomatides, tales como la mayoría de los
invertebrados con excepción de los artrópodos, las ginmospermas, briófitos,
pteridófitos y algas en el reino vegetal, además de hongos y protistas distintos de los
ciliados (Vickerman 1994).
Los géneros de trypanosomatides han sido tradicionalmente divididos en dos grupos, los
que contienen especies que parasitan vertebrados e insectos y los que contienen especies
que parasitan insectos y plantas, denominados hasta hace poco superiores e inferiores,
respectivamente (Camargo 1999). Pese a que esta denominación no tiene ningún
fundamento en base a las relaciones filogenéticas que éstos parecen presentar (Hollar &
Maslov 1997), la división sigue siendo práctica a la hora de abordar al grupo. La
separación a nivel de género en ambos grupos ha sido difícil de tratar por los taxónomos
(Momen 2001). En la siguiente sección veremos cómo ha sido el avance en este aspecto
de los géneros de los llamados trypanosomatides inferiores, con énfasis en el género
Phytomonas.
1.2. Problemas taxonómicos del género.
El primer criterio utilizado para la caracterización del género Phytomonas, como vimos
anteriormente, fue el planteado por Donovan, basado en la naturaleza del hospedero no
invertebrado, las plantas. Uno de los problemas que tiene este criterio es que existen
especies de otros géneros normalmente monogenéticos que pueden proliferar en plantas
de manera ocasional (Conchon et al. 1989). Posteriormente Wallace (1979) propone
sumar otro criterio al de hospedero, basándose en los estadios morfológicos de los
trypanosomatides (Tabla 1) establecidos por Vickerman (1976) .
Wallace define entonces a los géneros monogenéticos y las Phytomonas del siguiente
modo: Leptomonas, promastigotes parásitos de animales invertebrados; Herpetomonas,
promastigotes parásitos de insectos que también pueden tener la forma opistomastigote;
Blastocrithidia, epistomastigotes parásitos de animales invertebrados; Crithidia,
coanomastigotes parásitos de animales invertebrados; Rhynchoidomonas, parásitos de
insectos con forma trypomastigote de extremos punteagudos; Phytomonas, promastigotes
parásitos de plantas e insectos. Además acota que algunas especies de Leptomonas y
Blastocrithidia presentan formas de resistencia, tipo esporas, denominadas cistos
(Wallace et al. 1992).
Este nuevo criterio de Wallace basado en la morfología permite entonces distinguir
a las Phytomonas de los géneros Blastocrithidia, Crithidia y Rhynchoidomonas, pero
sigue siendo oscura la separación entre Leptomonas, Herpetomonas y Phytomonas dado
que los tres géneros parasitan insectos y presentan la forma promastigote a excepción de
la ocurrencia eventual del estadio opistomastigote en Herpetomonas. Esta condición,
sumada al hecho de que ocasionalmente especies de los géneros Leptomonas y
Herpetomonas pueden proliferar en plantas (Conchon et al. 1989, Teixeira et al. 1996)
evidencian la insuficiencia de este criterio para la caracterización taxonómica del género
Phytomonas.
Para complicar un poco más el panorama, se han reportado en Phytomonas, aunque de
manera aislada, la ocurrencia eventual de los estadios: amastigote y coanomastigote
(Jankevicius et al. 1989, Camargo 1999).
Tabla 1. Estadios morfológicos de los trypanosomatides.
Estadio Definición Esquema
Promastigote Formas elongadas con el kinetoplasto anterior al núcleo, el flagelo originado cerca del kinetoplasto emergiendo por el extremo anterior, estando el extremo anterior definido por la dirección hacia la cual la movilidad tiene lugar.
Opistomastigote
Formas elongadas con el kinetoplasto en posición posterior al núcleo, el flagelo naciendo próximo al kinetoplasto y atravesando el cuerpo hasta emerger por el extremo anterior.
Amastigote Formas redondeadas o elongadas carentes de un flagelo externo.
Epistomastigote
Formas elongadas con el kinetoplasto cercano al núcleo, la base del flagelo cerca del kinetoplasto emergiendo de un lado del cuerpo celular adosado a la superficie hasta el extremo anterior a partir del cual se extiende quedando una porción de flagelo libre.
Trypomastigote
Formas elongadas con el kinetoplasto en posición posterior al núcleo, con la base del flagelo próximo al kinetoplasto y emergiendo lateralmente formando una membrana ondulante hasta el extremo anterior, a partir de donde puede o no quedar una porción libre de éste.
Coanomastigote
Forma corta y relativamente corpulenta con el kinetoplasto cercano al núcleo y usualmente anterior a éste, con el flagelo emergiendo de una especie de reservorio que se abre hacia el amplio extremo anterior.
Esferomastigote
Formas redondeadas con el flagelo libre.
Tomado de Wallace, Roitman & Camargo 1992.
Para solventar estos problemas, desde finales de los años 80 del pasado siglo, un grupo
de investigadores, la mayoría pertenecientes al Instituto de Ciencias Biomédicas de la
Universidad de Sao Paulo Brasil, se ha abocado a la búsqueda de marcadores
bioquímicos, serológicos y moleculares, taxonómicamente válidos para la caracterización
del género, algunos de los cuales se reseñan a continuación.
Entre los nuevos marcadores que se han desarrollado para caracterizar al género
Phytomonas, tenemos el marcador bioquímico que consiste en la carencia en
Phytomonas y Herpetomonas de una enzima del metabolismo ornitina-arginina, la
arginasa (Camargo et al. 1987), lo que permite separar a estos dos géneros del resto de
los tripanosomatides, pero es aún insuficiente para la discriminación del género
Phytomonas.
Dentro de los marcadores serológicos se encuentra el desarrollo de anticuerpos
monoclonales específicos para Phytomonas (Teixeira et al. 1989, 1995) los cuales han
sido probados con relativo éxito en una cantidad importante de aislados, con la dificultad
de que no todos los anticuerpos desarrollados reconocen a todos los aislados de
Phytomonas probados, de modo que hay que hacer uso de una batería de estos
anticuerpos para un escrutinio mas o menos exhaustivo, lo que lo hace costoso y poco
práctico además de que nada asegura que no se esté dejando por fuera a algunos aislados
de Phytomonas incapaces de ser reconocidos por la batería de anticuerpos utilizada.
Entre los marcadores moleculares género-específicos encontrados se destacan en
primer lugar, la carencia en Phytomonas del sitio de restricción Pvu II a 360 pb aguas
arriba del extremo 5’ de la subunidad 18S del ADN ribosomal, el cual se encuentra
presente en Crithidia y Herpetomonas y puede encontrarse o no en Leptomonas
(Camargo et al. 1992). Este marcador es útil siempre que pueda ser complementado con
la información del marcador bioquímico anteriormente descrito para permitir la
discriminación entre los géneros Leptomonas y Phytomonas.
En segundo lugar se encuentra el diseño realizado por Teixeira et al. (1996) de un
oligonucleótido que funciona como sonda específica para Phytomonas, derivada del gen
que codifica para el ARN Spliced Leader (SL) involucrado en la maduración del ARN
mensajero mediante el proceso conocido como trans-splicing que presentan todos los
trypanosomatides. Aunque esta sonda evidentemente no puede ser utilizada para
discriminar entre todos los llamados trypanosomatides inferiores, resulta un excelente
marcador para el género Phytomonas.
Por último, buscando métodos más simples y rápidos para la identificación de estos
flagelados Serrano et al. (1999) diseñan una prueba de PCR con oligonucleótidos que
permiten la amplificación del gen Spliced Leader (SL) de manera específica para el
género Phytomonas, esta resulta ser la prueba más sencilla y económica disponible hasta
el momento para identificar este género.
Los organismos del género Phytomonas pueden ser subdivididos en tres grupos de
acuerdo con el tropismo hacia el tipo de tejido de la planta en el que proliferan
naturalmente, así tenemos: los que crecen en los tubos laticíferos de plantas con látex
denominados laticícolas, los que proliferan en el floema llamados floemícolas y los que
se encuentran en frutos llamados frutícolas (Dollet 1994). Esta subdivisión del género se
ve apoyada por diferencias en perfiles isoenzimáticos (Vainstein et al. 1987, Guerrini et
al. 1992, Muller et al. 1994, Fernandez-Becerra et al. 1996), parámetros del ADN del
kinetoplasto (Fernandez-Becerra et al. 1996; Ahomadegbe et al. 1990, 1992; Muller et
al. 1995) y propiedades de los cultivos (Dollet 1994).
De estos tres grupos sólo los floemícolas están claramente asociados a patologías
sistémicas en plantas, mientras que los frutícolas causan daño de manera localizada en
frutos, disminuyendo su valor comercial (Dollet 1993).
1.3. Distribución geográfica.
El género Phytomonas, aunque presenta una amplia distribución geográfica es
predominantemente tropical y subtropical (Wallace et al. 1992). Ha sido reportado en todos
los continentes, entre los 51°30’ de latitud Norte y los 50° de latitud Sur, con un rango
altitudinal que va desde el nivel del mar hasta los 2340 m.s.n.m. (Dollet 1984). Se diría que
es cosmopolita pero hasta el momento no ha habido reportes en la Antártica, China ni Japón
(Wallace et al. 1992).
En las plantas con látex existen reportes de Phytomonas de las siguientes regiones:
Mauricio, Africa (del Norte, del Sur, Oriental, Occidental y Central), Madagascar, Islas
Comoro y Reunion, Europa, Rusia, América (del Norte, del Sur y Central), Islas del
Caribe, Islas del Pacífico, Australia e India (Camargo 1999).
Las Phytomonas floemícolas asociadas a enfermedades sistémicas de plantas tienen una
distribución netamente neotropical, los flagelados asociados a la necrosis del floema en
café sólo se han encontrado en Surinam y zonas adyacentes de Brasil y Guyana, mientras
que los asociados a la marchitez en palmas tienen una distribución un poco más amplia
abarcando toda la zona continental norte de Sur América y Centro América y la isla
caribeña de Trinidad (Wallace et al. 1992). El caso más reciente de la Zingiberaceae
Alpinia purpurata se restringe, hasta el momento, a la isla caribeña de Grenada (Dollet et
al. 2001).
1.4. Ciclo de vida.
Como hemos adelantado, el ciclo de vida del género Phytomonas involucra a dos
hospedadores, un hospedador vegetal que puede pertenecer a una amplia gama de
familias de angiospermas y a un hospedador invertebrado, insecto, del orden Hemiptera.
Hasta el momento sólo cinco estudios han descrito el ciclo de vida de Phytomonas.
França (1920) describe el ciclo de P. davidi en Euphorbia peplus y el insecto
Stenocephalus agilis, más tarde Holmes (1930) y McGhee & Hanson (1964) describen el
ciclo de vida de P. elmassiani en Asclepias y Oncopeltus fasciatus, luego Vickerman
(1962) estudia el ciclo de vida de P. elmassiani en Pergularia extensa (Asclepiadaceae)
y Oncopeltus famelicus y más recientemente Jankevicius et al. (1989) describe el ciclo
de vida de P. serpens en el tomate y el insecto Phthia picta. Aunque todas estas
descripciones concuerdan en la mayoría de los aspectos, debido a que es la de McGhee &
Hanson (1964) la más completa, será ésta la que tomaremos como modelo.
En el latex de Asclepias curassavica P. elmassiani se encuentra principalmente en
la forma promastigote con un promedio de 14 µ de longitud y 2,5 µ de ancho,
pudiéndose observar promastigotes en división y algunas pocas formas amastigotes. La
transmisión hacia el insecto vector se da cuando éste se alimenta de la planta infectada
succionando el látex a través del estilete. Luego de 4 días en el insecto se encuentran en
el píloro formas similares a las encontradas en plantas pero sin dividirse y a los 6 días
se observa cierta elongación de los organismos. A los 10 días hay formas gigantes de
hasta 80 µ de longitud en el píloro y al mismo tiempo comienzan a aparecer estas
formas gigantes en el hemocele. Luego de 12 días se encuentran formas gigantes en las
glándulas salivales, después de 20 días además de las formas gigantes empiezan a verse
formas pequeñas similares a las observadas en el látex y luego de 26 días sólo hay
formas pequeñas en las glándulas salivales del insecto (McGhee & Hanson 1964). De
acuerdo con Holmes (1930) los parásitos sólo se encuentran en el lóbulo dorsal de las
glándulas salivales.
En el mismo trabajo de McGhee & Hanson (1964) se reporta la existencia de otro
flagelado, Leptomonas oncopelti, capaz de coinfectar al insecto O. fasciatus, el cual no
puede ser distinguido de P. elmassiani en la parte media del estómago del insecto pero se
hace evidente en el píloro por presentar formas císticas, lo que evidencia que es posible
encontrar infecciones mixtas de flagelados, al menos en insectos.
La reproducción de estos flagelados, como en el resto de los trypanosomatides, se da por
fisión binaria a lo largo del eje longitudinal del cuerpo celular, iniciándose la citoquinesis
por el extremo anterior (Dollet 1984). Pese a que su modo de división es
fundamentalmente asexual hay algunas evidencias que sugieren la existencia de eventos
sexuales en al menos algunas especies de este grupo (Souza 1997), pero la naturaleza y
frecuencia de estos eventos aún se desconocen.
1.5. Especies de Phytomonas.
La caracterización de las especies de Phytomonas se ha realizado tradicionalmente
de acuerdo con dos criterios: la especificidad de los flagelados hacia el grupo de plantas
hospederas y las diferencias morfométricas entre los distintos aislados (Wallace et al.
1992), pese a que estos caracteres no son considerados del todo satisfactorios, de acuerdo
con ellos actualmente se reconocen las especies detalladas en la tabla 2.
El hecho de que se aíslen flagelados de distintos hospederos no necesariamente implica
una diferencia especie-específica entre éstos, este punto se ve reforzado por estudios en
los que flagelados tomados de una especie de planta pueden experimentalmente infectar
y colonizar a otros grupos (Conchon et al. 1989, McGhee & Hanson 1971), sin embargo
este criterio presenta algún valor si se toma en cuenta la especificidad del hospedero a
nivel de Familia u Orden (Wallace et al. 1992).
Tabla 2. Especies de Phytomonas reconocidas actualmente.
Hospedero original Especie de Phytomonas Tipoa
EuphorbiaceaeEuphorbia pilulifera Phytomonas davidi (Lafont 1909) Donovan 1909 L Manihot esculenta Phytomonas francai Aragao 1927 L Euphorbia tirucalli Phytomonas tirucalli Reichenow 1940 L
AsclepiadaceaeAraujia angustifolia Phytomonas elmassiani (Migone 1916) Wenyon 1926 L Morrenia odorata Phytomonas bordasi (França 1921) Wenyon 1926 L
MoraceaeFicus edulis Phytomonas ficuum (Fantham 1925) Camargo et al. 1990 L Ficus hochstetteri Phytomonas ganorae (Franchini 1931) Camargo et al. 1990 L Ficus opposita Phytomonas bancrofti (Holmes 1931) McGhee & McGhee 1979 L Ficus costarricana Phytomonas tortuosa Ruíz 1958 L
Rubiaceae
Coffea liberica Phytomonas leptovassorum Stahel 1931 F
Arecaceae (Palmae)
Cocos nucifera Phytomonas staheli McGhee & McGhee 1979 F
Solanaceae Lycopersicon esculentum
Phytomonas serpens (Gibbs 1957) Podlipaev 1986 Fru
Poaceae (Gramineae)
En cuanto a las diferencias morfológicas es importante recalcar que, a pesar de que en
estos flagelados predomina la forma promastigote, presentan una gran variabilidad
morfológica, prueba de ello es el registro de las distintas formas de P. serpens (Fig. 1)
Figura 1.Variedad morfológica de Phytomonas serpens cepa 9T.1-10, en tomate; 11-15, cultivo en medio bifásico; 16-21, cultivo maduro en medio LIT (tomado de Jankevicius et al. 1989).
realizado por Jankevicius et al. (1989), de modo que las diferencias morfológicas
tampoco resultan concluyentes. El mismo aislado puede presentar características
morfológicas en una planta que varían notablemente al crecer y desarrollarse en otra
planta (McGhee & Hanson 1971) de manera que en términos generales éste se considera
un criterio bastante más pobre a nivel taxonómico que el anterior.
Recientemente se han estado aplicando técnicas más modernas para la búsqueda de
caracteres ultraestructurales, bioquímicos y moleculares de valor taxonómico, que
permitan la caracterización de especies de Phytomonas, pero la data acumulada hasta el
momento no es lo suficientemente consistente para permitir una revisión seria del género
(Wallace et al. 1992, Camargo 1999). En vista de esta situación, cada vez menos
investigadores osan asignarle el epíteto específico a sus aislados, prefiriendo
caracterizarlo de acuerdo con un código que toma en cuenta el hospedero, origen
geográfico y fecha de colección (Dollet 1994).
1.6. Vectores.
Uno de los aspectos menos estudiados hasta el momento respecto a los flagelados
de plantas es justamente el que atañe a los insectos vectores, lo que ha constituido un
problema a la hora de establecer estrategias de control de las patologías que se observan
en los cultivos de palmas y otras plantas, asociadas a flagelados (Camargo 1999).
Los vectores de trypanosomatides de plantas son insectos fitófagos relativamente
grandes, a menudo presentes en gran número, de colores vistosos y frecuentemente
poseen flagelados en sus órganos digestivos. Los grupos de insectos hasta ahora
asociados a plantas infectadas con flagelados se limitan a tres familias del Orden
Hemiptera: Ligaeidae, Coreidae y Pentatomidae (Camargo & Wallace 1994). Las
especies pertenecientes a esos grupos se detallan en la tabla 3.
Gran parte de las asociaciones insecto-planta-parásito se han planteado basándose en
observaciones regulares y relativamente pocas han sido demostradas experimentalmente.
Por otra parte la mayoría de los ensayos que intentan comprobar estas relaciones se han
llevado a cabo con plantas e insectos silvestres colectados en el campo, de los que
difícilmente podría asegurarse su carencia de flagelados inicial antes de la realización de
los ensayos de infección (Dollet 1984).
Tabla 3. Insectos del Orden Hemiptera asociados a plantas infectadas con flagelados.
Especie de Phytomonas Planta Insecto Familia
Oncopeltus fasciculatus Oncopeltus sandarachatus Oncopeltus cingulifer Oncopeltus unifasciatellus
P. elmassiani Asclepias spp.
Lygaeus kalmii
Lygaeide
P. davidi Pergularia extensa Oncopeltus famelicus Euphorbia pilulifera Nysius euphorbiae Euphorbia hypericifolia Nysius euphorbiae Euphorbia hirta Dieuches humilis
Lygaeide
Euphorbia pinea Dicranocephalus agilis Euphorbia peplus Dicranocephalus agilis Euphorbia pilulifera Pachybrachius bilobata scutellatus
Euphorbia hypericifolia Pachybrachius bilobata
Coreidae
Phytomonas sp. Euphorbia hirta Pachybrachius bilobata Cecropia palmata Edessa loxdali Pentatomidae
Lincus lethifer Elaeis guineensisLincus lobuliger
P. staheli
Cocos nucifera Lincus croupius Pentatomidae
Lycopersicon esculenta Nezara viridula Pentatomidae P. serpens Phthia picta Coreidae
Tomado de Camargo & Wallace 1994.
Entre los trabajos que intentan demostrar el rol de vector de algunos insectos se destacan
los realizados por McGhee & Hanson entre 1960 y 1970 que relacionan a Oncopeltus
fasciatus con la transmisión de flagelados hacia Asclepias curassavica y viceversa
(McGhee & Hanson 1971). Kastelein (1985) hace otro tanto al poner en evidencia la
relación entre Edessa loxdali en la transmisión de Phytomonas hacia Cecropia palmata.
Trabajos posteriores demuestran que las infecciones de flagelados en palmas son
transmitidas por insectos del género Lincus (Perthius et al. 1985, Louise et al. 1986). El
trabajo más completo llevado a cabo con plantas e insectos cultivados en laboratorio ha
sido el de Jankevicius et al. (1989) quienes demuestran la transmisión de P. serpens por
Phthia picta en Lycopersicon esculentum (tomate).
Es de esperarse que a la luz de las nuevas técnicas de detección de trypanosomatides del
género Phytomonas se estén adelantando nuevos trabajos en esta área.
1.7. Plantas hospederas.
Los trypanosomatides de plantas han sido reportados en más de 100 especies
representadas en 23 familias de angiospermas (Wallace et al. 1992). Las familias
Euphorbiaceae y Asclepiadaceae son las que contienen mayor número de especies
portadoras de flagelados (Camargo 1999). De las familias reportadas sólo tres
pertenecen a la Clase Liliopsidae (Monocotiledoneae): Arecaceae, Zingiberaceae y
Poaceae. Si se agrupan a las 23 familias de acuerdo con el tipo de Phytomonas capaz de
infectarlas veremos que sólo tres de las familias reportadas pueden tener Phytomonas de
distintos tipos: la familia Euphorbiaceae posee tanto floemícolas como laticícolas; la
familia Moraceae posee tanto laticícolas como frutícolas y la familia Fabaceae
(Leguminosae) puede presentar tanto floemícolas como frutícolas (Camargo 1999).
Tabla 4. Familias de plantas portadoras de Phytomonas.
Laticícolas Floemícolas FrutícolasApocynaceae Amaranthaceae AnacardiaceaeAsclepiadaceae Arecaceae Anonaceae Cecropiaceae Euphorbiaceae Bixaceae Euphorbiaceae Fabaceae Fabaceae Moraceae Rubiaceae Moraceae Sapotaceae Zingiberaceae Myrtaceae Oxalidaceae Pasifloraceae Poaceae Punicaceae Rosaceae Rutaceae Solanaceae Vitaceae
1.8. Evolución.
El interés en la evolución de los trypanosomatides no es nada nuevo, pero recientemente,
gracias a la data molecular generada, éste se ha visto notablemente incrementado.
Estudios recientes han revertido en buena medida la visión tradicional de la evolución de
estos flagelados, por ejemplo, los llamados trypanosomatides inferiores, que como
hemos dicho comprenden los parásitos monogenéticos de insectos y las Phytomonas han
aparecido de manera consistente como más recientes que los trypanosomas (Fernandes et
al. 1993, Maslov et al. 1994, 1996, Hollar & Maslov 1997, Hannaert et al. 1998).
Figura 2. Arbol consenso de la familia Trypanosomatidae obtenido por máxima verosimilitud, basado en la secuencia del gen que codifica para el ARN de la subunidad pequeña del ribosoma. El árbol está enraizado en el Bodonido Bodo caudatus. Las especies de los géneros Bodo, Rhynchobodo y Dimastigella pertenecen a la familia Bodonidae y Trypanoplasma borreli pertenece a la familia Cryptobidae. Bajo el árbol se encuentra la escala de distancia (0,1 sustituciones por sitio). Tomado de Hollar & Maslov (1997).
Con el fin de mostrar dónde está ubicado el género Phytomonas en relación con otros
géneros de trypanosomatides y cómo parecen estar relacionados los aislados de
Phytomonas de tropismos distintos entre sí analizaremos la Fig. 2, ésta muestra un árbol
filogenético tomado de Hollar & Maslov (1997) cuya topología es consistente con otros
trabajos de evolución molecular (Marche et al. 1995, Fernandes et al. 1993, Lukes et al.
1997).
En relación con otros géneros de trypanosomatides las Phytomonas se encuentran
ubicadas de manera consistente formando un clado junto con los géneros monogenéticos
de insectos y Leishmania, clado que deja por fuera al género Trypanosoma.
Por otra parte el género Phytomonas se encuentra filogenéticamente más cerca de
Herpetomonas que de cualquier otro de los géneros incluidos en el árbol, tanto en este
como en otros trabajos (Camargo 1999).
El hecho de que los distintos aislados de Phytomonas con tropismos hacia diferentes
tejidos de la planta aparezcan formando cada uno un clado diferente en la Fig. 2 sugiere
que conforman tres grupos naturales. Sin embargo, tomando en cuenta que en ese estudio
sólo se han agrupado aislados provenientes de hospederos similares (frutícolas todos de
tomate, laticícolas todos del género Euphorbia y sólo un aislado floemícola), esta
separación no resulta del todo concluyente y sólo sirve para apoyar la hipótesis de que
este género es monofilético (todos los aislados del género, independientemente del
tropismo, aparecen agrupados en un único clado con exclusividad).
Existen algunos trabajos orientados en este sentido, por ejemplo Dollet (2001)
realiza un trabajo donde propone que las Phytomonas floemícolas forman un grupo
monofilético basándose en distintas características moleculares. Sin embargo este
esfuerzo no ha sido igualmente dirigido hacia los otros grupos.
Para poner a prueba la hipótesis filogenética que separa a los tipos de Phytomonas en tres
grupos naturales mediante un análisis de secuencia, convendría realizar un estudio con el
mismo u otro marcador genético, incluyendo aislados de cada grupo que provengan de
hospederos pertenecientes a distintas familias -si es posible- o al menos a distintos
géneros de plantas, incluyendo además muestras tomadas de insectos (asociados a
determinados grupos de plantas).
1.9. Patogénesis y Phytomonas en plantas laticíferas.
Debido a que la mayoría de las especies de plantas laticíferas hospederas de Phytomonas
pertenecen a las familias Euphorbiaceae y Asclepiadaceae, gran parte de los trabajos que
abordan la patogenicidad del género Phytomonas en plantas con látex se concentren en
géneros de estas familias.
Las infecciones en plantas laticíferas pueden ser sistémicas o más comúnmente
localizadas, esto último debido al modo como están organizados los tubos laticíferos en
la planta. En los géneros de las familias Euphorbiaceae y Asclepiadaceae donde se ha
registrado infección de Phytomonas los sistemas laticíferos son no-articulados
(unicelulares). Estos laticíferos consisten de largas células multinucleadas que pueden
estar ramificadas o no y que nunca establecen comunicación con otras células laticíferas
(Mauseth 1988), gracias a esto las infecciones pueden estar confinadas a una rama o
sector del tallo. De acuerdo con França (1914) otra de las razones por las que puede
verse restringida la infección es por la embolia causada por la acumulación de flagelados
o por coagulación del látex.
El problema de si las Phytomonas pueden considerarse patógenos de las plantas con látex
o no ha sido ampliamente debatido, sin embargo actualmente hay un consenso creciente
en que la mayoría de las especies no son patogénicas para las plantas laticíferas. França
(1914) reporta que el látex de plantas infectadas tiene un aspecto más acuoso y posee
menos gránulos de almidón que las plantas libres de infección. Otros autores no
encuentran evidencia de patogenicidad claramente asociada a estos flagelados para este
tipo de plantas (Wallace et al. 1992).
Un trabajo que aporta algo de luz en esta área es el realizado por Dollet y Gargani
(1989) en donde encuentran Phytomonas en plantas de Asclepias curassavica del
Ecuador sanas y enfermas, mientras que paralelamente las examinan en búsqueda de
partículas virales. En ese trabajo encuentran que las partículas virales sólo se encuentran
presentes en las plantas enfermas, por lo que no hay que descartar entonces la posibilidad
de que infecciones concomitantes con otros patógenos sean las responsables de los casos
en los que se desarrolla enfermedad en este tipo de plantas.
En el caso de las infecciones en yuca (Manihot palmata = Manihot esculenta) hay un
claro desarrollo de enfermedad cuyos síntomas principales son: clorosis en la parte aérea
de la planta y atrofia de las raíces. Esta enfermedad, que conlleva a una disminución
significativa de la capacidad de almacenamiento de las raíces (órgano de importancia
económica como alimento), se ha denominado chochamento das raizes (vaciamiento de
las raíces). Este suceso reportado en Brasil, asociado a Phytomonas françai, es único en
su patogenicidad y conviene considerarlo como un caso aparte del resto de las plantas
laticíferas (Wallace et al. 1992).
2. Relación parásito hospedador.
En el sistema flagelado-vector-planta pueden distinguirse dos grandes relaciones parásito
hospedador, uno es el formado por el dúo vector-parásito y el otro el compuesto por el par
parásito-planta, es de este último subsistema del que nos ocuparemos. En la relación
parásito-planta se pueden distinguir a su vez dos aspectos que en conjunto definen los
términos en los que se da la relación. Por una parte están las estrategias de
establecimiento y multiplicación del flagelado dentro de la planta y por la otra, su
contraparte, las estrategias de control de la infección por parte de la planta de modo que
se asegure un funcionamiento lo suficientemente favorable para que le sea permitido
completar su ciclo de vida.
Debido a que los tejidos involucrados en el caso de los flagelados floemícolas, frutícolas
y laticícolas son marcadamente distintos, es de esperarse que el tipo de respuesta
implicada en tales asociaciones también lo sea, aunque ésta siempre estará sujeta a la
versatilidad defensiva propia de la familia, género y especie de la planta involucrada, así
como del aislado del flagelado implicado. En este trabajo nos proponemos dilucidar
algunas de las estrategias químicas de control de la infección causada por Phytomonas
que podrían estar desplegando algunas plantas locales con látex.
Vale la pena aclarar que en este trabajo se está utilizando el término parásito de manera
laxa para designar a organismos que no son de vida libre. Con el término no se pretende
hacer ningún tipo de juicio respecto al tipo de asociación que el organismo presenta con
su hospedador, pues como hemos dicho, en la relación Phytomonas-plantas con látex no
se ha podido establecer claramente si hay beneficios o daños en las plantas asociadas a
este tipo de organismo, o si éste es por completo inocuo para el hospedador.
2.1. Defensa en plantas.
Las plantas se encuentran expuestas a lo largo de toda su existencia al ataque de
una amplia variedad de microorganismos potencialmente patógenos, insectos
predadores y otras pestes. Para lidiar contra todas estas amenazas han desarrollado
una serie de sistemas defensivos basados en barreras mecánico-estructurales y
químicas además de la capacidad para responder metabólicamente de manera activa
ante ciertos desafíos (Walton 1997). En el sistema que nos ocupa, las barreras
mecánico-estructurales que normalmente evitan la entrada de microorganismos en las
plantas, son burladas por el insecto vector, con su aparato bucal perfectamente
adaptado para tal fin.
El uso de barreras estructurales que limiten espacialmente la infección y el
despliegue de barreras químicas son las únicas armas que poseen las plantas que
estudiaremos para mantener a raya la infección de flagelados. De estos dos tipos de
barreras nos concentraremos exclusivamente en las químicas.
La defensa en plantas resulta de la acción combinada de distintos factores, de modo
que es un fenómeno complejo. Una distinción principal en cuanto a las sustancias
asociadas con defensa es que éstas pueden encontrarse en la planta antes del contacto
con el agente invasor, es decir, de manera constitutiva o pueden ser inducibles,
sintetizándose luego de que se ha percibido el contacto con el organismo extraño.
Estas sustancias constitutivas e inducibles pueden ser subdivididas a su vez en dos
tipos, las implicadas en defensa estructural, basada en cambios de caracteres
anatómicos que involucran cambios en la pared celular, la permeabilidad o el acceso
hacia un tejido y las implicadas en defensa química, basada en sustancias
biológicamente activas de alto y bajo peso molecular. Es importante aclarar que estas
categorías de sustancias no son del todo absolutas, por ejemplo, sustancias
constitutivas pueden ser producidas en mayor cantidad luego del contacto con el
agente invasor gracias a una respuesta activa y sustancias biológicamente activas son
necesarias para el proceso de polimerización de compuestos estructurales (Shewry &
Lucas 1997).
Dentro de las sustancias químicas asociadas a la defensa podemos separar las de
naturaleza proteica de las no proteicas. Los componentes no proteicos asociados a
defensa también llamados metabolitos secundarios, incluyen una amplia variedad de
compuestos, entre los que tenemos: terpenos, compuestos fenólicos, taninos,
flavonoides, alcaloides, aminoácidos no proteicos, especies de oxigeno activo y
fitoalexinas (Dixon 1986, Levine et al. 1994). Las fitoalexinas son sustancias de bajo
peso molecular químicamente diversas con actividad antimicrobiana, que son
sintetizadas de novo luego del contacto con el agente extraño (Walton 1997). Debido
a que en este trabajo nos concentraremos en algunas de las sustancias proteicas
asociadas a la defensa, trataremos este punto en la siguiente sección.
2.2. Proteínas asociadas a la defensa.
Podemos ordenar a las principales proteínas asociadas a la defensa en cinco
grandes grupos de acuerdo con su función. El primer grupo esta conformado por la
hidrolasas, que incluyen: proteasas o peptidasas que son enzimas capaces de
hidrolizar los enlaces peptídicos en sitios específicos de las proteínas modificando su
estructura y como consecuencia en el caso de enzimas, su actividad catalítica;
quitinasas, que son enzimas que hidrolizan los enlaces glicosídicos de los polímeros
de n-acetil-glucosamina que conforman la quitina, componente principal de la pared
celular de los hongos, glucanasas, las que hidrolizan los enlaces glicosídicos de
polímeros de glucanos, componentes de la pared celular de bacterias (Bowles 1990) y
proteínas inactivadoras de ribosomas, las cuales son glicosidasas que escinden el
enlace n-glicosídico de adenina en secuencias específicas del ARN de ribosomas
eucarióticos extraños a la planta, incapacitándolos para llevar a cabo la elongación de
proteínas (Stirpe & Barbieri 1986).
El segundo grupo contiene inhibidores enzimáticos, entre los que se destacan los
inhibidores de proteasas que están dirigidos hacia las proteasas del patógeno,
inhibidores de amilasas que impiden la degradación de almidón por parte del atacante,
herbívoro o parásito e inhibidores de poligalactorunasas, los cuales inhiben la acción
de enzimas que degradan la pared celular vegetal (Bowles 1990, Shewry & Lucas 1997).
Un tercer grupo lo conforman las proteínas tóxicas que incluyen: lectinas que son
proteínas capaces de reconocer azúcares de manera específica y producir aglutinamiento
celular y tioninas, proteínas básicas de bajo peso molecular (5kDa) de las que se
sospecha poseen actividad tioredoxina reduciendo proteínas que pueden perder su
actividad o hacerse más susceptibles a proteasas (Bowles 1990, Shewry & Lucas 1997).
El cuarto grupo está conformado por las enzimas de los últimos pasos de la vía
biosintética de fitoalexinas (Bowles 1990) y el quinto y último grupo contiene las
llamadas proteínas relacionadas con la patogénesis (pathogenesis-related proteins o
PR-proteins), las cuales son de bajo peso molecular y por lo general inducibles, de las
que hasta ahora se conocen 13 familias con funciones diversas (Hoffmann-
Sommergruber 2000).
En este estudio nos enfocaremos únicamente en tres tipos de proteínas, las
proteasas, inhibidores de proteasas y lectinas, gracias a que contamos con la
infraestructura para aplicar las técnicas de detección de este tipo de proteínas.
2.2.1. Proteasas.
Las proteasas o peptidasas son enzimas capaces de hidrolizar los enlaces
peptídicos de las proteínas modificando su estructura y en el caso de enzimas, su
actividad catalítica. Estas enzimas pueden clasificarse de acuerdo con distintos
criterios y uno de los más utilizados es su mecanismo de acción y dependencia de
metales para su funcionamiento. En la tabla 5 pueden apreciarse las familias de
proteasas reconocidas actualmente, aunque hay que decir que se han aislado e
identificado muchas otras enzimas proteolíticas que no se ajustan a esta clasificación
(Neurath 1989).
Tabla 5. Familias de enzimas proteolíticas.
Familia Proteasas representativas Residuos característicos del sitio activoa
Serínproteasa I Quimotripsina Tripsina Elastasa Kalicreina pancreática
Asp102, Ser195, His57
Serínproteasa II Subtilisina Asp32, Ser221, His64 Cisteín-proteasas Papaína
Actinidina Catepsinas de hígado de rata B y H
Cys25, His159, Asp158
Aspárticoproteasas Penicilopepsina Acido proteasas de Rhizopus chineses y Endothia parasitica Renina
Asp 33, Asp213
Metaloproteasas I Carboxipeptidasa bovina A Zn, Glu270, Try248
Metaloproteasas II Termolisina Zn, Glu143, His231 aEl número del residuo corresponde a la secuencia de aminoácidos de las proteasas en negrilla. Tomado de Neurath 1989.
La proteólisis es un proceso esencial en muchos aspectos fisiológicos y de
desarrollo de las plantas. Es responsable del mantenimiento celular y de la respuesta
al estrés mediante procesos como: la degradación de proteínas defectuosas o
extrañas, el reciclaje de aminoácidos necesarios para sintetizar nuevas proteínas y la
maduración de zimógenos y hormonas peptídicas mediante cortes en enlaces
específicos. También es fundamental en el control del desarrollo y metabolismo
mediante la reducción de enzimas clave y proteínas reguladoras, además de participar
en la muerte celular programada de células en tejidos y órganos específicos (Vierstra
1996, Beers et al. 2000).
Una de las especies de plantas con látex en las que se ha estudiado el posible
rol defensivo de sus proteasas es Carica papaya. En esta planta se conocen hasta el
momento 4 tipos de proteasas: papaína, quimopapaína, karicaína y glicil-
endopeptidasa o proteinasa IV de papaya, todas pertenecientes a la familia de las
cisteínproteasas, constituyendo en conjunto el 80% del total de proteínas del látex.
De estas proteasas se conocen su secuencia aminoacídica y la secuencia
correspondiente a su ADNc lo que permite saber que son sintetizadas como
proenzimas, con las formas maduras conteniendo 212-218 aminoácidos precedidas
por una prosecuencia de 106-108 residuos y las cuatro presentan un alto grado de
homología. Se ha demostrado que in vivo, la conversión de la forma inactiva a la
activa ocurre cuando el látex es expelido de los laticíferos, alcanzando un máximo
de actividad en menos de 2 min. luego del daño al sistema laticífero. Paralelamente
a este proceso se van haciendo visibles los primeros síntomas de coagulación del
látex, lo que sugiere que estas proteasas también están implicadas en esta
transformación considerada como de primera línea en la defensa contra patógenos
en plantas con látex pues los coágulos del látex sellan las heridas evitando la
entrada de éstos (Silva et al. 1997, Moutim et al. 1999, El Moussaoui et al. 2001).
Tabla 6. Datos de proteasas de Euphorbias, euphorbaínas.
Inhibidor de serínproteasa Euphorbaína
DFP PMSF Antitripsina
DEPC Sustrato pH opt. PM
(kDa)
1 i n --- i Azocaseína 7,0 - 7,5 43 p i i --- --- Azocaseína 7,0 74 y1 i --- i i Azocaseína 6,5 - 7,0 67 y2 --- --- i --- Azocaseína 6,5 – 7,0 33 y3 --- --- i --- Ester 7,0 67
t1 --- i n i Azocolágeno 7,5 74
t2 --- i n i Ester 7,5 74
t3 --- --- n i Azocolágeno 7,5 – 8,0 74
t4 --- i n i Ester 6,0 – 6,5 74 d1 --- i --- i Ester 6,3 – 7,8 117 d2 --- i --- i Ester 6,5 – 7,8 65 la1 i --- ip i Azocaseína 7,5 66 la2 i --- --- i --- --- 44 la3 --- --- --- --- --- --- 33 lc i ip --- i Ester 8,3 70
i = inhibe, ip = inhibe parcialmente, n = no inhibe, --- = no se midió Ester: carbobenzonxi glicin p-nitrofenilester. Realizada con datos acopiados por Lynn & Clevette-Radford 1988
En la familia Euphorbiaceae se han encontrado 17 proteasas de 8 especies de
plantas, a saber: hevaínas b y 1 de Hevea brasiliensis, euphorbaínas d1 y d2 de
Elaeophorbia drupifera, euphorbaína 1 de Euphorbia lathyris, p de E. pulcherrima,
y1, y2 y y3 de E. cyparissias, t1, t2, t3 y t4 de E. tirucalli, la1, la2 y la3 de E. lactea y lc
de E. lactea cristata. La mayoría de estas proteasas perdieron su actividad al
someterse a los efectos de inhibidores de serínproteasas y a un agente específico para
histidina (DEPC) lo que implica que poseen un residuo de serina y otro de histidina
en su sitio activo, es decir son serínproteasas. Sin embargo, estas varían en cuanto a
su peso molecular (de 33 a 117 kDa con la mayoría entre 60 y 80 kDa) y muestran
diferencias en su capacidad para degradar distintos sustratos (Lynn & Clevette-
Radford 1988). En la tabla 6 se muestran algunos datos de las euphorbaínas
encontradas hasta ahora.
Lamentablemente hasta el momento no se han publicado estudios sobre el
posible rol de estas euphorbaínas en los mecanismos de defensa de estas
euphorbiáceas y aunque no debe descartarse la idea de que funcionen de modo
similar a las encontradas en papaya, puede que estén involucradas en mecanismos
totalmente diferentes.
2.2.2. Inhibidores de proteasas.
Los inhibidores de enzimas hidrolíticas, proteasas y amilasas, son de las proteínas
asociadas a defensa relativamente más estudiadas, por lo general son constitutivas
y tejido específicas, aunque su expresión puede aumentar luego del ataque de
patógenos (El Moussaoui et al. 2001). Estos inhibidores enzimáticos se clasifican
en familias de acuerdo con su secuencia de aminoácidos y especificidad, pues
comúnmente su efecto inhibitorio se restringe a proteasas cuyos mecanismos de
reacción son similares (Shewry & Lucas 1997). Entre los inhibidores de proteasas
más comunes en plantas se encuentran los que inhiben serínproteasas tales como
tripsina, quimotripsina y subtilisina, además éstas pueden ser bifuncionales
siendo capaces de inhibir amilasas además de proteasas (Richardson 1991). En la
tabla 7 se detallan las principales familias de inhibidores de proteasas de plantas.
En términos defensivos los inhibidores de proteasas están dirigidos hacia
proteasas exógenas, a menudo reduciendo la actividad de proteasas digestivas de
herbívoros (disminuyendo su palatabilidad) o secretadas por microorganismos
que las utilizan como parte de su estrategia de dispersión dentro de la planta,
pudiendo además resultar tóxicas para algunas larvas de invertebrados (El
Moussaoui et al. 2001, Lorito et al. 1994). Actualmente es común que especies
mejoradas genéticamente contengan inhibidores de proteasas exógenas muy
eficientes que les confieren resistencia hacia pestes (Shewry & Lucas 1997).
Tabla 7. Familias de inhibidores de proteasas en plantas.
Monómero Familia
PM (kDa) Cys
Enzimas inhibidas Distribución
Afinidad con otras familias
1. Bowman-Birk 8-9 (14) 14 (18)
Tripsina Quimotripsina Elastasa
Leguminosae Graminae 6, 7
2. Kunitz 21-22 4
Tripsina Quimotripsina Subtilisina Kalikreina
Leguminosae Graminae Araceae Alismataceae
8
3. Potato I 8-9 0-2 Quimotripsina Tripsina Subtilisina
Solanaceae Graminae Leguminosae Polygonaceae Cucurbitaceae
---
4. Potato II 6 (12) 8 Tripsina Quimotripsina Solanaceae 7, 9
5. Cucurbita 3 6 Tripsina Factor Hageman Cucurbitaceae ---
6. Superfamilia de cereales 12-13 10
Amilasa Tripsina Factor Hageman
Graminae Cruciferea Euphorbiaceae Lecythidaceae Leguminosae
1
7. Thaumatin-PR 22-23 16 Amilasa
Tripsina Gramineae Solanaceae 2, 7
8. Carboxi-peptidasa 4 6 Carboxi-
peptidasa Solanaceae 4
9. Tipo cistatina 12 0 Cisteín proteasas Graminae ---
Modificado de Richardson (1991)
No se encontró mucha información disponible sobre inhibidores de proteasas
en látex. Del látex de Carica papaya se han aislado dos ADNc que codifican para
inhibidores tipo cistatina, por lo que se presume que estos se expresan en el sistema
laticífero, sin embargo hasta el momento no se han aislado las proteínas. El único
inhibidor de proteasa aislado a partir del látex de papaya es del tipo Kunitz (El
Moussaoui et al. 2001).
2.2.3. Lectinas en plantas.
Este tipo de proteína se descubrió en extractos de semillas de Ricinus
communis en 1888 y desde entonces se ha encontrado en una amplia variedad
de especies de plantas, que cubren desde las algas más simples hasta las
plantas superiores (Etzler 1992).
Las lectinas han sido definidas tradicionalmente de manera laxa como
proteínas capaces de enlazar carbohidratos, una definición más reciente que
describe de modo más preciso a este grupo de proteínas dejando por fuera
algunas toxinas y otros tipos de proteínas que actúan de forma diferente, es la
formulada por Kocourek & Horejsi (1983) quienes proponen que “las lectinas
son proteínas de naturaleza no inmunoglobulínica capaces de reconocimiento
específico y enlace reversible hacia azúcares que forman parte de
carbohidratos complejos sin alterar la estructura covalente de los enlaces
glicosídicos de los ligandos reconocidos” (Etzler 1992). La mayoría de la
literatura que hemos consultado maneja una definición menos estricta que
esta última y también menos laxa que la primera, enfatizando la capacidad de
estas proteínas para aglutinar células y precipitar glicoconjugados.
Las lectinas pueden variar ampliamente en términos de secuencia y estructura, sin
embargo, todas poseen un dominio de 30-43 aminoácidos denominado dominio de
unión a quitina (Chitin-binding domain) que comparten con las quitinasas
diferenciándose de éstas por la carencia del dominio catalítico capaz de escindir los
enlaces glicosídicos. Hasta ahora se han caracterizado un amplio número de lectinas
de plantas, la mayoría pertenecientes a cereales, legumbres y solanaceas (Shewry &
Lucas 1997)
La amplia distribución de éstas proteínas en el reino vegetal supone que han
sido conservadas a lo largo del proceso evolutivo debido a su importancia en la
supervivencia de las plantas, sin embargo, aún se sigue debatiendo el rol biológico de
las lectinas vegetales (Etzler 1992).
En el último siglo se han propuesto una gran variedad de funciones para estas
proteínas entre las que se encuentran: defensa contra organismos patógenos y
predadores, factor de enlace en la simbiosis Rhizobium-legumbre, movilización de
materiales de reserva durante la maduración de semillas, mantenimiento del estado de
latencia de las semillas, proteínas de reserva, transporte de carbohidratos,
estimuladores mitogénicos de células embrionales, elongación de la pared celular y
reconocimiento celular polen-estigma (Etzler 1992). Algunas de estas funciones
propuestas se ven apoyadas por evidencia experimental.
Uno de los factores que apoya la idea de que en general las lectinas se
encuentran asociadas a la defensa en plantas superiores, es que de acuerdo con
trabajos recientes, buena parte de las lectinas de plantas tienen como blanco
carbohidratos ajenos a éstas (Peumans et al. 2000). Aunque azúcares simples pueden
actuar como inhibidores competitivos, las lectinas de plantas pueden mostrar una
extraordinaria especificidad hacia la forma de los oligosacáridos (Bowles 1990).
En el ámbito defensivo se ha encontrado que algunas lectinas han evidenciado
propiedades antimicrobiales (Stinissen & Peumans 1985, Chrispeels & Raikhel 1991,
Raikhel et al. 1993). Gran parte de la actividad antimicrobial encontrada es contra
hongos que contienen quitina, sin embargo también se ha encontrado la inhibición
del crecimiento de algunos hongos que carecen de quitina (Shewry & Lucas 1997).
Se ha reportado también la expresión inducida por heridas de una lectina en papa
(Bowles 1990). Del mecanismo de acción como agente antimicrobiano poco se
conoce, aparte de la capacidad de aglutinación celular que de por sí puede ser
limitante para el establecimiento y dispersión de microorganismos en la planta, se ha
propuesto que algunas de estas proteínas poseen capacidad para la inactivación de
ribosomas extraños a los de la planta (Peumans et al. 2000).
Otra clase de acciones defensivas atribuidas a las lectinas es la que afecta a
insectos y predadores vertebrados. En estos casos pueden funcionar como tóxicos
tanto de invertebrados como de vertebrados o como inhibidores de crecimiento de
larvas de insectos. En esta área se está investigando muy activamente, pues algunas
de estas lectinas tóxicas para invertebrados resultan buenas candidatas como genes de
resistencia para cultivos transgénicos (Shewry & Lucas 1997).
Aparte de algunos trabajos sobre la proteína afín a lectinas producida por
Hevea brasiliensis (caucho), la heveína, sólo hemos encontrado un trabajo sobre
lectinas en plantas con látex realizado por Barbieri et al. en 1983. En este estudio
purifican y caracterizan dos lectinas de las euphorbiáceas Hura crepitans y
Euphorbia characias y encuentran que E. characias posee una lectina
glicoprotéica con 11% de carbohidratos de 80 kDa formada por dos subunidades
idénticas de 40 kDa., mientras que H. crepitans tiene una lectina de 140 kDa
conformada por 4 subunidades de 37.5, 35.5, 31 y 29 kDa, esta lectina es capaz
de inhibir la síntesis de proteínas en lisados de reticulocitos de conejo. Las dos
lectinas encontradas mostraron capacidad hemoaglutinante de eritrocitos
humanos sin especificidad por el grupo sanguíneo, siendo inhibidas por D-
galactosa y otros carbohidratos complejos que contenían este azúcar (Barbieri et
al. 1983).
