Evaluación de fijación simbiótica de genotipos promisorios ...

Evaluación de fijación simbiótica de nitrógeno para la identificación de

genotipos promisorios en fríjol voluble (Phaseolus vulgaris L.)

Norma Constanza Barbosa Torres

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Escuela de Posgrados

Palmira, Colombia

2016

Evaluación de fijación simbiótica de nitrógeno para la identificación de

genotipos promisorios en fríjol voluble (Phaseolus vulgaris L.)

Norma Constanza Barbosa Torres

Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Agrarias

Director

Ph.D. Idupulapati M. Rao

Codirector

M.sc. Daniel Gerardo Cayón

Línea de Investigación:

Fisiología de Cultivos.

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Escuela de Posgrados

Palmira, Colombia

2016

Lema

"No pretendamos que las cosas cambien si siempre hacemos lo mismo. La creatividad nace de la angustia como el día nace de la noche. Es en la crisis que nace la inventiva, los descubrimientos y las grandes estrategias. Quien supera la crisis se supera a sí mismo sin quedar "superado"

Albert Einstein

Agradecimientos

Idupulapati M. Rao, por su dirección en este trabajo, por compartir su conocimiento y ser

el Ejemplo a seguir en la ciencia.

Steve Beebe por acogerme profesionalmente en el programa de frijol, y darme la

oportunidad para hacer este sueño realidad.

Gerado Cayón, por su dirección, apoyo, y enseñanzas durante mi formación académica y

el desarrollo de mis trabajos de grado.

Al Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) por acogerme durante estos años,

disfrutar de sus beneficios y reconocimiento. Al Fondo de Capacitación del CIAT y

CRECIAT por brindarme el apoyo financiero y el tiempo para realizar esta maestría.

Al Grupo consultivo para la Investigación Agrícola Internacional (CGIAR) y la fundación Bill

and Melinda Gates, por el financiamiento del proyecto, enmarcado en el CRP 3.5 Grain

Legumes, strategic objective 2: Identifying and promoting crop and pest management

practices for sustainable legume production. Output 3.1 strategies to optimize Biological

Nitrogen Fixation by legumes. Product Line 4: Symbiotic Nitrogen Fixation in common bean.

A mis colegas Neuza Asakawa, Elizabeth Portilla, Héctor Fabio Buendía, José Polania,

Cesar Cajiao, Mariela Rivera y por su apoyo y asistencia profesional.

A mi familia, mis padres, Tía Chela y Mi Wilder amado, por su apoyo, compañía, ánimo y

paciencia.

Resumen y Abstract IX

Resumen

Las deficiencias de Nitrógeno (N) afectan cerca del 40% de la producción de frijol común

en el mundo, causando pérdidas de alrededor de 60% en rendimiento. Es sabido que los

frijoles de hábito voluble tienen una mayor habilidad para fijar N atmosférico que los frijoles

de tipo arbustivo, a través de Fijación Simbiótica de Nitrógeno (FSN). Uno de los

principales factores en la eficiencia de FSN es el genotipo de la planta. Los objetivos

principales de este estudio fueron: i) cuantificar la variación genotípica de la habilidad en

FSN; ii) identificar genotipos promisorios de frijol voluble en FSN que combinen con buen

rendimiento y puedan servir como padres en el programa de mejoramiento genético y iii)

validar el uso de 15N en grano como metodología para la cuantificación de FSN. Un total

de 100 genotipos de frijol voluble fueron evaluados en su habilidad FSN. Los ensayos

fueron realizados en dos localidades en Colombia (Darién y Popayán) con inoculación de

Rhizobium tropici cepa CIAT 899 además de suministro óptimo de agua y nutrientes

excepto N. Las determinaciones incluían la evaluación visual de nodulación, determinación

de abundancia natural de 15N en biomasa de copa y grano, % N derivado de la atmosfera

(%Ndfa), N total fijado por hectárea (Ndfa total), biomasa aérea, N total derivado del suelo

(Ndfs), uso eficiente de N (NUE), índice de particionamiento de N (NPI) e índice de

cosecha de vaina. Diferencias significativas fueron observadas en la habilidad en FSN

entre genotipos. Las líneas promisorias identificadas presentaron hasta 4.6 Mg ha-1 de

rendimiento soportado por 60% de Ndfa equivalente a 92 kg de N fijado ha-1 sin aplicación

de fertilización nitrogenada al suelo. Cinco (5) genotipos fueron identificados como

promisorios ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21 and CGA 10, estas líneas servirán como

padres en el programa de mejoramiento genético. Por otro lado, se valida el uso de grano

para esta determinación con una correlación positiva y altamente significativa entre las dos

metodologías. Por lo tanto, se valida el uso de grano para estimar Ndfa en cambio de Ndfa

a partir de biomasa aérea, para determinar la capacidad FSN. Esta metodología ayudará

a los programas de mejoramiento genético a identificar fácilmente genotipos con

habilidades superiores en este atributo.

Palabras clave: Frijol voluble, fijación simbiótica de nitrógeno, rendimiento, uso eficiente

del nitrógeno, nitrógeno derivado de la atmosfera y nodulación.

X Evaluación de fijación simbiótica de nitrógeno para la identificación de genotipos

promisorios en frijol voluble (Phaseolus vulgaris L.)

Abstract

Nitrogen (N) deficiency affects about 40% of the common bean producing regions causing

yield losses up to 60%. Symbiotic Nitrogen Fixation (SNF) – through association with root-

nodulating rhizobia for the uptake of atmospheric N – contributes to improve grain yield.

Climbing bean is known to be superior to bush bean in its potential for SNF ability. One of

the main factors determining the efficiency of SNF is the plant genotype. The three main

objectives of this study were to: (i) quantify genotypic variability in SNF ability of climbing

bean; (ii) identify genotypes that combine high SNF ability with high yield potential that

could serve as parents in the breeding program and iii) validate the use of 15N natural

abundance in grain as a selection method to quantify SNF ability. A total of 100 genotypes

of climbing bean including 89 ENF (disease resistant) lines and 11 checks were evaluated

for SNF ability. Field trials were conducted at two locations (Darien and Popayán) in

Colombia. Both trials received Rhizobium inoculum and adequate nutrients except N

fertilizer. Measurements included visual evaluation of root nodulation, 15N natural

abundance (δ15N) in shoot tissue and grain, %N derived from the atmosphere (%Ndfa),

total Ndfa, canopy biomass, total N uptake, N use efficiency, N partitioning index and pod

harvest index. Significant phenotypic differences were observed in SNF ability between

genotypes. Good yielding genotypes with grain yield as high as 4.6 Mg ha-1 fixed as much

as 60% of their total N from the atmosphere (TNdfa) which is estimated to be up to 92 kg

of N ha-1 without application of N fertilizer to soil. Based on phenotypic evaluation from both

locations, five lines (ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21 and CGA 10) were identified as

promising for further testing and use as parents in the breeding program. Phenotypic

variation in SNF ability is usually estimated using δ15N of shoot tissue rather than δ15N of

grain tissue. We tested the relationship between δ15N of grain vs δ15N of shoot at both

locations. We found positively significant relationship between the two methods. Thus using

grain samples to determine SNF ability helps the breeding programs to select for genotypes

with superior SNF ability.

Keywords: Climbing bean, symbiotic nitrogen fixation, grain yield, nitrogen use efficiency,

nitrogen derived from atmosphere and nodulation.

XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ IX

Lista de figuras ............................................................................................................ XIII

Lista de tablas ............................................................................................................ XVII

Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................... XIX

Introducción .................................................................................................................... 1

Objetivos .......................................................................................................................... 4

Hipótesis .......................................................................................................................... 4

1. Estado actual ............................................................................................................ 5 1.1 Frijol Común (Phaseolus vulgaris L.) .................................................................. 5 1.2 Frijol Voluble tipo IV ........................................................................................... 8 1.3 Fijación Simbiótica de N ..................................................................................... 9 1.4 Nitrogenasa y mecanismo de acción ................................................................ 11 1.5 Infección, Nodulación y el proceso de FSN ...................................................... 12 1.6 Métodos de Cuantificación de Fijación Simbiótica de Nitrógeno ....................... 13

1.6.1 Medida de la actividad de la Nitrogenasa – Método de reducción de acetileno ................................................................................................................... 14 1.6.2 Medida de balance de Nitrógeno ................................................................... 14 1.6.3 Métodos de Abundancia Natural de 15N y determinación de % Ndfa. ............. 15

1.7 Potencial de Fijación Simbiótica de Nitrógeno (FSN) en frijol voluble ............... 17 1.8 Validación de Metodología grano para cuantificar FSN .................................... 18 1.9 Características para evaluar la respuesta de la planta a FSN .......................... 19

1.9.1 Uso eficiente de N (NUE) ............................................................................... 19 1.9.2 Particionamiento de N (%NPI) ....................................................................... 20 1.9.3 Biomasa y Movilización de fotoasimilados. .................................................... 20

1.10 Factores abióticos que afectan el proceso de FSN ........................................... 21 1.10.1 Sequia ........................................................................................................... 22 1.10.2 Efecto de concentraciones altas de N edáfico en FSN................................... 22 1.10.3 Efecto de deficiencias de fosforo (P) en FSN ................................................. 25 1.10.4 Efecto de deficiencias nutricionales de Fe, Mo, Ca. ....................................... 25

2. Metodología ............................................................................................................ 27 2.1 Localización y condiciones experimentales. ..................................................... 27

XII Evaluación de fijación simbiótica de nitrógeno para la identificación de

genotipos promisorios en frijol voluble (Phaseolus vulgaris L.)

2.2 Diagnóstico de línea base ................................................................................. 28 2.3 Material Vegetal ................................................................................................ 28 2.4 Inoculación con Rhizobium cepa CIAT 899 ....................................................... 29 2.5 Diseño experimental ......................................................................................... 29 2.6 Determinación de Fijación Simbiótica de Nitrógeno .......................................... 29 2.7 Determinación de B valor ensayo en invernadero ............................................. 31 2.8 Medidas fisiológicas y variables complementarias ............................................ 32 2.9 Validación de Resultados Nodulación y Ndfa en invernadero de genotipos promisorios y no promisorios en FSN identificados en campo ..................................... 33 2.10 Análisis estadístico ........................................................................................... 33

3. Resultados ............................................................................................................. 35 3.1 Diagnóstico de la línea base del suelo .............................................................. 35 3.2 Habilidad de fijación simbiótica de nitrógeno ..................................................... 38

3.2.1 Nodulación .................................................................................................... 38 3.2.2 Nitrógeno derivado de la atmosfera (%Ndfa) ................................................. 40 3.2.3 Nitrógeno derivado de la atmosfera % Ndfa y el rendimiento de grano ......... 42 3.2.4 Nitrógeno total derivado de la atmosfera TNdfa (kg N ha-1) y el rendimiento de grano. 44 3.2.5 Nitrógeno total derivado del suelo TNdfs (kg N ha-1) y el rendimiento de grano. 45 3.2.6 Fijación Simbiótica de Nitrógeno y extracción de N en biomasa aérea y grano. 46 3.2.7 Índice de eficiencia de uso e índice de particionamiento de nitrógeno ........... 48 3.2.8 Fijación Simbiótica de nitrógeno y producción de biomasa aérea. ................. 49

3.3 Análisis Multivariado Componentes Principales (PCA) y biplots ........................ 51 3.3.1 Análisis multivariado componentes principales CP ........................................ 51

3.4 Análisis de Biplots ............................................................................................. 53 3.4.1 Análisis de clúster localidad Darién ............................................................... 53

3.4.1.1 Clúster #3: ................................................................................................ 53 3.4.1.2 Clúster #2: ................................................................................................ 54 3.4.1.3 Cluster #1: ................................................................................................ 55

3.4.2 Análisis de clúster localidad de Popayán ...................................................... 57 3.5 Validación de resultados FSN en Invernadero .................................................. 60 3.6 Validación del uso de 15N abundancia natural a partir de grano ........................ 63

4. Discusión ................................................................................................................ 67 4.1 Diferencias en la habilidad FSN entre localidades y genotipos ......................... 67 4.2 Validación de estimación de Ndfa a partir de grano y diferencias en abundancia natural 15N en biomasa aérea y grano ......................................................................... 71

5. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 73 5.1 Conclusiones .................................................................................................... 73 5.2 Recomendaciones ............................................................................................ 74

A. Anexo: Phenotyping Common Beans for Symbiotic Nitrogen Fixation (SNF): Protocol for field evaluation ......................................................................................... 75

Bibliografía .................................................................................................................... 91

XIII

Lista de figuras

Pág.

Figura 1-1. Representación esquemática Ilustración de los hábitos de crecimiento y etapas

de desarrollo fenológico en frijol común (Phaseolus vulgaris L.)…………………………. 8

Figura 1-2. Catalizada por Nitrogenasa. Ferredoxina reduce Fe proteína. Unión e hidrolisis

de ATP. La proteína Fe reduce la Mofe proteína, y la proteína Mofe reduce la N2 ......... 11

Figura 1-3. El proceso de infección durante la organogénesis nódulo. B. Modelo

esquemático de la estructura de un nódulo indeterminado y del desarrollo de los

simbiomas, epidermis, córtex interno, tejido vascular. 1-2 Formación del bacteroide, 3

procesos de diferenciación del simbioma y 4 simbiomas maduros ................................. 13

Figura 1-4. Ilustración de Abundancia Natural de δ15N para la estimación de Fijación

Simbiótica de Nitrógeno A. Valor igual a cero (0 ‰) para planta fijadora dependiente 100%

de N atmosférico B. Planta con fijación intermedia C. Planta totalmente dependiente del N

del suelo con δ15N en tejido cercano o igual al valor del suelo. ...................................... 15

Figura 1-5. Modelo esquemático de la Autorregulación de la Nodulación (AON). La

percepción del factor Nod rhizobial (1) inicia la infección y la Nodulación, sino que también

genera un inhibidor de larga distancia desde la raíz (2). LjCLE-RS1 y -RS2 son péptidos

que reciben la señal. Esta señal se transporta a la sesión y provoca la producción de la

señal derivada a la parte aérea (3). Las quinasas de tipo receptor LLR (LjHAR1 / GmNARK

/ MtSUNN / PsSYM29) y KLAVIER median este proceso. La señal derivadala parte aérea

se transloca a la raíz donde se reprime la Nodulación TML / RDH1 (4). PsNOD3 y MtRDN

en la raíz truncan la Nodulación (Cuchi et al., 2010). ..................................................... 24

XIV Evaluación de fijación simbiótica de nitrógeno para la identificación de


Figura 3-1. Mapeo para definición de línea base antes del establecimiento del ensayo. A.

Población de rhizobium en suelo por punto de muestreo UFC/ g suelo .......................... 37

Figura 3-2. Mapeo para definición de línea base antes del establecimiento del ensayo. B.

Concentración de P disponible en mg kg-1 ...................................................................... 37

Figura 3-3. Mapeo para definición de línea base antes del establecimiento del ensayo. C.

Concentración de Nitratos mg/ kg. .................................................................................. 38

Figura 3-4. Habilidad en nodulación según escala 1-9 para para los 100 genotipos de frijol

voluble en las dos localidades A. Nodulación en la localidad de Darién B. Nodulación en la

localidad de Popayán. ..................................................................................................... 39

Figura 3-5. Apariencia de nodulación y vigor de biomasa aérea entre genotipos

contrastantes para nodulación A. Genotipo ENF 28 alta nodulación, promisorio para ambas

localidades B. Genotipo ENF 81, baja nodulación………………………………………….. 40

Figura 3-6. La identificación de genotipos que combinan una mayor % Ndfa con el

rendimiento de grano (kg / ha) cultivadas en un Inceptisol en Darién en 2014 y Popayán

en 2015. Los datos de δ15N de grano fueron utilizados para estimar %Ndfa. Los genotipos

con valores más altos de rendimiento de grano y %Ndfa fueron identificados en el

cuadrante superior derecho. Genotipos marcados en rojo mostraron capacidad FSN

superiores en ambos lugares. Genotipos marcados en azul eran pobres en su capacidad

FSN en ambos lugares.................................................................................................... 44

Figura 3-7. La identificación de genotipos que combinan un mayor Ndfa Total expresado

en kg N fijado ha-1 con el rendimiento de grano (kg ha-1) cultivadas en un Inceptisol en

Darién en 2014 y Popayán en 2015. Los datos de δ15N de grano fueron utilizados para

estimar %Ndfa y con ello Ndfa total. Los genotipos con valores más altos de rendimiento

de grano y Ndfa total fueron identificados en el cuadrante superior derecho. Genotipos

marcados en rojo mostraron capacidad FSN superiores en ambos lugares. Genotipos

marcados en azul eran pobres en su capacidad FSN en ambos lugares ........................ 45

Contenido XV

Figura 3-8. . La identificación de genotipos que combinan un mayor Ndfs Total expresado

en kg N fijado desde el suelo por ha-1 con el rendimiento de grano (kg ha-1) cultivadas en

un Inceptisol en Darién en 2014 y Popayán en 2015. Los datos de δ15N de grano fueron

utilizados para estimar Ndfs total. Los genotipos con valores más altos de rendimiento de

grano y Ndfa total fueron identificados en el cuadrante superior derecho. Genotipos


marcados en azul eran pobres en su capacidad FSN en ambos lugares ....................... 46

Figura 3-9. La identificación de genotipos que combinan una mayor N total derivado de la

atmósfera (TNdfa) en kg de N por hectárea con NUE cultivadas en un Inceptisol en Darién

2014 y en Popayán en 2015. Los genotipos con valores más altos de y TNdfa fueron

identificados en el cuadrante superior derecho. Genotipos marcados en rojo mostraron

capacidad FSN superiores en ambos lugares. Genotipos marcados en azul eran pobres en

su capacidad FSN en ambos lugares ............................................................................. 49

Figura 3-10. La identificación de genotipos que combinan una mayor Biomasa de parte

aérea (SB) en kg de N por hectárea cultivados en un Inceptisol en Darién 2014 y en

Popayán en 2015. Los genotipos con valores más altos de SB y TNdfa fueron identificados

en el cuadrante superior derecho. Genotipos marcados en rojo mostraron capacidad FSN

superiores en ambos lugares. Genotipos marcados en azul eran pobres en su capacidad

FSN en ambos lugares. .................................................................................................. 50

Figura 3-11. Variables de FSN , biomasa y rendimiento representadas en Biplots de 100

genotipos de frijol voluble establecidos en la localidad de Darién (2014). Los clúster o

agrupamientos se identifican por colores y la magnitud de los vectores indica el CP de cada

variable. ......................................................................................................................... 56

Figura 3-12. Variables de FSN biomasa y rendimiento representadas en Biplots de 100

genotipos de frijol voluble establecidos en la localidad de Popayán (2015). Los clúster o


variable. ......................................................................................................................... 60

XVI Evaluación de fijación simbiótica de nitrógeno para la identificación de


Figura 3-13. Validación de habilidad en FSN en sustrato arena cuarzo estéril de genotipos

identificados como promisorios y no promisorios en campo en campo. A. Contrastes de

vigor de planta entre genotipos promisorios en FSN CGA 10 y No promisorios ENF 81. B.

Contraste en apariencia de Nodulación genotipos promisorios ENF 235 y no promisorio

ENF 81............................................................................................................................ 62

Figura 3-14. Contenidos de Clorofila en genotipos promisorios y no promisorios en FSN

durante todo el ciclo de cultivo ........................................................................................ 63

Figura 3-15. Relación entre δ15N de biomasa aérea y δ15N a partir de grano de 100

genotipos en ambas localidades. Genotipos promisorios en habilidad FSN fueron

marcados con color rojo. Genotipos no promisorios fueron marcados con color azul...... 65

XVII

Lista de tablas

Pág.

Tabla 3-1. Caracterización de suelos en cuanto a cantidad de Nitrógeno, %Materia

Orgánica, fosforo disponible NPM de Rhizobium en Darién y Popayán 2014 ................. 36

Tabla 3-2. Promedios y rangos asociados a Fijación Simbiótica de Nitrógeno (FSN) en 100

genotipos de frijol voluble desarrollado en Darién 2014 y Popayán 2015 ....................... 41

Tabla 3-3. Coeficientes de correlación (r) entre % Nitrógeno derivado de la atmosfera

estimado usando tejido de parte aérea (%Ndfa-SH), % Nitrógeno derivado de la

atmosferausando tejido de grano (%Ndfa-G).Nitrógeno Total derivado de la atmosfera en

kg N ha-1 usando grano (TNdfa-G), Nitrógeno total derivado del suelo en kg N ha-1 usando

grano (TNdfs-G), Nitrógeno total en grano kg N ha-1 (N total G), Uso Eficiente del Nitrógeno

en kg de grano producido por N asimilado en parte aérea kg.kg-1 (NUE), Biomasa de copa

kg ha-1 (SB) and Rendimiento en kg ha-1 (GY) de 100 líneas de frijol voluble establecidas

en Darién y Popayán Colombia en 2014 and 2015. ........................................................ 47

Tabla 3-4. Nod: Evaluación visual de Nodulación , CB: biomasa aérea, NG: N total en grano

(kg ha-1), Nsh: N total en biomasa aérea (kg ha-1), %Ndfa-G: % N derivado de la atmosfera

usando grano, TNdfa-Sh: N total fijado derivado del aire a partir de biomasa aérea (kg N

ha-1), TNdfs-Sh: N total derivado del suelo a partir de biomasa aérea (kg N ha-1), TNdfa-G:

N total fijado derivado del aire a partir de grano (kg N ha-1), TNdfs-G: N total derivado del

suelo a partir de grano (kg N ha-1), GY: rendimiento (kg ha-1), NUE: Uso eficiente del

Nitrógeno (kg g kg N-1 ), NPI: Indice de particionamiento del nitrógeno and PHI: Índice de

cosecha de vaina. .......................................................................................................... 52

Tabla 3-5. Evaluación de Nodulación y determinación de %Ndfa–G en genotipos

identificados como promisorios y no promisorios bajo condiciones de invernadero ........ 61

XVIII Evaluación de fijación simbiótica de nitrógeno para la identificación de


Tabla 3-6. Diferencias fenotípicas en % de nitrógeno derivado de la atmósfera estimadas

usando tejido foliar (% Ndfa-SH),% de nitrógeno derivado de la atmósfera estimado usando

tejido de grano (% Ndfa-G), Abundancia natural de 15N de tejido foliar (‰) y Abundancia

natural de 15N de grano (‰) de 100 genotipos de común frijol sembrados en Darién y

Popayán, 2014 y 2015 Colombia .................................................................................... 66

XIX

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolo Término Unidad SI

DAP Dias despues de siembra DAP

MSNM Metros sobre el nivel del mar msnm

N Nitrógeno N

Ndfa N derivado del aire (N fijado) % kg N ha−1 |

Ndfs N derivado del suelo % kg N ha−1

𝛿15N Abundancia Natural Isotopo de 𝛿15 ‰

NA Habilidad en nodulación 1 -9

NUE Uso eficiente del Nitrógeno Kg g kg N

NPI Indice de particionamiento de N %

PHI Índice de cosecha de vaina %

SB Biomasa aerea Kg ha−1

FSN Fijación Simbiotica de Nitrógeno FSN

SCMR Contenido de clorofila SPAD

GY Rendimiento (kg ha−1) GY

Introducción

Parte de la población mundial padece de desnutrición. En el mundo cerca de 795 millones

de personas equivalentes al 10,5% de la población mundial está bajo esta condición y se

calcula que el 26% de los niños del mundo padecen retraso del crecimiento (FAO, 2015).

La mayor parte de población se registra en Asia con 280 millones, sin embargo, avanzó en

el África subsahariana (Etiopía, Ghana, Kenia, Nigeria, Ruanda y Uganda) con 220

millones (FAO, 2015). Es evidente que existe un problema significativo de demanda de

alimentos y garantías en seguridad alimentaria, especialmente para países en condición

de vulnerabilidad.

En este sentido, las leguminosas y especialmente el frijol común (Phaseolus vulgaris L.),

tienen un papel importante en los sistemas de producción agrícola en todo el mundo. Este

cultivo es el más importante en América Latina y África Oriental y meridional, cultivado

principalmente por pequeños agricultores, donde es a menudo sembrado en ambientes

marginales con baja fertilidad especialmente con deficiencias de Fósforo y Nitrógeno

además de un mínimo uso de insumos (Beebe et al., 2012), debido a esto, los rendimientos

son hasta 60% reducidos, alrededor de menos de tres veces del potencial reportado para

este cultivo con tendencia a disminuir en el largo plazo (Rao, 2014; FAO, 2006). Así,

Cultivos sembrados bajo estas circunstancias generan en las poblaciones vulnerables

hambre, desnutrición y desplazamiento.

Por otro lado, y paralelo a la problemática de seguridad alimentaria, el consumo de

fertilizantes nitrogenados ha aumentado en las últimas décadas, principalmente por el

incremento en la demanda de alimento y el rendimiento en los cultivos. El nitrógeno (N) es

uno de los principales impulsores de la producción agrícola mundial con requerimientos

entre 150 y 200 millones de toneladas de mineral N cada año en los sistemas agrícolas

para la producción de alimentos (Unkovich et al., 2008). Actualmente, este incremento se

ha dado tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo y se predice que los

2 Evaluación de fijación simbiótica de nitrógeno para la identificación de genotipos


requisitos de fertilizantes nitrogenados aumentarán en el futuro, sin embargo, a pesar de

la síntesis de 100 toneladas de N al año para suplir esta demanda, existen problemas con

el uso de fertilizantes nitrogenados especialmente con la baja eficiencia de uso y

aprovechamiento referido a la volatilización de NH3, la lixiviación de NO3 contaminado

fuentes de agua y la desnitrificación de nitratos a N2O como gas de efecto invernadero

contribuyendo al aumento progresivo del calentamiento global. Algunos de los impactos

más fuertes del esta problemática se sentirán en los “pequeños agricultores” o de

“agricultura de subsistencia” de países en desarrollo (Morton 2007), debido a la reducción

de los rendimientos en cultivos desarrollados en suelos con baja fertilidad, una alta

demanda de nitrógeno, la demanda de alimentos cada vez mayor y, sumado a esto, el

incremento en los costos de fertilizantes de síntesis que hacen insostenible la producción

de alimentos y la seguridad alimentaria.

Así, con las problemáticas de reducción de rendimientos por deficiencias nutricionales y

los efectos negativos generados por la fertilización nitrogenada; se ve como alternativa de

solución, el desarrollo de genotipos de frijol promisorios en la asimilación de nutrientes

especialmente nitrógeno además de la disminución de la demanda en fertilización. Estas

soluciones son esenciales para contribuir a la seguridad alimentaria de una población

creciente que requiere más alimentos con menos recursos.

Para ello, la capacidad que poseen las leguminosas y en especial el frijol denominada

fijación simbiótica de nitrógeno (FSN) se convierte en la alternativa de solución para la

búsqueda de genotipos eficientes con el uso del nitrógeno y capaces de suplir la demanda

a través de la interacción con la bacteria nitrificante Rhizobium, que convierte el nitrógeno

inútil del aire (N2) en nitratos y amonio NO3 y NH4 que la planta puede utilizar para el

crecimiento y la producción de proteínas (Kumarasinghe et al., 1992). Se ha reportado

que en condiciones óptimas, hasta el 73% del nitrógeno total de la planta es aportado por

FSN y cantidades de hasta 125 kg N ha-1 se han registrado sosteniendo rendimientos de

hasta 4 Ton ha-1 sin aplicaciones de fertilizantes (Giller, 2001).

Sin embargo, hay diferencias de potencial FSN entre frijol arbustivo y voluble, está

reportado que este último tiene hasta 50% más capacidad de fijar nitrógeno

atmosféricamente asociado a altos rendimientos (Graham and Rosas, 1977; Graham and

Preliminares de la investigación 3

Temple, 1984; Kipe-Nolt and Giller, 1993; Bliss, 1993). Es evidente que el potencial de

mejoramiento de FSN en frijol común está presente, por esto, buscar este atributo en los

diferentes genotipos de frijol voluble, se considera necesario con el fin de incrementar la

oferta de nitrógeno para la planta bajo condiciones de baja fertilidad como estrategia para

una agricultura sustentable y de esta manera mejorar la cantidad y la calidad de alimento.

De igual forma, el estudio de FSN se considera una estrategia amigable con el

medioambiente y de bajo costo reduciendo la aplicación de fuentes nitrogenadas.

El Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) desde los años 70´s ha venido

desarrollando un trabajo arduo de mejoramiento genético a través de la evaluación

fenotípica y genética de materiales tanto del acervo andino como del mesoamericano

enfocado al estudio de genotipos tolerantes a sequía y enfermedades (Beebe et al., 2000).

El programa de frijol actualmente cuenta con líneas mejoradas provenientes de cruzas

simples, retrocruzas y cruces interespecíficos, que han sido usadas como padres y

caracterizadas para atributos de interés, sin embargo, el atributo genético de fijación de

nitrógeno no había tenido prioridad hasta ahora, teniendo en cuenta que actualmente las

variedades comerciales de frijol son pobres en la fijación de nitrógeno (Martínez y Romero,

2003).

Actualmente la fijación simbiótica de nitrógeno (FSN) en frijol retomó importancia al estar

incluido dentro del programa de mejoramiento como una más de las características de

evaluación fenotípica para la obtención del ideotipo de frijol común, con interés en

mejoramiento de frijol de hábito voluble. Por ende, genotipos de frijol voluble podrían ser

promisorios para el mejoramiento de la capacidad de fijación de nitrógeno en el cultivo de

frijol aumentando el rendimiento. Por esta razón, se plantea esta investigación con el

objetivo general de evaluar el potencial de fijación Simbiótica de Nitrógeno (FSN) de

diferentes genotipos de frijol para identificar variabilidad fenotípica y materiales

promisorios, que eventualmente puedan ser utilizados como padres en programas de

mejoramiento genético.



Objetivos

Objetivo general

Evaluar la fijación Simbiótica de Nitrógeno (FSN) potencial de genotipos de frijol común de

hábito voluble e identificar materiales promisorios, a ser utilizados como progenitores en

programas de mejoramiento genético.

Objetivos específicos

1. Cuantificar la variación genotípica de la habilidad en FSN.

2. Identificar genotipos promisorios de frijol voluble en FSN que combinen

con buen rendimiento y puedan servir como padres en el programa de

mejoramiento genético.

3. Validar el método para estimar la capacidad FSN usando abundancia

natural de isótopo 15N en grano como alternativa a la determinación a

partir de abundancia natural de 15N en el tejido de biomasa aérea.

Hipótesis

Ho: Existe variación genotípica en FSN entre los genotipos de frijol voluble y se valida el

método de cuantificación de 15N a partir de grano.

Ha: Es posible identificar algunos genotipos de frijol voluble con alta habilidad en FSN en

combinación con potencial de rendimiento y tolerancia a enfermedades. La relación 15N

biomasa aérea y 15N de grano es inversa y no significativa.

1. Estado actual

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es una de las leguminosas más importantes para el

consumo humano en el mundo. El Frijol común se caracteriza por su alta diversidad

genética la cual incluye variedades de frijol arbustivo y hábito trepador o voluble el cual

tiene alta capacidad de fijación simbiótica de nitrógeno y de potencial de rendimiento en

comparación con frijol arbustivo (Graham and Rosas, 1977; Graham and Temple, 1984;

Kipe-Nolt and Giller, 1993; Bliss, 1993). Así, la fijación simbiótica de nitrógeno (FSN)

contribuye a una nutrición nitrogenada mejorada y es una estrategia ecológica y de bajo

costo para mejorar la productividad en el cultivo de frijol común (Beebe, 2008).

Por ello, es necesario mejorar la eficiencia y la estabilidad de FSN en el cultivo de frijol. En

este sentido, en primer lugar, se enuncian los principios fisiológicos, la importancia de frijol

además de las metodologías de cuantificación de la FSN, los métodos de medición y se

revisa si el frijol de hábito voluble es o puede ser proveedor de potencial genético para

mejorar la capacidad de FSN en el mejoramiento de frijol común.

1.1 Frijol Común (Phaseolus vulgaris L.)

Frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la leguminosa alimenticia más importante cultivada

en las zonas tropicales de América Latina y África Oriental y meridional. Para más de 300

millones de personas en el mundo, especialmente en países en desarrollo, es la pieza

central de la dieta diaria (FAO, 2003). Nutricionistas caracterizan este cultivo como una de

las más importantes fuentes de proteína, además de las cantidades generosas de fibra,

carbohidratos y complejos de primera necesidad en la dieta, como el ácido fólico, hierro y

zinc. (Broughton et al., 2003).

La cosecha de frijol mundial es de 18 millones de toneladas al año y tiene un valor estimado

de US $ 11 mil millones (CIAT 2006). La mayor parte (11,5 millones de toneladas) se



produce en América Latina y África. La mayoría de la producción de frijol en América Latina

se lleva a cabo en pequeñas explotaciones que van de 1 a 10 hectáreas de tamaño, a

menudo en tierras con pendientes pronunciadas y de baja fertilidad (Beebe et al., 2008).

El cultivo de frijol es cultivado por pequeños agricultores que a menudo se expone a

condiciones desfavorables con un uso mínimo de insumos (Beebe et al., 2008).

Alrededor del 50% de las áreas de producción de frijol en África Oriental y central y el 60%

en África meridional tiene deficiencia de N debido a la pérdida de las N en el suelo y la

limitada aplicación de fertilizantes (Beebe et al., 2014). Por esta razón, los rendimientos

promedios se ven afectados desde un 60% a un 100% por factores bióticos y abióticos

entre los cuales se encuentran: enfermedades, plagas y estrés abiótico como sequías y

baja fertilidad del suelo. En consecuencia, los rendimientos se encuentran entre 600 a 900

kg ha-1, aunque su potencial de rendimiento en condiciones óptimas es capaz de llegar a

2.500 a 5.000 kg ha-1 (CIAT, 2000).

Las tierras altas de África Oriental y central representan más del 80% de la producción de

frijol y se caracterizan por una alta densidad de población, estas tierras presentan

disminución de la fertilidad del suelo y la siembra se realiza con una aplicación limitada de

insumos especialmente de N (Jensen and Hauggaard-Nielsen, 2003). Sin embargo, la

fijación de nitrógeno (proceso paralelo de asimilación de N a través de la atmosfera)

contribuye en un 60% en el al rendimiento del frijol, en términos de oferta de nitrógeno al

sistema de cultivo y el contenido de nutrientes del grano (Jensen and Hauggaard-Nielsen,

2003). Sin embargo, las líneas de frijol comerciales actuales son a menudo pobres en fijar

N bajo las restricciones ambientales actuales.

El frijol común es un cultivo extremadamente diverso en términos de métodos de cultivo,

los usos, la variedad de ambientes a los que se han adaptado y variabilidad morfológica.

Se encuentran desde el nivel del mar hasta los 3000 msnm y se cultivan en sistema de

rotación o en asociación, a menudo con maíz (Broughton et al., 2003). Las semillas son de

forma y existe una rica variedad de colores y granos. El tamaño de la semilla varía de 50

mg / semilla de las accesiones silvestres de México, a más de 2000 mg / semilla en algunas

variedades de semillas grandes de Colombia (Graham y Ranalli, 1997).

Capítulo 1. Estado actual 7

Existen importantes centros secundarios de diversidad en África, Brasil, Europa, Oriente

Medio y América del Norte. Una colección mundial que comprende algo más de 40.000

accesiones se encuentra en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, Cali

Colombia) e incluye especies silvestres y muestras de malezas, las variedades locales no

mejoradas y líneas puras de Phaseolus vulgaris, así como numerosas especies

relacionadas (Singh et al., 1991).

Esta diversidad particularmente rica se da por la historia de domesticación de frijol que

condujo a dos grandes bancos de genes correspondiente al acervo mesoamericano y el

acervo Andino, que se puede distinguir por el potencial de rendimiento y morfología (Singh

et al., 1991).

Así el frijol común se clasifica en cuatro hábitos de crecimiento: el hábito de crecimiento

tipo I se caracteriza por plantas que presentan brotes e inflorescencias terminales

reproductivas (determinadas), erecto rama, y sin capacidad de escalada; tipo II hábito de

crecimiento erecto pero con un crecimiento vegetativo terminal de creciente brotes que son

indeterminados; tipo III hábito de crecimiento que también es indeterminado, pero más

postrados, con los brotes de crecimiento de terminales; mientras que el hábito de

crecimiento de tipo IV incluye, plantas indeterminadas de altura con un crecimiento alto,

entrenudos largos, yemas vegetativas terminales, y una fuerte capacidad trepadora (Singh,

1982; Checa et al, 2006).

Las condiciones ambientales tales como la calidad de la luz y la duración del día en gran

medida influyen en el crecimiento, la expresión de hábito y las diferencias entre los hábitos

de crecimiento II y III o entre III y IV (Figura. 1-1) (Singh, 1982; CIAT 1984).

Dentro del acervo andino se encuentra el frijol de hábito IV o voluble que se caracteriza

por poseer un tamaño de grano grande, diversidad de tipos y rendimientos superiores

hasta 4 Ton ha-1



Figura 1-1. Representación esquemática Ilustración de los hábitos de crecimiento y etapas de desarrollo fenológico en frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Adaptado de Morfología de la planta de frijol CIAT 1984

1.2 Frijol Voluble tipo IV

El rasgo más evidente del frijol voluble es la capacidad de trepar y la necesidad de un

tutorado en sistemas productivos. El frijol Voluble se considera un componente importante

de la agricultura tradicional en varios lugares de América Latina, especialmente en

México, Guatemala, Colombia, Ecuador y Perú (Voysest, 2000) y se han extendido a la

región de los Grandes Lagos de África (Sperling y Munyaneza, 1995). Genotipos de frijol

común voluble tienen el potencial de rendimiento más alto entre todas las accesiones de

especies que se encuentran. Un estudio realizado por Kornegay et al. 1992, encontró que

el mejoramiento de la capacidad de rendimiento se encuentra asociada positivamente con

un aumento de la expresión de los rasgos de hábito voluble. Esto le permite que el sistema

de cultivo de frijol voluble se clasifique como monocultivo y también como cultivo

intercalado (Woolley y Davis, 1991). El cultivo intercalado implica crecimiento en

asociación con el maíz, ya sea en plantaciones transicionales o simultáneas, y en este

sistema agrícola, el maíz proporciona el apoyo necesario para este hábito de crecimiento.

En monocultivo, frijol voluble se siembran con el apoyo de estacas en madera, de bambú

o sistemas de enrejado. En este sistema, puede proporcionar un uso para los árboles en


proyectos agroforestales. El sistema de tutorado requerido en frijol voluble, es un sistema

muy extendido en la región andina y una alternativa que reduce la necesidad de estacas,

pero requiere una inversión en cables y cuerdas para atar los tallos (Sañudo et al., 1999).

Este sistema de tutorado para frijol trepador se justifica económicamente porque el

rendimiento puede superar a 4500 kg ha-1 en condiciones óptimas. Sin embargo, es más

laborioso debido a la necesidad de mano de obra, a pesar de esto, se considera una

importante fuente de empleo en la agricultura para la producción y mano de obra

estacional. Por lo tanto, el frijol voluble es particularmente útil para las pequeñas

propiedades en donde la superficie disponible es limitada, pero no la mano de obra, y

donde la demanda de granos es alta (Sañudo et al., 1999).

Las variedades de frijol voluble más cultivadas tienen adaptación agroecológica en

regiones de altitudes altas entre 2000 a 2800 metros sobre el nivel del mar (msnm)

(Voysest, 2000), pero a diferencia del frijol arbustivo, el frijol voluble está más cerca del

fenotipo silvestre en términos de hábito de crecimiento y sensibilidad al fotoperiodo

(Debouck, 1991; Singh, 2001). En la década de 1990, los mejoradores de frijol en el CIAT

liberaron los llamados frijoles volubles adaptados a altitud media (MAC) capaces de

crecer y rendir hasta 4500 kg ha-1 en condiciones de altitud media entre los 500 a 1500

msnm. Estas líneas MAC se caracterizaron también por presentar maduración temprana

comparadas con granos de volubles tradicionales además de presentar altos contenidos

de Zn y Fe en el grano además de resistencia a virus del mosaico común (BCMNV),

aunque no tenían un grano comercial deseable para países del Este Africano (Beebe,

2014; Blair et al., 2007). Esta ha sido una de las historias de impacto más drásticas del

CIAT, en el que los rendimientos de frijol en algunos países como Uganda, se triplicaron

en comparación con los rendimientos de frijol arbustivo disponibles en ese momento.

1.3 Fijación Simbiótica de N

Aunque Nitrógeno gaseoso (N2) representa casi el 78% del Nitrógeno en la tierra, este no

está directamente disponible para las plantas. La fijación simbiótica de N2 (FSN) es el

proceso mediante el cual bacterias del genero Rhizobium en asocio con las leguminosas

convierten el N2 atmosférico en amoníaco (NH3), una forma de nitrógeno (N) asimilable.

Los productos de FSN se pueden incorporar como componentes orgánicos, proteínas y

ácidos nucleicos (Unkovich et al., 2008; Kipe-Nolt et al, 1993; Peoples et al, 1995). Giller



(2001) lo define como el proceso de reducción de N2 a una forma de N fácilmente

disponible para la planta como NH4. En condiciones óptimas, hasta el 73% del nitrógeno

total de la planta es aportado por FSN y cantidades de hasta 125 kg N fix ha-1 (Giller, 2001),

es evidente que el potencial de mejoramiento de FSN está presente, sin embargo para que

se dé la FSN debe haber relación y coordinación de factores, entre los cuales están: la

selectividad de la planta leguminosa, la especificidad de la bacteria Rhizobium y las

condiciones ambientales que incluye la condición de elementos como el Nitrógeno, fosforo,

molibdeno y Fe en el suelo (Taiz y Zeiger, 2002). El proceso de fijación de nitrógeno

requiere de cada uno de estos elementos y en algunos casos el exceso puede generar

inhibición del proceso. Adicional a esto, debido a la estabilidad molecular del nitrógeno

atmosférico, este proceso es energéticamente costoso, y requiere de 16 moléculas de ATP

por cada N2 reducido (Taiz y Zeiger, 2002):

N2+8H+8℮-+16ATP 2NH3+H2+16ADP+16Pi

La reacción es catalizada por la enzima nitrogenasa sintetizada por la bacteria Rhizobium.

Los géneros contemplados en la FSN en frijol son Rhizobium etli, Rhizobium

leguminosarum bv. phaseoli y Rhizobium tropici (Martinez-Romero , 1991; Taiz y Zeiger,

2002). A diferencia de las cianobacterias Rhizobium no puede generar un ambiente

anaerobio en donde poder realizar la fijación de nitrógeno por sí mismas. Para llevar a

cabo el proceso, estas bacterias en las inmediaciones de las raíces de las leguminosas y

tras una serie de reacciones, dan originen a la formación de un órgano mixto nuevo

denominado nódulo simbiótico, en el cual se proporciona un entorno controlado anaerobio,

con el fin de evitar la inhibición de la enzima nitrogenasa. A través del nódulo se da la

simbiosis planta – Rhizobium donde la planta suministra carbohidratos a la bacteria y la

bacteria obtiene energía para sintetizar la enzima necesaria para efectuar el proceso de

fijación en el proceso FSN (Giller, 2001; Unkovich et al., 2008).

Nitrogenasa


1.4 Nitrogenasa y mecanismo de acción

Todos los microorganismos que convierten el N2 en amonio NH4 ,lo hacen gracias a la

actividad del complejo enzimático Mo-Fe nitrogenasa; la enzima requiere de la

colaboración de otras dos proteínas llamadas ferrodoxina y flavodoxina; éstas actúan como

donadores de electrones y reductores naturales (Giller, 2001).

El complejo enzimático, que cataliza la reducción del N2 en amoniaco, está constituido por

dos metaloproteínas, y contiene tres tipos de grupos prostéticos. La nomenclatura para

designar estas proteínas es variable. Así, la proteína I es llamada Fierromolibdeno-

proteína Fe-Mo. El otro componente, la proteína II, es igualmente nombrada dinitrogenasa

reductasa o "Fierro-proteína". Para su funcionamiento, el complejo requiere un donador de

electrones de bajo potencial, de la hidrólisis de ATP y de un ambiente estrictamente

anaerobio. Esta proteína contiene el cofactor con fierro y molibdeno (FeMo-Co). La

proteína II es un dímero de alrededor de 68,000 Da, formado por dos subunidades

idénticas unidas por un grupo prostético único de 4Fe-4S. El gene responsable de la

síntesis de esta proteína es nifH. Esta proteína tiene la función de transportar los electrones

del donador fisiológico de electrones (ferrodoxina o flavodoxina), hacia la proteína I para

llevar a cabo la reducción de la molécula de N2, (Figura 1-2). Como se mencionó

anteriormente, la Nitrogenasa es sumamente susceptible a la inactivación por el O2 (Giller,

2001).

Figura 1-2. Catalización de N2 por Nitrogenasa. La Ferredoxina reduce Fe proteína. Unión

e hidrolisis de ATP. La proteína Fe reduce la MoFe proteína, y la proteína MoFe reduce la

N2 . Adaptado de Taiz y Zeiger, 2002.

http://www.monografias.com/trabajos11/grupo/grupo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos15/medio-ambiente-venezuela/medio-ambiente-venezuela.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/dinamica-grupos/dinamica-grupos.shtml

http://www.monografias.com/trabajos7/mafu/mafu.shtml



1.5 Infección, Nodulación y el proceso de FSN

Infección de las raíces por rizobios es un proceso de múltiples etapas iniciado por la

secreción de exudados de la raíz como flavonoides y nutrientes tales como ácidos

orgánicos y aminoácidos. Los Rhizobios responden a estos exudados y se unen a sitios

particulares en las raíces de leguminosas (Van Rhijn y Vanderleyden., 1995; Madigan et

al, 2003; Garg y Geetanjali, 2007). En la superficie los pelos radicales, los rizobios causan

hinchazón, la deformación y si introducción a través de la secreción de oligosacáridos

llamados factores Nod (Giller, 2001).

Los Rizobios son entonces atrapados en el pelo de raíz deformado y entran por la lisis de

la pared celular y la posterior invaginación de la membrana plasmática. El nuevo material

de la pared celular de la planta huésped forma alrededor de la lesión un tubo hacia el

interior, conocido como el hilo de infección, que se propaga por la raíz. Simultáneamente,

las células corticales se dividen para formar un primordio de nódulos y el hilo de la infección

crece hacia estos primordios (van Rhijn y Vanderleyden, 1995, Madigan et al.,, 2003; Garg

y Geetanjali, 2007). Además, un número limitado de células en el periciclo también se

dividen (Kinkema et al.,, 2006).

Una vez que el hilo de infección alcanza el primordio en desarrollo, las bacterias se liberan

en las células vegetales a través de endocitosis y encerrados en estructuras en forma de

vacuolas rodeadas por una membrana peribacteroide derivada de la membrana plasmática

(simbioma) (Figura 1-3). En estas estructuras, los rizobios se diferencian en bacteroides y

comienza la conversión de N2 a NH4 (Giller, 2001; Stacey et al, 2006; Garg y Geetanjali,

2007). Un nódulo es un órgano verdadero con especialización celular. Al lado de las células

de plantas infectadas, las células vegetales infectadas se ocupan de la asimilación y

sistemas de transporte vía simplásto que permite el intercambio de nutrientes entre el

nódulo y el tejido vascular periférico (Stacey et al, 2006; Kouchi et al, 2010).


Figura 1-3. El proceso de infección durante la organogénesis nódulo. B. Modelo

esquemático de la estructura de un nódulo indeterminado y del desarrollo de los

simbiomas, epidermis, córtex interno, tejido vascular. 1-2.

Formación del bacteroide, 3. procesos de diferenciación del simbioma y 4. simbiomas

maduros. Adaptado de Taiz y Zeiger, 2002.

1.6 Métodos de Cuantificación de Fijación Simbiótica de Nitrógeno

Un método exacto de medición de fijación N2 es esencial para cualquier evaluación de la

capacidad FSN, sin embargo, tal método ha sido difícil de estandarizar (Giller, 2001). A

pesar de la investigación activa en este tema, muchas mediciones de la cantidad de N2

fijado en el campo siguen teniendo incertidumbre en el dato obtenido. Esto es en gran

parte, debido a que la diferenciación de N adquirido de la atmósfera y el N absorbido desde

el suelo y las variables que intervienen en el proceso. A continuación, se describen las

principales metodologías y las limitaciones de los tres métodos más importantes para medir

la FSN, en los que encontramos i) la cuantificación de la actividad de la Nitrogenasa ii) el

método de balance de N y iii) Abundancia Natural de 15N (Giller, 2001 y Unkovich et al.,

2008).



1.6.1 Medida de la actividad de la Nitrogenasa – Método de reducción de acetileno

El ensayo de reducción de acetileno (ARA), es un método indirecto que mide las tasas de

actividad de la enzima nitrogenasa bacteriana producida por Rhizobium en el metabolismo

de FSN, responsable de la conversión de N2 atmosférico en amonio (NH4) Unkovich et al.,

2008). Este método se basa en el hecho de que la enzima Nitrogenasa participa tanto en

la trasformación de N2 a NH3 como en la reducción de acetileno (C2H2) a etileno (C2H4).

Este método se lleva a cabo incubando el material de ensayo (raíces y nódulos por planta

a analizar), en una atmósfera que contiene 10% de acetileno en un recipiente cerrado. De

esta manera se mide la concentración de etileno producido por acción de la nitrogenasa

después de un período de incubación y se mide a través de cromatografía de gases. La

cantidad de etileno seria directamente proporcional a la actividad de la nitrogenasa de los

nódulos evaluados. Este método es útil como un método rápido para la detección de

actividad de la enzima en uno o varios puntos de tiempo específicos y para las mediciones

de las tasas de la enzima en los sistemas simples de laboratorio. Su uso, sin embargo es

limitado principalmente a condiciones de laboratorio y es una metodología problemática si

se utiliza para cuantificar cantidades de N2 fijado en campo o en invernadero (Giller, 2001;

Unkovich et al., 2008).

1.6.2 Medida de balance de nitrógeno

El método de diferencia y balance de Nitrógeno es un método simple y directo para

cuantificar la cantidad de N2 fijado durante un período considerable de tiempo y consiste

en medir la concentración de N en el tejido multiplicándolo por el peso del material de

planta producida (Unkovich et al., 2008). Esto es, por supuesto, válido para N2 fijado en

ausencia de otras fuentes de N. Los rastros de N en la semilla o inóculo bacteriano se

pueden despreciar si la cantidad de N2 fijado es grande. Sin embargo, los problemas se

producen en condiciones de nitrógeno libre, pero que en realidad son contaminados con

N. Sin embargo, esto sólo será problemático si la cantidad de contaminación es

considerable en comparación con la cantidad de N2 fijado (Giller, 2001; Thies et al., 2001;

Unkovich et al, 2008). Sin embargo, la absorción de N determinado por este método sólo

será una aproximación de N absorbido por la fijación de las plantas en asocio. En el mejor


de los casos este método pueden proporcionar indicaciones aproximadas de las

cantidades de N2 fijado y en el peor de los casos, los resultados pueden ser engañosos.

1.6.3 Métodos de abundancia natural de 15N y determinación de % Ndfa.

Los isótopos estables son elementos que tienen variaciones en el número de neutrones

en sus átomos, pero estos átomos no se deterioran. Por ejemplo, el nitrógeno tiene un

peso atómico de 14, con siete protones y siete neutrones este isotopo de N es conocido

como δ14N, a su vez, el N puede presentar isotopos de 6 (13N) u ocho neutrones (δ15N)

(Unkovich et al., 2008). La diferencia entre isotopos depende de su estabilidad y δ15N es

el más estable y pesado por esta razón se puede cuantificar en órganos y tejidos. El

Nitrógeno se encuentra en mayor medida como δ15N en el suelo (abundancia natural de

δ15N) y δ14N en el aire. De esta manera, plantas cuya fuente principal de N es el suelo

(plantas no fijadoras) se espera que δ15N sea más abundante, en cambio, plantas cuya

fuente de Nitrógeno esta compartida entre la atmosfera y el suelo la cantidad de δ15N en

tejido será menor. La estimación del enriquecimiento de δ15N del N del suelo se hace

generalmente a través de la utilización de una planta que no fija N como referencia

(Unkovich et al., 2008) (Figura 1-4).

Figura 1-4. Ilustración de Abundancia Natural de δ15N para la estimación de Fijación Simbiótica de Nitrógeno A. Valor igual a cero (0 ‰) para planta fijadora dependiente 100% de N atmosférico B. Planta con fijación intermedia C. Planta totalmente dependiente del N del suelo con δ15N en tejido cercano o igual al valor del suelo. Adaptado de Unkovich et al, 2008.



Desafortunadamente, el enriquecimiento del suelo δ15N puede variar con la profundidad,

por lo que cualquier diferencia en el patrón de enraizamiento de las plantas de ensayo y

de referencia puede conducir a la absorción de N del suelo. En conclusión, las plantas de

referencia tienen que ser elegidas cuidadosamente, asegurando un patrón de

enraizamiento y profundidad que sea similar a la planta de ensayo y del mismo modo una

absorción de N-similar a lo largo de la temporada de crecimiento. La mejor opción de cultivo

de referencia podrían ser plantas, que tengan capacidad de nodular con una cepa de

rhizobio en particular y conocida o plantas mutantes no nodulantes. También las malezas

no fijadoras genotipos no nodulantes se pueden utilizar como un cultivo de referencia

(Unkovich et al., 2008).

El valor de abundancia natural de δ15N de la planta fijadora de nitrógeno dependiente

exclusivamente del N2 como fuente en un medio libre de N se denomina B-valor. Se ha

informado de que B-valores puede diferir con la variedad de la planta, la temperatura, las

condiciones de luz, la edad de las plantas, etc. (Shearer y Kohl, 1986, Unkovich et al.,

1994, Unkovich et al., 2008). Por lo tanto, es esencial para llevar a cabo experimentos de

invernadero diseñados para estimar los valores de B en condiciones muy similares en

comparación con el experimento en el que se utiliza el método de δ15N, este dato es

requerido en la fórmula para poner en evidencia el dato de δ15N, en tejido a partir de su

trasformación en un valor menos ambiguo: el porcentaje de N derivado de aire (% Ndfa) el

cual puede calcularse a partir del valor δ15N usando la siguiente ecuación:

%𝑵𝒅𝒇𝒂 =δ15N de la planta de referencia (no nodulante, maleza) − δ15N de la planta fijadora de N2

δ15N de la planta de referencia − B valor 𝒙 𝟏𝟎𝟎

𝑻𝒐𝒕𝒂𝒍 𝑵𝒅𝒇𝒂 (𝒌𝒈 𝑵 𝒉𝒂) =%𝑁𝑑𝑓𝑎 𝑥 𝑁 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑘𝑔 𝑁 ℎ𝑎)

100

Los valores reportados de β value para frijol son menores a cero, se encuentran reportes

de -2.0, -2-50 y -1.97‰ para un promedio de -2.16‰. (Peoples, 2000; Yoneyama, 1986;

Mariotti, 1980 citados por Unkovich et al 2008). Reportes más recientes y realizados para

ambientes específicos muestran β valores para frijol arbustivo de -3.74‰ con corrección

de N en semilla inicial (Douxchamps et al, 2010). En contraste, los valores para plantas de

referencia están cercanos al valor de δ15N del suelo, para algunos pastos el valor es


positivo por encima de cero de 4.0 a 6.0 ‰, para genotipos de leguminosas mutantes que

no tienen la facultad de nodular los valores son superiores a 7‰. (Unkovich, 2008).

La evaluación de la nodulación puede proporcionar un complemento útil para mediciones,

pero puede haber problemas en la recuperación de todos los nódulos en el suelo y muchas

veces no hay una relación simple entre la masa de nódulos y la fijación de N2. A pesar de

algunas limitaciones, los métodos basados en isótopos proporcionan el enfoque más

preciso para las mediciones de la cantidad de FSN en las plantas (Unkovich, 2008).

1.7 Potencial de fijación simbiótica de nitrógeno (FSN) en frijol voluble

Existen muy pocos estudios que utilizan variedades de frijol voluble. La mayoría de los

estudios tratan sobre volubles en cuento a su rendimiento de grano de campo en sistema

de cultivo intercalado con maíz (Vieira y Vieira, 1996; Geren et al, 2008;.. Dawo et al, 2009).

También se han realizado trabajos enfatizados en la resistencia a enfermedades, y el

cultivo intercalado con plátano (Wortmann y Sengooba, 1993) (Garzón et al., 2008 Musoni

et al., 2010). Sólo CIAT publicó algunos estudios genéticos sobre frijoles volubles o cruces

entre volubles y frijol arbustivo, en los últimos 10 a 20 años, sin embargo, los esfuerzos se

han dirigido a: i) el mejoramiento a enfermedades, con énfasis en mosaico común de virus

(BCMV) y, ii) el mejoramiento para la mejora de los valores nutricionales de hierro y zinc.

Actualmente, se hace hincapié en la tolerancia al estrés abiótico especialmente bajo la

tolerancia de la fertilidad y el calor y resistencia a las enfermedades (Blair, 2006).

Sin embargo, existen menos informes sobre la evaluación de FSN en frijol voluble que en

frijol arbustivo. Graham y Halliday (1976) fueron los primeros en establecer una buena

correlación entre el hábito de crecimiento y su capacidad de fijación de nitrógeno con

mayor FSN en frijol voluble. Estos primeros resultados fueron pronto confirmadas por

Graham y Rosas (1977) que encontraron que genotipos de frijol voluble son superiores a

frijol arbustivo en la reducción de acetileno y de la actividad específica de nódulos (cantidad

de acetileno producida / g de peso seco de nódulos). Sin embargo, en este estudio no se

encontraron diferencias en el desarrollo de nódulos (peso seco de nódulos). Kumarasinghe

et al., (1992) describió el cv voluble. Cipro en términos de su fijación de N2 e informó que

la FSN fue alta en todas las etapas de crecimiento, pero la máxima fijación se produjo entre



las etapas de llenado de vaina, que es el período de mayor demanda de N por la planta

acumulando hasta 119 kg N ha-1 equivalente a 84% de Ndfa. Un estudio más reciente de

Kimani et al (2004) evaluó 60 arbustivos y 60 variedades de frijol voluble encontrando que

frijol voluble tiene mayor capacidad de nodulación en comparación con frijol arbustivo. Por

desgracia, en este estudio, no se tomaron otras variables de medición para FSN distintos

al número de nódulos.

Wortmann (2001) explica que el frijol voluble tiene mayor capacidad para fijar N atmosférico

correspondiente a 49 kg N ha-1 mientras que para frijol arbustivo el valor fue de 34 kg N ha-

1 estos resultados se determinaron a partir de abundancia Natural de δ15N. Hardarson et

al (2003) mostró que accesiones de frijol voluble fueron capaces de fijar hasta 100 kg N ha

mientras que en frijol arbustivo la reducción fue de un 50%. Por otro lado, Ramaekers et al

(2013) evaluó FSN en líneas RILs a partir de los parentales voluble G2333 x el arbustivo

G19839 en campo, donde el porcentaje de fijación (%Ndfa) calculada en los estados

fenológicos R6, R7/8 fue cercano a 50% Ndfa en volubles mientras que en arbustivos fue

inferior con un 30%. De esta manera, es evidente que el potencial de FSN está presente.

1.8 Validación de Metodología grano para cuantificar FSN

El método δ15N abundancia natural presenta algunas ventajas sobre otras metodologías.

Se puede aplicar tanto en condiciones de invernadero y campo. Por otra parte, el método

permite la estimación de la fijación de N en casi cualquier situación en la que tanto las

legumbres fijadoras y no fijadores de N coexisten. Esta metodología se puede aplicar a los

campos de los agricultores, o para cualquier experimento de campo (Unkovich et al., 2008;

Douxchamps et al., 2010). Por lo general se usa la parte aérea o el tejido de la planta

cosechada en diferentes etapas de crecimiento, tales como la floración o llenado de vainas.

(Boddey et al., 2000; Unkovich et al., 2008). Sin embargo, el hecho de tomar muestra de

biomasa aérea, desde una perspectiva de mejoramiento genético, es compleja debido a

que la muestra que se requiere es de gran tamaño y conlleva a mayores costos en tiempo

y dinero para las determinaciones de FSN. Por esta razón, los programas de mejoramiento

de frijol no seleccionan de forma rutinaria para el mejoramiento en la capacidad para fijar

N atmosférico.


Por esto, el desarrollo de metodologías que puedan estimar la capacidad FSN utilizando

tejido de grano podría ser más fácil de integrar de manera rutinaria en la mayoría de los

programas de mejoramiento desde el grano de cosecha para estimar no solo el rendimiento

y la calidad nutricional si no también la capacidad en FSN. Por lo tanto, basado en el

principio que entre un 80 y un 90% del N se movilizan a partir de estructuras vegetativas

al grano en frijol (Ramaekers et al., 2013), y que reportes anteriores que ya validan su uso

mostraron una relación altamente positiva y significativa entre el δ15N de grano y δ15N de

parte aérea para cuantificar FSN (Polania, et al 2016), es necesario reiterar esta relación

para frijol voluble.

1.9 Características para evaluar la respuesta de la planta a FSN

La habilidad en la fijación de Nitrógeno representa para las leguminosas y el frijol mayor

probabilidad para la obtención de N y garantía para la demanda de N en todas las rutas

metabólicas que al final se traducen en Vigor y rendimiento. De esta manera, la fijación de

Nitrógeno está relacionada directamente con variables que se benefician de esta

capacidad. En frijol al presentarse una asimilación de N compartida entre el aire y el suelo,

indicadores como el Uso eficiente del Nitrógeno (NUE), el particionamiento del N a grano

(%NPI), la movilización de asimilados (PHI) y el vigor en términos de Biomasa, evidencian

los efectos de la capacidad %Ndfa y con ello el efecto en el comportamiento fisiológico de

la planta (Lynch and Rodríguez, 1993).

1.9.1 Uso eficiente de N (NUE)

El uso eficiente del nitrógeno por sus siglas en inglés (NUE) es un indicador que muestra

la eficiencia de recuperación de este elemento o en otras palabras, la capacidad de

reducción de las pérdidas de N desde que es asimilado hasta la cosecha. De esta manera,

es posible a través de NUE cuantificar si los genotipos evaluados dentro de un experimento

aprovechan al máximo el recurso N (ya sea de origen del suelo o del aire) para producir la

mayor cantidad de grano. Para el caso de ensayos de Fijación de N donde gran parte del

Nitrógeno asimilado es a través de la simbiosis, es pertinente evaluar el uso eficiente del

N para definir la influencia de FSN en el rendimiento. Anteriores reportes confirman que la

eficiencia en el uso de Nitrógeno es un indicador asociado positivamente con el



rendimiento y el vigor de planta (Zhiqin et al, 2016; Beatty and Wong, 2016; Lynch and

Rodríguez, 1993)

1.9.2 Particionamiento de N (%NPI)

El Nitrógeno asimilado a partir del suelo o del aire se transloca a través de la planta para

participar en fotosíntesis y con ello en producción de grano. En estudios fenotípicos donde

se requiere determinar la eficiencia de uso también es pertinente cuantificar a través de

porcentajes la cantidad del N total asimilado en la fase vegetativa que fue removida o

particionada a la formación de grano. Este índice muestra qué porcentaje de N fue

removido a grano y con ello se dimensiona la eficiencia de uso. Múltiples estudios reportan

%NPI como uno de los índices más importantes para determinar el efecto de estreses

abióticos, fertilización y comportamiento entre genotipos en diferentes especies.

Barraclough et al, (2014) usó %NPI para determinar cuánto del N asimilado en cuatro

genotipos de cereales con diferentes dosis de fertilización se removía al grano y determinó

que dos de cuatro genotipos removilizaban desde partes vegetativas hasta un 85% del N

en todos los tratamientos. En estudios de Fijación de Nitrógeno donde la planta depende

en gran medida de su capacidad para trasformar N atmosférico en amonio, el %NPI sirve

como indicador de la eficiencia del uso de N a partir del aire en la formación de grano.

Otros estudios en frijol muestran que esta especie es capaz de traslocar cerca de 80 a

93% del N al grano (Ramaekers et al., 2013). Por otro lado, para estudios de FSN es

importante determinar %NPI debido a que se ha demostrado que se trasloca y acumula

preferiblemente el N fijado del aire en el grano (Westermann et al, 1985. Dubois y Burris,

1986; Wolyn et al., 1991).

1.9.3 Biomasa y movilización de fotoasimilados.

La biomasa aérea o biomasa dosel pueden entenderse en un sentido fisiológico, como el

resultado de la fotosíntesis neta acumulada del cultivo, y está directamente relacionada

con la producción de fotoasimilados, por esta razón la producción de biomasa es un

indicador de vigor y rendimiento. (Araus et al., 2002).

El objetivo del mejoramiento genético de plantas es seleccionar genotipos que produzcan

mayor cantidad de materia seca (fuente de foto-asimilados) acompañada de una mayor


capacidad de asignación de foto-asimilados al grano. Existen reportes que indican que

esta relación es directa y es usada para inferir acerca de la capacidad de los genotipos y

se ha encontrado una relación positiva entre la biomasa de dosel en la mitad del llenado

de la vaina y el rendimiento de grano, tanto en condiciones de riego y sequía, (Rosales-

Serna et al., 2004; Muñoz-Perea et al., 2007; Klaedtke et al., 2012; Assefa et al., 2013;

Beebe et al., 2013; Rao et al., 2013). Polania et al (2016) cita que genotipos de frijol con

una mayor FSN bajo estrés por sequía, reducen su biomasa comparada con plantas

desarrolladas bajo riego, sin embargo, genotipos promisorios a pesar de esta reducción,

presentan mayor biomasa que genotipos no promisorios y son eficientes con el uso del

carbono para producir los fotoasimilados necesarios en proceso de fijación de N2.

Adicionalmente, en este mismo estudio, la movilización de asimilados a través de biomasa

a grano cuantificados como Índice de particionamiento de vaina e Índice de cosecha (PHI

y HI) referidos como el porcentaje de fotoasimilados exportados de biomasa aérea a vainas

y de vainas a grano, mostraron estar directamente asociados con el rendimiento bajo

estrés por sequía. De esta manera, el mejoramiento de la removilización de N a grano

contribuye a incrementar los rendimientos (Wolyn et al., 1991). Investigaciones anteriores

sugieren que la resistencia a la sequía en frijol común se asocia con una removilización

fotosintatos más eficiente para la formación y producción de granos (Rao, 2001; Hall, 2004;

Rosales-Serna et al., 2004; Klaedtke et al., 2012; Rosales et al., 2012; Assefa et al., 2013;

Beebe et al., 2013, 2014; Rao et al., 2013)

1.10 Factores abióticos que afectan el proceso de FSN

El proceso de FSN requiere de la coordinación de factores internos y externos. Dentro de

los internos se encuentra la especificidad de la planta con la cepa de Rhizobium con la que

se asociará en simbiosis para generar el ensamble y el inicio de la infección. Dentro de los

factores externos que influyen la FSN, se encuentra la temperatura del suelo que afecta el

desempeño de la cepa, la condición de sequía o riego y por último, el factor externo

asociado con la condiciones de suelo que incluye, condición de radiación, concentraciones

de oxígeno, inundación y los contenidos de nutrientes en exceso o en deficiencias

necesarios en los mecanismos de la Fijación Simbiótica de N. El proceso de asimilación

de nitrógeno atmosférico es complejo y requiere de la coordinación de estos factores.



1.10.1 Sequia

La población de Rhizobium en el suelo se reduce drásticamente en condición de sequía

(Giller, 2001). Se ha reportado que Rhizobium sobrevive en poblaciones pequeñas (1.0 x

104 UFC/ gr suelo) bajo sequía que contengan reducidas cantidades de arcilla y materia

orgánica (Chao y Alexander, 1982). Paralelamente, el efecto de sequía tiene efectos

drásticos en el proceso FSN, este proceso se inhibe fácilmente siendo más sensible que

la fotosíntesis, la transpiración, el desarrollo de biomasa y la asimilación de nitratos desde

el suelo (Sinclair et al, 1987; Serraj et al, 1999). En el mismo sentido, se ve afectada la

translocación de los productos de la fijación de la parte aérea al grano (Giller, 2001). Sin

embargo, la tolerancia a la sequía en beneficio de la FSN está relacionado directamente

con la habilidad de las plantas para capturar agua a través de su distribución de raíces,

discriminación de C y adaptaciones estomáticas (Giller, 2001; Devi et al., 2013, Beebe et

al, 2014; Polania et al, 2016). Genotipos promisorios en FSN bajo sequia están asociados

positivamente con vigor de planta, uso eficiente del agua, biomasa de raíces y

removilización de asimilados a grano. Hardarson et al.1993 identificó genotipos con alta

capacidad de fijar N atmosférico bajo condiciones de riego, manteniendo su capacidad con

evidencia de cambios fisiológicos para el mantenimiento de FSN. Polania et al., 2016

identifico genotipos de frijol mesoamericanos RCB 593, SEA 15, NCB 226 y BFS 29 con

buena FSN bajo condiciones de estrés por sequía en asocio positivo con rendimiento de

grano, biomasa aérea, NUE y PHI. La Sequía afecta este proceso, sin embargo los

hallazgos de genotipos promisorios en FSN bajo estrés, generan la posibilidad de mejorar

este atributo.

1.10.2 Efecto de concentraciones altas de N edáfico en FSN

En el caso de leguminosas en asocio con bacterias para fijar N atmosférico, es sabido

que la regulación de este proceso está dado por la planta hospedera y la cepa de la

bacteria simbionte (Giller, 2001). Sin embargo, este proceso también esta mediado por

la concentración de NO3 en el suelo que en concentraciones altas inhibe el proceso FSN

(Leidi and Navarro, 2000; Wanek and Arndt, 2002; Salvagiottia et al., 2008; Giller, 2001;

Ajebesone, 2015, Burchill et al., 2014). Esta regulación se asocia con los altos costos

energéticos que requiere el proceso de FSN correspondientes a 16 moléculas de ATP

por cada molécula de N2 fijada y una demanda del 33% de los asimilados de fotosíntesis


destinados para este proceso (Giller, 2001). Según estas cifras la planta bloquea el

proceso en función de un ahorro y optimización energética. Carroll and Mathews, (1990)

evidenciaron los efectos inhibitorios en la nodulación y contenidos de ureidos en

presencia de nitratos en el suelo. Otros efectos se han observado en nódulos

desarrollados donde se detiene la actividad de FSN, al presentarse una reducción de la

actividad de la nitrogenasa cuantificada a través de la metodología de ARA (Giller, 2001).

En presencia de nitratos, el proceso de inhibición se le puede dar respuesta a través de

una señal interna importante, referida a un sistema de regulación y retroalimentación

sistémica que incluye una larga distancia de señalización entre la raíz y parte aérea,

llamada proceso de Autorregulación de Nodulación (AON) (Figura 1-5). Este mecanismo

fisiológico se activa a través de la producción de señales desde la raíz hasta el tallo y

viceversa, esto promueve la supresión del desarrollo de nódulos inhibiendo la producción

de factores Nod y reduciendo la actividad de la nitrogenasa de nódulos desarrollados. De

esta manera AON genera i) Supresión de la nodulación por completo ii) reducción de la

masa de raíces y nódulos y iii) se inhibe la actividad de la Nitrogenasa en nódulos

maduros (Taiz and Zeiger, 2002; Giller, 2001). Okamoto et al., (2009) reportaron que el

gen LjCLE - RS2, está fuertemente regulando la señal desde las raíces en respuesta a

nitrato. Además, el HAR1 – mutante de Lotus japonicus exhibe un fenotipo tolerante a

nitrato que presenta nodulación y por ende tiene actividad FSN (Oka - Kira et al., 2005).



Figura 1-5. Modelo esquemático de la Autorregulación de la Nodulación (AON). La

percepción del factor Nod rhizobial (1) inicia la infección y la Nodulación, sino que también

genera un inhibidor de larga distancia desde la raíz (2). LjCLE-RS1 y -RS2 son péptidos

que reciben la señal. Esta señal se transporta a la sesión y provoca la producción de la

señal derivada a la parte aérea (3). Las quinasas de tipo receptor LLR (LjHAR1 / GmNARK

/ MtSUNN / PsSYM29) y KLAVIER median este proceso. La señal derivadala parte aérea

se transloca a la raíz donde se reprime la Nodulación TML / RDH1 (4). PsNOD3 y MtRDN

en la raíz truncan la Nodulación (Adaptado de Cuchi et al., 2010). Adaptado de Taiz y

Zeiger, 2002.

Existe una relación directamente proporcional entre la cantidad de Nitrógeno aplicado

(r=0.68) y el rendimiento con valores hasta de 450 kg/ha, sin embargo la relación es

inversamente proporcional entre N tomado por fijación y aplicaciones de fertilización

Nitrogenada superiores a 10 kg/ha (Rennie et al., 1988 citado por Salvagiotti et al., 2008).

Takahashi, 1991 muestra que sin la aplicación de fertilizante N, la soja alcanza una

cantidad máxima de fijación de N2 de 337 kg N fix/ha, En contraste, al aplicar 100 y 300

kg/ ha de fertilizante de N se evidencia una reducción con un valor de fijación de N2 de solo

17 kg N fix ha-1. Wolfgang y Arndt (2002) observaron una reducción en nódulos de las


raíces de soja y una considerable disminución en la fijación de nitrógeno del 84% a 3% de

%Ndfa con un aumento en la concentración de nitrato de 0,25 a 25 mM.

1.10.3 Efecto de deficiencias de fosforo (P) en FSN

La FSN se ve afectada considerablemente por deficiencias de P en el suelo. Chagas et al.,

(2010) sugiriere que los niveles de P altos en los suelos aumentan el porcentaje de

nitrógeno procedente de la atmósfera (% Ndfa) en hojas de frijol y bajo inoculación de

cepas de rizobios. Esto se debe a que las leguminosas para formar las relaciones

simbióticas con las bacterias y para convertir el nitrógeno N2 en amonio (NH4) requieren

de una oferta energética elevada correspondiente a 16 ATPs por cada molécula de N

atmosférico (Taiz y Zeiger, 2002). De hecho, se ha demostrado en varios estudios que hay

un incremento neto de 5 al 28 % en la fotosíntesis para la producción de ATP en las plantas

leguminosas que hacen FSN con inoculación de cepas de Rhizobium (Kaschuk et al.,

2009). Olivera et al, (2004) cita que la demanda de P en nódulos es mayor que en otros

tejidos. Ojiem (2006), observó un aumento del 50% en la acumulación de biomasa y

nodulación del frijol común variedad. KK8 con la aplicación de 30 kg P ha- 1 y concluyó que

la aplicación de P es esencial para la fijación de N2. Olivera et al., (2004) Explica que en el

nódulo, el nitrógeno genera la fijación de amonio NH4 y que este se procesa a aminoácidos

y ureidos a través de la Ciclo de la SG / GOGAT; en este proceso la enzima glutamina

sintetasa GS utiliza ATP y forma glutamina, con lo cual, la glutamina se convierte en

glutamato por el glutamato sintasa (NADH - GOGAT) y finalmente el N es asimilable como

aminoacidos (Cullimore y Bennett 1998). Este proceso y la posterior transformación en

aminoácidos y ureidos, son procesos que consumen energía. Por esto, las deficiencias de

P generan la inhibición de la enzima Glutamina sintetasa (GS) y GOGAT y por ende la

disminución de síntesis de aminoácidos y compuestos nitrogenados.

1.10.4 Efecto de deficiencias nutricionales de Fe, Mo, Ca.

El molibdeno y el hierro están involucrados tanto en la asimilación de N como en la fijación

de nitrógeno FSN, una deficiencia de molibdeno puede provocar una deficiencia de

nitrógeno, si el nitrógeno fuente es principalmente nitrato o si la planta depende de FSN.

Aunque las plantas requieren sólo una pequeña cantidades de molibdeno, las limitaciones

de molibdeno en forma molibdato se dan debido a que este elemento es susceptible a la



lixiviación y complejación con la materia orgánica, por su parte el Fe puede ser adsorbido

en suelos altamente erosionados (Taiz y Zeiger, 2002).

En el nódulo donde se alberga Rhizobium la enzima nitrogenasa está compuesta

molecularmente por dos componentes: la proteína - Fe y el proteína Mo-Fe, de manera

que esta enzima contiene en su estructura molecular iones de molibdeno (Mo4 + a través

Mo6 +) y Fe que actúan como cofactores sirviendo como puentes en la cadena

oxidoreduccion de electrones. (Taiz y Zeiger, 2002). De esta manera, la oferta de Mo y Fe

es esencial para el funcionamiento de la enzima nitrogenasa y con ello la FSN. Según

Tarek Slatni et al (2008), plantas de frijol con crecimiento bajo deficiencias de Fe mostraron

que el crecimiento de nódulos y FSN disminuyeron, al igual que la actividad GS involucrada

en el ciclo de GOGAT debido a que el Fe está involucrado en la síntesis de Nitrato

reductasa. En el mismo sentido Krouma y Abdelly (2003) evidenciaron diferencias

genotípicas en requisito Fe y uso eficiente de Fe (UEF) de los cultivares de frijol en función

de la fijación simbiótica de nitrógeno (FSN) Los resultados muestran que el cultivar ARA14

produce más materia seca y más nódulos que Coco blanc. ARA14. ARA 14 se caracterizó

por una alta capacidad de fijación de nitrógeno y un mejor uso Fe. Los resultados sugieren

que la eficiencia en el uso del Fe en la fijación simbiótica de nitrógeno podría ser utilizado

para detectar las líneas de frijol tolerantes a la deficiencia de Fe en la condición de la

fijación simbiótica de nitrógeno. Según Ella et al., (2006) las leguminosas, que desarrollan

una simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno, tienen una mayor demanda de hierro

debido a que este elemento es componente de la leghemoglobina. Las deficiencias en

hierro pueden afectar la iniciación y el desarrollo del nódulo. Múltiples autores concuerdan

en la importancia y las evidencias del Fe en la eficiencia de FSN (Tang et al., 1990, O’Hara

et al., 1988, Krouma et al., 2006, Moran et al., 1997, Clément et al., 2005).

2. Metodología

2.1 Localización y condiciones experimentales.

Se realizaron dos ensayos en campo: Finca experimental CIAT Berlín II en Darién (Valle

del cauca), y en la Estación experimental CIAT en la localidad de Popayán (Cauca) de

junio a septiembre en el 2014 y 2015 respectivamente. Las localidades variaron en altitud,

el contenido de nitrógeno del suelo y la precipitación media anual.

La Finca experimental CIAT en Darién se encuentra situada entre 03°5'0 '' N y 76°28'0 ''

W, con una altitud de 1.523 metros sobre el nivel del mar (msnm). La temperatura media

anual es de 20°C y una precipitación anual de 1.650 mm. El suelo en Darién se clasificó

como un Inceptisol (Typic Dystrandept) con pH 5.6, 7.1% de materia orgánica determinado

por espectrometría Walkley-Black, nitrógeno total 0.25% y 26.6 kg ha−1 de nitrógeno

disponible. El P disponible fue determinado por Bray II, el cual correspondió a un valor de

6.45 mg kg-1, adicionalmente la densidad aparente del suelo fue determinada por el método

del cilindro con un valor correspondiente a 0.97 g/cm3.

La estación de Popayán está localizada entre 2°25′39″ N and 76°37′17″ W con un altitud

de 1750 msnm. El promedio de temperatura en esta localidad fue de 20.1°C y un régimen

de lluvia de 2124 mm anuales. El suelo se clasificó como un Inceptisol (Typic dystandept)

derivado de cenizas volcánicas, con pH edáfico de 5.71, 14.4% de materia orgánica,

nitrógeno total correspondiente a 0.72% y 72.4 kg ha−1 de N disponible, 4.89 mg kg-1 de P

disponible determinado por Bray II. La densidad aparente fue determinada por el método

del cilindro correspondiente a 1.1 g/cm3.

Los experimentos fueron establecidos en áreas de 2800 m2, con fertilización edáfica

correspondiente a: 40 kg ha−1 de P (GranoFOS 40®) and 30 kg ha−1 de K excepto nitrógeno

(N) además de una fertilización foliar para suplir de los micronutrientes Mo, Fe, Co, Zn.

http://tools.wmflabs.org/geohack/geohack.php?language=es&pagename=Popay%C3%A1n&params=2_26_39_N_76_37_17_W_



Las arvenses fueron controladas en preemergencia y pos emergencia al igual que las

plagas y las enfermedades. Durante el ciclo del cultivo en cada uno de los ensayos fue

registrada la precipitación acumulada con valores de 190 mm en 2014 y 275 mm en 2015.

2.2 Diagnóstico de línea base

Previo al establecimiento del ensayo, se realizó un diagnóstico de línea base de suelos a

través de la cuantificación y mapeo de las variables: Población de Rhizobium nativo

expresado en (ufc/ g suelo) por medio de la técnica de número más probable (NMP) y

conteo de poblaciones en plantas trampa de macroptilium atropurpureum antes y después

de las inoculaciones con Rhizobium tropici (CIAT- UNDP, 1988). Otras de las variables de

suelo mapeadas fueron: distribución de P disponible (P mg kg-1), nitrógeno disponible (N:kg

ha−1), y % de materia orgánica mediante un muestreo sistemático en 9 puntos. Esto con el

fin de suministrar información y dar futuras repuestas al comportamiento de Fijación de N

en Frijol voluble.

2.3 Material Vegetal

El material vegetal de frijol voluble consistía en 100 líneas de fríjol voluble, correspondiente

a 89 líneas avanzadas denominadas líneas ENF y 11 controles. Las poblaciones

parentales de las líneas ENF se obtuvieron a través de cruzamientos simples y dobles. El

objetivo de estos cruces fue encontrar materiales resistentes a enfermedades

especialmente para antracnosis y / o el virus del mosaico común del frijol, por esta razón

su nombre ENF (enfermedades) (CIAT, 2012). Para este estudio se seleccionaron líneas

de grano rojo, rojo moteado, crema, blanco y amarillo. Los controles fueron G5702 como

control histórico reportado por CIAT como genotipo supernodulante, y dos líneas G2333 y

G19839 como padres de algunas líneas ENF evaluadas por Ramaekers et al (2013).

También fueron usados como controles genotipos no nodulantes como GLORIABAMBA

NN y algunas líneas MAC como MAC 4, MAC 9, MAC 33, MAC 74, MAC 56, MAC 25,

MAC 57 con atributos de grano comercial, adaptación a alturas medias y alto rendimiento.

La semilla de estos genotipos se obtuvo del programa de mejoramiento genético de frijol

del CIAT, Cali Colombia.

Capítulo 2. Metodología 29

2.4 Inoculación con Rhizobium cepa CIAT 899

Para garantizar la fijación simbiótica de nitrógeno no se aplicaron fuentes de nitrógeno en

el suelo y se inoculó con Rhizobium Tropici cepa CIAT 899. La preparación del inóculo se

realizó siguiendo la metodología reportada por Remans et al., (2008). La cepa fue aislada

y purificada proveniente de ampolletas liofilizadas de la colección de Rhizobium del CIAT.

La bacteria fue sembrada en medio de cultivo LMA (Levadura Manitol Agar) y en

incubación a 28°C a pH 6.8. Rhizobium tropici es una cepa de rápido crecimiento, la

bacteria se trasladó a un medio LMA liquido donde se llevó a crecimiento por

aproximadamente 6 días. Se realizaron las pruebas de viabilidad del inoculo con el fin de

garantizar una población superior a 1.0 x 10 7 ufc/ml. Para la fabricación del inoculo sólido

para aplicaciones en campo, se inyectaron 30 ml de medio liquido en bosas de turba estéril

de 50 g. Estas bolsas de sellaron y se agitaron por 7 días a temperatura ambiente.

Posteriormente, se realizan las pruebas de viabilidad para garantizar la población de la

cepa en campo. La inoculación se llevó a cabo a los 8 y 15 días después del

establecimiento (DDE) , aplicado en drench a la base del tallo, previa calibración de la

bomba y el operario (Anexo A).

2.5 Diseño experimental

Para cada localidad, se realizó un diseño alpha latice 10 x 10 con tres repeticiones para

un total de 600 surcos. Los tratamientos correspondieron a cada uno de los 100 genotipos.

Las unidades experimentales consistían en dos surcos de 2.5 metros de largo y 0.60 entre

surcos y 10 cm entre plantas, para un total de 50 plantas por repetición y 150 por genotipo

con tres repeticiones.

2.6 Determinación de Fijación Simbiótica de Nitrógeno

Se realizaron muestreos en las etapas de desarrollo fenológico del cultivo: floración (R6),

mitad de llenado de vaina (R7/8) y cosecha (R9).

Se asignó previo a los muestreos, un surco para realizar muestreos destructivos y otro

para determinación de componentes de rendimiento.



En floración (R6), se cuantificó la Nodulación, esta determinación se realizó mediante la

extracción de tres plantas y posteriormente se asignó una calificación a través de una

escala de evaluación visual donde 1 se considera pobre Nodulación y 9 excelente habilidad

nodulante, esta estimación se asignó teniendo en cuenta la homogeneidad de las tres

raíces, numero de nódulos, viabilidad, abundancia y tamaño de nódulos (Schoonhoven

and Corrales CIAT. 1991) (ver Anexo A protocolo FSN).

Tanto en floración como en mitad de llenado de vaina se determinó biomasa aérea. Para

esta variable se tomaron 50 cm (largo del surco) de biomasa aérea correspondiente

aproximadamente a 6 plantas. La biomasa fue separada en hojas y tallos y secada a 60°C

por dos días, para determinación de materia seca. Una submuestra de materia seca fue

molida y almacenada en vacutainers® con el fin de pesar 3.0 mg de tejido en microbalanza

y encapsularla para la determinación de isotopo de 15N. Estas variables fueron analizadas

en el Centro de Isótopos Estables de UC Davis, California, USA mediante un analizador

elemental PDZ Europa ANCA-GSL interfaz con un espectrómetro de masas de isótopos

20-20 relaciones (PDZ Europa Sercon Ltd., Cheshire, UK; Sharp 2005).

Con los datos de isótopos 15N, la cantidad de nitrógeno fijado (% Ndfa) fue calculada

utilizando la siguiente formula: (Shearer and Kohl, 1986 citado por Unkovich, 2008).

%𝑵𝒅𝒇𝒂 =δ15N de la planta de referencia (no nodulante, maleza) − δ15N de la planta fijadora de N2

δ15N de la planta de referencia − B valor 𝒙 𝟏𝟎𝟎

Donde δ15N de la planta de referencia es el valor del genotipo no nodulante

GLORIABAMBA NN, δ15N de la planta fijadora corresponde al valor del genotipo nodulante

y el B valor es δ15N de una planta de habito IV con crecimiento en arena cuarzo libre de

fuente de N y por ende, con total dependencia del suministro de N por FSN. Este B valor

fue = -3.32‰ obtenido a partir del promedio de δ15N corregido por N en semilla, del

genotipo MAC 33 de habito IV evaluado en invernadero (sección 2.7).

Para mitad de llenado (R7/8) de vaina se tomaron 50 cm (largo de surco) de biomasa

aérea y raíces del surco de muestreo y se determinaron las mismas variables que en

floración. En cosecha se cuantificaron componentes de rendimiento como número y peso

seco de vainas y granos, además de la determinación de 15N a partir de harina de grano.


Los índices NUE, NPI y PHI fueron determinados con los datos de mitad de llenado y

cosecha. Estos Indices se calcularon a través de las siguientes formulas:

i) Uso eficiente del Nitrogeno (NUE): NUE = ((Rendimiento de grano kg ha-1)/ (N en biomasa aérea en kg ha-1)

ii) Indice de particionamiento del N (%): NPI = (rendimiento x % N grano) / Kg Biomasa aérea x %N en Biomasa aérea) x 100.

iii) Indice de cosecha de vaina (%): PHI = (biomasa seca de grano en cosecha) / (biomasa seca de vainas en cosecha) x 100.

2.7 Determinación de B valor ensayo en invernadero

Debido a la necesidad de determinar el B valor, y con esto cuantificar con más precisión

el Nitrógeno derivado de la atmosfera (%Ndfa) en frijol voluble (sección 2.5), se estableció

simultáneamente un ensayo en invernadero.

Los genotipos utilizados en este ensayo fueron determinados por diferir en su hábito de

crecimiento así: genotipo CAL 96 para habito I, SMC 140 para habito II, GGR18 para habito

III y MAC 33 para habito de crecimiento IV o voluble, como control se evaluó el genotipo

BAT 477 NN. Se estableció un diseño de bloques completos al azar con 5 repeticiones

para cada etapa fenológica correspondiente a floración, mitad de llenado y cosecha. Con

65 unidades experimentales. Cada unidad experimental consistía en un pote de 8 kg con

arena cuarzo estéril y libre de N, las plantas fueron inoculadas con la cepa de Rhizobium

CIAT 899 y regadas semanalmente con solución nutritiva libre de N. Las variables que

fueron evaluadas semanalmente fueron los contenidos de clorofila SPAD y el vigor. En los

muestreos correspondientes a floración, mitad de llenado y cosecha se secó el tejido de

biomasa aérea, nódulos y grano en cosecha a 60°C por 48 horas. A su vez, una

submuestra de tejido seco se molió y encapsuló para la determinación de δ15N por

espectrofotometría de masas en UC Davis, California. La Corrección de N por semilla se

realizó a partir de la fórmula:

𝐵 = (δ15N toda la planta x N total de toda la planta) − (δ15N en semilla inicial x Nitrógeno total de semilla inicial)

(𝑁 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎 − 𝑁 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎)



Fueron necesarios para la corrección de N por semilla los datos de peso inicial de semilla

y contenidos de N en semilla antes de iniciar el montaje del ensayo.

Adicionalmente durante el muestreo se determinó Nodulación y sus componentes, peso y

número de nódulos. Al final fue generada una tabla con los resultados de B value por habito

de crecimiento, por etapa de fenológica de desarrollo y combinada, los datos fueron

congruentes y cercanos a los valores generados para frijol en reportes pasados

(Douxchamps, 2010, Uncovich, 2008)

2.8 Medidas fisiológicas y variables complementarias

Con el dato %Ndfa se logró cuantificar Ndfa total expresado en kg N fijado ha-1 y Nitrógeno

total derivado del suelo expresado en kg N ha-1 a partir de las siguientes formulas:

(𝑖) 𝑁 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑛 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑒𝑟𝑒𝑎 𝑜 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑜 = % 𝑁 𝑥 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑜 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑘𝑔/ ℎ𝑎

(𝑖𝑖) 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑁𝑑𝑓𝑎 (𝑘𝑔 /ℎ𝑎) = %𝑁𝑑𝑓𝑎 𝑥 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑁 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑒𝑟𝑒𝑎 𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑁 𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑜 𝑘𝑔 /ℎ𝑎

(𝑖𝑖𝑖) 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑁𝑑𝑓𝑠 (𝑘𝑔/ ℎ𝑎) = 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑁 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑒𝑟𝑒𝑎 𝑜 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑜 − 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑁𝑑𝑓𝑎 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑜 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑜

En mitad de llenado de vaina, se registraron los valores de contenidos de clorofila (SMCR)

en un trifolio intermedio de 10 plantas en el surco de muestreo, esta medición fue

determinada con un equipo SPAD chlorophyll meter model 502. Adicionalmente, la

fenología fue monitoreada y registrado días a floración por genotipo y repetición al igual

que días a madurez fisiológica (número de días desde la siembra hasta que al menos el

90% de las plantas alcanzan la madurez fisiológica en una parcela (Ramaekers et al 2013;

Ambachew et al, 2015)

En cosecha fueron tomados 0.5 m del surco de muestreo. Se realizó el registro de número

de plantas, numero de semillas y vainas, peso de semillas y vainas, peso de 100 semillas,

rendimiento kg ha-1, δ15N, % N el tejido y con esto la determinación de Índice de cosecha

de vaina (PHI), Uso eficiente de N (NUE), Particionamiento del N (NPI).


2.9 Validación de resultados nodulación y Ndfa en invernadero de genotipos promisorios y no promisorios en FSN identificados en campo

Después de los resultados obtenidos en Darién donde se identificaron genotipos

promisorios y no promisorios tanto en Nodulación como en %Ndfa, se realizó una

validación del comportamiento de los genotipos en invernadero. Se evaluaron los

genotipos promisorios en FSN de Darién ENF 28, ENF 235, ENF 234, CGA 10, ENF 98 y

ENF 130. Y no promisorios ENF 29, ENF 207, ENF 81, CGA 52 y ENF 95 además de los

controles no nodulantes Gloriabamba NN y un genotipo promisorio ENF 130 como control

absoluto sin suministro de Nutrientes con solución nutritiva y sin inoculación de Rhizobium

cepa CIAT 899. Todos los genotipos se desarrollaron en potes de 8 kg en sustrato arena

cuarzo estéril y soluciones nutritivas libres de N e inoculo liquido con un población

superior a (107 Rhizobium cells/ml). Este ensayo se organizó en un diseño de experimento

en bloques completos al azar; para cada genotipo de frijol, se montaron cuatro repeticiones

para un total de 52 plantas en el experimento. El muestreo fue en Floración y se valuó

Nodulación a partir de la escala visual 1- 9, el vigor de plantas y del contenido de clorofila

a lo largo del ensayo. Adicionalmente las determinaciones de δ15N, %N se obtuvieron con

datos de biomasa aérea y grano para hacer los cálculos de %Ndfa y Total Ndfa.

2.10 Análisis estadístico

Los datos fueron analizados por medio del programa estadístico SAS 9.3 con el paquete

PROC MIXED y PROC CORR (SAS Institute Inc., 2008). Se determinaron las medias

ajustadas por variable para cada genotipo en cada localidad (ambiente) correspondiente a

Darién y Popayán. Esto se obtuvo utilizando la teoría de los modelos mixtos junto con el

procedimiento MIXED teniendo en cuenta los efectos de las repeticiones y bloques y los

genotipos como los tratamientos. Los coeficientes de correlación de Pearson fueron

determinados con el paquete PROC CORR donde *, **, *** correspondían a los niveles de

significancia a niveles de probabilidad de p< 0.05, 0.01 y 0.001 respectivamente. Para el

análisis multivariado, la relación entre las variables a nivel fenotípico se evaluó mediante

gráficos Biplots y análisis de componentes principales PCA a través del paquete SAS

PRINCOMP indicando hasta 8 componentes (SAS Institute Inc., 2008).

3. Resultados

3.1 Diagnóstico de la línea base del suelo

La FSN se ve afectada por múltiples factores entre ellos la condición del ambiente y en

especial la condición en la que se encuentra el suelo (Giller, 2001). Se realizó el mapeo de

los lotes antes del establecimiento del ensayo para las dos localidades. Los análisis previos

al establecimiento de los ensayos mostraron, pH acido en ambas localidades sin

diferencias significativas con valores de 5.5 en Darién y 5.7 en Popayán (Tabla 3-1).

Respecto a la población de Rhizobium nativo, los resultados muestran que la población

fue baja con valores de a 1.0x104 ufc/g suelo en ambas localidades, evidenciando la

necesidad de incrementar la población mediante inoculación uniforme con la bacteria

Rhizobium tropici Cepa CIAT 899. La población de Rhizobium se determinó con el fin de

identificar las necesidades de inoculación y el éxito del establecimiento de la bacteria en

cada lote, teniendo en cuenta que el antecedente de cultivo de cada uno fue en ambos

casos, cultivos de pasturas y mantenimiento de ganado.

La determinación posterior a la primera inoculación mostró que hubo un aumento de la

población a valores por encima de 1.0 x 107 en la localidad de Darién, aunque en la

localidad de Popayán hubo aumento pero no se llegó a los valores esperados, esto debido

en gran medida a las concentraciones de NO3 en el suelo evidenciados en valores altos

de %Materia Orgánica (%MO) correspondientes a 14%. Es preciso recordar que tanto la

actividad de la bacteria como el proceso de FSN se inhiben bajo condiciones de suelo con

altas concentraciones de N (Giller, 2001) (Tabla 3-1).

Esto también es evidente en los contenidos de Nitrógeno total disponible y NO3 mapeados

(Figura 3-1, Figura 3-2 y Figura 3-3), donde la localidad de Popayán muestra valores

mayores a pesar de No fertilizar con Nitrógeno ninguno de los dos ensayos. En cuanto a



fosforo, indispensable también para el éxito del proceso de FSN, los valores son similares

para las dos localidades correspondientes a 5.1 y 4.9 valores medidos antes de la

fertilización de 60 kg ha-1 de P.

Tabla 3-1. Caracterización de suelos en cuento a: cantidad de nitrógeno, %materia orgánica, fosforo disponible y NPM de Rhizobium en Darién y Popayán 2014. Eventos de lluvia y temperatura durante el ciclo de cultivo A. Darien 2014 B. Popayán 2015

Características del suelo antes del experimento

Localidad pH %MO NT % N disponible

(kg ha−1 ) P

(mg/kg)

Rhizobium antes de inoculación (MPN)

cfu/g soil

Darién 2014 5.5 7.1 0.35 26.63 5.1 1.0x104

Popayán 2015 5.7 14.4 0.7 72.4 4.9 5.0 x104

Source: Darien and Popayán soil analysis- Nutrition Plants and soil microbiology Laboratory, CIAT.

days after planting

0 20 40 60 80 100

Pre

cip

itació

n (

mm

dia

-1)

0

10

20

30

40

50T

em

pe

ratu

ra °

C

12

14

16

18

20

22

24

26

28

mm Darien

riego

dia vs T max darien

dia vs T min Darien

dia vs temp promedio Darien

Days after planting

0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

5

10

15

20

25

30

A. Darien 2014

B. Popayán 2015

127 mm 77.5 mm 85.5 mm

220 mm 29.7mm 25.7mm

Capítulo 3. Resultados 37

Figura 3-1. Mapeo para definición de línea base antes del establecimiento del ensayo. A.

Población de Rhizobium en suelo por punto de muestreo UFC/ g suelo

Figura 3-2. Mapeo para definición de línea base antes del establecimiento del ensayo. B.

Concentración de P disponible en mg kg-1



Figura 3-3. Mapeo para definición de línea base antes del establecimiento del ensayo. C.

Concentración de Nitratos mg/ kg.

3.2 Habilidad de fijación simbiótica de nitrógeno

3.2.1 Nodulación

Una de las primeras variables a evaluar en floración para ambas localidades fue la

habilidad en nodulación a través de la escala visual de 1 a 9, basada en número de

nódulos, abundancia, viabilidad, tamaño y homogeneidad entre raíces de muestreo (1

pobre nod y 9 máxima nod).

La nodulación presentó efectos significativos entre localidades. La localidad de Darién

presentó mayores valores de nodulación que la de Popayán con valores promedio de

calificación de 7.0 y 3.0 respectivamente (Tabla 3-2. Figura 3-4). Los genotipos

presentaron diferencias altamente significativas entre localidades. Sin embargo, genotipos

como ENF 235 y ENF 28 presentaron la mayor nodulación en las dos localidades. Los

genotipos CGA 10 y ENF 234 promisorios para nodulación en la localidad de Darién

redujeron la Nodulación drásticamente en la localidad de Popayán. En contraste, el


genotipo ENF 81 presentó los valores más bajos de nodulación en las dos localidades y

su comportamiento se clasificó al nivel del genotipo no nodulante GLORIABAMBA NN.

En la Figura 3-5, se observa la apariencia de una raíz clasificada en 8 correspondiente al

genotipo ENF 28 de alta nodulación y este comportamiento fue congruente entre las

repeticiones en ambas localidades con aproximadamente 1200 nódulos viables, medianos

a grandes en tamaños y abundantes. En contraste, se muestra también la apariencia de

una raíz con clasificación 2 para el genotipo ENF 81 con menos de 30 nódulos, pobre

abundancia y en su mayoría inviables.

La evaluación de nodulación presentó una asociación positiva con la biomasa aérea para

las dos localidades aunque en la localidad de Popayán la biomasa fue 40% mayor con un

promedio de 5594 kg ha-1 comparado con la de Darién con 3753 kg ha-1 (Tabla 2).

Genotipos promisorios presentaron buenos valores de biomasa aérea, como ENF 28 con

3878 kg ha-1. Los genotipos no promisorios en nodulación presentaron un valor de biomasa

inferior, como ENF 81 con 2135 kg ha-1. Los genotipos no nodulantes presentaron los

valores más bajos afirmándose como controles (Figura 3-5).

Figura 3-4. Habilidad en nodulación según escala 1-9 para para los 100 genotipos de frijol voluble en las dos localidades A. Nodulación en la localidad de Darién B. Nodulación en la localidad de Popayán.

CG

A

10

EN

F

28

EN

F

98

EN

F 2

34

INIA

P

404

NN

CG

A

46

CG

A

57

CG

A

62

CG

A

64

EN

F

29

EN

F

31

EN

F

34

EN

F

64

EN

F

70

EN

F

71

EN

F

80

EN

F

82

EN

F

85

EN

F

130

EN

F

137

EN

F

159

EN

F

169

EN

F

188

EN

F 2

35

G

19839

G

5702

MB

C

118

CG

A

56

EN

F

52

EN

F

76

EN

F

136

EN

F

164

EN

F

167

EN

F

233

MA

C

57

MA

C

27

BO

LIV

AR

CG

A

42

D.

MO

RE

NO

EN

F

21

EN

F

23

EN

F

86

EN

F

87

EN

F

91

EN

F

92

EN

F

113

EN

F

147

EN

F

163

EN

F

171

EN

F

178

EN

F

190

EN

F

201

EN

F

211

MA

C

56

MA

C

25

MB

C

117

PO

07A

T 4

9

PO

07A

T 5

7

CG

A

58

CG

A

61

CG

A

71

CG

A

78

EN

F

24

EN

F

25

EN

F

32

EN

F

61

EN

F

96

EN

F

172

EN

F

173

EN

F

174

EN

F

182

EN

F

194

EN

F

199

EN

F

202

EN

F

204

EN

F

208

EN

F

212

EN

F

213

MA

C

9

MA

C

33

CG

A

11

CG

A

52

EN

F

3

EN

F

4

EN

F

30

EN

F

83

EN

F

84

EN

F

95

EN

F

114

EN

F

177

EN

F

193

EN

F

207

G

2333

MA

C

74

MA

C

4

MA

C 5

2E

NF

2

7

EN

F

81

EN

F

112

GLO

RIA

BA

MB

A N

N

02

46

810

Escala

de n

od

ula

ció

n (

1-9

)

Darien 2014ENF 235

ENF 28

CGA 10

ENF 234

ENF 81

Gloriabamba NN

Genotipo

D. M

OR

EN

OEN

F 235

EN

F 28

EN

F 130

EN

F 34

G 5702

EN

F 137

EN

F 173

EN

F 201

CG

A 52

CG

A 56

EN

F 159

EN

F 174

EN

F 204

EN

F 21

EN

F 234

EN

F 24

EN

F 25

EN

F 27

EN

F 31

EN

F 32

EN

F 52

EN

F 61

EN

F 71

EN

F 84

EN

F 87

EN

F 95

G 2333

MAC

33

MAC

52

MAC

74

CG

A 46

CG

A 57

CG

A 58

EN

F 147

EN

F 163

EN

F 164

EN

F 167

EN

F 171

EN

F 182

EN

F 188

EN

F 190

EN

F 199

EN

F 202

EN

F 207

EN

F 211

EN

F 212

EN

F 30

EN

F 4

EN

F 83

EN

F 91

G 19839

INIA

P404 N

NM

AC

27

MAC

9

PO

07AT49

BO

LIV

AR

CG

A 10

CG

A 11

CG

A 42

CG

A 61

CG

A 62

CG

A 64

CG

A 71

CG

A 78

EN

F 112

EN

F 113

EN

F 114

EN

F 136

EN

F 169

EN

F 172

EN

F 177

EN

F 178

EN

F 193

EN

F 194

EN

F 208

EN

F 213

EN

F 23

EN

F 233

EN

F 29

EN

F 3

EN

F 64

EN

F 70

EN

F 76

EN

F 80

EN

F 81

EN

F 82

EN

F 85

EN

F 86

EN

F 92

EN

F 96

EN

F 98

MAC

25

MAC

4

MAC

56

MAC

57

MBC

117

MBC

118

PO

07AT57

GLO

RIA

BAM

BA N

N

0

2

4

6

8

Popayán 2015ENF 235

ENF 28

ENF 234

CGA 10 ENF 81

Gloriabamba NN



Figura 3-5. Apariencia de nodulación y vigor de biomasa aérea entre genotipos

contrastantes para nodulación (A). Genotipo ENF 28 con alta nodulación, promisorio para

ambas localidades (B). Genotipo ENF 81, baja nodulación.

3.2.2 Nitrógeno derivado de la atmosfera (%Ndfa)

La fijación de nitrógeno derivado de la atmósfera presentó diferencias altamente

significativas entre localidades. La localidad de Popayán presentó una reducción de 30%

(Tabla 3-2) probablemente debido a los altos contenidos de MO y N que presentaba este

suelo; respecto a los contenidos en la localidad de Darien; resultados acordes a lo

reportado, donde altos contenidos de NO3 en el suelo inhiben el proceso FSN (Giller, 2001;

Burchill et al, 2014; Salvagiottia, 2008; Leidi and Rodriguez, 2000, Wolfgang and Arndt.

2002). En contraste, la localidad de Darién que presentó un menor contenido de N en

suelo, favoreció un mayor %Ndfa. El %Ndfa para Popayán fue en promedio de 34% en

comparación con Darién con 41.3%.

Los índices NUE y NPI fueron 51% menores en Popayán con diferencias significativas (p<

0.05), indicando menos eficiencia y removilización de N para la producción de grano. La

A

.

B

.


translocación de fotosintatos a grano expresada como el índice de cosecha de vainas

(PHI), aunque fue mayor en la localidad de Darién, no se presentaron diferencias

estadísticas significativas (Tabla 3-2).

Sin embargo, a pesar que los genotipos establecidos en la localidad de Popayán

presentaron menores valores para los parámetros de FSN, la biomasa aérea fue 30%

superior en relación a la localidad de Darién. La acumulación de N fue 40% mayor al igual

que la cantidad de Nitrógeno asimilado desde el suelo (Total Ndfs); y el contenido de

clorofila SPAD (Tabla 3-2). El contenido de nitrógeno asimilado derivado del suelo en las

dos localidades expresado en kg N ha-1 (Total Ndfs) fue superior al Nitrógeno total derivado

de la atmosfera kg N ha-1 (TNdfa), el 60% del nitrógeno total asimilado provino del suelo,

debido a que, la planta de frijol se caracteriza por una asimilación de N compartida ( suelo

y atmosfera), favoreciendo la del suelo al requerir un menor gasto energético en relación

a la asimilación por Fijación Simbiótica de N (Giller, 2001). Por otro lado, fue evidente una

relación positiva entre el nitrógeno derivado del suelo (Ndfs total) y el rendimiento (Tabla

3-3). Sin embargo, entre localidades, los genotipos establecidos en Darién presentaron un

40% más de capacidad en fijación de nitrógeno atmosférico proveniente del proceso FSN

en relación a la localidad de Popayán. Adicionalmente, las plantas desarrolladas en la

localidad de Darién presentaron 12% más rendimiento que en Popayán (Tabla 3-2) con

diferencias significativas en el rendimiento de grano entre las dos localidades (p<0.05). Es

evidente el efecto positivo del N fijado proveniente de la atmosfera por el proceso de FSN

para el rendimiento.

A pesar de las diferencias entre localidades, dentro de cada una, se identificó variabilidad

en la capacidad FSN y en rendimiento, identificando genotipos promisorios adaptados a

las diferentes concentraciones de N en el suelo.

Tabla 3-2. Promedios y rangos asociados a Fijación Simbiótica de Nitrógeno (FSN) en 100

genotipos de frijol voluble desarrollado en Darién 2014 y Popayán 2015

*,**,*** Significant difference al 0.05 level as estimated from MIXED procedure



3.2.3 Nitrógeno derivado de la atmosfera % Ndfa y el rendimiento de grano

La capacidad para fijar nitrógeno del aire está directamente relacionada con el rendimiento.

Sin embargo la correlación entre Ndfa (%) y rendimiento fue baja (r= 0.14*) (Tabla 3-3).

Sin embargo, las líneas ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21 and CGA 10 fueron

promisorias en FSN en ambas localidades independiente de las condiciones favorables y

desfavorables para el proceso de FSN.

Estas líneas promisorias mantuvieron altos niveles de fijación Ndfa superiores a 50% en

combinación con buenos rendimientos por encima de 3500 kg ha-1. (Figura 3-6). El

Rasgo Experimento Media Min Max GxA

SPAD Contenidos de clorofila Darien 38.4 ± 0.3 33.7 43.9 a **

Popayan 42.5 ± 0.3 37.8 47.7 b

Escala nodulacion (1-9) Darien 7.0 ± 0.95 1.0 8.0 a

** Popayan 3.0 ± 0.7 1.0 7.0 b

Biomasa aerea (kg Ha-1) Darien 3753 ± 285.3 1527 7488 a

*** Popayan 5594 ± 285.3 2901 8876 b

PHI (%) Darien 74.7 ± 0.2 65.2 83.5 a ns

Popayan 70.3 ± 0.2 57.3 78.2 b

Rendimiento (kg ha-1) Darien 3592 ± 157.1 1786 6830 a ***

Popayan 3172 ± 156.9 1931 4644 b

N total en biomasa aerea (kg N ha-

1) Darien 148.1 ± 13.4 59.0 295.7 a

** Popayan 251.2 ± 13.5 131.5 401.8 b

N total en grano (kg N ha-1) Darien 130.1 ± 8.0 60.4 200.5 a ns

Popayan 120.5 ± 8.0 73.7 183.1 a

%Ndfa_Grano Darien 41.3 ± 6.6 0.0 67.8 a ***

Popayan 34.4 ± 2.8 0.2 43.7 b

%Ndfa_Biomasa aerea Darien 24.6 ± 5.5 0.0 44.6 a ***

Popayan 19.1 ± 3.1 0.0 32.6 b

Total Ndfa Biomasa (kg N ha-1) Darien 35.1 ± 4.4 1.8 85.8 a **

Popayan 45.2 ± 4.4 0.1 93.4 b

Total Ndfa grano (kg N ha-1) Darien 49.2 ± 2.0 0.2 91.2 a ***

Popayan 42.4 ± 2.1 0.3 60.1 b

Total Ndfs grano (kg N ha -1) Darien 81.7 ± 6.7 35.5 144.5 a ns

Popayan 78.1 ± 6.8 47.7 181.9 a

Total Ndfs Biomasa (kg N ha-1) Darien 113.1 ± 12.0 48.1 265.0 a **

Popayan 205.9 ± 12.0 108.9 340.4 b

Índice particionamiento de N (%) Darien 102.4 ± 4.9 45.4 189.5 a ***

Popayan 53.9 ± 5.0 25.4 94.2 b

Uso eficiente del N Darien 27.8 ± 1.3 11.4 60.7 a ***

Popayan 14.2 ± 1.3 6.5 23.5 b


genotipo ENF 235 presentó los valores más altos de %Ndfa en ambas localidades (Figura

3-6). El genotipo ENF 28 fue uno de los mejores fijadores y también presentó tolerancia a

antracnosis, atributo evaluado en ensayos anteriores (datos no publicados CIAT, 1995).

El control MAC 27 fue promisorio al presentar valores intermedios dé %Ndfa

correspondientes a 40% y el más alto de los valores de rendimiento correspondiente a

6827 y 4460 kg ha1 en Darién y Popayán respectivamente (Figura 3-6). En contraste, los

genotipos ENF 213, CGA 11 y ENF 81 fueron inferiores en su capacidad de fijar Nitrógeno

con 25% de Ndfa y rendimiento correspondiente a 2500 kg ha-1. GLORIABAMBA NN como

genotipo control, evidenció el más bajo rendimiento y 70% del nitrógeno asimilado fue

proveniente de suelo (TNdfs) equivalente a 95 kg N ha-1 del total del requerimiento

reportado para frijol correspondiente a 136 kg ha-1 (Cardona et al., 1995). Nuestros

controles nodulantes G 5702, G 19839, MAC 56, MAC 4, G 2333, MAC 9, MAC 33,

MAC 74, MAC 57, MAC 52 and MAC 25 muestran menor %Ndfa y rendimiento que los

genotipos identificados como promisorios (Figura 3-6)



Figura 3-6. La identificación de genotipos que combinan una mayor % Ndfa con el

rendimiento de grano (kg / ha) cultivadas en un Inceptisol en Darién en 2014 y Popayán

en 2015. Los datos de δ15N de grano fueron utilizados para estimar %Ndfa. Los genotipos

con valores más altos de rendimiento de grano y %Ndfa fueron identificados en el

cuadrante superior derecho. Genotipos marcados en rojo mostraron capacidad FSN

superiores en ambos lugares. Genotipos marcados en azul fueron pobres en su capacidad

FSN en ambos lugares.

3.2.4 Nitrógeno total derivado de la atmosfera TNdfa (kg N ha-1) y el rendimiento de grano.

Los genotipos ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21, PO 07AT49 y CGA 10 presentaron

los valores más altos de nitrógeno fijado en kg N ha -1 (TNdfa). Estas líneas promisorias

tuvieron valores de Nitrógeno total derivado de la atmosfera (TNdfa) de hasta 92 kg de N

fijado por ha soportado rendimientos de 4600 kg ha-1 sin aplicación de fertilizante (Figura

3-7). Una correlación positiva y significativa fue evidenciada entre Ndfa total y rendimiento

de grano para ambas localidades, correspondiente a (r = 0.40***) para Darién y (r =0.86***)

(Tabla 3-3). Evidenciando que el N fijado a partir del aire es una parte importante del total

de N asimilado y que este aporte contribuye positivamente en el rendimiento de grano.

-10 0 10 20 30 40 50

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

%Ndfa grano

Mean: 3172 ***

Mean: 34.4 ***

r= 0.04 nsB . Popayán 2015

ENF 52

ENF 235ENF 159

D.MORENO

ENF 21ENF 28

PO07AT49ENF 234

ENF 202ENF 130

GLORIABAMBA NN ENF 81CGA 11

ENF 213

ENF 194

MAC 57

MAC 27CGA 46

ENF 95

PO07AT47

MAC 25

MBC 117

CGA 10

ENF 98

CGA 57

ENF 4

ENF 86ENF 190

ENF 201

ENF 82

ENF 85

ENF 178

BOLIVAR

ENF 114

ENF 87

0 10 20 30 40 50 60 70

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Re

nd

imie

nto

( k

g h

a-1

)

%Ndfa en grano

MAC 27

ENF 83

ENF 64MBC 117

CGA 10

PO07AT49

ENF 82

ENF 28

ENF 235

CGA 58

ENF 213

ENF 233ENF 163

MAC 56CGA 11

CGA 52GLORIABAMBA NN

ENF 81

ENF 194

MAC 25ENF 24

ENF 207

ENF 95

ENF 204MAC 57

G 2333

ENF 85

CGA 61

ENF 21

ENF 173

ENF 98

ENF 234

ENF 112ENF 31

ENF 87

ENF 4

ENF 130

ENF 92

ENF 61

ENF 147

ENF 177

MAC 33

ENF 84

ENF 113

ENF 86

ENF 171

ENF 112

MAC 4

MBC 118

Mean: 3593 ***

r= 0.14 *A. Darien 2014Mean: 41.3 ***


Figura 3-7. Identificación de genotipos que combinan un mayor Ndfa Total expresado en

kg N fijado ha-1 con el rendimiento de grano (kg ha-1) cultivadas en un Inceptisol en Darién

en 2014 y Popayán en 2015. Los datos de δ15N de grano fueron utilizados para estimar

%Ndfa y con ello Ndfa total. Los genotipos con valores más altos de rendimiento de grano

y Ndfa total fueron identificados en el cuadrante superior derecho. Genotipos marcados en

rojo mostraron capacidad FSN superiores en ambos lugares. Genotipos marcados en azul

fueron pobres en su capacidad FSN en ambos lugares

3.2.5 Nitrógeno total derivado del suelo TNdfs (kg N ha-1) y el rendimiento de grano.

Los genotipos promisorios en para fijación biológica de N en la localidad de Darién, donde

las condiciones fueron más favorables para el proceso, muestran una menor proporción de

N asimilado a partir del suelo (TNdfs), en contraste con los genotipos no promisorios y el

genotipo no nodulante que evidenciaron valores mayores de N derivado del suelo (Figura

3-8). El genotipo MAC 27 se destacó por combinar buena fijación de N2 con una buena

capacidad de tomar nitrógeno del suelo. En la localidad de Popayán, el comportamiento

fue diferente, las concentraciones altas de NO3 en afectaron el proceso FSN y en general

los genotipos tomaron en mayor medida N derivado del suelo que del aire, sin embargo, se

identificaron genotipos que a pesar de esta condición mantuvieron la fijación de nitrógeno,

ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21 y CGA 10 Fijaron N en ambas localidades (Figura 3-

8). Los genotipos ENF 83, MBC 117 y MAC 57 fueron genotipos con altos rendimientos

aunque su capacidad fijadora de N fue moderada.

0 20 40 60 80 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

MAC 27

ENF 235

PO07A49

ENF 21

ENF 84 CGA 10

ENF 28

ENF 130

ENF 234

CGA 46

ENF 83

ENF 64MBC 117

G 2333ENF 207

ENF 208

MAC 57

MAC 52

CGA 58

MAC 4

ENF 163

ENF 213CGA 11

ENF 81

GLORIABAMBA NN

CGA 61

ENF 71ENF 212

ENF 194

ENF 95

MBC 118ENF 36

MAC 56

ENF 52

Re

nd

imie

nto

( k

g h

a-1

)

Total Ndfa - grano (kg N ha-1

)

A. Darien 2014 r= 0.40 ***

Mean: 3593***

Mean: 49.3 ***

-10 0 10 20 30 40 50 60 70

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

ENF 235CGA 10

PO07AT49

ENF 52

ENF 21

ENF 28

CGA 57

ENF 130

D. MORENO

CGA 46

MAC 27

ENF 234

ENF 213

ENF 81

CGA 11

ENF 194

GLORIABAMBA NN

MAC 57

ENF 95

MAC 52

ENF 114

ENF 193ENF 96

CGA 62

ENF 92

ENF 61

CGA 52MBC 117

ENF 159

ENF 233

ENF 4

ENF 147

ENF 163

ENF 86ENF 113

ENF 201

ENF 190

ENF 178

ENF 82

MAC 56

ENF 211

Total Ndfa grano(kg N ha-1

)

Mean: 3172 ***

Mean: 42.4 ***

r= 0.86 ***B. Popayán 2015



Figura 3-8. . La identificación de genotipos que combinan un mayor Ndfs Total expresado

en kg N fijado desde el suelo por ha-1 con el rendimiento de grano (kg ha-1) cultivadas en

un Inceptisol en Darién en 2014 y Popayán en 2015. Los datos de δ15N de grano fueron

utilizados para estimar Ndfs total. Los genotipos con valores más altos de rendimiento de

grano y Ndfa total fueron identificados en el cuadrante superior derecho. Genotipos


marcados en azul eran pobres en su capacidad FSN en ambos lugares

3.2.6 Fijación Simbiótica de Nitrógeno y extracción de N en biomasa aérea y grano.

Los genotipos establecidos en la localidad de Popayán presentaron 45% más contenido

Total de N en parte aérea en kg ha-1 que los de la localidad de Darién (Tabla 3-2). El

contenido de N en biomasa se relacionó positivamente con la biomasa de la parte aérea,

al igual, que rendimiento con el contenido de N en grano, expresado en (kg ha-1) (Tabla 3-

3).

Sin embargo, no se presentaron diferencias significativas entre los genotipos promisorios

y no promisorios en cuanto a este rasgo (p <0,05) Tabla 3-2). Los genotipos promisorios

en FSN ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21, PO07AT49 y CGA 10 presentaron 33% más

de nitrógeno total en grano y parte aérea que los no promisorios, esto ocurrió en ambas

localidades . Los controles G 5702, G 19839, MAC 56, MAC 4, G 2333, MAC 9, MAC

33, MAC 74, MAC 57, MAC 52 y MAC 25 mostraron un comportamiento similar con un

promedio de 132 kg N ha-1 en cuento al contenido de N con respecto a los genotipos

40 60 80 100 120 140

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Total Ndfs grano (kg N ha-1

)

Mean: 3593 **

Mean: 78.1 ns

r= 0.91 ***B. Popayan 2015

ENF 234

ENF 235

CGA 10

PO07AT49

ENF 28

ENF 52

ENF 21ENF 130

CGA 64

MAC 27CGA 46

CGA 11ENF 213

ENF 81 GLORIABAMBA NN

ENF 3G 2333

ENF 190

ENF 201

ENF 82

ENF 25

ENF 86

ENF 113

D.MORENO

MAC 57

MAC 25

ENF 95

ENF 74

MAC 57

ENF 114

MAC 25

ENF 193ENF 83

ENF 95

ENF 69

ENF 71

CGA 42

ENF 194

ENF 171

ENF 87

20 40 60 80 100 120 140 160

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

MAC 27

ENF 83

ENF 64

ENF 207ENF 85

MAC 52

ENF 95

ENF 194MAC 25

ENF 81

CGA 46

ENF 52

CGA 10

ENF 130

ENF 28

ENF 235

PO07AT49

GLORIABAMBA NNCGA 11

ENF 234

ENF 213

ENF 21

ENF 23

ENF 169

MAC 56

ENF 164

ENF 87

ENF 233

ENF 70

ENF 167

ENF 204

ENF 29ENF 173

ENF 136

CGA 52

ENF 91

ENF 112

ENF 147

Re

nd

imie

nto

( k

g h

a-1

)

Total Ndfs grano (kg N ha-1

)

Mean: 3593 ***

Mean: 81.6 ***

r= 0.75 ***A. Darien 2014


promisorios con un valor de 138 kg N ha-1. De manera que, se afirma la existencia de una

influencia positiva del N de la capacidad en FSN

Tabla 3-3. Coeficientes de correlación (r) entre % Nitrógeno derivado de la atmosfera

estimado usando tejido de parte aérea (%Ndfa-SH), % Nitrógeno derivado de la atmosfera

usando tejido de grano (%Ndfa-G).Nitrógeno Total derivado de la atmosfera en kg N ha-1

usando grano (TNdfa-G), Nitrógeno total derivado del suelo en kg N ha-1 usando grano

(TNdfs-G), Nitrógeno total en grano kg N ha-1 (N total G), uso eficiente del nitrógeno en kg

de grano producido por N asimilado en parte aérea kg.kg-1 (NUE), Biomasa aérea en kg

ha-1 y el rendimiento en kg ha-1 de 100 líneas de frijol voluble establecidas en Darién y

Popayán Colombia en 2014 and 2015.

Darien

Rasgo % Ndfa-SH %Ndfa-G TNdfa-G TNdfa-SH TNdfs-G N total G NUE SB GY

% Ndfa-SH 1

%Ndfa-G 0.42*** 1

TNdfa-G 0.21** 0.72*** 1

TNdfa-SH 0.76*** 0.29** 0.30** 1

TNdfs-G 0.34*** -0.67*** 0.07 0.10* 1

N total G -0.16* 0.15* 0.52*** 0.09 0.81*** 1

NUE 0.11 0.12* 0.12* 0.39*** 0.33*** 0.35*** 1

SB 0.05 0.04 0.21** 0.48*** 0.28** 0.36*** -0.59*** 1

GY 0.14* 0.14* 0.40*** 0.06 0.75*** 0.94*** 0.33*** 0.31*** 1

Popayán

Rasgo % Ndfa-SH %Ndfa-G TNdfa-G TNdfa-SH TNdfs-G N total G NUE SB GY

% Ndfa-SH 1

%Ndfa-G 0.46*** 1

TNdfa-G 0.02 0.35*** 1

TNdfa-SH 0.58*** 0.20** 0.24** 1

TNdfs-G -0.32** -0.34*** 0.73*** 0.09 1

N total G -0.23** -0.09 0.89*** 0.15* 0.96*** 1

NUE 0.02 0.03 0.31*** 0.45*** 0.31*** 0.33*** 1

SB 0.20* -0.07 0.32*** 0.60*** 0.37*** 0.37*** -0.60*** 1

GY 0.21* 0.04 0.86*** 0.20** 0.91*** 0.95*** 0.33*** 0.41*** 1



3.2.7 Índice de eficiencia de uso e índice de particionamiento de nitrógeno

Los genotipos establecidos en la localidad de Popayán en la localidad de Popayán

presentaron mayor acumulación de N en parte aérea aunque una menor acumulación de

N en grano. Dentro de las localidades se evidencia que los genotipos promisorios tienen

mayor eficiencia en uso y particionamiento del nitrógeno (NUE y %NPI) hacia la producción

de grano, estos genotipos se caracterizaron por presentar mayor producción de grano por

unidad de N asimilado en comparación con genotipos con una menor capacidad en fijación

de N atmosférico.

NUE mostró un asocio positivo con Ndfa total correspondiente a r= 0.12 y r= 0.31 para

Darién y Popayán respectivamente (Tabla 3-3). Los genotipos promisorios en Fijación

Simbiótica de N, ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21, PO 07AT49 y CGA 10 en Darién

mostraron una mayor eficiencia de uso de N con 33 kg kg-1 de grano por kg de N asimilado

en comparación con Popayán con sólo 16 kg kg-1. Por el contrario, los genotipos no

promisorios en fijación ENF 213, CGA 11 y ENF 81 y el no nodulante GLORIABAMBA NN

presentaron menores valores de NUE y NPI correspondientes a 20 kg kg-1 para Darién y

13 kg kg-1 en promedio para frijol voluble en Popayán (Figura 3-9).. Los controles G 5702,

G19839, MAC 56, MAC 4, G 2333, MAC 9, MAC 33, MAC 74, MAC 57, MAC 52 y MAC

25, presentaron un comportamiento similar a los genotipos promisorios en cuanto a NUE

y NPI en la localidad de Popayán, por el contrario, estos controles fueron 10% menos

eficientes en el uso del Nitrógeno en la localidad de Darién comparado con los promisorios

(Figura 3-9)


Figura 3-9. La identificación de genotipos que combinan una mayor N total derivado de la

atmósfera (TNdfa) en kg de N por hectárea con NUE cultivadas en un Inceptisol en Darién

2014 y en Popayán en 2015. Los genotipos con valores más altos de y TNdfa fueron

identificados en el cuadrante superior derecho. Genotipos marcados en rojo mostraron

capacidad FSN superiores en ambos lugares. Genotipos marcados en azul fueron pobres

en su capacidad FSN en ambos lugares

3.2.8 Fijación Simbiótica de nitrógeno y producción de biomasa aérea.

Se presentaron diferencias altamente significativas para producción de biomasa aérea

entre localidades. La biomasa aérea fue 30% mayor en Popayán que en Darién. Sin

embargo, genotipos en la localidad de Popayán presentaron menor Fijación de N y

rendimiento (Tabla 3-2). La relación fue positiva y significativa entre la capacidad fijadora

de N de los genotipos y la cantidad de biomasa aérea producida correspondiente a r =0.48

y r = 0.60 para la localidad de Darién y Popayán respectivamente (Tabla 3-3) Se presentó

variación entre el TNdfa (kg N ha-1) de los genotipos y la producción de en ambos lugares,

esto se debe probablemente a las diferencias entre genotipos en su capacidad para

adquirir N del suelo (TNdfs) y también a las diferencias en la eficiencia de uso de N para

la producción de biomasa de parte aérea. ENF 182 fue un genotipo muy vigoroso con un

mayor valor de TNdfa (kg N ha-1) en Darién, mientras ENF 167 combinó mayor vigor y

valor de TNdfa (kg N ha-1). ENF 173, ENF 82 y ENF 159 fueron genotipos superiores en

-10 0 10 20 30 40 50 60 70

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26B. Popayan 2015 0.31 ***r=

Mean: 42.4***

Mean: 14.2 ns

Total Ndfa grano (kg N ha-1

)

ENF 92ENF 82

ENF 190

ENF 173

ENF 201

ENF 80

ENF 61

ENF 29

ENF 164

CGA 57

ENF 30

ENF 212

ENF 171

ENF 137

G 5702 ENF 32

ENF 188 ENF 96

ENF 233

ENF 193

ENF 172

ENF 112

ENF 95GLORIABAMBA NN

ENF 81

ENF 21

CGA 11

CGA 64

CGA 46

ENF 213

ENF 234

ENF 130

ENF 235

ENF 28

PO07AT49CGA 10

MAC 27

0 20 40 60 80 100

10

20

30

40

50

60

70

Us

o e

fic

ien

te d

el N

itro

ge

no

NU

E (

kg

kg

-1)

Total Ndfa grano (kg N ha-1

)

Mean: 27.9 ***

Mean: 49.3 *** r= 0.12 *A. Darien 2014

CGA 10

PO07AT49

ENF 235

ENF 21

ENF 52

ENF 130

CGA 11

GLORIABAMBA NN

ENF 213

ENF 81

CGA 46

MAC 27

CGA 64

ENF 28

PO07AT57

ENF 31

ENF 84

ENF 112

ENF 234

MAC 57CGA 42

ENF 114

ENF 83

ENF 201CGA 61

ENF 167

ENF 113ENF 121

ENF 71 ENF 173

ENF 80 ENF 29CGA 71

ENF 92

ENF 208

CGA 56

ENF 194

ENF 87

ENF 182

ENF 95

ENF 3

ENF 96



su capacidad FSN en Darién, mientras ENF 159 presento una capacidad superior en

Fijación Simbiótica de N pero moderado en su producción de biomasa aérea (Figura 3-10).

La línea MAC 27 presentó un nivel moderado de biomasa aérea en Darién con un

rendimiento excepcional. Aunque su FSN fue moderada. Genotipos promisorios en FSN

ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21, PO07AT49 y CGA 10 presentaron una biomasa de

copa de moderada a buena en ambas localidades relacionándose positivamente con Ndfa

y Rendimiento.

Figura 3-10. La identificación de genotipos que combinan una mayor Biomasa de parte

aérea (SB) en kg de N por hectárea cultivados en un Inceptisol en Darién 2014 y en

Popayán en 2015. Los genotipos con valores más altos de SB y TNdfa fueron identificados

en el cuadrante superior derecho. Genotipos marcados en rojo mostraron capacidad FSN

superiores en ambos lugares. Genotipos marcados en azul fueron pobres en su capacidad

FSN en ambos lugares.

0 20 40 60 80 100

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

GLORIABAMBA NN

ENF 159

ENF 173

ENF 82

ENF 213

ENF 28

ENF 92

MAC 57

ENF 167

ENF 29

ENF 177

ENF 64ENF 202CGA 78 CGA 56

CGA 46

CGA 10

PO07AT49CGA 11

ENF 234

ENF 83

CGA 52

ENF 172

ENF 233

MAC 74

ENF 235MAC 33

CGA 58

ENF 112

ENF 211

ENF 201

Total Ndfa parte aerea (kg N ha-1

)

Mean: 5594 ***

Mean: 45.2***

r= 0.60 ***B. Popayán 2015

ENF 81

-20 0 20 40 60 80 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Bio

ma

sa

aé

rea

( k

g h

a-1

)

Total Ndfa parte aerea (kg N ha-1

)

Mean: 3753***

Mean: 35.1 ***

r= 0.48 ***A. Darien 2014ENF 182

ENF 25

ENF 194

ENF 64

ENF 30

GLORIABAMBA NN

ENF 81

ENF 213

CGA 11 ENF 235

CGA 10

ENF 21

ENF 52

ENF 28CGA 64

CGA 46

MAC 27

ENF 234

ENF 172 G 19839

ENF 173

ENF 82

ENF 159

CGA 62

ENF 211

ENF 85

ENF 147

ENF 29

ENF 84

G 2333

ENF 136

ENF 188

ENF 4

ENF 137

ENF 80ENF 208

ENF 201

ENF 98

MBC 117

CGA 61

MAC 74


3.3 Análisis multivariado componentes principales (PCA) y biplots

3.3.1 Análisis multivariado componentes principales CP

El análisis multivariado muestra que los tres primeros componentes explican el 83%

de la variabilidad observada en el fenotipaje de FSN de los 100 genotipos de frijol

voluble en las localidades de Darién y Popayán (Tabla 3-4). En el componente 1 los

rasgos que más contribuyeron a la variabilidad fueron: %Ndfa, nitrógeno total de parte

aérea expresado en kg ha-1, nitrógeno derivado del suelo (TNdfs).

Uso eficiente del nitrógeno (NUE) y % de particionamiento del N (NPI). En el

componente 2, las variables fueron: Biomasa de parte aérea, Contenido total de N en

grano, nitrógeno derivado del suelo (TNdfsG) a partir de grano y el rendimiento. En el

componente 3 se encontraron: estimación visual de Nodulación y nitrógeno total

derivado de la atmosfera (TNdfa) a partir de grano y parte aérea. PHI estaba en el

cuarto componente con menor influencia en el rendimiento de grano.El análisis de PC

sugiere que bajo condiciones nitrógeno favorables y desfavorables para el proceso

FSN (ubicaciones Darién y Popayán), el rendimiento se asocia principalmente con el

nitrógeno del suelo y su acumulación en la biomasa, y también con la capacidad de

usar y particionar eficientemente el N asimilado.

Otros rasgos que influencian en gran medida el rendimiento fueron la capacidad de

fijar nitrógeno atmosférico y la biomasa aérea. La Nodulación tiene una influencia

moderada, sin embargo, se demuestra que no necesariamente a mayor Nodulación

existe una mayor fijación y rendimiento y que es probable que estas variables

dependan más de la calidad de nódulos de la cantidad Estos rasgos demuestran la

importancia de la asimilación tanto de N del suelo como de N del aire

complementándose como fuentes alternas que contribuyen juntas a la productividad

de frijol voluble.



Tabla 3-4. Nodulación: Evaluación visual de nodulación , biomasa aérea (kg ha-1),, NG: N

total en grano (kg ha-1), Nsh: N total en biomasa aérea (kg ha-1), %Ndfa-G: % N derivado

de la atmosfera usando grano, TNdfa-Sh: N total fijado derivado del aire a partir de biomasa

aérea (kg N ha-1), TNdfs-Sh: N total derivado del suelo a partir de biomasa aérea (kg N ha-

1), TNdfa-G: N total fijado derivado del aire a partir de grano (kg N ha-1), TNdfs-G: N total

derivado del suelo a partir de grano (kg N ha-1), rendimiento (kg ha-1), NUE: Uso eficiente

del Nitrógeno (kg g kg N-1 ), NPI: Indice de particionamiento del nitrógeno and PHI: Índice

de cosecha de vaina.

Componentes principales

1 2 3 4 5 6

Eigenvalues 4.230 3.360 1.553 0.639 0.503 0.392

% Varianza acumulada 0.385 0.690 0.831 0.889 0.935 0.971

Matriz de componentes

Nodulación 0.064 0.134 0.620 -0.611 0.140 0.444

Biomasa aerea 0.416 0.240 -0.106 -0.042 0.208 -0.097

NG -0.154 0.497 0.004 -0.024 -0.334 -0.036

Nsh 0.413 0.254 -0.116 0.039 0.255 0.019

%Ndfa-G 0.314 0.302 0.218 0.047 -0.262 -0.663

TNdfa-Sh 0.276 0.153 0.350 0.729 0.052 0.415

TNdfs-Sh 0.375 0.234 -0.281 -0.245 0.294 -0.159

TNdfa-G -0.067 0.348 0.507 0.075 -0.115 -0.639

TNdfs-G -0.166 0.406 -0.345 -0.082 -0.343 0.424

Rendimiento -0.171 0.472 -0.099 0.055 0.036 -0.021

NUE 0.413 0.139 -0.062 0.106 0.502 0.082

NPI 0.424 0.090 0.009 0.067 0.537 -0.004

PHI 0.044 0.134 0.411 -0.630 0.120 0.243


3.4 Análisis de Biplots

En análisis de biplots permite observar el agrupamiento de genotipos según características

en común y su relación con los componentes principales. Los 100 genotipos fueron

analizados y agrupados en tres clúster relacionados con los valores de las variables de

fijación de nitrógeno, biomasa y rendimiento. Los genotipos fueron agrupados en 3 clúster

para las localidades de Darién y Popayán donde se identificaron los mejores

agrupamientos y los peores. Para la localidad de Darién (Figura 3-11) las variables de

rendimiento y fijación presentaron valores deseables con agrupamiento en el clúster #3

seguido por el #1 y por último el clúster #2 con valores menos favorables. Para la localidad

de Popayán (Figura 3-12) en términos de fijación de Nitrógeno, eficiencia del uso de N y

rendimiento, los mejores genotipos se ubicaron en el Clúster #3, seguido por Clúster # 2 y

clúster #1.

3.4.1 Análisis de clúster localidad Darién

3.4.1.1 Clúster #3:

Se encuentran los genotipos con mayor fijación de nitrógeno (>60 kg N ha-1) tanto en Grano

como en parte aérea, además de buen rendimiento (3916 kg ha-1), mayor cantidad de

biomasa (4882 kg ha-1), nitrógeno en grano (147.9 kg N ha-1) y parte aérea (195.0 kg N ha-

1). Sin embargo, estos genotipos tienen menos Uso eficiente del Nitrógeno (NUE) y

particionamiento (NPI), es decir que, producen 22 kg de grano por kg de nitrógeno, este

valor en frijol es bueno, sin embargo, hubo genotipos en el clúster # 1 que produjeron más

grano con la misma cantidad de N asimilado, con un valor promedio de 48 kg de grano por

kg de N siendo más eficientes.

En general los genotipos en este clúster tomaron nitrógeno tanto de la atmosfera como del

suelo y lo removilizaron adecuadamente a grano al evidenciar buen rendimiento, buen

particionamiento y contenidos de N en grano. Dentro de este clúster podemos encontrar

44/100 genotipos, sin embargo de estos 44, 18 genotipos presentaron rendimiento superior

a > 4000 kg ha-1. Continuando con la selección se encontraron 12 genotipos con ambos

atributos tanto mayor rendimiento como mayor Fijación derivada de la atmosfera TNdfaG

(>60 kg N fijado ha) , estos genotipos correspondieron a: CGA 10, CGA 56, CGA 57, D.

MORENO, ENF 21, ENF 52, ENF 64, ENF 85, ENF 130, ENF 182, ENF 188 y ENF 204.



De esos 12 genotipos 9 /100 tienen Biomasa superior a 4000 kg ha-1 correspondientes a:

CGA 10, CGA 56, D. MORENO, ENF 52, ENF 64, ENF 85, ENF 182, ENF 188, ENF 204.

Estos 9 Genotipos tienen a parte de los atributos anteriores valoración de Nodulación de

>6. El genotipo destacado para este clúster fue CGA 10. A pesar de esto, en este clúster

hay genotipos con TNdfa bajo <40 kg N ha como CGA 71, ENF 4, ENF 24, ENF 95,

ENF 177, ENF 194, ENF 207, G 2333 y MAC 74.

Estos están en este clúster a pesar de tener baja fijación de N porque presentaron valores

altos de biomasa aérea 4950 kg ha y rendimiento promedio 3700 kg ha. No tienen un valor

alto de NUE (21.8 kg de grano por cada kg de N) y tiene un valor alto de Nitrógeno derivado

del suelo. Estos genotipos toman más N de suelo (111 kg N ha) que de la atmosfera (30.5

kg N ha) y lo que toman lo translocan adecuadamente a rendimiento. Solo 5 genotipos en

este clúster tuvieron PHI superior a 80% correspondiente a: ENF 24, ENF 159, ENF 173,

ENF 174 y ENF 177, la correlación con YDHA y Ndfa fue de 0.24 y 0.17 respectivamente.

3.4.1.2 Clúster #2:

Este agrupamiento es grande con 37 Genotipos con los menores valores en rendimiento,

fijación de N tanto de la atmosfera y N en grano, este se divide en dos subgrupos 2A y 2B:

Clúster 2A: Este agrupamiento está más influenciado por las variables NUE, NPI y

rendimiento, sin embargo los genotipos más cercanos al eje TNdfa tienen valores

significativos de fijación de N superiores a 60 kg N ha , NUE de 32kg de grano por kg de

N , biomasa intermedia inferior a Clúster #3 con 3200 kg ha y rendimiento de 3600 a 4000

kg ha , correspondiente a los genotipos CGA 64, ENF 28, ENF 29, ENF 96, ENF 112,

ENF 113, ENF 201, ENF 234 y ENF 235.

De estos 10 genotipos 6 tienen valores de fijación destacados > 65 kg N ha CGA 64, ENF

28, ENF 29, ENF 112, ENF 234 y ENF 235 además presentaron valores altos de

Nodulación y de estos solo ENF 112 tuvo esta característica más un rendimiento superior

a 4.0 ton ha-1.

Cluster 2B: Este subagrupamiento está caracterizado por presentar los valores más bajos

en rendimiento de 1700 a 3100 kg ha, baja fijación de Nitrógeno de 36 kg N ha, valores

bajos de NUE ( 20.4) y NPI y biomasa (3000 kg ha) aquí se encuentran 19 genotipos


correspondientes a CGA 11, CGA 52, CGA 58, ENF 3, ENF 23, ENF 70, ENF 81, ENF

86, ENF 87, ENF 92, ENF 147, ENF 163, ENF 164, ENF 212, ENF 213, ENF 233, MAC

4, MAC 33, MAC 56.

3.4.1.3 Cluster #1:

Este Agrupamiento es pequeño con 17 genotipos. Es el clúster que contienen a los

genotipos con menor producción de Biomasa aérea (2227 kg ha) pero con el mayor

rendimiento (4015 kg ha), esto se debe en gran medida a sus altos valores de NUE y NPI

( 48.5 kg de grano por cada kg de N y 173.1 % ) comparado con los demás clúster (28.3

promedio ), estas plantas también tienen capacidad de fijar Nitrógeno (47.3 kg N fijado ha)

aunque con valores menores a los genotipos contenidos en clúster 3 ( 55 a 60 kg N ha). El

NUE y NPI fueron las variables que más influyeron a este clúster, en el están los genotipos

más eficientes en el uso del Nitrógeno. De los 17 genotipos encontrados en este clúster

solo 6 genotipos tienen valores superiores de TNdfa ó nitrógeno fijado superiores a 60 kg

N ha-1 , rendimientos de casi 5000 kg ha-1 ( 4914 kg) y NUE y NPI sobresalientes > 45 NUE

correspondientes a ENF 31, ENF 84, MAC 27, CGA 46 y PO 07A T 49.

Por otra parte, Genotipos No sobresalientes con valores de fijación inferiores a 40 kg N ha,

Biomasa aérea de 1860 kg ha y rendimientos de intermedios a bajos (3200 kg ha)

corresponden a los genotipos CGA 42, CGA 61, CGA 78, ENF 61, ENF 81 y ENF 114.

Incluyendo todos los clúster para Darién, genotipos con rendimientos > 3500 kg ha y

TNdfa> 50 kg N ha corresponden a 33/100 entre los cuales tenemos a ENF 235, CGA 10,

PO 07A T 49, ENF 52, ENF 29, ENF 204, ENF 173, CGA 56, CGA 57, ENF 21, ENF

84, ENF 82, ENF 174, ENF 112, ENF 31 y ENF 28.



Figura 3-11. Variables de FSN, biomasa y rendimiento representadas en Biplots de 100 genotipos de frijol voluble establecidos en la localidad de Darién (2014). Los clúster o agrupamientos se identifican por colores y la magnitud de los vectores indica el CP de cada variable.


3.4.2 Análisis de clúster localidad de Popayán

En términos de fijación de nitrógeno, eficiencia del uso de N y rendimiento del mejor al peor

los clúster se organizaron así: Clúster #3, Clúster # 2 y Clúster #1 (Figura 3-12)

3.4.2.1 Clúster #3:

En este clúster se albergan 52/100 Genotipos más de la mitad de la población evaluada y

en él se caracteriza el CP 1 con una varianza de 42.8% donde influyen en mayor medida

las variables de rendimiento, Uso eficiente del N además de fijación de N del aire y del

suelo determinadas ambas a partir de Grano (TNdfaG y TNdfaSh).

Los genotipos cercanos a los ejes de este clúster tienen buen rendimiento 3354 kg ha,

mayor fijación Simbiótica de N (46.6 kg N fijado ha), a su vez la mayor asimilación de N

derivado del Suelo (82.3 kg de N ha derivado desde el suelo), evaluación visual de

nodulación con escala 3.3 y Uso eficiente del N (16.6 kg de grano por cada kg de N

asimilado), se afirma, que es el mejor clúster para variables de interés como el rendimiento

y la fijación de N.

Sin embargo, en este clúster están los genotipos con menor valor de biomasa de parte

aérea 4800 kg ha comparado con los genotipos agrupados en el 7200 en el clúster 2. De

los 52 genotipos contenidos en este clúster hay 16/100 con TNdfa superior a 50 kg N fijado

ha con promedio de 53.3, estos genotipos corresponden a CGA 52, ENF 112, ENF 130,

ENF 172, ENF 174, ENF 21, ENF 235, ENF 28, ENF 32, ENF 84, ENF 95, MAC 25,

MAC 27, MAC 52, MAC 74, PO07AT49.

De estos 19 genotipos, 10/100 presentaron combinación de TNdfa > 50 kg N ha y

rendimiento superior a 3600 kg ha , estos corresponden a CGA 52, ENF 235, ENF 28,

ENF 32, ENF 84, ENF 95, MAC 25, MAC 27, MAC 52 y PO07AT49. Por otra parte, hay

genotipos que se comportan opuestos a los ejes de este clúster donde la fijación de N es

inferior a 40 kg N fijado ha y el rendimiento < 3600 kg ha-1 BOLÍVAR, CGA 71, ENF 137,

ENF 171, ENF 188, ENF 194, ENF 199, ENF 207.



3.4.2.2 Clúster #2:

Las variables que se contemplan aquí son Biomasa de parte aérea, nitrógeno derivado de

la atmosfera y el suelo (TNdfs TNdfa) y N total. Los 25 genotipos que se encuentran en

este clúster presentan mayor rendimiento con 3407 kg ha-1, el mayor valor de NUE 11.78

kg de grano por kg de N asimilado y de al igual manera, la mayor Biomasa aérea

aproximadamente de 7267 kg ha-1 , hay que destacar que la fijación de N proveniente del

suelo es mayor que la de la atmosfera , este clúster presenta los valores mayores de TNdfs

266.63 kg de N fijado desde el suelo comparado con 44.86 desde la atmosfera, por ende

el valor de N en parte aérea también es el mayor 328.9 kg ha-1.

Se puede decir que el rendimiento depende en mayor medida del N suministrado por el

suelo que por la simbiosis además hubo un buen uso del N a grano 11.78, sin embargo

recordemos que estos valores fueron menores a Darién con 48.5 kg de N por cada kg de

N asimilado. La nodulación en todos los clúster fue baja, en este en particular fue escala

visual de nodulación de 2.6.

En cuanto a fijación atmosférica de nitrógeno , los genotipos con valores de TNdfa

superiores a 50 kg N fijado ha corresponden a CGA 46, CGA 64, ENF 159, ENF 204,

ENF 164, ENF 167, ENF 234, MAC 57, destacando a CGA 46 con 60.1 kg N fijado ha.

Y de estos, genotipos tienen valores de rendimiento por encima de los 3600 kg ha-1. CGA

46, ENF 167, ENF 234, MAC 57. En cuanto a biomasa de Copa los 25 genotipos en este

clúster tienen valores superiores a los 5000 hasta 8000 kg ha-1., son genotipos con un valor

de biomasa alto. Recordemos que en Darién el máximo fue de 7000 y un promedio menor

con 4700 contra 7200 kg ha-1en Popayán.

Los valores de fijación derivado de la atmósfera en parte aérea TNdfa-Sh fue mayor que

en grano con 19 genotipos sobresalientes >50 kg N fijado ha. Y en promedio TNdfa-Sh de

69.3 kg N fijado ha. Los genotipos que corresponden a un valor > 60 kg N ha de TNdfa son

CGA 42, CGA 46, CGA 62, CGA 64, ENF 159, ENF 164, ENF 208, ENF 234, ENF

70, ENF 71, ENF 91, ENF 92 y MAC 57 .

Por otro lado, los genotipos No promisorios para fijación de N atmosférico con valores

menores a 40 kg N ha corresponden a CGA 56, CGA 78, ENF 213, ENF 23, ENF 29,


ENF 64, ENF 80, ENF 92. Todos estos genotipos tuvieron rendimientos inferiores a 3600

kg ha-1.

3.4.2.3 Clúster # 1:

Este clúster abarca 21 /100 genotipos y es el menos promisorio de los tres debido a que

los genotipos contenidos aquí presentaron los menores valores de rendimiento 2402 kg ha

promedio, valores de FSN que no superan los 50 kg de N ha correspondiente a 31.5 kg N

fijado por ha, menor uso eficiente de N de 10.6 y solo el 40% de N fue a grano como NPI,

los contenidos de N en grano son los menores con 60.6 comparado con 82.2 en clúster 3

y hasta menor Nitrógeno derivado del suelo con 180.87 kg N ha comparado con 266.4 en

clúster #2. Adicionalmente los genotipos de este clúster tienen alta TNdfs 198 kg N ha, de

lo que se infiere que toman más N del suelo que fijado de la atmosfera. Todos los genotipos

aquí contenidos tienen TNdfa inferior a 50 kg N ha-1., lo que los hace no promisorios. Por

otro lado se encuentran los no promisorios con valores < 30 kg N ha CGA 11, ENF 113,

ENF 178, ENF 190, ENF 201, ENF 212, ENF 25, ENF 81, ENF 82, ENF 85, ENF 86

y G 19839, los más alejados y opuestos los CP 1 y CP 2.

En términos Generales en Popayán para los tres Clúster, la fijación de N fue menor tanto

en Nodulación como en valores de TNdfa, sin embargo dentro de los 100 genotipos

encontramos 25/100 con valores > 50 Kg N fijado ha FSN. De esos 25 genotipos 18/100

se encuentran en el clúster 3 y 7/100 en el clúster #2, lo cual reitera la importancia de

variables de FSN especialmente TNdfa-G para el rendimiento. Estos genotipos promisorios

presentaron de 3000 hasta los 4500 kg ha en rendimiento. Algunos de los destacados

fueron CGA 46, PO07AT49, MAC 27, ENF 95, MAC 25, MAC 52, CGA 52, ENF 167,

ENF 32, ENF 84, ENF 234, ENF 28, ENF 235.



Figura 3-12. Variables de FSN biomasa y rendimiento representadas en Biplots de 100

genotipos de frijol voluble establecidos en la localidad de Popayán (2015). Los clúster o


variable.

3.5 Validación de resultados FSN en Invernadero

La validación del comportamiento de genotipos promisorios en campo arrojó resultados

positivos, debido a que la respuesta fue congruente tanto para genotipos promisorios como

para genotipos identificados con poca habilidad en FSN. Los genotipos en este ensayo

dependían exclusivamente del N que eran capaces de asimilar a través de fijación, gracias


a que su desarrollo fue llevado a cabo en arena cuarzo estéril con inoculación de

Rhizobium tropici y sustentado nutricionalmente con soluciones nutritivas sin fuente de N.

Gracias a estas condiciones la respuesta en crecimiento y desarrollo no se vio sesgada

por ningún otro factor que no fuera FSN.

Tabla 3-5 Evaluación de nodulación y determinación de %Ndfa–G en genotipos identificados como promisorios y no promisorios bajo condiciones de invernadero Evaluación de Nodulación y determinación de %Ndfa–G en genotipos identificados como promisorios y no promisorios bajo condiciones de invernadero.

LÍNEA Nodulación

campo Nodulación invernadero

%Ndfa-G invernadero

Total Ndfa-G inver.

CGA 10 8.0 8.0 53.1 90.3

ENF 234 8.0 8.0 51.1 62.0

ENF 28 8.0 8.0 59.3 68.4

ENF 98 8.0 3.0 50.5 35.8

ENF 130 7.0 8.0 41.2 68.2

ENF 235 7.0 7.0 62.7 91.2

ENF 29 7.0 9.0 51.1 74.5

CGA 52 3.0 6.0 20.8 18.3

ENF 207 3.0 6.0 13.9 21.3

ENF 95 3.0 2.0 22.3 30.8

ENF 81 2.0 2.0 8.2 8.9

GLORIABAMBA NN 1.0 1.0 0.0 0

ENF 130 SIN INOCULO SIN S/N 7.0 2.0 20.8 16.7

ENF 130 SIN INOCULO 7.0 2.0 13.9 25.3

Media promisorios 7.6 8.0 52.7 70.1

dif.sig (a) 0.6** 0.4** 19.4*** 33.3**

desvest 0.5 0.6 6.4 17.4

%cv 6.5 7.2 12.1 24.9

Según la (Tabla 3-5). Genotipos promisorios en FSN identificados previamente en campo

como CGA 10, ENF 28, ENF 235, ENF 130 presentaron un comportamiento similar en

invernadero con clasificación en la evaluación visual de Nodulación de 8.0. El genotipo

ENF 98 fue uno de los que no mostró congruencia en la validación. Sin embargo, la

mayoría de genotipos estuvieron acordes con lo presentado en campo (Figura 3-13). Por

otro lado, los genotipos no promisorios ENF 81, ENF 95, ENF 207 y CGA 52 presentaron



de igual forma congruencia en su comportamiento bajo la condición de invernadero. Se

demostró la veracidad del ensayo con el genotipo no nodulante, al presentar un

crecimiento significativamente inferior al resto de genotipos sin éxito en la continuación

de sus etapas fenológicas (Figura 3-13. Otro de los controles, ENF 130 sin suplemento

de soluciones nutritivas ni inoculación con Rhizobium, presentó un vigor inferior sin llegar

a culminar el ciclo fenológico al igual que GLORIABAMBA NN. En cuanto a los valores

de %Ndfa a partir de grano los valores fueron mayores en genotipos promisorios

identificados en campo que en genotipos con menor habilidad en FSN (Tabla 3-5).

Figura 3-13. Validación de habilidad en FSN en sustrato arena cuarzo estéril de genotipos

identificados como promisorios y no promisorios en campo en campo. A. Contrastes de

vigor de planta entre genotipos promisorios en FSN CGA 10 y No promisorios ENF 81. B.

Contraste en apariencia de Nodulación genotipos promisorios ENF 235 y no promisorio

ENF 81.

A

.

B


La determinación de los contenidos de clorofila SPAD a los largo del ensayo, muestra que

genotipos promisorios en FSN sintetizaron clorofila adecuadamente a partir

exclusivamente de N asimilado por FSN. Los contenidos de clorofila descienden en

genotipos con menor fijación y para los controles los valores son reducidos (Figura 3-14).

Esta variable demuestra una relación positiva entre en N asimilado y los contenidos de

clorofila y por ende el éxito del desarrollo de las plantas solo bajo en efecto de N asimilado

por la FSN.

Figura 3-14. Contenidos de clorofila en genotipos promisorios y no promisorios en FSN

durante todo el ciclo de cultivo

3.6 Validación del uso de 15N abundancia natural a partir de grano

La variación fenotípica de la capacidad fijadora de nitrógeno es usualmente estimada

usando δ15N del tejido de parte aérea y no es usual el uso de grano para estas

determinaciones. Por esto se realizó la cuantificación del asocio entre la determinación a

partir de parte aérea y la de grano en ambas localidades con el fin de validar el uso de este

último y con esto reducir los altos costos que implica el uso y manejo de biomasa aérea

-5.0

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

21 30 36 43 53

SCM

R S

pad

Ch

loro

ph

yll

read

ing

DDS

Contenidos de clorofila SCMR spad

CGA 52 CGA10 ENF 130 con

ENF 130 sin ENF 207 ENF 234

ENF 235 ENF 28 ENF 29

ENF 81 ENF 95 gloriabambaNN



(Figura 3-15). Adicionalmente, la relación directa entre él % Ndfa en grano con% Ndfa en

biomasa darían a los mejoradores la posibilidad de seleccionar genotipos para FSN

basados en los valores de grano sin la necesidad de secar, moler y encapsular grades

volúmenes de biomasa aérea.

Como resultado de la validación, se encontró una relación positiva y significativa entre los

valores de% Ndfa estimados con abundancia natural de δ15N en biomasa aérea y los

valores %Ndfa estimados con abundancia natural de δ15N de grano con valores de r =

0.41*** para la localidad de Darién y r =0.46*** para la localidad de Popayán (Tabla 3-3).

Estos resultados indican que la determinación de δ15N de muestras de grano en la cosecha

puede ser más fácil para la estimación de FSN y la identificación de genotipos superiores

en los programas de mejoramiento. Gloriabamba NN fue el genotipo de frijol voluble

utilizado como control absoluto. Se observaron diferencias significativas tanto en grano

como en tejido de parte aérea entre los genotipos fijadores de N y no fijadores en ambas

localidades (p<0.05) (Tabla. 3-6).

Los valores de δ15N de biomasa aérea para los genotipos no fijadores fueron de 9.1‰ y

7.2‰ en Darién y Popayán (Tabla 3-6, Figura 3-15). El δ15N de biomasa aérea de los 100

genotipos de frijol voluble (Excluyendo Gloriabamba NN) varió de -0.7‰ a la 7.5‰ en

Darién y de 0,2 a la 7,2 en Popayán. El δ15N de grano de los 100 genotipos varió de 0,8‰

a la 7,9‰ en Darién y desde 0,3‰ a la 7,5‰ en Popayán (Tabla 3-6). Para ambas

localidades los genotipos promisorios en habilidad FSN ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF

21, PO 07AT49 y CGA 10, mostraron un menor valor de δ15N de grano y de biomasa con

valores promedio de 2.5‰ y 5.0‰ respectivamente. En contraste, genotipos ENF 213,

CGA 11, ENF 81 y el control no nodulante GLORIABAMBA NN que demostraron menor

habilidad en fijar N atmosférico, presentaron mayores valores de δ15N correspondientes a

7.0‰ en grano y biomasa. Para las dos localidades la correlación fue positiva y significativa

entre abundancia natural de δ15N en grano y biomasa aérea con un r= 0.51***, lo que

demuestra que es factible el uso de grano como muestra representativa para la

cuantificación de FSN entre genotipos, y facilitar con ello el proceso y aumentar la

probabilidad de selección de genotipos en FSN (Fig. 3-15).


Figura 3-15. Relación entre δ15N de biomasa aérea y δ15N a partir de grano de 100

genotipos en ambas localidades. Genotipos promisorios en habilidad FSN fueron

marcados con color rojo. Genotipos no promisorios fueron marcados con color azul.

3 4 5 6 7 8 9

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Abundancia natural de 15N en parte aerea (0/00)

Ab

un

da

nc

ia n

atu

ral d

e 1

5N

en

gra

no

(0

/00

)

Mean: 5.9***

Mean: 4.2 **

r= 0.51***GLORIABAMBA NN

ENF 81

ENF 235

ENF 28

PO 07AT 49

CGA 10

ENF 234

ENF 21ENF 159

ENF 82

CGA 11

ENF 213

ENF 207

ENF 117

ENF 64

ENF 188

CGA 64

ENF 34

CGA 52ENF 24

ENF 71

ENF 85

ENF 211ENF 86

CGA 52



Tabla 3-6. Diferencias genotípicas en % de nitrógeno derivado de la atmósfera estimadas

usando tejido foliar (% Ndfa-SH),% de nitrógeno derivado de la atmósfera estimado usando

tejido de grano (% Ndfa-G), Abundancia natural de 15N de tejido foliar (‰) y Abundancia

natural de 15N de grano (‰) de genotipos de común frijol sembrados en Darién y Popayán,

2014 y 2015 Colombia

Genotipo

% Ndfa- Grano

%Ndfa-

Biomasa aerea

15N abundancia Natural-G (‰)

15N abundancia Natural- SH (‰)

Darien Popayan Darien Popayán Darien Popayan Darien Popayán

2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015

Pro

mis

ori

os

en

%N

dfa

-G

ENF 235 68 39 41 14 1.2 3.3 4.3 5.8

ENF 28 64 38 17 19 1.8 3.4 7.6 5.4

PO 07A T 49 61 37 20 19 2.1 3.5 7.1 5.3

CGA 10 57 32 26 18 2.6 4.0 6.4 5.4

ENF 29 56 33 42 17 2.8 4.0 4.3 5.5

CGA 64 55 35 11 25 2.8 3.7 8.3 4.8

ENF 173 55 34 37 25 2.8 3.9 4.9 4.8

ENF 234 55 39 24 25 2.8 3.3 6.9 4.7

ENF 130 45 39 19 24 4.1 3.3 7.2 4.9

CGA 46 44 32 22 23 4.2 4.1 6.9 4.9

MAC 27 41 37 15 22 4.6 3.5 7.7 5.0

ENF 21 50 43 37 25 3.5 2.9 4.9 4.7

ENF 174 50 37 23 16 3.5 3.6 6.8 5.6

CGA 56 49 31 30 15 3.6 4.1 5.8 5.7

Inte

rme

dio

s %

Nd

fa-G

ENF 91 49 36 15 23 3.6 3.6 8.3 4.9

ENF 159 49 43 43 33 3.7 2.9 4.2 4.0

ENF 31 48 34 29 21 3.7 3.9 5.9 5.1

ENF 204 48 32 18 22 3.7 4.1 7.4 5.0

MAC 4 47 34 34 20 3.8 3.9 5.3 5.3

ENF 3 47 38 20 22 3.8 3.4 7.1 5.0

ENF 171 47 31 25 14 3.8 4.2 6.4 5.9

CGA 57 47 37 28 23 3.9 3.5 6.1 5.0

No

pro

mis

ori

os

% N

dfa

- G

G 2333 31 42 28 19 5.8 3.0 6.1 5.4

CGA 71 30 34 22 14 6.0 3.9 6.9 5.8

MAC 74 24 35 25 11 6.7 3.7 6.4 6.2

ENF 95 23 40 20 24 6.8 3.2 7.1 4.8

CGA 11 23 30 21 16 6.9 4.3 7.0 5.7

ENF 213 46 28 23 14 4.0 4.5 7.1 5.9

ENF 207 15 34 17 20 7.9 3.9 7.6 5.2

ENF 81 9 37 25 22 8.6 3.5 6.5 5.0

Gloriabamba NN 0 0 0 0 9.7 7.5 9.1 7.2

Mean 42.9 34.5 23.7 19.4 4.4 3.8 6.7 5.3

Sig. diff. *** *** *** *** ** ** *** ***

4. Discusión

4.1 Diferencias en la habilidad FSN entre localidades y genotipos

Este estudio permitió identificar las diferencias fenotípicas en fijación Simbiótica de

nitrógeno (FSN) y las mejores líneas de frijol voluble con esta habilidad. La evaluación de

FSN no se había realizado antes en líneas elite de frijol voluble y la mayoría de estudios

reportados han sido realizados para líneas de frijol arbustivo (Marique et al, 1993;

Douxchamps et al, 2010; Kipe et al., 1993; Kipe and Giller, 1993; Hardarson et al, 1993;

Kamfwa et al 2015, Polania et al, 2016). En fríjol voluble, el número de estudios que

comparan diferentes genotipos en la capacidad FSN señalan que este hábito tiende a tener

un mayor potencial en la asimilación de N atmosférico para la producción de grano, y es

por esto, que tanto en potencial de rendimiento como el fijación simbiótica de N los

genotipos de frijol voluble son superiores en comparación a los de habito I, II, III o

arbustivos. Se conoce que este tipo de frijol tiene la capacidad para fijar más de 80 kg de

N ha- 1 en condiciones en las N es el único factor limitante (Graham and Rosas, 1977;

Graham and Temple, 1984; Kipe-Nolt and Giller, 1993; Bliss, 1993, Remaekers, 2013).

Sin embargo, a pesar de las ventajas competitivas que suministra el proceso de fijación a

la planta de frijol, este proceso se ve afectado por múltiples factores, entre los que

encontramos la sequía (Devi et al., 2013, Polania et at., 2016) y factores de condición de

suelo como las altas concentraciones de nitratos (Leidi and Navarro, 2000; Wanek and

Arndt, 2002; Salvagiottia et al, 2008; Giller, 2001; Ajebesone, 2015, Burchill et al, 2014).

Este último factor, se presentó en la localidad de Popayán con contenidos de materia

orgánica del 14% y altos niveles de N, condiciones de suelo negativas para el proceso de

Fijación Simbiótica de N. En contraste, la localidad de Darién presentó menos nitrógeno

disponible según el diagnóstico de línea base. La condición de N del suelo de Popayán

afecto negativamente el proceso FSN evidenciándose inicialmente una drástica reducción



en la Nodulación de los genotipos. Nuestros resultados confirman informes anteriores

sobre la sensibilidad de FSN en frijol (Giller, 2001; Ajebesone, 2015). En la localidad de

Popayán genotipos susceptibles redujeron su capacidad de %Ndfa hasta en un 80%

mientras que genotipos con menor sensibilidad la reducción presentada fue solo del 30%.

Esta respuesta se produce debido a que, en condiciones de alta concentración de N en el

suelo, las plantas leguminosas disponen de mecanismos específicos para controlar el

contenido de nitratos y el número de nódulos en respuesta a estos estímulos. Una señal

interna importante es el sistema de retroalimentación sistémica de la raíz al tallo

denominado Regulación Automática de la Nodulación (por sus siglas en ingles AON).

(Giller, 2001, Taiz y Zeiger, 2002).

Este mecanismo muestra que la nodulación se suprime por completo, la masa total de

nódulos se reduce y además se inhibe la actividad de la Nitrogenasa de nódulos maduros,

esto con el fin de reducir los costos de energía innecesarios y mantener la eficiencia de

uso. Se puede decir, que la planta bajo una alta oferta de N en el suelo, reduce su inversión

energética en asimilación de N a partir de FSN. Parson et al, (1993) sugirió que una mayor

regulación del crecimiento y la actividad de los nódulos se desencadena por la

concentración de la reducción de compuestos de N en el floema que son mediados a través

de señales. El mecanismo de retroalimentación de N ofrece una elegante explicación de

cómo la planta huésped puede regular tanto la infección como la actividad de fijación de N

en los nódulos. El Frijol voluble establecido en Popayán, presentó reducción en la

nodulación y %Ndfa. Adicionalmente, una reducción de 43% en la removilización de N a

grano, por ende mayor acumulación de N en parte aérea y un 50% menos de la eficiencia

del uso de nitrógeno comparado con los volubles en la localidad de Darién. Esta respuesta

se explica debido a que, la acumulación de N en los brotes y las hojas es una de las

principales evidencias de la inhibición de FSN (Purcell et al., 2000; Vadez and Sinclair,

2001; King and Purcell, 2005). Otros reportes citan que una de las respuestas de la

inhibición de la FSN por sequía es la acumulación de ureidos en el tallo (Coleto et al, 2014)

demás esta reportado que el frijol prefiere acumular y removilizar N fijado a partir del aire

que el fijado a partir del suelo (Westermann et al., 1985; Dubois and Burris, 1986; Wolyn

et al., 1991). Esto sugiere que el proceso metabólico de señalización: regulación de la

Nodulación (AON), se presentó en los volubles como una respuesta a las condiciones

desfavorables de N para el proceso de FSN, presentándose la inhibición de la nodulación,

Capítulo 4. Discusión 69

reducción en Ndfa y acumulación de N en parte aérea, menos NUE y %NPI, además de la

producción excesiva de biomasa aérea.

A pesar del diferenciado comportamiento de los genotipos entre las dos localidades

evaluadas, se identificaron genotipos estables y prometedores en la habilidad de FSN,

exhibiendo buenos valores de Ndfa superiores a 80% equivalentes a 90 kg N ha-1 en

condiciones favorables de N y 60% de Ndfa equivalentes a 60 kg N ha-1 bajo condiciones

desfavorables, estos valores son acordes a estudios reportados donde un valor Ndfa

sobresaliente se encuentra por encima del 60% (Unkovich and pate, 2000; Hardarson G.

& Craig Atkins, 2003; Wortmann, 2001; Kumarasinghe et al., 1992). Esto es de

importancia, debido a que la eficiencia de los principales cultivos en la recuperación de N

aplicado como fertilizante es baja y no supera el 30%. De esta manera, el nitrógeno fijado

se convierte en una alternativa debido a que el N asimilado representa cerca de 150 kg de

N aplicado por hectárea como fertilizante (Subbarao et al, 1995). En el mismo sentido, los

genotipos promisorios en Fijación Simbiótica de N encontrados también se asociaron

positivamente con los rasgos de biomasa aérea, el contenido de N total en el grano,

rendimiento, NUE y NPI para ambas localidades. Las líneas con mayor capacidad de

Fijación Simbiótica de N presentaron mayores valores de biomasa aérea lo cual indica la

importancia del vigor de la planta para apoyar el proceso de FSN, además de contribuir a

la movilidad tanto de C y N a los granos en desarrollo (Polania et al, 2016). Plantas de frijol

vigorosas permiten mayores contenidos de N tanto fijado a partir del suelo como del aire,

manteniendo y mejorando la removilización (NUE y NPI) contribuyendo así, al aumento de

la producción total del contenido N (Wolyn et al., 1991).

Se observó en estudios previos con frijol común, que genotipos superiores en Fijación

Simbiótica de N en condición de estrés por sequía, tienen la capacidad de generar

adaptación a través de control interno y presentar asocio positivo con el rendimiento de

grano, la biomasa aérea y eficiencia en la removilización de N (Beebe et al., 2014; Polania

et al, 2016). Por esto, mayor biomasa aérea, acumulación de N en grano y eficiencia en la

removilización de N son rasgos para seleccionar líneas promisorias en Fijación Simbiótica

de N (Beebe et al., 2014; Sinclair and Vadez, 2012).



Fue evidente un asocio positivo entre el rendimiento de grano y TNdfa (kg N ha-1) tanto en

condiciones desfavorables como favorables para la inhibición de Fijación Simbiótica de N.

Las líneas que se identificaron como promisorias ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21, PO

07AT49 y CGA 10 se caracterizaron por acumular más N a partir de fijación simbiótica,

mayor capacidad para ignorar el efecto de N y una menor regulación interna de la

nodulación (AON), garantizando la continuidad del proceso de fijación y con ello una buena

producción de granos a través del uso eficiente de N. Las líneas de ENF 28 y ENF 235

presentaron la menor inhibición de la capacidad en Fijación Simbiótica de N en condiciones

desfavorables de N, estas líneas podrían ser usadas como potenciales padres para

mejorar la capacidad de FSN.

Por el contrario, el control absoluto Gloriabamba NN mostró menor capacidad de fijar N y

rendimiento de grano, lo cual indica que el N del aire es igual o más importante que el N

del suelo demostrando que ambas fuentes de N trabajan juntas para la productividad en

frijol. El hecho de que el genotipo no nodulante posea una capacidad limitada para Fijación

Simbiótica de N afecta considerablemente el rendimiento de frijol (Westermann et al., 1985;

Dubois and Burris, 1986; Wolyn et al., 1991). Por esto, los genotipos no promisorios ENF

213, CGA 11 y ENF 81 fueron determinantes para comprobar la importancia de los rasgos

asociados con FSN. Estos genotipos tuvieron un comportamiento similar al No nodulante

Gloriabamba NN; los rasgos evaluados como biomasa aérea, los índices removilización y

uso eficiente del N, y el rendimiento de grano presentaron los menores valores comparados

con las líneas que mostraban mayor habilidad en Fijar N.

Por otro lado, los genotipos ENF de frijol voluble evaluados fueron superiores a las líneas

control. Estos mostraron 30% más de capacidad en fijación que las líneas control MAC 33,

52 MAC, MAC 9, 4 MAC, MAC 25, G19839, G5702 y G2333. Sólo el control MAC 27

presentó 38% Ndfa equivalente a 50,2 kg de N fijado por ha, considerándose este valor

dentro del rango óptimo para genotipos prometedores en FSN. También MAC 27 fue

excelente en rendimiento, con una producción superior a 4000 kg ha-1 y presentó además

tolerancia antracnosis, rasgo evaluado en experimentos anteriores (CIAT, datos no

publicados). ENF 28 fue el único de los genotipos identificados como promisorios que tiene

tolerancia a la antracnosis, atributo evaluado en experimentos anteriores. En este orden

de ideas, MAC 27 y ENF 28 pueden ser utilizados como padres en el programa de

Capítulo 4. Discusión 71

mejoramiento por su buena capacidad en Fijación Simbiótica de N en combinación con

tolerancia a enfermedades y rendimiento.

4.2 Validación de estimación de Ndfa a partir de grano y diferencias en abundancia natural 15N en biomasa aérea y grano

Es factible cuantificar la capacidad de FSN a partir de %Ndfa de grano. Este estudio

permitió comparar la estimación de Ndfa% usando tejido foliar (% Ndfa-SH) vs. Tejido de

grano (% Ndfa-G), para cuantificar las diferencias fenotípicas en frijol común en la

capacidad de FSN en frijol voluble, y para probar si Ndfa% -G podría ser un rasgo útil para

cuantificar fácilmente FSN en programas de mejoramiento. Los resultados de las dos

localidades muestran que valores de % Ndfa estimados a partir de muestras de tejido foliar

en la etapa mitad de llenado de vaina (% Ndfa-SH) y muestras a partir de tejido de grano

en el momento de la cosecha (% Ndfa-G), presentan valores similares, por ende, los

valores de %Ndfa-G son válidos y se comprobó que la metodología de grano es factible

para cuantificar la capacidad de FSN en diferentes genotipos. La correlación fue positiva

(r = 0,51) entre ambos métodos y lugares lo que valida esta afirmación.

Estudios previos han validado el uso del grano en vez de biomasa aérea para cuantificar

FSN. Polania et al (2016) encontró una muy buena correlación entre Ndfa%-G y %Ndfa-

SH correspondiente a r = 0,81*** en 2012 y r= 0,66 en el año 2013 en 36 genotipos de

frijol arbustivo élite evaluados para FSN en condiciones de sequía. Kamfwa et al., (2015)

utilizando ambos tipos de tejido, sugirió la selección de alta capacidad basado en el tejido

de grano que además el uso de esta metodología podría ser fácil integrar en los programas

de mejoramiento. También se han reportado resultados similares para Ndfa% utilizando la

técnica de abundancia natural de δ15N en el grano y biomasa aérea para otras especies

de leguminosas (Bergersen et al., 1985).

Este comportamiento tiene relación directa con la removilización de N a partir de

estructuras vegetativas a grano y toma importancia la cantidad y calidad del N fijado a partir

de FSN (Bergersen et al., 1992; Unkovick y Pate, 2000). Se ha demostrado en reportes

anteriores que frijol común es capaz de trasladar alrededor de 80 a 93% del total de su N

al grano, y que la mayoría de N asimilado se transloca al grano sin importar si la fuente



proviene del suelo, el aire o ambos (Ramaekers et al., 2013). Las líneas evaluadas en este

estudio, presentaron movilización de N hasta del 90% de biomasa aérea a grano para la

localidad de Darien, y 60% para la localidad de Popayán. Genotipos con mayor

acumulación de N en biomasa aérea presentaron mayores valores de acumulación de N

en el grano durante la cosecha y los genotipos que acumularon menos N en biomasa

aérea, acumularon menos N en el grano. Esta tendencia valida el uso de grano como tejido

para la cuantificación rápida y factible de Fijación Simbiótica de N.

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

Diferencias genotípicas en la habilidad de FSN fueron evidentes para genotipos de frijol

voluble entre las localidades y entre genotipos por localidad. Presentándose mayor FSN y

rendimiento en Darién que en Popayán debido a los niveles de N en suelo. En cada

localidad se identificó variabilidad genotípica a través de la identificación de genotipos

promisorios y no promisorios en la capacidad para fijar nitrógeno atmosférico.

La habilidad en FSN está asociada positivamente con el rendimiento. La respuesta de los

genotipos de frijol voluble en FSN es determinante para la respuesta productiva. El

nitrógeno fijado del aire y el asimilado del suelo trabajan conjuntamente para la

productividad del frijol. A su vez, menores rendimientos se asocian con menor habilidad en

FSN.

El uso eficiente del nitrógeno (NUE) y el índice de partición de nitrógeno (NPI) además de

la biomasa aérea se relacionan positivamente con la capacidad de frijol voluble en fijar N.

Genotipos promisorios en FSN fueron más eficientes en la producción de grano por unidad

de N asimilado, y a su vez, la removilización de N desde biomasa a grano es completa.

Estos índices sirven como atributos de selección para la habilidad FSN en genotipos de

frijol voluble.

Las líneas ENF 235, ENF 234, ENF 28, ENF 21, PO 07AT49 y CGA 10 se caracterizaron

por presentar una mayor capacidad de fijar N a través del proceso de FSN. Estas líneas

mantuvieron su capacidad FSN tanto en condiciones favorables y desfavorables en cuanto

a las concentraciones de N en el suelo presentando mayor capacidad para ignorar el

efecto de N y una menor regulación interna de la nodulación (AON), Por esto, estas

líneas pueden ser incluidas como padres en el programa de mejoramiento genético.



Se valida el uso de %Ndfa-G para la cuantificación de FSN. Los valores de %Ndfa a partir

de parte aérea y grano presentaron una asociación positiva y significativa para ambas

localidades. De esta forma, el uso de grano se convierte en la mejor metodología para

cuantificar la capacidad de genotipos de frijol para fijar Nitrógeno. Su implementación en

programas de mejoramiento genético reducirá los costos de mano de obra y será factible

este parámetro en tiempo de cosecha.

5.2 Recomendaciones

Esta investigación soportó los datos existentes sobre la capacidad y habilidad en fijación

de Nitrógeno de frijol voluble y se logró identificar genotipos con potencial en FSN para

incluirlos como progenitores en el programa de mejoramiento. Ahora con la validación para

la determinación de %Ndfa a partir de grano, será posible la inclusión de este atributo de

forma fácil y rápida en próximas generaciones. Conociendo a los genotipos promisorios

será posible también el inicio de cruzas con otros genotipos con atributos deseables en

color, forma y tamaño comercial de grano además de tolerancia a enfermedades.

Adicionalmente, los genotipos tendrán que ser evaluados bajo condiciones de estrés

abiótico en sequía, concentraciones bajas de fosforo en el suelo y calor, con el fin de seguir

caracterizando y acercarnos cada vez más al ideotipo de frijol.

A. Anexo: Phenotyping Common Beans for Symbiotic Nitrogen Fixation (SNF): Protocol for field evaluation

Phenotyping Common Beans for Symbiotic Nitrogen Fixation (SNF):

Protocol for field evaluation

The common bean Phaseolus vulgaris L. is an important legume for food security, with a worldwide production of 23'250.253 tons (FAOSTAT, 2013). It is rich in iron, protein, fiber and carbohydrate and essential for the nutrition of the population, especially that of developing countries. This legume is produced by small resource-poor farmers in Latin America, Asia and Africa under marginal environments affected by drought and low soil fertility, especially nitrogen and phosphorus (Beebe et al, 2008). Symbiotic nitrogen fixation (SNF) – through association with root-nodulating rhizobia for the uptake of atmospheric nitrogen – effectively contributes to improved nitrogen nutrition and is an ecologically sound and low cost strategy to improve the productivity of common bean cultivation in the face of an increasing world population and climate change. However, it



should be considered that one of the main factors determining the efficiency of SNF is the plant genotype. Identification of key plant traits and mechanisms that contribute to improved Symbiotic Nitrogen Fixation (e.g., visual evaluation of root nodulation, 15 Nitrogen isotope in tissue and grain, canopy biomass, photosynthesis, nitrogen uptake, pod partitioning index, pod harvest index) can increase the efficiency of breeding programs through the selection of superior genotypes. The following protocol allows for the identification of phenotypic differences in SNF under field conditions through the quantification of traits related to nitrogen fixation plant capacity (% nitrogen derived from the atmosphere based on 15N natural abundance in tissue and grain -%Ndfa-) and visual evaluation of root nodulation.

Contacts:

Norma Barbosa: [email protected] José A. Polanía: [email protected] Mariela Rivera: [email protected] Jaumer Ricaurte: [email protected] Idupulapati M. Rao: [email protected]

Contents

1. Planting Design

- Rhizobium tropici inoculation

2. Sampling at Flowering

- Determining “Flowering”

- SPAD Chlorophyll Meter Readings (SCMR)

- Photosystem II Quantum Yield (QY)

- Visual evaluation of root nodulation - Visual evaluation of plant growth Preparation of samples for analysis δ15N and

% N (UC Davis, California)

3. Sampling at Mid pod filling - Determining “Mid pod filling”

- SPAD Chlorophyll Meter Readings (SCMR)

- Photosystem II Quantum Yield (QY)

- Shoot Biomass

- Preparation of samples for analysis δ15N and % N Total N and %N (mg/g tissue) (UC Davis, California)

4. Sampling at harvest time

- Determining “harvest time”

- Biomass (pods and grain)

- Preparation samples for GRAIN analysis δ15N and % N Total N and %N (UC

Davis, California)

Anexo A. Phenotyping Common Beans for Symbiotic Nitrogen Fixation (SNF) 77

5. Evaluation of Symbiotic Nitrogen Fixation - Visual scale of nodulation/genotype (1-9) - % Ndfa - Shoot nitrogen uptake - Nitrogen use efficiency - Nitrogen partitioning index - Pod harvest index - Pod partitioning index - Harvest index - Yield production efficiency - Seed production efficiency - Pod production efficiency - 100 seed weight, and days to flowering and maturity

6. References

1. Planting design

Field trials need to be conducted during

the wet season (irrigated for no stress),

without nitrogen fertilization and with

inoculation of Rhizobium Tropici CIAT

899. Trials could include germplasm

accessions, bred lines, and

recombinant inbred lines as entries.

These conditions need to be applied to

quantify the effects of SNF on crop

growth and seed yield.

Depending on the number of

genotypes to be evaluated, a partially

balanced lattice design with 3

replicates could be used. The field

trials can be planted in continuous

rows with each genotype per

replicate planted in 2 side-by-side

rows (or 4 rows for small trials) of 2 to

4 m of length. Rows should be

spaced 60 cm apart. Seeds should

be planted 7.5 cm apart (i.e. 15 seeds

per m), thus yielding 10 to 15 plants

per meter. Photo: Polania.J

(2012)



2.

2. Sampling at Flowering

Polania.J

(2012)

Sterile turba bags of Inoculum

Rhizobium tropici (CIAT 899) must

be applied at a dose of 3 kg/ha or

15 inoculum bags per 50 L tap

water, in drench directed at the root

base and soil for each plant with a

first trifoliate leaf. The inoculum

must have 2.2 x 107 CFU/g

guaranteed per viability test in

2.1 Determining “Flowering”

Days and status to flowering is measured individually for each plot. This is at the moment when 50% of the plants are flowering (e.g., the majority of plants have flowers totally developed).

Photo: Polania.J (2012)

2.2 SPAD Chlorophyll Meter Readings (SCMR) SCMR is measured by using a non-destructive, hand-held chlorophyll meter (e.g., SPAD-502 Chlorophyll Meter). SPAD-502 determines the relative amount of chlorophyll that is present in the leaf by measuring the absorbance of the leaf in two wavelength regions. Chlorophyll has absorbance peaks in the blue (400-500 nm) and red (600-700 nm) regions, with no transmittance in the near-infrared region. SPAD-502 measures the absorbance of the leaf in the red and near-infrared regions. Using these two transmittances, the meter calculates a numerical SPAD (Soil Plant Analysis Development) value, ranging from 0 to 80 which is proportional to the amount of chlorophyll present in the leaf. SPAD is measured on a fully expanded young leaf of one plant for each replicate.


Photo: Polania.J

(2012)

2.3 Photosystem II Quantum Yield (QY) Photosystem II quantum yield (QY) is measured by using a non-destructive, hand-held QY meter (e.g., Fluorpen FP100). Fluorpen FP100 is a fluorometer that enables quick and precise measurement of chlorophyll fluorescence parameters. FP100 measures FT (continuous fluorescence yield in non-actinic light). QY (Photosystem II quantum yield) is measured on a fully expanded young leaf of one plant for each replicate (the same leaf that is used for SPAD measurement).

2.4 Visual evaluation of root nodulation The visual scale of 1-9 is used to evaluate the extent of nodulation.

Approximate nodule number

# Description Climbing bean Bush bean

9 Excellent nodule amount >240 >80

8 Very abundant nodule

amount

240 80

7 Abundant 121 -240 big

size)

80-41

6 Intermediate -high 121 -240 (small

size)

40-21 (big size)

5 Intermediate 61-120 (big size) 40-21 (small size)

4 Intermediate - low 61-120 (small

size)

20-10 (big size)

3 Low 60-30 20-10 (small size)

2 Very low <30 <10

1 Nothing 0 0

Note: To evaluate the nodule viability the color inside a nodule can be used as a guide and if it is pink or red the nodule is viable and effective, and if it is green or white the nodule is considered non-viable or ineffective. The numbers in the table can deviate between different experiments. Therefore it is recommended to have a reference plant for classification 1 and classification 8-9 define the number and appearance of the nodules in both cases. This requires some training.

8

2



2.5 Visual evaluation of plant growth The evaluation is based on a visual scale of 1-9 for plant vigor (adaptation).

Scale Climbing/bush bean

# Description

9 Excellent

7-8 Good

5-6 Intermediate

3-4 Poor

1-2 Very poor

Note: evaluation should be based on a control plant or reference with the score of 1. This requires some training.

7 3

2.6 Preparation of samples for analysis δ15N and % N (University of California (UC), Davis, California, USA) To determine the shoot δ15N and % N content, one plant of each genotype from each plot or treatment is selected for destructive sampling. The plant is cut to the soil surface, put in a paper bag, and transported to the laboratory.


The plant is then washed with deionized water and dried in the oven at 60oC for 2 days. If analysis by plant part is desired, the plants can be separated into leaves, stems and other plant parts before drying.

Polania.J (2012)


3.0 mg of ground tissue is

weighed on a microbalance. The

samples are packed in tin

capsules for solid

samples (5x9mm) (Fisher

Scientific). This process requires a

lot of precision.

Each capsule is wrapped carefully in a regular

form. Each sample is placed into a well of 96

well tissue culture plates with a flat bottom

(Ref. 353072 box per 50 units (Falcon)).

Consider the order of sequence: 1 to 12

corresponds to columns and A to H

corresponds to rows. More details can be

found at

www.stableisotopefacility.ucdavis.edu/13can

d15ntips.html

After oven drying, the plant is ground using a mill. The samples should be fine and homogenous. The ground samples are packed in glass tubes. Each Vacutainer ( glass tube) must have 10 g of ground tissue.

http://www.stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15ntips.html

http://www.stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15ntips.html



3. Sampling at Mid-pod filling

Each box is identified for its sending to UC Davis California. δ15N and total nitrogen concentration (%) is determined using PDZ Europa ANCA-GSL elemental analyzer interfaced to a PDZ Europa 20-20 isotope ratio mass spectrometer (Sercon Ltd., Cheshire, UK)

UC Davis, 2014

3.2 – 3.3 SPAD Chlorophyll Meter Readings (SCMR) and Photosystem II Quantum Yield (QY) For these variables the process is the same as for flowering.

3.1 Determining “Mid-pod filling” Mid-pod filling occurs just before leaves begin to turn yellow, when the plant has no more flowers and seeds are clearly defined in pods.



3. 4 Shoot Biomass

A row length of 0.5 m for each plot should be selected for destructive sampling. The plants are counted, cut to the soil surface, put in a plastic bag, and transported for processing.

Photos: Polania.J (2012)

Each sample is put in separate paper bags for oven drying at 60oC for 2 days. Total dry matter production and the distribution of dry matter into different plant parts (leaf biomass, stem biomass, pod biomass, total above-ground biomass) is quantified on a balance.

Photos: Polania.J (2012)



4. Sampling at harvest time

3.5 Preparation samples for analysis δ15N and % N (UC Davis, California) For these variables the process is the same as for flowering.

4.1 Determining “harvest time” Harvest time occurs when leaves have turned yellow, when the plant has no more flowers and seeds are clearly defined in pods. The pods are dry and the seeds sound when the pods are shaken.

4.2 Biomass (pods and grain)

A 0.5 m long row is selected for each genotype. The number of plants are counted and cut to the soil surface. The samples are put into a paper bag and transported for analysis.


Plants are separated into stems, pods and seeds. The number of pods and seeds per harvested area is counted. Stems, pods and seeds are dried in the oven at 60oC for 2 days and dry weights are recorded.

4.3 Preparation of samples for δ15N in grain and % total N in grain (UC Davis, California). Grain is weighed (8-14 g approx.) and washed with tap water and also with bi-distilled water. Each sample is put in separate paper bag for oven drying at 60oC for 2 days.



Grain samples are ground for 4 minutes in porcelain cups with small balls inside each one.

The samples should be fine, homogenous and identified. The ground samples are packed in glass tubes for analysis. Each Vacutainer (glass tube) must have 10 g of ground grain.


5. Evaluation of Symbiotic Nitrogen Fixation

Visual scale of nodulation/genotype (1-9): Visual evaluation According to scale: 1 corresponding to excellent nodulation and 9 corresponding to very poor nodulation. Consider the size of nodules, because bigger nodules will have better ratings than small and medium sized nodules.

Percentage Nitrogen derived from the atmosphere (% Ndfa) : the data of UC Davis must be used in this formula in order to calculate the % Ndfa

Where: δ15N of reference plant refers to a control plant or Non N2 fixing plant ‰ δ15N of N2 fixing legume refers to N2 fixing plant in these case : bean genotypes ‰

B’ is δ15N of shoots of legumes that are fully dependent of N2 fixation and grown on a N free medium, sampled at the same growth stage as the field plants.

3.0 mg of ground tissue is

weighed on a microbalance. The

samples are packed in tin

capsules for solid

samples (5x9mm) (Fisher

Scientific). This process requires

a lot of precision. The samples

are placed into each vial of tissue

culture plate 96 well. Send

samples with proper

identification to UC Davis

(California).



Shoot nitrogen uptake:

δ 15N and %Nitrogen (of shoot or grain (sample 3.0 mg) are results from isotope ratio mass spectrometer analysis from UC Davis. The values of %N in shoot tissue are used together with shoot biomass to quantify shoot N uptake in kg/ha.

Nitrogen use efficiency (NUE): NUE (kg of grain produced per kg of N uptake in shoot biomass) = ((Grain yield in kg/ha)/ (shoot N uptake in kg/ha in biomass)).

Nitrogen partitioning index (%): NPI = (kg of N in grain per hectare/kg of N per hectare in shoot biomass) x 100.

Pod harvest index (%): The PHI for each genotype = (seed biomass dry weight at harvest) / (pod biomass dry weight at harvest) x 100.

Pod partitioning index (%): The pod partitioning index for each genotype = (pod biomass dry weight at harvest) / (total shoot biomass dry weight at mid-pod filling) x 100.

Harvest index (%): The HI for each genotype = (seed biomass dry weight at harvest) / (total shoot biomass dry weight at mid-pod filling) x 100.

Yield production efficiency: The yield production efficiency for each genotype = (seed biomass dry weight at harvest)/(total shoot biomass dry weight at mid-pod filling).

Seed production efficiency (number g-1): The seed production efficiency for each genotype = (seed number per area) / (total shoot biomass dry weight at mid-pod filling per area)

Pod production efficiency (number g-1): The pod production efficiency for each genotype = (pod number per area) / (total shoot biomass dry weight at mid-pod filling per area).

100 seed weight The weight of 100 seeds in grams recorded.

Statistical analysis: For all of the above quantifications, variance is calculated by using a statistical software system, such as SAS/STAT Software. A probability level of 0.05 is considered statistically significant.


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