Evaluación de la calidad microbiológica de bocaditos...

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Evaluación de la calidad microbiológica debocaditos fritos a base de Papa (Solanum

tuberosum) que se elaboran y expenden en formaartesanal en la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito

Bellavista – Callao.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAOVICERRECTORADO DE INVESTIGACIÓN

FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA Y DE ALIMENTOS

Evaluación de la Calidad Microbiológica deBocaditos Fritos a base de Papa (Solanumtuberosum) que se elaboran y expendenen forma artesanal en la Urb. Ciudad delPescador – Distrito Bellavista – Callao.

Blgo. – Mblgo.: ARTURO MARIANO GARCÍA MERINO.

RESOLUCIÓN: N°1383-2010-R(10 de Diciembre del 2010 al 30 de Noviembre del 2011)

BELLAVISTA –CALLAO2012

3

A mi inolvidable MADRE,A mi ESPOSA e

Hijos Luis Arturo y Gabriel Alonso,frutos de mi vida.

4

“La disciplina es el camino al éxito, pues ella demuestra el empeñoque ponemos en la meta”

“El primer paso de la sabiduría es liberarse de la necedad “

Horacio

“Lo escuche y lo olvide, lo vi y lo entendí, lo hice y lo aprendí”

“Leer sin meditar es una ocupación inútil”

Confucio

“La falta de tiempo es escusa de aquellos que pierden tiempo porfalta de métodos”

Albert Einstein

“El único hombre que no erra es aquel que nunca hace nada”

Theodore Roosevelt

“Estar preparados es importante, saber esperar lo es aun mas, peroaprovechar el momento adecuado es la clave de la vida”

Arthur Schnitzler

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ÍNDICE

Pag.

RESUMEN……………………………………………………………….… 08

I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………….. 09

1.1. Objetivos y alcance de la investigación………….................... 10

1.2. Importancia y Justificación de la investigación………………. 11

II. PARTE TEÓRICA O MARCO TEÓRICO……………………………… 12

III. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………….…………… 17

3.1. Método para la obtención de papas fritas en hojuela…….….. 17

3.2. Procesamiento de muestras para su análisis Microbiológico. 21

IV. RESULTADOS………………………………………………….………. 56

V. DISCUSIÓN……………………………………………………………….. 62

VI. CONCLUSIONES……………………………………………………….. 64

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………. 65

VIII. APÉNDICE..………………………………………………………….... 66

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PAPA FRITA EN SU PRESENTACION HOJUELA

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I. DATOS GENERALES1. TITULO DEL PROYECTO

Evaluación de la calidad microbiológica de los bocaditos fritos a base

de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma

artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito Bellavista – Callao.

2. FACULTAD

Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos.

3. INSTITUTO DE INVESTIGACION

Instituto de la Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos.

4. INVESTIGADOR RESPONSABLE O JEFE DEL PROYECTO

Apellidos : García Merino

Nombres : Arturo Mariano.

Categoría : Auxiliar

Clase : Dedicación Exclusiva

Condición : Nombrado

Código : 1364

Profesión : Biólogo - Microbiólogo / Ing. Alimentario

5. PROFESORES ORDINARIOS A T.C o D.E PARTICIPANTES

Ninguno.

6. PERSONAL ADMINISTRATIVO DE APOYO

Ninguno.

7. DURACION DEL PROYECTO

12 meses.

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RESUMEN

El presente trabajo se desarrollo en el laboratorio de Microbiología - Chucuito.

Basado según la exigencia de la “Norma Sanitaria que establece los criterios

microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de

consumo humano” (R.M. N° 591– 2008/MINSA) , grupo V. GRANOS DE

CEREALES, LEGUMINOSAS, QUENOPÒDIACEAS Y DERIVADOS (harinas y

otros), (V-8): Hojuelas a base de granos (gramíneas, quenopodiáceas y

leguminosas) que requieren cocción.

Para la determinación y/o seguimiento de los microorganismos indicadores de

calidad según dicha norma, se realizaron bajo los métodos indicados por la

ICMSF; en la evaluación de muestras, se realizaron análisis cuantitativos como

cualitativos.

El Tipo de muestreo es aleatorio, las muestras se adquirió de los diferentes carrito

expendedores que circundan en la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito Bellavista –

Callao.- durante 11 meses: Enero (2011) a Noviembre (2011)

Las pruebas se hicieron por duplicado, se trabajó un total de 22 muestras en el

laboratorio de Microbiología de Chucuito- FIPA-UNAC.

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I. INTRODUCCION

a) Descripción y análisis del tema

La higiene de los alimentos comprende el conjunto de condiciones y

medidas necesarias para garantizar la seguridad y salubridad de los

productos alimentarios incluida la manipulación por el consumidor desde el

momento que adquiere el alimento en un punto de venta hasta que lo

prepara y consume. La seguridad alimentaria por su parte, se logra mediante

el adecuado control de la calidad de la materia prima durante su

procesamiento hasta obtener un producto manufacturado óptimo, pero

también es crucial lograr condiciones adecuadas de almacenamiento,

transporte y manipulación del producto final en los mercados donde se

comercializa.

La venta de alimentos en la vía pública es hoy una característica importante

en nuestra capital y en las ciudades más importantes al interior del país ya

constituye un factor positivo para la economía de nuestro país ya que

moviliza una gran cantidad de recursos y genera empleo informal, al mismo

tiempo que satisface la necesidad de obtención de comidas rápidas de bajo

costo, junto al lugar de trabajo, especialmente por la población de más bajos

ingresos. Además, presenta como beneficio la satisfacción de tradiciones y

hábitos de consumo de alimentos típicos.

b) Planteamiento del problema

A pesar de las ventajas conocidas del comercio informal de alimentos, durante

la elaboración pueden ocurrir posibles riesgos para la salud de la población ya

que, en la mayoría de los casos, los alimentos son preparados por personas

que carecen de adiestramiento para su adecuada manipulación y lo hacen en

condiciones precarias de higiene.

Estudios realizados en nuestro medio han demostrado que la gran mayoría de

los vendedores de alimentos no cuentan con un sistema de agua de buena

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calidad, ni el volumen adecuado para las necesidades diarias, siendo común la

reutilización del agua para el lavado de utensilios, las manos y las superficies

de trabajo, entre otras, transformándose en una fuente abundante cantidad en

microorganismos.

c) Problema

¿Qué grado del calidad microbiológica tendrán las frituras a base de Papa

(Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden? en la Urb. Ciudad del

Pescador – distrito Bellavista – Callao?

1.1. Objetivos y alcance de la investigación1.1.1. Propósito de la Investigación.

Objetivo General Evaluar a la calidad microbiológica de las frituras a base de Papa que

se elaboran en la Av. Juan Pablo II de la Urb. Ciudad del Pescador –

Distrito Bellavista – Callao.

Objetivo Específico

Determinar la presencia microorganismos indicadores de alteración, de

higiene y patógenos en muestras de papa frita en hojuela.

1.1.2. Alcances de la Investigación Tipo de Investigación

Investigación experimental (aplicada).

Sector que s e verá beneficiado de los resultados de lainvestigación.Se beneficiaran de los resultados de la investigación.

El Ministerio de Salud. La Municipalidad de Bellavista – Callao.

El público consumidor.

Los docentes de la especialidad y aéreas afines.

Alumnos de la escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos.

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Los Sectores Industriales (Industria de alimentos e industrias

Pesqueras).

Las personas que realizan actividades afines.

1.2. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN.

1.2.1. IMPORTANCIA

El aporte de la presente investigación, radica en demostrar mediante métodos

estandarizados, la presencia de microorganismos muchos de ellos patógenos,

los cuales al ser ingeridos junto con el alimento preparado estos pueden

desencadenar graves alteraciones en la salud del consumidor.

Además esta investigación nos servirá para demostrar la calidad microbiológica

de estos alimentos, por el solo hecho de presentarse coliformes o mohos ya

nos indicando la falta de higiene y salubridad que ha tenido el alimento durante

su elaboración y/o durante su expendio.

1.2.2. JUSTIFICACION

Existen razones fundamentales para realizar este tipo de investigación como

son la sola presencia de Coliformes, mohos, Bacillus y Salmonella en frituras

que ya nos indica la contaminación a partir de portadores que han manipulado

el alimento y la exposición de estos productos en plena vía pública.

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II. PARTE TEORICA O MARCO TEORICO

América Latina produce cerca de 8 millones de toneladas de papas anualmente. La

producción y el rendimiento varían considerablemente entre países. Dentro de la

Zona Andina, Perú tiene la más alta tasa de crecimiento de la producción y

rendimiento. El producto ha aumentado cerca del 300% desde los comienzos de

1960. El continuo aumento de la producción es una respuesta a la fuerte demanda

de la papa para consumo en fresco y procesada. El crecimiento en el producto ha

sido facilitado entre otras cosas por la disponibilidad de un buen sistema de manejo

de plagas y enfermedades.

Las industrias de nivel casero o semi-industrial procesan por su parte menos de 6

toneladas diarias. Los mayores niveles de urbanización reciente y una presencia

más activa de la mujer en el mercado laboral han ocasionado cambios en los

hábitos de consumo que se reflejan en una mayor demanda por productos

procesados o semiprocesados. Para el caso de la papa esto ha significado un

crecimiento importante del mercado industrial en los últimos años y una previsión

para el futuro inmediato que permite esperar que el porcentaje actual de

participación de la industria de procesamiento en el mercado de la papa llegue por

lo menos a duplicarse en los próximos 10 años. (3) (2005).

Las papas fritas envasadas se obtienen de papas lavadas, peladas, cortadas y

fritas en aceite. El mercado nacional ofrece este producto en distintos tamaños y

texturas: con sal, con limón y sal, y de distintos sabores como queso o adobo

(derivados de la adición de diversos ingredientes), entre otros. Sin embargo,

estrictamente, ¿qué contienen las papas fritas, además de aceite y sal?

Acompáñenos a descubrirlo.

Normalmente, el contenido en materia seca determina el rendimiento del producto

terminado. Así por ejemplo, aumenta el rendimiento de las hojuelas por menores

pérdidas cuantitativas de evaporación de agua, mientras que disminuye la

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retención de aceite en la fritura. Esto es importante, tanto para la economía como

para la nutrición fisiológica. El contenido ideal es de 25% en el caso de papas fritas

referidas a materia fresca (medidas a una temperatura prefijada); en caso contrario

dejarían de ser comerciales.

En la actualidad, las papas fritas envasadas son la marca favorita de todo el

mundo, lo que explica la demanda tan alta que estos productos tienen. De hecho,

el alto consumo de papas fritas ha dado origen a la fabricación de otros productos

que no son estrictamente papas fritas, pues están elaborados a base de harina de

papa y puestos en empaques que cuidan más la presentación del producto

(rebanadas más enteras). (20).(2008).

2.1. Qué contienen

De acuerdo con los resultados obtenidos en el presente estudio de calidad, las

papas fritas son productos salados y muy energéticos, por cada 100 gramos

proporcionan entre 489 a 587 kilocalorías, esto debido a su contenido de grasa

(entre 23% y 40%) e hidratos de carbono (entre 50% y 60%), aunque también

aportan otros nutrientes como proteína vegetal (de 6% a 8%) y sal (entre el 0.2% y

el 1.9%, según la marca). (20).(2008).

2.2. El estudio

En el estudio se evaluaron la calidad microbiológica 22 muestras de bocaditos fritos

a base de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma

artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito Bellavista – Callao. (venta

ambulante), todos correspondientes a los que sólo contienen sal. Para el análisis

se tomaron 2 muestras mensual de diferentes carritos expendedores en distintos

puntos de venta.

El estudio también incluye el análisis de papas fritas a granel para informar sobre

su calidad microbiológica exigida por la Norma Sanitaria N° RM-591. Cada

producto se sometió a las pruebas que a continuación se indican.

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Según la “Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad

sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano” (R.M. N°591– 2008/MINSA) Protocolo para los análisis microbiológicos de Granos de

Cereales, leguminosos, quenopodiáceos y derivados (harinas y otros), según

DIGESA grupo V. GRANOS DE CEREALES, LEGUMINOSAS,

QUENOPÒDIACEAS Y DERIVADOS (harinas y otros) (V-8): Hojuelas a base de

granos (gramíneas, quenopodiáceas y leguminosas) que requieren cocción: (22)

2.3. PARAMETROS DE EVALUACION

Categoría.- Escala relativa al riesgo que representa un alimento y a lamanipulación posterior prevista. Grado de riesgo que representan losmicroorganismos en relación a las condiciones previsibles de manipulación yconsumo del alimento. (22)

Componentes del plan de muestreo"n" (minúscula): Número de unidades de muestra, seleccionadas al azar de unlote, de acuerdo a normas nacionales o internacionales referidas a alimentos ybebidas apropiadas para fines de realizar el análisis microbiológicos. (22)

Agentes Microbianos Categoría Clases N cLimite por g

m M

Aerobios mesófilos 2 3 5 2 104 106

Mohos 2 3 5 2 103 104

Coliformes 5 3 5 2 102 103

Bacillus cereus 8 3 5 1 102 104

Salmonella sp. 10 2 5 0 Ausencia/25g -

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"c": Número máximo permitido de unidades de muestra rechazables en un plan demuestreo de 2 clases o unidades de muestra provisionalmente aceptables en unplan de muestreo de 3 clases. Cuando se detecte un número de unidades demuestra mayor a “c” se rechaza el lote. (22)

"m" (minúscula): Límite microbiológico que separa la calidad aceptable de larechazable. En general, un valor igual o menor a “m”, representa un productoaceptable y los valores superiores a "m” indican lotes rechazables en un plan demuestreo de 2 clases. (22)

"M" (mayúscula): Los valores de recuentos microbianos superiores a "M" soninaceptables, el alimento representa un riesgo para la salud. (22)

Clase.- Son los planes de muestreo que se expresan en términos de clase son doso tres.- Los de planes de muestreo dependen del grado del peligro involucrado. (22).

Tipos de plan de muestreo para lote o lotes:

A. Plan de 2 clases: Es un plan de muestreo por atributos, donde puedeestablecerse únicamente la condición de "aceptable" o "rechazable".- Se usacuando no se puede tolerar la presencia o ciertos niveles de un microorganismo enninguna de las unidades de muestra.Un plan de 2 clases queda definido por “n” y “c”;

Para microorganismos patógenos:Condición de "aceptable" = ausenciaCondición de "rechazable" = presencia

Para otros microorganismosCondición de "aceptable" = menor o igual al nivel crítico establecido, “c”Condición de "rechazable" = mayor al nivel crítico establecido, “c”

B. Plan de 3 clases: Es un plan de muestreo por atributos.- Se usa cuando se

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puede tolerar cierta cantidad de microorganismos en algunas de las unidades demuestra que queda definido por "n", "c", "m", "M"; donde se establece: Condición de "aceptable":

Cuando todas las unidades de muestra presentan recuentos igual o inferiores a"m".Cuando hasta "c" unidades de muestra pueden tener recuentos entre "m" y "M"(incluido "M").

Condición de "rechazo":Cuando más de "c" unidades de muestra presentan recuentos entre "m" y "M"(incluido "M").Cuando al menos 1 de las unidades de muestra presentan recuentossuperiores a "M".(22)

La realización del presente trabajo servirá como un aporte para la mejora delexpendio ambulante de estos alimentos en dicha zona. No se han reportadooficialmente trabajos realizados en la zona.Contenido de sodio. La Organización Mundial de la Salud recomienda no consumirmás de seis gramos de sal al día (2,400 mg de sodio), por lo que se considerónecesario consignar en las tablas de resultados el aporte que proporcionan losproductos analizados.

Calidad sanitaria. Para comprobar la inocuidad del producto, se determinó laausencia de microorganismos patógenos y de microorganismos indicadores demanejo sanitario deficiente.

2.4. Determinación del Universo Las muestras para el análisis se obtuvieron de los carritos expendedores que

circulan por la Urb. Ciudad del Pescador – Distrito Bellavista - Callao. El tipo de muestreo es aleatorio. Tamaño de muestra = 22 muestras.

2.5. Métodos experimentalesLa parte experimental se desarrollo en el laboratorio de Microbiologia –Chucuito, se adquirió los medios y reactivos específicos para cadamicroorganismo, para la identificación bioquímica y serológica de los mismos.

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III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Método para la obtención de papas fritas en hojuela

Dentro de las múltiples posibilidades de la papa en Perú, la más interesante es la

transformación en hojuelas (Chips). La gran diversificación de la industria

procesadora obliga a un mejoramiento genético de la papa para asegurar un buen

rendimiento y la máxima calidad en papas fritas (hojuelas)).

Los requerimientos de calidad que hay que cumplir son: color aceptable (bajo

contenido en azúcares menos del 0.1%), alto contenido en materia seca (más del

20%), excelente textura y sabor del producto final, libre de enfermedades y daños y

tamaño entre 40 y 80 mm.

El color tiene una relación directa con el contenido en azúcares reductores. En su

apariencia externa y evolución, el color debe ser: desde un color blanco-

amarillento, (aceptable) pasando por un color amarillo-oro (deseable) hasta un

color marrón-negruzco (rechazable), que viene dado por una alta concentración de

azúcares reductores (2%) y que hace un producto indeseable en sabor y

apariencia.

La buena apariencia, textura crujiente y sabor agradable son puntos importantes de

cara al consumidor y a la venta del producto. Ello se consigue, lógicamente,

procesando papas de alta calidad, supervisadas y clasificadas para este tipo de

procesamiento. (5)(1998).

Los factores que influyen directamente en la calidad final de las papas fritas y

prefritas son, fundamentalmente, la temperatura en almacenamiento, variedad

empleada y madurez fisiológica del tubérculo y, con menor trascendencia, la

composición del suelo, la fertilización, el medio ambiente y el riego.

PARDEAMIENTO POR COCCION DE PAPAS PARA CONSUMO FRESCO En

diferentes variedades de papas para consumo en fresco aparece el pardeamiento

por cocción, la cual es la coloración azul-grisácea que presentan los tubérculos

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después de cocinarlos. En esta coloración están involucradas sustancias químicas

como: hierro, ácido clorogénico, ácido cafeico, fenoles totales, ácido cítrico, etc.(2)(1997).

3.1.1. Materialesa. Cinco variedades de Papas nativas

b. Aceite vegetal de soya: 2 litros

c. Freidora eléctrica de capacidad de fritura 150 - 200 grs/batch de hojuela cortada

d. Hervidor eléctrico

e. Papel absorbente

f. Sal refinada

g. Cortadora manual para hojuelas

h. Selladora de bolsas

i. Balanza

j. Bolsas de polipropileno

k. Coladores de plástico

l. Detergente

m.Ácido cítrico

n. Cloros

o. Baldes de plástico

p. Diversos recipientes.

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Diagrama de Flujo para Obtener Hojuelas de Papa

Recepción y pesado

Selección y clasificación

Lavado y desinfectado(con 20 ppm de cloro)

Agua Cortado

Agua a 50 ºC Escaldado

Escurrido Agua

Fritado: Temperaturas 170, 180 y 190 ºCTiempo 5, 6 y 7 minutos

Enfriado

Envasado y pesado

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3.1.2. Descripción del proceso:

a. Recepción y pesado: Se realiza esta operación con la finalidad de determinar elrendimiento conversión de la materia prima a hojuelas o chips de papa.

b. Selección y clasificación: En este proceso se retira del proceso, aquellaspapas que tiene defectos externos visibles.

c. Lavado y desinfectado: El objetivo es eliminar la suciedad que viene inherenteal producto por sucesivos lavados con la ayuda de esponjas; después se añadecloro al agua para reducirla carga microbiana.

d. Cortado: Se cortó en forma de laminas cuyo espesor debe fluctuar entre 1 a 1.2mm. variando el diámetro en función a las características fenotípicas de lavariedad.

e. Escaldado: Se considera como una operación crítica. Las rodajas de papa sonescaladas enagua para inactivar enzimas y cuya temperatura no deberá deexceder los 50 ºC por un tiempo de 3 a 5 minutos; un exceso de calor y tiempopuede modificar las características del producto.

f. Oreado: En lo posible eliminar el sobrenadante del agua que queda en lashojuelas porque encaso contrario en el fritado se formaran bolsas de aire, el cualle resta calidad.

g. Fritado: Tiene por finalidad de la cocción y brindar las característicasorganolépticas y principalmente crocantes debido a la baja humedad que quedaen el producto, se ensayaron diferentes tiempos y temperaturas de fritado.

h. Enfriado: Las hojuelas fritas previo escurrido del aceite se enfriaron en bandejaslos cuales contenían papel para absorber el aceite adherido a las hojuelas.

i. Salado: Con la finalidad de resaltar el sabor de las hojuelas se le agrega unapizca de sal finamente molida a gusto del cliente.

j. Envasado y pesado: Con la finalidad de mantener las característicasorganolépticas del producto como crocantes, textura y el crounch las hojuelas depapa son envasadas en bolsas de polipropileno. (2) (1997), (6) (1989).

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3.2. Procesamiento de las muestras de papa en hojuela para su análisis

Microbiológico.

3.2.1. Triturado de la muestra

Se trata de una operación importante dentro de la preparación de la muestra

para su análisis. En el triturado hay que evitar la destrucción de los gérmenes

por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo.

Además de una perfecta trituración de los alimentos, es necesario obtener una

mezcla homogénea para lograr la distribución equilibrada de los gérmenes y

sus toxinas. (10) (2000).

3.2.2. Técnica del Triturador de paletas (Stomacher) (*)(Método ICMSF).

Que actúa golpeando rítmicamente la mezcla de alimento y diluyente que ha

sido introducida previamente en una bolsa de plástico estéril. Los choques

producidos por las paletas dislaceran el alimento y ponen a las bacterias en

suspensión.

3.2.2.1. Material y Aparatos

1. Stomacher Colworth, o aparato similar, operando a unas 230 r.p.m. y con

una capacidad de 400 ml.

2. Bolsas de polietileno de paredes delgadas (aproximadamente del calibre

200), de unos 18 x 30 cm y con el fondo soldado.

3. balanza de una capacidad no inferior a 2.5 g y de una sensibilidad de 0.1 g.

4. Instrumentos para prepara las muestras: cuchillos, tenedores, pinzas,

tijeras, cucharas, espátulas depresores linguales, todo ello previamente

esterilizado en autoclave o por aire caliente.

5. Frigorífico, a 2 – 5 ºC.

6. Pipetas bacteriológicas estériles de 1 y 10 ml.

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7. Agua de peptona para diluciones o agua de peptona salina para diluciones.

El diluyente se repartirá en volúmenes de 9 o de 90 ml en tubos de cultivo o

en frascos de dilución. Tanto el diluyente como los recipientes en los que se

reparten deben estar convenientemente esterilizados.

3.2.2.2. Técnica

1. Comenzar a trabajar tan pronto como sea posible después de la toma de

muestras. Pesar, en un bolsa de polietileno previamente tarada, al menos

10g representativos de la muestra total (ICMSF, 1974). Los alimentos

congelados no precisan ser previamente descongelados a no ser que ello

resulte necesario para pesar las unidades de muestra. Tampoco es

necesario picar, antes de homogeneizar, alimentos como la carne. Si es

preciso descongelar la muestra, esta se mantendrá en su envase original (o

en el recipiente en que llego al laboratorio) en un frigorífico a 2 – 5 ºC y se

iniciara el análisis tan pronto como la descongelación permita tomar

adecuadamente las unidades de muestra (el tiempo máximo de

descongelación no superara las 18 horas).

2. Añadir un volumen de diluyente igual a 9 veces la muestra. Así se obtiene

una dilución 10-1.

3. Si se sabe o se sospecha que el alimento contiene gérmenes patógenos,

es conveniente colocar la bolsa conteniendo la muestra y el diluyente dentro

de otra bolsa como precaución frente a la posibilidad de que se rompa la

primera.

4. Para alimentos con un elevado contenido en grasa (superior al 20%) como

ocurre por ejemplo en ciertas carnes, es necesario añadir un 1 % de Tween

80 o de otro tensoactivó no toxico.

5. Colocar la bolsa en el “Stomacher” y hacer funcionar el aparato durante 60

segundos.

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6. Agitar energéticamente la bolsa con las manos y pipetear 10 ml en un frasco

conteniendo 90 ml de diluyente, o bien pasar 1 ml a un tubo conteniendo 9

ml de diluyente. De este modo se obtiene la dilución 10-2

7. Agitar energéticamente la suspensión de 100 ml 25 veces en un arco de 30

cm, o aspirar 10 veces la suspensión de 10 ml con una pipeta estéril.

Pipetear 10 ml en un nuevo blanco de dilución de 90 ml o 1ml en uno de 9

ml, obteniendo de esta forma la dilución 10-3. Repetir esta operación para

preparar las diluciones 10-4 y 10-5, o las necesarias, según indique la

experiencia, para el alimento que se va a analizar.

(*) Este método no es utilizado específicamente en ninguna región determinada del mundo, pero está adquiriendo

cada vez mayor popularidad debido a las ventajas que presenta sobre todo en lo que se refiere a ahorro de trabajo.El Stomacher Colworth 400 puede obtenerse de la firma A. J. Seward and Co. Ltd., BlacKfriars Road, Londres,Inglaterra. (10) (2000).

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3.2.3. Recuento Estándar en placa de Microorganismos Aerobios (MétodoICMSF).

3.2.3.1. Material y Aparato1. Los señalados anteriormente en la práctica, para la preparación y dilución

de los homogenizados de alimentos.

2. Placas petri de vidrio (100 x 15 mm) o plástico (90 x 15 mm).

3. Pipetas bacteriológicas de 1,5 y 10 ml (de idénticas características a las

exigidas para diluciones de muestras de leche; Hausler 1972).

4. Baño de agua o estufa de aire para templar y mantener el medio fundido a

44 - 46°C.

5. Estufa de incubación, 29-31°C. (Nota: la constancia y uniformidad de la

temperatura en las estufas son notoriamente deficientes. Para comprobar

el primer factor, mantenimiento de una temperatura constante, deben

realizarse lecturas continuas o frecuentes de la temperatura interior,

durante un periodo de tiempo de varias horas, utilizando pares términos o

termómetros adecuados. Para comprobar la uniformidad de la temperatura

en el interior de la estufa, deben hacerse lecturas similares, también en un

periodo de varias horas y en distintos lugares, cuando se encuentre llena

de placas petri {véase también Hausler, 1972}. Al colocar las pilas de

placas de petri dentro de la estufa hay que tener presente que estas

deben estar separadas entre sí y también de las paredes y del techo de la

estufa. Cada montón o pila debe estar formado como máximo por seis

placas, siendo preferible que su número no sea superior a cuatro).

6. Contador de colonias (se recomienda el modelo Quebec de campo oscuro

o equivalente).

7. Dispositivo de registro automático del número de colonias contadas.

8. Agar para recuento en placa Plate Count: P.C.(Agar de los Standards

Methds;).

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3.2.3.2. Técnica

1. Preparar la muestra de alimentos por el procedimiento recomendado en la

sección sobre preparación y dilución de los homogenizados de alimentos.

2. Pipetear por duplicado, en placas de petri, alícuotas de 1ml de las

diluciones 10-1,10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y una alícuota de 0,1 ml de la dilución

10-5, lo que supone la siembra por placa de 10-1 a 10-6g de alimentos. Se

aconseja esta serie de disoluciones en aquellos casos en que se

desconoce el número aproximado de gérmenes presentes en el alimento,

pero el rango de diluciones preparadas y sembradas puede modificarse en

función a la cifra de microorganismos esperada. De todos modos, siempre

deben sembrarse tres diluciones distintas.

3. Fundir el agar para recuento en placa utilizando vapor de agua hirviendo y

procurando que este en tratamiento térmico no sea excesivamente

prolongado. Templar el medio a 44-46ºC y controlar cuidadosamente su

temperatura para que al mezclarlo con la dilución del alimento no sean

inactivados los gérmenes. Verter inmediatamente en las placas de petri 10-

15 ml de medio fundido y templado. El periodo de tiempo transcurrido

entre la realización de las diluciones y el vertido del medio no debe

superar los 20 minutos y es preferible que sea inferior a 10 minutos.

4. Acto seguido, mezclar el inocuo con el medio fundido, inclinando y girando

las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación sería la

siguiente: (a) imprimir a la placa movimiento de vaivén 5 veces con una

dirección, (b) hacerla girar 5 veces en sentido de las agujas del reloj, (c)

volver a imprimir movimientos de vaivén en una dirección que forme

ángulo recto con la primera y (d) hacerla girar 5 veces en sentido contrario

a las agujas del reloj.

5. Con el fin de controlar la esterilidad, preparar una o varias placas

conteniendo medio y el diluyente sin inocular. Transcurrido el periodo de

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incubación, el numero de colonias presentes en estas placas no debe

modificar el recuento en más de una unidad en la segunda cifra

significativa (véase el apartado 8).

6. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-31ºC por

48+3 horas.

7. Calcular el recuento estándar en placa o el recuento estándar en placa

estimado de acuerdo con las directrices recogidas en las apartados 8 y

9.Tener en consideración todas las instrucciones relativas al cálculo, a los

datos que deben anotarse a la presencia de inhibidores y de colonias de

crecimiento difusivo en superficie, a los informes e interpretación y a la

reproductibilidad y error personal, que se presenta en los puntos 10 a 14.

8. Calculo del recuento estándar en placa

(a) Elegir las dos placas, correspondientes a una dilución, que presenten

entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada placa utilizando

el contador de colonias y el dispositivo de registro automático. Hallar la

media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución

(la inversa de la dilución cuyas placas han sido seleccionadas). Dar el

valor obtenido como el recuento estándar en placa (véase el apartado 10,

más adelante).

Ejemplo: Dilución 10-2

Placa 1 : 72 colonias x 102 = 7.200


Se promedia: 7.200 + 7.600 = 7.400 colonias

2

Se reporta: 74 x 102 u.f.c./g. o mL.

27

(b) Si una de las placas de la dilución elegida presenta algo menos de 30

colonias o algo más de 300, deben contarse también todas las colonias

de ambas y como en el caso anterior, hallar la media aritmética y

multiplicarla por el factor de dilución. El valor obtenido se dará como el

recuento estándar en placa.

Ejemplo: Dilución 10-2



Se promedia: 2.200 + 4.600 = 3,400 colonias

2


(c) Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre

30 y 300 colonias, deben hallarse los recuentos estándar en placa de

cada dilución tal como se ha señalado anteriormente y se dará como

resultado la media de los dos valores obtenidos, a no ser que uno de

ellos sea superior al doble del otro, en cuyo caso se dará como recuento

estándar en placa el valor más bajo.

Ejemplo 1: Dilución 10-1 = Nº promedio de colonias contadas : 290

Dilución 10-2 = Nº promedio de colonias contadas: 35

Se relaciona el cómputo de los 2 recuentos : 3.500 = 1.2

2.900

En este caso se reporta el promedio: 2,900 + 3,500 = 3,200 col.

2


28

Ejemplo 2: Dilución 10-2 = Nº promedio de colonias contadas : 170

Dilución 10-3 = Nº promedio de colonias contadas : 45

Se relaciona el cómputo de los 2 recuentos: 45.000 = 2.2

17.000

En este caso se reporta el recuento menor es decir: 17.000 col.


9. Cálculo del recuento estándar en placa estimado (R.E.P.E.)

(a) Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, el valor

calculado se da como el recuento estándar en placa estimado y el

cálculo del número de gérmenes presentes en el alimento se lleva a

cabo en los distintos casos en la forma en la que se indica en los

apartados (b), (c) y (d), a continuación.

(b) Si todas las placas presentan más de 300 colonias, dividir las dos

placas, correspondientes a la dilución más elevada, en secciones

radiales (2,4 u 8) y contar todas las colonias que se hallan en una o

más secciones. Multiplicar el conseguir una estimación del número

total de colonias presentes en la placa.

Hallar la media de valor estimado por las dos placas y multiplicar

por el factor de dilución correspondiente. El valor obtenido se da

como el recuento estándar en placa estimado.

(c)Si en las placas inoculadas con la dilución menos concentrada se

encuentran más de 200 colonias en una sección correspondiente a

la octava parte de la placa, multiplicar 1.600 (procedente de 200 x 8)

por el factor de dilución y expresar el recuento estándar en placa

estimado con superior (>) al valor obtenido. Ejemplo: 1,600 x (103) =

> 1’600,000 u.f.c./g. o mL. En estos casos resulta aconsejable

señalar entre paréntesis la dilución utilizada.

29

(d) Cuando no se encuentran colonias en las placas correspondientes a

la dilución más concentrada, expresar el recuento estándar en placa

estimada como inferior a (<) 1 multiplicado por el factor de la

dilución más concentrada. Ejemplo: 10-1 = 0 colonias. Se reporta

como <10 u.f.c./g. o mL.

10. Calculo y representación de los resultados

Cuando se dan los valores del recuento estándar en placa o

recuento estándar en placa estimado, deben utilizarse únicamente

dos cifras significativas. Estas dos cifras corresponden a los dígitos

primera y segunda (empezando por la izquierda) de la media de la

colonias halladas o estimadas. Los dígitos restantes tienen que ser

sustituidos por ceros. Por ejemplo, si el valor calculado fue de

523.000, este a de darse como 520.000 (52 x 104). Si el tercer

digito empezando por la izquierda es 5 o superior, se le añade una

unidad al segundo digito (se redondea). Por ejemplo, si el valor

calculado es 83.600, este debe hacerse como 84.000 (84 x 103).

11. Presencia de colonias de crecimiento difusivo en superficie

(a) Cuando las placas elegidas aparezca estas colonias y siempre que

el área ocupada por ellas no supere la mitad de la placa, contar las

colonias de otro tipo que se encuentran fuera de esta zona.

Corregir la cifra obtenida teniendo en cuenta el área en que no se a

podido contar las colonias.

(b) Siempre que la zona ocupada por este tipo de colonias supere la

cuarta parte de la superficie de la placa hay que anotar su

presencia. Si este problema lo presenta más que una placa de cada

veinte hay que tomar las medidas necesarias para evitar su

aparición (como, por ejemplo reducir la humedad de la estufa de

30

incubación o mezclar el inóculo con el medio fundido y templado de

forma mas completa).

12. Presencia de inhibidores

En algunos casos se puede sospechar la presencia de inhibidores.

Las sospechas surge cuando el numero de gérmenes en la dilución

más concentrada es notablemente menor de los que cabria esperar.

Para la detección de los posibles inhibidores pueden utilizarse

diversas pruebas, recomendándose las descritas por la International

Dairy Federation (IDF, 1970b).

13. Presentación e interpretación de los resultados

(a) Los resultados obtenidos deben darse como recuento estándar en

placa o como recuento estándar en placa estimada por gramo o por

mililitro de alimento, según corresponda.

(b) Siempre que se utilice el método de recuento en placa para

decidir si una partida de alimentos se acepta o se rechaza,

debe tenerse en consideración únicamente de recuento

estándar en placa y nunca en recuento estándar en placa

estimada. Desde el punto de vista de un organismo oficial, el

recuento estándar en placa estimado es solo útil como una

aproximación inicial para valorar la calidad bacteriológica de un

alimento.

(c)En el caso de que se utilice el recuento en placa para establecer si un

alimento determinado (por ejemplo, leche) se cumple una norma

microbiológica, véase la obra de la comisión sobre planes de

muestreo (ICMSF, 1974).

31

3.2.4. Método de Recuento de Levaduras y Mohos por siembra en placa en

todo el medio (Método ICMSF).


1. Lo necesario para la preparación y dilución de los homogeneizados de

alimentos (Primera práctica).

2. Placas de Petri, de vidrio (100 × 15mm) o de plástico (90 × 15mm).

3. Pipetas bacteriológicas de 1,5 y 10 ml.

4. Baño de agua o estufa de aire forzado para templar el agar fundido, 44-

46ºC.

5. Estufa de incubación, 20 - 24º C.

6. Contador de colonias (tipo Quebec de campo oscuro o similar).

7. Dispositivo de recuento con registro automático.

8. Agar Oxitetraciclina Gentamicina extracto de levadura glucosa OGY1.

3.2.4.2. Técnica

1. Preparar la muestra de alimento por uno de los tres procedimientos

recomendados en el capítulo sobre preparación y dilución de los

homogeneizados de alimentos.

2. Pipetear en placas de Petri alícuotas de 1 ml de las diluciones 10-1, 10-2,

10-3, 10-4, 10-5, utilizando dos placas por cada dilución. Se propone esta

serie de diluciones para los casos en que no se conozca el número

aproximado de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra.

Por supuesto, las diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre

serán función del recuento esperado.

3. Rápidamente, verter en las placas de Petri 10 -15 ml del agar oxitetraciclina

gentamicina extracto de levadura glucosa, fundido y templado a 44-46º C.

4. Mezclar inmediatamente el inóculo con el agar balanceando la placa de

izquierda a derecha cinco veces, rotándola en el sentido de las agujas del

32

reloj otras cinco veces, realizando otras cinco veces el movimiento de

vaivén en sentido perpendicular al primero y rotándola, finalmente cinco

veces en sentido contrario a la agujas del reloj.

5. Invertir las placas cuando se haya solidificado el agar e incubarlas a 20-

24ºC durante 3-5 días.

6. Con ayuda del contador de colonias y del dispositivo de recuento con

registro automático, contar las colonias en aquellas placas que

contengan entre 30 y 300, llevando a cabo un examen microscópico cuando

sea necesario para identificar las colonias de levaduras.

7. Calcular el número de levaduras y mohos por gramo o mililitro de alimento.

3.2.4.3. Lectura y Expresión de Resultados

1. Proceder la lectura, como en la Numeración de Microorganismos Aerobios

Mesofilos Viables.

2. Elegir para el reporte las placas que contengan entre 30-300 UFC/ g. o ml.

Se cuentan todas las colonias de Mohos y de Levaduras por separado

3. Reportar como Levaduras / gr o ml de muestra.

4. Reportar como Mohos / gr o ml de muestra.

1 Preparar 900 ml de Agar base extracto de levadura-glucosa, luego distribuir en volúmenes de 90 ml y esterilizar

por autoclavado.; luego al momento de su utilización adicionar 10 ml. de Oxitetraciclina (10 mg por cada 100

ml de medio).

La oxitetraciclina se prepara en condiciones estériles, en la proporción de 100 mg de oxitetraciclina por cada

litro de medio.

33

3.2.5. RECUENTO DE COLIFORMES: TÉCNICA DEL NÚMERO MÁSPROBABLE (NMP) MÉTODO ICMSF 11 (Norteamericano)


1. Lo necesario para la preparación y dilución de los homogeneizados de

alimentos, (Primera práctica).

2. Estufa de incubación, 35-37ºC.

3. Pipetas bacteriológicas de 1ml.

4. Asa de inoculación, con alambre de nicrom o de platino-iridio.

5. Caldo lactosa bilis (2%) verde brillante, volúmenes de 10ml en tubos de 150

x 15mmm, conteniendo tubos de fermentación de Durham invertidos (75x

10mm).

6. Caldo lauril sulfato triptosa, volúmenes de 10ml en tubos de 150 x 15mm,

conteniendo tubos de fermentación de Durham invertidos o viales similares

de vidrio( 75 x 10 mm)

7. Agar eosina azul de metileno (EMB) o agar de ENDO, para placas.

3.2.5.2. TÉCNICA

1. Preparar las muestras de alimentos por uno de los procedimientos

recomendados en la sección sobre preparación y dilución de los

homogeneizados de alimentos. Para hacer las diluciones pueden utilizarse

los blancos de dilución o frascos de diluyentes sobrantes del método de

recuento en placa.

(Importante: una vez hechas las diluciones del alimento, debeprocurarse que transcurra el menor tiempo posible hasta que serealizan las siembras, pues así se evitan la multiplicación o la muerte delos microorganismos suspendidos en el diluyente).

34

2. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones del homogeneizado del alimento

en tubos de caldo lauril sulfato triptosa, utilizando tres tubos por cada dilución.

3. Incubar los tubos a 35-37ºC durante 24 y 48 horas.

4. Pasadas las 24 primeras horas, anotar los tubos que muestren producción de

gas2

Volver a la estufa los tubos negativos para su incubación durante 24 horas

más.

5. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas2.

6. Elegir la dilución más alta en la que sean positivos de formación de gas los

tres tubos y las dos diluciones superiores más próximas. Por ejemplo, si la

dilución más alta en la que aparecen los tres tubos positivos es la 1:100 y en

la 1:1.000 hay un tubo positivo y en la 1:10.000 ninguno, el resultado se

anotaría del siguiente modo: dilución 1:100=3, dilución 1:1000=1 y dilución

1:10.000=0. Estos resultados corresponden en la tabla del NMP para series

de tres tubos a un NMP de 400.

Si no hubiera ninguna dilución que presentase los tres tubos positivos,

seleccionar las tres diluciones más altas con algún tubo positivo fueran 1:10,

1:100, 1:1.000 y 1:10.000 con 2, 2, 1 y 1 tubos positivos , respectivamente ,

los resultados se anotan como 1:100=2, 1:1.000=1 y 1:10 .000=1. Este

resultado corresponde en la tabla del NMP a 200.

Cuando no se hayan hechos diluciones más altas, de forma que la ultima

presente también los tres tubos positivos , seleccionar las tres últimas

diluciones realizadas. Por ejemplo, si las tres últimas diluciones realizadas

fueran 1:100, 1:1.000 y 1:10.000, y el número de tubos positivos fuera 3, 3 y

3, respectivamente, los resultados se anotarían como 1:100=3, 1:1.000=3 y

1:10.000=3. En este caso el NMP es igual o mayor de 11.000.

7. Confirmar que los tubos de caldo lauril sulfato triptosa seleccionados en el

paso 6 son positivos de organismos coliformes, transfiriendo un asa de cada

tubo a otro tubo de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante o sembrando por

estría en placas de Agar eosina azul de metileno o de Agar de Endo. Incubar

35

los tubos de confirmación durante 24-48 horas a 35-37ºC y observar la

producción de gas. La formación de las confirma la presencia de organismos

coliformes. Observar los medios sólidos de confirmación para ver si existen

colonias típicas de coliformes después de 24 y 48 horas de incubación a 35-

37ºC.

La formación en el Agar eosina azul de metileno de colonias negras o con el

centro negro, o bien de colonias de colonias mucoides de color rosa – naranja

confirma la presencia de organismos coliformes .De modo semejante, en

Agar de Endo las colonias de coliformes son rojas y están rodeadas también

de halos rojos.

8. Anotar el número de tubos confirmados como positivos de organismos

coliformes en cada dilución.

9. Para obtener el NMP, proceder de la forma siguiente. Ver en cada una de las

tres diluciones seleccionadas el número de tubos en los que se confirmo la

presencia de coliformes. Buscar en la tabla del NMP (tabla 6) y anotar el NMP

que corresponda al número de tubos positivos de cada dilución. Así, si en el

primer ejemplo dado en el punto 6 anterior todos los tubos positivos en las

tres diluciones seleccionadas (1:100, 1:1.000 y 1:10.000) resultasen

confirmados de presencia de coliformes, los valores de cada dilución serian 3,

1 y 0, respectivamente. Para calcular el NMP de organismos coliformes por

gramo de alimento, se multiplica el valor que figura en la tabla por 10(en este

ejemplo 40 x 100 = 400 por gramo).

1 Este método sigue el recomendado para el agua (APHA y col., 1976) y los alimentos (APHA, 1966; Lewis yAngelotti, 1964; AFDOUS, 1966; USFDA, 1972; AOAC, 1975).

36

TABLA 01.Numero Más Probable (NMP) de bacterias; tres tubos por cada dilución. b

Numero de tubos positivos en cadadilución Limites de confianza

Dilución10-1

Dilución10-2

Dilución10-3

NMP/gramo 99% 95%

0 1 0 3 <1 23 <1 11 0 0 4 <1 28 1 21 0 1 7 1 35 2 21 1 0 7 1 36 2 21 2 0 11 2 44 4 32 0 0 9 1 50 2 32 0 1 14 3 62 5 42 1 0 15 3 65 5 52 1 1 20 5 77 8 62 2 0 21 5 80 8 63 0 0 23 4 177 7 123 0 1 40 10 230 10 183 1 0 40 10 290 20 213 1 1 70 20 370 20 283 2 0 90 20 520 30 393 2 1 150 30 660 50 513 2 2 210 50 820 80 643 3 0 200 <100 1.900 100 1.4003 3 1 500 100 3.200 200 2.4003 3 2 1.100 200 6.400 300 4.800

a Calculada a partir de los datos de Manb De cada dilución se inoculan tres tubos de medio, cada uno con 1ml. Para calcular el NMP de diluciones

mayores que las figuran en la tabla, multiplicar el NMP por el factor adecuado: 10,100,1.000,etc. Por ejemplo, silos tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10-2,10-3 y 10-4, multiplicar por 10; si las diluciones son10-3,10-4 y 10-5, multiplicar por 100.

37

3.2.6. Recuento de presuntos Bacillus cereus (Metodo ICMSF).


1. Los señalados anteriormente en la práctica, para la preparación y dilución de

los homogenizados de alimentos.

2. Placas petri de vidrio (100 x 15 mm) o plástico (90 x 15 mm).

3. Pipetas, 1, 5 y 10 ml, graduada en unidades de 0,1 ml

4. Difusor de varillas de vidrio (por ejemplo, palo de hockey) 3-4 mm de diámetro

con un área mm 45-55 difusión

5. Incubadoras, 30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C

6. Cuenta Colonia

7. Mechero Bunsen

8. Asas de alambre, N º 24 de nicrom o alambre de platino, 2 mm y 3 mm de

diámetro

9. Vortex mezclador

10. Microscopio, portaobjetos y cubreobjetos

11. Tubos de cultivo, 13 x 100 mm, estéril

12. Tubos de ensayo, 16 mm x 125, o la placa de punto

13. Botellas, 3 onzas, estéril

14. Recipiente de anaerobios, BBL GasPak, con H 2 + CO 2 sobres generador y

catalizador

15. Baño de agua, 48 a 50 ° C

16. Bastidores tubo de cultivo

17. Baño de agua o estufa de aire forzado para mantener el agar fundido, 44-

46 C.

18. Estufa de incubación, 35-37 C.

19. Agar yema de huevo polimixina rojo fenol (MYP), agar yema de huevo sal

polimixina cloruro de trifeniltetrazolio o agar sangre de caballo, para placas.

38

3.2.6.2. Técnicas1. Preparar las muestras de alimento por el método propuesto en la presente

guía para la preparación de los homogeneizados de alimentos. Preparar las

diluciones de 10 -1 a 10-4, o más altas si fuera preciso.

2. Sembrar uniformemente por estría 0,1 ml de cada una de las diluciones

decimales en la superficie seca de placas de agar yema de huevo polimixina

rojo fenol (MYP), agar yema de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio

o de agar sangre de caballo (previamente secados), utilizando dos placas para

cada dilución.

3. Si se observase el crecimiento de microorganismos del género Proteus, con su

característico crecimiento extendido por la placa, o se sospechase su

existencia en el alimento en estudio, inhibir su difusión añadiendo sobre la

superficie de cada placa de medio 1 ml de alcohol etílico del 96 % y dejar que

se evapore dentro de la estufa, o bien aumentar la concentración de cloruro

sódico en los medios hasta aproximadamente el 1,5 %.

4. Incubar las placas de agar yema de huevo polimixina rojo fenol o de agar yema

de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio durante 24 horas, y la placa

de agar sangre de caballo durante 24-48 horas. Frecuentemente, los

microorganismos contaminantes enmascaran las colonias de B.cereus

después de las 24 horas de cultivo en estos medios (Kim y Goepfert, 1971

a,b).

5. Dar como recuento de presunto B. cereus las colonias con las reacciones

caracteríticas siguientes : (a) en agar yema de huevo polimixina rojo fenol

amplias zonas de precipitado sobre un fondo rojo-violeta, (b) en agar yema de

huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio colonias de color rojo-púrpura

brillante, con una amplia zona de precipitado, (c) en agar sangre de caballo

hemólisis alfa o beta.

6. Prepare diluciones seriadas de 10 -2 a 10 -6 mediante la transferencia de 10 ml

de muestra homogeneizada (dilución 1:10) a 90 ml de dilución en blanco,

mezclando bien con agitación vigorosa, y continuando hasta 10 -6 dilución se

39

alcanza. Inocular las placas duplicadas PAI agar con cada dilución de la

muestra (incluyendo 1:10) mediante la difusión de 0,1 ml de manera uniforme

sobre la superficie de cada plato con una varilla de vidrio estéril difusión.

Incubar las placas 24 horas a 30 ° C y observar las colonias de la zona

rodeada por precipitado, lo que indica que se produce lecitinasa. B. cereusColonias son normalmente de color rosa que se vuelve más intenso después

de una incubación adicional.

Si las reacciones no son claras, las placas se incuban durante 24 h adicionales

antes del recuento de colonias. Seleccionar las placas que contienen un

estimado de 15 a 150 eosina rosa, lecitinasa productores de las colonias.

Parte inferior de las placas de la marca en zonas con rotulador negro para

facilitar el conteo y recuento de colonias que son típicos de B. Cereus. Este

es el recuento en placa de presunción de B. Cereus. Pick 5 o más colonias

presuntamente positivo de las placas de agar del PAI y la transferencia de

inclinaciones de agar nutritivo para su confirmación como B. Cereus.Confirmar los aislamientos como B. cereus como se describe en F y G, a

continuación. Calcular el número de B. Cereus células / g de la muestra,

basada en el porcentaje de las colonias de prueba que se confirman como B.Cereus. Por ejemplo, si el recuento de media obtenida con 10 -4 dilución de la

muestra fue de 65 y 4 de 5 colonias de prueba fueron confirmados como B.Cereus, el número de B. Cereus células / g de alimento es de 65 x 5.4 x

10.000 x 10 = 5.200.000. (NOTA: El factor de dilución es diez veces mayor

que la dilución de la muestra, ya que sólo 0,1 ml fue probado).

3.2.6.3. Confirmación de B. cereus

Además de B. cereus, otras especies dan reacciones positivas o débilmente

positivas en medios con yema de huevo (Gordon y col., 1973). Tanto el ácido

formado a partir del manitolcomo las enzimas reductores del cloruro de

trifeniltetrazolio pueden difundir en el medio hasta colonias negativas.

Finalmente, la actividad hemolítica no es exclusiva de B. cereus. Por estas

40

razones, deben someterse a confirmación colonias representativas

procedentes de estos medios.

Sin embargo, en las pruebas de rutina son suficientes frecuentemente los

recuentos, en particular si las reacciones típicas aparecen bien marcadas. Si

estás no fuesen completamente típicas, llevar a cabo pruebas confirmatorias.

Por ejemplo, confirmar las colonias que son yema de huevo y manitol positivas,

e inversamente aquéllas que son yema de huevo y manitol negativas.

Siguiendo el esquema de identificación de Gordon y col. (1973), confirmar

todas las colonias que producen hemólisis alfa en agar sangre.

41

3.2.7. AISLAMIENTO DE SALMONELAS (Metodo ICMSF).Los métodos para el aislamiento e identificación de salmonelas a partir de losalimentos pueden considerarse divididos en seis etapas sucesivas:

1. Enriquecimiento no selectivo.2. Enriquecimiento selectivo.3. Siembra en placa de medios sólidos selectivos y diferenciales.4. Estudio de las características bioquímicas de las colonias sospechosas, en los

medios adecuados.5. Análisis antigénico, en dos fases: (a) empleo del antisuero polivalente O y del

antisuero polivalente H, y (b) utilización de los antisueros específicos de grupoO y H.

6. Tipificación por medio de bacteriófagos.

Los pasos 1 al 3 se refieren al aislamiento y los 4 al 6 a la identificación. El paso 1tiene como fin la revitalización de las salmonelas dañadas por las diferentescondiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento. El paso 2 es deenriquecimiento selectivo y sirve para favorecer el crecimiento de las salmonelasen un ambiente que puede contener gran número de bacterias diferentes de ellasmismas. El paso 3 permite la «visualización» de las colonias sospechosas, por suaspecto característico. El paso 4 se refiere a la identificación bioquímica. El paso 5conduce, por medio de pruebas serológicas, la identificación definitiva de lascepas sospechosas como miembros del género Salmonella. El paso 6 logra aúnmás exacta identificación de los gérmenes aislados, identificación que es departicular interés para propósitos epidemiológicos, ya que los tipos serológicos deun grupo fágico común suelen tener el mismo origen y, a la inversa, las cepas quepresentan igual estructura antigénica, pero diferente grupo fágico, sonprobablemente de diferente origen.Antes, el enriquecimiento no selectivo se utilizaba solamente cuando se creía queun tratamiento como el calentamiento, la deshidratación, la irradiación o lacongelación, o ciertas condiciones como el bajo pH, habían lesionado lassalmonelas en los alimentos. Recientemente, Edel y Kampelmacher (1973) yGabis y Silliker (1974a) han señalado que incluso en muestras de alimentos talescomo carnes crudas y huevo líquido, el preenriquecimiento de la muestra en un

42

medio no selectivo da como resultado el que se aíslen más salmonelas que en elcaso de siembra directa en un medio de enriquecimiento selectivo. Actualmente,basándose en estos descubrimientos, la Comisión recomienda que todas lasmuestras sean preenriquecidas en un medio no selectivo antes de pasarlas auno de enriquecimiento selectivo.El enriquecimiento no selectivo se ha realizado tradicionalmente por cultivo de lasmuestras en caldo lactosado. Esta práctica fue iniciada por North (1961) en elanálisis de la clara de huevo desecada. Con posterioridad, diversos investigadoreshan estudiado modificaciones en la composición del medio de preenriquecimientoy han llegado a la conclusión de que su composición no es tan crítica como sesuponía. Así, por ejemplo, los investigadores europeos han utilizado normalmenteagua de peptona tamponada en vez de caldo lactosado (Edel y Kampelmacher,1968). En algunos alimentos, como la levadura desecada, la composición de lamuestra sólo requiere su reconstitución en agua destilada. En el caso de la lecheen polvo descremada, la muestra se reconstituye en agua destilada

conteniendo el colorante verde brillante. Los caramelos y bombones sereconstituyen en leche descremada con verde brillante. Con alimentos ricos engrasas, tales como los subproductos grasos de origen animal, la inclusión deTergitol 7 facilita la dispersión de la grasa en el medio no selectivo. Engeneral, el caldo lactosado y el agua de peptona tamponada son intercambiables.La Tabla 8 presenta un resumen parcial de los medios utilizados para elpreenriquecimiento.Un caldo de enriquecimiento selectivo estimula la multiplicación de las salmonelasy reduce o inhibe el crecimiento de los organismos competitivos, tales como loscoliformes, Proteus y Pseudomonas, cuyo crecimiento superaría al de lassalmonelas, en particular si estos organismos competidores están presentes en elalimento en un número mucho mayor que las salmonelas. El uso de más de uncaldo selectivo, así como la temperatura de incubación, pueden afectar de formaimportante el porcentaje de recuperación de Salmonella. Datos de Edel yKampelmacher (1968) señalaron que fue posible recuperar un mayor número deSalmonella a partir de muestras de carne cuando los caldos selectivos seincubaban a 43°C que cuando se incubaban a 37°C, sobre todo en muestras que

43

contenían un alto nivel de organismos competidores. Estos resultados han sidoconfirmados por Silliker y Gabis (1974).

Tabla 02.Métodos de enriquecimiento previo para Salmonellas.

Producto Caldo de preenriquecimiento

Huevos completos desecados, yemas de

huevo desecadas, claras de huevo

desecadas, huevos líquidos

pasterizados y congelados, mezclas

preparadas en polvo, galletas, fórmulas

para niños, huevos crudos, carnes

crudas, pasta conteniendo huevo, tintes

y sustancias colorantes.

Caldo lactosa o agua de peptona

tamponada (medios 51 y 22,

respectivamente).

Levadura desecada (inactiva). Agua destilada.

Leche en polvo descremada y leche en

polvo entera.

Agua destilada con 2 ml de solución al

1% de verde brillante por litro3

(Reactivo 5).

Caramelos y bombones. Leche en polvo reconstituida con verde

brillante (Medio 95).

Subproductos grasos animales fundidos,

coco.

Caldo lactosa con 1% de Tergitol

(Medio 52)

o agua de peptona tamponada con

0,22% de Tergitol (Medio 23).

a Pesar asépticamente 100 gramos de la muestra en un matraz de 2 litros estéril (o en un frasco de tapón de roscacon boca ancha de una capacidad similar). Añadir 1 litro de agua destilada estéril y mezclar bien. Determinar el pHmediante papel reactivo (si el pH es < 6,6, ajustar a 6,8 ± 0,2 con NaOH 1N). Añadir solución de verde brillante ymezclar bien. Incubar como se indica en el texto.

44

Debido a que es necesario restringir el número de variables de selección, la

Comisión recomienda el uso de caldo selenito-cistina y de caldo tetrationato verde

brillante, ambos incubados a 43°C.

Los agares selectivos generalmente contienen sustancias inhibidoras que hacen

que los medios sean selectivos, y un sistema indicador que colorea las colonias o

el medio que las rodea, lo que hace al medio diferencial, es decir, capaz de

diferenciar caracteres bioquímicos de las colonias que crecen en él. Los

laboratorios tienen, a veces, preferencias por determinados medios diferenciales;

pruebas realizadas en colaboración muestran que cada laboratorio obtiene los

mejores resultados con aquellos medios con los que está más familiarizado.

Respetando este hecho, la Comisión recomienda que cada laboratorio utilice un

medio diferencial de su elección, pero que adicionalmente utilice agar sulfilo de

bismuto y agar verde brillante. Entre otros medios que pueden utilizarse, están el

agar verde brillante sulfadiazina, el agar verde brillante de MacConkey, el agar

desoxicolato citrato, el agar Salmonella-Shigella y aun otros medios selectivos y

diferenciales a gusto del propio laboratorio.

El valor de los resultados, como en cualquier procedimiento analítico, dependerá

de la adecuada elección de la muestra en representación del lote y de la cantidad

de alimento muestreado. La National

Academy of Sciences-National Research Council de los EE UU (1969) han

recomendado planes de muestreo para la detección de Salmonella en alimentos

basados en el grado de riesgo que presenta un

determinado alimento. Estos mismos planes, ligeramente modificados, han sido

recomendados por la ICMSF (1974).

Investigaciones patrocinadas por la ICMSF y otros organismos han mostrado que

no es necesario analizar cada una de las muchas muestras o unidades analíticas

obtenidas de un determinado lote de alimentos (Silliker y Gabis, 1973). Estas múl-

tiples unidades analíticas pueden ser combinadas o «mezcladas», a fin de obtener

unidades mayores para realizar las pruebas. Por ejemplo, 60 unidades de 25 g se-

45

leccionadas de un lote de producto concreto pueden ser combinadas o

«mezcladas» para obtener tres muestras de 500 g para el análisis. Si se encuentra

que estas tres muestras de 500 g dan resultados negativos, se deduce que el nivel

de Salmonella no es mayor de 1 en 500 g. De modo similar, las muestras que

presenten un menor grado de riesgo para el consumidor, como son las que

requieren el análisis de 30 muestras de 25 g, pueden ser «mezcladas» para el

análisis en un menor número de unidades. Para muestras de 25 g, podrán ser

analizadas dos mezclas de muestras, cada una de 375 g. Si las dos fueran

negativas, habría una probabilidad del 95% de que el nivel de contaminación en el

lote analizado no fuera mayor de una Salmonella en 250 g, lo que es la misma

probabilidad que existiría si cada una de las 30 muestras de 25 g hubiera sido

analizada y encontrada negativa. Es evidente la importancia práctica de este

procedimiento por «mezcla» que permite un control de calidad estadístico del

riesgo o defecto de presencia de Salmonella con unos costos de análisis que son

económicamente posibles.

AISLAMIENTO DE SALMONELAS (Metodo ICMSF).

Esta parte incluye tres etapas fundamentales: (i) enriquecimiento no selectivo, (ii)

enriquecimiento selectivo, (iii) siembra en placa en medios de agar selectivo.


1. Homogeneizador mecánico que trabaje a 8.000 r.p.m. como mínimo y a

45.000 r.p.m. como máximo.

2. Vasos para el homogeneizador, de 1 litro de capacidad, con tapas,

resistentes a la temperatura de pasterización, un recipiente por cada muestra

de alimento a analizar.

3. Balanza con pesas, de al menos 2.500 g de capacidad y de 0,1 g de

sensibilidad.

46

4. Instrumentos para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas,

tenedores, tijeras, cucharas, espátulas, todos ellos previamente esterilizados

o pasterizados.

5. Estufa a 35-37°C.

6. Baño con agua circulante, a 43 ± 0,05°C.

7. Recipientes con tapa, resistentes a la temperatura de pasterización, o esterili-

zación, con capacidad suficiente para contener el volumen del medio de enri-

quecimiento que se utilice, incluyendo la muestra.

8. Pipetas bacteriológicas de 1 ml.

9. Aguja y asa de inoculación con alambre de nicrom o de platino-iridio.

10. Placas de Petri de vidrio de 100 x 15 mm, u otras equivalentes.

11. Caldo lactosado, sin distribuir.

12. Agua de peptona tamponada.

13. Leche descremada en polvo, con verde brillante, reconstituido.

14. Caldo lactosado con 1% de Tergitol 7.

15. Caldo selenito cistina, sin distribuir y en tubos con 10 ml.

16. Caldo tetrationato verde brillante, modificación de Kauffmann, sin distribuir y

en tubos con 10 ml, según se precise.

17. Agar verde brillante, para placas.

18. Agar bismuto sulfito, para placas.

19. Medio «elegido por el propio laboratorio», para placas.

20. Agua de peptona tamponada con 0,22% de Tergitol.

21. Agar triple azúcar hierro (TSI) inclinado.

22. Agar lisina hierro inclinado (LIA).

3.2.7.2. Enriquecimiento previo de Salmonelas

1. Mézclese la muestra con 9 volúmenes del medio de enriquecimiento escogido

de la Tabla 8, en proporción peso/volumen. Si la muestra no es soluble en el

medio de enriquecimiento o si no se produce su rápida dispersión, mézclese

47

la muestra con volumen apropiado de medio y añádase la muestra mezclada

al volumen total del medio de enriquecimiento.1

2. Incúbese el medio de enriquecimiento previo durante 18-24 horas a 35-37°C.

3.2.7.3. Enriquecimiento selectivo de Salmonelas

1. Pipetear 1 ml del cultivo de preenriquecimiento en 10 ml de caldo selenito

cistina. Incúbese en un baño de agua a 43 ± 0,05°C durante 24 horas.

2. Pasar 1 ml del cultivo de preenriquecimiento a 10 ml de caldo tetrationato

verde brillante. Incúbese a 43 ± 0,05°C durante 24 horas.

1 Esterilícese el medio de preenriquecimiento en el autoclave; en el caso de que esto sea difícil, debido a que el

volumen de líquido sea demasiado grande, pasteurícese en su propio recipiente. Simplemente es necesariodestruir todas las bacterias no esporuladas, lo que ocurre a, o por encima de, 80°C. Diversos tipos de recipientesde plástico, de bajo precio, pueden resistir este calentamiento. Utilícese el medio pasterizado el mismo día de supreparación. Enfríese o témplese el medio de preenriquecimiento a 35-37°C, antes de proceder a inocularlo. Si lamuestra contiene una alta concentración de azúcar o de sal, u otra sustancia inhibidora, ajústese cuidadosamenteel volumen del medio de preenriquecimiento para promover el crecimiento de las salmonelas. De manera similar,si el pH de la muestra es tan alto o tan bajo que pueda perjudicar el crecimiento de las salmonelas en el medio depreenriquecimiento, ajústese el pH del medio por adición de una solución al 1% de ácido sulfúrico o de hidróxidopotásico. El pH del medio inoculado debería ser de 6,6 a 7,0 antes de proceder a la incubación.

48

3.2.7.4. Siembra en placa en medios de agar selectivo para Salmonelas

1. Pasar un asa de 5 mm de cada uno de los dos medios de enriquecimientoselectivo a la superficie de una placa de cada uno de los tres medios de agarselectivo señalados a continuación y extender de tal manera que se obtengancolonias aisladas.

2. Incubar las placas de agar verde brillante durante 24 horas a 35-37°C. Lascolonias típicas de Salmonella son incoloras, rosa o fucsia o traslúcidas aopacas, con el medio que las rodea de color rosa a rojo.

3. Incubar las placas de agar sulfito de bismuto a 35-37°C durante 48 horas. Lascolonias típicas de Salmonella en agar sulfito de bismuto aparecen marroneso grises a negro, a veces con un brillo metálico. El medio que rodea lascolonias es, generalmente, marrón al principio, cambiando a negro segúntranscurre el tiempo de incubación. Algunas cepas producen colonias verdes,con el medio que las rodea muy poco o nada oscurecido.

4. Incubar e interpretar las «placas del medio elegido por el laboratorio» segúnlas indicaciones del fabricante.

3.2.7.5. Identificación de Salmonelas

En esta sección se incluyen las tres etapas seguidas en la identificación de culti-vos sospechosos de pertenecer al género Salmonella: (1) comprobación de las co-lonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas determinativas, (2) identifica-ción serológica de las cepas sospeehosas mediante el uso del antisueropolivalente O, del antisuero polivalente H, de los antisueros O específicos de grupoy de los antisueros H de Spicer-Edwards, (3) tipificación por bacteriófagos.

La identificación de una cepa como miembro del género Salmonella está dentrode la capacidad de cualquier laboratorio que posea los medios y antisueros de quese dispone en el comercio. Los laboratorios que realicen la detección rutinaria desalmonelas en alimentos, deben utilizar pruebas bioquímicas para explorar las ce-pas sospechosas y posteriormente someter dichas cepas a pruebas serológicaspara determinar si son efectivamente salmonelas. La identificación definitiva de las

49

salmonelas, como pertenecientes a un determinado serotipo, requiere el envío delas cepas a un centro especializado en tipificación.

3.2.7.6. Exploración bioquímica para la identificación de Salmonellas

3.2.7.6.1. Material y Aparatos1. Asa de inoculación, preferiblemente de alambre de platino-iridio o de nicrom.

2. Baño de agua termorregulado a 35-37°C.

3. Colonias sospechosas de ser salmonelas en placas de agar verde brillante,

agar sulfito de bismuto o el agar «escogido por el propio laboratorio».

4. Agar lisina hierro inclinado en tubos con columnas de agar de 25-30 mm.

5. Agar triple azúcar hierro, inclinado en tubos con columnas de agar de 25-30

mm.

3.2.7.6.2. Métodos

1. Tomar con una aguja de inoculación estéril dos o más colonias de cada tipo

sospechoso, del agar verde brillante, del agar sulfito de bismuto y del medio

«elegido por el propio laboratorio» y pasar a tubos de agar triple azúcar hierro

y de agar lisina hierro, inclinados. Inocular los medios mediante siembra en

estría atrás y adelante en la superficie inclinada y, a continuación, por

picadura en la columna de agar. Inocular primero un medio y, sin flamear la

aguja, inocular el segundo medio de la misma manera.

2. Incubar los tubos de ambos medios durante 24 horas a 35-37°C. Los cultivos

sospechosos de ser Salmonella muestran en agar triple azúcar hierro las

partes inclinadas alcalinas (color rojo) y las columnas de medio acidas (color

amarillo), con o sin producción de SH2 que da lugar al ennegrecimiento del

agar. Los cultivos sospechosos de ser salmonelas presentan en agar lisina

hierro una reacción alcalina (color púrpura) en todo el medio, con o sin

producción de SH2 (ennegrecimiento). La reacción «sospechosa» en agar

triple azúcar hierro indica que el organismo fermenta la glucosa (columna

amarilla) pero que no fermenta la lactosa ni la sacarosa (parte inclinada roja),

50

reacciones típicas de las salmonelas. Sin embargo, algunas salmonelas

pueden fermentar la sacarosa o la lactosa y producir acidez (color amarillo)

tanto en la parte inclinada como en la columna de medio.

Por contraste, la reacción «sospechosa» en agar lisina hierro es resultado

de la descarboxilación de la lisina, produciéndose una reacción alcalina

(púrpura) en la columna de medio. Los organismos que no son capaces de

descarboxilar la lisina, pero que fermentan la glucosa, producirán una

reacción acida (amarilla) en la columna de medio. Los microorganismos que

ni fermentan la glucosa ni descarboxilan la lisina, darán lugar a una parte

inclinada y a una columna alcalina (púrpura). Los organismos que presentan

esta reacción son, generalmente, aerobios estrictos del género

Pseudomonas. Estas cepas pueden no presentar crecimiento en la columna

de medio en razón de su metabolismo aeróbico. Tales cepas pueden ser

«exploradas» más ampliamente por medio de la prueba de la oxidasa. Las

salmonelas fermentadoras de la lactosa y de la sacarosa darán reacciones

típicas «sospechosas» en agar lisina hierro, ya que este medio no contiene ni

lactosa ni sacarosa. Los organismos del género Arizona pueden dar en agar

triple azúcar hierro reacciones sospechosas de ser salmonelas, debido a una

fermentación tardía de la lactosa. Estos organismos pueden dar reacciones

sospechosas de ser salmonelas en agar lisina hierro ya que descarboxilan la

lisina y fermentan la glucosa. La mayor importancia es el que ambos géneros,

Arizona y Salmonela, fermentadores de la lactosa y/o de la sacarosa pueden

dar reacciones típicas de Salmonella en agar lisina hierro, incluso aunque las

mismas cepas puedan no presentar aspecto de Salmonella en los cultivos de

agar triple azúcar hierro inclinado. Del mismo modo, determinadas cepas de

Salmonella pueden no descarboxilar la lisina y, debido a esto, mostrar la

columna de medio acida y la parte inclinada alcalina, en agar lisina hierro.

Estos organismos presentan reacciones típicas de Salmonella en agar triple

azúcar hierro.

51

3.2.7.7. Pruebas serológicas para la identificación de Salmonellas (P. R.Edwards y Ewing, 1972; AOAC, 1967)

3.2.7.7.1. Material y Aparatos

1. Portaobjetos de vidrio de 5 x 7,5 cm o placas de Petri de 100 x 15 mm.

2. Agujas y asas de inoculación, preferiblemente de alambre de platino-iridio o

de nicrom.

3. Pipetas de 0,2 ml de capacidad, con divisiones de 0,01 ml; de 1,0 ml de

capacidad con divisiones de 0,01 ml; y de 5 ml y 10 ml con divisiones de 0,1

ml.

4. Tubos de ensayo para reacciones serológicas de 75 x 10 mm o de 100 x 13

mm.

5. Baño de agua termorregulado a 50 ± 1°C.

6. Cultivos de las presuntas salmonelas o Atizona en tubos de agar triple

azúcar hierro y de agar lisina hierro inclinados.

7. Caldo H en tubos de 100 x 13 mm con 5 ml de volumen.

8. Cloruro sódico en solución acuosa al 0,85%.

9. Solución salina formulada al 0,6% (Solución salina al 0,85% conteniendo 0,6

ml de formalina por cada 100 ml).

10. Antisueros Salmonella:

(a) Antisuero Salmonella polivalente O (somático) que contenga por los

menos aglutininas para los siguientes antígenos O: 1-16,19, 22, 23, 24,

25 y Vi.

(b) Antisueros Salmonella individuales O (somáticos) para, al menos, cada

uno de los grupos: A, B, C1, C2, D, E (E1, E2, E3, E4), F, G, H, I y Vi.

(c) Antisuero Salmonella polivalente H (flagelar) que contenga, por lo

menos, aglutininas para los siguientes antígenos H: a, b, c, d, eh, en,

enx, fg, fgt, gm, gmq, gms, gp, gpu, gq, gst, gt, i, k, lv, lw, lz13, lz28, mt, r,

y, z, z4 z23, z4 z24, z4 z32, z6, z10, z29,1, 2 ; 1, 5; 1, 6; y 1, 7.

(d) Antisueros Salmonella H (flagelares) de Spicer-Edwards consistentes en

7 antisueros mezclados que reaccionan del siguiente modo:

52

(i) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 1, que reacciona con los

antígenos a, b, e, d, eh, fg, fgt, gm, gms, gmt, gp, gpu, gq, gst, ms, mt, i.

(ii) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 2, que reacciona con los

antígenos: a, b, c, k, r, y, Z29.(iii) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 3, que reacciona con los

antígenos: a, d, eh, k, z, z4 z23, z4 z24, z4 z32, z29.

(iv) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 4, que reacciona con los

antígenos b, d, fg, fgt, gm, gms, gmt, gp, gpu, gq, gst, ms, mt, k, r, z, z10.

(v) Antisuero Salmonella H «complejo e, n», que reacciona con los antí-

genos enx y enz15.

(vi) Antisuero Salmonella H «complejo L» que reacciona con los antígenos

lv, lw, lz13, lz28.

(vii) Antisuero Salmonella H «complejo 1», que reacciona con los antígenos

1,2; 1,5; 1,6; 1,7;z6.

3.2.7.7.2. Técnica para la reacción con el antisuero polivalente O (somático),en placa o en porta

1. Diluir y ensayar primeramente los antisueros con cultivos testigo conocidos

para garantizar la eficacia de la prueba cuando se realice con los cultivos

problema.

2. Marcar con un lápiz de cera dos secciones de alrededor de 1 x 2 cm sobre la

cara interna de una placa de Petri de vidrio o sobre un portaobjetos de 5 x 7,5

cm..

3. Depositar una pequeña cantidad (un asa) de un cultivo en agar nutritivo o en

agar triple azúcar hierro inclinado de 24-48 horas, directamente sobre una

placa o portaobjetos en la parte superior de cada zona marcada.

4. Depositar una gota de una solución de NaCl al 0,85% en la parte inferior de

cada sección marcada. Emulsionar el cultivo en la solución salina con un asa

53

o aguja de inoculación limpia y estéril en una sección y repetir lo mismo en la

otra sección.

5. Añadir-una gota de antisuero Salmonella polivalente O a una de las

secciones de cultivo emulsionado y mezclar con un asa o aguja estéril.

6. Balancear atrás y adelante un minuto las mezclas de ambas secciones y

observar a continuación sobre fondo oscuro. En caso de reacción positiva, se

produce una aglutinación rápida e intensa.

7. Clasificar la reacción del siguiente modo:

(a) Positiva, cuando hay aglutinación en la mezcla cultivo-solución salina-suero

y no en la mezcla cultivo-solución salina.

(b) Negativa, cuando no hay aglutinación en la mezcla cultivo-solución salina-

suero.2 Estos cultivos deberán ensayarse también frente al antisuero

polivalente H (flagelar) (III, a continuación).

(c) No específica, cuando ambas mezclas presentan aglutinación. Este resulta-

do requiere nuevos ensayos, tal como se describe en la obra Identificationof Enterobacteriaceae de P. R. Edwards y Ewing (1972).

2 Los antisueros polivalentes O no contiene aglutininas para los antígenos de

algunas Salmonelas. Debido a esto, se dan reacciones negativas con

determinadas cepas como S. cerro grupo K (18); S. Minnesota grupo L (21);

S. alachua, grupo O (35).

3.2.7.7.3. Técnica para la reacción con el antisuero polivalente (flagelar)

1. Diluir y ensayar primeramente los antisueros con cultivos conocidos testigo

para comprobar la eficacia de los resultados obtenidos con los cultivos

problema.

54

2. Añadir 5 ml de solución salina formolada al 0,6% a 5 ml de un cultivo en caldo

H de 24 horas del organismo en estudio. Aguardar una hora antes de su

utilización. Este caldo formolado puede ser almacenado a 5-8°C durante

algunos días, en el caso de que sea necesario.

3. Depositar en un pequeño tubo serológico (de 75 x 10 mm o de 100 x 13 mm)

0,02 ml del antisuero Salmonella polivalente flagelar adecuadamente diluido

y añadir 1 ml del caldo de cultivo formolado (antígeno), del apartado 2.

4. Preparar un control sustituyendo el antisuero por solución salina formolada,

colocando 0,02 ml de solución salina formolada en un tubo serológico del

mismo tamaño que los utilizados en la prueba anterior (apartado 3) y

añadiendo 1 ml del cultivo en caldo formolizado del apartado 2.

5. Incubar la mezcla antígeno-suero (punto 3 anterior) y la correspondiente mez-

cla antígeno-solución salina (punto 4 anterior) a 50°C durante una hora en un

baño de agua. Observar los resultados preliminares a intervalos de 15

minutos y leer los resultados finales transcurrida la hora de incubación.

6. Clasificar la reacción del siguiente modo:

(a) Positiva, cuando hay aglutinación de la mezcla cultivo-solución salina

formolizada-suero (apartado 3) y no hay aglutinación en la mezcla cultivo-

solución salina formolizada (apartado 4).

(b) Negativa, cuando no hay aglutinación en la mezcla cultivo-solución salina

formolizada-suero.3

(c) No específica, cuando ambas mezclas aglutinan. Este resultado requiere

pruebas adicionales como las descritas en la obra Identification ofEnterobacteriaceae de P. R. Edwards y Ewing (1972).

7. Los cultivos que son inmóviles o los que dan resultado negativo cuando se

ensayan de nuevo con el antisuero Salmonella polivalente H (flagelar) se

clasifican según los resultados de otras pruebas como se describe en la obra

Identification of Enterobacteriaceae de Edwards y Ewing (1972).3 El antisuero polivalente H no contiene aglutininas para los antígenos de algunas salmonelas. Además pueden

esperarse resultados negativos con ciertas cepas como S. simsbury, Z27; S. Wichita ,Z37; S. Chittagong, Z35 .

55

3.2.7.7.4. Técnica para la reacción con cada uno de los antisueros o de grupoEsta prueba se lleva a cabo para determinar el grupo O (somático) al que

pertenece el cultivo en estudio.

1. Diluir y ensayar previamente los antisueros con cultivos testigo conocidos,

para garantizar los resultados con los cultivos problema.

2. Llevar a cabo con los cultivos la reacción O de grupo como en el apartado II,

pasos 2 a 6, utilizando todos y cada uno de los antisueros O de grupo

(incluso el Vi), en vez del antisuero Salmonella polivalente O.

3. Los cultivos que dan resultados positivos con el suero Vi se suspenden en 1

ml de solución salina fisiológica para formar una suspensión densa, a

continuación se calientan en un baño de agua hirviendo durante 20 a 30

minutos y se dejan enfriar. Volver a ensayar la suspensión tratada por el calor

utilizando los antisueros O de grupo: D, C1, y Vi. Los cultivos Vi positivos que

reaccionan con el suero somático del grupo D pertenecen probablemente a

Salmonella typhi y los que lo hacen con el suero somático del grupo C, a

Salmonella paratyphi C. Los cultivos Vi positivos tratados por el calor que no

dan reacción positiva con ninguno de los sueros somáticos de grupo, pero

que continúan reaccionando con el suero Vi, pertenecen probablemente al

grupo Citrobacter y no son salmonelas.

4. Anótese como pertenecientes a este grupo los cultivos que den reacción

positiva con alguno de los sueros O de grupo. Los cultivos que no reaccionan

con ninguno de los antisueros O de grupo se anotan como negativos. (14)

56

IV. RESULTADOS

De acuerdo al cronograma del proyecto de investigación, durante todo este periodose realizaron los Análisis Microbiológicos

Mes de Enero:Resultado de Carrito Nº 01 Resultado de Carrito Nº 02 Resultado

PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIOAerobiosmesófilos

10 UFC/g Aerobiosmesófilos

10 UFC/g 10 UFC/g

Rcto. demohos

<10 UFC/g Rcto. demohos

<10 UFC/g < 10 UFC/g

Rcto. delevaduras

10 UFC/g Rcto. delevaduras

10 UFC/g 10 UFC/g

Bacilluscereus

<100 UFC/g Bacilluscereus

<100 UFC/g <100 UFC/g

Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25gColiformes < 10 UFC /g Coliformes 4 NMP/g 7 NMP/g

Mes de Febrero:Resultado de Carrito Nº 03 Resultado de Carrito Nº 04 Resultado



10 UFC/g 10 UFC/g

Rcto. demohos


<10 UFC/g < 10 UFC/g

Rcto. delevaduras


10 UFC/g 10 UFC/g

Bacilluscereus


<100 UFC/g <100 UFC/g

Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25gColiformes 4 NMP/g Coliformes 4 NMP/g 4 NMP/g

57

Mes de Marzo:Resultado de Carrito Nº 05 Resultado de Carrito Nº 06 Resultado

PromedioENSAYO RESULTADO ENSAYO RESULTADO PROMEDIO

Aerobios

mesófilos

87 x 10

UFC/g

Aerobios

mesófilos

99 x 10

UFC/g

93 x 10 UFC/g

Rcto. de

mohos

40 UFC/g Rcto. de

mohos

30 UFC/g 35 UFC/g

Rcto. de

levaduras

10 UFC/g Rcto. de

levaduras

10 UFC/g 10 UFC/g

Bacillus

cereus

<100 UFC/g Bacillus

cereus

<100 UFC/g <100 UFC/g

Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25g

Coliformes <3 NMP/g Coliformes <3 NMP/g <3 NMP/g

Mes de Abril:Resultado de Carrito Nº 07 Resultado de Carrito Nº 08 Resultado


Aerobios

mesófilos

20 UFC/g Aerobios

mesófilos

20 UFC/g 20 UFC/g

Rcto. de

mohos

<10 UFC/g Rcto. de

mohos

<10 UFC/g <10 UFC/g

Rcto. de

levaduras

30 UFC/g Rcto. de

levaduras

30 UFC/g 30 UFC/g

Bacillus

cereus

<100 UFC/g Bacillus

cereus

<100 UFC/g <100 UFC/g


Coliformes 3 NMP/g Coliformes 3 NMP/g 3 NMP/g

58

Mes de Mayo:Resultado de Carrito Nº 09 Resultado de Carrito Nº 10 Resultado


40 x 10UFC/g

Aerobiosmesófilos

40 x 10UFC/g

40 x 10UFC/g

Rcto. demohos

20 UFC/g Rcto. demohos

20 UFC/g 20 UFC/g

Rcto. delevaduras


30 UFC/g 30 UFC/g

Bacilluscereus


<100 UFC/g <100 UFC/g

Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25gColiformes 7 NMP/g Coliformes 7 NMP/g 7 NMP/g

Mes de Junio:Resultado de Carrito Nº 11 Resultado de Carrito Nº 12 Resultado



90 UFC/g 75 UFC/g

Rcto. demohos


<10 UFC/g <10 UFC/g

Rcto. delevaduras

<10 UFC/g Rcto. delevaduras

<10 UFC/g <10 UFC/g

Bacilluscereus


<100 UFC/g <100 UFC/g

Salmonella Ausencia/25g Salmonella Ausencia/25g Ausencia/25gColiformes <3 NMP/g Coliformes <3 NMP/g <3 NMP/g

59

Mes de Julio:Resultado de Carrito Nº 013 Resultado de Carrito Nº 14 Resultado


Aerobios

mesófilos

50 UFC/g Aerobios

mesófilos

38 x 10

UFC/g

20 x 10UFC/g

Rcto. de

mohos

10 UFC/g Rcto. de

mohos

30 UFC/g 20 UFC/g

Rcto. de

levaduras

30 UFC/g Rcto. de

levaduras

10 UFC/g 20 UFC/g

Bacillus

cereus

<100 UFC/g Bacillus

cereus

<100 UFC/g <100 UFC/g



Mes de Agosto:Resultado de Carrito Nº 015 Resultado de Carrito Nº 16 Resultado


Aerobios

mesófilos

40 x 10

UFC/g

Aerobios

mesófilos

25 x 10

UFC/g

33 x 10 UFC/g

Rcto. de

mohos

20 UFC/g Rcto. de

mohos

30 UFC/g 25 UFC/g

Rcto. de

levaduras

20 UFC/g Rcto. de

levaduras

40 UFC/g 30 UFC/g

Bacillus

cereus

<100 UFC/g Bacillus

cereus

<100 UFC/g <100 UFC/g



60

Mes de Setiembre:Resultado de Carrito Nº 17 Resultado de Carrito Nº 18 Resultado


Aerobios

mesófilos

50 UFC/g Aerobios

mesófilos

38 x 10

UFC/g

22 x 10UFC/g

Rcto. de

mohos

10 UFC/g Rcto. de

mohos

30 UFC/g 20 UFC/g

Rcto. de

levaduras

30 UFC/g Rcto. de

levaduras

10 UFC/g 20 UFC/g

Bacillus

cereus

<100 UFC/g Bacillus

cereus

<100 UFC/g <100 UFC/g



Mes de Octubre:Resultado de Carrito Nº 19 Resultado de Carrito Nº 20 Resultado


Aerobios

mesófilos

60 UFC/g Aerobios

mesófilos

90 UFC/g 75 UFC/g

Rcto. de

mohos

<10 UFC/g Rcto. de

mohos

<10 UFC/g <10 UFC/g

Rcto. de

levaduras

<10 UFC/g Rcto. de

levaduras

<10 UFC/g <10 UFC/g

Bacillus

cereus

<100 UFC/g Bacillus

cereus

<100 UFC/g <100 UFC/g


Coliformes <3 NMP/g Coliformes <3 NMP/g <3 NMP/g

61

Mes de Noviembre:Resultado de Carrito Nº 19 Resultado de Carrito Nº 20 Resultado


Aerobios

mesófilos

80 UFC/g Aerobios

mesófilos

14x10 UFC/g 11 x 10UFC/g

Rcto. de

mohos

<10 UFC/g Rcto. de

mohos

40 UFC/g 20 UFC/g

Rcto. de

levaduras

20 UFC/g Rcto. de

levaduras

<10 UFC/g 10 UFC/g

Bacillus

cereus

<100 UFC/g Bacillus

cereus

<100 UFC/g <100 UFC/g


Coliformes <3 NMP/g Coliformes 4 NMP/g 4 NMP/g

62

V. DISCUSION

Los resultados respecto a la calidad Microbiológica de las hojuelas de papa que se

expenden en plena vía pública no presentan contaminación microbiana,

encontrándose por debajo de los limites mínimos permisibles que contempla la

“Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e

inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano” (R.M. N° 591–2008/MINSA) Protocolo para los análisis microbiológicos de Granos de Cereales,

leguminosos, quenopodiáceos y derivados (harinas y otros), según DIGESA.

Sin embargo durante encuestas a consumidores de este producto papas en

hojuela, se quejaron de ciertas reacciones alérgicas o se habían indigestado, los

casos no son constantes sino variables.

Esta situación constituye un factor de riesgo para la salud humanapor casos de

toxiinfección alimentaria, ya que la falta de control y capacitación de los

expendedores en el manipuleo de estos productos debe ser más continuo, obligar a

que sus anaqueles de expendio en especial las superficies estén más protegidos

del aire y polvo del medio ambiente.

Cabe destacar que la calidad microbiológica de las hojuelas de papa que se

expenden en la vía publica no presentan contaminación microbiana, pero la

contaminación se puede dar en los manipuladores de este tipo de producto

alimenticio, coincidiendo con lo establecido por LARRAÑAGA, I.; CARBALLO, J.

(1998.), quien demuestra que los puntos critico de control son manipuladores,

superficies y forma de expendio; y estos no son controlados por las autoridades

sanitarias y no se le da la importancia debida

Por la manera como se expenden en plena vía pública, sería interesante realizar un

estudio microbiológico del aire donde se encuentran dichos carritos.

63

La contaminación por el aire es importante tanto por razones higiénicas y/o

económicas.

La cantidad de microorganismos añadidos al alimento por sedimentación de las

partículas que presenta el aire es significante, éste puede elevar el número total de

microbios en el alimento, más si se usa para airear el producto.

Antes de adquirir estos productos, verifique y asegúrese de que los envases se

encuentren bien cerrados y en perfectas condiciones. (9)

Continuar apoyando pruebas de fritura con otras variedades de materia prima

(camote, yuca).

64

VI. CONCLUSIONES

En el presente trabajo realizado ninguna de las 22 muestras analizadas se

detectaron microorganismos indicadores de alteración, de higiene y patógenos que

represente riesgo para la salud humana.

Con relación a los microorganismos indicadores de alteración de alimentos

como son los microorganismos Aerobios Mesofilos, Mohos y Levaduras los

resultados de las 22 muestras analizadas muestran valores por debajo de “m” que

es el límite que separa la calidad aceptable de la rechazable; por consiguiente la

contaminación de las muestras con tales microorganismos es pequeña.

Con relación a los microorganismos indicadores de higiene de alimentos como

son los Coliformes, los resultados de las 22 muestras analizadas muestran valores

por debajo de “m” que es el límite que separa la calidad aceptable de la rechazable;

por consiguiente la contaminación de las muestras con Coliformes es mínima.

Con relación a los microorganismos patógenos que puedan contaminar los

alimentos como es Bacillus cereus y la presencia de Salmonella; los resultados de

las 22 muestras analizadas muestran valores para Bacillus cereus por debajo de

“m” que es el límite que separa la calidad aceptable de la rechazable; por

consiguiente la contaminación de las muestras se encontraron exentas con este

microorganismo.

Con relación a Salmonella los resultados obtenidos de las 22 muestras

analizadas muestran ausencia para con este microorganismo.

Finalmente las papas fritas en hojuela se consideran aptos para el consumo

humano por que cumplen con la exigencias de los criterios microbiológicos

establecidos en la Norma Técnica Sanitaria (NTS N° 071-MINSA/DIGESA-V-.01)

para el grupo y subgrupo de alimentos al que pertenece.

65

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Adams, M.R Y Moss N.O.: Microbiología de los alimentos. Editorial acriba S.A.Zaragoza 1997.

2. Aguilera J M 1997. Fritura de Alimentos. En: Aguilera JM (Editor). Temas enTecnología de Alimentos. Volumen 1. Programa Iberoamericano de Ciencia yTecnología para el Desarrollo (CITED). Instituto Politécnico Nacional, México: 187-213.

3. Álvarez, M. (2005). La Fritura de los Alimentos.http://www.monografias.com/trabajos31/frituraalimentos/frituraalimentos.shtml?monosearch.

4. BANWART, George J. Microbiología básica de los alimentos Ediciones bellaterra S. A.,Barcelona 1982.

5. Bello Gutiérrez, José., 1998, Ciencia y tecnología culinaria, Ediciones Díaz de Santos,S.A., Juan Bravo, 3-A. 28006, MADRID- España. Pp.: 107-129

6. CRUEGER W. A. 1989. Biotecnología, 3° Edición. Editorial Acribia S.A. Zaragoza

7. FAO 1992 Manual para el Control de Calidad de los Alimentos.

8. FRAZIER. W.C., Westhoff, D.C. 1993 Microbiología de los Alimentos. 2° Ediccion,Editorial Acribia, Zaragoza.

9. HOBBS, ROBERTS, 1993 Higiene y Toxicología de los Alimentos.

10. International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF), 2000Microorganismos de los alimentos, Volumen 1 Editorial Acribia, Zaragoza. España.

11. JAY. J.M. 1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Edit. Acribia, S.A., 804p

12. LARRAÑAGA, I.; CARBALLO, J. 1998. Control e Higiene de los Alimentos, Editorial Mc.Graw Hill. España, 1998. 33.

13. Norman G. Marriott, 2003, Principios de Higiene Alimentaria, Editorial Acribia S.A.,Zaragoza, - 416 páginas

14. LABORATORIO PROFECO Papas fritas envasadashttp://www.profeco.gob.mx/revista/pdf/est_08/56-63%20papas.pdf

15. (R.M. N° 591– 2008/MINSA ) “Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicosde calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano”

http://www.monografias.com/trabajos31/frituraalimentos/frituraalimentos.shtml

http://www.profeco.gob.mx/revista/pdf/est_08/56-63%20papas.pdf

66

VIII. APENDICE

Grafico N° 01 Recuento de Aerobios mesófilos vs tiempo

106 UFC/g

105 UFC/g

104 UFC/g

103 UFC/g

102 UFC/g

10 UFC/g

m Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov M

Grafico N° 02 Recuento de mohos vs tiempo

104 UFC/g

103 UFC/g

102 UFC/g

10 UFC/g


67

Grafico N° 03 Numeración de Coliformes vs tiempo

103 UFC/g

102 UFC/g

10 UFC/g


Grafico N° 04 Recuento de Bacillus cereus vs tiempo

104 UFC/g

103 UFC/g

102 UFC/g

10 UFC/g N E G A T I V O S


Grafico N° 05 Ausencia y/o Presencia de Salmonella vs tiempo

Muestra/25 g.

m M

A U S E N C I A / 25 g.

(-) Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Set Oct Nov (-)

68

FECHA Y FIRMA DEL RESPONSABLE DEL PROYECTO

CALLAO, 20 de Marzo del 2012.

FIRMA DEL RESPONSABLE DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

-----------------------------------------------------------------------------Blgo. – Mblgo.: ARTURO MARIANO GARCÍA MERINO

Profesor InvestigadorCódigo UNAC: 1364

69

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA Y DE ALIMENTOS

Bellavista, 20 de Marzo del 2012.

SEÑOR DIRECTOR DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN DE LA F.I.P.A.Ing.: DOMINGO NIETO FREIRE.Presente.

Asunto: LEVANTAMIENTO DE OBSERVACIONES

DE PROYECTO DE INVESTIGACION

De mi especial consideración:

Tengo a bien dirigirme a usted para saludarlo cordialmente, a la vez hacerlellegar el informe final del Proyecto de Investigación Titulado: Evaluación de la calidadmicrobiológica de los bocaditos fritos a base de Papa (Solanum tuberosum) que seelaboran y expenden en forma artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador – DistritoBellavista – Callao. Con el levantamiento de las respectivas observaciones.

Aprobado con Resolución de Decanato Nº 063-2010DFIPA

Agradeciendo la atención que le brinde al presente me despido reiterándole lossentimientos de mi especial consideración y estima personal.

Atentamente.

____________________________________Blgo.- Ing. : ARTURO GARCIA MERINO

Responsable del ProyectoCódigo: 001364

CC.: Arch.

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