(DIAGNOSIS II)

Tema 7. DIAGNÓSTICO DE VIRUS VEGETALES

FITOPATOLOGÍA

Por qué los virus requieren de técnicas especiales de diagnóstico ?

Son parásitos OBLIGADOS e INTRACELULARES

Son parásitos NO CELULARES (ACELULARES)

Son partículas o moléculas de ADN o ARN + proteínas

NO SON VISIBLES con equipos ópticos comunes.

Provocan importantes enfermedades PERSISTENTES E

INCURABLES.

NO SIEMPRE PRESENTAN SÍNTOMAS VISIBLES

(LATENCIA)

REQUIEREN DE MÉTODOS O TÉCNICAS ESPECIALES

PARA SU DIAGNÓSTICO

POSTULADOS DE KOCH

1. EL AGENTE CAUSAL DEBE ESTAR O HABER ESTADO ASOCIADO CON LA ENFERMEDAD Y VICEVERSA. SINTOMATOLOGÍA (PUEDE CONFUNDIRSE CON FITOTOXICIDAD) NO PRESENTAN SIGNOS.

2. EL AGENTE PATÓGENO DEBE SER AISLADO AL ESTADO PURO, ENPLANTAS HOSPEDANTES PARA ESTUDIAR SUS CARACTERÍSTICASMORFOLOGICAS, SEROLÓGICAS, MOLECULARES, PROPIEDADES IN VITRO. No se cultivan, cómo los aíslo? Con qué métodos los detecto o estudio

sus propiedades? MÉTODOS BIOLÓGICOS, SEROLÓGICOS O MOLECULARES

3. UNA PLANTA HOSPEDANTE SANA DE LA MISMA ESPECIE Y EDAD AL SERINOCULADA CON EL AGENTE AISLADO EN CONDICIONES FAVORABLESDEBERÁ REPRODUCIR LOS SÍNTOMAS CARÁCTERISTICOS DE LAENFERMEDAD, Pruebas de patogenicidad? TRANSMISIBILIDAD

4. EL AGENTE FITOPATÓGENO DEBE SER REAISLADO DEL HOSPEDANTEINOCULADO AL ESTADO PURO E IDENTIFICADO CON EL AISLADOPRIMERAMENTE.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE VIRUS DE PLANTAS

1- MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Estudia la ARQUITECTURA DE LAS PARTÍCULAS VIRALES (forma y tamaño)

Requiere de instrumental sofisticado Requiere de técnicos especialistas (capacitación) Es poco sensible Consume mucho tiempo No siempre se puede identificar la especie o el género

2- TÉCNICAS BIOLÓGICAS

SINTOMATOLOGÍA

RANGO DE HOSPEDANTES – PLANTAS INDICADORAS

TRANSMISIBILIDAD

ANÁLISIS DE LAS PROPIEDADES “IN VITRO” Punto de inactivación termal (PIT) Punto de dilución final (PDF) Desecamiento Longevidad “in vitro”

ESTUDIA LAS CARACTERISTICAS DEL VIRUS A TRAVÉS DE SU EXPRESIÓN EN PLANTAS HOSPEDANTES (BIOENSAYOS)

SINTOMATOLOGÍA

•Son indispensables para la valoración de los daños provocados por las virosis.

•Son en muchos casos los únicos recursos para un reconocimiento rápido en el cultivo.

• En pocos casos sirve por si sóla como método de diagnóstico. Ej Corcovo del tabaco causado por GRSV

Peste negra del tomate

i- SISTÉMICOS

(CAMBIOS DE COLOR)

• MOSAICOS (HOJAS)

•MOTEADOS (HOJAS)

•ESTRIADO (TALLOS)

Fotos de otra autoría.

SISTÉMICOS (CAMBIOS DE COLOR)

QUEBRADO (FLORES)ANILLADOS (FRUTOS)

Fotos de otra autoría.

SISTÉMICOS

(DEFORMACIONES)•CORDÓN DE ZAPATOS (HOJAS)

•AMPOLLADURAS

•HENDIDURAS (TRONCOS)

Fotos de otra autoría.

SISTÉMICOS (NECROSIS)

Fotos de otra autoría.

SISTÉMICOS (DETENCIÓN DE CRECIMIENTO, ENANISMO, ACHAPARRAMIENTO)

Fotos de otra autoría.

ii-SÍNTOMAS LOCALES(LESIONES CLORÓTICAS O NECRÓTICAS

Fotos de otra autoría.

SINTOMATOLOGÍA

iii-AUSENCIA DE SÍNTOMAS

• INAPARIENCIA,• ENMASCARAMIENTO• RECUPERACIÓN

BIOENSAYOS

RANGO DE HOSPEDANTES conjunto de plantas que pueden ser infectadas por un virus determinado.

Plantas indicadoras son aquellas que responden de forma consistente y distintivasfrente a las infecciones virales en condiciones de invernáculo.

Pueden manifestar síntomas locales o sistémicos

RANGO DE HOSPEDANTES

INOCULACIÓN MECANICA

TRANSMISIBILIDAD

EN LA NATURALEZA los VIRUS pueden transmitirse por:

INSECTOS POLEN SEMILLA (Virus del Mosaico del pepino, Mosaico común de la soja) CUSCUTA (holoparásita) ÓRGANOS DE PROPAGACIÓN VEGETATIVA (yemas de citrus CTV,

Psorosis; en tubérculos de papa PVY, en estacas c. de azúcar ScMV) ÁCAROS (Fam. Eriophydae) NEMÁTODES (Nepovirus – Xiphinema, Longidorus, Trichodorus) HONGOS (Olpidium brassicae - necrosis del tabaco) CONTACTO ENTRE PLANTAS ENFERMAS A SANAS (TMV, PVX)

CON LA INTERVENCIÓN DEL HOMBRE:

POR EL HOMBRE (HERRAMIENTAS, LABORES CULTURALES, ETC) INJERTO (TODOS) INOCULACION MECÁNICA (RANGO DE HOSPEDANTES)

TRANSMISIÓN POR INSECTOS

RELACIÓN VIRUS -VECTOR

Adquisición Incubación Transmisión

Persistente

Trips – TSWV

Circulativo propagativo

> 1 HORA Días a Semanas

Toda la vida

No persistente

Pulgón – PVY

No circulativo

No propagativo

Pocos segundos

NO TIENE Pocos minutos

Semi-persistente

Pulgón – CTV

Circulativo

No propagativo

Minutos a horas

Horas a días Depende de la adquisición

PROPIEDADES IN VITRO

•Punto de inactivación termal (PIT)Es la máxima temperatura que soporta el jugo viroso tratado durante 10 minutos sin perder su infectividad.

•Punto de dilución final (PDF)Es la máxima dilución que soporta el jugo viroso sin perder su efectividad.

•Desecamiento Es la capacidad de las partículas virosas de soportar el desecamiento de los tejidos donde se hallan incluidas, sin perder su infectividad.

•Longevidad “in vitro”Es el máximo tiempo que un virus permanece infectivo en el extracto vegetal, mantenidos en tubos cerrados, a temperatura de laboratorio.

Ej. Tobacco Mosaic Virus: PIT 92ºC, PDF 1/1.000.000, Desec. 50 años

Interpretación de los resultados de las técnicas biológicas

Los resultados se comparan con valores o respuestas YADETERMINADAS Y VALIDADAS PARA CADA ENTIDADVIRAL CONOCIDA (BIBLIOGRAFÍA , BANCOS DE DATOS)

SIRVEN PARA CARACTERIZAR UN VIRUS.

Son engorrosas, costosas, insumen mucho tiempo.

Ninguna por si sola permite la identificación de un virus.

Siempre es necesario complementar dos o mas técnicas.

3 - TÉCNICAS SEROLÓGICAS

SERODIAGNÓSTICO = DIAGNÓSTICO MEDIANTESEROLOGÍA = TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

ESTUDIA LAS PROPIEDADES DE LA CUBIERTAPROTÉICA DE LOS VIRUS.

SE BASAN EN LA IDENTIFICACIÓN DE UN VIRUS(EL ANTÍGENO) A TRAVÉS DE LA REACCIÓNCON SUS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS.

ANTÍGENO cualquier sustancia capaz de inducir una respuesta inmune cuando es introducida en un animal apropiado, lo que implica producción de nuevos anticuerpos.

Molécula AJENA al hospedante.

complejidad y de peso molecular.

Proteínas, glúcidos, polímeros de ácidos nucleicos, VIRUS, BACTERIAS, HONGOS O ALGUNOS DE SUS CONSTITUYENTES

REACTIVOS EN SEROLOGÍA

REACTIVOS EN SEROLOGÍA

ANTICUERPOS son moléculas proteicas(inmunoglobulinas) producidas en respuestaal antígeno que las originó. Circulan en elsuero sanguíneo (ANTISUERO) y se unenespecíficamente con el/ los antígenos quelos originaron.

Existen distintos tipos: IgG (80 %), IgA, IgM,

IgD y IgE.

Se localizan en suero sanguíneo

Reaccionan ESPECÍFICAMENTE con “su

Antígeno” mediante uniones no covalentes.

OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS

Los fitopatógenos inoculados en animalesvertebrados desencadenan “respuesta inmune”sin provocar enfermedad a los mismos.

Se pueden producir anticuerpos inyectandovirus fitopatógenos purificados en animales.

Los anticuerpos se emplean en diferentestécnicas.

VIRUS

VIRUS

AnticuerposESPECÍFICOS

VIRUS PURIFICADOS

Antígenos

INMUNIZACIÓN

Para inmunizar el animal se inyecta el virus purificados con un adyuvante (sustancias que estimulan la respuesta inmune, aumenta la producción de anticuerpos).

La sangría del animal se realiza varias semanas después de la inmunización.

La sangre se centrifuga, se precipita la fraccion sólida y se separa el suero (donde están los anticuerpos = antisuero)

PRUEBAS CON MOLÉCULAS INDICADORASO MARCADORES se emplean anticuerposy/o antígenos que están unidos amoléculas que tienen actividad propia yamplifican el poder de la pruebaaumentando su sensibilidad. Marcadores radioactivos Marcadores fluorescentes. Ensayos inmunoenzimáticos

E.L.I.S.A. marcadores enzimáticos

TÉCNICAS SEROLÓGICAS

ELISA (Enzime Linked Inmunosorbent Assay)

ANTICUERPOS:

especificidad para

reconocer al antígeno

que lo originó

CONJUGADO ENZIMÁTICO:

Anticuerpo marcado con una enzima

•La interacción específica Ag - Ac es reconocida por la acción de una

enzima unida a uno de los reactivos.

Distintas técnicas: DAS ELISA, NC ELISA, etc

ENZIMA: actividad

catalítica

E

Anticuerpos

Virus (Antígeno)

Anticuerpos

conjugados con

enzima

ESQUEMA DE LA TECNICA

DAS - ELISA

Celda

Sustrato

(Double sandwich antibody – ELISA)

1- COBERTURA DE LA PLACA CON

ANTICUERPOS (SENSIBILIZACION)2- PREPARACION Y AGREGADO DE LA MUESTRA (ANTIGENO)

3- AGREGADO DEL CONJUGADO ENZIMATICO

4- ADICIÓN DEL SUSTRATO

LAVADO

LAVADO

Lectura de absorbancia a longitud de onda de 405

nm mediante un ESPECTROFOTÓMETRO de

lectura vertical .

LECTURA DE LOS RESULTADOS

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La presencia de color (mayores valores deabsorbancia) indica la presencia del virus, laintensidad del color puede usarse para estimar laconcentración de virus en la muestra.

VENTAJAS

ALTA ESPECIFICIDAD ALTA SENSIBILIDAD ( 1- 10 NG/ML) SIMPLICIDAD RAPIDEZ (LOS RESULTADOS SE OBTIENEN EN

POCAS HORAS) NUMEROSAS MUESTRAS SIMULTÁNEAMENTE

(96 CELDAS/PLACA) NO REQUIERE TRATAMIENTO ESPECIAL DE LAS

MUESTRAS (EXTRACTO CRUDO) POCO INFLUENCIADA POR LA MORFOLOGÍA DE

LOS PATÓGENOS

EL MÉTODO ELISA ES, POR LEJOS, LA TÉCNICA INMUNOLÓGICA MÁS UTILIZADA EN AGRICULTURA PARA LA IDENTIFICACION DE VIRUS

Baja concentración de patógenos en la muestra

Gran número de muestras (lotes de papa semilla,

semillero de caña de azúcar)

Rigor científico del análisis (Certificación de

yemas de citrus, papa semilla, controles

cuarentenarios)

Análisis de material asintomático (Inapariencia,

latencia)

Urgencia en entrega de los resultados

Concentración o movimiento de los virus en la

planta

TÉCNICAS SEROLÓGICAS: Aplicaciones

4- TÉCNICAS MOLECULARES DE DIAGNÓSTICO

ESTUDIA O DETECTA LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS O GENES DE LOS VIRUS

SE BASAN EN LA PRESENCIA DE SECUENCIAS ÚNICASEN LOS ACIDOS NUCLEICOS DEL GENOMA DE CADA VIRUS.

REQUIERE DEL CONOCIMIENTO PREVIO DE LAS SECUENCIAS GENÉTICAS DEL VIRUS A DETECTAR (GENE BANK).

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Es una herramienta de extrema utilidad tanto porsu sensibilidad y especificidad como por susimplicidad.

Consiste en la multiplicación "in vitro" de unao unas pocas cadenas de ácido nucleico (DNA oRNA) de una longitud discreta hasta nivelestales que permitan su fácil detección en geles deagarosa.

Se fundamenta en los mecanismos naturalesde la replicación del ácidodesoxirribonucleico (DNA)

Representación esquemática de la molécula de DNA

1- Es semi-conservativa, REQUIERE UNA HEBRA MOLDE (ADN VIRAL)

2- Requiere de CEBADORES (FRAGMENTOS DE ADN ESPECÍFICO Y COMPLEMENTARIO AL ADN VIRAL) para comenzar

3- La enzima POLIMERASA SINTETIZA LAS NUEVAS CADENAS

REPLICACIÓN

H

O

H H

HH

PO

O

O

-

-

H

OCH2

H

HO

H

HH

PO

O

O

-

H

OCH2

H

HO

H

HH

PO

O

O -

PO

O -

O

PO

O -

-

O

5' O

CH2

OH

P

O

O O-

O

O

O

O

H

Base Base

Base

O

CH2

P

O

O O-

O

H

Base

Base Base

O

CH2

P

O

O O-

O

H

O

CH2

P

O

O O-

O

H

Base

O

CH2

P

O

O O-

O

H

Base

Base

O

CH2

P

O

O O-

O

H

3'

HH

H

H

H

H

H

H

H

H

OH

H

OH

A T

G C

Deoxiribonucleósido 5' trifosfato a ser incorporado.

Nueva hebra sintetizada Hebra molde

O

H

H

OH

Pirofosfato inorgán ico l iberado

Dirección de síntesis de la nueva cadena

de DNA

Síntesis de DNA: La adic ión de deoxiribonuclótidos al extremo 3' de una cadena polinucleotídica es la reacción fundamental para la síntesis de DNA. El apareamiento de bases entre los deoxiribonucleótidos incorporados y la cadena molde es la guía para la formación de la nueva cadena que tendrá una secuencia nucleótidica complementaria.

CH2

La secuencia ADN VIRAL a detectar(amplificar) se somete a 30 ciclos decopiado en un pequeño tubo deensayo.MOLDE.

Fragmentos cortos de ADN(cebadores) complementarios aporciones específicas del acidonucleico viral se adhieren al ADNVIRAL.

La polimerasa termoestable es la quesintetiza múltiples copias de una hebrade ADN complementaria a la porciónde ADN comprendida entre los doscebadores

ETAPAS DE CADA CICLO 1-Desnaturalización del DNA, 2-hibridación de cebadores y 3-extensión de la nueva

cadena

5' 3'

3' 5'

DNA con sus cadenas

complementarias

desnaturalizadas

Primers

específicos

5' 3'

5'3'

Síntesis de DNA

PROGRAMA DE TERMOCICLADO

Materiales necesarios

Para desarrollar una reacción de PCRse colocan en un tubo de microcentrífuga los siguientes reactivos:

DNA molde (ADN VIRAL)CEBADORES (DISEÑADOS EN FUNCIÓN AL

VIRUS A DETECTAR) DNA polimerasa, Desoxirribonucleósidos trifosfato (A,T,C,G) Tampón adecuado

TERMOCICLADOR

Para visualizar la reacción GELES DE AGAROSA CUBA ELECTROFORESIS TRANSILUMINADOR

N° de ciclos

3510203031

32

N° de doble cadenas con la

longitud prevista28

256262.144

268.435.456536.870.912

1.073.741.824

Partiendo de una molécula de DNA y asumiendo

una eficiencia del 100% en cada ciclo se obtienen:

EL PRODUCTO DE LA PCR PUEDE DETECTARSE USANDO ELECTROFORESIS EN GEL, POR CORRIENTE ELECTRICA SE SEPARAN A LAS MOLECULAS DE DISTINTOS TAMAÑOS.

LUEGO LOS FRAGMENTOS SE TIÑEN EN EL GEL CON UN PIGMENTO ESPECÍFICO PARA ACIDOS NUCLEICOS.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Calles 1: marcador de peso molecular

Calle 2: Testigo positivo TMV

Calles 3-5: muestras problema infectadas con TMV

Calle 6: muestra sin infeccion de TMV

1 2 3 4 5 6

LA VISUALIZACION DE UNA BANDA DEL TAMAÑO APROPIADO INDICA LA PRESENCIA DEL VIRUS PARA EL CUAL SE DISEÑARON LOS CEBADORES

Bibliografía complementaria

Fernandez Valiela, M.V. 1995. Virus patógenos de las plantas y su control. Tomos 1 y 2. 4ta Edición.

Ramallo, J.C. y S. Hongn. 1997. Síntomas, propiedades, transmisión y diagnóstico de virus vegetales. Serie didáctica Nº 33. FAZ, UNT.

Agrios, G. 1985. Fitopatología.