Generación de anticuerpos

(http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_anticuerpos&opc=tecnicas)

Los anticuerpos son proteínas que son producidas por el sistema inmunológico en respuesta a moléculas externas que entran en el cuerpo, estas moléculas externas son los llamados antígenos, y su reconocimiento molecular por el sistema inmunológico da como resultado la producción selectiva de anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a ese antígeno. Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B y circulan a través de la sangre donde se unen a su antígeno específico, permitiendo ser eliminados de la circulación.

Esta habilidad del sistema inmunológico animal para producir anticuerpos para unirse específicamente a los antígenos nos permite fabricar marcadores que nos permiten la detección de moléculas de interés en aplicaciones de investigación y diagnóstico.Otra de las características de los anticuerpos que nos ayudan a utilizarlos como herramientas de reconocimiento es su relativa uniformidad y su buena estructura caracterizada que nos permite purificarlos, marcarlos y detectarlos de una manera predecible y reproducible por métodos generalizados.

Durante los 70 y 80 se generaron protocolos de producción, purificación y modificación para uso de detección específica de antígenos, y siguen relativamente vigentes. La producción de anticuerpos necesita la preparación de animales, inyección del antígeno en el laboratorio para provocar la alta producción de anticuerpo y su posterior recolección. Alternativamente las líneas celulares de hibridomas producen monoclonales específicos para un antígeno se pueden producir por fusión de una célula que secreta un anticuerpo específico con una línea inmortal de mieloma.

La purificación de anticuerpos incluye el aislamiento del anticuerpo del suero (anticuerpos policlonales), fluido ascítico, sobrenadante de cultivo de una línea celular de hibridoma (anticuerpo monoclonal). Los métodos de purificación varían desde muy crudos (precipitación de las proteínas de la muestra incluyendo cualquier anticuerpo presente), a purificación general (purificación por afinidad de ciertas clases de anticuerpos sin tener en cuenta la especificidad al antígeno) hasta la específica (purificación por afinidad de los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno en concreto. El nivel de purificación necesaria depende de la aplicación para la cual queremos utilizar el anticuerpo.

TIPOS DE ANTICUERPOS

Estructura de una inmunoglobulina

Los anticuerpos (o inmunoglobulinas) son glicoproteínas compuestas de una o más unidades, cada una de ellas contiene 4 cadenas de polipéptidos:

- 2 cadenas idénticas, son las llamadas cadenas pesadas (H)- 2 cadenas idénticas, son las llamadas cadenas ligeras. (L)

Las amino terminales de las cadenas polipéptido tienen una alta variación en la composición de aminoácidos y son consideradas como las regiones variables (V) para distinguirlas de las consideradas relativamente regiones constantes (C).

Cada cadena L consiste en un dominio variable VL y un dominio constante CL.

Las cadenas H consisten de un dominio variable VH y 3 dominios constantes CH1, CH2 y CH3.

Cada cadena pesada tiene alrededor del doble de aminoácidos (peso molecular aprox. 50.000) que la cadena ligera, resultando aproximadamente un peso molecular de 150.000.

Las cadenas pesadas y ligeras se unen por la combinación de interacciones no covalentes e interacciones covalentes de enlaces disulfuro, formando una estructura simétrica bilateral.

Las regiones V de las cadenas H y L comprenden las sitios de unión con el antígeno de la molécula de la inmunoglobulina (Ig). Cada monómero Ig contiene 2 sitios de unión de antígenos.

Clases de inmunoglobulinas

Las 5 clases primarias de inmunoglobulina son IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Estas se distinguen por el tipo de cadena pesada que se encuentra en la molécula:

- Moléculas IgG con cadena pesada conocidas como cadena -γ- IgM como cadena -μ - IgA como cadena α - IgE la cadena  ε- IgD como la cadena δ

Diferencias en polipéptidos de la cadena pesada permite a estas inmunoglobulinas funcionar en diferentes tipos de inmuno respuestas y en diferentes estadios de la inmuno respuesta. La secuencia de la proteína polipétido responsable de estas diferencias se

encuentran primeramente en los fragmentos FC. Mientras hay 5 diferentes tipos de cadenas pesadas solo hay 2 tipos principales de cadenas ligeras. Kappa y Lambda.

IgG, como monómero, es la clase Ig predominante en suero humano. Producida como parte de la inmuno respuesta secundaria de un antígeno, lo que representa el 75% del total de Ig del total del suero. Debido a su relativa abundancia  y excelente especificidad hacia un antígeno, IgG es el principal anticuerpo usado en investigación y diagnóstico.

IgM existe como un pentámero en mamíferos, predomina en respuestas inmunes primarias a los antígenos y es el 10% de las Ig en suero humano. Las IgM también se expresa como monómero en la membrana de los linfocitos B. Es el receptor de antígenos de las células B, y la cadena H contiene un dominio hidrofóbico para anclarse en la membrana. Monómeros de IgM se unen a través de enlaces disulfuro  y una cadena de unión (J).

IgA existe en suero en dos formas, monomérica y dimérica, constituyendo aproximadamente el 15% del total de Ig. Las IgA de secreción, un dímero, es el primer mecanismo de defensa contra alguna infección local por su abundancia en membranas de secreción (saliva, lágrimas). La principal función de las IgA de secreción puede no se de destruir el antígeno, si no prevenir la introducción de sustancias externas al sistema circulatorio.

IgD e IgE se encuentran en suero en cantidades mucho más pequeñas que otras Igs. IgD de membrana es un receptor de antígenos encontrado principalmente en linfocitos B maduros. Las IgE defienden primeramente la invasión parasitaria.

Adicionalmente a la mayor clase de inmunoglobulinas, hay diferentes subclases de Ig basadas en menores diferencias en el tipo de cadena pesada de cada una de las clases Ig existentes en todas las membranas de cada especie animal. En humanos hay 4 subclases de IgG: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 nombradas en orden decreciente de su concentración en suero). Su variación es menor que la variación en la clases de Ig.

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Anticuerpos policlonales y monoclonales

Los anticuerpos (sin importar su clase o subclase) se producen y purifican en dos formas básicas para su uso como reactivos en inmunoensayos: policlonales y monoclonales. Normalmente, la respuesta inmunológica a un antígeno es heterogénea, resultante de diferentes líneas celulares de linfocitos B (precursores de las células del plasma) productores de anticuerpos para el mismo antígeno. Todas estas células originarias de células madre comunes, desarrollan un anticuerpo que detecta un epítopo diferente del mismo antígeno. Como consecuencia de esta heterogénea respuesta, el suero de un animal inmunizado contendrá numerosos clones de anticuerpos específicos de un antígeno, potencialmente de diferentes clases y subclases de Ig comprendiendo sobre el 2-5% del total de Ig. Debido a esta colección heterogénea un anticuerpo purificado de esta muestra se llama anticuerpo policlonal. Los anticuerpos policlonales son específicamente útiles como anticuerpos secundarios marcados en inmunoensayos.

Si un linfocito B individual produce y secreta solo una molécula de anticuerpo específica, los clones de linfocitos B producen anticuerpos monoclonales. Todos los anticuerpos secretados por un clon de célula B son idénticos, proveen una fuente de anticuerpos homogéneos con una especificidad definida y específica. Aunque los linfocitos B se pueden separar de una suspensión, tienen una vida limitada y no se pueden cultivar para producir una cantidad suficiente de anticuerpo.

Afortunadamente esta restricción ha sido superada  con el desarrollo de la tecnología de hibridoma, en la que los linfocitos B aislados se fusionan con células de mieloma e la misma especie para crear líneas celulares hibridas de monoclonales que son virtualmente inmortales que mantienen su capacidad de producir anticuerpos monoclonales. Estos

hibridomas se pueden guardar congelados y cultivar para producir anticuerpos monoclonales en grandes cantidades.

Los anticuerpos monoclonales son usados como anticuerpos primarios en aplicaciones que requieren especificidad a un solo epítopo. Los clones de hibridoma se pueden hacer crecer en cultivos celulares para recoger los monoclonales en el sobrenadante o crecerlos en la cavidad peritoneal de un ratón para recolectarlo del fluido ascítico.

PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS

Los anticuerpos son proteínas, por lo que los métodos de purificación a partir de muestras biológicas (suero, fluido ascítico o sobrenadante de cultivo) son formas especializadas de los métodos de purificación de proteínas. La purificación se puede hacer en forma cruda, es decir precipitando todas las inmunoglobulinas y otras proteínas, o solo los anticuerpos que puedan fijarse a un antígeno específico.

La purificación cruda de anticuerpos se puede hacer con diferentes métodos como precipitación con persulfato de amonio, adsorción tiofílica o cromatografía de intercambio iónico. Estos métodos son útiles dependiendo de la aplicación en la que vayamos a utilizar nuestro anticuerpo. En aplicaciones a mayor escala normalmente se utiliza el intercambio iónico para purificar un tipo de inmunoglobulina, en cambio en investigación y en producción a pequeña escala se utiliza más la purificación por afinidad.

La cromatografía por afinidad (purificación por afinidad), un ligando es unido a un soporte sólido, como por ejemplo crosslinkado a gel de bolas de agarosa. La muestra fluida àsa a través del soporte material permitiendo que las inmunoglobulinas se unan al ligando inmovilizado. Mientras que los componentes que no se han unido se lavan y eluyen del soporte. Posteriormente ponemos un buffer que nos cambie las condiciones del medio y haga que se rompa la unión entre la inmunoglobulina y el ligando de manera que podamos eluir nuestro anticuerpo en una forma purificada.Proteica A, proteína G y sus formas recombinantes, son componentes de la pared celular bacteriana que se unen a la región Fc de las inmunoglobulinas y son de lejos las más escogidas para purificar IgG por afinidad. La proteína L es la tercera proteína de origen bacteriano que ha sido desarrollada para usarla en purificación anticuerpos por afinidad, se une a diferentes clases de inmunoglobulinas (por ejemplo IgG, IgM, IgA) siempre y cuando tengan la cadena ligera Kappa. Algunas lectinas se unen específicamente a IgA humana. “Mannan binding protein” (MBP) nos permite purificar IgM tanto humana como de ratón.

Como en cualquier método de purificación, los buffers de unión como de elusión son componentes importantes en la purificación de anticuerpos cuando se usan los ligandos comentados anteriormente. Generalmente, la fuerza iónica y el pH son los factores más importantes afectando la eficiencia de unión y consecuentemente la elusión de las inmunoglobulinas de estos ligandos. Sin embargo, la temperatura y otros componentes son también importantes en casos particulares.

Para purificar anticuerpos específicos contra antígenos, hemos de inmovilizar el antígeno a un soporte y lo utilizamos para purificar por afinidad las inmunoglobulinas que se unan a él.

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PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS

Producción de anticuerpos policlonales

El proceso de producción de policlonales es relativamente sencillo, se inmuniza el animal y el sistema inmunológico de este responde al antígeno para producir anticuerpos contra la molécula inyectada.  Sin embargo, esta producción depende de este sistema biológico complejo, los resultados no son predecibles. Los animales individualmente e incluso de la misma identidad genética, responden de manera diferente generando anticuerpos diferentes contra la molécula inyectada. Sin embargo con el conocimiento básico de cómo responde el sistema inmunológico a la inyección de una molécula exterior y con las herramientas adecuadas para la inyección, un investigador puede aumentar mucho las probabilidades de obtener un anticuerpo útil.

• El sistema inmune

El sistema inmune es un sistema de vigilancia diseñado para proveer protección al inquilino de invasores externos. La vigilancia se produce por proteínas y células que circulan por el organismo para identificar y destruir células externas, virus o macromoléculas.

La protección inmune es proveída por un sistema dual compuesto por la respuesta celular inmune y por la respuesta humoral inmune. La respuesta celular inmune es producida por los linfocitos T y no puede ser transferida de un individuo a otro por transfusión de suero. La inmunidad humoral envuelve las proteínas solubles encontradas en suero (anticuerpos) que se pueden transferir cuando el suero es transfusionado.

• Inmunogenicidad

- Antígenos e inmunógenos

Una generación satisfactoria de anticuerpos depende de la unión de linfocitos B, procesando y presentando el antígeno al linfocito helper T, el cual señala la célula B a producir y secretar anticuerpos. Un antígeno es cualquier molécula ques es identificada como no propia por los componentes del sistema inmune. Un inmunógeno es un antígeno que es capaz de provocar una respuesta inmune incluyendo la producción de anticuerpos vía respuesta inmune. Todos los inmunógenos son antígenos pero no todos los antígenos son inmunógenos. Es importante tenerlo en cuenta  porque para producir anticuerpos es importante

convertir los antígenos en inmunógenos en el caso de que no sean antes de inyectarlos al animal, y para ello los unimos químicamente a otras moléculas inmunógenas.

- Propiedades que determinan la inmunogenicidad

Inmunogenicidad es la habilidad de una molécula para crear una respuesta inmune.Para que una molécula sea inmunogénica tiene que cumplir tres características: Externa, alto peso molecular y complejidad química.

Tiene que ser externa para que el sistema no la reconozca como propia y la ignore. Generalmente los compuestos de un organismo no son inmunogénicos al mismo individuo y son inmunogénicamente pobres para individuos de la misma especie.

En cuanto al peso molecular, compuestos de tamaño pequeño (ej. MW<1.000 o MW 1.000-6.000) no son inmunogénicos). La mayoría de los compuestos con MW> 6.000 son inmunogénicos.

- Macromoléculas como inmunógenos

Es posible hacer ciertas generalizaciones sobre la inmunogenicidad de las 4 mayores clases de macromoléculas: Carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos y proteínas. Los carbohidratos son solo inmunogénicos si tienen una estructura relativamente compleja de polisacáridos o forman parte de una molécula más compleja, como glicoproteínas.

Los lípidos normalmente no son inmunogénicos pero pueden hacerse si se conjugan a una proteína cárrier. Lo mismo les pasa a los ácidos nucléicos.

Por su complejidad y tamaño, las proteínas son generalmente buenas inmunógenas. Dado que la gran mayoría de inmunógenos naturales son macromoleculas compuestas por proteínas, carbohidratos o una combinación de los dos, es perfectamente entendible que las proteínas son ampliamente inmunogénicas. Los péptidos pueden tener la complejidad necesaria para ser inmunogénicos, pero su pequeño tamaño normalmente les hacer ser poco inmunogénicos por si solos. Normalmente los péptidos se conjugan a un carrier para provocar una respuesta inmune y producir anticuerpos.

- Haptenos y epítopos

Péptidos otras moléculas pequeñas que se usan como antígenos les llamamos haptenos. Son antigénicos, no inmunogénicos. Los haptenos pueden hacerse inmunogénicos uniéndolos a un carrier.

Un epítopo es el sitio específico del antígeno donde se une el anticuerpo. Para antígenos muy pequeños, prácticamente la estructura completa puede actuar como epítopo. Dependiendo de su complejidad y tamaño, un antígeno puede causar la producción de diferentes anticuerpos dirigidos a varios epítopos. Los anticuerpos policlonales son mezclas de inmunoglobulinas y colectivamente se unen a múltiples epítopos en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales por definición contienen un solo clon de anticuerpo y es específico en su unión a un epítopo en particular.

Anticuerpos específicos se pueden generar contra casi una única estructura, natural o sintética, siempre que sea posible presentarla al sistema inmune de forma que sea inmunogénica. Los anticuerpos resultantes se pueden unir a epítopos compuestos de moléculas enteras, grupos funcionales particulares  de moléculas grandes, grupos de aminoácidos funcionales  en estructuras terciarias de proteínas, una única estructura en lipoproteínas, glycoproteínas, RNA, DNA o polisacáridos. Los epítopos puedn ser también partes de estructuras celulares, bacterias, hongos o virus.

• Carriers

Una proteína carrier es cualquier proteína usada para unirse con péptidos u otros

haptenos que no son suficientemente grandes o complejo por sí mismos para inducir una respuesta inmune  para producir anticuerpos. El carrier, como es grande y complejo, confiere inmunogenicidad al hapteno conjugado, resultando la producción de anticuerpos de epítopos del hapteno y el carrier. Muchas proteínas se pueden usar como carriers y se escogen basándonos en inmunogenicidad, solubilidad y disponibilidad de grupos funcionales en los cuales podemos conjugar el hapteno. Los dos más usados comúnmente son Keyhole Limpet Hemocayanin (KLH) y Bovine Serum Albumin (BSA).

En una respuesta inmune típica los anticuerpos son producidos por linfocitos B (normalmente en conjunción con célula T-helper y células presentando-antígeno). En la mayoría de los sistemas carrier-hapteno, las células B producirán anticuerpos que son específicos para ambos, el hapteno y el carrier. En el sistema clásico hapteno-carrier, Los linfocitos T reconocen el carrier y coopera con las células B las cuales induce una respuesta anticuerpo-específica al hapteno.

Una respuesta anticuerpo se dirigirá contra epítopos a ambos, carrier y hapteno, es muy importante planificar cuidadosamente como los anticuerpos específicos al hapteno van a ser identificados y purificados del suero inmunizado final. Para crear el inmunógeno mejor, puede ser beneficioso preparar el conjugado con difertentes carriers y con diferentes ratios de unión hapteno-carrier.

- KLH como carrier

KLH es ampliamente usado como carrier por su gran peso molecular (agregados de 450.000-8.000.000 kDa compuestos de subunidades de 350 y 390 kDa) y muchos grupos lisina disponibles. Es una proteína que contiene cobre que pertenece a un grupo de proteínas llamadas hemocianinas que se encuentran en artrópodos y moluscos. KLH se aísla del molusco Megathura Crenulata. Cationes divalentes ayudan en la formación de grandes agregados. Los agregados del KLH no se disocian con la simple extracción de los cationes divalentes de la suspensión. Mientras el KLH es 5 estados diferentes de agregación  en buffer TRIS, PH 7.4, se disocia reversiblemente a estados de agregados menores o subunidades individuales con cambios moderados de PH y se disocia completamente a PH 8.9. Cada subunidad contiene sitios de unión de oxígeno, y una molécula de oxígeno se puede unir por cada 2 átomos de cobre en KLH. La proteína que contiene oxígeno es azul, mientras que la que no contiene oxígeno es incolora. La extracción del oxígeno también disocia la proteína a estados de agregados menores. Cuando el KLH se disocia en subunidades se espera que se unan más anticuerpos porque habrá más sitios antigénicos disponibles.

Debido a su tamaño, KLH muchas veces es poco soluble en agua. Mientras esto no afecta a su inmunogenicidad , la manipulación del KLH en solución puede ser difícil. Incluso retirando las partículas insolubles de la solución de KLH, es difícil determinar  la cantidad de KLH presente. Las soluciones de KLH son turbias, por lo que las lecturas de absorbancia a 280 son imprecisas.

Imject Mariculture Keyhole limpet Hemocyanin de Pierce está purificada y liofilizada en un buffer estabilizante. Después de su reconstitución, la solución-suspensión es un azul opalescente, lo cual es característico de altamente purificado, KLH no desnaturalizado. Los productos Imject mcKLH de Pierce ofrecen las ventajas combinadas de alta inmunogeneicidad y buena solubilidad en agua, haciendolos ideales para la conjugación hapteno-carrier.

Tradicionalmente, KLH se obtenía de Keyhole Limpets gigantes recolectados de su ambiente natural. Este método distorsionaba el frágil ecosistema donde vivían. Los métodos actuales son mucho menos agresivos al hábitat natural y ahora se cultivan en tanques (cultura marina o “mariculture”), donde se les saca la sangre como una donación de sangre humana y así pueden vivir durante muchos años.

Además de ser obtenido con un método medioambiental más amigable, mcKLH tiene algunas ventajas sobre el KLH obtenido tradicionalmente. Lo más importante para su uso como carrier, mcKLH ha mejorado su uniformidad y solubilidad, por lo que el buffer que contiene altas concentraciones d cloruro sódico no es necesario para prevenir la precipitación de la proteína durante la reacción de conjugación con el hapteno y su uso. Todos los productos de Pierce carrier KLH usan mariculture KLH.

- BSA y OVA como carriers

La albúmina sérica bovina (BSA; peso molecular 67.000) pertenece a la clase de proteínas séricas llamadas albúminas. Las albúminas constituyen más o menos la mitad del contenido de proteínas del plasma y son bastante estables y solubles. BSA es mucho más pequeña que el KLH pero es completamente inmunogénica. Es un carrier bastante popular para compuestos poco antigénicos. BSA es un polipéptido de cadena simple con 59 residuos de lisinas, 30-35 de los cuales tienen aminas primarias que son capaces de reaccionar con reactivos de conjugación. Tiene numerosos grupos carboxilatos que dan al BSA su carga negativa neta (PI 5.1). Imject BSA es un BSA altamente purificado que una vez reconstituido puede usarse para conjugas haptenos sin dualizaciones ni purificaciones posteriores.

BSA es utilizado comúnmente en el desarrollo de inmunoensayos porque es completamente soluble y tiene numerosos grupos funcionales útiles para croslinkar  a pequeñas moléculas que de otro modo no se unirían eficientemente a las placas de poliestireno. Además, BSA se utiliza mucho como estándard para ensayos de proteínas, como tiene carga también se utiliza como marcador de peso molecular en SDS-PAGE y también como reactivo de bloqueo. Sin embargo, este múltiple uso del BSA requiere que tengamos cuidado para evitar reacciones cruzadas  con el carrier en protocolos de screening de anticuerpos en aplicaciones finales.

Por esta razón, BSA se utiliza frecuentemente  como proteína carrier no-relevante en screening de anticuerpos e inmunoensayos después de usar KLH para provocar la respuesta inmune contra el hapteno. Solo usando diferentes carriers en la misma inmunización y pasos de screening/purificación podemos asegurarnos la detección de anticuerpos hapteno-específico en vez de carrier-específico.

Ovoalbúmina  (OVA; peso molecular 45.000) se puede usar como carrier. Es también conocido como albúmina de huevo, constituye el 75% de las proteínas en los huevos de gallinas. OVA contiene 20 grupos lisina y se utiliza principalmente como carrier secundario (screening) mejor que para inmunizaciones, aunque es inmunogénica. También contiene 14 residuos de ácido aspártico y 33 residuos de ácido glutámico que aportan grupos carboxilo, lo cuales se pueden utilizar para la conjugación con los haptenos. OVA es un polipéptido de cadena simple con muchos residuos hidrofóbicos y un punto isoeléctrico de 4.63. La proteína se desnaturaliza por encima de 56ºC o cuando se le somete a corriente eléctrica o se agita vigorosamente. OVA es inusual entre las proteínas en siendo soluble en altas concentraciones de solvente orgánico DMSO, permitiendo conjugaciones con haptenos que nos son solubles en buffers acuosos.

Adyuvantes

Para aumentar la respuesta inmune a un inmunógeno, se puede utilizar varios aditivos llamados adyuvantes. Cuando se mezcla y se inyecta con un inmunógeno, un adyuvante aumentará la respuesta inmune. El adyuvante no es el sustituto del carrier porque aumente la respuesta inmune al inmunógeno porque no puede hacer que el hapteno sea inmunogénico. Los adyuvantes son estimuladores no específicos de la respuesta inmune, ayudando a anclar o secuestrar  el material inyectado y causando un aumento dramático en la respuesta de anticuerpo.

Hay muchos adyuvantes populares, incluyendo los “ Freund’s complete adjuvant (FCA)”. Este reactivo consiste de una emulsión agua-aceite y mycobacterium muerto. La emulsión de agua-aceite localiza el antígeno durante un largo periodo de tiempo, y el mycobacterium atrae los macrófagos  y otras células apropiadas al sitio de inyección.  El FCA es usado en las inyecciones iniciales. Las siguientes inyecciones usan inmunógeno en una emulsión con FCA que no contiene el componente mycobacterial. FCA son muy efectivos, pero ponen en riesgo al animal y el experimento por la toxicidad del componente mycobacterial.

Imject Alum es igualmente efectivo y una alternativa más conveniente a los FCA. La preparación de la muestra con los Imject Alum es simplemente mezclar el antígeno con la solución de adyuvante, y a continuación la inyección.

Otra alternativa a los FCA es el Adjuprime Immune Modulator. Es un adyuvante carbohidratado no tóxico y fácil de administrar  en una sola fase acuosa. Estas características únicas le hace más fácil y seguro de usar que el FCA. El adjuprime es una diana de macrófagos y adyuvante de liberación sostenida de antígeno. Prporciona un

amplio espectro macromolecular y antígenos oligopéptidos  a la superficie celular del macrófago y estimula la respuesta humoral al antígeno. El Adjuprime genera una respuesta de anticuerpo equivalente al FCA sin la respuesta inflamatoria asociada.

Proceso

Los animales normalmente utilizados son conejos, ratones, ratas, cobayas, gallinas, cabras, caballos, ovejas, vacas y llamas.

Uno de los factores importantes en la producción de policlonales es el background, y para reducirlo lo más importante es utilizar animales libres de patógenos y que no hayan sido inmunizados anteriormente. Otro factor es el estrés antes y durante la inmunización, y para reducir este factor es importante anestesiar el animal en la inyección, extracción de la sangre y mantenerlo en una sala limpia y acondicionada.

 Cada productor de anticuerpos puede tener su propio programa y puede variar entre 60 y 100 días de inmunización.

 En función de nuestras necesidades podemos crear policlonales prácticamente contra cualquier molécula como por ejemplo proteínas, péptidos, DNA y moléculas químicas.

• Anticuerpos contra proteínas versus contra péptidos

Lo mejor es tener un anticuerpo contra nuestra proteína, pero lo ideal es tener un anticuerpo contra un epítopo de nuestra proteína, pero tal como hemos comentado tendremos una mezcla de anticuerpos contra diferentes epítopos, por ello tenemos la posibilidad de crear anticuerpos contra péptidos de nuestra proteína, lo que nos proporcionará una mayor especificidad de nuestro policlonal, aunque tenemos el riesgo de que no sea reconocido en nuestro ensayo porque puede quedar en el interior de nuestra proteína plegada en el caso de que queremos detectarla de forma nativa.

Para crear anticuerpos contra péptidos es muy importante seleccionar bien el péptido de nuestra proteína, y para ello debemos tener en cuenta diferentes parámetros: su hidrofobicidad, es decir, si este péptido puede estar en la parte externa de nuestra proteína plegada o en su interior. Su antigenicidad. Predicción de estructuras secundarias. Y predicción de la probabilidad de que esté en la parte superficial de la proteína. Normalmente el péptido sintetizado puede tener un tamaño entre 10 y 17 aminoácidos. Después hemos de sintetizar el péptido y acoplarlo a un carrier.

La cantidad de antígeno necesaria en la inmunización puede ser aproximadamente:

Animal Antígeno/inyección

Ratón 40 microgramos

Rata 50           “

Cobaya 50           “

Cabra 400          “

Oveja 400          “

Llama 400          “

Gallina 200          “

Conejo 100          “

• Programa clásico de inmunización

Como hemos comentado se pueden establecer diferentes programas de inmunización en función de la aplicación posterior del policlonal y la dificultad que presente nuestro antígeno.

Ante la posibilidad de que el antígeno pueda provocar daños al animal y causar su muerte, siempre se recomienda utilizar como mínimo dos animales para asegurarnos la producción de los policlonales.

- Un programa estándar de inmunización para conejos sería el siguiente:

Día 0 14 28 38 56 66 87

Inyección 1ª 2ª 3ª   4ª    

SangradoPre-

inmune    2 ml   20 ml 60 ml

- Programa para inmunización de huevos:

Día 0 14 28 38 56 66 87

Inyección 1ª 2ª 3ª   4ª    

Yema deHuevo

Pre-inmune

    Huevos*      

(*) Los huevos se recogen entre el dia 38 y el 87 y se mezclan por semana y por gallina.

- Programa para inmunización de ratones:

Día 0 14 28 38

Inyección 1ª 2ª 3ª  

Sangrado Pre-inmune     350 ul

Producción de anticuerpos monoclonales

Como hemos comentado un monoclonal es un anticuerpo que reconoce un solo epítopo.

La producción se puede dividir en 5 fases:

1. Inmunización.2. Fusión.3. Screening y amplificación del hibridoma.4. Clonación e isotipado5. Producción del monoclonal

Vamos a describir un programa estándar, el cual puede ser modificado según las necesidades.

• Fase I: Inmunización.

En este paso utilizamos ratones de una edad aproximada de 6-8 semanas. Para poder servirnos de referencia de la efectividad de la inmunización cogemos suero preinmune del ratón en el día 0. A cada uno de los ratones se le suministra 4 inyecciones con una cantidad de 50 ug de antígeno por inyección y por animal. En todas las inyecciones utilizamos la misma cantidad de volumen de antígeno como de “ Freund’s complete adjuvant (FCA)”. La primera inyección en el día 0, el resto de las inyecciones cada 3 semanas.

A los 10 días de la última inyección seleccionamos por elisa cual es el ratón con una mejor respuesta inmune.

Este proceso puede durar unas 11 semanas.

• Fase II: Fusión.

Esta fase la podemos realizar de dos maneras diferentes:

1. Clásica2. Electrofusión

1. Sistema clásico:

Cogemos los linfocitos, del ratón con una mejor respuesta inmune tal como hemos comentado, y los fusionamos con une línea celular tumoral (por ejemplo SP2- Ag-14) utilizando Polietileno Glycol (PEG) para formar un hibridoma (célula resultante de la fusión de las dos células con características similares a ambas, que expresará anticuerpos de manera “permanente”). Los hibridomas resultantes los sembraremos en placas de 96 pocillos en medio HAT.

Este proceso puede durar 2-3 semanas.

2. Electrofusión:

En el sistema clásico fusionábamos los dos tipos de células utilizando reactivos químicos y dándole un tiempo para que esta fusión sucediese de manera

espontánea. En la electrofusión lo que hacemos es utilizar un campo eléctrico para fusionar las células, para ello tenemos 4 pasos diferentes:

a. Alineación y compresión: para ello utilizamos un proceso llamado dielectroforesis, es decir un campo eléctrico no uniforme y cambiante. Es necesario porque un cuerpo sin carga (en este caso la célula) no se mueve, pero si el campo eléctrico va cambiando las cargas internas de las células formarán un dipolo y hará que la parte positiva de la célula se mueva hacia el polo negativo del electrodo y así las células se van alineándose formando una cadena de manera que la parte positiva de una célula se una con la negativa de otra.

b. El segundo paso es aplicar un campo eléctrico más fuerte para que las membranas formen poros y se puedan abrir para fusionarse. Este pulso es parecido al de la transfección, en este caso las membranas de células adyacentes al estar ambas abiertas se pueden unir y se fusionan.

c. Este tercer paso se trata de aplicar un campo eléctrico débil y cambiante para mantener las células alineadas y de tiempo para que maduren y se unan los citoplasmas.

d. En el cuarto paso es después de la maduración de la unión de las membranas las células se cultivan para promover su viabilidad y su crecimiento.

• Escreening y amplificación del hibridoma

- Las IgG producidas por los hibridomas se testan contra el antígeno deseado.

- Las colonias positivas se expanden y se testan otra vez contra el antígeno.

- En este punto también podemos testar otros antígenos u otras regiones de nuestro antígeno para ver posibles reacciones cruzadas que nos puedan interferir en nuestro ensayo final.

Por ejemplo las técnicas para testar los IgG pueden ser Elisa, western blot e inmunofluorescencia.

Esta fase puede durar aproximadamente 5-7 semanas.

• Clonación e isotipado

Los hibridomas específicos seleccionados se clonan por dilución limitada, es decir diluimos los pocillos que nos han dado positivos en la fase anterior y volvemos a sembrar, para que en cada pocillo solo quede un clon. Para seleccionar el clon de interés podemos hacer el escreening como en la fase 3, primero contra el antígeno

utilizado en la inmunización y posteriormente los positivos contra otros antígenos.

Una vez seleccionado el clon, a continuación vemos la subclase de cada uno de los monoclonales por un test de Elisa.

• Fase 5: Producción de monoclonal

En esta fase es cuando obtenemos nuestro anticuerpo monoclonal en grandes cantidades, se puede realizar de dos maneras diferentes:

1. Inmunización de ratones. 2. Cultivo celular.

1. Inmunización de ratones:

Se trata de inyectar el hibridoma en la zona peritoneal del ratón para que produzca anticuerpos del hibridoma introducido, de manera natural. Al cabo de 10-15 días podemos extraer el medio ascítico del ratón y purificar el anticuerpo. Aproximadamente podemos obtener unos 5-10 ml de fluido por cada uno de los ratones inmunizados.

2. Cultivo celular

Este es un sistema In Vitro donde no utilizamos animales para producir nuestros anticuerpos monoclonal.

Cultivamos nuestro hibridoma seleccionado en un frasco de cultivo con los nutrientes adecuados, de esta forma los hibridomas expresan el anticuerpo monoclonal al medio de cultivo donde lo recogeremos y purificaremos. Los anticuerpos los recogeremos cada 5-7 días y cambiaremos el medio para aportar nuevos nutrientes.

Otro tipo de producción In Vitro es con un sistema en continuo de nuestros hibridomas y el medio de cultivo. Se usa la tecnología de “Holow -Fibre”, los hibridomas se colocan en un birreactor que contiene las “Holow -Fibre” a través de las cuales circula el medio de cultivo fresco, los capilares de la “Holow -Fibre” son porosos y a través de ellos pueden pasar los nutrientes a las células y los metabolitos de las células pasan al interior de las fibras para ser eliminados, los anticuerpos secretados y las células no pueden pasar al interior de la fibra debido a su tamaño. Los parámetros de cultivo como puede ser el nivel de oxígeno y PH se pueden regular externamente. De esta manera podemos producir anticuerpos de forma continua ya que también los podemos extraer de forma continua, de manera que alargamos el tiempo de cultivo y también el rendimiento en la producción de anticuerpos monoclonales. Al ser un sistema cerrado nos aseguramos que la probable contaminación del cultivo sea mínima.

La última innovación en bioreactores a pequeña escala son los llamados “Celline”

En una cámara intermedia colocamos el hibridoma para que produzca el anticuerpo monoclonal, en la cámara superior tenemos el medio de cultivo y esta dos están en contacto a través de una membrana con un tamaño de poro de 10.000 KDa a través de la cual se produce el intercambio de nutrientes y metabolitos. En una cámara inferior encontramos un espacio vacío por donde entrará el oxígeno y el CO2 que nos proporcionará el intercambio gaseoso con los hibridomas a través de una membrana de silicona.

A nivel industrial podemos producir nuestro anticuerpo monoclonal para tener un gran cantidad utilizando bioreactores, en los cuales pondremos los hibirdomas en la superficie de partículas porosas que están en suspensión. A estas partículas se les adhieren los hibridomas en los poros, y debido a su gran superficie nos permite tener un gran número de células  en cultivo, unido a la gran capacidad de los bioreactores, podemos producir monoclonales en cantidades importantes. También podemos hacer pequeñas producciones en el laboratorio con partículas en suspensión con los llamados “Cellspin”, un sistema de agitación para mantener las partículas en suspensión y producir nuestro anticuerpo a escala media.

También podemos utilizar frascos rodantes a nivel industrial o laboratorio. Las células se adhieren a la superficie del plástico y al rodar el frasco las células van adquiriendo los nutrientes necesarios para producir y liberar los monoclonales.