GENES TIPO MYB DE Carica papaya EN CONDICIONES DE … · Alcocer, quienes me han formado a lo largo...

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias Biológicas

GENES TIPO MYB DE Carica papaya EN

CONDICIONES DE ESTRÉS ABIÓTICO Y EFECTO

DE SU SOBREEXPRESIÓN EN LA ACUMULACIÓN

DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Tesis que presenta

JORGE LUIS ESPADAS ALCOCER

En opción al título de

DOCTOR EN CIENCIAS

(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)

Mérida, Yucatán, México

2019

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó

para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de

Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en

contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados,

dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de

la Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de

Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de

igual manera los productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o

pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le pertenecen

patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y en el

mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o

desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo

dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad

Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.

___________________________

Jorge Luis Espadas Alcocer

Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Biotecnología del Centro de

Investigación Científica de Yucatán, y forma parte del proyecto de Ciencia Básica

Conacyt 2010-I (CB-2010-01) que lleva por nombre “Factores de transcripción de

papaya (Carica papaya) como una plataforma molecular para mejorar su

tolerancia a estreses bióticos y abióticos”, con número 155356, bajo la dirección

del Dr. Luis Carlos Rodríguez Zapata.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por la beca otorgada

(No. 391831) en apoyo a mis estudios de doctorado y a la beca de movilidad de la

convocatoria Becas Mixtas 2017 Movilidad en el Extranjero (No. 291212) otorgada

durante mi estancia en la Universidad de Alcalá. Agradezco los apoyos otorgados

a través del proyecto de Ciencia Básica 2010-I (CB-2010-01) que lleva por nombre

“Factores de transcripción de papaya (Carica papaya) como una plataforma

molecular para mejorar su tolerancia a estreses bióticos y abióticos” con número

155356.

Un especial agradecimiento al Dr. Luis Carlos Rodríguez, por su apoyo, paciencia

y por brindarme todos los recursos necesarios para realizar este proyecto y

concluir mi posgrado.

A la Universidad de Alcalá, por la estancia en el laboratorio 2L3 del Departamento

de Química Analítica, Química Física e Ingeniería Química durante el periodo

mayo-julio de 2017 y a las doctoras Merichel Plaza del Moral y María Luisa Marina

Alegre, por su asesoría durante la estancia.

A la Comunidad de Madrid (España) y Europa, por el apoyo financiero del

programa FEDER (proyecto S2013 / ABI-3028, AVANSECAL-CM).

A la Dra. Rocío de Lourdes Borges Argáez, al Dr. Lenin Sánchez Calderón, al Dr.

Luis Carlos Rodríguez Zapata y al Dr. Enrique Castaño de la Serna, por haber

formado parte de mi comité tutorial.

A la Dra. Blondy Beatriz Canto Canché, a la Dra. Rocío de Lourdes Borges Argáez,

al Dr. Lenin Sánchez Calderón y al Dr. Enrique Castaño de la Serna, por haber

formado parte de mi comité de examen predoctoral.

A la Dra. Rocío de Lourdes Borges Argáez, al Dr. Lenin Sánchez Calderón, al Dr.

Luis Carlos Rodríguez, a la Dra. Ana Li Arroyo Herrera, a la Dra. María Marcela

Gamboa Angulo y al Dr. Enrique Castaño de la Serna, por haber formado parte de

mi comité de revisión de tesis.

A la Dra. Rocío de Lourdes Borges Argáez, por permitirme realizar diferentes

análisis cromatográficos en su laboratorio. También agradezco a la técnica en el

equipo HPLC Q.B.B. Mirbella del Rosario Cáceres Farfán, por su asesoría.

Al M. en C. Francisco Espadas y Gil, por su apoyo durante la capacitación para la

realización de análisis fisiológicos.

También estoy muy agradecido con mis compañeros de laboratorio por todo el

apoyo que me proporcionaron y su sincera amistad: Q.F.B. Miguel Ángel Keb

Llanes, Dr. Alejandro Pereira Santana, M. en C. Samuel David Gamboa Túz,

Biólogo Francisco Antonio Reyes Soria, M. en C. Evelyn Carrillo Bermejo, Ing.

Bioquímica Carolina Abigail Sulu Uc, M. en C. Sandi Julissa Reyes Hernández, M.

en C. Jesús Alejandro Zamora Briseño.

DEDICATORIAS

En general, dedico este trabajo a la humanidad, particularmente a las buenas

personas que se preocupan por el bienestar de todos. Ejemplos de esas buenas

personas son mis padres, Rita Otilia Alcocer Valladares y Carlos Ignacio Espadas

Alcocer, quienes me han formado a lo largo de toda mi vida y a quienes les estaré

eternamente agradecido. Otros excelentes ejemplos son mis hermanos, Carlos

Paúl Espadas Alcocer, María José Espadas Alcocer y María Guadalupe Espadas

Alcocer, con quienes compartí una hermosa infancia y me han brindado todo su

amor y cariño.

ÍNDICE

i

ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ v

ÍNDICE DE CUADROS ...................................................................................................... xi

RESUMEN ......................................................................................................................... 1

ABSTRACT ....................................................................................................................... 3

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 5

CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 7

1.1 ANTECEDENTES ............................................................................................... 7

1.1.1 Factores de trascripción ............................................................................ 7

1.1.2 Los factores de transcripción MYB ........................................................... 8

1.1.3 Estrés abiótico .......................................................................................... 11

1.1.4 Metabolismo .............................................................................................. 12

1.1.5 Compuestos fenólicos ............................................................................. 15

1.1.6 Relación entre los factores de transcripción MYB y el estrés abiótico en

plantas 18

1.1.7 Relación entre los factores de transcripción MYB y la síntesis de

compuestos fenólicos ............................................................................................ 20

1.1.8 Relación entre el metabolismo secundario, estrés abiótico y los

factores de transcripción MYB en plantas ............................................................ 22

1.1.9 Carica papaya y Nicotiana tabacum como fuentes de metabolitos

secundarios ............................................................................................................ 24

JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................... 28

OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 29

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 29

HIPÓTESIS .................................................................................................................. 30

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................................. 31

CAPÍTULO II ................................................................................................................... 33

ANÁLISIS IN SILICO Y EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES CpMYBs EN TEJIDOS

DE PAPAYA SOMETIDOS A ESTRÉS SALINO Y POR SEQUÍA .................................. 33

2.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 33

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 37

2.2.1 Analisis in silico de genes MYBs en C. papaya ........................................... 37

ÍNDICE

ii

2.2.2 Aplicación de los tratamientos de estrés abiótico para PCR de punto final . 38

2.2.3 Expresión diferencial de genes CpMYBs por PCR de punto final ............... 39

2.2.4 Aplicación de los tratamientos de estrés abiótico para PCR de punto final . 41

2.2.5 Expresión diferencial de genes CpMYBs por PCR en tiempo real .............. 42

2.2.6 Análisis estadístico ..................................................................................... 45

2.3 RESULTADOS .................................................................................................. 46

2.3.1 Análisis in silico de genes MYBs de C. papaya ........................................... 46

2.3.2 Expresión diferencial por PCR de punto final o semicuantitativa................. 51

2.3.3 Expresión diferencial de genes CpMYBs por PCR en tiempo real .............. 60

2.4 DISCUSIÓN ....................................................................................................... 74

CAPÍTULO III .................................................................................................................. 77

GENERACIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE N. tabacum CON

SOBREEXPRESIÓN DE LOS GENES CpMYBs ............................................................ 77

3.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 77

3.2 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 79

3.2.1 Generación de vectores binarios mediante el sistema Gateway® Cloning

Technology ............................................................................................................... 79

3.2.2 Generación de cepas de Agrobacterium tumefaciens que contengan los

vectores binarios generados ..................................................................................... 82

3.2.3 Generación de plantas transgénicas de tabaco .......................................... 82

3.2.4 Selección de plantas transgénicas positivas ............................................... 85

3.2.5 Localización de las proteínas CpMYBs en tejidos de plantas transgénicas de

tabaco 86

3.3 RESULTADOS .................................................................................................. 88

3.3.1 Generación de plantas transgénicas de tabaco con sobreexpresión de los

genes CpMYB4 y CpMYB44 ..................................................................................... 88

3.3.2 Ubicación de los CpMYBs en tejidos de plantas transgénicas positivas ..... 98

3.4 DISCUSIÓN ....................................................................................................... 99

CAPÍTULO IV ................................................................................................................ 101

ANÁLISIS DE PERFILES CROMATOGRÁFICOS OBTENIDOS POR HPLC DE

EXTRACTOS DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE TABACO SOBREEXPRESANTES

DE LOS GENES CpMYBs EN CONDICIONES DE ESTRÉS POR SEQUÍA ................ 101

ÍNDICE

iii

4.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 101

4.2 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 104

4.2.1 Reactivos y equipos .................................................................................. 104

4.2.2 Material vegetal ........................................................................................ 104

4.2.3 Estrés por sequía ..................................................................................... 105

4.2.4 Ensayo de capacidad antioxidante equivalente a Trolox (TEAC) .............. 105

4.2.5 Proceso de extracción de compuestos fenólicos ...................................... 105

4.2.6 Preparación de estándares de compuestos fenólicos ............................... 106

4.2.7 Análisis de compuestos fenólicos por HPLC-DAD .................................... 106

4.2.8 Análisis estadístico ................................................................................... 107

4.3 RESULTADOS ................................................................................................ 108

4.3.1 Experimento de estrés por sequía ............................................................ 108

4.3.2 Análisis cromatográficos por HPLC-DAD de extractos de hojas de N.

tabacum 110

4.3.3 Capacidad antioxidante de extractos de hojas de N. tabacum .................. 121

4.4 DISCUSIÓN ..................................................................................................... 123

CAPITULO V ................................................................................................................. 125

PHENOLIC COMPOUNDS INCREASE THEIR CONCENTRATION IN Carica papaya

LEAVES UNDER DROUGHT STRESS ......................................................................... 125

5.1 RESUMEN....................................................................................................... 125

5.2 INTRODUCTION ............................................................................................. 126

5.3 MATERIALS AND METHODS ........................................................................ 128

5.3.1 Chemical and reagents ............................................................................. 128

5.3.2 Plant material ............................................................................................ 128

5.3.3 Relative water content and osmotic potential ............................................ 129

5.3.4 Photosynthesis and transpiration rate ....................................................... 129

5.3.5 Proline quantification ................................................................................ 129

5.3.6 Scanning electron microscopy .................................................................. 129

5.3.7 Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds ............................ 130

5.3.8 DPPH radical scavenging assay ............................................................... 131

5.3.9 Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay ............................... 131

5.3.10 Analysis of phenolic compounds by HPLC-DAD ................................... 131

ÍNDICE

iv

5.3.11 Identification of phenolic compounds by HPLC-ESI-QTOF-MS ............. 132

5.3.12 Statistical analysis ................................................................................. 133

5.4 RESULTS AND DISCUSSION ........................................................................ 134

5.4.1 Drought stress characterization: net photosynthetic rate, transpiration rate,

and proline content .................................................................................................. 134

5.4.2 Extraction of phenolic compounds and antioxidant capacity .................... 137

5.4.3 Characterization of phenolic compounds from papaya leaves extracts.... 139

5.4.4 Identification of phenolic compounds by HPLC-ESI-QTOF-MS ................. 141

5.5 SUPPORTING INFORMATION ....................................................................... 151

CAPÍTULO VI ................................................................................................................ 159

6.1 CONCLUSIONES Y PERPECTIVAS............................................................... 159

6.1.1 CONCLUSIONES ..................................................................................... 159

6.1.2 PERSPECTIVAS ...................................................................................... 160

ANEXOS ....................................................................................................................... 163

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 169

ÍNDICE DE FIGURAS

v

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 Tipos de factores de transcripción MYB en plantas ........................................... 9

Figura 1.2 Estructura principal de una molécula flavonoide ............................................. 17

Figura 1.3 Cuantificación de compuestos fenólicos, flavonoles y antocianinas en plantas

mutantes de los genes AtMYB7 y AtMYB4. ..................................................................... 23

Figura 1.4 Fenotipos de plantas de A. thaliana en condiciones de riego estrés por sequía y

estrés por salinidad .......................................................................................................... 24

Figura 1.5 Estrategia experimental general para la caracterización de genes CpMYBs en

tejidos de C. papaya sometidos a estrés salino y por sequía. .......................................... 31

Figura 2.1 Fases y componentes de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo

real .................................................................................................................................. 35

Figura 2.2 Alineamientos se secuencias de aminoácidos de los CpMYB1, 4, 12 y 44

putativos.. ........................................................................................................................ 48

Figura 2.3 Análisis de dominios R2 y R3 de los CpMYBs putativos. ................................ 49

Figura 2.4 Árbol filogenético de secuencias de aminoácidos de CpMYBs putativos y MYBs

identificados en A. thaliana.. ............................................................................................ 51

Figura 2.5 Crecimiento de plantas de papaya en medio sólido. Tratamiento de estrés

salino en medio líquido .................................................................................................... 52

Figura 2.6 Contenido de prolina en hojas de papaya durante el tratamiento de estrés por

salinidad. ......................................................................................................................... 52

Figura 2.7 Crecimiento de plantas de papaya en medio sólido y tratamiento de estrés por

sequía en medio Sunshine .............................................................................................. 53


salinidad. ......................................................................................................................... 54

Figura 2.9 A) ARN total de tejidos de hoja y raíz sometidos a estrés salino. B) ADNc de

tejidos de hoja y raíz sometidos a estrés salino. .............................................................. 55

Figura 2.10 A) ARN total de tejidos de hoja y raíz sometidos a estrés por sequía. B) ADNc

de tejidos de hoja y raíz sometidos a estrés por sequía. .................................................. 56

Figura 2.11 Expresión diferencial de los genes CpMYBs en tejidos de papaya sometidos a

estés salino. ..................................................................................................................... 57

ÍNDICE DE FIGURAS

vi

Figura 2.12 Expresión diferencial de los genes CpMYBs en tejido de hoja de papaya

sometidos a estés por sequía. ......................................................................................... 57

Figura 2.13 Corroboración de las secuencias nucleotídicas de la predicción del gen

CpMYB4 y del gen aislado secuenciado .......................................................................... 58

Figura 2.14 Corroboración de las secuencias nucleotídicas de la predicción del gen

CpMYB44 y del gen aislado secuenciado ........................................................................ 59

Figura 2.15 Corroboración de las secuencias de aminoácidos de la predicción del

CpMYB4 y del gen aislado secuenciado .......................................................................... 60

Figura 2.16 Corroboración de las secuencias de aminoácidos de la predicción del

CpMYB44 y del gen aislado secuenciado ........................................................................ 60

Figura 2.17 Validación del gen TBPI. ............................................................................... 62

Figura 2.18 Validación del gen CpMYB44. ....................................................................... 63

Figura 2.19 Validación del gen CpMYB4.......................................................................... 64

Figura 2.20 Tratamiento de estrés salino en medio líquido. ............................................. 65


salinidad. ......................................................................................................................... 65

Figura 2.22 Tasa fotosintética de plantas de papaya estrés por salindad en medio líquido

........................................................................................................................................ 66

Figura 2.23 Efecto del estrés por sequía en fenotipos de plantas de papaya ................... 67


sequía. ............................................................................................................................. 67

Figura 2.25 Tasa fotosintética de plantas de papaya estrés por sequía. .......................... 68

Figura 2.26 ARN total de tejidos de hoja y raíz sometidos a estrés por sequía. ............... 68

Figura 2.27 ARN total de tejido de hoja sometidos a estrés por sequía.. ......................... 69

Figura 2.28 Expresión relativa de los genes CpMYB44 y CpMYB4 en tejidos de hojas

sometidos a estrés por sequía o salinidad. ...................................................................... 73

Figura 3.1 Vector pDonrTM221.......................................................................................... 80

Figura 3.2 Vector pK7FWG2.0. ........................................................................................ 81

Figura 3.3 Amplificación del gen CpMYB4, amplificación del gen CpMYB44, células de A.

thumefaciens EHA105 empleadas como vector de clonación de plásmidos. ................... 89

Figura 3.4 Proceso de generación de plantas transgénicas de tabaco. ........................... 89

ÍNDICE DE FIGURAS

vii

Figura 3.5 Análisis por PCR del gen NPTII en muestras de ADNg de plantas transgénicas

de tabaco con sobreexpresión del gen CpMYB44. .......................................................... 90

Figura 3.6 Análisis por PCR del gen CpMYB44 en muestras de ADNg de plantas

transgénicas de tabaco con sobreexpresión del gen CpMYB44. ..................................... 90

Figura 3.7 Análisis por PCR de los genes NPTII y CpMYB4 en muestras de ADNg de

plantas transgénicas de tabaco con sobreexpresión del gen CpMYB4. ........................... 91

Figura 3.8 Análisis por PCR del gen NPTII en muestras de ADNg de plantas transgénicas

de tabaco con sobreexpresión del gen CpMYB4. ............................................................ 91


transgénicas de tabaco con sobreexpresión del gen CpMYB4. ....................................... 92

Figura 3.10 Selección de plantas T1 de las líneas 1 a 7 del gen CpMYB44 en medio de

selección con kanamicina. ............................................................................................... 92

Figura 3.11 Selección de plantas T1 de las líneas 1, 2, 4, 5, 7, 9 y 14 del gen CpMYB4 en

medio de selección con kanamicina. ................................................................................ 93

Figura 3.12 Selección de plantas T2 de las líneas CpMYB4.2.7 y CpMYB4.4.7 del gen

CpMYB4 en medio de selección con kanamicina. ............................................................ 94


CpMYB4 en medio de selección con kanamicina.. ........................................................... 94


CpMYB4 en medio de selección con kanamicina.. ........................................................... 95

Figura 3.15 Selección de plantas T2 de las líneas CpMYB44.6.7y CpMYB4.7.2del gen

CpMYB44 en medio de selección con kanamicina. .......................................................... 95

Figura 3.16 Selección de plantas T2 de la línea CpMYB44.5.3 del gen CpMYB44 en

medio de selección con kanamicina. ................................................................................ 96

Figura 3.17 Crecimiento de plantas T2 de diferentes líneas de los genes CpMYB4 y

CpMYB44 para análisis cromatográficos posteriores. ...................................................... 97


transgénicas de tabaco de la línea T2 4.4.7.2. ................................................................. 97


transgénicas de tabaco de la línea T2 44.6.7.2. ............................................................... 97

Figura 3.20 Localización de las proteínas CpMYBs en tejidos de plantas de tabaco. ...... 98

ÍNDICE DE FIGURAS

viii

Figura 4.1 Fenotipos de plantas de tabaco sometidas a diferentes condiciones de

crecimiento: control, 12 días con riego y 12 días sin riego ............................................. 109

Figura 4.2 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco silvestre en

condiciones control extraídos con 100% metanol .......................................................... 110

Figura 4.3 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco extraídos con metanol

acuoso 70% (v/v). .......................................................................................................... 111

Figura 4.4 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco sometidas a 10 min

de sonicación extraídos con 100% metanol y metanol acuoso 70% (v/v).. ..................... 112

Figura 4.5 Perfil cromatográfico de una mezcla de los cinco estándares seleccionados

analizados a 280 y 350 nm ............................................................................................ 113

Figura 4.6 Perfiles cromatográficos de una mezcla de los cinco estándares seleccionados

y una muestra de extractos de hojas de tabaco sometidas a 10 min de sonicación

extraídos con 100% metanol, una mezcla de los cinco estándares seleccionados y una

muestra de extractos de hojas de tabaco sometidas a 10 min de sonicación extraídos con

100% metanol analizados a 280. ................................................................................... 114

Figura 4.7 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco silvestres en

diferentes condiciones de estrés analizados a 280 y 350 nm.. ....................................... 115

Figura 4.8 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco de la línea T2

CpMYB44 44.6.7.2 en diferentes condiciones de estrés analizados a 280 y 350 nm. .... 116


CpMYB4 4.4.7.2 en diferentes condiciones de estrés analizados a 280 y 350 nm. ........ 117

Figura 4.10 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco en condiciones

control en el día inicial analizados a 280 y 350 nm ........................................................ 118


control en el día inicial analizados a 280 y 350 nm. ....................................................... 119

Figura 4.12 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco plantas en

condiciones de sequía en el día final analizados a 280 y 350 nm. ................................. 120

Figura 4.13 Capacidad antioxidante equivalente a trolox de extractos de hojas de plantas

tabaco bajo tratamiento de estrés por sequía. ............................................................... 122

Figure 5.1 Effect of drought stress on C. papaya plants phenotypes .............................. 134

Figure 5.2 Physiological effects of drought stress in C. papaya plants. .......................... 136

Figure 5.3 Scanning electron micrographs of the abaxial surface of leaves ................... 137

ÍNDICE DE FIGURAS

ix

Figure 5.4 The DPPH· free radical scavenging capacity and trolox equivalent antioxidant

capacity· of extracts from leaves of C. papaya plants under drought stress treatment. ... 139

Figure S.1 Chromatographic profiles at 280 nm of compounds detected in extracts of

papaya leaves……………………………………………………………………………………151

Figure S.2 Chromatographic profiles at 350 nm of compounds detected in extracts of

papaya leaves................................................................................................................ 151

Figure S.3 Peak areas at 280 nm of compounds detected in extracts of papaya leaves. 152

Figure S.4 Peak areas at 350 nm of compounds detected in extracts of papaya leaves. 153

ÍNDICE DE CUADROS

xi

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1.1 Ejemplos de factores de trascripción MYBs que participan en los mecanismos

de respuestas estrés abiótico en A. thaliana. ................................................................... 19

Cuadro 1.2 Genes o proteínas MYB involucrados con la producción de metabolitos

secundarios en los mecanismos de respuestas estrés abiótico en plantas. ..................... 20

Cuadro 1.3 Ejemplos de genes/proteínas MYB que participan en la biosíntesis de

flavonoides y ligninas en A. thaliana ................................................................................ 21

Cuadro 1.4 Usos medicinales de la Carica papaya. ......................................................... 26

Cuadro 1.5 Compuestos presentes en extractos de hojas de papaya identificados

empleando UPLC-ESI-MS en modo de ionización negativa............................................. 27

Cuadro 2.1 Condiciones de PCR semicuantitativas de punto final empleadas. ................ 40

Cuadro 2.2 Reactivos empleados en las reacciones de qPCR: ....................................... 43

Cuadro 2.3 Condiciones de PCR cuantitativas empleadas. ............................................. 44

Cuadro 2.4 Pares de oligos empleados para los análisis por qPCR. ................................ 44

Cuadro 2.5 Números de accesos de genes MYBs. .......................................................... 46

Cuadro 2.6 Ortólogos de MYBs en el proteoma de C. papaya. ........................................ 47

Cuadro 2.7 MYBs candidatos con funciones conocidas y sus respectivos ortólogos de C.

papaya. ............................................................................................................................ 47

Cuadro 2.8 Pares de oligos para genes CpMYBs. ........................................................... 51

Cuadro 2.9 Datos de la validación del gen TBPI. ............................................................. 61

Cuadro 2.10 Datos de la validación del gen CpMYB44. ................................................... 62

Cuadro 2.11 Datos de la validación del gen CpMYB4. ..................................................... 63

Cuadro 2.12 Valores de CTs promedio del gen TBPI en las muestras de hoja sometidas a

estrés por sequía. ............................................................................................................ 69

Cuadro 2.13 Valores de CTs promedio del gen TBPI en las muestras de hoja y raíz

sometidas a estrés por salinidad. ..................................................................................... 70

Cuadro 2.14 Valores de CTs promedio del gen CpMYB44 en las muestras de hoja

sometidas a estrés por sequía. ........................................................................................ 70

Cuadro 2.15 Valores de CTs promedio del gen CpMYB44 en las muestras de hoja y raíz


ÍNDICE DE CUADROS

xii

Cuadro 2.16 Valores de CTs promedio del gen CpMYB4 en las muestras de hoja

sometidas a estrés por sequía. ........................................................................................ 71

Cuadro 2.17 Valores de CTs promedio del gen CpMYB4 las muestras de hoja y raíz


Cuadro 3.1 Componentes del medio de precultivo. .......................................................... 84

Cuadro 3.2 Componentes del medio de cocultivo. ........................................................... 84

Cuadro 3.3 Componentes del medio de selección. .......................................................... 85

Cuadro 3.4 Componentes del medio de enraizamiento. ................................................... 85

Cuadro 3.5 Pares de oligos con adaptadores Gateway para los genes CpMYBs. ........... 88

Table 5.1 List of tentatively identified compounds from papaya leaf extracts by HPLC-

DAD-QTOF-MS and -MS/MS analysis and changes in their respective areas detected in

chromatographic profiles from different treatments………………………………………….146

Table S.1 List of peaks of chromatographic profiles at 280 and 350 nm of peaks detected

in extracts of papaya leaves…..………………………………………………….……………154

RESUMEN

1

RESUMEN

Los extractos obtenidos de tejidos de hojas de Carica papaya poseen diversas actividades

biológicas las cuales parecen estar vinculadas con el contenido de compuestos fenólicos.

Diferentes estudios demuestran diversas funciones que tienen los factores de

transcripción tipo MYB en la regulación molecular de los mecanismos de respuesta ante

un estrés abiótico mediante la generación de compuestos fenólicos que actúan como

antioxidantes naturales. En la actualidad se ha logrado la separación e identificación de

distintos compuestos fenólicos en los tejidos de C. papaya mediante diferentes tipos de

técnicas cromatográficas, pero aún se desconocen los elementos de señalización que

participan en la síntesis de estos compuestos, así como su posible participación en los

mecanismos de respuesta antioxidante ante un estrés abiótico. Con la presente

investigación se pretendió llevar a cabo la caracterización, a nivel molecular, de genes

que codifican para factores de transcripción tipo MYB obtenidos de tejidos de C. papaya

sometidos a diferentes condiciones de estrés abiótico. Así también, ser realizó un análisis

de perfiles cromatográficos de extractos de tejidos de plantas de papaya y de plantas

transgénicas de Nicotiana tabacum con sobreexpresión de estos genes sometidas a

diferentes condiciones de estrés abiótico.

Los resultados obtenidos permitieron la elucidación de las posibles funciones de los

factores de transcripción tipo MYB de C. papaya caracterizados y su posible participación

indirecta en los mecanismos de respuesta de la planta ante condiciones de estrés abiótico

por sequía por medio de un escrutinio de los perfiles cromatográficos de extractos de

hojas y de los cambios en los niveles de expresión de estos genes. Sin embargo, debido a

la carencia de cambios en la tolerancia al estrés por sequía o de los perfiles

cromatográficos de plantas de tabaco sobreexpresantes de los genes CpMYBs no existen

evidencias sólidas de que los factores de transcripción CpMYB caracterizados en este

estudio participen en posibles mecanismos de generación de compuestos fenólicos como

mecanismo de respuesta ante un estrés abiótico por sequía.

ABSTRACT

3

ABSTRACT

The extracts obtained from Carica papaya leaf tissues possess diverse biological activities

which seem to be linked to the content of phenolic compounds. Different studies show

diverse functions that the MYB transcription factors have in the molecular regulation of the

response mechanisms to an abiotic stress by means of the generation of phenolic

compounds that act as natural antioxidants. At present the separation and identification of

different phenolic compounds in the tissues of C. papaya has been achieved through

different types of chromatographic techniques, but it is still unknown the signaling

elements that participate in the synthesis of these compounds as well as their possible

participation in the mechanisms of antioxidant response to abiotic stress. The aim of the

present investigation was to carry out the characterization, at the molecular level, of genes

that code for MYB type transcription factors obtained from C. papaya tissues subjected to

different conditions of abiotic stress. Also, an analysis of chromatographic profiles of tissue

extracts of papaya plants and transgenic plants of Nicotiana tabacum with overexpression

of these genes subjected to different abiotic stress conditions was performed.

The results obtained allowed the elucidation of the possible functions of the MYB type

transcription factors of C. papaya characterized and their possible indirect participation in

the response mechanisms of the plant before conditions of abiotic stress due to drought by

means of a scrutiny of the profiles chromatographic extracts of leaves and changes in the

expression levels of these genes. However, due to the lack of changes in tolerance to

drought stress or the chromatographic profiles of tobacco plants overexpressing the

CpMYBs genes, there is no solid evidence that the CpMYB transcription factors

characterized in this study participate in possible mechanisms of generation of phenolic

compounds as a response mechanism to abiotic stress due to drought.

INTRODUCCIÓN

5

INTRODUCCIÓN

Los factores de transcripción (FTs) son proteínas que afectan la tasa de transcripción por

interacciones específicas con el ADN y/o otras proteínas (Luque-Cabrera y Herráez-

Sánchez, 2001). Los factores de transcripción MYB pertenecen a la familia del tipo hélice-

giro-hélice y se dividen en diferentes clases dependiendo del número de repeticiones

adyacentes. En plantas, la familia predominante de proteínas MYB poseen dos

repeticiones del dominio MYB (R2R3-MYB) (Jiang et al., 2004; Rosinski y Atchley, 1998).

Numerosas proteínas R2R3-MYB han sido caracterizadas en diferentes investigaciones y

se ha demostrado que se encuentran involucradas en procesos específicos de respuesta

en plantas: metabolismo primario y secundario, destino e identidad celular, procesos de

desarrollo y respuesta a estreses bióticos y abióticos (Dubos et al., 2010). Muchos genes

y proteínas son regulados bajo estreses abióticos, de los cuales los factores de

transcripción son indispensables. La familia de factores de transcripción MYB ha

demostrado ser esencial como parte de los mecanismos de respuesta de las plantas ante

estreses abióticos.

Los campos de cultivo de plantas de interés comercial están expuestos a diversos tipos

de estrés abiótico, tales como altas o bajas temperaturas, salinidad y sequía. El estrés

abiótico por sequía es el problema más serio para la agricultura global ya que afecta

alrededor del 40% de la superficie terrestre mundial (Ashraf et al., 2012). Adicionalmente,

el estrés abiótico por salinidad afecta alrededor del 7% de la superficie terrestre mundial

(Munns y Tester, 2008; Rozema y Flowers, 2008). Las plantas en diferentes condiciones

de estrés presentan aumentos significativos en las concentraciones de compuestos

fenólicos los cuales actúan como antioxidantes naturales (Król et al., 2014; Tsao y Yang,

2003). La producción de estos metabolitos es regulada por diferentes elementos tales

como los factores de transcripción MYB (Dubos et al., 2010). A la fecha existen diversos

estudios que demuestran la participación de los factores de transcripción MYB en los

mecanismos de respuesta de las plantas ante diversas condiciones de estrés abiótico

mediante la generación de metabolitos secundarios (Fornalé et al., 2014; Nakabayashi et

al., 2014; Cheng et al., 2013; Jin et al., 2000a).

INTRODUCCIÓN

6

Se sabe que casi todos los tejidos de la planta de C. papaya, una planta de alto interés

comercial, poseen propiedades medicinales (Mueller y Mechler, 2005). A la fecha se han

caracterizado diferentes tipos de compuestos fenólicos en extractos de hojas de papaya,

los cuales parecen conformar parte de un sistema de respuesta ante diferentes

condiciones de estrés ( Gogna et al., 2015; Canini et al., 2007). Sin embargo, aún se

deconocen gran parte de los mecanismos moleculares que regulan la producción de

compuestos fenólicos en los tejidos de papaya. Algunos de los posibles reguladores de

estos mecanismos pueden ser factores de transcripción del tipo MYB, de los cuales aún

no existen reportes que evidencien su existencia o funciones. Por otra parte, la planta de

tabaco (Nicotiana tabacum) es otra planta modelo ideal para el estudio de procesos

biológicos (Zhang et al., 2011) con la cual es posible la caracterización de la funcionalidad

de los genes exógenos insertados en su genoma (Campbell et al., 2007). La planta de

tabaco es un modelo ideal para el estudio de la funcionalidad de genes MYBs por medio

de su inserción y sobreexpresión mediante técnicas moleculares.

A pesar de que se han realizado distintos estudios de la diversidad de compuestos

fenólicos en diferentes tejidos de C. papaya, la mayoría de las investigaciones se enfocan

a la identificación de compuestos fenólicos y a sus actividades biológicas. A la fecha no se

han elaborado reportes acerca de las funciones que desempeñan los compuestos

fenólicos como parte de posibles mecanismos de defensa de la planta de papaya ante

estreses abióticos. En este estudio se realizó la caracterización de genes CpMYBs

aislados de tejidos de plantas de papaya sometidas a estrés abiótico. La caracterización

se realizó mediante la generación de plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan

los diferentes genes CpMYBs aislados las cuales fueron sometidas a condiciones de

estrés abiótico con la finalidad de observar los efectos que tiene la sobreexpresión de

estos genes MYB en su tolerancia al estrés, así como en la producción de compuestos

fenólicos. Los resultados obtenidos servirán como precedente para la facilitar la futura de

generación de plantas de interés comercial con mayor tolerancia al estrés ambiental y con

mejor valor nutrimental.

CAPÍTULO I

7

CAPÍTULO I

1.1 ANTECEDENTES

1.1.1 Factores de trascripción

Los factores de transcripción son proteínas que afectan la tasa de transcripción mediante

interacciones específicas con el ADN y/o otras proteínas. Los activadores y represores

transcripcionales tienen efectos positivos o negativos respectivamente, en la tasa de

trascripción. Los factores de transcripción pueden afectar el inicio de transcripción y/o

elongación del ARNm. Muchos factores de transcripción se unen a elementos de

regulación cis, reconociendo módulos que forman parte de los promotores o los

potenciadores. Los factores de transcripción se denominan también “factores que actúan

en trans” o “factores trans”, pues sus genes están en posición alejada y no relacionada

con aquella región cuya expresión regulan (Luque-Cabrera y Herráez-Sánchez, 2001).

Existen también diversos co-activadores, co-represores y otros cofactores que en vez de

interactuar directamente con el ADN interactúan con las proteínas de unión al ADN y

regulan los efectos de la transcripción. Algunos de estos cofactores tienen actividades

enzimáticas que les permiten modificar otros cofactores, polimerasas o histonas

(Semenza, 1998).

Los factores de transcripción que interactúan con la RNA polimerasa II son conocidos

como factores de transcripción de la clase II (TFII). Dependiendo del gen, la interacción se

lleva a cabo simultáneamente con un número considerable de ellos. Dependiendo del tipo

de secuencias o elementos promotores a los cuales se unen, los TFIIs se clasifican en

generales, proximales e inducibles (Luque-Cabrera y Herráez-Sánchez, 2001).

Los genomas de eucariontes poseen amplias familias de factores de transcripción. Los

factores de transcripción constituyen alrededor del 0.5 y 0.8% del contenido total de genes

en los genomas de eucariontes. El número total y la proporción de factores de

transcripción en un genoma aumentan de acuerdo a la complejidad del organismo. La

mayoría de los factores de transcripción eucarióticos reconocen secuencias de motivos de

ADN cortas y degeneradas, en contraste con los factores de transcripción de procariontes

que prefieren interaccionar con motivos largos (Hughes, 2010).

CAPÍTULO I

8

El reino Plantae está conformado por las divisiones Viridiplantae (plantas verdes),

Rhodophyta (algas rojas) y Glaucophyta (algas glaucofitas simples). La división

Viridiplante incluye a las plantas vasculares y no vasculares. En general, entre el 3 y 6%

de los genes de las plantas verdes codifican para factores de transcripción, mientras que

en las algas sólo del 0.5 al 2% de los genes codifican para factores de transcripción.

Muchas de las uniones de los factores de transcripción de plantas con regiones de ADN

se realizan por medio de láminas beta, contrastando con otros organismos eucariontes y

procariontes, donde la mayoría de las interacciones se realizan a través de hélices alfa.

Las familias de factores de transcripción más abundantes en plantas son los MYBs/SANT,

bHLH, bZIP, homeodominios, dedos de zinc C2H2, entre otros (Lang et al., 2010;

Yamasaki et al., 2008).

1.1.2 Los factores de transcripción MYB

Los factores de transcripción MYB pertenecen a la familia del tipo hélice-giro-hélice. El

primer gen MYB que se identificó fue el oncogen v-MYB del virus del mieloblastoma aviar

1. Desde entonces, se han identificado diversas proteínas con dominios MYB en los

protozoarios, los hongos, las algas, las plantas y los animales (Klempnauer et al., 1982).

El dominio MYB posee una región de unión al ADN de alrededor de 50-52 aminoácidos

que adopta una conformación hélice-giro-hélice (HTH) (Du et al., 2009; Romero et al.,

1998). Los factores de transcripción MYB contienen de una a cuatro repeticiones

imperfectas del dominio MYB en tándem localizadas cerca de la región N-terminal.

Basado en el número de repeticiones adyacentes en el dominio MYB, la familia MYB se

divide en cuatro clases: 4R-MYB (cuatro repeticiones), 3R-MYB MYB (tres repeticiones),

2R-MYB (dos repeticiones) y el 1-RMYB o MYB-R (relacionados a MYB) (solo un dominio).

Las tres repeticiones de la proteína MYB prototípica c-MYB se denominan R1, R2 y R3.

Las repeticiones de otras proteínas MYB se nombran de acuerdo con su similitud con las

repeticiones R1, R2 o R3 de c-MYB (Figura 1.1). Las cuatro clases se encuentran en

plantas, representando al taxón con la mayor diversidad de proteínas MYB. La clase más

pequeña es el grupo 4R-MYB, cuyos miembros contienen cuatro repeticiones similares a

CAPÍTULO I

9

R1/R2. La segunda clase contiene proteínas MYB (3R-MYB) de tipo R1R2R3, típicamente

codificadas por cinco genes en genomas de plantas superiores. Los genes que codifican

las proteínas 3R-MYB se han encontrado en la mayoría de los genomas eucariotas, por lo

que representan una clase de gen conservada con roles, aunque divergentes, en el

control del ciclo celular. La tercera clase heterogénea comprende proteínas con una

repetición de MYB única o parcial, designadas colectivamente como "relacionadas con

MYB" y que caen dentro de varias subclases (Dubos et al., 2010; Du et al., 2009; Haga et

al., 2007; Ito, 2005). En plantas, los integrantes de la familia predominante de proteínas

MYB poseen dos repeticiones del dominio MYB (R2R3-MYB) (Jiang et al., 2004; J A

Rosinski y Atchley, 1998) mientras que las proteínas MYB de animales poseen tres

repeticiones (R1R2R3-MYB) (Romero et al., 1998).

Figura 1.1 Tipos de factores de transcripción MYB en plantas

(Dubos et al., 2010).

El primer gen MYB aislado en plantas fue el gen COLORED 1 (C1) (c-MYB) el cual está

involucrado en la síntesis de antocianinas en la capa aleurona del maíz (Paz-Ares et al.,

1987). Se conocen alrededor de 204 MYBs en A. thaliana (Yanhui et al., 2006), 197 MYBs

en Populus thichocarpa (Wilkins et al., 2008), 279 MYBs en Vitis vinifera (Velasco et al.,

2007), 218 MYBs en arroz (Yanhui et al., 2006) y 157 MYBs en Zea mays (Du et al., 2012).

CAPÍTULO I

10

Los factores de trascripción R2R3-MYB de plantas se clasifican, con base a análisis

filogenéticos, en tres grupos los cuales son consistentes con la clasificación de la

especificad de unión al ADN: el grupo A incluye a MYBs con mayor parecido a c-MYB y

sin intrones, el grupo B contiene a MYBs codificados por genes con un intrón en la

posición conservada (3) y el grupo C contiene MYBs codificados por genes con un intrón

en la posición 2 (Romero et al., 1998).

Los factores de transcripción R2R3-MYB poseen una estructura modular conformada por

un dominio MYB de unión al ADN en la región N terminal y un dominio de activación o

represión usualmente localizada en la región C terminal. Con base en la conservación del

dominio de unión y diferentes motivos en la región C terminal, los R2R3-MYBs pueden

dividirse en 22 subgrupos (Stracke et al., 2001; Kranz et al., 1998). Varios de estos

subgrupos están presentes en los MYBs de A. thaliana; sin embargo existen subgrupos

en otras especies de plantas que no se encuentran presentes en el proteoma de A.

thaliana, probablemente estos subgrupos se formaron por proceso de especialización o

por divergencia (Wilkins et al., 2008).

Las segunda y tercera hélices de cada estructura HTH poseen cada una tres residuos

conservados de triptófano (o residuos hidrofóbicos) las cuales conforman el centro

hidrofóbico de la estructura tridimensional HTH. La tercera hélice, denominada “hélice de

reconocimiento”, de cada repetición se une directamente al surco mayor de la cadena de

ADN. La segunda hélice también interacciona con el ADN de manera menos específica

(Du et al., 2009; Ogata et al., 1994). En plantas, dos cisteínas en el dominio MYB de los

factores de transcripción R2R3-MYBs participan en el control de la unión al ADN el cual

depende del estado de oxido-reducción (redox). Bajo condiciones no reductoras, los

puentes de disulfuro entre las dos cisteínas previenen la unión del dominio MYB al ADN

(Heine et al., 2004). La unión de los factores de transcripción MYB al ADN se realiza por

medio de la interacción en conjunto de dos repeticiones HTH (Jia et al., 2004).

Las proteínas MYB interactúan con uno o más elementos cis inducidos por estrés

conocidos como sitios de unión MYB (MBS, por sus siglas en inglés). Estos motivos

contienen las secuencias consenso MBSI (CNGTT(A/G)) y MBSII [C(G/T)T(A/T)GTT(A/G)]

que sirven para la activación de genes “río abajo”. En plantas, la mayoría de los FTs

MYBs R2R3 interaccionan con el motivo MBSII. El grupo de FTs R2R3 MYBs que se unen

CAPÍTULO I

11

preferencialmente al motivo MBSI (grupo A) tienen un mayor valor de identidad de su

estructura primaria con los dominios de unión de ADN de la familia c-MYB (Romero et al.,

1998; Solano et al., 1995).

Las proteínas R2R3-MYB desempeñan diversas funciones biológicas en las plantas:

participan en el metabolismo primario y secundario, destino e identidad celular, procesos

de desarrollo y respuesta a diferentes tipos de estrés (Dubos et al., 2010).

1.1.3 Estrés abiótico

El estrés biológico se define como cualquier fuerza adversa o condición que interrumpe el

funcionamiento normal y bienestar de un sistema biológico (Shulaev et al., 2008). Los

episodios de estrés se clasifican en transitorios (aquellos de corta duración como las altas

temperaturas del medio día) y crónicos (aquellos de duración prolongada con las altas

concentraciones de Na+ en el suelo). El estrés durante las etapas de crecimiento

temprano disminuye la tasa de crecimiento afectando levemente el rendimiento de los

cultivos mientras que el estrés durante el desarrollo reproductivo puede

considerablemente disminuir su productividad (Bailey-Serres et al., 2012).

El estrés abiótico es la primera causa de pérdida de cultivos a nivel mundial, reduciendo la

producción de la mayoría de los cultivos en más del 50% (Vinocur y Altman, 2005; W.

Wang et al., 2003). Los campos de cultivo de plantas de interés comercial están

expuestos a diversos estreses ambientales, tales como altas o bajas temperaturas,

salinidad y sequía.

El estrés por sequía y el estrés por salinidad son dos de los tipos de estrés abiótico que

pueden tener repercusiones altamente significativas en la producción de cultivos de

interés comercial. El estrés por sequía puede definirse como la situación en la cual la

cantidad de agua disponible para la planta en la zona de las raíces es menos de la

requerida para sustentar el máximo crecimiento y productividad (Deikman et al., 2012). El

estrés por salinidad es una condición del suelo en el cual la concentración de sales

solubles es elevada (con una conductividad eléctrica ≥ 4 dS/m), equivalente a

CAPÍTULO I

12

aproximadamente 40 mM NaCl y generando una presión aproximada de 0.2 MPa (Munns,

2002).

El estrés abiótico por sequía es el problema más serio para la agricultura global ya que

afecta alrededor del 40% de la superficie terrestre mundial (Ashraf et al., 2012).

Adicionalmente, el estrés abiótico por salinidad afecta alrededor del 7% de la superficie

terrestre mundial (Munns y Tester, 2008; Rozema y Flowers, 2008).

1.1.4 Metabolismo

Se denomina metabolismo al conjunto de reacciones químicas catalizadas

enzimáticamente que de forma regulada y coordinada teniendo lugar en las células vivas.

El metabolismo se divide en catabolismo, que es la fase degradativa y en anabolismo, que

es la fase constructiva o biosintética. El catabolismo es el proceso por el cual los

nutrientes (carbohidratos, lípidos y proteínas) provenientes del medio ambiente o de los

depósitos celulares son degradados en moléculas más pequeñas como el ácido láctico,

CO2, o urea. El catabolismo se realiza con liberación de la energía inherente en los

nutrientes, parte de la cual se almacena en forma de ATP. En el anabolismo, las

moléculas precursoras se unen para formar componentes moleculares estructurales de

las células como polisacáridos, ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Estos procesos

requieren de energía la cual es proporcionada por la hidrólisis del ATP. El catabolismo y el

anabolismo tienen lugar simultáneamente en las células (Garrido Pertierra et al., 2001).

Gran parte de los metabolitos en los seres vivos son generados mediante mecanismos de

respuesta ante diferentes estímulos tales como el estrés. Las plantas responden ante

estas condiciones por medio de mecanismos de respuestas bioquímicos ( equena-

odrígue y omás-Balibrea, 2008).

Clasificación de los metabolitos: la línea divisoria entre el metabolismo primario y

secundario es borrosa. A las sustancias que forman parte de las reacciones metabólicas

se les denomina metabolitos. Generalmente los metabolitos se clasifican de acuerdo a su

distribución en la naturaleza, pudiendo ser metabolitos primarios (distribución amplía) o

metabolitos secundarios (distribución reducida) (Lurá et al., 1997). Algunos aminoácidos

CAPÍTULO I

13

son metabolitos secundarios, mientras que muchos alcoholes esteroídicos o esteroles

tienen un papel estructural esencial en la mayoría de los organismos y deben ser

considerados como metabolitos primarios. Los dos tipos de metabolismo están

interconectados, el metabolismo primario origina moléculas pequeñas que se utilizan

como producto de partida en los procesos metabólicos secundarios (Claramun et al.,

2013).

Los metabolitos secundarios son compuestos cuya producción está restringida en grupos

taxonómicos específicos, los cuales no son necesarios para la vida de un organismo, pero

desempeñan un rol en la interacción del organismo con su ambiente, asegurando la

supervivencia de este en su ecosistema (Verpoorte, 2000).

Muchos de los metabolitos secundarios tienen funciones importantes en los sistemas

defensivos o de excreción. En general, los metabolitos secundarios son responsables del

olor, sabor y color de las plantas, así como de sus propiedades medicinales. Los

metabolitos secundarios poseen una gran diversidad de tipos estructurales; sin embargo,

la mayoría se sintetizan a partir de un número reducido de precursores. Así el ácido

acético (en forma de acetil coenzima A) sirve de precursor de la biosíntesis de ácidos

grasos, poliacetilenos, eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos)

policétidos macrocíclicos y aromáticos. Por otra parte, el mevalonato es un precursor de la

síntesis de terpenos (como los esteroides y carotenoides) y un número elevado de

compuestos aromáticos se sintetizan a partir del ácido shiquímico (aminoácidos

aromáticos, ácidos cinámicos y ciertos polifenoles). Además, muchos compuestos

nitrogenados (alcaloides y antibióticos peptídicos) proceden de aminoácidos ( astillo

arcía y artíne Solís, 01 laramun et al., 2013).

Los metabolitos secundarios de la planta modelo A. thaliana se clasifican en los siguientes

grupos mayoritarios: compuestos secundarios que contienen nitrógeno, terpenoides,

derivados de azúcares (ciclitoles) y compuestos fenólicos (Mueller, 2003).

El grupo de los compuestos secundarios nitrogenados incluye a los alcaloides y los

glucosinolatos. Los alcaloides son un grupo diverso de compuestos de bajo peso

molecular que contienen uno o más varios átomos de nitrógeno incluidos en un

heterociclo. En la actualidad se conocen más de 12,000 compuestos diferentes. Se

CAPÍTULO I

14

derivan de aminoácidos y tienen una alta actividad farmacológica a dosis bajas (Wink,

1998). Los glucosinolatos son compuestos con un átomo de nitrógeno, un átomo de

azufre en forma de ion sulfato y otro átomo de azufre a través del cual se une la glucosa,

formando un S-heterósido. Derivan de la tirosina, la fenilalanina, el triptófano, la

homometionina o la homofenilalanina. Son característicos de las crucíferas o brasicáceas

y de otras familias del mismo orden. Algunas de las propiedades de los glucosinolatos son:

efectos protectores frente a sustancias cancerígenas, atrayentes de polinizadores,

repelentes de patógenos, insecticidas, fungicidas, entre otras (Amâncio y Stulen, 2007).

Los terpenoides son compuestos que resultan de la polimerización de unidades

isoprénicas, el isopentil pirofosfato (IPPP) con su isómero dimetilalil pirofosfato (DMAPP),

moléculas de cinco átomos de carbono que proceden del ácido mevalónico. Se conocen

más de 30,000 terpenoides, principalmente de origen vegetal, muchos de los cuales son

empleados para la elaboración de saborizantes y fragancias, antibióticos, hormonas

animales y vegetales, lípidos de las membranas, atrayentes de insectos y mediadores de

las cadenas de transporte de electrones durante la respiración celular y la fotosíntesis. Se

clasifican según su número de átomos de carbono (siempre múltiplos de cinco) en:

monoterpenos (10 carbonos), sesquiterpenos (15 carbonos), diterpenos (20 carbonos)

triterpenos (30 carbonos), tetraterpenos (40 carbonos) y politerpenos ( astillo arcía y

Martíne Solís, 01 ).

Los ciclitoles son cicloalcanos en los que un grupo hidroxilo está unido a cada uno de los

tres o más átomos del anillo. Los ciclitoles de la serie de ciclohexano constituyen los

inositoles; aquellos que contienen al menos cinco centros asimétricos en el anillo, de los

cuales al menos tres están directamente enlazados a oxígeno (u otros calcógenos), o

nitrógeno reciben el nombre estereoprincipal de inositol; los otros se nombran

sistemáticamente como ciclohexanopolioles ( arcía lcolea, 1 1). Estos compuestos

forman parte del sistema de respuesta de las plantas ante diferentes tipos de estreses

como salinidad, sequía y bajas temperaturas (Vernon et al., 1993). Los ciclitoles son

altamente solubles, poco reactivos y metabólicamente inertes. Estas cualidades les

permiten acumularse en altas concentraciones sin interferir con las estructuras celulares o

el metabolismo (Loewus y Loewus, 1983).

Los compuestos fenólicos se describirán en la siguiente sección.

CAPÍTULO I

15

Cuando se comparan las vías biosintéticas del metabolismo primario con las del

secundario se observa que estas últimas, si bien utilizan mecanismos de reacción

similares a los de las primeras, tienen también características propias y que no tienden a

la economía energética y simplicidad de las vías primarias. Debido a su diversidad

estructural, las diferentes vías biosintéticas de los metabolismos secundarios están

sometidas a un control general que responde a factores ambientales ( arés y uáre ,

1997).

La generación de los metabolitos secundarios en los organismos se es ocasionada por la

acumulación de mutaciones en el material genético originalmente asociado con las rutas

metabólicas de metabolitos primarios. Los cambios en las secuencias de ADN-ARN

responsables de la formación de ciertos tipos de metabolitos secundarios son usualmente

accidentales. Los cambios en las rutas metabólicas de los metabolitos secundarios son

generalmente tolerados más fácilmente que en las rutas metabólicas de metabolitos

primarios. Los efectos de estos cambios pueden manifestarse como modificación de la

especificidad de enzimas, producción de estructuras modificadas, disponibilidad de

sustratos entre otros. La cantidad de cualquier metabolito secundario presente en un

organismo es el resultado del equilibrio entre su síntesis, almacenamiento y degradación.

La formación de un metabolito secundario depende de diferentes condiciones tales como

la fase de desarrollo del organismo, los cambios morfológicos y citológicos, la regulación

enzimática, la regulación por otros metabolitos secundarios, etc (Seigler, 1999).

1.1.5 Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos o polifenoles son un grupo único de metabolitos presentes en

frutas, vegetales y otras plantas. Su actividad está basada en sus grupos funcionales

capaces de aceptar las cargas negativas de radicales libres. Son ampliamente estudiados

debido al beneficio para la salud humana y al tratamiento de enfermedades. Esto conlleva

a un interés particular de los factores ambientales que modifican su concentración en las

plantas de origen así como en las metodologías para aislarlos, describirlos e identificarlos

(Watson, 2014). Se caracterizan por la presencia de uno o más anillos fenólicos en su

estructura. Son productos del metabolismo secundario de las plantas a partir de la ruta del

CAPÍTULO I

16

ácido shiquímico o de la ruta de poliacetatos (Dewick, 2009). Algunas de las funciones de

los compuestos fenólicos son la defensa contra patógenos, radiación ultravioleta, estrés

osmótico, absorción de nutrientes, síntesis de proteínas, actividad enzimática, fotosíntesis,

componentes estructurales y alelopatía (Kvasnička et al., 2008; Stalikas, 2007; Manach et

al., 2004).

Sus estructuras varían desde estructuras simples como los fenoles simples (fenol,

resorcinol) o los ácidos fenólicos (comúnmente asociados con uno o varios residuos de

azúcares por los grupos hidroxilo) hasta sustancias altamente polimerizadas tales como

los taninos (C6-C3-C6) (Lattanzio et al., 2006).

Los polifenoles pueden clasificarse de acuerdo al número de anillos fenólicos que poseen

y de los elementos estructurales que estos presentan. Los principales grupos de

polifenoles son: ácidos fenólicos (derivados del ácido hidroxibenzoico o del ácido

hidroxicinámico) (C6-C1), estilbenos (C6-C2-C6), lignanos (C6-C3) y flavonoides (C6-C3-C6)

(Lattanzio et al., 2006; Manach et al., 2004).

Los fenilpropanoides son una clase de compuestos fenólicos cuya estructura

característica consiste de un anillo aromático unido a una cadena lateral de tres carbonos.

Se derivan biosintéticamente del aminoácido fenilalanina y contienen uno o más residuos

C6-C3. Los más comunes son los ácidos hidroxicinámicos, los cuales son importantes no

sólo como eslabones de la síntesis de lignina, sino también en la regulación del

crecimiento y a la resistencia ante enfermedades. Algunos ejemplos de fenilpropanoides

son las hidroxicumarinas, fenilpropenos, suberinas y cutinas, lignanos, estilbenos,

flavonoides y taninos (Heldt y Heldt, 2005). Se estima que los fenilpropanoides abarcan

más del 30% de todo el carbono orgánico en la biosfera, principalmente en forma de

lignina (Kyle y Duthie, 2005). Poseen diversas funciones biológicas en las plantas:

protección contra la luz UV, defensa contra patógenos o herbívoros, componentes

estructurales de la membrana celular, pigmentos o moléculas de señalización (Jaakola,

2013; Heldt y Heldt, 2005).

Los flavonoides conforman el grupo más grande de los compuestos fenólicos en plantas

(más de 9,000 individuos) (Williams y Grayer, 2004). Los flavonoides son compuestos de

bajo peso molecular conformados por quince átomos de carbono ordenados en una

CAPÍTULO I

17

configuración C6-C3-C6. Esencialmente la estructura principal consiste de dos anillos

aromáticos A y B unidos por un puente de tres carbonos, usualmente en forma de un

anillo heterocíclico C. El anillo aromático se deriva de la ruta de los poliacetatos y el anillo

B junto con la unidad C3 proceden de la ruta del ácido shiquímico (Figura 1.2) ( Quiñones

et al., 2012; Merken y Beecher, 2000). Dependiendo de los diferentes patrones de

sustituyentes del anillo C pueden existir diferentes clases de flavonoides: flavonoles,

flavonas, flavononas, flavanoles (o catequinas), isoflavonas y antocianinas (Manach et al.,

2004; Hollman y Katan, 1999), de los cuales las flavonas y flavonoles son los más

abundantes y estructuralmente diversos (Harborne et al., 1998). Las sustituciones en los

anillos A y B incrementan la diversidad de compuestos en cada clase de flavonoides.

Estas sustituciones pueden incluir oxigenaciones, alquilaciones, glicosilaciones,

acilaciones o sulfonaciones (Balasundram et al., 2006; Hollman y Katan, 1999).

Figura 1.2 Estructura principal de una

molécula flavonoide (Balasundram et al.,

2006).

En plantas, los flavonoides participan en la regulación de diferentes procesos tales como

las interacciones planta-patógeno, polinización, protección solar, desarrollo de las semillas

y alelopatía (Hernández et al., 2009; Winkel-Shirley, 2001). Muchos genes involucrados

con la síntesis de flavonoides son inducidos durante estreses bióticos y abióticos, tales

como daño mecánico, sequía, toxicidad a metales y déficit de nutrientes (Ververidis et al.,

2007; Dixon y Paiva, 1995). Un denominador común de estas condiciones es la

producción y acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en

inglés), tales como los aniones superóxidos, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo y

oxígeno singlete (Asada, 2006). Los flavonoides actúan como antioxidantes protegiendo a

las plantas del estrés oxidativo debido a su alto potencial de reducción, que les permite

CAPÍTULO I

18

actuar como agentes reductores, donadores de hidrógenos y quemadores de oxígeno

singlete. Adicionalmente pueden actuar como quelante de metales (Tsao y Yang, 2003).

1.1.6 Relación entre los factores de transcripción MYB y el estrés abiótico en

plantas

Debido a la carencia de locomoción, las plantas responden ante las condiciones de estrés

por medio de mecanismos de respuestas bioquímicos ( equena- odrígue y omás-

Balibrea, 2008). Las sequías, las altas concentraciones de sales y las temperaturas bajas

son los mayores problemas para la agricultura debido a que estos factores ambientales

evitan que las plantas crezcan y se reproduzcan de manera óptima por los cambios

morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que estos causan en ellas

(Rodríguez et al., 2005).

Los mecanismos de respuesta y adaptación al estrés abiótico son vitales para la

supervivencia de las plantas. Los factores de transcripción son elementos indispensables

en los mecanismos de regulación de la expresión de genes y la síntesis de proteínas en

condiciones de estrés abiótico. La familia de factores de transcripción MYB ha

demostrado ser esencial para las respuestas de las plantas ante estreses abióticos

(Cuadro 1.1) (Dubos et al., 2010).

CAPÍTULO I

19

Cuadro 1.1 Ejemplos de factores de trascripción MYBs que participan en los

mecanismos de respuestas estrés abiótico en A. thaliana (Li et al., 2015).

Algunos ejemplos de investigaciones que denotan la participación de genes MYBs con la

producción de metabolitos secundarios ante condiciones de estrés abiótico se enlistan en

el Cuadro 1.2.

AtMYB No. de acceso Estrés abiótico

MYB2 MYB3 MYB4 MYB6 MYB7 MYB12 MYB13 MYB15 MYB20 MYB21 MYB33 MYB35 MYB41 MYB44 MYB60 MYB62 MYB65 MYB68 MYB73

PAP1/MYB75 MYB80 MYB88

PAP2/MYB90 MYB96 MYB99

MYB102 BOS1/MYB108

MYB110 MYB111

FLP/MYB124

AT2G47190 AT1G22640 AT4G38620 AT4G09460 AT2G16720 AT2G47460 AT1G06180 AT3G23250 AT1G66230 AT3G27810 AT5G06100 AT3G28470 AT4G28110 AT5G67300 AT1G08810 AT1G68320 AT3G11440 AT5G65790 AT4G37260 AT1G56650 AT5G56110 AT2G02820 AT1G66390 AT5G62470 AT5G62320 AT4G21440 AT3G06490 AT3G29020 AT5G49330 AT1G14350

Sequía, salinidad, déficit de P, anoxia Altas temperaturas

UV Altas temperaturas

UV-B Sequía, UV-B Ácido bórico

Sequía, congelamiento Salinidad Sequía Sequía Sequía

Sequía, salinidad Sequía, salinidad, frío

Sequía Déficit de P

Sequía Ácido bórico

Salinidad Sequía, azúcar, déficit de P, UV-A, déficit de N

Sequía Sequía, salinidad

Azúcar, déficit de P, déficit de N Sequía Sequía

Sequía, daño mecánico Sequía, salinidad, déficit de P, estrés oxidativo

Sequía Déficit de P, UV-B Sequía, salinidad

CAPÍTULO I

20

Cuadro 1.2 Genes o proteínas MYB involucrados con la producción de metabolitos

secundarios en los mecanismos de respuestas estrés abiótico en plantas.

Gen/Proteína Planta Estrés Función Referencia

PAP1

A. thaliana

Sequía Síntesis de flavonoides (Nakabayashi

et al., 2014; Rowan et al.,

2009; Leyva et al., 1995)

MYB12

AtMYB3

Altas/Bajas temperaturas

Supresión/aumento de síntesis de antocianinas

AtMYB6

AtMYBL2

MYB10 Malus

domestica

Aumento de la

temperatura

Disminución de síntesis de

antocianinas

(Lin-Wang et al., 2011)

PcMYB10 Pyrus

communis

Disminución de la

temperatura

Aumento de síntesis de antocianinas

(L. Li et al., 2012)

LbMYB1 Ipomoea

batata Salinidad

Incremento de antocianinas en

plantas transgénicas de papa.

(Cheng et al., 2013)

1.1.7 Relación entre los factores de transcripción MYB y la síntesis de compuestos

fenólicos

En la ruta de los fenilpropanoides se genera p-coumaril-Coenzima A, un sustrato que es

común en la síntesis de diferentes compuestos fenilpropanoides (flavonoides, coumarinas,

etc.). El proceso inicia con la desaminación de la fenilalanina (generada por la ruta del

ácido shiquímico) por la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) generándose ácido

cinámico. Este producto es hidroxilado por la ácido cinámico-4-hidroxilasa (C4H) para

generar ácido p-coumárico. Posteriormente, por acción de la 4-ácido coumárico:CoA

ligasa (4CL), se genera p-coumaroil-Coenzima A, el cual es empleado para la síntesis de

flavonoides y ligninas (Vermerris y Nicholson, 2006).

Por otra parte, la síntesis de flavonoides es iniciada por la chalcona sintasa (CHS) la cual

genera tetrahidroxi-chalcona a partir de los sustratos p-coumaroil-Coenzima A y cuatro

moléculas de malonil-CoA. Posteriormente la chalcona es isomerizada por la chalcona

isomerasa (CHI) para formar la flavonona naringenina, la cual es convertida a

CAPÍTULO I

21

dihidrokaempferol. Este último es hidroxilado por la flavonoide 3’-hidroxilasa (F3’H) o por

la 3’, ’-hidroxilasa (F3’ ’H) para formar los dihidroflavonoles DHQ y DH las cuales son

requeridas para la producción de antocianinas derivadas de la delfinidina. Además, estas

moléculas incoloras son convertidas en antocianinas por acción de las enzimas

dihidroflavonol 4-reductasa (DFR), antocianidina sintasa (ASN) y la UDP-

glucosa:flavonoide 3-O-glucosil-transferasa (UFGT) ( ut eit y Lud ig- ller, 014; Du et

al., 2009).

La biosíntesis de ligninas usa al p-coumaroil-Coenzima A como precursor. Los

subsecuentes pasos de hidroxilación y metilación ocurren al nivel de ésteres de ácido

hidroxilcinámico y sus correspondientes aldehído y/o alcoholes (Humphreys y Chapple,

2002). En el Cuadro 1.3 se enlistan diferentes proteínas MYB involucradas con la

biosíntesis de flavonoides y ligninas en plantas.

Cuadro 1.3 Ejemplos de genes/proteínas MYB que participan en la biosíntesis de

flavonoides y ligninas en A. thaliana (Dubos et al., 2010).

Sub-grupo

Nombre Acrónimo Código Funciones

3 AtMYB058 At1g16490

Ruta de los fenilpropanoides/ Síntesis de lignina

AtMYB063 At1g79180 Ruta de los fenilpropanoides/

Síntesis de lignina

4

AtMYB003 At1g22640 Ruta de los fenilpropanoides




5 AtMYB123 TT2 At5g35550 Ruta de los

fenilpropanoides/Biosíntesis de proantocianidinas

6

AtMYB075 PAP1 At1g56650 Ruta de los

fenilpropanoides/Biosíntesis de antocianinas

AtMYB090 PAP2 At1g66390 Ruta de los


AtMYB113 At1g66370 Ruta de los


AtMYB114 At1g66380 Ruta de los


7 AtMYB011 PFG2 At3g62610 Ruta de los

fenilpropanoides/Biosíntesis de

CAPÍTULO I

22

flavonoles

AtMYB012 PFG1 At2g47460 Ruta de los

fenilpropanoides/Biosíntesis de flavonoles

AtMYB111 PFG3 At5g49330 Ruta de los

fenilpropanoides/Biosíntesis de flavonoles

12

AtMYB028 HAG1/PMG1 At5g61420 Biosíntesis de glucosinolatos

AtMYB029 HAG3/PMG2 At5g07690 Biosíntesis de glucosinolatos

AtMYB034 ATR1 At5g60890 Biosíntesis de glucosinolatos

AtMYB051 HIG1 At1g18570 Biosíntesis de glucosinolatos

AtMYB076 HAG2 At5g07700 Biosíntesis de glucosinolatos

AtMYB122 At1g74080 Biosíntesis de glucosinolatos

13 AtMYB061 At1g09540 Ruta de los fenilpropanoides/ Síntesis de lignina/Cierre de

estomas

21

AtMYB052 At1g17950 Engrosamiento de la pared celular



1.1.8 Relación entre el metabolismo secundario, estrés abiótico y los factores de

transcripción MYB en plantas

A continuación, se enlistan otros estudios que demuestran la participación de los factores

de transcripción MYB de los mecanismos de respuesta de plantas ante diferentes

condiciones de estrés abiótico mediante la generación de metabolitos secundarios:

Plantas transgénicas de papa que expresaban el gen IbMYB1 (un factor de transcripción

MYB de la planta de camote (Ipomoea batatas) presentaron un aumento significativo en la

producción de metabolitos secundarios tales como flavonoides y antocianinas

(metabolitos antioxidantes) así como una mayor tolerancia ante diferentes clases de

estrés abióticos (Cheng et al., 2013).

La represión gen codificante para el factor de transcripción AtMYB4 ocasiona un aumento

en la producción de esteres sinapato, un aumento de la expresión de genes de enzimas

participantes de la síntesis de flavonoides y una mejor tolerancia ante el estrés por luz

UV-B. En contraste, la sobreexpresión del gen AtMYB4 en plantas modelo de A. thaliana y

N. tabacum ocasionan un cambio drástico en el fenotipo de las hojas así como una mayor

susceptibilidad ante la luz UV-B (Jin et al., 2000).

CAPÍTULO I

23

En otro estudio se determinó que el AtMYB7, el cual pertenece al mismo subgrupo que el

AtMYB4, actúa como un represor de la síntesis de flavonoides (Figura 1.3) y que su

expresión es reprimida por el AtMYB4. También se observó que la expresión de AtMYB7

es inducida por estrés salino (Fornalé et al., 2014).

Figura 1.3 Cuantificación de compuestos

fenólicos, flavonoles y antocianinas en plantas

mutantes de los genes AtMYB7 y AtMYB4.

Plantas de A. thaliana con sobreexpresión de los genes AtMYB12 y AtMYB75 presentan

una mejor tolerancia ante estrés por sequía, así como una mejor capacidad de

recuperación ante este estrés en comparación con plantas silvestres de A. thalaiana. Se

presentó un aumento significativo de las concentraciones de flavonoles y antocianinas en

las plantas sobreexpresantes de los de los genes AtMYB12 y AtMYB75 en comparación

con las plantas silvestres tanto en las condiciones de crecimiento normal con luz así como

en oscuridad (Nakabayashi et al., 2014).

El factor de transcripción AtMYB44, cuya expresión se encuentra regulada por la

presencia del Ácido Abscísico (ABA), desempeña una función importante ante distintos

tipos de estreses abióticos. Plantas de A. thaliana con sobreexpresión de este gen

presentan una mayor susceptibilidad al ABA, así como de del cierre de estomas ante

inducido por ABA. La sobreexpresión de este gen también ocasiona una mayor tolerancia

CAPÍTULO I

24

ante estrés hídrico por sequía y estrés salino (Figura 1.4) ( Persak y Pitzschke, 2014;

Jung et al., 2007).

Figura 1.4 Fenotipos de plantas de A. thaliana en condiciones de riego

estrés por sequía (izquierda) y estrés por salinidad (derecha).

Nomenclatura: WT (plantas control), T-17, T18, T-21 (líneas de plantas

transgénicas de A. thaliana con sobreexpresión del gen AtMYB44),

atMYB44 (plantas mutantes de A. thaliana con silenciamiento del gen

AtMYB44).

A la fecha no se conoce si parte de los mecanismos de respuesta del AtMYB44 antes el

estrés abiótico se encuentra involucrado con la síntesis de metabolitos secundarios. Sin

embargo, en un estudio bioinformático reciente, en el cual se emplearon bases de datos

de co-expresión de genes y de interacciones regulatorias, se estableció una posible

regulación positiva de la síntesis de flavonoides por el factor de transcripción AtMYB44 (Qi

et al., 2014).

1.1.9 Carica papaya y Nicotiana tabacum como fuentes de metabolitos

secundarios

Nicotiana tabacum

La planta de tabaco (N. tabacum) es una planta ampliamente cultivada desde hace varios

siglos. El principal uso comercial de esta planta se da en las empresas tabacaleras. La

CAPÍTULO I

25

fitoquímica de la planta de tabaco ha sido ampliamente estudiada, reportándose más de

2,500 compuestos diferentes. Estos compuestos incluyen diferentes tipos de metabolitos:

isoprenoides, alcaloides, flavonoides y antocianinas (Nugroho y Verpoorte, 2002).

Estudios recientes han puesto en evidencia las diferentes propiedades bioquímicas de

extractos de tejidos de la planta de tabaco: polifenoles extraídos de hojas de tabaco

(ácido clorogénico y rutina) demostraron poseer propiedades antioxidantes y

antimicrobianas (Wang et al., 2008). La nicotina posee propiedades antimicrobianas y

antifúngicas (Pavia et al., 2000) y algunos cembranoides poseen diferentes grados de

actividades antimicrobianas, antioxidantes, antimutagénicas y anticancerígenas (Aqil et al.,

2011; El Sayed y Sylvester, 2007). Además, se ha observado que las concentraciones de

compuestos que participan en la ruta de la síntesis de flavonoides presentan variaciones

significativas cuando las plantas de tabaco son sometidas a un estrés abiótico ocasionado

por el ataque de un patógeno (Mitsunami et al., 2014).

Carica papaya

La papaya (Carica papaya) es un frutal que se encuentra distribuido en varias regiones

tropicales y subtropicales del mundo. Es ampliamente cultivado ya que su fruto es uno de

los de mayor valor nutritivo conocido: es rico en vitaminas, potasio, magnesio, calcio,

fósforo (Simonsohn, 2000), ácido fólico, carotenos, carbohidratos y ácidos grasos (Mueller

y Mechler, 2005). Las hojas contienen vitamina E y numerosas enzimas (esterasas,

proteasas y saponinas) (Baur y Fruhmann, 1979).

Desde tiempos antiguos, los distintos tejidos de C. papaya han sido empleados, en varios

países, para el tratamiento de distintas enfermedades y malestares. En el Cuadro 1.4 se

enlistan algunos de los usos medicinales tradicionales de la papaya:

CAPÍTULO I

26

Cuadro 1.4 Usos medicinales de la Carica papaya (Mueller y Mechler,

2005).

Uso Parte

empleada Preparación

Ictericia

Fruta no madura

Decocción de la fruta no madura

Semillas Decocción

Savia de látex

Bebida

Diarrea con sangre

Hojas Decocción junto con hojas de Mangifera

Indica y Psidium guajava

Raíz Decocción

Semillas Decocción

Asma bronquial Raíz

Decocción en vino de palma aplicado en el recto

Hojas Secadas e inhaladas

Infestaciones de gusanos

Savia de látex

De 3 a 4 cucharadas en un estómago vacío

Mezclado con comida para hacer una pasta

Dolor de cabeza Hojas Secado y untado en la cabeza

Raíz Comido o untado en la piel

El fruto y las semillas tienen actividades antihelmínticas y antiamebianas (Okeniyi et al.,

2007). La infusión de hoja seca se utiliza como purgante en Ghana. En la India, los frutos

de papaya semimaduros e inmaduros se ingieren o se aplican en el útero para provocar el

aborto debido a los altos niveles de látex de los frutos en estas etapas de la madurez.

Pero el consumo de frutas maduras durante el embarazo no causa ningún riesgo (Adebiyi

et al., 2002).

Además de los usos medicinales de la papaya, diferentes estudios han demostrado que

diferentes extractos de los tejidos de la papaya poseen propiedades antimicóticas

(Giordani et al., 1997), antibacteriales (Doughari y Manzara, 2007), vermífugas (Adebiyi y

Adaikan, 2005), antiictéricas (Boum et al., 1978), insecticidas (Pérez-Gutiérrez et al.,

2011), antioxidantes (Zhou et al., 2011) y ansiolíticas (Kebebew y Shibeshi, 2013).

Investigaciones recientes han indicado que existen variaciones en el contenido de

metabolitos secundarios en los diferentes tejidos de papaya, así como en el estado de

maduración del tejido. Por ejemplo, existen variaciones en los contenidos totales de

CAPÍTULO I

27

fenoles y flavonoides de diferentes extractos de semillas y frutos de C. papaya y parece

ser que el contenido de estos compuestos está directamente correlacionado con su

actividad antioxidante y citotóxica (Khor y Wong, 2014).

Al comparar los contenidos de metabolitos secundarios de hojas y semillas (maduras e

inmaduras) de papaya, se obtuvo que el extracto etanólico de hoja presentó un mayor

contenido de alcaloides y flavonoides en comparación con los extractos de los extractos

de ambos tipos de semillas (las cuales presentaron un mayor contenido de triterpenos y

saponinas). Además, el extracto etanólico de hoja presentó una actividad antifúngica

mayor y más amplía (Chávez-Quintal et al., 2011).

En el estudio realizado por Julianti et al. (2014) se determinó que extractos de hojas de

papaya poseen actividades antiplasmódicas las cuales parecen deberse a la presencia de

alcaloides y flavonoides.

Estudios recientes sobre la caracterización de compuestos fenólicos presentes en

extractos de tejidos de papaya empleando técnicas separativas como la cromatografía

líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) y la cromatografía de gases-

espectrometría de masas (CG-EM) han determinado la presencia de compuestos tales

como el ácido clorogénico, hesperidina, rutina, naringenina, ácido cafeico, ácido cinámico,

kaempferol, ácido protocatecuico, ácido coumárico, entre otros (Cuadro 1.5) (Gogna et al.,

2015). Las concentraciones de estos metabolitos presentan diferencias significativas en el

tipo de tejido (hoja o semilla) así como en la edad del tejido (hojas jóvenes y viejas).

Cuadro 1.5 Compuestos presentes en extractos de hojas de papaya

identificados empleando UPLC-ESI-MS en modo de ionización negativa

(Gogna et al., 2015).

Metabolito Peso molecular [M − H]− Tiempo de retención

Ácido cafeico Ácido coumárico

Hesperidina/Rutina Naringenina Kaempferol

Ácido cinámico Ácido clorogénico

Ácido protocatecuico

180 164 610 272 286 148 354 154

179 163 609 271 285 147 353 153

4.34 5.32 5.82 5.82 6.44 11.99 14.22 14.22

CAPÍTULO I

28

JUSTIFICACIÓN

Desde hace varias décadas se han realizado diversos estudios que han demostrado las

diversas funciones que tienen los factores de transcripción de plantas en los mecanismos

de respuesta a diferentes condiciones de estrés ( equena- odrígue y omás-Balibrea,

2008). Varios de estos mecanismos de respuesta se llevan a cabo por la generación de

metabolitos secundarios en las plantas, tales como los compuestos fenólicos, los cuales

presentan cierta especificad entre las especies, los tejidos, las etapas de desarrollo y

otras condiciones (Dubos et al., 2010). Los factores de transcripción del tipo MYBs

conforman una de las familias más grandes en los genomas de las plantas, especialmente

los R2R3-MYB. Existe una gran diversidad de investigaciones que han demostrado la

participación clave de los factores de transcripción MYB en los mecanismos de respuesta

ante diferentes tipos de estrés abiótico mediante la generación de compuestos fenólicos

(Nakabayashi et al., 2014; Morant et al., 2010; Rowan et al., 2009).

A través de la historia se ha demostrado que casi todos los tejidos de la planta de C.

papaya poseen propiedades medicinales (Mueller y Mechler, 2005). Estudios recientes

han demostrado diversas propiedades de los extractos de tejidos de papaya: actividad

antioxidante, bactericida, antifúngica, entre otras (Doughari y Manzara, 2007; Adebiyi y

Adaikan, 2005). De manera similar a C. papaya, existe una gran diversidad de metabolitos

secundarios obtenidos de tejidos de N. tabacum (Nugroho y Verpoorte, 2002), muchos de

los cuales han sido estudiados con el objetivo de encontrar compuestos con propiedades

biológicas de interés comercial.

A la fecha se han caracterizado diferentes tipos de compuestos fenólicos en extractos de

hojas de papaya, los cuales parecen conformar parte de un sistema de respuesta ante

diferentes condiciones de estrés (biótico o abiótico) (Gogna et al., 2015; Canini et al.,

2007). En la actualidad se desconoce la existencia y participación de factores de

transcripción MYB de C. papaya en los mecanismos de respuesta ante diferentes tipos de

estrés abiótico mediante la generación de compuestos fenólicos. Los resultados

obtenidos facilitarán la elucidación de las funciones de los CpMYBs, así como la posible

generación de plantas de C. papaya con mayor tolerancia a condiciones de estrés abiótico.

CAPÍTULO I

29

OBJETIVO GENERAL

Determinar la participación de los genes tipo MYB de C. papaya involucrados en estrés

abiótico con la producción de compuestos fenólicos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar la expresión transcripcional de genes tipo MYB en tejidos de hoja y raíz de

C. papaya sometidos a estrés abiótico.

Determinar las variaciones de los perfiles cromatográficos obtenidos por HPLC de

compuestos fenólicos en hojas de plantas de C. papaya sometidas a diferentes

condiciones de estrés abiótico.

Determinar las variaciones de los perfiles cromatográficos obtenidos por HPLC de

compuestos fenólicos en hojas de plantas de N. tabacum que sobreexpresan genes

CpMYBs sometidas a diferentes condiciones de estrés abiótico.

Analizar el efecto de la tolerancia a estrés abiótico de plantas transgénicas de N.

tabacum que sobreexpresen los genes MYBs aislados de C. papaya mediante

comparación de fenotipos.

CAPÍTULO I

30

HIPÓTESIS

Genes MYBs de C. papaya regulan la producción de compuestos fenólicos en los

mecanismos de respuesta de C. papaya ante un estrés abiótico. Los genes MYBs

ocasionarán una variación significativa en la producción de algunos compuestos fenólicos

de tejidos de plantas transgénicas de N. tabacum que tengan una sobreexpresión de

estos mismos.

CAPÍTULO I

31

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Figura 1.5 Estrategia experimental general para la caracterización de genes

CpMYBs en tejidos de C. papaya sometidos a estrés salino y por sequía.

CAPÍTULO I

32

CAPÍTULO II

33

CAPÍTULO II

ANÁLISIS IN SILICO Y EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES CpMYBs EN

TEJIDOS DE PAPAYA SOMETIDOS A ESTRÉS SALINO Y POR SEQUÍA

2.1 INTRODUCCIÓN

La investigación biotecnológica moderna se apoya en procesos experimentales y en la

búsqueda de información asistida por computadoras e internet en bancos de datos

estructurales y funcionales de genes, proteínas y otras biomoléculas. Este último proceso

es conocido como análisis in silico (Müller-Esterl, 2008).

Estas nuevas metodologías son posibles gracias al avance en el campo de la

bioinformática que permite ordenar la gigantesca cantidad de datos que se han generado

por la constante secuenciación de nuevos genomas y transcriptomas de organismos de

interés (NCBI, Phytozome, EMBL-EBI). Las herramientas bioinformáticas disponibles de

forma gratuita nos permiten buscar y comparar de una manera rápida y eficiente estas

secuencias entre distintas especies (BLAST y FASTA), elucidar y diseñar in silico las

secuencias nucleotídicas y proteicas de nuevos genes y proteínas (Softberry y

Phytozome), predecir la posible estructura y posible función de los genes y proteínas

elucidadas (Multiple Sequence Alignment, Phyre 2, Pfam, Prosite), así como el diseño de

oligonucleótidos específicos para los genes putativos (IDT Olygo Analyzer) (Oliva Virgili y

Vidal Taboada, 2006). El uso de estas herramientas bioinformáticas permite el constante

análisis de secuencias putativas de nuevos genes y proteínas que podrían ser los mejores

candidatos para la función deseada.

La mayoría de las diferentes células especializadas en los organismos multicelulares son

capaces de alterar sus patrones de expresión génica en respuesta a señales

extracelulares respondiendo a menudo de una manera distinta a la misma señal

extracelular. Estos patrones de expresión génica le dan a cada célula sus características

distintivas (Alberts et al., 2006). La capacidad de amplificación exponencial de mínimas

cantidades de material genético hace de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

una herramienta clave para la búsqueda de la expresión diferencial de genes empleando

muestras de ADN complementario (ADNc). Este último se sintetiza a partir de pequeñas

CAPÍTULO II

34

cantidades de ARN mensajero (ARNm) generado por el mecanismo de respuesta a un

estrés externo en el tejido de estudio (Zavala Castro, 2005).

Otra herramienta importante para el análisis de genes es la reacción en cadena de la

polimerasa cuantitativa o de tiempo real (qPCR por sus siglas en ingles), los procesos de

amplificación y detección se producen de manera simultánea, sin necesidad de realizar

ninguna acción adicional, como elaboración, tinción y visualización de geles. Además,

mediante la detección por fluorescencia se puede medir, durante la amplificación, la

cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia

producida en la reacción es proporciona a la cantidad de ADN formado. Esto permite

evaluar y registrar en todo momento la cinética de reacción de amplificación. La reacción

puede dividirse en tres fases: la de crecimiento la geométrica, la lineal y la de finalización

(plateau). La fluorescencia evaluada es la que se produce durante la fase de crecimiento

exponencial temprana y el ciclo de PCR en el que se produce es denomina CT (cycle

threshold por sus siglas en ingles). Este valor está relacionado con el número de copias

blanco que posee la muestra que se está evaluando, lo cual permite que a través de la

PCR en tiempo real se realice la cuantificación con una alta sensibilidad y especificidad.

Para llevar a cabo la PCR en tiempo real, los termocicladores incorporan un lector de

fluorescencia que simultáneamente a la reacción indican en la pantalla la fluorescencia

emitida por cada muestra evaluada, lo que permite saber el momento real en que empieza

la amplificación. La fluorescencia emitida se debe a la acción de agentes intercalantes de

unión de ADN y son específicas marcadas con fluorocromos. Los primeros son

compuestos que se insertan entre las bases de una molécula de ADN, interrumpiendo la

alineación y el emparejamiento de bases de las cadenas complementarias (SYBR Green,

por ejemplo). La emisión de fluorescencia se da cuando se unen a ADN de cadena doble,

de tal forma que cuanta mayor cantidad de producto genere la reacción de PCR, mayor

cantidad de fluorescencia será emitida (Fonseca Mendoza et al., 2010).

La gráfica que representa la cinética de amplificación de una PCR en tiempo real se

conoce como amplificación plot (Figura 2.1). Es esta gráfica observamos, en el eje de x el

tiempo o los ciclos y en el eje y observamos la intensidad de la fluorescencia (Rn). La

línea base consiste de los ciclos en donde el cambio en la señal de fluorescencia es

mínimo. Para efectuar los ensayos de cuantificación, dentro de la fase geométrica es

CAPÍTULO II

35

necesario definir el punto de intensidad de fluorescencia o umbral de detección (threshold),

en el cual todas las muestras puedan ser comparadas entre sí. La línea base o límite de

detección se establece basándose en la fluorescencia de la señal de fondo (background)

y equivale a 10 veces la desviación estándar de la media de emisión de la línea base, el

cual sirve para la determinación de las CTs (Filion, 2012).

Figura 2.1 Fases y componentes de la reacción en

cadena de la polimerasa en tiempo real.

Los dos métodos más comúnmente utilizados para el análisis de datos obtenidos por

qPCR son la cuantificación absoluta y la cuantificación relativa. La cuantificación absoluta

determina en número de copias de entrada, usualmente por relación de la señal de la

PCR con una curva estándar. La cuantificación relativa relaciona la señal de PCR del gen

de interés en un grupo de tratamiento con otro tal como un control sin tratamiento. E

método 2-ΔΔ es una manera conveniente de analizar los cambios relativos en la

expresión de genes en los experimentos de qPCR (Livak y Schmittgen, 2001).

C. papaya pertenece al orden de las brassicales que se encuentra conformado de 17

familias, tales como las caricáceas (que incluye a C. papaya) y a las brasicáceas (que

incluye a A. thaliana). Ambas especies comparten un ancestro común de

aproximadamente 70 millones de años. Esta divergencia entre ambas especies y el

conocimiento de sus genomas permite la caracterización funcional de distintos genes en

papaya a partir de genes previamente caracterizados en A. thaliana y viceversa (Lyons et

al., 2008; S. W. Yang et al., 2004).

CAPÍTULO II

36

En este capítulo se describen las diferentes herramientas bioinformáticas empleadas para

el análisis in silico de genes putativos que codifiquen para factores de transcripción MYB

en el genoma de C. papaya a partir de genes MYBs conocidos en el genoma de A.

thaliana. También describe como se llevó a cabo el análisis de la expresión diferencial de

genes MYBs putativos en tejidos de C. papaya sometidos estrés salino y por sequía para

corroborar si se presentaba alguna variación de la expresión de estos genes en estas

condiciones de estrés.

CAPÍTULO II

37

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.2.1 Analisis in silico de genes MYBs en C. papaya

Se realizaron diferentes consultas bibliográficas para seleccionar genes MYBs de A.

thaliana de los cuales existen antecedentes de su participación en los mecanismos de

respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico o en la producción de metabolitos

secundarios. Una vez seleccionados, se obtuvieron sus secuencias proteicas por medio

de las base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y TAIR (The Arabidopsis Inforrmation Resource,

https://www.arabidopsis.org/). Estas secuencias fueron empleadas para realizar el análisis

bioinformático de proteínas ortólogas en el proteoma de C. papaya (Carica papaya

ASGPBv0.4) por medio del programa blastP del portal phytozome v12.1

(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html).

Posteriormente se obtuvieron listas de los supercontigs (regiones agrupadas del ADN

genómico) que incluyeran a los candidatos de MYBs presentes en el transcriptoma de C.

papaya ortólogos a los AtMYBs seleccionados. Los mejores candidatos se seleccionaron

con base en los siguientes parámetros en los análisis: mayores valores de score altos,

mayores valores de E negativos y mayor cobertura de las secuencias.

Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos putativas de los candidatos de factores de

transcripción MYB de C. papaya (CpMYBs) se obtuvieron de esta misma base de datos.

Se llevó a cabo el análisis de los dominios MYBs de los CpMYBs putativos empleando las

herramientas Pfam 32.0 (http://pfam.xfam.org/) de EMBL/EBI (The European Boinformatic

Institute, http://www.ebi.ac.uk/) y la base de datos PROSITE (http://prosite.expasy.org/)

del portal ExPASy (SIB Bioinformatics Resource Portal, http://www.expasy.org/). Se

realizaron alineamientos de las secuencias de aminoácidos empleando las herramientas

ClustalW2 y BOXSHADE 3.21 para comparar la variación de sus secuencias y la

conservación de los dominios característicos MYB R2R3. Las secuencias de aminoácidos

de CpMYBs putativos en conjunto con las secuencias de aminoácidos conocidos en A.

thaliana (obtenidos del portal Plant Transcription Factor Database v4.0,

http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/) se usaron para la construcción de un árbol filogenético

empleando el software MEGA Version 10.0.5 (https://www.megasoftware.net/).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

https://www.arabidopsis.org/)

https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html

https://www.megasoftware.net/

CAPÍTULO II

38

Se diseñaron pares de oligonucleótidos de ADN (oligos) específicos de los genes

candidatos empleando el programa OligoAnalyzer3.1 de IDT (Integrated Device

Technology; http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/).

2.2.2 Aplicación de los tratamientos de estrés abiótico para PCR de punto final

Estrés por salinidad

Se cultivaron plantas de papaya empleando semillas de la marca “semillas del aribe

(One ech)” en macetas con medio sólido (denominado en adelante como “medio

Sunshine”) compuesto de los siguientes sustratos: Sunshine (40%), eatmoss ( 0%),

Vermiculita (20%) y Perlita (20%). Después de alcanzar una edad de aproximadamente

tres meses, las plantas se transfirieron a un sistema de hidroponía con el medio Hoagland

(Hoagland y Aenon, 1950). Después de siete días de adaptación, se inició el tratamiento

de salinidad (medio Hoagland con NaCl 300 mM) (Parés y Basso, 2013).

Se tomaron muestras de tejidos de hoja y raíz, por triplicado, a las 0, 6, 12, 24, 48 y 96

horas después de iniciar el experimento. or cada punto se elaboró un “mix (me cla)” de

los triplicados (mezclas homogéneas de las muestras de cada punto del experimento) y

se emplearon de 100 a 200 mg de tejido para la extracción de ARN total.

Estrés por sequía

Se cultivaron plantas de papaya empleando semillas de la marca “semillas del aribe

(One ech)” en macetas con medio Sunshine. Después de alcanzar una edad de

aproximadamente cuatro meses, se inició el tratamiento de estrés por sequía.

Se tomaron muestras de tejidos de hoja y raíz, por triplicado, a los 0, 5, 8 y 12 días

después de iniciar el experimento (Mahouachi et al., 2006). Por cada punto se elaboró un

“mix (me cla)” de los triplicados (me clas homogéneas de las muestras de cada punto del

experimento) y se emplearon de 100 a 200 mg de tejido para la extracción de ARN total.

http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/

CAPÍTULO II

39

Cuantificación de prolina

La concentración de prolina en tejidos de plantas ha servido como un indicador de estrés,

ya sea biótico o abiótico. La determinación de la concentración de prolina se llevó a cabo

de acuerdo a la metodología descrita por Bates et al. (1973):

Se maceraron 250 mg de tejido de hoja con nitrógeno líquido en un mortero y se

mezclaron con 5 mL de ácido sulfosalicílico al 3% (por triplicado). Se transfirieron 1.5 mL

de muestra a un tubo de microcentrífuga de 2 mL y se centrifugó a 15,000 rpm por 10 min.

0.5 mL del sobrenadante se transfirieron a un tubo de ensayo en el cual se adicionaron

0.5 mL de disolución de ninhidrina y 1 mL de ácido acético glacial. La mezcla se agitó

vigorosamente y el tubo se colocó en un baño María por 1 hora a 95 °C. Posteriormente el

tubo se colocó en un baño de hielo y se agregó 1 mL de tolueno. El tubo se agito en un

agitador por 20 segundos y se dejó reposar por 5 min. Se transfirieron 0.6 mL de la fase

superior a una celda de cuarzo y la absorbancia se midió en un espectrofotómetro

calibrado a 520 nm. La cantidad de prolina en las muestras se determinó empleando una

curva de estándares de prolina.

2.2.3 Expresión diferencial de genes CpMYBs por PCR de punto final

Para la extracción del ARN total de las muestras se empleó la metodología del reactivo

Trizol de Invitrogen (Yang et al., 2012). Se realizó la verificación de la calidad del ARN

total observando la presencia de las bandas de las unidades ribosomales 28S y 18S.

Posteriormente se procedió a realizar la síntesis de ADN complementario (ADNc) a partir

de 1 µg de ARN total empleando el kit SmartTM cDNA Library Construction marca

Clontech. Se realizaron electroforesis en geles de agarosa al 1% de para verificar la

calidad del ADNc de las muestras y también se midieron sus concentraciones.

Posteriormente se realizó la estandarización del gen Actina 2 (de aproximadamente 124

pb) el cual sirvió como un patrón de referencia para normalizar las cantidades de ADNc

necesario para observar el patrón de expresión diferencial (Zhu et al., 2012). Una vez

realizada la estandarización del ADNc se llevaron a cabo PCRs semicuantitativas de

punto final empleando los oligos diseñados para los CpMYBs. También se verificaron los

CAPÍTULO II

40

patrones de expresión de los genes CpNAC02 (gen ortólogo a un AtNAC involucrado en

diferentes condiciones de estrés (Wu et al., 2009)) y CpDreb2A (gen ortólogo a un

AtDreb2A involucrado en diferentes condiciones de estrés (Nakashima et al., 2000)) de

los cuales investigaciones previas se tienen antecedentes de un aumento de su expresión

en diferentes tejidos de C. papaya ante distintos tipos de estrés abiótico.

Las condiciones de PCRs semicuantitativas de punto final de los genes CpMYBs se

enlistan en el Cuadro 2.1.

Cuadro 2.1 Condiciones de PCR semicuantitativas de punto final

empleadas.

Etapa Número de ciclos Condiciones

Desnaturalización inicial

1 95 °C por 5 min

Síntesis de amplicones

18-35 94°C por 30 segundos

50-55 °C por 30 segundos 72°C por 50-150 segundos

Elongación de amplicones incompletos

1 72°C por 5 min

Finalización de la reacción

1 4 °C

Aquellos genes que respondieron a los tratamientos de estrés fueron aislados y ligados al

vector de clonación pGEM T-Easy de Promega. La construcción fue introducida en células

competentes E. coli (cepa DH α) de la marca romega mediante un choque térmico. Las

células se cultivaron en placas de medio LB selectivo (bactotriptona: 1 g/L, extracto de

levadura: 0.5 g/L, NaCl: 1 g/L y ampicilina 100 mg/L). Se aislaron clonas positivas

(colonias blancas) y estas fueron cultivadas en medios líquido LB selectivo. Se verificó la

presencia de los genes respectivos insertados por medio de la técnica de PCR en colonia

de 1 µL de cada medio (Woodman, 2008). Una vez que ser realizó la verificación de las

clonas positivas a estas se les extrajeron los plásmidos con los genes de interés usando

el kit de extracción de plásmidos de la marca Qiagen (QIAprep Spin Miniprep Kit) (Imin et

al., 2006). Posteriormente los genes fueron secuenciados empleando los servicios del

Cinvestav Unidad Irapuato. Se realizaron alineamientos entre las secuencias

nucleotídicas de los genes positivos estas y las secuencias de las predicciones de estos

CAPÍTULO II

41

genes en C. papaya obtenidas previamente. Adicionalmente se realizaron alineamientos

de las secuencias de aminoácidos traducidas a partir de las secuencias de los genes

positivos y las predicciones en el genoma de C. papaya empleando la herramienta

Traslate Tool de ExPASy (http://web.expasy.org/translate/).

2.2.4 Aplicación de los tratamientos de estrés abiótico para PCR de punto final

Se realizó un segundo tratamiento de estrés por sequía en plantas de papaya de tres o

cuatro meses de edad en condiciones de invernadero. Se emplearon plantas de papaya

crecidas en invernadero y posteriormente estas se trasladaron a un cuarto de cultivo con

condiciones controladas (humedad del 70% y temperatura a 25 °C), se dejaron en

adaptación por siete días y posteriormente se iniciaron los experimentos. El experimento

de papaya tuvo una duración de 14 días mientras que el experimento de salinidad tuvo

una duración de 24 horas. En ambos casos se llevó a cabo la determinación de la tasa

fotosintética.


Se cultivaron plantas de papaya de la marca Semillas del Caribe (One Tech) en macetas

con medio Sunshine. Después de alcanzar una edad de aproximadamente tres meses y

medio, las plantas se transfirieron a un sistema de hidroponía con el medio Hoagland

(Hoagland y Aenon, 1950). Después de tres días de adaptación, se inició el tratamiento de

salinidad (medio Hoagland con NaCl 300 mM) (Parés y Basso, 2013).

Una vez iniciado el tratamiento se procedió de a realizar la extracción de ARN total de

tejidos de hoja. Se tomaron muestras (100-200 mg de tejido) a las 0, 12 y 24 horas

después de iniciar el experimento. Para cada punto del tratamiento, se emplearon tres

plantas.

http://web.expasy.org/translate/

CAPÍTULO II

42

Estrés por sequía

Se cultivaron plantas de papaya de la marca Semillas del Caribe (One Tech) en macetas

con medio Sunshine. Las plantas se mantuvieron en este medio hasta la edad de cuatro

meses.

Una vez que se inició el tratamiento se realizó la extracción de ARN total de tejido de hoja.

Se tomaron muestras (100-200 mg de tejido) a los 0, 9 y 14 días después de iniciar el

experimento (Mahouachi et al., 2006). Para cada punto del tratamiento, se emplearon tres

plantas.

Cuantificación de prolina

La cuantificación de prolina en hojas de papaya se realizó con la misma metodología

mencionada anteriormente.

Determinación de la tasa fotosintética

La tasa fotosintética neta se midió utilizando un analizador de gas infrarrojo portátil (Li-

6400XT, Licor, Lincoln, NE, EE. UU.) con una cámara de hojas adaptable de seis cm2. La

tercera hoja más grande de cada planta fue seleccionada para realizar las mediciones. El

flujo interno de CO2 fue de 400 µmol mol−1 y la fuente de luz fue de 300 µmol m−2 s−1. Las

mediciones se realizaron en la tarde (12:00 p.m. a 13: 00 p.m.) en una habitación con una

temperatura de 26 ° C y una humedad de aproximadamente el 80%.

2.2.5 Expresión diferencial de genes CpMYBs por PCR en tiempo real

Las muestras de ARN se resuspendieron en agua libre de nucleasas y se realizó un

tratamiento con DNAsa (Invitrogen) de 1 µg de cada muestra con la finalidad de eliminar

trazas de ADN genómico. Posteriormente 500 ng de cada muestra fueron

desnaturalizados con formamida y posteriormente se visualizaron por electroforesis en un

gel de agarosa al 1% para verificar la calidad del ARN tratado y también se midieron sus

concentraciones con un espectrofotómetro nanodrop (Jeanway).

CAPÍTULO II

43

Se realizó la verificación de la calidad del ARN total observando la presencia de las

bandas de las unidades ribosomales 28S y 18S. Posteriormente se procedió a realizar

ADNc a partir del ARN total empleando la MMLV reversa transcriptasa de la marca

Promega bajo las siguientes condiciones:

Se adicionaron 500 ng de ARN total (hoja) o 1 µg de ARN total (raíz), 0.5 µg del oligo

dT18 y la cantidad de agua estéril necesaria para un volumen final de 15 µL en tubos de

centrifuga estériles libres de RNAsas. Los tubos se calentaron a 70 °C por cinco min y

después inmediatamente se colocaron en un baño de hielo. Posteriormente se

adicionaron los siguientes reactivos: 5 µL del buffer M-MLV 5×, 1.25 µL de mix de dNTPs

10 mM, 200 unidades de M-MLV reversa transcriptasa y agua estéril necesaria para un

volumen de 25 µL. Los tubos se incubaron a 37 °C por una hora.

Después de la síntesis de las muestras de ADNc se inició el proceso de estandarización

de las cantidades de cada muestra para la PCR cuantitativa (qPCR). Para ello se empleó

1 µL de cada muestra y se realizaron qPCRs empleando el gen Tata Binding Protein I

(TBPI) como gen de control endógeno (Zhu et al., 2012). En el Cuadro 2.2 se enlistan los

componentes de las reacciones de qPCR. Se empleó un termociclador StepOne™ eal-

Time PCR System de 96 pozos de la marca Thermo Scientific. Las condiciones de

corrida de la qPCR se enlistan el Cuadro 2.3.

Cuadro 2.2 Reactivos empleados en las reacciones

de qPCR:

Reactivo Volumen (µL)

Master Mix 2× DyNAmo Color Flash Agua Mili Q

Primer Forward (10 µM) Primer Reverse (10 µM)

ADN 50× ROX reference dye

7.5 5.3 0.45 0.45

1 0.3

Volumen final 15

CAPÍTULO II

44

Cuadro 2.3 Condiciones de PCR cuantitativas empleadas.

Etapa Número de ciclos

Condiciones

Desnaturalización 1 95 °C por 10 min

Síntesis de amplicones 40-50 95°C por 30 segundos

60 °C por 1 min

Curva de disociación 1 1

60 °C por 1.5 min Aumento gradual de 60 °C hasta 95°

C (0.5 °C por ciclo)

Finalización de la reacción 1 95 °C por 15 segundos

En el Cuadro 2.4 se enlistan las secuencias de los pares de oligos empleados para los

análisis por PCR de tiempo real.

Cuadro 2.4 Pares de oligos empleados para los análisis por qPCR.

Nombre Forward Reverse

TBP1F GGT AGT AGT AGT TAG GTA TGT G GGC AAT CTG GTC TCA CTT

CpMYB44rtF GAAAAGATCTGCTAGTCTGGGTACG CCG TTT CGA TAT GCT GAG

TTG GAG

CpMYB4rtF GTA GTT GCA GTA TGG GGA TTG

TAA T TTT CAT CTC CAT TAA ACC

TCT GTA ATC C

Previo a la estandarización de las muestras, se realizó la validación del gen de control

endógeno (TBPI) así como el calculó de la eficiencia de la reacción. Para ello se

realizaron curvas estándar de las diluciones seriales por triplicado (1, 1/10, 100 y 1/1000)

de la muestra ADNc de hoja de papaya a cero días del tratamiento de sequía. Se generó

una gráfica de los valores de los ciclos de umbral (CTs) promedio obtenidos contra el

logaritmo de las cantidades de ADNc usadas anteriormente con la cual se elaboró una

regresión lineal de los puntos obtenidos. Se analizaron los valores de la pendiente de la

ecuación obtenida y el coeficiente de correlación.

Después de la validación del gen TBPI, se analizaron los valores de CTs de todos los

diferentes tipos muestras de ADNc (hoja y raíz en condiciones de estrés) y aquellas

CAPÍTULO II

45

muestras que presentaban valores de CTs diferentes a la CT promedio obtenida se les

ajusto la concentración hasta que sus valores de CTs fueran cercanos a la CT promedio.

Una vez normalizadas las cantidades de las muestras de ambos tratamientos, se llevó a

cabo la validación de los oligos de los genes CpMYB4 y 44 empleando la misma

metodología para la validación del gen TBPI.

2.2.6 Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 7.0

(GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Las colecciones de muestras de tejido, así

como la medición de los parámetros fisiológicos se repitieron al menos tres veces en

diferentes individuos en cada uno de los diferentes experimentos. Todos los análisis se

realizaron por triplicado. Las medias de la mayoría de los experimentos se compararon

mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA). Las diferencias significativas entre

los grupos de tratamiento se evaluaron con la prueba de Dunnett (p ≤ 0.0 ).

CAPÍTULO II

46

2.3 RESULTADOS

2.3.1 Análisis in silico de genes MYBs de C. papaya

En el Cuadro 2.5 se enlistan los distintos factores de transcripción MYB seleccionados para la

elucidación de genes que codifican para MYBs en el genoma de A. thaliana.

Cuadro 2.5 Números de

accesos de genes MYBs.

MYB Número de acceso

3 4 6 7 12 111 44 75 90

AT1G22640.1 AT4G38620.1 AT4G09460.1 AT2G16720.1 AT2G47460.1 AT5G49330

AT5G67300.1 AT1G56650.1 AT1G66390.1

Una vez realizado el análisis bioinformático de proteínas ortólogas de cada uno de los

nueve MYBs candidatos de A. thaliana en el proteoma de C. papaya empleando el

programa BLASTP 2.2.26+ del portal phytozome 10.3 se obtuvieron las diferentes listas

de los supercontigs del genoma de papaya que contienen a los candidatos CpMYBs

ortólogos a sus respectivos AtMYBs.

Al comparar las listas de los supercontigs se observó que varios de sus mejores ortólogos

respectivos se repitieron entre los distintos AtMYBs seleccionados (Cuadro 2.6).

Posteriormente estas repeticiones se descartaron, se seleccionaron y asignaron los MYBs

candidatos de C. papaya (Cuadro 2.7).

CAPÍTULO II

47

Cuadro 2.6 Ortólogos de MYBs en el proteoma de C.

papaya.

AtMYB N. de acceso Mejor ortólogo en

el proteoma de C. papaya

3 4 6 7

1 640.1 4 386 0.1 4 0 460.1 167 0.1

>evm.model.supercontig_37.149

1 111

47460.1 4 330.1


44 67300.1 >evm.model.supercontig_21.145

7 0

1 66 0.1 1 663 0.1


Cuadro 2.7 MYBs candidatos con funciones conocidas y sus respectivos

ortólogos de C. papaya.

MYB Rutas

metabólicas Estrés

Asignación como

CpMYB

Mejor ortólogo en el

transcriptoma de C. papaya

AtMYB4 Fenilpropanoides UV CpMYB4 >evm.model.supercontig_37.149

AtMYB12 Fenilpropanoides/

flavonoles Sequía, UV-B

CpMYB12 >evm.model.supercontig_9.95

AtMYB44 ABA,

flavonoides Salinidad/

Sequía CpMYB44 >evm.model.supercontig_21.145

AtMYB75 Flavonoides y antocianinas

Biótico: Pyrus

communis CpMYB1 >evm.model.supercontig_116.38

Posteriormente se realizaron alineamientos de las secuencias de aminoácidos de los

CpMYBs putativos empleando las herramientas ClustalW2 y BOXSHADE 3.21 (Figura

2.2). También se realizaron los análisis de los dominios R2 y R3 característicos de los

factores de transcripción MYB empleando las herramientas Pfam 28.0 y la base de datos

PROSITE (Figura 2.3). Se elaboró un árbol filogenético de las secuencias de aminoácidos

de los CpMYBs putativos así como de MYBs identificados en la planta modelo A. thaliana

(Figura 2.4) con las siguientes características: la historia evolutiva se infirió utilizando el

método de máxima verosimilitud (Maximun Likelihood) y el modelo basado en matrices

CAPÍTULO II

48

JTT (Jones et al., 1992). Se muestra el árbol con la probabilidad de registro más alta (-

95514.84). El porcentaje de árboles en los que se agrupan los taxones asociados se

muestra junto a las ramas. El (los) árbol (s) inicial (es) para la búsqueda heurística se

obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz

de distancias por pares estimadas utilizando un modelo JTT y luego seleccionando la

topología con un valor de probabilidad de registro superior. El árbol se dibujó a escala,

con longitudes de rama medidas en el número de sustituciones por sitio. Este análisis

involucró 145 secuencias de aminoácidos. Se generaron un total de 931 posiciones en el

conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (Kumar et al.,

2018). Los agrupamientos observados en el árbol obtenido coinciden ampliamente con los

reportados por (Dubos et al., 2010).

Figura 2.2 Alineamientos se secuencias de aminoácidos de los CpMYB1, 4,

12 y 44 putativos. Nomenclatura: dominio R2 (cuadro rojo), dominio R3

(cuadro verde), triptófanos característicos de los dominios MYB (asteriscos

azules), cisteínas características del dominio R2 de plantas (signos de más

amarillos) y lisina conservada (acento circunflejo verde).

CAPÍTULO II

49

Figura 2.3 Análisis de dominios R2 y R3 de los CpMYBs putativos

(común en los cuatro candidatos).

CAPÍTULO II

50

CAPÍTULO II

51

Figura 2.4 Árbol filogenético de secuencias de aminoácidos de CpMYBs

putativos y MYBs identificados en A. thaliana. Nomenclatura: círculo verde:

CpMYB1; círculo morado: CpMYB4; círculo azul: CpMYB12; círculo rojo:

CpMYB44.

Después de seleccionar a los candidatos a CpMYBs se diseñaron oligonucleótidos de

ADN (oligos) específicos de los genes candidatos empleando el programa

OligoAnalyzer3.1 de IDT (Integrated Device Technology) (Cuadro 2.8).

Cuadro 2.8 Pares de oligos para genes CpMYBs.

Nombre Forward Reverse

CpMYB1 ATGGCGGCTTCTTTGG AAAGTTCCAAAAATCTATATCTAAAC

CpMYB4 ATGGGAAGGTCTCCATG TTTCATCTCCATTAAACCTCTG

CpMYB12 ATGGGAAGATCACCATGTTGTG TGCATCCCACAAATGTTCATATTG

CpMYB44 ATGGCTTCAACGAGGAAAGATG CTCAATCTTGCTAATTCCAATTCGC

2.3.2 Expresión diferencial por PCR de punto final o semicuantitativa


En la Figura 2.5 se muestran las plantas de papaya de la marca “Semillas del aribe”

crecidas en macetas con medio sólido Sunshine así como las plantas de papaya que

fueron transferidas a un medio líquido para la posterior aplicación de estrés por salinidad.

Al inicio del experimento, las plantas presentaban hojas totalmente expandidas y con alta

turgencia; sin embargo, al finalizar el experimento las hojas perdieron turgencia

ocasionando que los pecíolos se doblaran. En la Figura 2.6 se indica en contenido de

prolina durante el transcurso del tratamiento. Se presentó un aumento significativo del

contenido de prolina en las hojas de plantas papaya sometidas a estrés por salinidad a

partir de las 48 horas de iniciado el tratamiento.

CAPÍTULO II

52

Figura 2.5 Crecimiento de plantas de papaya en medio sólido (izquierda).

Tratamiento de estrés salino en medio líquido (derecha).

Figura 2.6 Contenido de prolina en hojas de papaya durante el tratamiento

de estrés por salinidad.

Estrés por sequía


crecidas en macetas con medio Sunshine sometidas a estrés por sequía. Al inicio del

experimento las plantas presentaban hojas totalmente expandidas y con alta turgencia;

sin embargo, al finalizar el experimento las hojas perdieron turgencia ocasionando que los

pecíolos se doblaran y muchas de las hojas se desprendieran. Las hojas remanentes

presentaban marchitez en las puntas. En la Figura 2.8 se indica en contenido de prolina

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 6 12 24 48 96

µm

ol/g P

F

Horas

Concentración de prolina en hojas sometidas a estrés por salinidad

Control Salinidad

CAPÍTULO II

53

durante el transcurso del tratamiento. Se presentó un aumento significativo del contenido

de prolina en las hojas de plantas papaya sometidas a estrés por sequía hasta los 12 días

de haber iniciado el tratamiento.

Figura 2.7 Crecimiento de plantas de papaya en medio sólido (imagen

superior) y tratamiento de estrés por sequía en medio Sunshine (imágenes

inferiores).

CAPÍTULO II

54

Figura 2.8 Contenido de prolina en hojas de papaya durante el

tratamiento de estrés por salinidad.

Después de aplicar los tratamientos de estrés, se extrajo el ARN total de los tejidos de

hojas y raíces de papaya y posteriormente se realizó la síntesis de ADNc (Figuras 2.9 y

2.10).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5 8 12

µm

ol/g P

F

Días

Concentrción de prolina en hojas sometidas a estrés por sequía

Control Sequía

CAPÍTULO II

55

Figura 2.9 A) ARN total de tejidos de hoja y raíz sometidos a estrés

salino. B) ADNc de tejidos de hoja y raíz sometidos a estrés salino.

Nomenclatura: 1 KB: marcador de peso molecular; H0, 6,12, 24, 48 y

96: muestras de hoja después de diferentes días de tratamiento; R0, 6,

8, 12, 24 y 96: muestras de raíz después de diferentes días de

tratamiento.

CAPÍTULO II

56

Figura 2.10 A) ARN total de tejidos de hoja y raíz sometidos a

estrés por sequía. B) ADNc de tejidos de hoja y raíz sometidos

a estrés por sequía. Nomenclatura: 1 KB: marcador de peso

molecular; H0, 5, 8, 12 y 18: muestras de hoja después de

diferentes días de tratamiento; R0, 5, 8, 12 y 18: muestras de

raíz después de diferentes días de tratamiento.

Se realizó la normalización de las muestras empleando como control interno al gen Actina

2 de C. papaya. Debido a que algunas de las muestras de tejido de raíz en estrés por

sequía no presentaron amplificación del gen de actina se omitió su análisis por PCR

semicuantitativa. Se hicieron PCRs semicuantitativas de los genes CpNac02, CpMYBs y

CpDreb2A empleando las cantidades de muestras de ADNc normalizados anteriormente.

En las Figuras 2.11 y 2.12 se muestran los perfiles de expresión de los genes analizados.

Se observó que de los distintos genes CpMYBs candidatos, sólo los genes CpMYB4 y

CpMYB44 presentaron variaciones de los patrones de expresión diferencial ante los

distintos tratamientos de estrés aplicados.

CAPÍTULO II

57

Figura 2.11 Expresión diferencial de los genes CpMYBs en tejidos de

papaya sometidos a estés salino.

Figura 2.12 Expresión diferencial de los genes

CpMYBs en tejido de hoja de papaya sometidos a

estés por sequía.

Una vez identificados los genes que presentaron expresión diferencial ante el estrés

aplicado en los tejidos de papaya (CpMYB4 y CpMYB44), se realizó su aislamiento,

amplificación y posterior secuenciación. Con los resultados obtenidos de las

secuenciaciones de los genes CpMYB4 y CpMYB44 se realizaron alineamientos de estas

secuencias con las predicciones obtenidas previamente para observar el grado de

CAPÍTULO II

58

identidad entre las secuencias (Figuras 2.13 y 2.14). Posteriormente las secuencias

nucleotídicas obtenidas fueron traducidas empleando la herramienta Translate tool de

Expasy con las cuales se realizaron alineamientos de las secuencias de aminoácidos de

las predicciones anteriores y de las secuencias de aminoácidos obtenidas (Figuras 2.15 y

2.16).

Figura 2.13 Corroboración de las secuencias nucleotídicas de la predicción

del gen CpMYB4 (CpMYB4ph) y del gen aislado secuenciado (CpMYB4sec).

CAPÍTULO II

59

Figura 2.14 Corroboración de las secuencias nucleotídicas de la predicción

del gen CpMYB44 (CpMYB44ph) y del gen aislado secuenciado

(CpMYB44s).

CAPÍTULO II

60

Figura 2.15 Corroboración de las secuencias de aminoácidos de la

predicción del CpMYB4 (CpMYB4ph) y del gen aislado secuenciado

(CpMYB4sec).

Figura 2.16 Corroboración de las secuencias de aminoácidos de la

predicción del CpMYB44 (CpMYB44p) y del gen aislado secuenciado

(CpMYB4s).

2.3.3 Expresión diferencial de genes CpMYBs por PCR en tiempo real

Después de la identificación de genes CpMYBs y del análisis de sus niveles de expresión

por PCR semicuantitativa de punto final se procedió a la repetición de los tratamientos de

estrés hídrico por sequía y salinidad para realizar un análisis cuantitativo por PCR de

tiempo real de los genes CpMYBs caracterizados. Esto se realizó con la finalidad de

observar congruencia con el comportamiento del cambio de expresión diferencial

aparente observado en los perfiles de expresión diferencial por punto final.

CAPÍTULO II

61

Para la validación de los oligos para qPCR del gen TBPI, el cual fue empleado como gen

de control endógeno (Zhu et al., 2012), se determinaron los valores de CTs de diferentes

diluciones de la muestra H0 del experimento de sequía (Cuadro 2.9). Posteriormente se

elaboró una gráfica de los valores de los ciclos de umbral (CTs) obtenidos contra el

logaritmo de las cantidades de ADN usadas anteriormente (Figura 2.17). Se elaboró

regresión lineal de los puntos obtenidos y se analizaron los valores de la pendiente de la

ecuación obtenida y el coeficiente de correlación.

Cuadro 2.9 Datos de la validación del gen TBPI.

Dilución Concentración

del ADNc Log[ADN] CT(promedio)

1 8.95 0.95182304 21.6696472

10 0.895 −0.04817696 24.9754562

100 0.0895 −1.04817696 28.3394947

1000 0.00895 −2.04817696 32.3757553

Se realizó una regresión lineal de los puntos obtenidos, se analizaron el valor de la

pendiente de la ecuación obtenida y su coeficiente de correlación. Puesto que el valor

pendiente obtenido es cercano a −3.32 y el valor del índice de correlación obtenido es

mayor de 0.99 (0.9976), se determinó que la eficiencia de la reacción es cercana al 100%

y que la reacción de PCR es altamente reproducible.

CAPÍTULO II

62

Figura 2.17 Validación del gen TBPI.

La validación de los genes CpMYB4 y CpMYB44 se realizó empleando la misma

metodología utilizada para el gen TBPI. Los resultados de la validación se enlistan en los

Cuadros 2.10 y 12.11 y en las Figuras 2.18 y 2.19. Se descartaron las muestras de H0 no

diluidas puesto que se encontraban fuera del rango dinámico de la reacción de qPCR.

Cuadro 2.10 Datos de la validación del gen CpMYB44.



10 0.895 −0.04817696 20.4708824

100 0.0895 −1.04817696 23.8957376

1000 0.00895 −2.04817696 27.3065052

10000 0.000895 −3.04817696 31.1398678

y = -3.5482x + 24.895 R² = 0.9976

0

5

10

15

20

25

30

35

-2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

CT

log [ADN]

Validación del gen TBPI

CAPÍTULO II

63

Figura 2.18 Validación del gen CpMYB44.

Cuadro 2.11 Datos de la validación del gen CpMYB4.



10 0.895 −0.04817696 16.8284531

100 0.0895 −1.04817696 20.5259209

1000 0.00895 −2.04817696 24.023983

10000 0.000895 −3.04817696 27.789608

y = -3.5418x + 20.22 R² = 0.9992

0

5

10

15

20

25

30

35

-3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0

CT

log [ADN]

Validación del gen CpMYB44

CAPÍTULO II

64

Figura 2.19 Validación del gen CpMYB4.

Posteriormente se determinó la expresión relativa de los genes CpMYB44 y CpMYB4 en

las diferentes condiciones de estrés. Puesto que los valores de las pendientes obtenidas

fueron cercanos a 3.32 y sus valores de los índices de correlación obtenidos fueron

mayores a 0.99, se determinó que las eficiencias de las reacciones fueron cercanas al

100% y que las reacciones de PCR fueron altamente reproducibles.



crecidas en macetas con medio Sunshine la cuales fueron posteriormente transferidas a

un medio líquido para la posterior aplicación de estrés por salinidad. Al inicio del

experimento, las plantas presentaban hojas totalmente expandidas y con alta turgencia;


pecíolos se doblaran. En la Figura 2.21 se indica en contenido de prolina durante el

transcurso del tratamiento. Se presentó un aumento significativo del contenido de prolina

en las hojas de plantas papaya sometidas a estrés por salinidad a partir de 12 horas de

haber iniciado el tratamiento. En la Figura 2.22 se indica la tasa de fotosíntesis de las

plantas durante el transcurso del tratamiento. Se presentó una disminución significativa de

y = -3.6382x + 16.659 R² = 0.9998

0

5

10

15

20

25

30

-3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0

CT

log [ADN]

Validación del gen CpMYB4

CAPÍTULO II

65

la tasa de fotosíntesis en las hojas de plantas papaya sometidas a estrés por salinidad a

partir de las 12 horas de iniciado el tratamiento.

Figura 2.20 Tratamiento de estrés salino en

medio líquido.


tratamiento de estrés por salinidad. Nomenclatura: contenido de prolina al

inicio del experimento (0 HS), a las doce horas del inicio del experimento

(12 HS) y a las veinticuatro horas del inicio del experimento (24 HS) del

experimento.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 HS 12 HS 24 HS

µm

ol/g P

F

Concentración de prolina en hojas sometidas a estrés por salinidad

CAPÍTULO II

66

Figura 2.22 Tasa fotosintética de plantas de papaya estrés por

salinidad en medio líquido. Nomenclatura: plantas al inicio del

experimento (0 HS), a las doce horas del inicio del experimento (12 HS)

y a las veinticuatro horas del inicio del experimento (24 HS) del

experimento.

Estrés por sequía


crecidas en macetas con medio Sunshine sometidas a estrés por sequía. Al inicio del

experimento las plantas presentaban hojas totalmente expandidas y con alta turgencia;


pecíolos se doblaran y muchas de las hojas se desprendieran. Las hojas remanentes

presentaban marchitez en las puntas. En la Figura 2.24 se indica en contenido de prolina

durante el transcurso del tratamiento. Se presentó un aumento significativo del contenido

de prolina en las hojas de plantas papaya sometidas a estrés por sequía hasta los 14 días

de haber iniciado el tratamiento. En la Figura 2.25 se indica la tasa de fotosíntesis de las

plantas durante el transcurso del tratamiento. Se presentó una disminución significativa de

la tasa de fotosíntesis en las hojas de plantas papaya sometidas a estrés por sequía a

partir de los 9 días de haber iniciado el tratamiento.

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 HS 12 HS 24 HS

Fo

tosín

tesis

(µ

mo

l·m

-2·s

-1)

Fotosíntesis en estrés por salinidad

CAPÍTULO II

67

Figura 2.23 Efecto del estrés por sequía en fenotipos de

plantas de papaya. Nomenclatura: Aspecto en el día 0

(0DC), aspecto a los 9 días de sequía (9 DS) y al final del

experimento de sequía (14 DS).


tratamiento de estrés por sequía. Nomenclatura: contenido de prolina en

el día 0 (0DC), a los 9 días de sequía (9 DS) y al final del experimento de

sequía (14 DS).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 DS 9 DS 14 DS

µm

ol/g P

F

Concentración de prolina en hojas sometidas a estrés por sequía

CAPÍTULO II

68

Figura 2.25 Tasa fotosintética de plantas de papaya estrés por sequía.

Nomenclatura: plantas en el día 0 (0DC), a los 9 días de sequía (9 DS) y

al final del experimento de sequía (14 DS).

Una vez realizados los tratamientos por sequía y salinidad, se procedió a la extracción de

ARN total (Figuras 2.26 y 2.27) el cual fue empleado para la síntesis de ADNc.

Figura 2.26 ARN total de tejidos de hoja y raíz sometidos a estrés por

sequía. Nomenclatura: 1 KB: marcador de peso molecular; ARN de hojas de

papaya al inicio del experimento (0 HS), a las doce horas del inicio del

experimento (12 HS) y a las veinticuatro horas del inicio del experimento (24

HS) del experimento.

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 DS 9 DS 14 DS

Fo

tosín

tesis

(µ

mo

l·m

-2·s

-1)

Fotosíntesis en estrés por sequía

CAPÍTULO II

69

Figura 2.27 ARN total de tejido de hoja sometidos a estrés por sequía.

Nomenclatura: 1 KB: marcador de peso molecular; ARN de hojas de papaya

al inicio del experimento (0 DS), a los nueve días de sequía (9 DS) y al final

del experimento en las plantas en sequía (14 DS).

Después de la síntesis de ADNc de las muestras se realizaron qPCRs del gen TBPI para

la normalización de las concentraciones de cada muestra. Los Cuadros 2.12 y 2.13

muestran los resultados obtenidos para las amplificaciones del gen TBPI en los diferentes

estreses. En ambos tratamientos se obtuvo un valor de CT promedio de 23.5.

Cuadro 2.12 Valores de CTs promedio del gen

TBPI en las muestras de hoja sometidas a estrés

por sequía.

Muestra CT promedio

0 DS.1 23.34

0 DS.2 23.27

0 DS.3 23.47

9 DS.1 23.21

9 DS.2 23.22

9 DS.3 23.02

14 DS.1 23.64

14 DS.2 23.68

14 DS.3 24.18

CAPÍTULO II

70


TBPI en las muestras de hoja y raíz sometidas a

estrés por salinidad.

Muestra CT promedio

0 HS.1 24.51

0 HS.2 23.84

0 HS.3 24

12 HS.1 23.57

12 HS.2 23.39

12 HS.3 23.41

24 HS.1 22.97

24 HS.2 23.16

24 HS.3 23.49

Posteriormente se realizaron las qPCRs de los genes CpMYB44 (Cuadros 2.14 y 2.15) y

CpMYB4 (Cuadros 2.16 y 2.17) en las diferentes condiciones de estrés. Se presentaron

diferentes valores promedios de CTs respecto a las obtenidos con el gen TBPI.


CpMYB44 en las muestras de hoja sometidas a

estrés por sequía.

Muestra CT promedio

0 DS.1 21.27

0 DS.2 21.43

0 DS.3 22.75

9 DS.1 20.21

9 DS.2 20.36

9 DS.3 20.69

14 DS.1 20.20

14 DS.2 20.66

14 DS.3 21.32

CAPÍTULO II

71

Cuadro 2.15 Valores de CTs promedio del

gen CpMYB44 en las muestras de hoja y

raíz sometidas a estrés por salinidad.

Muestra CT promedio

0 HS.1 22

0 HS.2 22.41

0 HS.3 21.82

12 HS.1 20.11

12 HS.2 19.73

12 HS.3 20.64

24 HS.1 19.72

24 HS.2 19.43

24 HS.3 19.90


gen CpMYB4 en las muestras de hoja

sometidas a estrés por sequía.

Muestra CT promedio

0 DS.1 21.94

0 DS.2 22.46

0 DS.3 22.16

9 DS.1 22.54

9 DS.2 23.14

9 DS.3 23.15

14 DS.1 23.79

14 DS.2 23.45

14 DS.3 23.70

CAPÍTULO II

72


gen CpMYB4 las muestras de hoja y raíz

sometidas a estrés por salinidad.

Muestra CT promedio

0 HS.1 23.42

0 HS.2 23.15

0 HS.3 23.38

12 HS.1 23.27

12 HS.2 22.78

12 HS.3 22.35

24 HS.1 22.60

24 HS.2 22.3

24 HS.3 22.93

Los calores de CTs obtenidos fueron empleados para la determinación de la expresión

relativa de los genes CpMYB44 y CpMYB4 en tejidos de hoja y raíz sometidos a ambos

estreses usando el análisis 2-ΔΔ (Livak y Schmittgen, 2001) empleando al gen TBPI

como gen de referencia (Figura 2.28).

CAPÍTULO II

73

Figura 2.28 Expresión relativa de los genes CpMYB44 y CpMYB4 en

tejidos de hojas sometidos a estrés por sequía o salinidad.

Un estudio bioinformático realizado recientemente en nuestro laboratorio proporcionó la

información necesaria para la elucidación de redes transcriptómicas de respuestas

específicas de tejidos de plantas de papaya ante condiciones de estrés por sequía

(Gamboa-Tuz et al., 2018). Parte de la información fue empleada para la generación de

un mapa de calor de diferentes concentraciones de transcriptos CpMYBs putativos en los

diferentes tejidos de plantas de papaya sometidas a estrés por sequía. Se observó que

los genes CpMYB4 y CpMYB44 presentaron cambios significativos en su número de

copias en los tejidos de hojas: el número de copias del CpMYB4 disminuyó conforme el

avance del estrés mientras que el número de copias del CpMYB44 aumentó conforme el

avance del estrés. Estos comportamientos coinciden con los reportados previamente tanto

por PCR de punto final y PCR por tiempo real.

CAPÍTULO II

74

2.4 DISCUSIÓN

Existen diferentes estudios que evidencian las funciones de los factores de transcripción

tipo MYB en los mecanismos de señalización de respuesta de los tejidos de plantas

sometidos a estrés abiótico mediante la generación de metabolitos secundarios

(Nakabayashi et al., 2014; Rowan et al., 2009; Leyva et al., 1995). Sin embargo, las

proteínas y compuestos que conforman estos mecanismos aún son desconocidas en los

distintos tejidos de C. papaya, así como la existencia y participación de los MYBs en estos

mecanismos. El hecho de que C. papaya y A. thaliana pertenezcan al orden de las

brassicales permite la caracterización funcional de distintos genes en papaya a partir de

genes previamente caracterizados en A. thaliana y viceversa (Lyons et al., 2008; Yang et

al., 2004). Es este trabajo la consulta de investigaciones previas fue empleada como

criterio de selección de los AtMYBs que servirían como referencia para la elucidación y

aislamiento de genes CpMYBs candidatos que podrían participar en los mecanismos de

respuesta de plantas de C. papaya sometidos a diferentes tipos de estrés abiótico

mediante la generación de metabolitos secundarios.

Los análisis de las secuencias de aminoácidos de las predicciones de CpMYBs indicaron

que estos poseen los dominios y los motivos característicos de los factores de

transcripción de los MYBs tipo R2R3: los dominios R2 y R3, la presencia de triptófanos

conservados en cada dominio y la presencia de una o dos cisteínas (Jiang et al., 2004).

De los cuatro CpMYBs candidatos (CpMYB1, CpMYB12, CpMYB4 y CpMYB44), sólo dos

de estos (CpMYB4 y CpMYB44) presentaron amplificación de las muestras de ADNc de

tejidos de papaya. El árbol filogenético elaborado con las secuencias proteicas de los

CpMYBs putativos y de los AtMYBs mostro el comportamiento esperado: los CpMYBs se

ubicaron en clados de los AtMYBs respectivos (AtMYB75, AtMYB12, AtMYB4 y AtMYB44)

con los que compartían un mayor grado de identidad. Es importante mencionar que varios

de los AtMYBs que forman parte de los distintos clados formados, además de tener

secuencias proteicas similares entre ellos, también parecer formar parte de los

mecanismos de respuesta de las plantas ante diferente condiciones de estrés abiótico

(Nakabayashi et al., 2014; Kim et al., 2013; Rowan et al., 2009; Leyva et al., 1995).

Los perfiles de expresión por PCR de punto final de los genes CpMYBs en las hojas y

raíces sometidos a estrés abiótico mostraron diferentes comportamientos: inicialmente

CAPÍTULO II

75

hubo un aumento y posterior diminución de la expresión del gen CpMYB44 tanto en los

tejidos de hoja como en los de raíz en condiciones de salinidad mientras que en

condiciones de sequía se presentó un aumento progresivo de la expresión. En el caso del

gen CpMYB4, ambos tipos de tejido en ambas condiciones de estrés presentaron una

disminución de la expresión del gen conforme al avance del experimento. Las secuencias

nucleotídicas secuenciadas de los genes CpMYB4 y CpMYB44 coincidieron casi por

completo con las secuencias obtenidas previamente de la base de datos Phytozome.

Estas variaciones pueden deberse al hecho de que se empleó el genoma de C. papaya

cultivar SunUp para la predicción de genes CpMYBs mientras que la planta empleada en

este estudio fue cultivar Maradol. Las traducciones de estos genes codificaron para

factores de transcripción MYB con los dominios característicos R2R3.

Estudios previos han demostrado la participación del factor de transcripción AtMYB44 en

diferentes tipos de estreses abióticos así como un aumento significativo de la tolerancia

de plantas modelo con sobreexpresión de este gen (Persak y Pitzschke, 2014; Jung et al.,

2007). Al ser ortólogos, el aumento de la expresión del gen CpMYB44 podría deberse a

que el factor de transcripción CpMYB44 desempeña una función similar en tejidos de C.

papaya sometidos a estrés salino.

En el caso del gen CpMYB4, estudios previos demuestran la participación del AtMYB4 en

los mecanismos de respuesta ante estrés por luz UV (Fornalé et al., 2014; Jin et al., 2000).

Sin embargo, los niveles de expresión del mismo no se ven afectados por el estrés salino

mientras que la expresión del gen AtMYB7 (un homólogo cercano al gen AtMYB4)

presenta un aumento significativo en condiciones de estrés salino (Fornalé et al., 2014).

La disminución de la expresión del gen CpMYB4 ante ambos estreses estudiados en este

trabajo parece deberse a un sistema de regulación negativa como mecanismo de

respuesta ante las condiciones de estrés.

De manera complementaria se realizaron los análisis de expresión diferencial por qPCR

de los genes CpMYB44 y CpMYB4 en tejidos de hojas de plantas sometidas a las mismas

condiciones de estrés. Se observó que los comportamientos de las expresiones de estos

genes fueron similares a los obtenidos en los análisis de PCR de punto final: el gen

CpMYB44 presento un aumento en la expresión en ambos tipos de estrés. En el caso del

gen CpMYB4, se observó una disminución significativa en hojas sometidas a estrés por

CAPÍTULO II

76

sequía mientras que su expresión se mantuvo constante en condiciones de salinidad.

Puesto que los análisis de expresión diferencial por PCR de tiempo real son mucho más

sensibles que los realizados por PCR de punto final es posible que la divergencia entre

los resultados obtenidos pudo deberse a errores subjetivos durante la estandarización de

las cantidades de muestras de ADNc empleado al gen Actina 2 como control interno. A

pesar de que los análisis filogenéticos realizados con las secuencias de aminoácidos de

los CpMYBs putativos y los AtMYBs mostraron los agrupamientos cercanos esperados de

los CpMYBs con los AtMYBs empleados como referencias para su elucidación, el

comportamiento de los cambios de los niveles de expresión de los genes CpMYBs

estudiados presentaron diferencias significativas con sus ortólogos de A. thaliana debido

probablemente a divergencias evolutivas entre ambas especies de plantas.

Se determinó la existencia de dos genes CpMYBs: el CpMYB4 y el CpMYB44. También

se generaron evidencias de que la expresión de ambos genes parece estar regulada por

condiciones de estrés abiótico por salinidad y sequía sustentando la posibilidad de que

estos puedan participar en los mecanismos de respuesta de la planta ante estrés abiótico.

Sin embargo, aún es necesario realizar análisis funcionales estos genes tales como la

generación de plantas modelo con sobreexpresión de los genes CpMYBs obtenidos que

permitan determinar la función de estos genes en los mecanismos de respuesta de las

plantas ante las condiciones de estrés estudiadas.

CAPÍTULO III

77

CAPÍTULO III

GENERACIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE N. tabacum CON

SOBREEXPRESIÓN DE LOS GENES CpMYBs

3.1 INTRODUCCIÓN

Las plantas producen una amplia variedad de compuestos químicos de gran importancia

económica. Estos compuestos se encuentran unidos a características importantes de la

planta: color, fragancia de las flores, sabor y olor de la comida, resistencia ante pestes y

enfermedades. En años resientes ha surgido un rápido interés de la producción de

metabolitos secundarios debido a sus múltiples aplicaciones: drogas, antioxidantes,

saborizantes, fragancias, colorantes, insecticidas y feromonas. De manera particular, la

modificación genética de plantas ha abierto la posibilidad de explotación de la capacidad

biosintética de las plantas modelo y células vegetales (Verpoorte et al., 1999).

La planta de tabaco (N. tabacum) es una planta modelo ideal para el estudio de procesos

biológicos (J. Zhang et al., 2011). Un organismo modelo es la especie de cualquier grupo

taxonómico de organismos vivos que escogida como referencia. Los investigadores

escogen organismos modelo que les permiten evaluar un tema específico, son

representativos de un grupo más grande y crecen con facilidad en el laboratorio. Con el fin

de descubrir las conexiones entre los genes y el desarrollo, los biólogos emplean

organismos con tiempos de generación relativamente cortos y genomas pequeños, cuyo

funcionamiento se conoce bastante bien (Campbell et al., 2007). Entre las plantas hay

diversos modelos propuestos en respuesta a los intereses particulares de investigación.

Así, para las monocotiledóneas, maíz, trigo y arroz fueron los modelos considerados

durante algún tiempo. Actualmente el modelo más predominante para las

monocotiledóneas es el arroz. El modelo principal en plantas dicotiledóneas es A. thaliana

( artón óme , 014).

Desde hace unas cuantas décadas, varios métodos para la transferencia e integración

estable de un gen en el genoma de una planta huésped. Una de estas técnicas es la

transferencia de genes a explantes de hojas empleando cepas genéticamente

modificadas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens (Hooykaas y Schilperoort, 1992).

CAPÍTULO III

78

La transformación tumoral de las plantas es consecuencia de la estimulación de la división

celular de la planta por los productos codificados por una región de ADN específica

llamada T-DNA, que es transferida de la bacteria a la planta. El T-DNA y la región de

virulencia (vir), cuyos productos generan la transferencia de un intermediario (complejo-T)

y median su transporte están localizados en el plásmido inductor de tumores pTi. La

expresión de los genes en la región vir es inducida a la ver por los exudados de la planta

(Rocha et al., 2004).

Algunos ejemplos de la modificación de producción de metabolitos secundarios en tejidos

de N. tabacum modificados genéticamente son: la expresión de la estilbeno sintasa de

Vitis vinifera (uva) en tabaco permite la acumulación de estilbenos y por lo tanto un

incremento de la resistencia a Botrytis cinérea, demostrando en evidencia el papel de los

estilbenos como fitolexinas (Hain et al., 1993). El aumento de la producción de

metabolitos secundarios que las plantas silvestres producen de manera natural por medio

de la sobreexpresión de genes estructurales que codifican enzimas biosintéticas. Por

ejemplo, la expresión de una lisina descarboxilasa bacterial en plantas de tabaco

incrementa la producción de diamina cadaverina (Fecker et al., 1993). Acumulación de 4-

hidroxibenzoato en plantas de tabaco que expresan el gen ubiC de E. coli (Siebert et al.,

1996). Acumulación de 2-propenilpirrolidina en plantas de tabaco que expresan el gen

Citrocromo P-450 (IIC14) de conejo ocasionando una senescencia temprana (Saito et al.,

1991).

En este capítulo se describe la metodología requerida para la generación y detección de

plantas transgénicas de tabaco con sobreexpresión de los genes CpMYBs, así como el

proceso requerido para la generación de líneas transgénicas necesarias para el análisis

cromatográfico de los metabolitos generados durante condiciones de estrés abiótico.

CAPÍTULO III

79


3.2.1 Generación de vectores binarios mediante el sistema Gateway® Cloning

Technology

El sistema de clonación de Gateway explota el sistema de recombinación de sitio

específico utilizado por el bacteriófago lambda para transportar secuencias entre

plásmidos que portan sitios de unión de recombinación compatibles flanqueantes (att).

Una vez acoplado como un clon de entrada, un fragmento de ADN puede recombinarse

en una variedad de vectores de destino, lo que resulta en clones de expresión adaptados

a aplicaciones específicas. Las reacciones de recombinación son conducidas por dos

mezclas de enzimas conocidas por sus nombres comerciales como BP clonasa y LR

clonasa (Liang et al., 2013). A continuación, se explica la metodología empleada:

Adición de secuencias attb (sitio B) a los genes CpMYBs: se diseñaron oligos específicos

para los genes CpMYB4 y CpMYB44, secuenciados previamente, los cuales contenían la

mitad de la secuencia del sitio B necesarios para realizar la reacción de recombinación BP.

Posteriormente se realizó una segunda amplificación por PCR para generar el sitio B

completo.

Una vez que los genes CpMYBs tenían el sitio B completo, se realizó la reacción de

recombinación BP en la cual los genes fueron insertados en el vector destino pDonrTM221

(Figura 3.1).

CAPÍTULO III

80

Figura 3.1 Vector pDonrTM

221.

La construcción se usó para la transformación de células competentes E. coli DH α

mediante un choque térmico. Las células se cultivaron en placas de medio LB selectivo

(bactotriptona 1 g/L, extracto de levadura 0.5 g/L, NaCl 1 g/L, kanamicina 50 mg/L).

Se cultivaron algunas colonias en medio líquido selectivo LB y se verificó la presencia de

los genes respectivos por medio de PCRs en colonia de 1 µL de una dilución 1:10 de

medio (Woodman, 2008). Una vez que se obtuvieron clonas positivas se les extrajeron los

plásmidos con los genes de interés usando el kit de extracción de plásmidos de la marca

Qiagen (QIAprep Spin Miniprep Kit) (Imin et al., 2006). Posteriormente se realizó una

segunda PCR del gen específico empleando una dilución 1:30 del plásmido aislado.

Posteriormente se realizó la reacción de recombinación LR empleando al vector

pK7FWG2.0 como vector de destino (Figura 3.2). Se escogió este vector ya que este

posee los sitios LB y RB, los cuales son reconocidos por el mecanismo de inserción de

ADN de interés al ADN genómico de la planta infectada, así como los genes que codifican

para la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) y la neomicina

fosfotransferasa (la cual confiere tolerancia a las plantas transformadas al antibiótico

selectivo kanamicina). Una vez insertado los genes en el vector, la construcción se usó

para la transformación de células competentes E. coli DH α mediante un choque térmico.

CAPÍTULO III

81

Las células se cultivaron en placas de medio LB selectivo (bactotriptona 1 g/L, extracto de

levadura 0.5 g/L, NaCl 1 g/L) que contenía espectinomicina (50 mg/L) como antibiótico de

selección de células positivas.

Figura 3.2 Vector pK7FWG2.0.

Se cultivaron algunas células en medio líquido LB selectivo. Se verificó la presencia de los

genes respectivos por medio de PCRs de colonia empleando 1 µL de una dilución 1:10 de

medio. A las clonas positivas se les extrajeron los plásmidos con los genes de interés.

Posteriormente se realizó una segunda PCR empleando una dilución 1:30 del plásmido

aislado.

CAPÍTULO III

82

3.2.2 Generación de cepas de Agrobacterium tumefaciens que contengan los

vectores binarios generados

Una vez corroborada la presencia de los genes de interés en las construcciones estas se

emplearon para la transformación de células competentes A. tumefaciens EHA105

(Hellens et al., 2000) de acuerdo a la metodología de (Wise et al., 2006). Las células se

cultivaron en placas de medio YEP (bactotriptona 1 g/L, extracto de levadura 0.5 g/L, NaCl

0.5 g/L) que contenían espectinomicina (100 mg/L), tetraciclina (10 mg/L) y rifampicina

(100 mg/L) como antibióticos de selección de células positivas.

Se cultivaron algunas células en medio líquido selectivo YEP con antibióticos de selección.

Se verificó la presencia de los genes por medio de PCRs de colonia empleando 1 µL de

una dilución 1:10 de medio. Una vez verificadas varias clonas positivas a estas se les

extrajeron los plásmidos con los genes de interés. Posteriormente se realizó una segunda

PCR empleando una dilución 1:30 del plásmido aislado.

3.2.3 Generación de plantas transgénicas de tabaco

Para la generación de explantes transgénicos de tabaco se emplearon células de A.

tumefaciens EHA 105 que contenían las diferentes construcciones pK7FWG2.0::CpMYBs

de acuerdo a la metodología modificada de Clemente (2006) la cual se resume a

continuación:

Preparación de explantes: hojas de plantas silvestres de tabaco crecidas en condiciones

in vitro se cortaron con tijeras en cuadros pequeños bajo condiciones estériles. Los

explantes se colocaron (con el lado adaxial hacia arriba) sobre las placas con medio de

precultivo. Los explantes se cultivaron a 25°C bajo fotoperiodo de 18 horas luz por al

menos 24 horas.

Cultivo de cepas: las distintas cepas generadas fueron activadas en tubos con 5 mL de

medio de cultivo YEP con antibióticos de selección durante 8 horas a 200 rpm a una

temperatura de 28 °C. Posteriormente 2 mL de cada cepa fueron transferidos a matraces

con 50 mL de medio YEP con antibióticos de selección durante 16 horas a 200 rpm a una

CAPÍTULO III

83

temperatura de 28 °C hasta que los medios de cultivo presentaran un valor de

absorbancia a 660 nm de alrededor de 0.5 a 1. Posteriormente los medios de cultivo

fueron transferidos a tubos de centrifuga de 50 mL y centrifugados a 4,000 × g por 20 min

a 4 °C. Los sobrenadantes se descartaron y las bacterias sedimentadas se

resuspendieron en medio de cocultivo líquido con acetosiringona (100 µM). Los tubos se

mantuvieron a una temperatura de 4 °C hasta su uso.

Infiltración y cocultivo de explantes: los explanes de las placas con medio de precultivo se

traspasaron a los tubos con medios de cocultivo con bacterias y se agitaron suavemente.

Los tubos se colocaron abiertos en el interior de la cámara de vacío en la cual se realizó

un vacío de 40 cm Hg y se mantuvo por 5 min. Al final de este tiempo se abrió la llave de

paso eliminar el vacío dejando un lapso de 3 min. Este proceso se repitió dos veces más.

Los explantes se colocaron de nuevo en placas con medio de precultivo y se agregaron

alrededor de 5 mL del medio de cocultivo bacteriano. Las cajas se colocaron en agitación

por 24 horas a una revolución baja (50 rpm) en oscuridad a temperatura ambiente. Los

explantes se sacaron del medio de cocultivo líquido, se secaron con papel filtro estéril, se

colocaron en las placas con medio de precultivo con acetosiringona (100 µM) y se

cultivaron durante tres días en condiciones de luz (16 horas luz-8 horas oscuridad) a

temperatura ambiente.

Lavados y selección: los explantes se enjuagaron con agua destilada estéril hasta eliminar

la mayor cantidad de restos celulares. Posteriormente se realizaron tres lavados (de 5 min

cada uno) en una disolución de NaCl al 0.9%, timentina (200 mg/L) y cefatoxima (100

mg/L). Los explantes se colocaron en medio de selección.

Generación de callos: los explantes se mantuvieron en los medios de selección para

inducir la generación de brotes de células vegetales infectadas empleando fitohormonas

específicas (timentina (200 mg/L), kanamicina (300 mg/L), ácido naftalacético (0.1 mg/L) y

benzilaminopurina (1.0 mg/L)). Este proceso duró alrededor de 15 a 20 días

aproximadamente. Una vez generadas plántulas con tallos de alrededor de tres cm de

longitud estas se cortaron de los brotes y se transfirieron a medios de enraizamiento

[timentina (200 mg/L), kanamicina (300 mg/L) y ácido naftalacético (0.1 mg/L)]. Las

CAPÍTULO III

84

plantas que generaron raíces abundantes fueron trasferidas a medio Sunshine para el

crecimiento de las plantas T0 y obtención de semillas T1.

En los Cuadros 3.1 a 3.4 se enlistan los diferentes componentes de los distintos tipos de

medio MS empleados para la generación de las plantas transgénicas de tabaco.

Cuadro 3.1 Componentes del

medio de precultivo.

Reactivo 1 Litro

Sacarosa 30 g

Sales mayores (100×) 100 mL

Sales menores (10×) 10 mL

Fuente de hierro (200×)

10 mL

Vitamina B5 (100×) 10 mL

6-BAP (1mg/mL) 1 mL

ANA (1mg/mL 100 µL

pH 5.7

Gelrite 3.9 g


medio de cocultivo.

Reactivo 1 Litro

Sacarosa 30 g

MES 3.7 g




10 mL


6-BAP (1mg/mL) 1 mL

ANA (1mg/mL 100 µL

pH 5.7

Gelrite 3.9 g

Acetosiringona (100 µM) 1 mL

CAPÍTULO III

85


medio de selección.

Reactivo 1 Litro

Sacarosa 30 g




10 mL


6-BAP (1mg/mL) 1 mL

ANA (1mg/mL) 100 µL

pH 5.7

Gel rite 3.9 g

Kanamicina (100 mg/mL) 3 mL

Timentina (20 mg/mL) 1.5 mL

Cuadro 3.4 Componentes del medio

de enraizamiento.

Reactivo 1 Litro

Sacarosa 10 g




10 mL


ANA (1mg/mL) 100 µL

pH 5.7

Gelrite 3.9 g

Kanamicina (100 mg/mL) 3 mL

Timentina (20 mg/mL) 1.5 mL

3.2.4 Selección de plantas transgénicas positivas

A las plantas obtenidas se les extrajo ADN genómico y se realizó una PCR de punto final

del gen CpMYB de interés, así como del gen de resistencia a kanamicina (nptII) para

corroborar sus presencias en las plantas transgénicas. Las plantas transgénicas de

tabaco que sobreexpresaron los genes CpMYBs (generación T0), se emplearon para la

generación y selección de diferentes líneas (al menos cinco) para poder realizar los

análisis del efecto de la sobreexpresión de los genes CpMYBs en el la producción de

CAPÍTULO III

86

metabolitos ante condiciones de estrés abiótico (Tizaoui y Kchouk, 2012). Las diferentes

líneas T0 generadas fueron nombradas de acuerdo al número de gen CpMYB insertado

seguido de un punto y el número de planta generada a partir de un brote individual. Por

ejemplo, la primera planta de tabaco con la inserción del gen CpMYB44 generada del

primer brote de tabaco generado con los medios MS de selección fue denominada como

línea 44.1.

Para la a selección de plantas transgénicas para la generación T1 se realizó la siguiente

metodología: se seleccionaron semillas de capsulas secas de las plantas T0 las cuales

fueron desinfectadas (mediante lavados con alcohol y cloro al 50% con lavados

posteriores con agua destilada estéril). Posteriormente las semillas se colocaron en

medios MS con kanamicina (300 mg/L) en condiciones de fotoperiodo de 18 horas luz/6

horas oscuridad. Después de dos semanas de crecimiento, se seleccionaron al menos 10

plantas de cada línea que presentaron elongación de raíces con cotiledones bien

desarrollados y se traspasaron al medio sólido Sunshine.

A las plantas obtenidas se les extrajo el ADN genómico y se realizaron PCRs de punto

final del gen CpMYB de interés, así como del gen de resistencia a kanamicina (nptII) para

corroborar su presencia en las plantas transgénicas (generación T1). Las diferentes líneas

T1 fueron nombradas de acuerdo al nombre de la línea T0 de origen seguido de un punto

y el número de planta generada a partir de una semilla. Por ejemplo, la sexta planta de

tabaco generada de una semilla de la línea T0 44.1 denominada como línea 44.1.6. Una

vez seleccionadas las plantas transgénicas de tabaco sobreexpresantes de los genes

CpMYBs se procedió a la generación y selección de diferentes líneas T2 con la misma

metodología mencionada para la generación de las plantas de la generación T1.

Actualmente se dispone de semillas de tabaco de la generación T3.

3.2.5 Localización de las proteínas CpMYBs en tejidos de plantas transgénicas de

tabaco

Semillas de plantas silvestres y plantas transgénicas de tabaco (líneas T2 CpMYB4

4.4.7.2 y líneas T2 CpMYB44 44.6.7.2 fueron seleccionadas) fueron inoculadas en medios

CAPÍTULO III

87

de cultivo MS simple (plantas silvestres) y con kanamicina a 300 mg/L (plantas

transgénicas). Después de dos semanas, se seleccionaron al menos tres plantas de cada

línea que tuvieran raíces largas y hojas desarrolladas (verdes y expandidas) las cuales

fueron sometidas al siguiente proceso de fijación: las hojas y la raíz de las plántulas se

cortan de la plántula, se sumergen de manera individual en 1 mL de disolución fijadora de

paraformaldehído al 4% (750 µL de buffer de fosfatos 0.16 M pH 7.2 y 250 µL de

paraformaldehído al 16%) por 48 horas y se mantienen a 4 °C. Posteriormente las

muestras fijadas son sometidas al siguiente proceso de inclusión con gradientes de

sacarosa: 1 hora en disolución de sacarosa al 10% en buffer de fosfatos, 1 hora en

disolución de sacarosa al 20% en buffer de fosfatos con tres gotas de medio de inclusión

Leica y 1 hora en disolución de sacarosa al 30% en buffer de fosfatos con seis gotas de

medio de inclusión Leica. Posteriormente se realizaron cortes histológicos de las muestras

empleando el reactivo Leica y un criostato. Las muestras se montaron en portaobjetos a

los cuales se le añadió el reactivo VectaShield® Mounting Media DAPI (4’,6-diamidino-2-

fenildiol) de la marca Vector Laboratories durante al menos 30 min. Posteriormente las

muestras se fijaron con un cubreobjeto y se sellaron con esmalte comercial. Las muestras

se visualizaron en un microscopio confocal marca Olympus Fluoview FV1000 con un

objetivo de 40× a longitudes de onda específicas (488 nm de excitación y 510 nm de

emisión) para la localización celular de la proteína verde fluorescente (GFP) la cual se

encuentra unida a los factores de transcripción MYB expresados en las células vegetales

transgénicas.

CAPÍTULO III

88

3.3 RESULTADOS

3.3.1 Generación de plantas transgénicas de tabaco con sobreexpresión de los

genes CpMYB4 y CpMYB44

Se hicieron construcciones de los vectores binarios necesarios para el sistema de

generación de plantas transgénicas empleando el vector pK7FWG2.0 y los genes

CpMYB4 y CpMYB44. En el Cuadro 3.5 se enlistan por pares de oligos específicos

empleados para la generación de las construcciones pK7FWG2.0::CpMYBs.

Cuadro 3.5 Pares de oligos con adaptadores Gateway para los genes CpMYBs.

Gen Forward Reverse

CpMYB4 AAAAAGCAGGCTTCACCATG GGA

AGG TCT CCA TG AGAAAGCTGGGTG TTT CAT CTC

CAT TAA ACC TCT G

CpMYB44 AAAAAGCAGGCTTCACCATGGCTT

CAACGAGGAAAGATG AGAAAGCTGGGTGCTCAATCTTGCT

AATTCCAATTCGC

Posteriormente, las diferentes construcciones pK7FWG2.0::CpMYBs fueron insertadas en

células de A. tumefaciens EHA105 mediante un choque térmico. Una vez corroborada la

presencia de la construcción mediante PCR de colonia (Figura 3.3), se procedió a realizar

la transformación de explantes de hojas de tabaco para la generación de plantas

transgénicas empleando distintos medios MS de selección y generación de brotes (Figura

3.4).

CAPÍTULO III

89

Figura 3.3 De izquierda a derecha: amplificación del gen

CpMYB4 (A), amplificación del gen CpMYB44 (B), células de A.

thumefaciens EHA105 empleadas como vector de clonación de

plásmidos (C).

Figura 3.4 Proceso de generación de plantas transgénicas de tabaco.

Se generaron al menos seis líneas independientes de plantas de transgénicas de tabaco

(T0) con sobreexpresión verificada de los genes CpMYB4 y CpMYB44. La verificación de

la transformación se realizó por la presencia de los genes NPTII y CpMYB4 o CpMYB44

por PCR de punto final del ADN genómico de las plantas (Figuras 3.5 a 3.9). Se

CAPÍTULO III

90

colectaron al menos seis cápsulas de semillas T1 de cada planta transgénica y se

almacenaron a 4 °C hasta su posterior selección.

Figura 3.5 Análisis por PCR del gen NPTII en muestras de

ADNg de plantas transgénicas de tabaco con

sobreexpresión del gen CpMYB44. Nomenclatura: KB:

marcador de peso molecular; WT: planta silvestre; 1-6:

plantas T0; NC: control negativo.

Figura 3.6 Análisis por PCR del gen CpMYB44 en muestras de ADNg de

plantas transgénicas de tabaco con sobreexpresión del gen CpMYB44.

Nomenclatura: KB: marcador de peso molecular; NC: planta silvestre; 1-6:

plantas transgénicas T0.

CAPÍTULO III

91

Figura 3.7 Análisis por PCR de los genes NPTII y CpMYB4 en muestras

de ADNg de plantas transgénicas de tabaco con sobreexpresión del gen

CpMYB4. Nomenclatura: KB: marcador de peso molecular; Wt: planta

silvestre; 1-3 (verde) amplificación del gen NPTII en plantas T0 del gen

CpMYB4; 1-3 (morado) amplificación del gen CpMYB4 en plantas T0 del

gen CpMYB4, CN: control negativo.

Figura 3.8 Análisis por PCR del gen NPTII en muestras de ADNg de


Nomenclatura: KB: marcador de peso molecular; Wt: planta silvestre; 4-

17: plantas T0 del gen CpMYB4; 44.8: planta T0 del gen CpMYB44 línea

8, CN: control negativo.

CAPÍTULO III

92



Nomenclatura: KB: marcador de peso molecular; Wt: planta silvestre; 4-

17: plantas transgénicas T0, CN: control negativo.

Una vez seleccionadas las líneas de plantas T0 con sobreexpresión de los genes

CpMYB44 y CpMYB4, se procedió a la selección de semillas T1 en medios MS de

selección con kanamicina (300 mg/L) (Figuras 3.10 y 3.11).

Figura 3.10 Selección de plantas T1 de las líneas 1 a 7 del gen CpMYB44

en medio de selección con kanamicina. Se empleó una línea silvestre (wild

type) como control negativo.

CAPÍTULO III

93

Figura 3.11 Selección de plantas T1 de las líneas 1, 2, 4, 5, 7, 9 y 14 del

gen CpMYB4 en medio de selección con kanamicina. Se empleó una línea

silvestre (wild type) como control negativo.

Posteriormente se seleccionaron seis líneas T1 CpMYB44 (CpMYB44.1, 2, 4, 5, 6 y 7) y

seis líneas T1 CpMYB4 (CpMYB4.1, 2, 4, 5, 7 y 14) para generar plantas adultas de la

generación T1. Se plantaron 10 individuos de cada línea y una vez alcanzada la edad

adulta se procedió a la colecta de semillas de la generación T2.

Se colectaron y almacenaron varias cápsulas de la mayoría de los individuos T1.

Posteriormente las semillas de tres cápsulas de diferentes líneas de individuos T1 de

ambos genes fueron sembrados en medios MS de selección con kanamicina (300 mg/L)

para la selección de plantas de la generación T2 (Figuras 3.12 a 3.16).

CAPÍTULO III

94

Figura 3.12 Selección de plantas T2 de las líneas CpMYB4.2.7 (A) y

CpMYB4.4.7 (B) del gen CpMYB4 en medio de selección con kanamicina.

Se empleó una línea silvestre (wild type) como control negativo. Se

indica el número de plantas que formaron cotiledones sanos en

aproximadamente 10 días.



Se empleó una línea silvestre (wild type) como control negativo. Se indica el

número de plantas que formaron cotiledones sanos en aproximadamente 10

días.

CAPÍTULO III

95





días.





días.

CAPÍTULO III

96

Figura 3.16 Selección de plantas T2 de la línea

CpMYB44.5.3 del gen CpMYB44 en medio de

selección con kanamicina. Se empleó una línea

silvestre (wild type) como control negativo. Se indica

el número de plantas que formaron cotiledones sanos

en aproximadamente 10 días.

Posteriormente se seleccionaron alrededor de 25 plántulas de cuatro líneas T2 CpMYB4

(denominadas como 4.1.7.11, 4.2.7.1, 4.4.7.2 y 4.14.5.2) y seis líneas T2 CpMYB44

(denominadas como 44.1.4.4, 44.4.3.1, 44.5.3.6, 44.6.7.2, 44.6.7.3 y 44.7.2.1) para su

crecimiento en medio Sunshine (Figura 3.17). Debido a una tasa de crecimiento mayor

respecto a las demás líneas, las plantas de las líneas T2 CpMYB4 4.4.7.2 y las líneas T2

CpMYB44 44.6.7.2 fueron seleccionadas (Figuras 3.18 y 3.19) para la elaboración de

experimentos individuales de estrés por sequía y salinidad para evaluar el efecto de la

sobreexpresión de los genes CpMYBs en plantas transgénicas de tabaco sometidas a

estos mismos estreses abióticos respecto a la producción de metabolitos secundarios

(compuestos fenólicos). Los resultados de los análisis se muestran en el capítulo

siguiente.

CAPÍTULO III

97

Figura 3.17 Crecimiento de plantas T2 de diferentes líneas de

los genes CpMYB4 y CpMYB44 para análisis cromatográficos

posteriores.


plantas transgénicas de tabaco de la línea T2 4.4.7.2. Nomenclatura: 1 KB:

marcador de peso molecular; 1-12: plantas transgénicas T2, CN: control

negativo.


plantas transgénicas de tabaco de la línea T2 44.6.7.2. Nomenclatura: 1 KB:

marcador de peso molecular; 1-12: plantas transgénicas T2, CN: control

negativo.

CAPÍTULO III

98

3.3.2 Ubicación de los CpMYBs en tejidos de plantas transgénicas positivas

La ubicación de los factores de transcripción CpMYBs se llevó a cabo mediante la

visualización de la proteína verde fluorescente (GFP) fusionada a los CpMYBs traducidos

de los genes CpMYBs en el vector pK7FWG2.0. La visualización se realizó mediante

microscopía confocal (Figura 3.20). El compuesto DAPI sirve para la tinción de núcleos

celulares, lo cuales se aprecian en las imágenes obtenidas. Las proteínas CpMYBs se

ubicaron en diferentes compartimientos celulares siendo los núcleos las áreas con mayor

concentración.

Figura 3.20 Localización de las proteínas CpMYBs en tejidos de plantas

de tabaco. Descripción de la imagen: Campo claro: luz clara; DAPI:

reactivo de tinción nuclear; GFP: proteína verde fluorescente; MERGE:

superposición de las imágenes de DAPI, GFP y campo claro con una

resolución de 40×. Las flechas amarillas indican las zonas de

superposición de las señales por DAPI y GFP.

CAPÍTULO III

99

3.4 DISCUSIÓN

Desde el inicio del estudio y generación de plantas transgénicas hace más de dos

décadas, el desarrollo de nuevos mecanismos de generación y selección de plantas

transgénicas ha adquirido gran importancia. La generación de plantas modificadas

genéticamente es una herramienta importante que puede emplearse para facilitar la

comprensión de la organización y regulación de los genes eucarióticos en los organismos.

Las plantas transgénicas pueden tener aplicaciones importantes en casi todas las ramas

de la biología ya que estos ofrecen nuevos medios para la generación de plantas que

pueden tolerar mejor las condiciones de estrés (biótico o abiótico) así como para la

producción de metabolitos que puedan ser empleadas en diferentes ramas comerciales

tales como en la industria farmacéutica, alimenticia, entre otras (Moon et al., 2010; James

et al., 2002).

Es de suma importancia que las plantas generadas mantengan las propiedades

adquiridas a través del paso de las generaciones de individuos; sin embargo, lograr esta

condición muchas veces es difícil de alcanzar ya que los niveles de expresión y los

patrones de herencia transgénica generalmente muestran una amplia variación entre

líneas de plantas generadas independientemente aun cuando estas lleven la misma

construcción (vectores con genes exógenos) y sean generadas con las mismas

condiciones. Algunas de las posibles causas de estas variaciones son el número de

copias del gen exógeno insertadas en el genoma huésped así como las posiciones en las

cuales se dan estas inserciones en los genomas (Dietz-Pfeilstetter, 2010; Bhat y

Srinivasan, 2002).

Cada vez que las plantas transgénicas T0 se someten a procesos de autofecundación

pueden presentarse diversas constituciones genotípicas: individuos hemicigotos

(individuos con una única copia de un gen), individuos homocigotos (individuos con dos

alelos idénticos de un gen) e individuos negativos (sin copias del gen). Según la genética

mendeliana, la población segregadora de un solo gen (monohíbrido) produce una relación

genotípica 1:2:1 (homocigoto:hemicigoto:negativo) para el transgén. Esto indica que sólo

el 25% de las plantas son homocigotas para el transgén (formas dominantes o recesivas)

las cuales son más útiles para el mejoramiento de los cultivos (Passricha et al., 2016; Dai

et al., 1999).

CAPÍTULO III

100

Actualmente se han generado diferentes líneas (generación T3) transgénicas de plantas

transgénicas de tabaco con sobreexpresión los genes CpMYBs. Durante el inicio del

proceso de generación de plantas transgénicas con sobreexpresión de los genes

CpMYBs se emplearon tres criterios de selección: selección de líneas positivas mediante

antibióticos, análisis de presencia de genes insertados mediante PCR de punto final de

los genes insertados usando como sustrato ADN genómico de las plantas insertadas y la

fluorescencia de la GFP en tejidos celulares transformados.

Los resultados que se discuten en el siguiente capítulo (perfiles cromatográficos de

plantas transgénicas de tabaco) son un punto clave para la determinación de la existencia

de algún posible efecto de la sobreexpresión de los genes CpMYBs en las plantas de

tabaco y de la caracterización de las funciones que pueden desempeñar estos en la

generación de compuestos fenólicos ante un estrés abiótico.

CAPÍTULO IV

101

CAPÍTULO IV

ANÁLISIS DE PERFILES CROMATOGRÁFICOS OBTENIDOS POR HPLC DE

EXTRACTOS DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE TABACO

SOBREEXPRESANTES DE LOS GENES CpMYBs EN CONDICIONES DE

ESTRÉS POR SEQUÍA

4.1 INTRODUCCIÓN

N. tabacum es una planta modelo adecuada para el estudio de la funcionalidad de genes

exógenos de interés en la generación de metabolitos secundarios, tales como los

compuestos fenólicos. En el caso de los factores de transcripción MYB, N. tabacum ha

resultado ser un modelo ideal para el estudio de la funcionalidad de genes MYBs que al

ser sobreexpresados en esta ocasionan cambios significativos en la diversidad y

concentración de metabolitos secundarios importantes tales como los compuestos

fenólicos. Por ejemplo, la sobreexpresión del gen AtCAPRICE (que codifica para un MYB

R2R3) causa una disminución significativa en la producción de flavonoides así como una

clara variación en la coloración de las flores conforme incrementa su expresión relativa en

las plantas transgénicas (W. Zhang et al., 2009).

La metabolómica, un enfoque moderno popular empleado para la identificación de un gran

número de compuestos de bajo peso molecular en muestras biológicas, se ha aplicado

con éxito en el descubrimiento de fármacos (Wishart, 2008), ciencias de los alimentos

(Cevallos-Cevallos et al., 2009) y en estudios de sistemas biológicos (Broeckling et al.,

2012). Las tres plataformas de análisis más comúnmente utilizados para la identificación y

cuantificación de metabolitos en muestras biológicas son la cromatografía de gases-

espectrometría de masas (CG-EM), resonancia magnética nuclear (RMN) y cromatografía

líquida-espectrometría de masas (CL-EM) (Patti et al., 2012). Si bien, ninguno de estos es

independiente en el sentido de que proporcione una cobertura completa del metaboloma

de una muestra, la CG-EM se encuentra entre los más ampliamente aplicados debido a

su capacidad para separar mezclas complejas de metabolitos con alta eficiencia y a bajo

costo (A. Zhang et al., 2012).

CAPÍTULO IV

102

Un ejemplo de la variación de la producción, separación e identificación de metabolitos en

tejidos de plantas modificadas genéticamente es el realizado por Broeckling et al. (2012)

en el cual se estudió el efecto de la expresión de los genes PAP1 (Production of

Antocyanin Pigment 1, que codifica para un factor de transcripción R2R3-MYB) y el gen

ANR (una reductasa de flavonoides dependiente de NADPH/NADH) en la producción de

metabolitos en tejidos de plantas de tabaco. La identificación de los metabolitos se llevó a

cabo mediante CG-EM. Los resultados de este estudio indicaron una variación

significativa en la producción de metabolitos relacionados con la síntesis de antocianinas,

así como la variación de varios tipos de metabolitos en los diferentes tejidos de plantas

transgénicas en comparación con plantas silvestres de tabaco.

Plantas transgénicas de tabaco con sobreexpresión del gen AtMYB75 (PAP1) presentaron

una variación significativa en la producción de flavonoides y antocianinas, la expresión de

enzimas que participan en la síntesis de estos y la tolerancia ante un estrés biótico

(Gogna et al., 2015).

La cromatografía líquida de alta resolución o HPLC es una técnica cromatográfica usada

para la separación de los componentes de diferentes tipos de muestras usando una

variedad de interacciones químicas entre el analito y la columna cromatográfica. Es un

sistema compuesto físicamente de un reservorio de la fase móvil, bomba, inyector,

columna de separación y detector. El analito se pasa a través de una columna de la fase

estacionaria bombeando la fase móvil liquida con alta presión. La muestra se introduce en

pequeños volúmenes a la corriente de la fase móvil y allí se retarda por medio de

interacciones químicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna. El retardo

se conoce como tiempo de retención, único para cada analito y este varía de acuerdo a la

naturaleza del analito, de la fase estacionaria y la composición de la fase móvil. Los

solutos más comunes usados en la fase móvil son combinaciones de agua con líquidos

orgánicos, tales como metanol y acetonitrilo, también suelen usarse sales,

amortiguadores (buffers) y ácidos para contribuir a la separación de los componentes.

También se usan ácidos para actuar como formadores de pares iónicos (Abburra, 2007).

En este capítulo se presentan los resultados obtenidos de la caracterización de los

perfiles cromatográficos de compuestos fenólicos en tejidos de hojas de plantas de tabaco

silvestres y transgénicas con sobreexpresión de los genes CpMYBs. El objetivo principal

CAPÍTULO IV

103

de este estudio fue la elucidación de la funcionalidad de factores de trascripción MYB de

genes aislados de la planta C. papaya (CpMYBs) mediante el análisis de la variación de la

producción de compuestos fenólicos en plantas modelo de N. tabacum (tabaco) silvestre y

plantas de tabaco transgénicas con sobreexpresión de los genes CpMYBs sometidas a

estrés por sequía. En el capítulo V se muestran los resultados de perfiles cromatográficos

y caracterización de compuestos fenólicos de hojas de plantas silvestres de C. papaya

sometidos a estrés por sequía.

CAPÍTULO IV

104


4.2.1 Reactivos y equipos

Para la extracción del material vegetal se empleó metanol grado HPLC marca Scharlab

Chemie (Barcelona, España). Para el análisis por HPLC se emplearon metanol y ácido

fórmico grado HPLC-MS de la marca Fisher Scientific (Leicesthershire, Reino Unido). El

agua ultrapura (18. Ω / cm) utili ada para los procesos de extracción y análisis por

HPLC se obtuvo de un instrumento Milli-Q (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Se

emplearon distintos estándares de compuestos fenólicos todos de la marca Sigma Aldrich:

ácido cinámico, ácido coumárico, ácido clorogénico, naringenina y quercetina.

Las extracciones de compuestos fenólicos se realizaron empleando una sonda de

ultrasonido enfocada de alta intensidad (modelo VCX130, Sonics Vibra-Cell, Hartford, CT,

EE. UU.). Los extractos se evaporaron a sequedad utilizando un concentrador

(Concentrator Plus, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). La absorbancia de cada muestra

se midió utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (Agilent Cary 8454). El análisis de los

compuestos fenólicos se realizó utilizando un equipo HPLC 1100 de Agilent (Agilent

Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La separación se llevó a cabo utilizando una

columna analítica Ascentis Express C18 de núcleo fundido poroso (150 mm × 2.1 mm, 2.7

µm) con una columna protectora Ascentis Express C18 (0.5 cm × 2.1 mm, 2.7 µm), ambas

de Supelco (Bellefonte, PA, USA).

4.2.2 Material vegetal

Se analizaron hojas (tercera hoja más joven) de plantas de tabaco silvestres y plantas de

tabaco transgénicas (plantas de la línea T2 CpMYB4 4.4.7.2 y la línea T2 CpMYB44

44.6.7.2) con sobreexpresión de genes CpMYBs en condiciones de crecimiento óptimas y

sometidas a estrés por sequía. Las muestras se liofilizaron y se mantuvieron en

congelación hasta su análisis.

CAPÍTULO IV

105

4.2.3 Estrés por sequía

Durante el experimento de estrés por sequía se aplicaron tres tipos de tratamientos:

plantas en condiciones control en el día inicial (control 0 d), plantas en condiciones

óptimas en el día final (control 12 d) y plantas en condiciones de sequía en el día final

(sequía 12 d). Para cada tratamiento de estrés en los distintos tipos de hojas de tabaco se

emplearon al menos tres individuos.

4.2.4 Ensayo de capacidad antioxidante equivalente a Trolox (TEAC)

Se empleo el ensayo TEAC descrito por Plaza et al. (2014) para la determinación de la

actividad antioxidante de las muestras de extractos de tabaco. La absorbancia de cada

muestra se midió a 734 nm. El reactivo Trolox se usó como estándar de referencia y los

resultados se expresaron como valores TEAC (Trolox mmol por g de extracto en peso

seco). Estos valores se obtuvieron a partir de cuatro concentraciones diferentes (con un

rango de 0.5 a 2.5 mg mL−1) de cada extracto para dar una respuesta lineal entre 20 y 80%

de la absorbancia inicial.

4.2.5 Proceso de extracción de compuestos fenólicos

Se realizó un proceso de estandarización previo empleando muestras de hojas liofilizadas

de tabaco silvestre en condiciones control en el día inicial para determinar las condiciones

óptimas para extraer la concentración mayoritaria de compuestos fenólicos. Se emplearon

distintos tipos de disolventes (metanol acuoso 70% (v/v) y 100% metanol) y distintos

tiempos de extracción (10 o 20 min), manteniendo la temperatura de las muestras

alrededor de 4-8 °C. Se transfirieron alícuotas de hojas liofilizadas (20 mg) en tubos de

microcentrífuga que contenían 1 mL de disolvente cada uno. Las muestras se colocaron

en un baño de hielo y se sonicaron durante 10 o 20 min. Después de la sonicación, las

muestras se centrifugaron dos veces (13,000 rpm a 4 °C durante 15 min) y se eliminó el

sobrenadante. Los extractos se evaporaron a sequedad durante al menos 4 horas a 30 °C.

Los extractos secos se disolvieron en metanol acuoso 50% (v/v) a una concentración de

CAPÍTULO IV

106

10 mg/mL previamente a su análisis por HPLC-DAD. El número de señales, el tamaño de

las áreas y la resolución de los diferentes cromatogramas se compararon como criterios

de selección de las mejores condiciones de extracción. Posteriormente se llevó a cabo el

proceso de extracción de los demás tipos de muestras.

4.2.6 Preparación de estándares de compuestos fenólicos

Los estándares ácido cinámico, ácido coumárico, naringenina y quercetina se disolvieron

en una disolución de metanol:agua (50:50) a una concentración de 1.0 mg/mL. El

estándar de ácido clorogénico se disolvió en agua a una concentración de 1.0 mg/mL. A

partir de estos stocks de estándares se prepararon nuevos estándares a una

concentración de 0.1 mg/mL en metanol HPLC. También se preparó una mezcla de todos

los estándares a una concentración de 0.1 mg/mL en metanol HPLC.

4.2.7 Análisis de compuestos fenólicos por HPLC-DAD

Para el análisis de los compuestos fenólicos se empleó un método previamente publicado

pero con algunas modificaciones (Plaza et al., 2016). El instrumento de HPLC estaba

equipado con un desgasificador en línea, una bomba de disolvente cuaternaria, un

muestreador automático, un compartimento de calentador de columna y un detector de

matriz de fotodiodos (DAD) con capacidades de escaneo, todo controlado por el software

ChemStation (Agilent). Debido a la diversidad de longitudes de onda de absorción de los

compuestos fenólicos (Lattanzio et al., 2006), se eligieron diferentes longitudes de onda

para el análisis de HPLC: 250, 280, 350 y 520 nm. La temperatura de la columna fue de

50 ºC y la velocidad de flujo de 250 µL min1. Se inyectaron dos microlitros de extracto de

cada muestra. Las fases móviles consistieron en (A) agua con ácido fórmico al 0.5% y (B)

metanol con ácido fórmico al 0.5% en un análisis de gradiente programado como sigue: 0

min, 5% (B); 0-5 min, 5% (B); 5-35 min, 45% (B); 35-45 min, 45% (B); Con 10 min de post

tiempo para limpieza de la columna antes de la siguiente inyección. Cada extracto se

inyectó por duplicado.

CAPÍTULO IV

107

Una vez obtenidos los cromatogramas se procedió a la asignación de los números de

picos/señales obtenidos en los diferentes cromatogramas. Posteriormente se inició el

análisis de los tiempos de retención y las áreas de los diferentes picos/señales presentes

en los cromatogramas obtenidos. Las áreas de los picos obtenidos fueron analizadas con

el software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) para determinar

si existe alguna variación estadísticamente significativa entre los distintos tipos de plantas

(silvestres y transgénicas) así como entre los distintos tratamientos.

4.2.8 Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 7.0

(GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Las colecciones de muestras de tejido, así

como la medición de los parámetros fisiológicos se repitieron al menos tres veces en

diferentes individuos en cada uno de los diferentes experimentos. Todos los análisis se

realizaron por triplicado. Las medias de la mayoría de los experimentos se compararon

mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA), con la excepción de los datos

obtenidos a partir del análisis de HPLC-DAD que se analizaron con ANOVA de dos vías.

Las diferencias significativas entre los grupos de tratamiento se evaluaron con la prueba

de Dunnett (p ≤ 0.0 ).

CAPÍTULO IV

108

4.3 RESULTADOS

4.3.1 Experimento de estrés por sequía

Al inicio del experimento los distintos tipos de plantas de tabaco (silvestres,

sobreexpresantes del gen CpMYB44 y sobreexpresantes del gen CpMYB4) presentaron

el mismo fenotipo: tallos de altura similar y hojas verdes oscuras turgentes. Las plantas

control (doce días con riego) presentaron un crecimiento significativo de sus tallos, un

incremento en el número de hojas turgentes e inicio de la floración. En contraste, las

plantas en estrés (doce días sin riego) presentaron muy poco crecimiento del tallo, poca

generación y crecimiento de hojas, pérdida de la turgencia de las hojas e inicio de la

floración. No se presentaron diferencias significativas entre los fenotipos de las plantas

silvestres y plantas transgénicas ni se presentaron diferencias notorias de la tolerancia de

las plantas transgénicas sometidas al estrés por sequía (Figura 4.1).

CAPÍTULO IV

109

Figura 4.1 Fenotipos de plantas de tabaco

sometidas a diferentes condiciones de

crecimiento: control (A), 12 días con riego (B)

y 12 días sin riego (C). Nomenclatura:

plantas silvestres (Wt), plantas

sobreexpresantes del gen CpMYB44

(CpMYB44), plantas sobreexpresantes del

gen CpMYB4 (CpMYB4).

CAPÍTULO IV

110

4.3.2 Análisis cromatográficos por HPLC-DAD de extractos de hojas de N.

tabacum

Muestras de hojas liofilizadas de tabaco silvestre en condiciones control en el día inicial

fueron empleadas como muestras estándar en el proceso de estandarización. Para la

estandarización del proceso de extracción de compuestos fenólicos se consideraron dos

variables durante el proceso de extracción: polaridad de los disolventes y tiempo de

extracción asistida con la sonda de ultrasonido (Figuras 4.2 a 4.4). Al analizar los

resultados preliminares de los cromatogramas de los diferentes extractos de hojas se

observó que las señales de los picos detectadas en los cromatogramas obtenidos a 250,

280 y 350 nm fueron muy similares, siendo el mayor número de picos observados a 280

nm. Los cromatogramas obtenidos a 520 nm no presentaron ningún pico, lo cual podría

deberse a la ausencia de antocianinas las cuales presentan una máxima absorción a esta

longitud de onda Welch et al. (2008). Por lo tanto, los cromatogramas obtenidos a 280 y

350 nm fueron analizados en profundidad.

Figura 4.2 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco silvestre en

condiciones control extraídos con 100% metanol. Nomenclatura: A: cromatograma de

extracto sometido a 10 min de sonicación analizado a 280 nm; B: cromatograma de

extracto sometido a 10 min de sonicación analizado a 350 nm; C: cromatograma de

extracto sometido a 20 min de sonicación analizado a 280 nm; D: cromatograma de

extracto sometido a 20 min de sonicación analizado a 350 nm.

CAPÍTULO IV

111

Figura 4.3 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco extraídos con metanol

acuoso 70% (v/v). Nomenclatura: A: cromatograma de extracto sometido a 10 min de

sonicación analizado a 280 nm; B: cromatograma de extracto sometido a 10 min de

sonicación analizado a 350 nm; C: cromatograma de extracto sometido a 20 min de

sonicación analizado a 280 nm; D: cromatograma de extracto sometido a 20 min de

sonicación analizado a 350 nm.

CAPÍTULO IV

112

Figura 4.4 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco sometidas a 10 min

de sonicación extraídos con 100% metanol y metanol acuoso 70% (v/v). Nomenclatura: A:

cromatograma de extracto obtenido con 100% metanol analizado a 280 nm; B:

cromatograma de extracto obtenido con 100% metanol analizado a 350 nm; C:

cromatograma de extracto obtenido con metanol acuoso 70% (v/v) analizado a 280 nm; D:

cromatograma de extracto obtenido con metanol acuoso 70% (v/v) analizado a 350 nm.

Después de analizar los cromatogramas de los extractos obtenidos con diferentes

disolventes y tiempos de extracción, se generaron las siguientes observaciones: 1) había

una mayor cantidad de señales e intensidades de los picos obtenidos en los

cromatogramas de extractos obtenidos con 100% metanol en comparación con los

obtenidos con metanol acuoso 70% (v/v). 2) el tiempo de extracción asistida con la sonda

de ultrasonido no genero diferencias significativas entre los cromatogramas obtenidos.

Con base en las observaciones anteriores, se determinaron las condiciones óptimas para

la extracción de compuestos fenólicos: 100% metanol como disolvente de extracción y 10

min de extracción asistida con la sonda de ultrasonido.

Después de establecer las condiciones óptimas de extracción de compuestos fenólicos,

se realizó el análisis de los estándares de compuestos fenólicos (Figura 4.5). Los

diferentes estándares seleccionados forman parte de diferentes rutas de síntesis de otros

compuestos fenólicos de mayor complejidad. El objetivo del análisis de estos estándares

fue detectar cambios en sus concentraciones en las muestras (mediante la comparación

CAPÍTULO IV

113

de sus respectivas áreas) los cuales pueden ser empleados para la elucidación de

posibles rutas de síntesis de otros compuestos fenólicos en los extractos como

mecanismo de respuesta a las condiciones de estrés.

Figura 4.5 Perfil cromatográfico de una mezcla de los cinco estándares seleccionados

analizados a 280 y 350 nm. Tiempos de retención: A: ácido cinámico (36.900 min), B:

ácido coumárico (19.227 min), C: ácido clorogénico (15.226 min), D: naringenina (37.751

min), E: quercetina (34.100 min).

Se realizo la co-inyección de una muestra de un extracto de hojas de tabaco sometido a

10 min de sonicación extraído con 100% metanol con la mezcla de los cinco estándares

seleccionados para su identificación en los extractos de muestras de tabaco comparando

sus tiempos de retención respectivos. Debido su combinación para la co-inyección, las

muestras modificaron sus concentraciones a la mitad de la original. Sin embargo, ninguno

de los picos detectados en los extractos de muestras de tabaco coincidió con los picos

específicos de los estándares seleccionados (Figura 4.6).

CAPÍTULO IV

114

Figura 4.6 Perfiles cromatográficos de una mezcla de los cinco estándares

seleccionados y una muestra de extractos de hojas de tabaco sometidas a 10 min

de sonicación extraídos con 100% metanol (A), una mezcla de los cinco estándares

seleccionados (B) y una muestra de extractos de hojas de tabaco sometidas a 10

min de sonicación extraídos con 100% metanol (C) analizados a 280. Tiempos de

retención: A: ácido cinámico (36.900 min), B: ácido coumárico (19.227 min), C:

ácido clorogénico (15.226 min), D: naringenina (37.751 min), E: quercetina (34.100

min).

Posteriormente se procedió a la extracción de los compuestos fenólicos de las muestras

de hojas de plantas de tabaco silvestre y tabacos transgénicos con sobreexpresión de los

genes CpMYBs del experimento de estrés por sequía. Cada tratamiento en los diferentes

tipos de hojas de tabaco se realizó por triplicado. De cada grupo de triplicados, se escogió

un cromatograma representativo. En las figuras siguientes se muestran las

comparaciones de varios de los distintos cromatogramas obtenidos. Se emplearon dos

enfoques de comparación: 1) un solo tipo de muestra en los diferentes tipos de

tratamientos (Figuras 4.7 a 4.9) y 2) los diferentes tipos de muestras en un tipo de

tratamiento específico (Figuras 4.10 a 4.12).

CAPÍTULO IV

115

Figura 4.7 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco silvestres en

diferentes condiciones de estrés analizados a 280 (A) y 350 nm (B). Nomenclatura:

plantas en condiciones control en el día inicial (control 0 d), plantas en condiciones

control en el día final (control 12 d) y plantas en condiciones de sequía en el día final

(sequía 12 d).

CAPÍTULO IV

116


CpMYB44 44.6.7.2 en diferentes condiciones de estrés analizados a 280 (A) y 350

nm (B). Nomenclatura: plantas en condiciones control en el día inicial (control 0 d),

plantas en condiciones control en el día final (control 12 d) y plantas en condiciones

de sequía en el día final (sequía 12 d).

CAPÍTULO IV

117


CpMYB4 4.4.7.2 en diferentes condiciones de estrés analizados a 280 (A) y 350 nm

(B). Nomenclatura: plantas en condiciones control en el día inicial (control 0 d),

plantas en condiciones control en el día final (control 12 d) y plantas en condiciones

de sequía en el día final (sequía 12 d).

CAPÍTULO IV

118


control en el día inicial analizados a 280 (A) y 350 nm (B). Nomenclatura: hojas de

plantas silvestres (Silvestre), hojas de plantas de la línea T2 CpMYB44 44.6.7.2

(CpMYB44) y hojas de plantas de la línea T2 CpMYB4 4.4.7.2 (CpMYB4).

CAPÍTULO IV

119


control en el día inicial analizados a 280 (A) y 350 nm (B). Nomenclatura: hojas de

plantas silvestres (Silvestre), hojas de plantas de la línea T2 CpMYB44 44.6.7.2

(CpMYB44) y hojas de plantas de la línea T2 CpMYB4 4.4.7.2 (CpMYB4).

CAPÍTULO IV

120

Figura 4.12 Perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco plantas en

condiciones de sequía en el día final analizados a 280 (A) y 350 nm (B).

Nomenclatura: hojas de plantas silvestres (Silvestre), hojas de plantas de la línea T2

CpMYB44 44.6.7.2 (CpMYB44) y hojas de plantas de la línea T2 CpMYB4 4.4.7.2

(CpMYB4).

Posterior a la asignación de los picos detectados en los cromatogramas se procedió al

ordenamiento de datos, específicamente de las áreas de los picos. Estos datos (consultar

CAPÍTULO IV

121

Anexo I y II) se emplearon para la comparación de las variaciones de la

presencia/ausencia de los picos/señales y determinar si existe alguna variación en las

plantas silvestres con respecto a las plantas transgénicas tanto en condiciones de

crecimiento normal como en condiciones de estrés de sequía.

4.3.3 Capacidad antioxidante de extractos de hojas de N. tabacum

Los extractos de las distintas muestras (plantas silvestres y plantas transgénicas)

sometidas a los distintos tratamientos (control al inicio del experimento, control al final del

experimento y sequía al final del experimento) presentaron los siguientes

comportamientos: se observó un aumento general de la actividad antioxidante de las

plantas control al final del experimento (silvestre: 0.65 ± 0.22 mmol Trolox g P.S.−1;

CpMYB44: 0.75 ± 0.38 mmol Trolox g P.S.−1; CpMYB4: 1.03 ± 0.09 mmol Trolox g P.S.−1)

respecto a las plantas control al inicio del experimento (silvestre: 0.31 ± 0.05 mmol Trolox

g P.S.−1; CpMYB44: 0.69 ± 0.20 mmol Trolox g P.S−1; CpMYB4: 0.45 ± 0.11 mmol Trolox g

P.S.−1); respecto a las muestras sometidas al estrés por sequía (silvestre: 0.38 ± 0.11

mmol Trolox g P.S.−1; CpMYB44: 0.45 ± 0.03 mmol Trolox g P.S.−1; CpMYB4: 0.34 ± 0.03

mmol Trolox g P.S.−1), no se observaron diferencias estadísticamente significativas de las

actividades antioxidantes de los diferentes tipos de extractos con respecto a las plantas

control al inicio del experimento (0 días). A pesar de los diferentes comportamientos

observados en los diferentes tratamientos, las plantas transgénicas no presentaron

cambios estadísticamente significativos de sus actividades antioxidantes respecto a las

plantas silvestres (Figura 4.13).

CAPÍTULO IV

122

Figura 4.13 Capacidad antioxidante equivalente a Trolox de extractos de

hojas de plantas tabaco bajo tratamiento de estrés por sequía. Las columnas

representan la media obtenida de tres experimentos independientes para

cada tratamiento y las líneas verticales marcan la desviación estándar. Los

datos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía

utilizando la prueba de Dunnett con un valor de P ≤ 0.05. Los asteriscos sobre

las columnas indican valores que son estadísticamente diferentes de sus

valores control respectivos (* p ≤ 0.0332, ** p ≤ 0.0021, *** p ≤ 0.0002).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Sequía 0 d Control 12 d Sequía 12 d

mm

ol T

rolo

x g

P.S

.-1

Silvestre

CpMYB44

CpMYB4

*

CAPÍTULO IV

123

4.4 DISCUSIÓN

La manipulación del metabolismo de compuestos fenólicos, especialmente en respuesta a

estreses bióticos o abióticos, puede tener efectos secundarios imprevistos, ya que estos

compuestos pertenecen al grupo más grande de los metabolitos producidos por las

plantas (Mellway et al., 2009). Los diferentes tipos de análisis por HPLC son herramientas

ampliamente empleadas para la elaboración de perfiles cromatográficos así como para la

cuantificación e identificación de diversos compuestos fenólicos (Julianti et al., 2014;

Mitsunami et al., 2014; Nour et al., 2013; Zhang et al., 2009).

Se generó una metodología adecuada para la identificación por HPLC de los estándares

de compuestos fenólicos. A pesar de que estos estándares de compuestos fenólicos

pudieron ser analizados, estos no estuvieron presentes en los cromatogramas de los

extractos de hojas de tabaco indicando su ausencia en los extractos. Lo anterior puede

deberse a que estos metabolitos pudieran estar presentes a concentraciones muy bajas

por debajo de los límites de detección del equipo empleado o a que estos se encuentran

presentes en formas conjugadas (con azúcares, por ejemplo). No se observaron

diferencias significativas entre los fenotipos de las plantas de tabaco silvestres y las

plantas transgénicas en condiciones de crecimiento óptimo (con riego) ni tampoco se

observaron diferencias de las plantas transgénicas a la tolerancia al estrés por sequía.

Al analizar los diferentes perfiles cromatográficos de extractos de hojas de tabaco se

observó, en general, un aumento en la cantidad e intensidad de los picos señales en las

plantas (tanto en las plantas silvestres como en las transgénicas) sometidas a estrés por

sequía por doce días y las plantas en condiciones óptimas a los doce días en

comparación con las plantas control en el día cero. Sin embargo, al comparar las áreas de

los picos entre los diferentes tipos de plantas de tabaco (silvestres y transgénicas) no se

encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los distintos tipos de planta

de tabaco o en las distintas condiciones del estrés por sequía. El único pico/señal que

presento diferentes comportamientos distintivos entre los diferentes tipos de plantas y

tratamientos fue el pico 8 (15.354 min), el cual podría ser un derivado del ácido

clorogénico ya que presento un tiempo de retención (15.226 min) similar al pico 8.

Respecto a la actividad antioxidante de las muestras, a pesar de las diferencias

observadas entre los tratamientos (control inicial, control a los doce días y sequía a los

CAPÍTULO IV

124

doce días), no se encontraron datos estadísticamente significativos para poder establecer

diferencias entre las plantas silvestres y las transgénicas.

Con base en los resultados obtenidos de los análisis para la identificación y cuantificación

de los compuestos fenólicos en los tejidos de plantas de tabaco silvestres y en plantas de

las líneas de plantas transgénicas de tabaco generación T2 que sobreexpresan los genes

CpMYBs sometidas a estrés por sequía se concluye que no existen evidencias de que los

factores de transcripción CpMYB caracterizados en este estudio participen en posibles

mecanismos de generación de compuestos fenólicos como mecanismo de respuesta ante

un estrés abiótico por sequía.

CAPÍTULO V

125

CAPITULO V

PHENOLIC COMPOUNDS INCREASE THEIR CONCENTRATION IN Carica

papaya LEAVES UNDER DROUGHT STRESS

5.1 RESUMEN

Carica papaya L. cv. Maradol es una planta tropical con alto valor comercial debido a su

consumo y alto valor nutricional. Estudios recientes han corroborado una gran diversidad

de actividades biológicas en extractos de diferentes partes de la planta que parecen ser

causadas por la presencia de compuestos fenólicos. En este trabajo, se estudió el efecto

del estrés por sequía en el contenido de compuestos fenólicos y las capacidades

antioxidantes de los extractos acuosos de hojas de papaya. Los resultados muestran que

el estrés por sequía en las plantas aumentó su capacidad antioxidante y el contenido y

diversidad de los compuestos fenólicos. Se identificaron varios compuestos fenólicos por

cromatografía líquida de alto rendimiento con detección de arreglo de fotodiodos acoplada

a espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo y algunos de ellos se

detectaron exclusivamente en hojas de papaya bajo estrés por sequía. Dado que este es

el primer informe de la influencia del estrés por sequía en la acumulación de compuestos

fenólicos en las hojas de las plantas de papaya, este estudio abre muchas perspectivas

para obtener una mayor cantidad y diversidad de compuestos fenólicos de los tejidos

vegetales en condiciones de estrés abiótico que podrían explotarse en los alimentos. e

industrias médicas.

Autores: Jorge Luis Espadas, Enrique Castaño, María Luisa Marina, Luis Carlos

Rodríguez, Merichel Plaza.

Revista: Acta Physiologiae Plantarum.

Estatus del artículo: aceptado.

CAPÍTULO V

126

5.2 INTRODUCTION

Carica papaya is a fruiting plant distributed in several tropical countries. It is extensively

cultivated since its fruit is known for its high nutritional value (Chan, 2009). Different

medicinal properties of different papaya tissues have been reported: unripe green fruits:

wound healing and abortifacient activity (Anuar et al., 2008); leaves: treatment of asthma

and as abortifacient (Krishna et al., 2008); fruits and seeds: anthelminthic and antiamebic

activities (Okeniyi et al., 2007).

Phenolic compounds or polyphenols are a unique group of phytochemicals found in many

plants and present in fruits, leaves, and other different parts of the plant. Their antioxidant

capacity is based on their functional groups which are capable of accepting the negative

charges of free radicals and are widely studied due to their benefit for human health and

treatment of diseases (Manach et al., 2004). Extracts of different plants with high phenolic

content have been in high demand in the food industry because they delay oxidative

decomposition of lipids and thus enhance the nutritional value of food (Kähkönen et al.,

1999). This had led to a particular interest in environmental factors that modify phenolic

concentration at their origin source within the plant as well as in the methodologies to

isolate, analyze and identify them (Watson, 2014). Recent studies on the identification of

phenolic compounds present in extracts from papaya leaf tissues have determined the

presence of different phenolic compounds using separation techniques such as HPLC

coupled to mass spectrometry (HPLC-MS) and gas chromatography mass spectrometry

(GC-MS) (Rivera-Pastrana et al., 2010; Canini et al., 2007).

Fields of plants cultivated for commercial interest are exposed to many abiotic stresses,

such as salinity and drought (Vinocur y Altman, 2005). Drought stress is the status in

which the quantity of available water at the root zone of the plant is lower than that which

is needed to keep its optimal development and productivity (Deikman et al., 2012). As

drought stress increases the formation of reactive oxygen species, plants counteract this

condition by increasing the production of antioxidant molecules such as phenolic

compounds (Król et al., 2014). Stomata are specially designed cells which react to external

and endogenous signals and modify their form to enable gas exchange. The movement

occurs as a consequence of increasing osmotic potential and turgor pressure (Croxdale,

2007). In water dehydration stress conditions, partial or total stomatal closure enables

CAPÍTULO V

127

plants to maintain a suitable water balance while restricting the carbon intake (Agurla et al.,

2018). Hence the concentration of CO2 inside the leaves decreases, and much less

NADPH + H+ and ATP are utilized for CO2 fixation in the Calvin cycle, causing a

substantial excess of NADPH + H+. Plants under drought stress conditions amass greater

concentrations of highly reduced compounds, for example, terpenoids, phenolics, or

alkaloids (Kleinwächter y Selmar, 2015; Selmar y Kleinwächter, 2013).

The papaya plant is considered to be relatively durable as it relates to drought stress and

exhibits responses classified as dehydration postmortem (Mahouachi et al., 2006; Marler,

2000). In spite of the existence of some studies carried out in different tissues of papaya

plants, most of the research focuses on the identification of phenolic compounds and their

biological activities. To date, there have been no reports about the effects of drought

stress on the diversity and concentration of phenolic compounds in papaya leaves as a

possible defense mechanism of the papaya plant. The aim of this study was to evaluate

the effects that drought stress can have on the variety and total content of phenolic

compounds present in extracts from papaya leaves.

CAPÍTULO V

128

5.3 MATERIALS AND METHODS

5.3.1 Chemical and reagents

All the chemicals were of analytical grade. Methanol and ethanol of HPLC grade were

purchased from Scharlab Chemie (Barcelona, Spain). Trolox ((±)-6-hydroxy-2,5,7,8-

tetramethylchromane-2-carboxylic acid), potassium persulfate, B S ( , ’-azinobis(3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt), DPPH• (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) and proline were obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany).

Methanol and formic acid of HPLC-MS grade were supplied by Fisher Scientific

(Leicesthershire, UK). Ultrapure water (18. Ω/cm) as obtained from a illi-Q

instrument (Millipore, Billerica, MA, USA). Sulphosalycilic acid, glacial acetic acid and

phosphoric acid were purchased from Fermont (Monterrey, Mexico). Ninhidryn was

obtained from Applichem (Darmstadt, Germany). Toluene was supplied by Reproquifin

(Estado de Mexico, Mexico).

5.3.2 Plant material

Carica papaya L. cv. Maradol seeds (Clontech) were sown in pots containing solid medium

of Sunshine Blend Seedling Mix, Peat Moss (2:1, w/w) until they reached the age of three

months. Plants were grown under glasshouse conditions: temperature of 38 °C, humidity

of 40-80% and a photoperiod of 12 h light/12 h dark (Gamboa-Tuz et al., 2018; Figueroa-

Yañez et al., 2016).

Afterwards, plants were transferred to a room with controlled conditions: temperature of

25 °C, humidity of 40-80% and a photoperiod of 12 h light/12 h dark with a photon flux

density of 200 µmol m−2 s−1 (Arroyo-Herrera et al., 2016). The drought stress experiment

(which consisted on the lack of irrigation upon a time period) started after two weeks of

acclimation. All plants were watered at the beginning of the drought experiment. Leaves

samples were collected after a water deficit period of 0 and 14 days (0DC and 14DD,

respectively). The drought stress experiment was carried out in three different plants. Also,

three watered plants were used as control samples and their leaves were collected at the

14th day of the experiment (14DC). The samples were immediately frozen in liquid nitrogen

CAPÍTULO V

129

and stored at −80 °C until freeze-drying (FreeZone® 4.5 Liter Freeze Dry Systems,

Kansas City, USA). Samples were grounded and stored at −80 °C until analysis.

5.3.3 Relative water content and osmotic potential

Relative water content (RWC) was carried out as described by Hameed et al. (2015).

Osmotic potential (Ψs) as carried out as described by of Cach-Pérez et al. (2018).

Osmotic pressure of papaya leaves was calculated using van't Hoff equation on osmolarity

measured using a vapor pressure osmometer (Vapro-5600, Wescor, Logan, UT, USA).

5.3.4 Photosynthesis and transpiration rate

Net photosynthetic rate (A) and transpiration rate (T) were measured employing a portable

infrared gas analyzer (Li-6400XT, Licor, Lincoln, NE, USA) with an adaptable leaf chamber

of 6 cm2. The third larger leaf of each plant was selected to carry out the measurements.

The internal CO2 flow was of 400 µmol mol−1 and the light source was of 300 µmol m−2s−1.

5.3.5 Proline quantification

Proline quantification was carried out as described by Bates et al., (1973). Proline content

was measured using a proline standard curve. Results were expressed as µg of proline

per gram of D.W. leaf sample.

5.3.6 Scanning electron microscopy

The phenotypic analysis of the effect of drought stress on stomatal closure in samples

from papaya leaves was carried out as follows: square (1 cm2) leave samples were fixed

using a 2.5% glutaraldehyde solution diluted in buffer solution (0.2 M sodium phosphate,

pH 7.2) for two days. Samples were kept in the dark at 4 °C. They were then rinsed two

CAPÍTULO V

130

times with buffer solution and were subsequently dehydrated with consecutive washes of

ethanol:water solutions at different concentrations (30:70, 50:50, 70:70, 85:15, 96:4% (v/v)

and absolute ethanol) stored in the dark at 4 °C. Each wash was realized twice.

Immediately after dehydration process, a critical point drying process was performed at

1072 psi/31 °C (Samdri1-795 Tousimis Rockville, MD, USA). Samples were subsequently

added to metallic stubs with carbon conductive adhesive tape (Electron Microscopy

Science) and sputter coated with a 150 Å gold layer (Denton Vaccum Desk II, USA).

Stomatal aperture percentage was calculated for the abaxial epidermis at a magnification

of 200× (0.1213 mm2). Length of the guard cells was also measured in five stomata per

field. Counts and measurements were done in ten fields of each leaf. Sample analysis and

image recording were made employing a Scanning Electron Microscope (Jeol, JSM-

6360LV, Japan).

5.3.7 Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds

A previous standardization process was performed to determine the best extraction

conditions to obtain the maximum concentration of phenolic compounds from papaya

leaves. Control leaves samples 0DC were selected as test samples for standardization

process. The extractions of phenolic compounds from the different freeze-dried leaves of

papaya were performed on a high intensity focused ultrasound probe (model VCX130,

Sonics Vibra-Cell, Hartford, CT, USA). Aliquots of freeze-dried leaves (20 mg) were

transferred into microcentrifuge tubes containing 1 mL of water each. The samples were

placed into an ice bath and sonicated for 10 or 20 min at three different amplitude waves

of 30%, 50% and 70%. After sonication, samples were centrifuged twice (13000 rpm at

4 °C for 15 min) and the supernatant was removed. The extracts were evaporated to

dryness using a concentrator (Concentrator Plus, Eppendorf, Hamburg, Germany) for at

least 4 h at 30 °C. The dried extracts were dissolved in water at a concentration of 10

mg/mL prior to their analysis by HPLC-DAD. The number of signals, the size of the peak

areas and the resolution of the different chromatograms were compared as selection

criteria. Water was chosen as the best extraction solvent in comparison to several

hydroalcoholic mixtures through a series of HPLC analysis of the corresponding profiles

CAPÍTULO V

131

(data not shown). The extraction process of all papaya leaves samples was subsequently

carried out.

5.3.8 DPPH radical scavenging assay

The antioxidant capacity of the different kinds of leaves extracts was measured with the

DPPH radical scavenging assay according to Plaza et al. (2014). The absorbance was

measured at 516 nm in a UV-vis spectrophotometer (Agilent Cary 8454, Agilent

Technologies, Santa Clara, CA, USA). The DPPH-methanol solution was employed as a

reference. The remaining DPPH concentration in the reaction medium was determined

from a calibration curve. The percentage of remaining DPPH against the extract

concentration (µg of dry weight (D.W.) extract mL−1) was then plotted to calculate the

amount of antioxidant necessary to reduce the initial DPPH concentration by 50% or EC50.

Therefore, the lower EC50, the higher antioxidant capacity.

5.3.9 Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay

The TEAC assay described by Plaza et al. (2014) was employed. The absorbance of each

sample was measured using a UV-Vis spectrophotometer (Agilent Cary 8454) at 734 nm.

The reference standard was Trolox and results were expressed as TEAC values (mmol

Trolox per g D.W. extract). These values were acquired from four different concentrations

(ranging from 0.5 to 2.5 mg mL−1) of each extract in order to give a linear response

between 20 and 80% of the initial absorbance.

5.3.10 Analysis of phenolic compounds by HPLC-DAD

The analysis of phenolic compounds was carried out employing a 1100 HPLC system from

Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), by using a previously published

method with some modifications (Plaza et al., 2016). The HPLC instrument was equipped

with an online degasser, a quaternary solvent pump, an auto-sampler, a column heater

CAPÍTULO V

132

compartment and a photodiode array detector (DAD) with scanning capabilities, all

controlled by the ChemStation (Agilent) software. The detection wavelengths used were

250, 280, 350, and 520 nm. Separation was performed using a porous-shell fused-core

Ascentis Express C18 analytical column (150 × 2.1 mm, 2.7 µm) with an Ascentis Express

C18 guard column (0.5 cm × 2.1 mm, 2.7 µm), both from Supelco (Bellefonte, PA, USA).

The flow rate was 250 µL min−1 and the column temperature 50 ºC. Two microliters of

extract were injected. The mobile phases were (A) water with 0.5 % formic acid and (B)

methanol with 0.5% formic acid. The gradient analysis was as follows: 0 min, 5% (B); 0-5

min, 5% (B); 5-35 min, 45% (B); 35-45 min, 45 % (B); with 10 min of post time. Each

extract was injected in duplicate.

5.3.11 Identification of phenolic compounds by HPLC-ESI-QTOF-MS

The structural elucidation of phenolic compounds was achieved by a 1100 HPLC system

from Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) coupled to a quadrupole-time-

of flight mass spectrometer (QTOF-MS) Agilent 6530 equipped with an orthogonal

electrospray ionization (ESI) source (Agilent Jet Stream, AJS). Agilent Mass Hunter

Workstation software B.07.00 from Agilent was used for HPLC and MS control, data

acquisition, and data analysis. The chromatographic conditions were the same as stated in

section “ nalysis of phenolic compounds by 5.3.11”

The mass spectrometer was operated in negative and positive ion modes and the mass

range was from 100 to 1700 m/z. MS parameters were: capillary voltage, 3500 V; drying

gas flow rate, 12 L min−1; nebulizer pressure, 50 psig; and gas temperature, 350 ºC. The

fragmentor voltage was set at 80 V. The skimmer voltage was 60 V while octapole voltage

was 750 V. Source sheath gas temperature and flow were 400 ºC and 12 L min−1,

respectively. MS/MS was performed employing the auto mode and the following optimized

conditions; 2 precursors per cycle, dynamic exclusion after two spectra (released after 1

min), and collision energy of 5 V for every 100 Da. Internal mass calibration of the

instrument was performed using an AJS ESI source with an automated calibrant delivery

system. The reference compound solution for internal mass calibration containing purine

and HP-0921 (hexakis(1H,1H,3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine) in acetonitrile-water

CAPÍTULO V

133

(90:10, v/v) (4 μ and . μ , respectively, 1 µL min−1) from Agilent was used, m/z

121.0509 and m/z 922.0098, respectively.

5.3.12 Statistical analysis

All statistical analyses were performed using the GraphPad Prism 7.0 software (GraphPad

Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com). The collections of tissue samples

as well as the measurements of physiological parameters were repeated at least three

times in different individuals in each of the different experiments. All analyses were

performed in triplicate. The means of most experiments were compared using one-way

analysis of variance (ANOVA) except for the data obtained from the HPLC-DAD analysis

that was analyzed using a two-way ANOVA. Significant differences among the treatment

groups were determined with Dunnett’s test (p ≤ 0.0 ).

CAPÍTULO V

134

5.4 RESULTS AND DISCUSSION

5.4.1 Drought stress characterization: net photosynthetic rate, transpiration rate,

and proline content

Samples were collected from the third or fourth youngest leaf. The effects of drought

stress on the phenotype of C. papaya plants are illustrated in Figure 5.1. Watered plants

had turgid young dark green leaves with rigid petioles at the beginning of the experiment

and little turgid old yellow-green leaves with fallen petioles at the end of the trial. As the

drought stress experiment advanced, the younger leaves became flaccid and turned

yellowish while older leaves wrinkled, dried and turned brown as result of water deficit. The

RWC, osmotic pressure, A values, T values, and the content of free proline in leaves were

used as physiological related parameters to analyze the effects of drought stress

(Mahouachi et al., 2012; Ashraf y Foolad, 2007).

Figure 5.1 Effect of drought stress on C. papaya

plants phenotypes: 0DC (a), 14DC (b) and 14DD

(c). White arrows indicate the leaves collected for

the analyzes.

Relative water content (RWC) is an important parameter to assess plant water status

under drought stress conditions because it represents the equilibrium between water

supply to the tissue and transpiration rate (Lugojan y Ciulca, 2011). The means of RWC of

the samples 0DC (81.56 ± 3.11%) and 14DC (82.31 ± 3.51%) did not show significant

differences (p ≥ 0.0 ). Oppositely, the mean W values of 14DD samples ( 1.33 µmol ±

CAPÍTULO V

135

3.51%) decreased significantly (Figure 5.2a). Osmotic adjustment is an essential

mechanism for improving plant resistance to drought stress which results in a lower

osmotic potential through the increase of intracellular solutes such as amino acids,

betaines and sugars (Bajji et al., 2001). he means of Ψs of the samples 0D (−0.47 ±

0.0 a) and 14D (−0.46 ± 0.0 a) did not sho significant differences (p ≥ 0.0 ).

he mean Ψs values of 14DD samples (−0.6 µmol ± 0.03 a) decreased significantly

(Figure 5.2b).

During stress conditions, photosynthesis rate in plants decreases due to stomatal closure

to avoid water loss and the entry of CO2 is reduced (Li et al., 2017). The means of A of the

samples 0DC (3.07 ± 0.10 µmol CO2m−2s−1) and 14DC (2.73 ± 0.21 µmol CO2m

−2s−1) did

not exhibit significant differences (p ≥ 0.0 ). By contrast, the mean A values of 14DD

samples (−1.81 µmol ± 0.31 CO2m−2s−1) decreased significantly (Figure 5.2c). The

transpiration measurements of the leaves showed the same behavior: the T means of

samples 0DC (1.13 ± 0.12 mmol H2Om−2s−1) and 14DC (0.92 ± 0.04 µmol H2Om−2s−1) did

not show significant differences (p ≥ 0.0 ) and the mean values of 14DD samples (0. 7

µmol ± 0.11 H2Om−2s−1) decreased significantly (Figure 5.2d). Proline is an amino acid that

acts as osmolyte during osmotic stress and other kinds of abiotic stresses (Ashraf y

Foolad, 2007). Proline content levels in the samples 0DD (487 ± 77 µg g−1 D.W.) and

14DC (478 ± 48 µg g−1 D.W.) did not exhibit significant differences (p ≥ 0.0 ) (Figure 5.2e).

Oppositely, proline content levels in the 14DD samples (1793 ± 304 µg g−1 D.W.)

increased significantly. The behavior of these physiological parameters during the drought

stress treatment was the expected (Gamboa-Tuz et al., 2018; Mahouachi et al., 2012). A

scanning electron microscopy analysis of the abaxial surface of leaves was performed in

watered plants and plants under drought stress to know the effect of drought treatment on

the structures and functionality of stomatal aperture (Figure 5.3). The turgid physiology

and partial opening of most of the stomata in leaves of watered control plants from day 0

and until day 14 of the experiment did not show differences among treatments. However,

almost all stomata of leaves in drought stress were totally closed. This behavior has been

previously described in plants under drought stress (Huang et al., 2009).

CAPÍTULO V

136

Figure 5.2 Physiological effects of drought stress in C.

papaya plants. Relative water content (a), osmotic

potential (b), photosynthetic net rate (c), transpiration rate

(d), and proline content (e) of leaves of watered plants

(0DC and 14DC) and plants under drought stress

treatment (14DD). Columns represent the mean obtained

from three independent experiments for each treatment

and vertical lines mark standard deviation. Data were

analyzed by one-way ANOVA using the Dunnett’s test at p

≤ 0.05. Asterisks above the columns indicate values that

are statistically different from the control values (**** p ≤

0.0001).

CAPÍTULO V

137

Figure 5.3 Scanning electron micrographs of the abaxial surface

of leaves: 0DC (a), 14DC (b) and 14DD (c).

The absence of changes in the RWC, osmotic potential, photosynthetic activity

measurements, transpiration measurements, proline content and stomata aperture of the

0DC and 14DC samples proved that the environmental conditions did not cause negative

effects on the homeostasis of the plants. 14DD samples presented lower RWC values,

lower osmotic potential values, negative A values, lower transpiration rates, an increase of

about four times the proline content and the closure of almost all stomata. These results

indicated that a period of two weeks without watering was enough to cause significant

physiological damage in papaya plants.

5.4.2 Extraction of phenolic compounds and antioxidant capacity

The effect of the conditions employed to perform the extraction of phenolic compounds

from papaya leaves by ultrasound-assisted extraction (UAE) was studied considering three

different solvents (water, 50:50 methanol:water (v/v) and 50:50 ethanol:water (v/v)) at

different extraction times (10 and 20 min) and with different amplitude waves (30%, 50%

and 70%). These solvents were employed because methanol, water, ethanol, and alcohol-

water mixtures are most frequently employed for recovering phenolic compounds due to

their different polarities (Lattanzio et al., 2006). The extraction temperature was kept as

low as possible by using an ice bath. Based on our results (data not shown), water

extraction solvent, an amplitude wave of 70% and 10 min of sonication were selected as

the optimal extraction conditions to extract higher amounts of phenolic compounds from

papaya leaves by UAE. Thus, these optimal extraction conditions were used to get the

extracts from all the samples (0DC, 14DC and 14DD) in order to measure their antioxidant

CAPÍTULO V

138

capacity and to carry out the characterization of their phenolic composition by HPLC-DAD

and HPLC-MS.

The antioxidant capacity of the extracts was calculated with the use of TEAC and DPPH

assays. The DPPH· free radical scavenging capacity of extracts from 14DC samples

(100.42 ± 5.80 µg D.W. mL−1) decreased in comparison with the extracts of 0DC samples

(71.00 ± 3.29 µg D.W. mL−1). In contrast, the antioxidant capacity of extracts from14DD

samples (41.91 ± 2.21 µg D.W. mL−1) increased significantly (Figure 5.4a). The results of

the TEAC assay displayed a similar behavior than that of the DPPH test: the antioxidant

capacity of papaya leaves extracts of 14DC samples (0.37 ± 0.06 mmol Trolox g D.W.−1)

was lower than 0DC samples (0.74 ± 0.09 mmol Trolox g D.W.−1), while the antioxidant

capacity of 14DD samples (0.99 ± 0.10 mmol Trolox g D.W.−1) increased significantly

(Figure 5.4b). These results confirm that all different kinds of extracts presented

antioxidant properties, especially those of plants under drought stress. Our results are in

agreement with previous reports on the antioxidant capacities of papaya leaves extracts

(Vuong et al., 2015). Interestingly, the antioxidant capacities of 14DC samples decreased

compared to the extracts of 0DC samples. To date there are no reports about the effect of

the age difference of papaya plants on the antioxidant capacity of leaves. The analysis of

the antioxidant capacity variations between young and old leaves within papaya plants

was analyzed in this study (Gogna et al., 2015). It was determined that the extracts of the

young leaves showed higher antioxidant capacity in comparison with the old leaves. In

addition, the extracts of 14DD samples presented the highest antioxidant capacity from the

different kinds of extracts, probably due to the generation of additional phenolic

compounds which act as antioxidants. These results indicated that the natural decrease of

the antioxidant capacity of papaya leaves seems to revert in stress conditions.

CAPÍTULO V

139

Figure 5.4 The DPPH·

free radical

scavenging capacity (a) and Trolox

equivalent antioxidant capacity·

(b) of

extracts from leaves of C. papaya plants

under drought stress treatment. Columns

represent the mean obtained from three

independent experiments for each treatment

and vertical lines mark standard deviation.

Data were analyzed by one-way ANOVA

using the Dunnett’s test at p ≤ 0.05.

Asterisks above the columns indicate values

that are statistically different from the control

values (* p ≤ 0.0332, ** p ≤ 0.0021, *** p ≤

0.0002).

5.4.3 Characterization of phenolic compounds from papaya leaves extracts

A HPLC-DAD analysis was performed so as to identify the different kinds of phenolic

compounds present in the different extracts. Different wavelengths were chosen for HPLC

CAPÍTULO V

140

analysis due to the diversity of absorption wavelengths of the phenolic compounds

(Lattanzio et al., 2006). When analyzing DAD results of the different leaves extracts, the

detected peaks of the chromatograms obtained at 250, 280 and 350 nm were very similar,

of which the highest number of peaks was observed at 280 nm. Chromatograms obtained

at 520 nm did not present any peak. Therefore, the chromatograms obtained at 280 and

350 nm were analyzed in depth.

A total of 53 well defined peaks were detected in the different chromatograms obtained

from the HPLC-DAD analysis of the extracts at wavelengths of 280 and 350 nm: 25 peaks

were detected only at 280 nm, one peak (tR = 29.9 min) only at 350 nm and 27 peaks were

detected at both wavelengths (Table S1, Figure S1 and Figure S2). A total of 26 detected

peaks showed significant differences among the different kinds of papaya leaves extracts,

probably due to the growth of the plants and the drought stress treatment.

Although both chromatogram groups of samples 0DC and 14DC shared many peaks, the

areas of many of these (13 peaks at 280 nm and 9 peaks at 350 nm) decreased

significantly (p ≤ 0.0 ) and some of these peaks ere absent in the groups of

chromatograms of 14DC samples. Regarding data obtained from the chromatograms

group of 14DD samples, many of the areas of the previously detected peaks increased

significantly (p ≤ 0.05) (18 peaks at 280 nm and 10 peaks at 350 nm) and the areas of new

peaks (12 peaks at 280 nm and 4 peaks at 350 nm) were detected (see Table S1, Figure

S3 and Figure S4). Plants under drought stress conditions showed a decrease in their

biomass, probably as a strategy of adaptation to stress conditions. This decrease in

biomass caused an increase in the concentration of certain metabolites under drought

stress (Paulsen y Selmar, 2016). The results obtained in this investigation showed that

several of the peaks detected in the chromatograms showed a significant increase in their

respective areas in the extracts of 14 DD samples (Figure S3 and Figure S4). However, it

was also observed that some peaks (peaks 4, 5 and 6) of the extracts of 14 DC samples

had the same signal intensity as the extracts of 14 DD samples (Figure S3). Additionally,

some peaks (peaks 3 and 8) did not present significant differences between the different

treatments (Figure S3). These results indicated that the increase of the peaks in stress

conditions of the 14DD samples were due to an increase in the production of the

metabolites and not only due to an increase in their concentrations. Interestingly, the

CAPÍTULO V

141

significant changes in the peak areas obtained at 280 and 350 nm as well as the total

number of peaks from the different extracts presented the same behavior as their

respective antioxidant capacities: the extracts of 14DC samples decreased their

antioxidant capacities while the extracts of 14DD samples increased their antioxidant

capacities (see Figure 5.4). These results indicate that the increase of antioxidant capacity

in extracts from leaves under drought stress could be mainly caused by the increase in

phenolic composition.

5.4.4 Identification of phenolic compounds by HPLC-ESI-QTOF-MS

In order to characterize the phenolic compounds found in the extracts from papaya leaves,

a HPLC-DAD-QTOF-MS/MS method was optimized on the base of previous study from

our research group (Plaza et al., 2016). The in-depth study of the separated metabolites,

with the data provided by the MS, along with information reported in literature and MS

databases (FooDB and PhytoHub), allowed the preliminary identification and classification

of 23 phenolic compounds (Table 5.1). The metabolites were grouped according to one of

the following behaviors: group 1: only peak areas of the extracts of 14DC samples

decreased and those of 14DD samples increased in comparison with those of the extracts

of 0DC samples; group 2: only peak areas of the extracts of 14DC samples decreased

compared with those of the extracts of 0DC samples; group 3: only peak areas of the

extracts of 14DD samples increased in comparison with those of the extracts of 0DC

samples.

Hydroxycinnamic acid derivatives

The mean areas of peaks 35, 36, 32, 2, 38 and 39, compared with the samples of 0DC,

decreased in the 14DC samples and increased in the 14DD samples. The mean area of

peak 31 only increased in the 14DD samples. The highest peak (peak 35) was tentatively

identified as D-malic acid-p-coumarate derivative 1 and presented a molecular ion with m/z

279.0533 [M H] and deprotonated analyte adduct with m/z 559.0983 [2M − H]−. This ion

showed fragments at m/z 163 and 132 that could most probably be the fragments

corresponding to its aglycone and malic acid residues, respectively; and m/z 119

corresponding to the aglycone loss of CO2 (see Table 5.1). The peak 36 was also

tentatively identified as D-malic acid-p-coumarate derivative 2, because the mass spectra

CAPÍTULO V

142

presented the same molecular ion (m/z 279.0533 [ − H]−) and fragmentation pattern (m/z

163, 132 and 119) as peak 35. This MS/MS pattern has been previously proposed for D-

malic acid-p-coumarate (Regos et al., 2009). Increase of D-malic acid-p-coumarate has

been previously reported in plants under mechanical damage (Housti et al., 2002).

Peaks 31 and 32 presented a [ − H]− ion at m/z 295.0449, a [2 − H]− ion at 591.1075

and the [ − H]− ion produces clear fragments corresponding to its aglycone (m/z 179) and

malic acid residue (m/z 133). These peaks were preliminarily identified as caffeoylmalic

acid derivatives 1 and 2, respectively in accordance with the fragmentation reported in

literature (Lin y Harnly, 2008).

The peak 2 showed a molecular ion with m/z 353.0896 [ − H]−, its main fragment ion was

shown at m/z 191 (Table 5.1) and corresponded to quinic acid ion. This compound was

preliminarily identified as caffeoylquinic acid according to the fragmentation explained in

literature (Ncube et al., 2014; Regos et al., 2009). Peaks 38 and 39 were tentatively

identified as feruloylmalic acid derivatives 1 and 2, respectively. They displayed a

molecular ion ith m/ 30 .0637 [ −H]− and an analyte dimerization with m/z 619.0437

[ −H]−. MS/MS fragmentation of this ion gave fragmentation ions at 193 m/z and 134 m/z

that are equivalent to its aglycone and malic acid residues, respectively (Spínola et al.,

2015). Caffeoylquinic derivatives due to their antioxidant capacities have exerted

neuroprotective properties (Nakajima et al., 2007) and feruloylmalic acid has shown

antioxidative and anti-apoptotic activities (Luo et al., 2018).

It was also observed that the areas of some of the peaks (9, 11, 12 and 15) increased in

the samples of drought-stressed plants extracts when compared to the other types of

extracts. Peaks 9, 11, 12 and 16 were preliminarily identified as 2-O-caffeoyl hexoside

acid derivatives 1, 2, 3 and 4, respectively. hey exhibited [ −H]− ion at m/z 371.0626,

their dimeri ation at m/ 743.131 [ −H]− and their fragmentation pattern presented

product ions at m/z 209 and 191. The fragment at m/z 209 could be interpreted as an

aldaric acid moiety, particularly an hexoside acid like glucaric and galactaric that

under ent dehydration, giving rise to the fragment at m/ 1 1 [ 0 −H2O]− (Spínola et al.,

2015). The peaks 15 and 18 were preliminarily identified as 2-O-feruloyl hexoside acid

derivatives 1 and 2, respectively. They had a molecular ion at m/z 385.0779 [ − H]−.

Their fragmentation patterns were similar to 2-O-caffeoyl hexoside acid derivatives with

https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/antiapoptotic

CAPÍTULO V

143

product ions at m/z 209 and 191 that can be a hexoside acid like glucaric and galactaric

(m/z 209) and its dehydration (m/z 191) (Spínola et al., 2015). Also, the peaks 15 and 18

showed a fragment from ferulate ion at m/z 193. Moreover, peaks 13, 17 and 21 which had

molecular ions with m/z 355.0646 [ − H]−, showed very similar fragmentation pattern to 2-

O-caffeoyl hexoside acid derivatives and 2-O-feruloyl hexoside acid derivatives (see Table

5.1). Their main fragments at m/z 209 and 191 corresponded to product ions of a

hexoside acid and the loss of the water molecule from the hexoside acid, and at m/z 163

which could be the coumarate ion, being tentatively identified as p-coumaroyl hexoside

acid derivatives 1 (peak 13), 2 (peak 17) and 3 (peak 21). This fragmentation pattern was

previously described in literature (Coutinho et al., 2016). These peaks did not show

significant differences among the different extracts from papaya leaves. A decrease in the

concentration of hydroxycinnamic glucosides has been reported in tomato fruits during a

hydric stress (Sánchez-Rodríguez et al., 2011). Sinapic and ferulic acid glycoside esters

have reported antioxidant capacities (Kylli et al., 2008).

Flavonoids

The peak 44 was preliminarily identified as the flavonol quercetin glucoside rhamnoside

because it sho ed a [ −H]− at m/z 609.1462 and MS/MS yielding ions at m/z 463 and 301.

These fragments are the products of the loss of a deoxyhexose (rhamnose-like) sugar [M

– 146 − H]−, a deoxyhexose and a hexose (glucose-like) sugars [M − 146 − 162 − H]−,

respectively (Guimarães et al., 2013). The peak 48 presented a molecular ion with m/z

593.1524 [ − H]−, and was tentatively identified as kaempferol glucoside rhamnoside.

MS/MS yielded the main ions at m/z 447 and 285 as products of the loss of a

deoxyhexose sugar (rhamnose-like) [M – 146 − H]− and a deoxyhexose and a hexose

(glucose-like) sugars [M – 146 – 162 − H]−, respectively (Benayad et al., 2014). Quercetin

glucoside rhamnoside was identified only in extracts of leaves under drought stress

(14DD), while kaempferol glucoside rhamnoside was identified in all extracts but its peak

area decreased in watered plants extracts at day 14 (14DC). Some flavonol glycosides

with molecular structures similar to those previously mentioned present neuroprotective

(Nakayama et al., 2011) and hepatoprotective (Wang et al., 2015) properties.

The peaks 37 and 42 did not show significant differences between the different extracts

from papaya leaves. The peak 37 could be preliminarily identified as quercetin 3-O-

CAPÍTULO V

144

dirhamnosyl-glucoside because it showed a [ − H]− at m/z 755.1997 and MS/MS yielding

a main ion at m/z 300 (aglycone ion) (Barros et al., 2013). The peak 42 was preliminarily

identified as kaempferol-3-robinoside-7-rhamnoside (robinin). Its molecular ion was shown

at m/ 73 . 08 [ −H]−, and generated a fragment that is equivalent to its aglycone (m/z

285) (Mönchgesang et al., 2016). Quercetin 3-O-dirhamnosyl-glucoside has been

identified in root exudates of S. vulgaris and seems to participate in the protection

mechanism against chromium toxicity (Pradas del Real et al., 2017). Robinin has been

reported to have antiinflamatory properties (Ficarra et al., 1995).

Other compounds

The peaks 50 and 51 both displayed maximum absorbance at 314 nm and molecular ions

with m/z 677.2834 [ − H]−. These compounds were tentatively identified as So-NCC-2

derivatives 1 and 2, respectively, which belong to the group of tetrapyrroles. Peaks 51 and

52 produced fragments with m/z 659 [M − H2O − H]−, 645 [M − CH3OH − H]−, 627 [M −

CH3OH − H2O − H]−, 617, 541, 520 [M − ring A − H]−, 488, 448 and 402 (see Table 5.1).

These produced fragments are in agreement with the predicted MS/MS spectra acquired

in CFM-ID (http://cfmid.wishartlab.com) and in literature (Scherl et al., 2012).

Nonfluorescent chlorophyll catabolites (NCCs) are common products of chlorophyll

degradation during leaf senescence (Oberhuber et al., 2001). The presence of NCCs has

been reported in plants under drought stress (Borrmann et al., 2009). NCCs isolated from

pear peels have shown potential antioxidant capacity (Müller et al., 2007). Both of our

compounds were only identified in extracts of leaves under drought stress (14DD),

probably as part of the response mechanisms to oxidative stress.

The peak 6 was tentatively identified as guanosine which is a purine nucleoside. Its

molecular ion was shown at m/z 282.0822 [ − H]−, and produced a clear fragment at m/z

150 (Table 5.1). This fragmentation pattern has been previously described in literature

(Hartmann et al., 2006). Cyclic guanosine monophosphate (cGMP) acts as a secondary

mediator and participates in diverse kinds of plant responses to abiotic stresses (Van

Damme et al., 2014). The mean area of peak 6, compared with the extracts of 0DC

samples, increased in extracts of samples 14DC and 14DD but no significant differences

were observed between both treatments.

http://cfmid.wishartlab.com)/

CAPÍTULO V

145

Different studies have corroborated that all the tissues of the papaya plant present

different types of biological activities such as antioxidant capacity, owing to the presence

of phenolic compounds. However, to date there are very few studies on the variations of

chromatographic profiles of phenolic compounds in tissues from papaya plants under

conditions of abiotic stress. The increase in the production and concentration of phenolic

compounds during stress conditions may be due to a significant increase in the expression

and activity of enzymes that participate in the synthesis of metabolites in response to

stress conditions (Selmar et al., 2017). The results obtained in the bioinformatic analysis

conducted by Gamboa-Tuz et al. (2018) show a significant increase in the expression

levels of enzyme genes involved in the synthesis of different metabolites (such as abscisic

acid and suberin) in papaya plants in response to drought stress conditions. The results in

this study demonstrated that the content and diversity of phenolic compounds, as well as

their antioxidant capacities, increased in papaya leaves under drought stress. Additionally,

results showed that the content of phenolic compounds and the antioxidant capacity of

leaves in watered papaya plants tend to decrease as the plants aged. Some of the

identified compounds have been previously characterized in other plant tissues and we

found that several of these compounds presented different kinds of biological activities and

antioxidant capacities under stress conditions. Based on our results, we can conclude that

the application of an abiotic stress on the different tissues of papaya plants is a good

alternative for obtaining a higher quantity and diversity of phenolic compounds that can be

commercially exploited in food, cosmetic and pharmaceutical industries. Furthermore, C.

papaya plants that have undergone drought stress due to environmental factors are a

potential new source of phenolic compounds.

CAPÍTULO V

146

Table 5.1 List of tentatively identified compounds from papaya leaf extracts by HPLC-DAD-QTOF-MS and -MS/MS analysis and changes in their

respective areas detected in chromatographic profiles from different treatments: watered plants at day 0 (0DC), watered plants at day 14 (14DC) and

plants under drought stress at day 14 (14DD). Data represent the mean and relative standard deviation (RSD, %) obtained from three independent

experiments for each treatment.

ID tR (min)

UV-vis

max (nm)

Compounds identified

[M − H]−,

MF, ppm Main fragments detected (m/z, relative abundance)

Classification 0DC 14DC 14DD G References

Area RSD RA

(%)

Area RSD RA

(%)

Area RSD RA

(%)

2 1.5 276 Caffeoylquinic acid*

353.0896, C16H17O9, 6

191.0365 (20), 173.0262 (3),

135.0284 (0.4)

Organic oxygen compounds, alcohols and polyols, quinic acid derivates, coumaric acid derivatives, cinnamic acid esters

364.6 7.9 6.59 268.2 1.2 7.35 441.3 7.4 5.56 1 (Regos et al., 2009)

6 2.3 254 Guanosine* 282.0822, C10H12N5O5, -6

150.0387 (100) Purine nucleosides 223.7 4.2 4.04 350.7 4.4 9.61 399.8 1.0 5.04 (Hartmann et al., 2006)

9 3.4 326 2-O-caffeoyl

hexoside

acid derivative 1*

371.0638, C15H15O11, 6

209.0294 (100), 191.0179 (16)

Phenylpropanoids and polyketides, hydroxycinnamic acid derivatives, coumaric acid derivatives, cinnamic acid esters, glucaric acid derivatives

16.5 9.6 0.30 11.1 4.3 0.30 45.8 9.8 0.58 3 (Spínola et al.,

2015)

11 4.3 324 2-O-caffeoyl

hexoside 371.0611, C15H15O11, -1

209.0289 (100), 191.0185 (16)

Phenylpropanoids and polyketides, hydroxycinnamic acid

40.8 8.6 0.74 40.2 5.0 1.10 80.1 10.0 1.01 3 (Spínola et al.,

2015)

http://classyfire.wishartlab.com/tax_nodes/C0004603






CAPÍTULO V

147

acid derivative 2*

derivatives, coumaric acid derivatives, cinnamic acid esters, glucaric acid derivatives

12 5.4 322 2-O-caffeoyl hexoside

acid derivative 3*

371.0626, C15H15O11, 3

743.1312 (25), 209.0287 (100), 191.0184 (37), 147.0280 (5)

Phenylpropanoids and polyketides, hydroxycinnamic acid derivatives, coumaric acid derivatives, cinnamic acid esters, glucaric acid derivates

78.2 9.8 1.41 60.4 6.1 1.66 129.2 8.9 1.63 3 (Spínola et al., 2015)

13 7.1 312 p-coumaroyl hexoside

acid derivative 1

355.0636, C15H15O10, -8

209.0289 (72), 191.0185 (100), 163.0373 (16), 147.0292 (48)

Phenylpropanoids and polyketides, cinnamic acid derivatives, coumaric acid esters, cinnamic acid esters

18.7 8.2 0.34 N.D. N.D. 0.00 25.2 9.5 0.32 (Coutinho et al., 2016)

15 8.2 326 2-feruloyl hexoside

acid derivative 1*

385.0780, C16H17O11, 2

209.0290 (30), 193.0472(17), 191.0207 (100), 147.0315 (66)

Phenylpropanoids and polyketides, hydroxycinnamic acid derivatives, coumaric acid derivatives, cinnamic acid esters, galactaric acid derivatives

21.0 9.6 0.38 12.9 7.7 0.35 66.5 6.3 0.84 3 (Spínola et al.,

2015)

16 9.2 314 2-O-caffeoyl

hexoside

acid derivative 4*

371.0630, C15H15O11, 4

209.0181 (100), 191.0069 (42)

Phenylpropanoids and polyketides, hydroxycinnamic acid derivatives, coumaric acid derivatives, cinnamic acid esters, glucaric acid derivatives

66.0 7.0 1.19 17.2 7.8 0.47 55.9 8.2 0.70 2 (Spínola et al.,

2015)







CAPÍTULO V

148


acid derivative 2

355.0642, C15H15O10, -6

209.0278 (73), 191.0190 (100), 163.0390 (14), 147.0299 (46)



18 11.2 326 2-O-feruloyl hexoside

acid derivative 2

385.0779, C16H17O11, 2

209.0318 (46), 193.0469 (12), 191.0189 (100),

147.0268 (12)

Phenylpropanoids and polyketides, hydroxycinnamic acid derivatives, coumaric acid derivatives, cinnamic acid esters, galactaric acid derivates

43.4 6.9 0.78 27.1 2.8 0.74 66.0 4.9 0.83 (Spínola et al., 2015)


acid derivative 3

355.0646, C15H15O10, -5

209.0272 (70), 191.0163 (100), 163.0354 (15), 147.0269 (45)



31 21.5 320 Caffeoyl malic

acid derivative 1*

295.0449 C13H11O8, 4

179.0332 (28), 133.0127 (100)

Phenylpropanoids and polyketides, hydroxycinnamic acids derivates, coumaric acid derivatives, cinnamic acid esters

55.9 2.7 1.01 51.1 2.2 1.40 92.2 9.8 1.16 3 (Lin y Harnly, 2008)

32 21.8 328 Caffeoyl malic

acid derivative 2*

295.0471, C13H11O8, -4

591.1075 (100), 179.0336 (27), 133.0127 (100)

885.5 1.2 16.01 690.8 3.2 18.93 1250.7

6.2 15.77

1 (Lin y Harnly, 2008)





CAPÍTULO V

149

35 25.3 312 D-malic acid p-coumarate

derivative 1*

279.0533, C13H11O7, 8

559.0983 (6), 163.0244 (100), 132.9994 (99), 119.0358 (24)

Phenylpropanoids and polyketides, cinnamic acids and derivates, coumaric acid esters, cinnamic acid esters

1071.5

9.1 19.37 548.8 1.8 15.04 1316.0

5.5 16.59

1 (Regos et al., 2009)

36 25.5 310 D-malic acid p-coumarate

derivative 2*

279.0533, C13H11O7, 8

559.0983 (6), 163.0244 (44), 132.9994 (100), 119.0358 (15)

636.8 9.3 11.51 434.0 9.0 11.89 773.5 6.1 9.75 1 (Regos et al., 2009)

37 26.8 255 Quercetin 3-O-dirhamnosyl-glucoside

755.1997, C33H39O20, 6

300.10345 (100), 178.99966 (3)

Phenylpropanoids and polyketides, flavonoids, flavonoid-3-O -glycosides

10.6 4.8 0.19 N.D. N.D. 0.00 12.4 7.9 0.16 (Barros et al., 2013)

38 27.3 256 Feruloylmalic

acid derivative 1*

309.0637, C14H13O8, 7

619.0437 (8), 193.0437 (100), 134.0303 (19)

Phenylpropanoids and polyketides, cinnamic acid derivates, malic acid derivates, cinnamic acid esters

107.5 1.1 1.94 26.9 8.3 0.74 142.0 6.0 1.79 1 (Spínola et al., 2015)

39 27.5 326 Feruloylmalic

acid derivative 2*

309.0605, C14H13O8, 4

193.0497 (100), 133.0133 (20)

Phenylpropanoids and polyketides, hydroxycinnamic acid derivatives, coumaric acid derivatives

380.8 1.0 6.88 176.8 7.2 4.85 504.4 9.7 6.36 1 (Spínola et al.,

2015)

42 29.0 266 Kaempferol-3-robinoside

-7-rhamnoside (robinin)

739.2082, C33H39O19, 1

575.1416 (2), 394.0624 (0.3), 284.0303 (100), 285.0350 (42)

Phenylpropanoids and polyketides, flavonoids, flavonoid-7-O-glycosides

9.9 4.9 0.28 N.D. N.D. 0.00 13.8 0.6 0.28 (Mönchgesang et al., 2016)

CAPÍTULO V

150

44 29.9 260 Quercetin 3-rutinoside

(rutin)*

609.1462, C27H29O16, 0

463.0999 (0.1), 343.0532 (1), 301.0438 (58), 271.0336 (22), 179.0069 (5)


N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 30.6 7.1 0.63 3 (Guimarães et al., 2013)

48 33.7 264 Kaempferol glucoside

Rhamnoside*

593.1524, C27H29O15, -2

447.0995 (1), 327.0581 (2), 285.0484 (100)


71.5 6.8 1.29 11.9 4.8 0.33 90.4 9.6 1.14 2 (Benayad et al., 2014)

50 37.0 314 So-NCC-2 derivative 1

677.2839, C35H41N4O10

, 2

659.2707 (70), 645.2536 (60), 627.2431 (43), 617.2601 (100), 541.2454 (30), 520.2077 (98), 488.1823 (57), 448.1870 (75), 402.1828 (62)

Organoheterocyclic compounds, tetrapyrroles and derivatives

N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 17.5 5.1 0.22 (Scherl et al., 2012)

51 37.8 314 So-NCC-2 derivative 2*

677.2834, C35H41N4O10

, 1

645.2544 (100), 627.2445 (41), 585.2067 (36), 520.2067 (60), 489.1870 (39), 444.1914 (18), 402.1645 (9)

N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 72.2 8.9 0.91 3 (Scherl et al., 2012)

ID: peak assignment number. tR: retention time. MF: molecular formula. ppm: mass precision. N.D.: not determined. RA: relative abundance. G: group

number assigned (each group description has been explained above). *: metabolites that presented significant differences between treatments (p ≤

0.05).

CAPÍTULO V

151

5.5 SUPPORTING INFORMATION

Figure S.1 Chromatographic profiles at 280 nm of compounds detected in extracts

of papaya leaves of watered plants at day 0 (0DC), watered plants at day 14 (14DC),

and dried plants at day 14 (14DD).

Figure S.2 Chromatographic profiles at 350 nm of compounds detected in extracts

of papaya leaves of watered plants at day 0 (0DC), watered plants at day 14 (14DC),

and dried plants at day 14 (14DD).

CAPÍTULO V

152

Figure S.3 Peak areas at 280 nm of compounds detected in extracts of papaya

leaves of watered plants at day 0 (0DC), watered plants at day 14 (14DC), and

dried plants at day 14 (14DD). Columns represent the mean obtained from three

independent experiments for each treatment and vertical lines mark standard

deviation. Data were analyzed by two-way analysis of variance (ANOVA) using the

Tukey´s test at P ≤ 0.05. Asterisks above the columns indicate values that are

statistically different from the control values (* p ≤ 0.0332, ** p ≤ 0.0021, *** p ≤

0.0002, **** p ≤ 0.0001).

CAPÍTULO V

153

Figure S.4 Peak areas at 350 nm of compounds detected in extracts of papaya

leaves of watered plants at day 0 (0DC), watered plants at day 14 (14DC), and dry

plants at day 14 (14DD). Columns represent the mean obtained from three

independent experiments for each treatment and vertical lines mark standard

deviation. Data were analyzed by two-way analysis of variance (ANOVA) using the

Tukey´s test at P ≤ 0.05. Asterisks above the columns indicate values that are

statistically different from the control values (* p ≤ 0.0332, ** p ≤ 0.0021, *** p ≤

0.0002, **** p ≤ 0.0001).

CAPÍTULO V

154

Table S.1 List of peaks of chromatographic profiles at 280 and 350 nm of peaks detected in extracts of papaya leaves of watered plants at

day 0 (0DC), watered plants at day 14 (14DC), and plants under drought stress at day 14 (14DD). Data represent the mean and relative

standard deviation (RSD, %) obtained from three independent experiments for each treatment. The peaks were grouped according to one of

the next following behaviors: group 1: only peak areas of the extracts of samples 14DC decreased and those of samples 14DD increased in

comparison with those of the extracts of samples 0DC; group 2: only peak areas of the extracts of samples 14DC decreased in comparison

with those of the extracts of samples 0DC; group 3: only peak areas of the extracts of samples 14DD increased in comparison with those of

the extracts of samples 0DC.

ID tR

(min)

UV-vis

max

(nm)

280 nm 350 nm

0DC 14DC 14DD 0DC 14DC 14DD

Area RSD RA (%)

Area RSD RA

(%)

Area RSD RA

(%)

G Area RSD RA (%)

Area RSD RA (%)

Area RSD RA (%)

G

1 1.4* 264 116.7 6.0 2.11 84.0 4.3 2.30 110.5 1.2 1.39 2 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

2 1.5* 276 364.6 7.9 6.59 268.2 1.2 7.35 441.3 7.4 5.56 1 15.3 8.7 0.43 20.3 5.4 1.10 15.6 4.8 0.32

3 1.7 268 50.8 9.9 0.92 50.6 8.5 1.39 41.8 7.3 0.53 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

4 1.9* 258 252.4 4.9 4.56 354.3 1.6 9.71 367.4 4.9 4.63 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

5 2.1* 260 160.3 9.9 2.90 93.1 7.0 2.55 107.0 9.4 1.35 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

6 2.3* 254 223.7 4.2 4.04 350.7 4.4 9.61 399.8 1.0 5.04 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

7 2.8 252 5.5 9.1 0.10 19.5 4.8 0.53 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

8 2.9 326 20.6 8.0 0.37 33.8 3.2 0.93 36.7 7.5 0.46 13.6 3.9 0.38 11.3 5.6 0.61 26.7 9.0 0.55

9 3.4* 326 16.5 9.6 0.30 11.1 4.3 0.30 45.8 9.8 0.58 3 18.8 8.4 0.53 14.9 6.1 0.80 39.8 7.8 0.81

10 4.1 264 12.6 3.9 0.23 N.D. N.D. 0.00 21.2 9.0 0.27 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

11 4.3* 324 40.8 8.6 0.74 40.2 5.0 1.10 80.1 10.0 1.01 3 28.1 9.0 0.79 22.5 8.7 1.21 54.4 9.8 1.11

CAPÍTULO V

155

12 5.4* 322 78.2 9.8 1.41 60.4 6.1 1.66 129.2 8.9 1.63 3 66.4 9.4 1.86 58.4 7.0 3.15 124.4 10.0 2.55 3


14 7.8* 228 46.3 9.2 0.84 14.6 4.3 0.40 314.5 5.0 3.97 1 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

15 8.2* 326 21.0 9.6 0.38 12.9 7.7 0.35 66.5 6.3 0.84 3 30.5 7.0 0.86 18.5 7.2 1.00 74.8 9.8 1.53 3

16 9.2* 314 66.0 7.0 1.19 17.2 7.8 0.47 55.9 8.2 0.70 2 14.9 9.3 0.42 N.D. N.D. 0.00 24.6 9.3 0.50


18 11.2 326 43.4 6.9 0.78 27.1 2.8 0.74 66.0 4.9 0.83 36.6 6.9 1.03 24.9 9.6 1.34 68.3 4.0 1.40

19 12.7a 324 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 14.2 6.3 0.18 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 14.4 4.3 0.29

20 12.9

a

326 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 20.9 4.0 0.26 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00


22 14.5 326 15.3 4.2 0.28 N.D. N.D. 0.00 18.6 8.3 0.23 9.9 8.6 0.28 N.D. N.D. 0.00 21.7 9.0 0.44

23 15.6

a


24 16.2 314 35.1 5.6 0.63 20.2 8.6 0.55 62.0 9.9 0.78 17.1 3.4 0.48 N.D. N.D. 0.00 18.5 8.9 0.38

25 16.8

a

324 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 9.5 3.9 0.12 9.9 4.3 0.28 9.1 5.0 0.49 17.0 3.5 0.35


27 17.9

a

326 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 16.3 5.2 0.21 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 13.2 9.5 0.27


29 19.4 326 15.0 1.3 0.27 N.D. N.D. 0.00 21.8 0.9 0.27 21.9 6.5 0.61 13.6 3.3 0.73 28.0 7.8 0.57

CAPÍTULO V

156

30 19.6 312 28.3 6.1 0.51 8.8 3.0 0.24 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

31 21.5* 320 55.9 2.7 1.01 51.1 2.2 1.40 92.2 9.8 1.16 3 44.9 0.8 1.26 45.0 3.8 2.43 62.9 8.2 1.29

32 21.8* 328 885.5 1.2 16.01 690.8 3.2 18.93 1250.7 6.2 15.77 1 1069.5 1.6 30.01 816.3 3.9 44.07 1520.5 7.2 31.12 1


34 24.6

a


35 25.3* 312 1071.5 9.1 19.37 548.8 1.8 15.04 1316.0 5.5 16.59 1 279.7 9.1 7.85 N.D. N.D. 0.00 350.1 7.3 7.17 1

36 25.5* 310 636.8 9.3 11.51 434.0 9.0 11.89 773.5 6.1 9.75 1 153.1 3.5 4.30 154.8 2.1 8.36 208.3 9.9 4.26 1

37 26.8 255 10.6 4.8 0.19 N.D. N.D. 0.00 12.4 7.9 0.16 10.4 7.8 0.29 110.5 8.7 5.97 15.1 9.0 0.31

38 27.3* 256 107.5 1.1 1.94 26.9 8.3 0.74 142.0 6.0 1.79 1 244.0 5.1 6.85 59.0 6.8 3.19 323.5 1.8 6.62 1

39 27.5* 326 380.8 1.0 6.88 176.8 7.2 4.85 504.4 9.7 6.36 1 495.0 2.4 13.89 226.0 6.2 12.20 648.2 9.8 13.27 1

40 27.9* 256 103.1 9.3 1.86 60.1 8.7 1.65 108.5 4.5 1.37 2 114.5 5.4 3.21 63.8 1.9 3.44 142.1 6.7 2.91 2

41 28.1* 252 66.9 6.2 1.21 88.5 5.5 2.43 283.2 8.4 3.57 3 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

42 29.0 266 9.3 1.6 0.17 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 9.9 4.9 0.28 N.D. N.D. 0.00 13.8 0.6 0.28

43 29.6* 264 309.1 6.3 5.59 65.1 1.8 1.78 354.3 10.0 4.47 1 535.0 7.4 15.01 108.6 2.2 5.86 603.0 9.8 12.34 1

44 29.9* 260 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 30.6 7.1 0.63 3

45 30.3* 256 93.8 2.6 1.70 28.2 8.4 0.77 124.8 9.3 1.57 1 196.7 2.5 5.52 58.1 9.0 3.14 278.6 10.0 5.70 1


47 32.3

a


48 33.7* 264 71.5 6.8 1.29 11.9 4.8 0.33 90.4 9.6 1.14 2 128.7 8.9 3.61 16.6 3.0 0.90 131.6 6.5 2.69 2

CAPÍTULO V

157

49 34.4* 290 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 61.2 5.5 0.77 3 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

50 37.0

a


51 37.8* 314 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 72.2 8.9 0.91 3 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 16.1 4.7 0.33

52 38.8

a

N.D. N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 10.2 2.8 0.13 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

53 43.2* 240 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 102.8 2.5 1.30 3 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00 N.D. N.D. 0.00

ID: peak assignment number. tR: retention time. RA: Relative abundance. N.D.: not determined. G: group number assigned. *: peaks that

presented significant differences bet een treatments (p ≤ 0.0 ). a: peaks that did not present significant (p ≤ 0.0 ) differences bet een

treatments but only appear in extracts of leaves of plants under drought stress.

CAPÍTULO V

158

CAPÍTULO VI

159

CAPÍTULO VI

6.1 CONCLUSIONES Y PERPECTIVAS

6.1.1 CONCLUSIONES

Con base en los resultados obtenidos en este trabajo, se obtuvieron las siguientes

conclusiones:

Se concluye que no existen evidencias funcionales de que los factores de

transcripción CpMYBs caracterizados en este estudio regulen la síntesis de

compuestos fenólicos como mecanismo de respuesta ante un estrés abiótico por

sequía puesto que la sobreexpresión de los genes CpMYB44 o CpMYB4 en plantas

de tabaco no ocasionó diferencias significativas de la tolerancia al estrés por sequía

de plantas transgénicas respecto a las plantas silvestres ni tampoco se presentaron

variaciones significativas en la diversidad y concentración de compuestos fenólicos de

los extractos de las hojas de tabaco en diferentes condiciones de crecimiento (riego y

sequía) respecto a las plantas silvestres de tabaco en las mismas condiciones de

crecimiento (riego y sequía).

Se concluye que existen indicios, a nivel molecular, de que los factores de

transcripción CpMYBs caracterizados en este estudio parecen participar como

reguladores indirectos en los mecanismos de respuesta de la planta de C. papaya en

condiciones de estrés abiótico mediante la síntesis de compuestos fenólicos ya que

estos presentaron variaciones significativas en sus niveles de expresión génica

relativa de manera simultánea a cambios en la concentración y diversidad de

compuestos fenólicos de extractos de hojas de papaya en condiciones de estrés.

CAPÍTULO VI

160

6.1.2 PERSPECTIVAS

A pesar de que los resultados de ese trabajo de investigación indicaron que los CpMYBs

aislados no presentaron la funcionalidad esperada, los resultados obtenidos son una

evidencia importante de que otros CpMYBs de papaya podrían intervenir en otros

procesos de mecanismos de respuestas ante diferentes condiciones de estrés. Por

ejemplo, los resultados de los comportamientos de cambios niveles de expresión de los

genes caracterizados en este trabajo coincidieron con los observados en análisis

bioinformáticos de los transcriptomas realizados en plantas adultas de papaya sometidos

a estrés por sequía (Gamboa-Tuz et al., 2018). La información obtenida ha sido empleada

para nuevos análisis bioinformáticos en los cuales se han identificado nuevos CpMYBs

que presentaron cambios significativos en sus niveles de expresión durante condiciones

de estrés por sequía. Por tanto, varios de estos nuevos CpMYBs pueden ser estudiados

con la finalidad de caracterizar su funcionalidad en condiciones de estrés y ser empleados

como nuevas herramientas biotecnológicas para la generación de plantas de interés

comercial más tolerantes a condiciones de estrés.

Estudios alternos y recientes realizados en nuestro laboratorio durante la elaboración de

este trabajo evidencian que las plantas transgénicas al ser cultivadas en condiciones in

vitro en medios con diferentes tipos de fitohormonas presentan comportamientos

distintivos respecto a plantas silvestres tales como la generación de brotes en mayor

cantidad y menor tiempo, así como un mayor grado de tolerancia a condiciones de estrés

oxidativo. Por tanto, existen evidencias de la posible participación de los genes CpMYBs

aislados (especialmente el gen CpMYB4) en las rutas de síntesis de compuestos

auxínicos. Estos genes podrían ser empleados en desarrollo de nuevas metodologías de

propagación in vitro de plantas de interés biotecnológico ya que varias técnicas de

propagación emplean diversas fitohormonas que pueden afectar la tasa de producción de

brotes de plantas.

A la fecha se ha planificado e iniciado la realización de experimentos de las plantas

transgénicas obtenidas en este trabajo en los cuales se evaluarán los efectos de

diferentes fitohormonas en la tasa de generación de brotes en condiciones in vitro.

También se ha planificado la evaluación de la funcionalidad de los genes CpMYBs

aislados en este trabajo en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Se ha contemplado la

CAPÍTULO VI

161

generación de plantas transgénicas de A. thaliana con sobreexpresión de los genes

CpMYBs y también se ha contemplado la inserción de los genes CpMYBs en diferentes

líneas de plantas mutantes de A. thaliana con silenciamiento de genes AtMYBs (AtMYB7

y AtMYB44). La finalidad de estos experimentos será la evaluación de cambios en los

fenotipos de las plantas, cambios de tolerancia a diferentes condiciones de estrés y

cambios en la producción de compuestos fenólicos.

CAPÍTULO VI

162

ANEXOS

163

ANEXOS

Anexo I. Áreas de los picos señales identificados en los cromatogramas de extractos de hojas de tabaco analizados a 280 nm.

Tiempo de

retención

Control 0 d

Silvestre CpMYB44 CpMYB4

1 2 3 1 2 3 1 2 3

1.351 25.26 22.58 25.6833333 24.6 28.1 20.9833333 16.875 25.025 20.8166667

1.45 97.0333333 89.625 100.5 84.25 99.5 91.7 88.85 104.2 96.2166667

1.884 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7.118 298.6 232.95 330.916667 157.475 112.3 176.675 164.116667 149.766667 208.875

7.957 59.35 41.6333333 35.3166667 43.75 28.65 31.4666667 31.08 53.2166667 45.65

12.743 33.3 27.65 26.6833333 46.24 40.65 31.3333333 33.625 30.4833333 36.8

13.623 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15.354 4167.975 4128.78333 2044.76667 9823.46667 9583.5 5285.3 9060.175 3791.58333 4412

17.223 751.4 770.166667 750.816667 1528.3 1291.01667 862.216667 998.95 895.633333 1087.48

18.973 33.925 23.25 22.025 37.64 36.5833333 26.8833333 24.2 32.7 28.95

19.991 145.15 141.066667 75.7333333 290.016667 295.5 194.15 290.25 137.3 175.76

20.669 0 0 0 15.7666667 14.3666667 0 0 0 0

23.212 0 0 0 0 0 0 0 0 0

26.485 0 0 0 0 0 0 0 0 0

27.261 15.325 12.78 17.5833333 10 16.2833333 20.8333333 9.5 13.85 23.55

27.921 0 0 0 0 0 0 0 0 0

29.912 11.1333333 9.53333333 9.625 10.925 11.575 38.775 16.0666667 8.98333333 9.24

30.064 15.725 19.7 12.1333333 97.1833333 102.7 0 85.325 23.2666667 38.95

30.209 0 0 0 0 0 0 0 0 0

32.589 0 0 0 0 0 0 0 0 0

33.753 0 0 0 27.5666667 17.36 0 17.56 0 12.775

35.865 0 0 0 0 0 0 0 0 0

36.628 0 0 0 0 0 0 0 0 0

36.943 0 0 0 0 0 0 0 0 0

37.128 0 0 0 0 0 0 0 0 0

39.999 75.55 195.483333 65.65 0 0 0 205.65 204.383333 206.95

40.315 0 0 0 202.1 203.64 212.875 0 0 0

40.52 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ANEXOS

164

40.685 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tiempo de

retención

Control 12 d


1 2 3 1 2 3 1 2 3

1.351 26.4 24.125 23.4333333 23.6833333 19.7 23.675 18.7666667 18.0666667 15.25

1.45 90.2 91 97.2 94.65 91.9333333 92.3 85.5 88.325 89.3

1.884 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7.118 379.5 272.2 170.2 224.566667 120.166667 208.1 231.05 161.45 138.65

7.957 34.6 20.7833333 28.75 24.25 35.2333333 27.3333333 22.05 24.4666667 27.75

12.743 30.25 34 34.6333333 35.7333333 47.85 33.56 34.75 43.5666667 30.2

13.623 0 0 0 0 0 0 32.1666667 32.85 0

15.354 3470.3 8923.01667 8926.66667 4539.725 16235.275 7083.8 12060.6 10655.425 8231.725

17.223 805.425 994.733333 947.283333 1023 1482.85 1036.85 1003.13333 1232.63333 871.34

18.973 30.475 28.7 30.0333333 35.55 48.5 36.8333333 42.925 36.75 32.7166667

19.991 130.4 277.716667 305.416667 163.8 522.35 231.8 376.616667 345.775 239.116667

20.669 0 0 0 0 0 0 0 0 0

23.212 0 0 0 0 17.525 12 15.425 16.775 0

26.485 0 0 0 0 0 0 0 0 0

27.261 56.875 32.9 24.0333333 33.775 24.08 39.65 37.2333333 30.9 29.5

27.921 0 0 0 0 0 0 0 0 0

29.912 15.725 9.8 0 0 0 14.9 12.45 0

30.064 31.9 125.833333 74.3166667 0 17.8666667 15.6 202.533333 263.016667 86.88

30.209 0 0 0 0 0 0 0 0 0

32.589 0 0 0 0 0 0 0 0 0

33.753 0 18.4 10.95 0 44.925 10.7 27.7166667 35.3333333 19.0666667

35.865 8.7 9.71666667 0 0 13.9666667 10.275 12.25 9.8 0

36.628 0 0 0 0 0 0 0 0 0

36.943 0 0 0 0 0 0 0 0 0

37.128 0 0 0 0 0 0 0 0 0

39.999 0 0 0 0 0 0 175.9 138.3 0

40.315 132.283333 137.55 0 59.7333333 71.9666667 97.6833333 0 0 0

40.52 81.175 70.8666667 76.95 0 0 0 72.25 82.6166667 64.58

40.685 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ANEXOS

165

Tiempo de

retención

Sequía 12 d


1 2 3 1 2 3 1 2 3

1.351 20.95 13.05 23 0 0 0 22.7 0 20.825

1.45 79.275 66.15 128 158.45 123.975 150.525 93.14 134.2 83.225

1.884 0 0 0 31.5 0 44.7666667 0 0 0

7.118 245.883333 133.72 113.125 196.966667 94.2 128.55 133.475 187.033333 217.633333

7.957 22.35 54.65 119.583333 162.216667 107.183333 145.6 29.65 22 34.54

12.743 17.6 18.05 23.9666667 29.8666667 16.95 0 18.9 18.325 17.4

13.623 0 0 0 20.8 0 20.675 0 0 0

15.354 2326.93333 2966.76667 6277.53333 3195.5 3597.75 3771.95 2959.75 2134.25 2527.82

17.223 466.816667 460.033333 737.383333 829.3 441.433333 576.35 456.916667 405.15 442.483333

18.973 25.35 21.1 31.375 37.24 21.2666667 28.8333333 26.2166667 20.4833333 16.675

19.991 93.4 113.166667 193.216667 126.44 124.25 142.466667 125.275 95.25 97.45

20.669 0 0 0 0 0 0 0 0 0

23.212 154.05 103.15 33.1 81.8666667 34.85 63.6666667 75.3 105.225 120.233333

26.485 10.675 11.625 22.86 19.6 0 0 0 0 0

27.261 14.5 23.775 18.25 13.0333333 11.45 22.825 32.8 29.45 13.35

27.921 0 9.23333333 9.975 0 0 0 0 0 0

29.912 0 0 0 0 0 0 19.7 13.9 19.22

30.064 26.16 38.9 184.05 0 0 0 44.9 36.1166667 27.1

30.209 19.48 19.9333333 0 15.5666667 0 35.7666667 0 0 0

32.589 0 0 0 0 0 0 12.8 10.45 10.15

33.753 11.55 12.6666667 0 0 0 0 9.5 15.45 10.5333333

35.865 9.825 17.025 10.6 20.7833333 12.05 18.4166667 19.65 20.825 30.6666667

36.628 31.125 28.6666667 0 17.4 23.3666667 15.4833333 32.6 37.95 32.925

36.943 11.675 16 0 8.375 10.5 0 14.0166667 19.275 13.3333333

37.128 0 0 0 15.425 14 0 10.8666667 13.225 10.0666667

39.999 0 0 0 0 0 0 128.9 132.433333 123.45

40.315 0 0 0 130.516667 133.715 128.725 0 0 0

40.52 144.2 135.348 138.2 148.775 155.168 107.25 117.75 163.066667 160.15

40.685 0 117.312 75.15 0 0 0 0 0 0

ANEXOS

166

Anexo II Áreas de los picos señales identificados en los cromatogramas de extractos de hojas de tabaco analizados

a 350 nm.

Tiempo de

retención

Control 0 d


1 2 3 1 2 3 1 2 3

1.266 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1.334 28.375 33.38 33.1 25.35 24.1666667 34.5 30.82 30.26 29.6166667

1.468 143.85 141.95 146.85 135.3 141.9 147.116667 149 144.233333 147.05

7.119 215.7 170.15 242.366667 102.8 102.25 118.133333 122.55 103.75 149.625

12.637 22.675 16.3 15.9833333 27.75 24.0166667 17.8333333 19.725 18.35 22.76

15.354 3614.275 3568.96667 1771.25 8361.06667 8149.71667 4562.81667 7740.25 3265.18333 3795.225

16.916 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17.223 839.475 687.425 672.766667 1394.05 1151.95 770.583333 892.5 799.916667 970.52

19.994 83.3 78.7333333 42.95 154.816667 157.883333 104.3 159.975 74.6166667 89.62

29.911 13.6 10.7833333 12.4333333 25.8 23.875 68.45 19.8 10.6166667 11.0166667

30.205 49.775 42.7166667 26.7333333 218.116667 217.7 0 150.575 48.4166667 61.325

32.589 0 0 0 0 0 0 0 0 0

33.753 0 0 0 44.05 29.15 14.7 27.02 12.1333333 20.6

35.865 0 0 0 0 0 0 0 0 0

39.644 0 0 0 11 12.0333333 0 0 0 0

40.526 0 0 0 0 0 0 0 0 0

40.699 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tiempo de

retención

Control 12 d


1 2 3 1 2 3 1 2 3

1.266 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1.334 30.8 0 24.6333333 32.6166667 0 17.675 23.5666667 28.2333333 30.1

1.468 138.65 145.533333 150.183333 143.216667 147.533333 145.666667 141.433333 147.133333 143.15

7.119 274.5 195.35 123.225 161.316667 122.05 165.6 161.616667 107.466667 92.38

12.637 18.025 19.6666667 20.05 20.2333333 26.975 19.32 19.25 25.0166667 17.0833333

15.354 2985.025 7703.95 7710.7 3935.05 13694.025 6362.78 10239.4167 8832.16 6652.64

ANEXOS

167

16.916 0 0 0 0 79.975 11.0333333 0 0 0

17.223 723.475 844.575 844.866667 910.783333 1336.325 927.366667 895.6 1100.58333 750.25

19.994 69.575 164.716667 180.733333 89.95 275.35 123.725 214.25 181.616667 128

29.911 18.925 15.075 0 0 18.9 15.86 0 0 0

30.205 60.625 259.8 153.95 60.65 690.75 118.02 416.616667 561.78 170.175

32.589 0 0 0 0 0 0 0 0 0

33.753 0 31.82 22.5833333 14 18.4 20.2 43.2166667 45.9 27.4

35.865 9.4 8.175 0 0 11.7 11.6 14.125 18.45 0

39.644 0 0 0 43.675 26.6 19.55 31.76 19.9666667

40.526 21.0666667 22.925 18.2833333 14.95 12.8 22.775 18.0666667 24.5333333 13.6333333

40.699 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tiempo de

retención

Sequía 12 d


1 2 3 1 2 3 1 2 3

1.266 0 0 0 0 0 0 0 13.7 12.375

1.334 11.275 9.23333333 0 11.0333333 21.125 9.91666667 10.55 21.7 21.6

1.468 139.933333 143.15 144.516667 140.25 144.35 144.266667 141.5 146.033333 142.4

7.119 178.65 95.4666667 76.1166667 130.333333 74.825 87.55 116.366667 138.166667 155.866667

12.637 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15.354 2016.01667 2547.05 5403.6 2779.35 3130.31667 3277.825 2574.08333 1842.28333 2247.325

16.916 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17.223 414.116667 411.066667 656.133333 746.266667 396.333333 512.316667 408.216667 363.033333 394.016667

19.994 53.2 61.2333333 105.916667 65.45 69.8333333 79.7833333 62.375 52.85 57.58

29.911 0 0 0 0 0 0 14.3166667 14.875 16.14

30.205 32.7166667 52.425 39.825 55.2833333 100.625 73.625 47.45 34.075 36.0166667

32.589 0 0 0 0 0 0 15.6 12.65 14.84

33.753 0 12.925 50.1166667 12.8 14.2 22.75 0 0 0

35.865 26.375 13.8333333 10.9166667 20.8333333 12.7 17.725 15.5 16.2333333 23.6

39.644 0 0 0 11.7666667 23.9666667 12 0 0 0

40.526 67.8166667 65.325 16.26 51.925 76.7333333 33.2166667 44.625 91.875 55.05

40.699 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ANEXOS

168

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169

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