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GENÉTICA DEL CARCINOMA COLORRECTAL CON AGREGACIÓN FAMILIAR, EN UNA MUESTRA DE LA REGIÓN ANDINA COLOMBIANA Mabel Elena Bohórquez Lozano Ana Patricia Estrada Flórez Anggi Margarita Vélez Bohórquez Magdalena Echeverry de Polanco UNIVERSIDAD DEL TOLIMA 2019
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GENÉTICA DEL CARCINOMA COLORRECTAL CON AGREGACIÓN
FAMILIAR, EN UNA MUESTRA DE LA REGIÓN ANDINA COLOMBIANA
Mabel Elena Bohórquez Lozano
Ana Patricia Estrada Flórez
Anggi Margarita Vélez Bohórquez
Magdalena Echeverry de Polanco
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA 2019
Genética del carcinoma colorrectal con agregación familiar, en una muestra de la Región Andina colombiana / Mabel Elena Bohórquez Lozano … [et al.] -- 1ª. ed. -- Universidad del Tolima, 2019.
346 p. : il., tablas
Contenido: Generalidades de la genética del cáncer – Justificación -- Materiales y métodos -- Resultados – Conclusiones
ISBN: 978-958-5569-06-5
1. Carcinogénesis 2. Cáncer I. Título II. Bohórquez Lozano, Mabel Elena III. Estrada Flórez, Ana Patricia IV. Vélez Bohórquez, Anggi Margarita V. Echeverry de Polanco, Magdalena
583.74G326
© Sello Editorial Universidad del Tolima, 2019
© Mabel Elena Bohórquez Lozano, Ana Patricia Estrada Flórez, Anggi Margarita Vélez Bohórquez, Magdalena Echeverry de Polanco
Primera edición electrónicaISBN electrónico: 978-958-5569-06-5 Número de páginas: 290Ibagué-Tolima
Genética del carcinoma colorrectal con agregación familiar, en una muestra de la Región Andina colombiana Facultades de Ciencias y Ciencias de la Salud
Grupo de Investigación Citogenética, filogenia y evolución de [email protected]@ut.edu.co
Impresión, diseño y diagramación por PROVEER PRODUCTOS Y SERVICIOS S.A.S
Corrector de estilo: Carlos Alfonso Quimbayo
Todos los derechos reservados. Prohibida su reproducción total o parcial por cualquier medio, sin permiso expreso del autor.
Contenido
Dedicatorias ...................................................................................................... 11
Agradecimientos .............................................................................................. 13
Símbolos ............................................................................................................ 15
Prólogo .............................................................................................................. 17
Resumen ............................................................................................................ 19
Introducción ..................................................................................................... 23
Capítulo 1 Generalidades de la genética del cáncer ..................................................... 27
1.1. ¿Qué es el cáncer? .............................................................................................................291.2. Factores asociados con el desarrollo del cáncer................................................33 1.2.1. Oncogenes..............................................................................................................34 1.2.2. Genes supresores de tumores ......................................................................37 1.2.3. Genes de reparación .........................................................................................391.3. Cáncer con agregación familiar ..................................................................................401.4. Generalidades del carcinoma colorrectal (CCR) .............................................431.5. Epidemiología del cáncer gastrointestinal ..........................................................451.6. Herencia y riesgo del carcinoma colorrectal (CCR).........................................461.7. Perfil molecular del carcinoma colorrectal ..........................................................50 1.7.1. Vía supresora ........................................................................................................52 1.7.2. Vía mutadora ........................................................................................................55 1.7.3. Vía epigenética .....................................................................................................57
1.8. Síndromes familiares de CCR, asociados a genes de herencia mendeliana simple y/o compleja ..............................................................................57 1.8.1. Síndrome de Lynch (OMIM #120435-6) ................................................60 1.8.2. Síndromes polipósicos ....................................................................................701.9. Diagnóstico molecular del CCR con agregación familiar .............................87
Capítulo 2Justificación ...................................................................................................... 89
Capítulo 3Materiales y métodos ...................................................................................... 93
3.1. Aprobaciones éticas ........................................................................................................953.2. Selección de pacientes.....................................................................................................953.3. Muestras de sangre periférica......................................................................................963.4. Selección de familias.........................................................................................................963.5. Extracción y cualificación de ADN ..........................................................................983.6. Evaluación del perfil genético (línea germinal)...............................................1003.7. Análisis estadístico ........................................................................................................107
Capítulo 4Resultados ....................................................................................................... 109
4.1. Características demográficas de la muestra .....................................................111 4.1.1. Región de procedencia ................................................................................111 4.1.2. Género y edad ..................................................................................................112 4.1.3. Aspectos clínico-patológicos ....................................................................113 4.1.4. Antecedentes familiares de cáncer .......................................................1134.2. Síndromes familiares .........................................................................................................114 4.2.1. Perfil molecular síndromes familiares .................................................117 4.2.2. Mutaciones en genes conocidos encontradas en 20 pacientes con CCR y agregación familiar ...........................................126 4.2.3. Síndrome de Lynch .........................................................................................132 4.2.4.Síndromes Polipósicos ......................................................................................1504.3. CCR Familiar no sindrómico ....................................................................................154
Capítulo 5Discusión ......................................................................................................... 163
5.1. Aspectos clínicopatologicos .....................................................................................1655.2. Perfil molecular del CCR con agregación familiar .........................................165 5.2.1. Síndrome de Lynch – Cáncer colorrectal no polipósico - HNPCC .................................................................................................................168 5.2.2. Síndrome de Polipósis Múltiple Familiar: APC c.847C>T .........174 5.2.3. Síndrome Poliposis Juvenil asociada a SMAD4: c.403C>T ........175 5.2.4. Síndrome Poliposis asociada a MUTYH: c.1437_1439 del GGA ................................................................................................................1765.3. Cáncer colorrectal familiar no sindrómico .......................................................176
Capítulo 6Conclusiones ................................................................................................... 181
Perspectivas y recomendaciones ..........................................................................................184
Referencias ...................................................................................................... 187
Anexos ............................................................................................................. 227
Anexo A: Abreviaturas .......................................................................................................229Anexo B: Consentimientos informados ..................................................................236Anexo C: Cebadores sistema Acces Arrary- Fluidmg .......................................240
Listado de figuras
Figura 1. Poliposis Adenomatosa familiar – aspecto macroscópico. ......77Figura 2. Criterios diagnósticos Síndrome de Lynch, adaptado y traducido de Rodríguez, Bigas et, al. ..................................................98Figura 3. Access Array 48-48 IFC (High-throughtput LP 48-48 IFC). ....102Figura 4. CCR: Distribución por género y ciudad. ..........................................112Figura 5. CCR: Distribución por grupo etario. ..................................................112Figura 6. CCR: Distribución anatómica detallada. .........................................113Figura 7. CCR: Distribución de individuos en familias. .................................116Figura 8. Distribución de enfermos en familias CCR .....................................117Figura 9. Síndrome de Lynch: mutación MSH2 c 1552C>T. Familias extendidas- D-2-275 e I-2-202. ..........................................138Figura 10. CCR germinal: Familias - perfil molecular mutación MSH2 c.1552C>T. Id supuesto ...............................................................139Figura 11. Síndrome de Lynch: mutación MSH2 c G1034A. Familia D-3-19. ................................................................................................141Figura 12. Síndrome de Lynch: Familias - perfil molecular mutación MSH2 c.G1034A (p.Trp345*) ...........................................142Figura 13. Síndrome de Lynch: mutación MSH2 c C1316T. Familia D-3-17. ................................................................................................145Figura 14. Síndrome de Lynch: mutación MLH1 c C445T. Familia H-2-030. .............................................................................................147Figura 15. Síndrome de Lynch: mutación MLH1 c 545+1G>C. variante no reportada. Familia I-2-166. .............................................148Figura 16. Síndrome de Lynch: mutación MLH1 c 790+1G>A. Familia I-3-1. .....................................................................................................149Figura 17. Poliposis asociada a SMAD4 mutación c.403C>T. Familiograma D-3-9 .....................................................................................152Figura 18. Poliposisi asociada a MUTYH mutación c.1440_ 1440delinsGGA. Familia I-3-10. .............................................................153Figura 19. CCR familiar no sindrómico. Familia O-3-I. ....................................155Figura 20. CCR familiar no sindrómico. Familia I-3-13. ...................................156
Figura 21. CCR familiar no sindrómico. Familia I-3-3. ......................................157Figura 22. CCR familiar no sindrómico. Familia D-3-10. .................................158Figura 23. CCR familiar no sindrómico. Familia D-3-10. .................................159Figura 24. CCR familiar no sindrómico. Familia D-3-22. .................................160Figura 25. CCR familiar no sindrómico. Familia I-3-7. ......................................161Figura 26. CCR familiar no sindrómico. Familia D-3-24. .................................162
Listado de tablas
Tabla 1. Tipo de alteraciones genéticas asociadas con el desarrollo del cáncer en humanos ...............................................................................32Tabla 2. Características clínicas y genéticas – Síndromes de CCR familiar ..................................................................................................................71Tabla 3. Protocolo para amplificación - Sistema Acces ..............................103Tabla 4. Sistema Acces Array - Adición de códigos de barras ...............104Tabla 5. Distribución por región pacientes CCR ............................................111Tabla 6. Pacientes con antecedentes familiares de cáncer .......................114Tabla 7. Síndromes familiares CCR – distribución por ciudad – criterios clínicos .............................................................................................115Tabla 8. Síndromes familiares CCR – distribución de individuos ........115Tabla 9. Genes de riesgo examinados relacionados con síndromes familiares de CCR ..........................................................................................118Tabla 10. Mutaciones encontradas en los casos índice, para 12 genes de riesgo examinados, asociados a síndromes de cáncer con agregación familiar .............................................................................119Tabla 11. Casos índice de CCR (55), negativos para las mutaciones de genes de riesgo asociadas a los síndromes de cáncer con agregación familiar .............................................................................121Tabla 12. CCR con agregación familiar: características clínicas, moleculares: mutaciones, inmunohistoquímica, inestabilidad microsatelital. ...................................................................128Tabla 13. CCR germinal: Porcentaje de mutaciones por familia: .............131Tabla 14. Características genotípicas en Casos índice / CCR - Síndrome de Lynch ...................................................................................134
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Dedicatorias
A mi familia, que me dio la fuerza más grande: voluntad.
A la memoria de mi amigo y colega Rodrigo Prieto Sánchez, por su paciencia y respeto.
A los integrantes del grupo de Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones, por sus enseñanzas y aporte fundamental en mi formación personal y académica, y en la construcción de esta obra.
Mabel
Este es el relato molecular de un sueño, uno que camino por una senda larga y sinuosa para ser inmortalizado, por lo que debe dedicarse a los que marcharon junto a él. Para los que no sobrevivieron y para los que sí, muchas gracias.
Anggi
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ar Dedicado a la memoria de mi amigo y maestro Rodrigo Prieto, quien sembró en mí el interés por la genética. Quiero agradecer especialmente a su familia por permitirnos robar su tiempo, por dejarnos compartir con él tantas horas extras de trabajo, en las cuales se dedicó a explicarnos y a llenarnos la cabeza con lo maravilloso de la ciencia.
Ana Patricia
Al Grupo de Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones de la Universidad del Tolima, cuyos miembros, todos, incluidos los que ya se han ido temporalmente o para siempre, han hecho posible el desarrollo de estos trabajos.
Los quiero mucho, son los hijos que la academia me ha dado.
María Magdalena
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Agradecimientos
Este trabajo tuvo como pilar a las familias, la organización más general, pero a la vez la más importante del hombre, así que es a esas familias, a las que los autores quieren agradecer estos años de arduo trabajo, llenos de tropiezos, caídas, dificultades, alegrías y tristezas; cuyo final, en ocasiones, parecía imposible de atisbar. Fueron estas familias que, con su apoyo y valor, hicieron posible este libro:
Vélez Bohórquez: Javier y Daniel, por el valor, el apoyo, y sobre todo el amor.
Polanco Echeverry, que nos incluyeron como hijos a todos los del grupo, se comprometieron con nuestros planes y siempre tuvieron una palabra de aliento ante la adversidad.
Prieto Rojas: La pérdida de Rodrigo, esposo, padre amoroso y paciente amigo, hemos llorado todos. Siempre lo extrañaremos por su tolerancia, sabiduría y enseñanzas.
Carvajal Polanco, Estrada Flórez, Criollo Rayo, Ramírez Alfonso, Suárez Olaya y Montealegre, que apoyaron todo el proceso, desde la toma de muestras, las pruebas moleculares y los análisis de datos, hasta las alegrías y las penas.
Las que participaron en el estudio, quienes, aun habiendo perdido por cáncer a sus seres amados, decidieron acompañarnos de manera
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ar desinteresada, sabiendo que muy poco o nada, les podíamos ofrecer. A ellas, mil gracias. Nos enseñaron algo muy importante, el valor de la resignación.
La del grupo de Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones, que desde hace quince años nos ha permitido crecer en conocimiento, compromiso y amistad.
La del laboratorio de Genética del Cáncer del doctor Luis Carvajal, en la Universidad de California-Davis, que apoyó el aprendizaje de las nuevas técnicas de secuenciación y los análisis bioinformáticos, especialmente a su director y a Ruta Sasharabunde, por su paciencia.
La del Grupo de Genética Molecular del Wellcome Trust Centre for Human Genetics de la Universidad de Oxford-Inglaterra, por su apoyo en el desarrollo de algunas de las pruebas moleculares y el análisis bioinformático.
Las del doctorado en Ciencias Biomédicas, porque cada semestre dedicaron tiempo para ofrecernos sus invaluables aportes a este proyecto.
Las de las Facultades de Ciencias y Ciencias de la Salud: Sus profesores y directivos colaboraron en todos los aspectos administrativos y técnicos pertinentes.
La de la Universidad del Tolima, nuestra Alma Mater, por depositar su confianza en el Grupo de citogenética, filogenia y evolución de poblaciones de la Universidad del Tolima (GCFEP) y por el apoyo logístico y económico para hacer posible este trabajo de investigación.
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Símbolos
CaracterísticaSimbolo
familiogramaDescripción cuadros
Padres e hijos, números arabigos denota individuo
1
1
2
2
Número central = edad a Junio 201621
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Generaciones en números romanos I-II-III-IV Cáncer Colorrectal
Hombre Muestra de Sangre
Mujer Cáncer Gástrico
Hombre fallecido Caso Indice
Mujer fallecidaCáncer EndometrioCáncer de Cérvix
Gemelos Cáncer de Hígado
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Paciente - números arábigos D-2-00__ Poliposis
Familia – números romanos D-3 I__ Portador homocitogoto
Software para elaboracion de familiogramas
Portador heterocigoto
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Prólogo
Este libro es el resultado del trabajo de investigación CARCINOMA COLORRECTAL (CCR) ESPORÁDICO Y FAMILIAR EN COLOMBIA, producto de la tesis de doctorado en Ciencias Biomédicas de Mabel Elena Bohórquez Lozano, dirigida por María Magdalena Echeverry de Polanco y Luis Guillermo Carvajal Carmona. El proyecto nació en el año 2005, en el seno del grupo de Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones - Categoría A1 COLCIENCIAS -2017- como parte del programa de investigación: Análisis genético poblacional de enfermedades humanas, el cual se enfoca, principalmente, en la genética básica de distintos tipos de cáncer y el mapeo genético de diferentes poblaciones indígenas del territorio nacional. Como fruto de estos 13 años de trabajo, en el campo de las poblaciones humanas, a la fecha se han finalizado 17 proyectos de investigación y están en proceso de desarrollo otros siete. Se cuenta con 25 publicaciones, en su mayoría de carácter internacional y se ha logrado muestrear a 8.339 individuos, entre casos y controles poblacionales, familiares e indígenas, lo cual ha generado una importante colección de muestras de sangre y tumor, actualmente bajo custodia del grupo. En alianza con el Instituto Nacional de Cancerología, (INC) y la Universidad de California Davis, en la actualidad se avanza en tres convenios nacionales de investigación y dos internacionales, habiendo finalizado otros tres con el Cancer Research UK, la Unión Europea-Universidad de Oxford y Glaxo Smith Kline Oncology. Los resultados de este proyecto fueron presentados en el XIII Congreso Colombiano de Genética Humana y VII Congreso Internacional en la ciudad de Cali en 2014, en donde fueron galardonados con el Primer puesto – modalidad poster y en el XL Congreso Colombiano de Patología en el que ganó el Segundo puesto – modalidad de Poster.
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ar La tesis de doctorado correspondiente a este trabajo fue galardonada con calificación 5.0 -Laureada. Además, se ha socializado en diferentes seminarios y congresos, entre los que se cuentan: American Association for Cancer Research, San Diego, USA – 2014; 6th Biennal of The International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumours – InSIGHT- Brasil 2015 y 7th Biennial Meeting InSIGHT - Italia 2017.
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Resumen
En este trabajo se planteó describir las principales características clínicopatologicas y algunos de los fenotipos moleculares de Carcinoma Colorrectal (CCR) con agregación familiar.
Métodos
De una muestra de 1.278 pacientes, se seleccionaron 69 casos de CCR con agregación familiar, aplicando los criterios clínicos (Amsterdam, Bethesda y poliposis).
El ADN para la creación de las librerías génicas, se obtuvo a partir de muestras de sangre periférica, mediante PCR microfluídica (Fluidigm); la secuenciación se realizó por MiSeq (Illumina); la verificación de las variantes candidatas se realizó mediante secuenciamiento por el método de Sanger. Las mutaciones encontradas se probaron en los parientes de los pacientes.
Resultados
El promedio general de edad fue de 57,4 años, aproximadamente, 10 años menor que en los países desarrollados; la enfermedad es más frecuente en el género femenino (53,2%); para los casos índice, el promedio es de 46 años.
Se analizaron 459 familiares de los 69 casos índice, 74% de ellos fenotípicamente sanos, y 72% menores de 50 años; se identificaron 48 mutaciones en genes conocidos, de las cuales 18 tienen implicaciones funcionales. El síndrome familiar más frecuente fue el de Lynch (85%), en cuyos pacientes se identificaron tres mutaciones no sinónimas en MSH2,
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ar de las cuales, dos (MSH2 c.G1034A y MSH2 c.1552C>T) se presentaron en cinco individuos. Estas variantes fueron informadas previamente en Europa, pero no se encontraron reportes para Colombia. La tercera (-c.2458+1G>T) es una variante nueva con potencial patogénico, en evaluación. Para MLH1 se encontró la mutación c.C445T, sin datos conocidos en Colombia, y una variante nueva (c.545+1G>C), con potencial patogénico, en evaluación. Cabe destacar que en este trabajo se presentan los primeros reportes, para Colombia, de poliposis asociada a las variantes SMAD4 c.403C>T y MUTYH c.1437_1439delGGA.
De otra parte, es importante anotar que el 80% del total de las familias corresponde a casos de CCR familiar no sindrómico, generalmente clasificados como Lynch y polipósicos, en los cuales no se encontraron mutaciones de los genes conocidos como de alto riesgo para síndromes familiares; esto pone de relieve la necesidad de implementar nuevas dianas moleculares para determinar el perfil genético de este tipo de pacientes y desarrollar proyectos de investigación orientados a establecer en ellos el riesgo de presentar la enfermedad.
Conclusiones
Respecto del CCR en Colombia, el promedio de edad de presentación es de 57 años, inferior a la reportada en países desarrollados, en donde es de 67 años.
Es necesario establecer políticas públicas para el tamizaje del CCR en la población menor de 50 años. Estos sondeos se deben realizar con inmunohistoquímica para MLH1- MMR, y con la inestabilidad de los microsatélites para identificar a los pacientes en riesgo de ser portadores de mutaciones relacionadas con el síndrome de Lynch.
La identificación de variantes génicas nuevas y de mutaciones en genes relacionados con cáncer familiar, reportadas por primera vez en Colombia, permitirá generar políticas preventivas para el tamizaje de dichas mutaciones en la población en riesgo.
Palabras clave: Carcinoma colorrectal, genética, síndromes con agregación familiar, mutaciones.
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Summary
The purpose of this paper is to describe the main clinicopathological features and some of the molecular phenotypes of Colorectal Carcinoma (CRC) with familial agreggation.
Methods
The 69 indice cases of CRC, were selected from a sample of 1278 patients, using Amsterdam, Bethesda and Polyposis clinical criteria. A blood sample was taken by peripheral venipuncture; DNA genome libraries were created using PCR microfluidics of Fluidigm and sequencing with Illumina Miseq; the candidate variants were sequenced using the Sanger method. The mutations found were tested in the relatives.
Results
Our research indicates that the average age of Colombian CRC patients is 57.4 years (approximately 10 years younger than in developed countries). The disease is more common in females (53.2%). The frequency of patients younger than 50 years was (26.5%).
From the families of this 69 indice cases we sampled 459 individuals; 74% of them were phenotypically healthy and 75% were younger than 50 years. A total of 48 mutations in known genes were identified, 18 of which have functional implications. The most frequent familial syndrome was the Lynch syndrome (85%) with three nonsynonymous mutations in MSH2; two of which were presented in more than one family (MSH2 c.G1034A and MSH2 c.1552C>T in two and three individuals respectively). These
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ar variants were previously reported in Europe, but no reports were found in Colombia. The third one is a new variant –c.2458+1G>T with pathogenic potential in evaluation. Additionally, this paper presents the first reports known in Colombia of polyposis associated with variants SMAD4 c.403C>T and MUTYH c.1437_1439delGGA.
Familial, non syndromic cases of CRC were found in 80% of the families evaluated and were generally classified as Lynch and polyposis. Talking about this porcentaje, is important to say that we did not found known genes, of high risk for familial syndromes on it. Therefore, there is a need to implement new molecular targets to determine the genetic profile of those patients, in order to establish the risk of disease.
Conclusions
The CRC in Cololombia occurs on average 10 years earlier compared to developed countries. It is necessary to establish public policies for CRC screening in the population younger than 50 years old. These screenings should be done with immunohistochemistry for MLH1 and microsatellite instability to identify patients at risk of being carriers of mutations related to Lynch syndrome.
The identification of new gene variants and the mutations reported for the first time in Colombia in familial cancer-related genes will allow the establishment of preventive screening for such mutations in the population at risk.
Keywords
Colorectal cancer, genetic syndromes with familial aggregation mutations.
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Introducción
Muchos aspectos de la salud están influenciados por el genotipo y, dado que este evoluciona, los estudios genéticos tienen implicaciones importantes en el diagnóstico, comprensión y manejo de los mismos. Como ejemplos de este tipo de implicaciones se puede citar, en primer lugar, la influencia de la genética en la incidencia y en la prevalencia de una enfermedad en una población. La incidencia se define como el número de casos nuevos de un síndrome, registrados durante un período de tiempo particular, es decir, el flujo de la enfermedad durante ese lapso; en contraste, la prevalencia es la proporción de la enfermedad en un momento preciso, es decir, es un concepto estático, dependiente de la incidencia y la duración de la enfermedad. En segundo lugar, está el uso de la información evolutiva en la identificación de los genes de la enfermedad. En tercer lugar, la información que puede aportar el conocimiento de la genética en el diagnóstico temprano, en el tratamiento y en la prevención de la enfermedad.
No existe una distinción clara entre la variación genética normal y la asociada con las enfermedades. Las consecuencias fenotípicas de una variante genética dependen de la forma en que el gen o genes mutados interactúan entre ellos y con el medio ambiente; sin embargo, es necesario distinguir entre las variantes que son desfavorables en la mayoría de los ambientes y las que usualmente resultan neutrales. Por ejemplo, la fenilcetonuria, provocada por un gen mutante deletéreo, se desarrolla en individuos que tienen una baja actividad de la enzima fenilalanina hidroxilasa y viven con base en una dieta que contiene niveles mayores que los mínimos del aminoácido fenilalanina. En estos casos el exceso de fenilalanina no se metaboliza y se acumula, causando retardo mental además de otros síntomas. El diagnóstico puede hacerse temprano -antes
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ar o después del nacimiento- y la persona puede llevar una vida normal con sólo tener una dieta adecuada. (Jobling, 2004).
Cada vez resulta más claro que condiciones y enfermedades como: acondroplasia, Tay Sachs, braquidactilia, anemia de los glóbulos falciformes, distrofia muscular de Duchenne, hemofilia, fibrosis cística, corea de Huntington y muchas más, se producen, como consecuencia de fallas resultantes, en su mayor parte, de la mutación de un único gen, cuyo efecto fenotípico, a diferencia de otros como el de la fenilcetonuria, está muy canalizado, es decir, no presenta mayores fluctuaciones por las presiones ambientales. Por ejemplo, si alguien es homocigoto para la deleción de tres pares de bases del gen de la fibrosis quística, o si la secuencia CAG se repite más de cuarenta veces en uno de los dos genes del par relacionado con Huntington, la enfermedad se manifestará sin importar en dónde se viva ni la dieta.
Mucho más comunes que los anteriores son los desórdenes complejos o poligénicos, es decir, aquellos producidos por un grupo de genes. Entre estos se incluyen enfermedades como el asma, la esquizofrenia, la hipertensión, la diabetes, la aterosclerosis y el cáncer. Los cambios en uno o varios genes del grupo generan interacciones que pueden llevar a la predisposición hacia una enfermedad particular, cuyo fenotipo puede estar impactado en mayor grado por el ambiente. Como ejemplo, se puede considerar el caso del alcoholismo, en el cual se tiene un grupo de genes que predisponen al mismo; el presentar o no los síntomas de la enfermedad depende de la interacción del individuo con el alcohol. Lo mismo puede decirse del asma y de otras enfermedades. (J. D. B. Watson, A., 2004).
La compleja interacción de genes y medio ambiente es muy evidente en el cáncer, ya que este obedece a un desorden genético causado por mutaciones en varios genes, y cada mutación altera un comportamiento más en la célula, antes de que adquiera el carácter de maligna. El riesgo varía mucho, tanto inter como intrapoblacionalmente, en distintos ambientes; por ejemplo, el cáncer gástrico es casi tres veces más frecuente entre los japoneses que viven en Japón que entre los que viven en Hawái o en los Ángeles, lo cual lleva a pensar que una proporción considerable del riesgo se relaciona con la exposición a carcinógenos del medio. La naturaleza de los carcinógenos ambientales y la valoración del riesgo asociado con
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la exposición, son objeto de un gran interés en los estudios genéticos relacionados con esta enfermedad, ya que los agentes ambientales pueden actuar como mutágenos en células somáticas, que, a su vez, pueden provocar el cáncer. (Nussbaum, 2001).
Con frecuencia se dice que alguna enfermedad tiene un carácter hereditario porque varios miembros de la familia -tres o más- la presentan. Afortunadamente, el mayor porcentaje de los casos de cáncer no encajan en esta condición, ya que las mutaciones aparecen a lo largo de la vida del individuo, por ejemplo, por errores durante el proceso de replicación del ADN o como consecuencia de algunas reacciones químicas de la célula. Los rayos ultravioleta son agentes mutagénicos, al igual que el humo del cigarrillo y el asbesto. Una de las metas que se persigue con los estudios de enfermedades relacionadas con los daños genéticos causados por mutaciones o aberraciones es personalizar la medicina, de tal manera que los tratamientos se correspondan con el perfil genético de cada individuo. La comprensión de la etiopatología genética del cáncer se ha logrado en gran medida gracias al desarrollo de las técnicas de genética molecular, que permiten comparar las secuencias de genes normales con las de genes mutados.
En la actualidad, el genoma de cualquier individuo puede ser secuenciado para un gran número de loci, lo cual permite identificar su susceptibilidad genética a enfermedades tan complejas como el cáncer; de esta manera se podrá llegar, en un futuro cercano, a personalizar el tratamiento y, en los casos de agregación familiar, proporcionar los elementos para una asesoría genética enfocada en la prevención y diagnóstico temprano.
En el caso del carcinoma colorrectal (CCR) de agregación familiar, cuyo riesgo está asociado a mutaciones de origen germinal, además de algunos genes de bajo impacto fenotípico como GREM1, BMP4, y BMP2, están implicados loci de alto impacto ya identificados, entre los que se cuentan el APC, el MUTYH y los de los genes MSH2, MLH1, MLH6 y PMS2, pertenecientes al grupo MMR. En este trabajo, a partir de una muestra de 1.278 casos con CCR, se seleccionaron 69 casos con agregación familiar, a los cuales se les realizó la amplificación de los genes mencionados mediante el PCR microfluídica (Fluidigm) y secuenciación por MiSeq (Illumina).
Capítulo 1
GENERALIDADES DE LA GENÉTICA DEL CÁNCER
Fuente: Freepik.es
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1.1. ¿Qué es el cáncer?
Un patrón genético común en pacientes de todos los tipos de cáncer es la presencia de mutaciones que pueden ocurrir en la línea germinal o, con mucha mayor frecuencia, en
la somática. En consecuencia, el cáncer se define como un trastorno genético, en el que el control normal de proliferación celular se ha perdido, por cambios en los genes responsables del ciclo celular, lo mismo que por la apoptosis, oncogenes, genes supresores de tumores o genes de reparación.
La evidencia de que la mayor parte de síndromes de cáncer se desarrollan por la acumulación de variantes génicas de tipo somático a lo largo de la vida está dada por el aumento lineal de los casos con respecto de la edad. La incidencia general pasa de ser menos de dos casos por cada 100.000 personas con edades menores a 50 años, a cerca de 500 casos por cada 100.000 personas, al estar próximos a los 80 años. Así mismo, la acumulación sucesiva de mutaciones muestra una correlación con los cambios patológicos progresivos, que van desde el tejido normal hasta el tumoral. Por ejemplo, en el caso del cáncer de colon, en cada etapa de la carcinogénesis, que va desde la displasia hasta el adenocarcinoma, se han determinado por lo menos siete cambios genéticos. (Grady & Carethers, 2008; Meza, 2006).
Los diversos síndromes asociados al cáncer pueden entenderse de dos formas diferentes: como una enfermedad, o como la forma natural que
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ar tiene un organismo para llegar a su etapa final. Los genes de las células, tanto somáticas como germinales, están expuestos a lo largo de la vida a presentar y a acumular mutaciones. Si alguna de estas mutaciones le confiere a la célula una ventaja reproductiva, la consecuencia inmediata es que la selección natural aproveche esta ventaja, al igual que lo hace en cualquier otro proceso evolutivo, permitiendo que la célula prolifere, formando un clon que aumentará su número indefinidamente, de tal forma que puede llegar a tomar el control del órgano, del sistema o de todo el individuo. (Strachan, 2004).
El control del crecimiento celular está adecuado para responder a las necesidades precisas de un organismo. Los eventos que regulan el crecimiento de las células tumorales son, en su mayoría, debidos a mutaciones o cambios en el ADN de las células somáticas, razón por la cual los tumores surgen con mayor frecuencia en organismos con mayor edad. Los tumores benignos están formados por células muy parecidas en su fenotipo a las normales, permanecen localizados en los tejidos de origen y raramente afectan la salud del organismo (excepto cuando producen hormonas). Las células de los tumores malignos presentan fenotipos diferentes a los de las células normales, son inmaduras o muestran diferentes patrones de diferenciación y pueden diseminarse por todo el cuerpo comprometiendo la salud del organismo. (Mojica, 2001).
Además del desorden en la reproducción, que permite la proliferación de las células neoplásicas, existe otro proceso que, cuando se altera, incide en la aparición del cáncer: la muerte programada o apoptosis. Si la apoptosis se inhibe por mutaciones en los genes que se encargan de cumplir esta función, las células mutadas, de todo género, quedan libres para perpetuarse.
Por la década de 1960, el cáncer no se consideraba una enfermedad genética, pues sólo en muy pocos casos (el 10% o menos) se asociaba a genes con patrones de herencia definidos en el familiograma; el resto eran casos esporádicos. Para entender mejor el carácter genético del cáncer es importante recordar que esta enfermedad está relacionada con desórdenes del ADN, es decir, que la acumulación de mutaciones en una célula en particular causa en ella la pérdida progresiva de la habilidad para responder a las señales de regulación del crecimiento celular. De otra parte,
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hay que tener en cuenta que los genes no se encuentran únicamente en los cromosomas de los núcleos y las mitocondrias de las células germinales, sino que se repiten en todas y cada una de las células somáticas del organismo, en las cuales cumplen funciones discriminadas, según el tipo de tejido del respectivo órgano que los alberga; esto es importante porque aun cuando las mutaciones de tipo somático no son heredables entre generaciones, sí lo son entre clones celulares. Para que una célula dé origen a un tumor maligno, en la mayoría de los casos es necesario que confluyan en ella varías mutaciones, razón por la cual el cáncer de origen esporádico es, por lo general, una enfermedad de la edad postreproductiva. (Strachan, 2004).
La progresión de una célula eucariótica normal al ciclo reproductivo está controlada por factores moleculares. Las células normales crecen y se reproducen únicamente cuando el balance de las señales estimulatorias e inhibitorias recibidas desde el exterior de la célula favorece la proliferación. Una célula cancerígena no responde a las señales usuales y se reproduce sin control (Russell, 2003).
Existe un consenso alrededor de que la mayoría de los tipos de cáncer son provocados por una serie de eventos moleculares, que alteran los mecanismos normales de crecimiento y desarrollo. (T. F. Lee, 1994). El modelo de los dos éxitos o golpes para que el cáncer se inicie establece que se necesita una mutación en cada uno de los dos alelos de un gen asociado al cáncer, para que se desarrolle la enfermedad.
Los genes que suelen ser blanco de las mutaciones relacionadas con el cáncer, tanto familiar como esporádico, en su mayor parte pertenecen a una de las siguientes tres clases: oncogenes, genes supresores de tumores o genes de reparación. Estos últimos codifican proteínas que participan en la vigilancia del funcionamiento y conservación del genoma. Los tumores se desarrollan a consecuencia del daño causado por la influencia combinada de factores genéticos mutados que interactúan con factores ambientales, como las radiaciones, el humo del cigarrillo, los virus, etc., en uno o más de los tres tipos de genes, como se puede apreciar en la tabla 1.
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ar Tabla 1. Tipo de alteraciones genéticas asociadas con el desarrollo del cáncer en
humanos
Alteración genética Consecuencias Ejemplos
Cambios en la secuencia del
ADN
Mutación puntual
Ninguna, codificación alterada, splicing
alterado, proteínas truncadas.
Activación de proto-oncogenes
RAS, inactivación del supresor de tumor
TP53.
Inserciones o delecciones pequeñas
ORF alterado, inestabilidad del mARN.
Expansión/contracción del oligo-A en el gen
TGFBR2
Delecciones grandes
Proteínas truncadas, ORF alterado, regulación
génica alterada.
Delección de CDKN2A, perdida de dominios en el gen supresor de
tumor RB1.
Inserción grande
Perdida de genes, proteínas truncadas o cortas por perdida
de exones. Disrupción del gen con pérdida
de la proteína, splicing alterado.
Inactivación del gen supresor de tumores APC por inserción de
un retrotrasposon.
Infección viral
Introducción del genoma
viral e inserción de secuencias
virales en el genoma humano
Introducción de nuevas proteínas
regulatorias, alteración de la regulación
génica por la inserción viral, inestabilidad
cromosómica.
Inactivación de TP53 y RB1 por las proteínas
E6 y E1 del VPH, activación oncogénica
retroviral LTR.
Cambios en la estructura
cromosómica
Delecciones muy grandes
Perdida de varios genes.Delección 8p en cáncer
de próstata
Translocaciones cromosómicas
Regulación génica alterada, fusión de genes
y proteínas.
Activación del oncogén MYK en linfomas,
fusión de BCR-ABL en CML
Inversiones cromosómicas
Regulación de los genes alterada, fusión de genes.
Activación del oncogén RET en cáncer de
tiroides
Amplificación génica
Incremento de la expresión génica.
Sobreexpresión de los oncogenes MYC o
ERBB1
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Alteración genética Consecuencias Ejemplos
Cambios en el número
cromosómico
AneuploidiaAlterada expresión
génica
Alterado el número cromosómico en muchos canceres
avanzados.
Ganancia cromosómica
Alterada expresión génica
Ganancia del cromosoma 7 en células de cáncer
papilar renal.
Perdida cromosómica
Alterada expresión génica
Perdida de 3p en CCR
Traducido y adaptado de: (Schulz, 2005)
1.2. Factores asociados con el desarrollo del cáncer
Las células tumorales se caracterizan por el aumento en su actividad proliferativa y por la adquisición de capacidad invasiva. La primera condición les permite escapar de la regulación del crecimiento normal del tejido, y la segunda les otorga el potencial de migrar desde su lugar de origen a otros tejidos u órganos, dando paso a la metástasis. Estos cambios en el comportamiento natural de las células requieren de un gran número de alteraciones moleculares oncogénicas, que pueden afectar la proliferación y diferenciación celular en diferentes puntos del ciclo celular o alterar el proceso de apoptosis. (Garraway & Lander, 2013).
Las diferentes etapas de modificación molecular asociadas con la formación y progresión tumoral, se pueden plantear de acuerdo a la siguiente secuencia de eventos:
• Cambio de algunos proto-oncogenes a oncogenes.• Pérdida de la función de genes supresores.• Modificaciones en los genes de reparación del ADN.• Limitada función por mutación de los genes relacionados con la
apoptosis.
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ar • Otros mecanismos, tales como la activación de telomerasa, de genes interruptores, reparación de la oxidación mediada por radicales libres procedentes del metabolismo celular, reacciones de depurinación, de desaminación, etc.
• Inestabilidad genética (microsatélites y cromosómica). (Sánchez., 2006).
El inicio y progresión del cáncer compromete la alteración de genes fundamentales, con la consecuente afectación de las proteínas que se originan de estos. Dicho cambio puede generar una sobre expresión o reducción de las mismas, o un cambio funcional del polipéptido. Como se mencionó antes, son muchos los genes que al sufrir modificaciones se relacionan con el desarrollo del cáncer, pero, por consenso general, estos se pueden ubicar en tres grupos, de acuerdo con su papel en los mecanismos de crecimiento, proliferación y control celular o en la protección de la integridad del ADN.
1.2.1. Oncogenes
Peyton Rous, nacido en 1879, demostró en 1909 que un pollo con sarcoma podía contagiar un pollo sano. En ese entonces nadie le creyó, ya que el cáncer no se consideraba contagioso y lo más fácil era pensar que Rous estuviese equivocado. Posteriormente, en los años sesenta, se descubrió en animales, una cepa de oncovirus que empezaba por el propio sarcoma de Rous, seguido por otros oncovirus humanos como el de cáncer de cervix. Después de 55 años, Rous recibió el reconocimiento a su descubrimiento a la edad de 86 años, con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1966 (Nobel-Foundation).
Pronto se reveló que el sarcoma de Rous era portador de un gen, el src, que provoca cáncer. Enseguida aparecieron otros oncogenes provenientes de oncovirus y, por la misma década de los sesenta, Bruce Ames observó un hecho importante: muchas de las sustancias químicas y radiaciones que producen cáncer, como el alquitrán de hulla y los rayos X, tenían en común la capacidad para dañar o mutar el ADN. La conjetura de Ames fue inmediata: ¡El cáncer podría ser una enfermedad genética! (Ridley, 2001).
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La década de los sesenta fue muy importante para el esclarecimiento de la patogenia de los virus en relación con el cáncer y con otras enfermedades. En 1961, un virus de los simios llamado SV40 fue aislado de los riñones del mono Rhesus, para hacer uso de él en la preparación de la vacuna de la polio. Aunque se creía que el virus no tenía efecto en los monos, los experimentos mostraron que podía causar cáncer en roedores y, en condiciones controladas de laboratorio, en células humanas. Afortunadamente, los niños vacunados contra la polio no mostraron presencia de cáncer desarrollado como consecuencia de la vacuna, y SV40 no mostró más efectos en humanos que en simios. Este incidente dio inicio a las investigaciones con SV40 que buscaban dilucidar las bases genéticas del cáncer. Una vez que los científicos lograron secuenciar el SV40, se pudo establecer exactamente cuáles de sus genes eran los responsables del cáncer. Dichos genes podían transformar células normales en cancerígenas, capaces de formar tumores. Rápidamente los científicos empezaron a identificar genes tumorales en células humanas, para, finalmente, confirmar que el cáncer en humanos se debe a cambios en el ADN, y no simplemente, como se creía, a accidentes no genéticos en el crecimiento celular. Se encontraron, además, genes que aceleraban o promovían el crecimiento cancerígeno y genes que inhibían el mismo; al igual que los automóviles, las células necesitan tanto de un acelerador como de un freno para funcionar en forma apropiada. (J. D. B. Watson, A., 2004).
La influencia de la genética en el cáncer se aclaró en 1975 con una noticia que convulsionó al mundo científico: el gen src, descubierto en el virus de Rous, no era exclusivamente viral, aparecía en el genoma de los pollos, los ratones y también los humanos. Conclusión: el virus había robado el gen a uno de sus hospederos (J. D. B. Watson, A., 2004). Hoy en día está muy claro que los virus son agentes adecuados para introducir genes en una célula, lo cual los ha convertido en herramienta de primera línea para los investigadores, quienes los usan como vectores en terapia génica. Se conoce que, en los animales, ciertos virus ARN o retrovirus insertan una copia de su ARN en forma de ADN en el huésped. En la naturaleza abundan los ejemplos de bacterias, plantas y animales con ADN viral en su genoma, y este tipo de transferencia horizontal puede ser más común de lo que se piensa.
La transformación de células a un estado neoplásico puede ser el resultado de la infección de "virus tumorales", que inducen a las células que
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ar infectan a proliferar de manera incontrolada, dando origen a un tumor. Los virus tumorales, que pueden ser ADN o ARN, se encuentran en muchos animales y actúan de manera diferente, según el tipo de genoma que tengan.
Los retrovirus son virus tumorales que se replican mediante un ADN intermediario. Todos los virus tumorales ARN son retrovirus, pero no todos los retrovirus causan cáncer. Cuando un retrovirus infecta una célula, su genoma ARN se separa de la partícula viral y, gracias a la acción de la transcriptasa inversa, se sintetiza un ADNc del genoma llamada ADN proviral, el cual se integra al genoma de la célula hospedera. Después, utilizando la maquinaria metabólica del hospedero, los genes virales se transcriben en su totalidad al ARN correspondiente; posteriormente, este ARN se ensambla en la cápsula viral, para infectar otras células. (Frazer et al., 2012).
En el caso del retrovirus del sarcoma de Rous (RSV), la inducción del tumor es causada por uno de los oncogenes virales (v- oncs), que son responsables de muchos tipos diferentes de cáncer. Sólo los virus que contienen un (v- onc) son tumorales. Los oncogenes (v- oncs) son llamados por el nombre del tumor que producen y la v indica el origen tumoral, por ejemplo, el v- onc del gen RSV es v- src.
Los bacteriófagos que arrastran genes de una célula a otra se llaman transductores; por lo tanto, los que transducen genes retrovirales se llaman transductores de retrovirus. (También existen bacteriófagos no transductores).
Las células infectadas por el RSV se transforman rápidamente en cancerígenas, debido a la acción del gen v- src. El RSV contiene todos los genes necesarios para la replicación viral (gag, env y pol), por lo tanto, una célula transformada por un RSV produce virus RSV. En este sentido, el RSV difiere del resto de virus transductores que son defectivos para algunos de sus genes de replicación, por lo cual pueden infectar la célula, pero no logran descendientes. (Russell, 2003).
Los oncogenes tienen tres mecanismos de activación:
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Por amplificación a múltiples copias.Un ejemplo de este tipo se conoció en 1989, cuando se demostró
que algunos tumores de mama, que contienen copias múltiples de un oncogén conocido como HER2, pueden estar indicando una forma de desarrollo más rápida de la enfermedad, dado que las copias incrementan considerablemente el nivel de expresión de este gen, lo cual resulta muy útil en el momento del pronóstico al paciente. Otros oncogenes de este tipo son: MYC y NMYC. (Stevens y Reddy, 2013).
Por mutaciones puntuales.Las tres familias génicas RAS: HRAS, KRAS y NRAS, que intervienen en el
señalamiento mediante receptores acoplados a proteína G, se encuentran activadas en un gran número y variedad de tumores, incluyendo colon, pulmón mama y vejiga.
Por reordenamientos cromosómicos.Un ejemplo es el cromosoma Philadelphia, pequeño cromosoma
acrocéntrico que se observa en el 90% de los pacientes con leucemia mieloide crónica. Este es el resultado de la translocación 9/22 que genera un gen quimérico nuevo. El punto de rotura en el cromosoma 9 se encuentra dentro de un intrón del oncogén ABL; la translocación une la parte 3' del ABL con la 5' del BCR en el cromosoma 22, creando un gen nuevo con propiedades de transformación anormales. Este mecanismo rara vez se ve en carcinomas epiteliales, pero es frecuente en tumores hematológicos y sarcomas.
1.2.2. Genes supresores de tumores
Los genes supresores de tumores se caracterizan por ser opuestos a los oncogenes. Sus formas mutantes suelen ser las responsables de la formación de tumores, dado que su función es detectar el excesivo crecimiento celular y detenerlo. Puede afirmarse que para que un cáncer prolifere, debe tener un oncogén activo y un gen supresor de tumores inactivo. Por ser el más conocido y presentar múltiples mutaciones, un buen ejemplo de este tipo de genes es el Guardián del genoma, descubierto en 1979 por David Lane, llamado también, TP53, por codificar la proteína p53, de peso molecular de 53 Kilodaltons. El gen se sitúa en el brazo corto del cromosoma 17, entre las
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ar bandas p12 y p13. En un principio se creyó que TP53 era un oncogén, pero en 1992, Peter Hall, colaborador de Lane, se ofreció como sujeto experimental para demostrar que era supresor de tumores, irradiándose una zona del brazo durante dos semanas sucesivas. En este lapso, Lane tomó biopsias, habiendo comprobado la presencia aumentada de la proteína P53 en el tejido de su amigo, lo cual era evidencia clara de la respuesta del gen al daño ocasionado por la radiación. (Ridley, 2001).
El gen principal contiene 11 exones y mantiene la estabilidad e integridad genómica; suele estar mutado en más del 55% de las células de todos los tipos de cáncer humano, lo cual contribuye a la inestabilidad génica, a la acumulación de mutaciones y a la aceleración en el desarrollo del tumor. Se activa cuando la célula es agredida por agentes externos, cuando sufre daños en su ADN o cuando es sometida a estrés celular. Este hecho se hace evidente por el incremento en los niveles de la proteína P53, cuando, por ejemplo, por radiación, aparece un daño en los cromosomas, mientras que en condiciones normales dichos niveles permanecen bajos. Como consecuencia de la activación de TP53, entra en acción el grupo de genes mismatch repair, se para el ciclo celular, se repara el ADN o se da paso a la apoptosis.
Las personas heterocigotas portadoras del gen mutado tienen una probabilidad de un 95% de desarrollar cualquier tipo de cáncer; por ejemplo, en el caso del cáncer colorrectal, una mutación en el gen APC, supresor de tumores, puede llevar a otra mutación en el RAS, esta a una tercera en el gen supresor DDC, hasta llegar a una cuarta del alelo del TP53, que convierte el tumor en un carcinoma. Aunque la mayoría de las mutaciones de los genes supresores son recesivas, y la pérdida de función requiere la inactivación de ambas copias, p53 es la excepción. Mientras los genes RB y APC se inactivan por mutaciones sin sentido, que generan una proteína truncada o inestable, en p53 más del 70% de las mutaciones son las denominadas de reemplazamiento.
Como la proteína p53 silvestre tiene vida media corta, mientras las mutantes de tumores humanos presentan cambios conformacionales que incrementan su estabilidad y permiten su acumulación, anulando la expresión del alelo “silvestre” (perdida de heterocigosidad), la proteína mutante termina siendo la única que se expresa, lo cual permite su fácil detección mediante técnicas inmunohistoquímicas.
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Existen otros genes supresores de tumores, relacionados con el control de la apoptosis y la replicación celular, como los genes RAS, descubiertos a mediados de los ochenta por Henry Harris en Oxford, o los genes DCC, c-myc, RB, TGFßRII, BRCA1 y BRCA2, entre otros. Las personas con poliposis adenomatosa familiar (FAP) poseen mutaciones heredables en los genes APC.
1.2.3. Genes de reparación
En el momento de la replicación del ADN, después de la acción del ADN polimerasa, mientras persisten las señales que permiten distinguir la cadena neosintetizada del molde y gracias a ellas, se produce la reparación de los desapareamientos de las bases, mismatch repair.
En humanos, los genes más conocidos de este sistema son: hMSH1, hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hMLH2, hMTH, hPSM1, hPSM2. La función de estos genes es restablecer la correcta secuencia de los pares de bases de la cadena de ADN. Si la secuencia es incorrecta, se activan los mecanismos de corrección para devolver a las bases su secuencia original. Los genes del grupo MMR, especialmente los hMLH1 y hMSH2, son medicamente importantes, por presentar mutaciones en los pacientes con cáncer colorrectal hereditario no polipósico HNPCC. La función de la proteína codificada por el gen hMSH2 es reconocer los desapareamientos de la cadena neoformada y unirse de manera específica a los mismos, conjuntamente con otras proteínas asociadas, entre ellas una nucleasa que corta la cadena en el punto de la base incorrecta y la elimina, mientras un ADN polimerasa la reemplaza por la cadena correcta y una ligasa finaliza la unión de este acople. Si los MMR mutan, las proteínas expresadas carecen de su función correctora y, por ende, las cadenas de ADN no pueden ser reparadas en el caso de secuencias incorrectas. (Solari, 2004).
En la conferencia del National Cancer Institute, de 1997, a la inestabilidad genómica debida a las mutaciones de este grupo de genes se le dio el nombre de: Inestabilidad de los microsatélites (MSI). En este caso particular, los microsatélites son los pares de bases, que usualmente se modifican en las cadenas de ADN, como resultado de la inactividad de los mencionados genes.
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ar Los microsatélites son repeticiones de dinucleótidos que no codifican para ninguna información conocida, suelen ser muy polimórficos y se heredan como cualquier gen, por lo que deberían ser estrictamente idénticos. Esto no sucede en las células de los tumores del colon que presentan variaciones en la longitud de algunos microsatélites, fácilmente detectables por electroforesis en geles de agarosa.
Los errores de la polimerasa, en los pacientes que poseen mutaciones de genes del sistema MMR, especialmente los hMLH1 y hMSH2, se presentan principalmente en microsatélites, y consisten en un desplazamiento de la cadena molde, respecto de la cadena nueva, que, en consecuencia, adquiere o pierde algunos pares de bases.
Normalmente la proteína del hMSH2 reconoce las bases redundantes y se une a ellas corrigiendo el error. Por ejemplo, en un individuo heterocigoto para el gen hMSH2 bastará que por azar se altere el alelo silvestre, para que se desarrolle la inestabilidad en la célula tumoral, la cual provoca, especialmente en la mucosa del colon, la tendencia a la activación anormal de oncogenes y a la inactivación de genes supresores de tumores que favorecen el desarrollo de la enfermedad. El proceso se ve favorecido por el alto índice mitótico de las células de las glándulas de Lieberkühn del colon y por una alta producción normal de hMSH2. (Solari, 2004).
1.3. Cáncer con agregación familiar
Las mutaciones asociadas con el cáncer pueden originarse en cualquier tipo de célula somática, en cuyo caso son esporádicas, los síndromes son aislados y no se observa agregación familiar. Este este es el origen más frecuente de este tipo de mutaciones. En otros casos, menos frecuentes, las mutaciones aparecen en las células de la línea germinal; en consecuencia, es posible encontrarlas en los óvulos o en el esperma del portador y pueden transmitirse verticalmente, es decir, heredarse, y con ellas el riesgo asociado a la enfermedad, el cual se refleja en el genograma, en cuyo caso, algunos de los parientes del caso índice pueden resultar afectados del mismo, o de otros tipos de cáncer.
De todos modos, la enfermedad se asocia con cierto tipo de daños del material genético de las células, sean estas somáticas o germinales.
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En términos generales, lo más común es que exista una predisposición al cáncer cuando la persona es portadora de una mutación en un gen que controla de alguna manera, directa o indirecta, el ciclo celular, la reparación del ADN, la apoptosis, la supresión de tumores, etc. Si el fenotipo afectado por el gen mutado es de tipo recesivo, se necesita que aparezca en cualquier momento de la vida del individuo una mutación somática, adicional, en el gen homologo normal, para que empiece a desarrollarse la enfermedad. (Russell, 2003).
Tanto en los casos con agregación familiar como en los esporádicos, el cáncer suele aparecer después de una serie de mutaciones que le confieren riesgo a padecer la enfermedad. Esta mutación por sí sola no es suficiente para inducir un cáncer, pero, como ya se dijo, predispone a los individuos a la enfermedad, dado que tienen más probabilidades de sufrir una segunda mutación de tipo somático en el mismo locus. Por supuesto que esto también puede suceder en los casos esporádicos, pero dado que las dos mutaciones deben aparecer de novo, en el individuo, usualmente confluyen tarde en la vida del mismo y, al ser somáticas, no son heredables. (Jones-Steve, 2013).
El retinoblastoma es la malignidad intraocular más común en niños, y ayuda a aclarar la diferencia entre la génesis de los casos familiares y los esporádicos. Los datos sugieren que su incidencia es de 1 por cada 20.000 nacimientos y que un 90%, los casos de retinoblastoma son esporádicos, mientras el resto son familiares. Aparentemente, las características de transmisión corresponden al fenotipo controlado por un gen autosómico. (Solari, 2004).
El gen RB+ codifica para una proteína que normalmente funciona como supresora de la progresión del ciclo celular y es considerado como un clásico gen supresor de tumor. Los niños afectados presentan un reflejo blanco en el ojo, estrabismo y calcificaciones intratumorales. Los casos hereditarios por lo general son bilaterales, con focos múltiples y de aparición más temprana que los esporádicos, los cuales, a su vez, generan signos más tardíos y casi siempre son tumores únicos.
La explicación para estas diferencias fenotípicas es que los niños que heredan una copia del gen RB- mutado, tienen un riesgo mayor de
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ar desarrollar retinoblastoma, porque el número de neuronas retinianas es muy alto (más de cien millones), lo cual hace que durante el desarrollo de la retina exista una alta probabilidad de que el gen normal RB+ de alguna de estas células sufra una mutación RB-. En contraste, los niños que heredan dos copias funcionales del gen RB deben experimentar dos mutaciones en la misma célula de la retina para poder manifestar la enfermedad, lo cual implica una probabilidad dada por la tasa de mutación al cuadrado, que es realmente mucho más pequeña. Por esta razón, a pesar de que el fenotipo en cuestión, es expresado como una característica mendeliana, en términos moleculares es recesivo.
Recientes estudios, tanto en CCR como de glándula mamaria, han revelado que al igual que en el retinoblastoma, estos tipos de cáncer son predominantemente esporádicos, aunque existen casos claramente familiares. En el carcinoma de glándula mamaría los casos esporádicos son tardíos, mientras que los familiares suelen aparecer antes de los 40 años. En el 10% de los casos de carcinoma familiar de glándula mamaria se han encontrado mutaciones específicas de los genes BRCA1 y BRCA2. Estos dos genes codifican para proteínas relacionadas con la detección y reparación de daños del ADN. Las mutaciones en BRCA1, además, incrementan el riesgo a desarrollar cáncer de ovario. Al igual que en el retinoblastoma, tanto hombres como mujeres con mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, estén afectados o no, pueden pasar las mismas a sus descendientes, quienes, a su vez, verán aumentado su riesgo de desarrollar la enfermedad. (Jones-Steve, 2013).
La metilación del ADN es un factor epigenético de gran importancia como mecanismo de control de la expresión génica. El término epigenético, se refiere a los cambios que, aunque son heredables de célula madre a célula hija, no son causados por un cambio en la secuencia del ADN. Un ejemplo de estos cambios es el imprinting, en el cual la expresión de un gen varía, dependiendo de si es heredado por la vía paterna o por la materna, mientras los mecanismos genéticos explican caracteres hereditarios que resultan de cambios en la secuencia del ADN, los mecanismos epigenéticos describen caracteres hereditarios que no dependen de la secuencia del ADN. En las células de los vertebrados opera una variedad de mecanismos epigenéticos que perpetúan caracteres particulares de expresión génica en linajes de
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células somáticas; la metilación excesiva o deficiente de dinucleótidos CpG es un mecanismo epigenético, patógeno, frecuente en el cáncer. En los genes supresores de tumores, la metilación ocurre como una alternativa frecuente a la mutación de punto, en tanto que en otros, como RASSFIA del cromosoma 3 y HICI del 17, es el único mecanismo conocido para la pérdida de su función específica. (Strachan, 2004).
Hoy en día, se han logrado identificar cientos de genes mutados en diversos tipos de cáncer, como el de vejiga, mama, colon y pulmones. Por lo expuesto, todos los días se reconoce más la necesidad de impulsar y apoyar los estudios de genética molecular relacionados con el secuenciamiento, análisis de función y cartografía de los loci de los que se sospecha estén implicados con el incremento del riesgo de desarrollar diferentes tipos de cáncer, con el fin de direccionar este conocimiento hacia la prevención, tratamiento y/o curación de estos síndromes.
1.4. Generalidades del carcinoma colorrectal (CCR)
El CCR se origina en la cripta colónica, constituida por células madre localizadas en la base de la glándula, progenitoras de células que ascienden en la cripta y se diferencian a enterocitos, células caliciformes y células neuroendocrinas, entre otras (Gerbe, Legraverend, & Jay, 2012); numerosos autores han descrito los diferentes mecanismos de señalización y crecimiento involucrados en la cancerización de la cripta colónica. (Chang, Lin, Wu, Jeng, & Kuo, 2014; Hawthorn, Lan, & Mojica, 2014; Krausova & Korinek, 2014; Lamprecht & Fich, 2015; A. Patel, Tripathi, Gopalakrishnan, Williams, & Arasaradnam, 2015). Otros han señalado los implicados en la pérdida de la regulación de las células epiteliales con la consecuente transformación tumoral (Bell & Thompson, 2014; Zhu, Gao, Wu, & Qin, 2013). Adicionalmente, se ha investigado la alta tasa mitótica, ya que las células epiteliales de la cripta se reemplazan por completo en un lapso de dos a ocho días, la tasa de proliferación total por célula epitelial en el colon es de 1 billón a 3 billones por día (Raskov, Pommergaard, Burcharth, & Rosenberg, 2014) y la transformación de las células madres se realiza a una alta concentración de bacterias, presentes en la cripta, con un potencial
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ar rol tumorogénico de la microbiota. (Harmsen & de Goffau, 2016; Zeuner, Todaro, Stassi, & De María, 2014).
Las lesiones precursoras desde el punto de vista histológico se denominan focos de criptas aberrantes, y son el inicio de una proliferación glandular con diferentes alteraciones genéticas y epigenéticas (López-Ceron & Pellise, 2012; A. Patel et al., 2015), involucradas en la secuencia adenoma-carcinoma y en el desarrollo de cuatro tipos de adenomas: tubulares, tubulovellosos, vellosos y aserrados, con diferentes grados de displasia (Conteduca, Sansonno, Russi, & Dammacco, 2013), que crecen en tamaño y acumulan mutaciones hasta convertirse en CCR (Devita, 2011; Fearon, 2011; Greaves & Maley, 2012; Kumar, 2008; Lochhead et al., 2014; Schwitalla et al., 2013). Los adenomas son asintomáticos, generalmente se descubren buscando la etiología de anemias o sangrados digestivos bajos, mientras la mayoría de los carcinomas sólo presentan síntomas diferentes a los de los adenomas cuando están ya avanzados y se acompañan de sangrado profuso, obstrucción intestinal y dolor o cambios en los hábitos intestinales. El CCR del lado derecho presenta diferencias clínicas, patológicas y pronósticas, comparado con el del colon izquierdo y el del recto. (Hansen & Jess, 2012; G. H. Lee et al., 2015; van der Sijp et al., 2016). Aproximadamente el 50% de todos los carcinomas ocurren en el rectosigmoide. La apariencia macroscópica puede ser polipoide, ulcerada e infiltrante; histológicamente son adeno-carcinomas moderados o mal diferenciados, con secreción variable de mucina, que generalmente sufren una reacción linfocítica y desmoplásica. Los tumores con superficie papilar o vellosa pueden tener origen en un adenoma de este tipo. (Fleming, Ravula, Tatishchev, & Wang, 2012; S. E. Mills, 2009; Rosai, 2011).
La estadificación de los carcinomas colorrectales ha sido definida por el porcentaje de formación glandular: G1: tumores bien diferenciados >95%; G2: tumores moderadamente diferenciados 50% al 95%; G3: tumores pobremente diferenciados 5% al 50%; G4: tumores indiferenciados <5%. Dado que esta forma de gradación genera poca reproducibilidad interobservador, se ha postulado una nueva forma de clasificación, basada en el número de nidos pobremente diferenciados, observados en objetivos 20X, en un campo extendido (Ueno et al., 2012); esta clasificación probablemente se correlacione mejor con el pronóstico del paciente.
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Se ha informado que hasta un 5% de los casos de CCR pueden tener una predisposición hereditaria atribuida a genes conocidos. (Abuli et al., 2014). Según el autor, este porcentaje podría alcanzar hasta un 35% por genes aún no reportados de bajo impacto en el fenotipo.
En CCR se reportan varios síndromes de origen germinal, entre los que se cuentan: el de Lynch o Carcinoma Colorrectal no Polipósico con agregación familiar -HNPCC-; el de Poliposis Adenomatosa Múltiple Familiar -FAP- y los de Poliposis Hamartomatosa, Hiperplásica y Juvenil (Kumar, 2008; Rosai, 2011), los cuales serán descritos en detalle en los capítulos siguientes.
1.5. Epidemiología del cáncer gastrointestinal
Según la Agencia Internacional del Cáncer (IARC), en su publicación electrónica GLOBOCAN 2018, los tipos de cáncer gastrointestinal se cuentan entre las primeras 10 causas de morbimortalidad en el mundo.
El cáncer colorrectal es el tercero en incidencia en los hombres (1.026.000 casos, el 10,9% del total), y el segundo en mujeres (823.303 casos/año, el 9,5% del total) (WHO, 2018). A nivel mundial, casi el 60% de los casos ocurren en países desarrollados. (Binefa, Rodrígez-Moranta, Teule, & Medina-Hayas, 2014). Las mencionadas tasas de incidencia varían hasta en 10 veces en ambos sexos en todo el mundo, las más altas se estiman en Australia/Nueva Zelanda y Europa occidental; las más bajas, en África (excepto Sudáfrica) y Asia Sur-Central; y las intermedias, en América Latina (Bray et al., 2015). En el mundo, las tasas de incidencia son sustancialmente más altas en hombres que en mujeres.
En cuanto a la mortalidad causada por esta enfermedad, alrededor de 694.000 decesos/año (8,5% de todas las muertes por cáncer) la catalogan como la cuarta causa de mortalidad por cáncer, con más muertes en las regiones menos desarrolladas del mundo (52%), lo que refleja una menor tasa de supervivencia en estas regiones. (Rabeneck, Horton, Zauber, & Earle, 2015; WHO, 2012).
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ar En Colombia, según la información del Instituto Nacional de Cancerología (INC), en 2015, el cáncer gastrointestinal también se encuentra entre las primeras 10 causas de incidencia y mortalidad. En ambos sexos, el cáncer de estómago ocupa el cuarto puesto; colon, recto y ano el quinto puesto en morbimortalidad.
1.6. Herencia y riesgo del carcinoma colorrectal (CCR)
Como ya se mencionó, para el CCR se estima que un 30 - 35% de los casos podría explicarse por la base genética germinal, la cual se refleja en los genogramas de los casos índice, algunos de cuyos parientes presentan síndromes de cáncer (Abuli et al., 2014; Berg et al., 2010). Los dos tercios restantes, podrían explicarse por factores ambientales, mutaciones esporádicas o la interacción entre ambos. (Cherry, 2011; Zoratto et al., 2014). En promedio, los casos de CCR se diagnostican entre los 65 y los 70 años y suelen estar asociados a desordenes genéticos, ocasionados por mutaciones, ya sean de origen esporádico o germinal. Usualmente, los casos índice (con agregación familiar), asociados a genes con mutaciones de alto riesgo, se registran en personas jóvenes, menores de 50 años que representan un 5% del total de los casos, a edades entre los 35 y los 40 años.
Si se tienen en cuenta el modo de herencia y la interacción de los genes con el medio ambiente, se pueden considerar los siguientes escenarios para el CCR:
CCR con agregación familiar de origen germinal: Es la forma menos común de CCR. Agrupa aproximadamente un 5%
de todos los casos y está asociada a mutaciones en genes de impacto fenotípico alto o intermedio y se caracteriza por una herencia mendeliana simple. (Fearon, 2011). Los síndromes de CCR más conocidos, asociados a mutaciones hereditarias de genes de alto impacto en el fenotipo son: la Poliposis Adenomatosa Familiar (FAP <1%), la Poliposis asociada a MUTYH (MAP, <1%), el Cáncer Colorrectal no Polipósico con agregación familiar (Steinke et al., 2014) y el Síndrome de Lynch (3-5%). (Kastrinos & Syngal, 2011). Cabe anotar que un porcentaje cercano al 20% de pacientes con
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historia familiar de CCR y/o diagnóstico del mismo antes de los 50 años no tienen evidencia de mutaciones en línea germinal de los genes de alto impacto antes mencionados (Campos, 2017). Para estos casos, se han acuñado los términos CCR familiar (sin otra especificación), o CCR no sindrómico. (Armelao & de Pretis, 2014; E. M. Stoffel & Kastrinos, 2014). Diferentes estudios muestran la utilidad de la secuenciación del exoma o genoma completo, para el diagnóstico de CCR con agregación familiar, dado que los paneles multigenes, permiten hacer un tamizaje paralelo en diferentes vías moleculares, a costos que cada vez son más cómodos. (Basso, Bianchi, Malesci, & Laghi, 2017; Rohlin et al., 2017).
Es importante anotar que entre los alelos de riesgo mutados, que generan una predisposición de origen germinal, algunos son supresores de tumores. Entre ellos se incluyen genes que normalmente cumplen un rol esencial, previniendo que las células se conviertan en cancerígenas, contribuyendo a la regulación del ciclo celular y a la reparación del ADN. Algunas mutaciones germinales de estos genes se han asociado a casos con historia familiar. En estos casos, a menudo se asume un patrón de herencia autosómica dominante y alta penetrancia. No obstante, es importante aclarar que los casos índice suelen ser cuando nacen heterocigotos, es decir, portadores de un alelo silvestre funcional y de otro que produce una proteína truncada: el mutado. La proteína funcional suele ser suficiente mientras se mantiene la hererocigosis, por lo tanto, los portadores no desarrollan el cáncer, aunque posean un riesgo más alto de presentarlo a lo largo de su vida, ya que con la mutación heredan la predisposición. La razón es que al nacer con uno de los alelos ya mutado en todos sus millones de células, la probabilidad de que el segundo alelo mute (pérdida de heterocigosidad) en alguna de ellas, es mucho más alta que cuando los dos alelos son silvestres. La consecuente acumulación del daño en los dos genes hace que en la célula en cuestión toda la proteína sea truncada, lo cual puede conducir al desarrollo de una célula cancerígena que origine el tumor. Ya que dicha proteína es supresora de tumores, regula el ciclo celular, evita la alteración de la proliferación, participa en la reparación de los daños del ADN e interacciona con p53 en la vía de la apoptosis. (Strachan, 2004; J. D. B. Watson, A., 2004). En conclusión, la enfermedad empieza a desarrollarse cuando el individuo portador pierde la heterocigosis y se vuelve homocigoto, lo cual quiere decir que en este punto el patrón de herencia no es dominante, como suele afirmarse, sino, por el contrario, recesivo.
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ar En el punto relacionado estrictamente con la dominancia, los autores consideramos importante, aclarar que la dominancia no es una característica del gen sino del fenotipo que este controla.
CCR esporádico: Agrupa un 75-80% de los casos (Moran et al., 2010). Se caracteriza por
no presentar ningún tipo de agregación familiar. Suele relacionarse con la exposición a factores ambientales que, asociados a la variación geográfica y cultural, incrementan el riesgo a desarrollar la enfermedad. Dichos factores estarían interactuando con mutaciones de tipo somático, que conllevan a una predisposición genética, propia de cada individuo. (Siddiqui, 2011; A. J. Watson & Collins, 2011).
De acuerdo con lo anterior, puede decirse que el CCR tiene una etiología multifactorial, con factores de riesgo muy variados, que incluyen los hereditarios, moleculares, inflamatorios, medioambientales, edad y sobrepeso (Trabulo et al., 2015), además de factores dietéticos, como el alcohol, tabaco, grasas, carne, una baja ingesta de vegetales y fibra (Cappellani et al., 2013; A. J. Watson & Collins, 2011), y del microambiente de la mucosa intestinal -microbiota e interacción proteica-. (Chang et al., 2014; Cho, Carter, Harari, & Pei, 2014; Sinha et al., 2016).
Dada la complejidad de la enfermedad, la identificación del escenario de riesgo puede mejorar sustancialmente las estrategias de prevención, diagnóstico y tratamiento de la misma. (Win, Macinnis, Hopper, & Jenkins, 2012). Recientemente, se han logrado definir diferentes variables, tanto ambientales como genéticas (antecedentes familiares y personales, para diferentes tipos de cáncer, incluido el CCR), que permiten establecer este riesgo mediante programas disponibles para la comunidad http://rcalc.ccf.org (Shin et al., 2014; B. J. Wells, Kattan, Cooper, Jackson, & Koroukian, 2014). Cuando en los pacientes se tienen en cuenta lesiones premalignas, como pólipos o enfermedades inflamatorias intestinales autoinmunes, como la colitis ulcerativa (CU), puede decirse que una de cada seis muertes de pacientes con CU se debe a CCR; en cuanto a los pacientes con la enfermedad de Crohn (CD), una de cada 12 muertes de casos de CD es por CCR. (Andersen & Jess, 2013). En los casos con agregación familiar, es importante tener en cuenta la historia de los familiares, sobre todo los cercanos (padres, hermanos, hijos), ya que la asociación con el
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riesgo aumenta entre tres y seis veces con un pariente en primer grado afectado por CCR; esta asociación es mayor aún si hay más de un pariente de primer grado afectado por CCR. (Migliore, Migheli, Spisni, & Coppede, 2011; Rasool, Kadla, Rasool, & Ganai, 2013).
Para determinar el riesgo genético de los síndromes familiares de CCR asociados a genes de herencia mendeliana simple se deben tener en cuenta los loci que presentan las mutaciones de alto impacto en el fenotipo asociado. Existen tres síndromes de CCR familiar bien definidos: el síndrome de Lynch, la Poliposis Adenomatosa Familiar y la Poliposis Asociada a MUTYH. Además de estos tres, existen otros síndromes polipósicos poco frecuentes, como el de Peutz-Jeghers (LKB1) o poliposis hamartomatosa y el de Cowden (SMAD4 y BMPR1A) o poliposis juvenil (Omundsen & Lam, 2012), los cuales también están asociados a loci de alto impacto en el fenotipo.
No todos los factores de riesgo genético son atribuibles a mutaciones de alto impacto en el fenotipo patológico; existen también aquellos cuyo aporte individual al fenotipo es tan pequeño, que resulta muy difícil demostrar la asociación de la mutación con el incremento del riesgo de desarrollar la enfermedad. Dichos factores, cuando confluyen en un mismo individuo con otros también de bajo impacto y de efecto poligénico hacen que el riesgo se incremente ostensiblemente en función del número de loci implicados. Esta interacción, multifactorial, común en enfermedades complejas como el cáncer, incrementa el riesgo heredable de desarrollarlas, especialmente en los casos en los que dichos loci están en desequilibrio de ligamiento, motivo por el cual la segregación depende de la distancia entre ellos.
Para mayor claridad a este respecto, los autores recomiendan al lector no tomar como sinónimos los términos impacto y penetrancia. El impacto se refiere, en este contexto, al aporte de los alelos del genotipo en el fenotipo poligénico asociado; dicho impacto puede ser tan bajo para un locus en particular, que se haga muy difícil distinguirlo claramente, especialmente en muestras pequeñas. De otra parte, la penetrancia se define como la proporción de individuos que desarrollan un fenotipo asociado a los alelos correspondientes a un genotipo dado. De acuerdo con lo anterior, es claro que una mutación de bajo impacto, puede ser
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ar totalmente penetrante, aunque su aporte al fenotipo sea mínimo y logre pasar desapercibido, mientras otra considerada de alto impacto, por ser claramente identificable en el fenotipo asociado, puede tener penetrancia incompleta, es decir, no manifestarse en algunos individuos que portan el genotipo.
El riesgo se hace más complejo y difícil de calcular en las familias, aunque se pueda establecer claramente su origen germinal en los genogramas. Esta es una de las razones por las que los autores de este libro prefieren no hablar de penetrancia en este tipo de síndromes cuantitativos, ya que el cálculo de la misma depende del conocimiento exacto del genotipo, siendo este más difícil de obtener cuanto más complejo es el mismo, máxime cuando no se conoce el impacto de cada loci en particular sobre el fenotipo.
Al respecto cabe decir que se han descrito alrededor de 90 polimorfismos de base única (SNPs), gracias a los cuales se ha desarrollado una estrategia de búsqueda de las variantes comunes de bajo impacto, a través de “estudios de asociación” en los que se comparan las frecuencias de los alelos candidatos, entre grupos de casos y controles. (Fernández-Rozadilla et al., 2013; Hindorff, Gillanders, & Manolio, 2011; Houlston, 2012; Peters et al., 2013; Picelli et al., 2013; I. P. Tomlinson et al., 2010b). Sin embargo, para determinar el impacto de estas variantes génicas es muy importante contar con una muestra cuyo poder estadístico y sensibilidad sean altos, lo cual requiere de un gran número de casos, de los que puedan emerger claras las asociaciones con el riesgo de desarrollar la enfermedad. (Shirts, Jacobson, Jarvik, & Browning, 2014).
1.7. Perfil molecular del carcinoma colorrectal
El término biomarcador molecular ha sido usado desde 1989 como “Medical Subject Heading” (MeSH), para definir un parámetro biológico medible y cuantificable que sirva como índice para evaluar riesgo de enfermedad, de tal forma que coadyuve al diagnóstico temprano, la prevención y la respuesta a los medicamentos, entre otros aspectos.
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Estos marcadores generalmente se encuentran en sangre, fluidos o tejido corporal. (Muc-Wierzgon et al., 2014).
Con el mejoramiento continuo en las técnicas de identificación de marcadores genéticos, análisis de ligamiento, estudios de asociación y secuenciación de alto rendimiento, entre otros, se han identificado genes con polimorfismos de alto y bajo impacto, que permiten explicar en cierta medida el perfil molecular del CCR. Hoy en día, los cambios en la secuencia génica y en los niveles de expresión proteica, son usados frecuentemente, para el seguimiento y la progresión de la enfermedad, y para la respuesta terapéutica.
En oncología clínica se viene trabajando desde hace más de una década en la identificación de las mutaciones de los genes mencionados, con el fin de escoger aquellos que permiten identificar los mejores blancos terapéuticos que ayuden a establecer tanto el diagnóstico como el pronóstico; entre los biomarcadores clásicos se encuentran los genes: KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, PTEN, TP53, APC, SMAD4, considerados los genes blanco para escoger opciones terapéuticas, no solamente para CCR, sino para otras malignidades. (M. B. Chen et al., 2012; Coppede, Lopomo, Spisni, & Migliore, 2014; Jiang et al., 2012; Meguerditchian & Bullard Dunn, 2013). Para enfermedad metastásica se han recomendado estudios de metilación del ADN, ARN mensajero y micro ARN, entre otros. (Kamiyama, Noda, Konishi, & Rikiyama, 2014). Recientemente, los proyectos de investigación proponen nuevos marcadores como los heterodímeros de HER-3, IGF-1 e IGF-1R (insulin-like growth factor), micro-ARNs, c-Met, HGF, p14, p16, CDH1 (Coppede et al., 2014; Giampieri et al., 2013), SFRP2*, RARRES3+, CFTR+, FLNA+, MUC2+, TFF3+ (Sadanandam et al., 2013). También marcadores de células madre intestinales como LGR5, MSI1, SOX9 y BMI1 (Espersen, Olsen, Linnemann, Hogdall, & Troelsen, 2015), entre otros, todos ellos encaminados a determinar si se presentará resistencia al uso de diferentes medicamentos antitumorales, y determinar el pronóstico.
Además de los biomarcadores génicos, se han postulado metabólicos como la adiponectina, la leptina, concentraciones elevadas de lipoproteínas de alta densidad, hiperinsulinemia e hiperglicemia, que están siendo validados como factores predictivos y pronósticos. (Muc-Wierzgon et al., 2014).
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ar El biomarcador ideal es aquel que fácilmente se encuentre en una muestra biológica, que puede ser detectado por métodos no invasivos, que resulte económico y sea accesible para toda la población, sobre todo en países en vías de desarrollo como el nuestro, en los que se está en mora de su implementación y de tenerlo disponible como prueba de rutina para los pacientes y para el médico tratante.
El CCR es un proceso biológico complejo que puede involucrar muchos genes; en las últimas décadas se han identificado al menos dos mecanismos moleculares diferentes implicados en esta carcinogénesis: la inestabilidad cromosómica (CIN) y la inestabilidad microsatelital (MSI), por las cuales la mucosa colónica se transforma en carcinoma, proceso que se centra en los genes supresores de tumores (APC, DCC, SMAD2, TP53, SMAD4 y p16INK4a), oncogenes (RET), protooncogenes (KRAS) y genes reparadores del ADN (MMR o MUTYH). (Cancer Genome Atlas, 2012; Centelles, 2012; D. Chen et al., 2014; Deschoolmeester, Baay, Specenier, Lardon, & Vermorken, 2010; Grady & Carethers, 2008; Manne, Shanmugam, Katkoori, Bumpers, & Grizzle, 2010; Markowitz & Bertagnolli, 2009; Massimo Pancione, 2014; Moran et al., 2010; Pineda, González, Lázaro, Blanco, & Capella, 2010; Remo, Pancione, Zanella, & Vendraminelli, 2012; Worthley, Whitehall, Spring, & Leggett, 2007). El avance en las técnicas moleculares evidencia que estas vías pueden traslaparse o cruzarse. (JE, Medema, & Dekker, 2015). Dentro de las Rutas Carcinogénicas implicadas en el desarrollo del CCR se encuentran:
1.7.1. Vía supresora
La mayoría de los tumores esporádicos (65 - 80%) y algunos síndromes hereditarios, como la Poliposis Adenomatosa Familiar (Shi & Washington, 2012), se desarrollan por el mecanismo conocido como vía de inestabilidad cromosómica (CIN) o supresora convencional. (Aissi et al., 2013; Pino & Chung, 2010).
En esta vía se evidencia una secuencia histológica denominada secuencia “adenoma-carcinoma.” (Kahng, 2010). La primera alteración molecular es la pérdida del gen APC (5q21-q22), seguida, en su orden, de mutaciones en KRAS (12p12,1), TP53 (17p13,1) y DCC (18q21,3). La primera evidencia
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histológica está relacionada con los focos de criptas aberrantes, seguidos por la proliferación tubular o vellosa del epitelio glandular con displasia de bajo y alto grado, como lo ilustran Moran et al, en la secuencia adenoma-carcinoma. (Moran et al., 2010).
Recientemente, algunos autores han sostenido que en esta secuencia adenoma-carcinoma es evidente la disrupción epitelial con trastornos en la regulación de diferentes proteínas, importantes para entender la invasión del carcinoma, presentándose una pérdida de la regulación de la polaridad basal-apical, que originaría pequeños quistes que favorecen la migración de las células clónales. (Bell & Thompson, 2014).
A continuación, se describen algunos de los genes involucrados en esta secuencia adenoma-carcinoma:
APC (MIM#611731): Es un gen de 15 exones, que codifica una proteína de 300-kDa, que regula
la segregación cromosómica, y la adhesión, migración y apoptosis celular en las criptas colónicas. La mayoría de los carcinomas colorrectales (hasta en un 85%) presentan mutaciones del APC, las cuales son encontradas muy temprano en la formación de los adenomas. (Fearon, 2011; Kudryavtseva et al., 2016; Schneikert et al., 2013). El APC, actúa en el proceso carcinogénico como un regulador de la B-catenina, por lo que es también llamado de vía canónica o de señalización dependiente de B-catenina; cuando ambos alelos del APC están mutados y, por tanto, inactivados, la B-catenina se acumula en el citoplasma y se activan factores de transcripción. Un 50% de ellos muestran mutaciones independientes de la B-catenina, así se destaca el papel de la wnt (Saito-Diaz et al., 2013), por su implicación en la regulación de las señales apoptóticas, concediéndole una ventaja selectiva a la célula epitelial que se multiplica y forma el microadenoma. (Krausova & Korinek, 2014).
KRAS (MIM#190070):Es un gen con cuatro exones que codifica para una pequeña proteína
GTPasa, que hace parte de una superfamilia de GTPasas de más de 154 miembros, divididos en cinco subfamilias: Ras, Rho, Rab, Arf y Ran. KRAS es de la subfamilia Ras que tiene cuatro proteínas que difieren en la secuencia amino terminal, y son: HRAS, NRAS, KRAS4A y KRAS4B; las últimas dos
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ar varían por splicing (empalme) alternativo; KRAS4B es la más frecuente. Todas las proteínas Ras son activadas cuando se unen al guanosin-trifosfato (GTP). Al activarse, aumentan su afinidad por las moléculas efectoras de rutas metabólicas en cascada; aguas abajo, muchas de ellas son kinasas que inician cascadas de señalización, en este caso específico activando la cascada oncogénética, a través de la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico. (EGFR) (Brand & Wheeler, 2012; Domagala et al., 2012; Oden-Gangloff et al., 2009). Las mutaciones en KRAS se presentan hasta en el 50% de los casos de CCR (Angulo, López-Ríos, & González, 2014; Fearon, 2011; Newton, Newman, & Hill, 2012; Yin, Liang, Yan, Liu, & Su, 2013). La mayoría de las mutaciones afecta al codón 12 (80 - 90%) (Deschoolmeester, Boeckx, et al., 2010; Parsons & Myers, 2013; C. Tan & Du, 2012). Algunas, el codón 13 o el 61, y corresponden a mutaciones missense, que producen sustituciones de aminoácidos; de estas, la más común es la sustitución de la glicina por el aspartato. (Zinsky, Bolukbas, Bartsch, Schirren, & Fisseler-Eckhoff, 2010). Se han reportado otras mutaciones en los codones 16, 146 y 154, relacionadas con diferentes tipos de cáncer (Brand & Wheeler, 2012; Domagala et al., 2012), y aunque las mutaciones en KRAS constituyen un paso para el desarrollo del adenoma, no se consideran como responsables de su inicio. Recientemente se han reportado subpoblaciones de mutaciones en KRAS, que pueden tener un impacto clínico en las respuestas a las terapias que tienen como blanco el receptor del factor de crecimiento epidermal -EGFR-. (Parsons & Myers, 2013). Las mutaciones en el gen KRAS son prácticamente excluyentes de las mutaciones en el gen BRAF. (Sridharan, Hubbard, & Grothey, 2014).
TP53 (Rossi et al., 2017):El gen supresor tumoral TP53, de 11 exones y su proteína, juega un rol
importante en la defensa contra el desarrollo y la progresión del cáncer, en respuesta a injurias celulares, como el daño en el ADN y la activación de oncogenes. TP53 regula la transcripción, deteniendo el ciclo celular y, en caso necesario, produciendo apoptosis, inhibición de la angiogénesis y senescencia celular. (Alan Stevens, 2009; Naccarati et al., 2012). En cerca del 40-50% de los casos con CCR se han reportado mutaciones en el gen TP53, la mayoría en los exones 5 a 8, que codifican para los residuos del segmento 130-286, una región muy importante para la estabilización de la estructura terciaria de la proteína. Estas mutaciones tienen como consecuencia la pérdida de la habilidad de la proteína para unirse al ADN y, por lo tanto,
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la pérdida de función. (Al-Kuraya, 2009). Se han descrito diferentes polimorfismos del gen que tienen una relación con la susceptibilidad al cáncer y el pronóstico de este; algunos con función biológica identificable, como la variante Arg72Pro y el SNP309G. (Gemignani et al., 2004; Joshi et al., 2011). El gen TP53 ha demostrado jugar un importante papel en la respuesta a la radioterapia en pacientes con CCR de localización rectal. (M. B. Chen et al., 2012).
Se cree que el mecanismo para inactivar la función de los genes supresores tumorales en un individuo es la pérdida de heterocigosidad (LOH). Aproximadamente el 70% de los casos de CCR muestran LOH en 17p, y este cambio afecta la función del gen TP53. En el gen TP53, aproximadamente el 85% de las mutaciones por sustituciones con cambio de sentido (missense) ocurren en los codones 175, 245, 248, 273 y 282; las mutaciones sin sentido (nonsense) y las que producen corrimiento de los marcos de lectura (frameshit) son escasas. (Fearon, 2011).
1.7.2. Vía mutadora
Recibe también el nombre de “vía de inestabilidad microsatelital” (MSI), por su nombre en inglés, “microsatellite inestability”. Esta vía se caracteriza por el aumento o disminución de secuencias repetidas de nucleótidos, lo cual es una consecuencia de la disfunción de los genes del sistema de reparación de apareamientos erróneos (“mismatch repair” - MMR). Por esta vía se explica la aparición del síndrome de Lynch y hasta un 15% de los casos de CCR esporádicos. (Boland et al., 1998). En la década del 90 se estableció un panel de microsatélites, con el fin de realizar un tamizaje que permitiera identificar a los posibles portadores de mutaciones en MMR. (Bedeir & Krasinskas, 2011). Esta condición también se conoce como fenotipo hipermutador (Boland & Goel, 2010), que produce la inactivación de diferentes tipos de genes, como por ejemplo, los que regulan la apoptosis (genes BAX o Caspasa-5), y otros implicados en el control y regulación del crecimiento celular (TGFβR2, WISP-3 o IGFIIR) (Laurent-Puig, Agostini, & Maley, 2010; Yashiro, Hirakawa, & Boland, 2010). Se ha intentado asociar los tumores con alta inestabilidad microsatelital a una mayor sobrevida, independientemente del estatus de BAX o TGFβR2, a través de diferentes estudios. (Bolocan, Ion, Ciocan, & Paduraru, 2012; Shima et al., 2011).
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ar Los casos de CCR que presentan una alta inestabilidad microsatelital (MSI-H) tienen deficiencia del sistema MMR y, por lo tanto, errores de replicación dependientes de la polimerasa, que se pueden presentar aproximadamente en un 12% de los tumores esporádicos y asociados con el síndrome de Lynch; generalmente se localizan en el colon derecho, presentan infiltración por células inflamatorias tipo linfocitos, patrón de crecimiento expansivo, una diferenciación celular mucinosa, medular o en anillo de sello y un mejor pronóstico, en comparación con los tumores estables para microsatélites -MSS- (Kloor, Staffa, Ahadova, & von Knebel Doeberitz, 2014).
1.7.3. Vía epigenética
Esta vía, también llamada de fenotipo metilado o aserrada, genera inestabilidad genómica. Las modificaciones epigenéticas se presentan por hipermetilación mediada por la acción de las enzimas ADN-metiltransferasas (DNMTs), hipometilación y modificaciones covalentes postrasduccionales en las histonas, entre otros mecanismos. (Bardhan & Liu, 2013; Coppede, 2014; Vaiopoulos, Athanasoula, & Papavassiliou, 2014). Los tumores se caracterizan por presentar metilación en las islas CpG, por lo cual se denominan tumores CIMP (CpG Island Methylator Phenotype Tumors, por su sigla en inglés), lo cual causa el silenciamiento de genes supresores de tumor (Clarke & Kopetz, 2015) o por la inactivación de genes reparadores del ADN, especialmente en el gen MLH1 del grupo MMR o el APC. Por este mecanismo estos genes de alto impacto fenotípico son inactivados por vía del promotor. (Matsubara, 2012). Existe una correlación directa entre la hipermetilación del promotor del MLH1 y las mutaciones en el gen BRAF; dicha asociación se presenta casi siempre en casos esporádicos de la enfermedad. También se han descrito en el espectro del fenotipo metilado. (Arends, 2013; Menéndez, Villarejo, Padilla, Menéndez, & Rodríguez Montes, 2012).
BRAF (MIM#164757):El proto-oncogén tipo B de raf (BRAF) está localizado en 7p34 y codifica
una de las tres kinasas de raf, la kinasa serina/treonina, que juega un rol en la señalización intracelular y en el crecimiento celular; es un efector aguas abajo de KRAS, en la vía de señalización protein kinasa (MAPK), mitógeno
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activada, pertenece a la familia de las serin-treonin-quinasas-RAF (Levidou et al., 2012), que incluye además los genes ARAF y CRAF. (Qin et al., 2012). La mutación BRAF-V600E frecuentemente está asociada con MSI, y consiste en la transversión de una timina por una adenina, en el nucleótido 1799 de la secuencia de BRAF; las alteraciones moleculares ocasionadas por esta mutación se localizan en el dominio quinasa de la proteína y conducen a la sustitución de un residuo de valina por uno de glutamato (p.Val600Glu), cuya carga negativa mimetiza la fosforilación de los residuos treonina 599 y serina 602, necesarios para la activación de BRAF. Se presenta en pacientes con CCR aserrado en un amplio rango que oscila entre un 5 y un 22% y, aproximadamente, en un 15% de casos de CCR esporádico. Las mutaciones en BRAF se asocian con una resistencia clínica al tratamiento con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y en el caso específico de la mutación BRAF V600E se relaciona con características clínico patológicas de alto riesgo que le confieren un curso clínico agresivo, por lo tanto, es considerada como un biomarcador de mal pronóstico. (D. Chen et al., 2014; Kalady et al., 2012; Murcia et al., 2016; Pritchard & Grady, 2011; Ritterhouse & Barletta, 2015).
1.8. Síndromes familiares de CCR, asociados a genes de herencia mendeliana simple y/o compleja
Aunque el riesgo hereditario a desarrollar el cáncer se conocía desde antes de 1900, solo se redescubrió con los trabajos de Gregor Mendel, en los albores del siglo XX. (Ellis, Hofer, Timmerman-Vaughan, Coyne, & Hellens, 2011; Reid & Ross, 2011); Posteriormente se propuso que algunos genes podían estimular la división celular mientras otros podían inhibirla; ahora se sabe que son genes de dos tipos. (Berger, Knudson, & Pandolfi, 2011; Reid & Ross, 2011). La investigación en cáncer con agregación familiar empezó en la década de los 80 con el estudio de gemelos; estos estudios han determinado que la susceptibilidad genética puede explicar hasta un 35% de los casos de CCR. (Zambirinis, Theodoropoulos, & Gazouli, 2009). Diferentes estudios han mostrado que una de cada cinco o seis personas con CCR (16%-20%), tiene un pariente de primer grado diagnosticado con la misma enfermedad; en este sentido, algunos estudios epidemiológicos
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ar desarrollados en poblaciones de alto riesgo (China e Irán) muestran que cerca del 10%-15% de los pacientes con cáncer gástrico presenta una historia familiar positiva para la enfermedad. (Fatemi et al., 2010). Los pacientes con historia familiar de CCR tienen un riesgo relativo estimado, que suele ser entre dos y seis veces más alto que el de los pacientes sin historia familiar. (Fatemi et al., 2010). Específicamente, con un pariente afectado en primer grado de consanguinidad el riesgo calculado es de 2,25, frente al de los pacientes sin historia familiar. Si se tiene más de un pariente en primer grado, el riesgo puede ascender a 4,25; y con un pariente en primer grado, diagnosticado antes de los 45 años el riesgo relativo se calcula en 3,87. (Armelao & de Pretis, 2014).
Se conocen al menos 13 genes de alto impacto fenotípico asociados con la predisposición genética a desarrollar CCR, cuando están mutados en línea germinal. (I. Tomlinson, 2015). Como ya se ha dicho, los síndromes considerados familiares, asociados a estos genes de herencia mendeliana simple, autosómica en su mayor parte, solo explican el 5% de los casos con agregación familiar, pero se estima que en total este porcentaje puede llegar a un 25% (K. W. Jasperson, Tuohy, Neklason, & Burt, 2010); esto significa que el 20% restante debe corresponder a los casos con un componente familiar claro, atribuibles a mutaciones en genes de alto impacto fenotípico aún no reportados, o al efecto multifactorial de los genes de bajo impacto, que en conjunto tienen un claro efecto sobre el riesgo de desarrollar la enfermedad. (De la Chapelle, 2004).
Adicionalmente, cuando se analiza un paciente sin antecedentes familiares, catalogado como un caso esporádico, es necesario tener en cuenta que existe un margen de error en la clasificación, dado que podría tener genes de bajo impacto fenotípico, que le confieran una susceptibilidad genética subyacente, que podría estar pasando desapercibida en las pruebas moleculares comunes.
De acuerdo con lo anterior, se ha planteado un modelo de herencia poligénica como hipótesis para explicar la predisposición a enfermedades complejas, como el cáncer y algunas otras de carácter crónico, como la diabetes mellitus. La hipótesis se denomina “enfermedad común-variante común”. (Bodmer, 2006). Esta hipótesis postula que las variantes de bajo impacto que predisponen al desarrollo del CCR son relativamente
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frecuentes en la población, y la presencia de un número más o menos elevado de ellas en el individuo incrementa el riesgo de padecer la enfermedad; la interacción de estos factores genéticos con el ambiente modularía el riesgo total de la enfermedad. Estos alelos de bajo impacto en el fenotipo podrían explicar el factor genético subyacente de los casos de CCR con agregación familiar y probablemente el de los esporádicos, por ende, la alta incidencia poblacional del cáncer.
La identificación de este tipo de alelos se realiza mediante estudios de asociación caso-control, también denominados estudios de asociación del genoma completo o GWAS, por sus siglas en inglés (genome-wide association studies). Estos estudios involucran generalmente grandes series de casos y controles, generalmente provenientes de poblaciones de diferentes sitios del mundo. De este modo se han logrado identificar múltiples polimorfismos de nucleótido único (SNP) asociados con el riesgo a desarrollar CCR, que de manera individual y separada no aportan mucho al riesgo, pero que juntos podrían tener una contribución significativa a la carga de la enfermedad. En este contexto, una pequeña proporción de la población podría ser portadora de un número de mutaciones tal, que podría aumentar el riesgo incluso hasta tres o más veces, en comparación con los que tienen un número medio de alelos de riesgo; los datos están disponibles en: http://www.genome.gov/gwastudies (Alonso-Espinaco et al., 2011; Dunlop et al., 2013; Houlston, 2012; I. P. Tomlinson et al., 2010a; Valle, 2014).
Se ha planteado que prácticamente el 100% de los pacientes de poliposis adenomatosa familiar, que representan el 1% de todos los casos de CCR, son portadores de una mutación de alto impacto fenotípico en APC. También se ha planteado un rango desconocido de predisposición genética que supera el 10% de los casos con agregación familiar, que se explica por las mutaciones de bajo impacto. (Half, Bercovich, & Rozen, 2009).
En relación con el riesgo de padecer CCR con agregación familiar, puede decirse que hay síndromes asociados a genes de alto riesgo y otros relacionados con genes de bajo impacto que actúan sobre el fenotipo de forma multifactorial (poligénica). (K. W. Jasperson et al., 2010).
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ar 1.8.1. Síndrome de Lynch (OMIM #120435-6)
También denominado cáncer colorrectal no polipósico, es el responsable del 3 al 5% de los casos de CCR (Aarnio, 2012; de la Chapelle, 2005; Lynch & de la Chapelle, 2003; Vasen et al., 1996; Vasovcak et al., 2011; Weissman et al., 2012) y la causa más frecuente de CCR familiar. Con 103 años de historia, este síndrome fue descrito por Alfred Scott Warthin, patólogo de la Universidad de Michigan, quien en 1913 describió la familia “G”, luego de realizar un análisis de tumores gastrointestinales y autopsias, entre 1895 y 1913. El doctor Scott estudió 3.600 neoplasias, de las que 1.600 correspondieron a carcinomas; 1.000 de esos pacientes tenían historia familiar de cáncer (Lindor, 2014; Warthin, 1913). En 1966, el Doctor Henry Lynch reportó dos familias, “N” y “M”, que presentaban características clínicas muy similares a las presentadas en la familia “G”. (Lynch, Shaw, Magnuson, Larsen, & Krush, 1966). Posteriormente, se consolidó el concepto de los síndromes que ahora se conocen como Síndrome de Lynch I y Síndrome de Lynch II; de estos, el primero solo afecta el colon, mientras el segundo presenta manifestaciones extracolónicas. En 1991 se adaptó el nombre actual: Cáncer Colorrectal Hereditario no Polipósico HNPCC. (OMIM #120435; #120436) (Lynch et al., 1991; Vasen, Mecklin, Khan, & Lynch, 1994).
El principal riesgo asociado con este síndrome es el de desarrollar carcinoma colorrectal (80%), aunque se pueden presentar otras neoplasias malignas extraintestinales que afectan el tracto genital femenino, como el carcinoma de endometrio (40 al 60%) y de ovario (10%); también se pueden afectar otras zonas del tracto gastrointestinal como el estómago (15%), el intestino delgado y la vía hepatobiliar, lo mismo que el tracto urinario con carcinomas de pelvis y uroteliales (Pradere, Lotan, & Roupret, 2017), y los sistemas nervioso y tegumentario. (Baiocchi et al., 2014; Lynch et al., 1991; S. G. Patel & Ahnen, 2012; Weissman et al., 2012; Win, Lindor, et al., 2012).
Los autores de este texto no comparten la calificación de hereditario para este ni para otros de los síndromes del cáncer, dado que no se heredan genotipos, ni caracteres fenótípicos; lo único que se hereda es la información contenida en espermas, óvulos o mitocondrias y, con ella, la predisposición a desarrollar un determinado síndrome. En este punto es importante tener en cuenta que, en términos generales, existe
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una variabilidad interindividual, que en conjunción con los diversos factores ambientales tiene que ver con el porcentaje de portadores que pueden o no desarrollar un fenotipo determinado, aunque presenten el genotipo correspondiente (penetrancia). Además, es necesario tener en cuenta que el riesgo puede estar influenciado por: la edad, el género del portador de la mutación, el grado de penetrancia del alelo en el fenotipo que controla, la poligenia y la herencia mendeliana simple, entre otros factores.
Características clínicopatologicasLos pacientes afectados HNPCC presentan CCR a edades tempranas;
un 50%, antes de los 50 años (Vasen, Mecklin, Khan, & Lynch, 1991). Es el tipo de tumor más frecuente en este síndrome; además, después de 10 años del primer diagnóstico se pueden presentar tumores sincrónicos y metacrónicos, aproximadamente en el 30% de los casos (Aarnio, 2012; Kastrinos & Stoffel, 2014), que afectan no solo el tracto gastrointestinal, sino también sistemas diferentes como el urotelial, el genital y el tegumentario. (Colas et al., 2012).
En los casos de síndrome de Lynch, el CCR tiende a localizarse en el colon derecho (ciego, ascendente, trasverso), lo cual hace más difícil un diagnóstico precoz dado el amplio diámetro del colon en estas zonas. Las manifestaciones clínicas iniciales, como el sangrado y la anemia, suelen ser detectadas cuando el tumor es ya muy grande y ha invadido capas profundas. Generalmente, cuando se diagnostica, el tumor ya ha obstruido la luz colónica, y sangra profusamente o duele.
Criterios de Ámsterdam: Estos criterios clínicos fueron adoptados por el grupo colaborativo internacional de HNPCC en el año 1991 (ICG-HNPCC) (Vasen et al., 1996). Los criterios de Ámsterdam han sido revisados en dos ocasiones. En la primera se incluyeron los tumores extracolónicos y se denominaron criterios de Ámsterdam II (Vasen, Watson, Mecklin, & Lynch, 1999); en la segunda, en 1997 en la ciudad de Bethesda, se intentaron, ampliar, haciéndolos más laxos en cuanto a la historia familiar (Rodríguez-Bigas et al, 1997). En esta modificación se tuvieron en cuenta marcadores moleculares como la inestabilidad microsatelital y la inmunohistoquímica (Gómez-Fernández et al., 2009). A medida que se aplican criterios clínicos menos restrictivos, se reduce la sensibilidad, en términos de la probabilidad
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ar de clasificar correctamente a un individuo enfermo y se aumenta la especificidad, es decir, la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, en la detección de individuos HNPCC (J. G. Park et al., 2002; Umar et al., 2004). Sin embargo, estos criterios son difíciles de aplicar en familias con pocos integrantes (Kanth, Grimmett, Champine, Burt, & Samadder, 2017). A continuación, se resumen los criterios clínicos mencionados:
• Criterios de Ámsterdam I/II que deben cumplirse para el diagnóstico de HNPCC:
Al menos tres familiares con cáncer asociado al Cáncer Colorrectal Hereditario No Polipósico HNPCC (cáncer colorrectal, de endometrio, de estómago, de ovario, de uréter/pelvis renal, de cerebro, de intestino delgado, de conducto hepatobiliar y cutáneo —tumores sebáceos—), confirmados mediante estudio histopatológico.
Un caso de estos tres debe ser pariente en primer grado de los otros dos.
Al menos dos generaciones sucesivas afectadas. Al menos uno de los casos debe ser diagnosticado antes de los 50
años. La Poliposis Adenomatosa Familiar debe estar excluida como
posibilidad diagnóstica.
• Criterios de Bethesda: Si se cumple al menos uno de los siguientes criterios, debe realizarse un cribado del síndrome de Lynch (inestabilidad de microsatélites y estudio inmunohistoquímico) en tejido tumoral:
Cáncer colorrectal diagnosticado antes de los 50 años de edad. Presencia de tumores colorrectales sincrónicos, metacrónicos, u
otros tumores asociados a HNPCC, independientemente de la edad.
Cáncer colorrectal con una histología asociada a la inestabilidad de microsatélites, diagnosticado en pacientes con edad < 60 años.
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Al menos un pariente de primer grado con cáncer colorrectal o un tumor asociado a HNPCC diagnosticados antes de los 50 años.
Al menos dos parientes de primer o de segundo grado con cáncer colorrectal o tumor asociado con HNPCC diagnosticados a cualquier edad o adenomas diagnosticados antes de los 40 años.
De acuerdo con los criterios moleculares, recientemente se ha redefinido el carcinoma colorrectal no polipósico, clasificándolo en dos tipos: el síndrome de Lynch, que se caracteriza por deficiencias en el sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2); y el cáncer colorrectal familiar de tipo X, del que se han encontrado perfiles de expresión genética múltiples en el sistema MMR (Domínguez-Valentin, Therkildsen, et al., 2013; Matloff, Lucas, Polydorides, & Itzkowitz, 2013; S. G. Patel & Ahnen, 2012; Warden et al., 2012) (Ferreira et al., 2009; Koh et al., 2011; Lindor et al., 2005; Morak, Massdorf, Sykora, Kerscher, & Holinski-Feder, 2011; Perea et al., 2009; Zambirinis et al., 2009).
Criterios histológicosTumores con células pobremente diferenciadas: Síndrome de Lynch,
presenta células tumorales pobremente diferenciadas; si adicionalmente tienen un componente mucinoso (acumulación de mucina extracelular), igual o mayor del 50% del volumen tumoral, se clasifican como carcinomas mucinosos. Dentro del grupo de los carcinomas con células pobremente diferenciadas, se describen los de patrón medular, en el cual las células se disponen en trabéculas con núcleos grandes y nucléolos prominentes. Otra forma histológica y pobremente diferenciada es la variante con células en anillo de sello, la cual se caracteriza porque las células tienen el citoplasma lleno de moco y rechazan el núcleo hacia la periferia celular. (Lynch et al., 2009; Sasaki et al., 1998; Shashidharan et al., 1999). Recientemente estas características se estandarizaron en el PATHSCORE, para tener criterios unificados. (Kaya et al., 2017).
Presencia de una reacción inflamatoria peritumoral linfoplasmocitaria característica, muy similar a la que se presenta en enfermedades inflamatorias intestinales idiopáticas como la enfermedad de Crohn. Estas células inflamatorias expresan marcadores de células T (CD3). (C. L. Wright & Stewart, 2003).
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ar El carcinoma extracolónico más común en el síndrome de Lynch es el cáncer de endometrio, y ocurre entre el 28% y el 60% de las mujeres con edades entre los 47 y los 55 años, haciéndose menor con los años, porque está relacionado con un alto nivel de estrógenos. Disminuye con la menopausia, hasta llegar a un 2 - 3% en las mujeres mayores de 60 años. (Weissman et al., 2012). Los carcinomas endometriales se asocian más frecuentemente con mutaciones en los genes MSH2 y MSH6, que con las de los genes MLH1 y PMS2. En portadores de mutaciones en MSH6 el riesgo de desarrollar carcinoma endometrial es del 64 al 71%, y para carcinomas de origen urotelial el riesgo varía del 1 al 12%. (Aarnio, 2012; Win, Lindor, et al., 2012).
Se ha planteado que en el Síndrome de Lynch existen variantes funcionales de diferentes genes involucrados en una variedad de vías metabólicas, como son el clearance xenobiótico, la actividad inmunológica y los factores de crecimiento, entre otros, que modificarían la expresión del síndrome. (Talseth-Palmer, Wijnen, Grice, & Scott, 2013).
Variantes clínicas sindrómicasSíndrome de Muir-Torre (OMIM#158320, MTS)
Esta peculiar variante suele presentarse a una edad promedio de 50 años (Ríos, Villalón, Munoz, Acuna, & Cifuentes, 2014). Se caracteriza por la presencia de manifestaciones cutáneas como las neoplasias de las glándulas sebáceas, que pueden presentarse antes de que aparezca el cáncer visceral; frecuentemente su aparición es después del CCR. Estas neoplasias se presentan como lesiones papulotuberosas múltiples en cara, párpados, cuero cabelludo y tronco; los carcinomas sebáceos generalmente aparecen en los párpados, pueden hacer metástasis y producir la muerte. Otros tumores que se presentan en estos pacientes son los queratoacantomas, tumores malignos de bajo grado, variantes del carcinoma escamocelular, que se presentan como lesiones levantadas con un cráter central. (Ríos et al., 2014; Shen, Hoffman, Hao, & Pier, 2012). Además de padecer de CCR, estos pacientes sufren de carcinomas en el resto del tracto gastrointestinal, endometrio (15%) y urotelio; la mutación más frecuente encontrada está en el gen MSH2. (Tanyi et al., 2009).
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Síndrome de Turcot o Síndrome de Deficienciaen MMR (OMIM #276300)
Es un desorden autosómico recesivo en el que se presentan de manera concurrente, tumores primarios del sistema nervioso central y adenomas o carcinomas de colon y recto, se acompañan de manchas de color café con leche o vino porto en la piel. Este síndrome fue descrito por primera vez en 1959. Los signos y síntomas aparecen de manera general en la segunda década de la vida, a nivel del sistema nervioso central. Con frecuencia hay presencia de glioblastoma multiforme y meduloblastoma. (Ozerov et al., 2013). Desde el punto de vista clínico se presentan tres tipos, a saber: Tipo 1: Presencia de más de 20 adenomas de colon, pero menos de 100, al menos uno con CCR; tipo 2: Menos de 10 adenomas de más de 3 cm con un patrón de herencia no muy bien determinado; tipo 3: Presencia de muchos adenomas, muy similar a la poliposis adenomatosa múltiple familiar, con CCR antes de los 30 años de edad. (Paraf, Jothy, & Van Meir, 1997) (Dipro, Al-Otaibi, Alzahrani, Ulhaq, & Al Shail, 2012) (Dora, Diego, Rómulo, & Natalia, 2012; Fritch Lilla, Yi, Hall, & Moertel, 2013).
Perfil genético y molecularEl síndrome de Lynch, es causado por mutaciones de la línea germinal
de uno de los genes que codifican proteínas del sistema de reparación del ADN, denominados MMR “mismatch repair”. (Aarnio, 2012). Este sistema de reparación fue descrito primero en la bacteria Escherichia coli como un sistema holoenzimatico, con los genes: mutS, mutL, mutH y mutU. (Grady & Carethers, 2008). En el hombre, está constituido por al menos cinco genes que codifican proteínas principales que tienen como función corregir los errores del ADN polimerasa en el momento de la replicación, reconociendo bases mal apareadas, pequeñas inserciones o deleciones, por un complejo sistema que acopla parejas proteicas que reconocen (MSH2/MSH3) y corrigen (MLH1/PMS2 o MLH1/MLH3) en las bases mal apareadas. (Boland, 2000; Boland & Goel, 2010; Centelles, 2012).
Sistema de reparación de genes MMRLo conforman nueve proteínas codificadas por los genes: MLH1, MLH3,
PMS1, PMS2, MSH2, MSH3, MSH4, MSH5 y MSH6. De este grupo, hasta ahora en humanos se han identificado genes homólogos a los bacterianos de E. coli, incluyendo seis del gen MutS (MSH1-MSH6) y tres genes homólogos de MutL (MLH1, PMS1 y PMS2). (Cannavo et al., 2005; Heinen, 2010). En
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ar este apartado solo se revisarán los genes más importantes implicados en la patogenia del síndrome de Lynch:
El gen MLH1 (NM_000249,2), homólogo de MutL, está localizado en el cromosoma 3p22.2 (OMIM:120436); presenta 19 exones, contiene una ORF (Open Reading Frame) de 57360pb que codifica un ARN mensajero de 2.524 bases. La proteína resultante tiene 556 aminoácidos; aunque el gen no presenta caja TATA en su promotor y la proteína no posee actividad enzimática por sí sola, forma heterodímeros con las proteínas PMS2 (MutL alfa) o PMS1 (MutL beta) o MLH3 (MutL gama). (Moreira et al., 2012). Estos complejos se unen con los heterodímeros MutS alfa (MSH2 y MSH6) o MutS beta (MSH2 y MSH3) reconociendo de esta manera las bases mal apareadas. Los heterodímeros con las proteínas MLH1 se encargan de reclutar, coordinar el acoplamiento de las diferentes proteínas involucradas en la escisión de las bases y la posterior reparación por síntesis de nuevas bases; MLH3, PMS2 y PMS1 se acoplan con la misma zona de MLH1. (Cannavo et al., 2005).
El gen MSH2 (NM_000251,1) está en el cromosoma 2p21-p16 (OMIM:609309), tiene una ORF de 80.098 pares de bases, con 16 exones que codifican un ARN mensajero de 3.145 pares de bases. La proteína resultante tiene 934 aminoácidos y es muy similar a la producida por el gen MLH1 sin caja TATA. (Punta et al., 2012).
El gen MSH6 (NM_000179,2) está localizado en el cromosoma 2p16.3 (OMIM:600678). Posee una ORF de 4.264 pares de bases con 10 exones, de los cuales el más grande es el 4, que corresponde al 60%.
El gen PMS2 (NM_000535,4) está localizado en el cromosoma 7p22.1 (OMIM:600259), con 15 exones; la proteína requiere formar un heterodímero con MLH1 que luego se unirá con MSH2/MSH3.
Los genes del sistema MMR (MLH1, MSH2, PMS1 y PMS2), al no poseer cajas TATA, se definen como genes constitutivos o housekeeping, que suelen mantener constantes sus niveles de expresión, lo que limita sus lugares de inicio de transcripción; es posible detectar la pérdida de la expresión de estas proteínas por métodos inmunohistoquímicos, usados desde 1994, los cuales son de bajo costo y fáciles de procesar con anticuerpos
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monoclonales, que aplicados contra las proteínas MLH1 y MSH2 en tejido incluido en parafina permiten determinar de manera sencilla la pérdida de expresión proteica, antes de realizar el diagnóstico molecular. (D. M. Wright et al., 2011).
También se han descrito otros loci relacionados con el síndrome de Lynch, a saber: PMS1, TGFBR2, MLH3, EpCAM y BRAF (Hegde, Ferber, Mao, Samowitz, & Ganguly, 2014), o el RINT1, con mutaciones que predisponen al cáncer de glándula mamaria (D. J. Park et al., 2014), además de mecanismos epigenéticos relacionados con el síndrome. (Peltomaki, 2014).
Inmunohistoquímica para MMR La imnunohistoquímica es una herramienta eficiente para evaluar el
estatus MMR, como un tamizaje inicial, con una sensibilidad similar a la de la inestabilidad microsatelital. (Yoon et al., 2011) (Shia et al., 2009) (Raut, Pawlik, & Rodrígez-Bigas, 2004) (L. Zhang, 2008). Esta prueba usa anticuerpos monoclonales contra las proteínas del grupo MMR; la técnica, utilizada como método de tamizaje para la detección de las mutaciones específicas permite visualizar la presencia o ausencia de expresión de la proteína, mediante una reacción coloreada sobre el tejido incluido en parafina.
Inestabilidad microsatelitalDesde hace 10 años los estudios de genética de poblaciones humanas
han evidenciado una diversidad en las poblaciones dependiendo de su antigüedad, la cual puede ser estimada teniendo en cuenta los cambios en las secuencias repetidas del ADN genómico, suponiendo que la tasa de mutación es constante. (Ayub et al., 2003). En el modelo de la secuencia adenoma–carcinoma del CCR las tasas de mutación producen cambios en las repeticiones de las secuencias de los microsatélites, produciendo mayor o menor número de repeticiones, circunstancia que ha sido usada como método de tamizaje molecular para el HNPCC (Kazama et al., 2006; Loukola et al., 2001; Tsao et al., 2000), ya que, de acuerdo con la definición del Instituto de Cáncer de los Estados Unidos (NCI), permite establecer tres fenotipos: MSS, MSI-L y MSI-H. (Raut et al., 2004). La estabilidad microsatelital (MSS) es determinada por el análisis de amplificación de 5-10 mononucleótidos o más microsatélites, derivados del panel NCI de referencia que usa los loci BAT-25, BAT-26, D5S346 (APC), D2S123, D17S250, BAT-40, TGF-βRII, D18S58, D18S69, D17S787. (Boland et al., 1998) (L. Zhang, 2008).
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La utilidad de la inestabilidad microsatelital en el tamizaje para el diagnóstico de síndrome de Lynch se ha probado en diferentes estudios, que han permitido incluirla como criterio clínico en el sistema Bethesda. (Pinol et al., 2005) (Rodrígez-Bigas et al., 1997). Recientemente se han adicionado al método pentanucleótidos -marcadores monomórficos que simplifican la interpretación de los datos-; además, se ha implementado el diagnóstico por técnicas de PCR-multiplex fluorescente, con análisis automatizado por electroferogramas. (Umar et al., 2004) (Bacher et al., 2004). Las investigaciones avanzan con rapidez y cada día se agregan más marcadores mononucleótidos con alta sensibilidad, comparables a BAT26 (Yamamoto & Imai, 2015), o se implementa el uso de tetranucleótidos asociados a la pérdida de expresión de MSH3. (Carethers, Koi, & Tseng-Rogenski, 2015). Este sistema de inestabilidad microsatelital se ha convertido en una prueba molecular muy útil en el tamizaje por determinar el estatus MMR, por estar asociado con parámetros clínico-patológicos específicos de síndrome de Lynch. (Centelles, 2012; Samowitz, 2015; Yoon et al., 2011; X. Zhang & Li, 2013). La alta inestabilidad MSI-H tiene mejor pronóstico que la estabilidad MSS, y existe controversia en cuanto a la respuesta al tratamiento con 5- fluorouracilo. (Setaffy & Langner, 2015).
Del genotipo al fenotipo Las mutaciones en los genes MLH1 y MSH2 representan el 90% de las
alteraciones genómicas encontradas en el síndrome de Lynch; el porcentaje aumenta a 95%, si se toman en cuenta los genes MSH6 (7-10%) y PMS2 <5%. (Belvederesi et al., 2006) (Balmana, Castells, & Cervantes, 2010). Las mutaciones en los genes reparadores del ADN (Forster et al.) relacionadas con la enfermedad suelen consistir en su mayor parte en cambios sin sentido (nonsense), de interrupción del marco de lectura (frameshit) o grandes reordenamientos (De la Chapelle, Palomaki, & Hampel, 2009), lo que hace que la proteína no sea funcional o sea degradada. (Heinen, 2010). Adicionalmente, en los genes reparadores se encuentra una proporción elevada de sustituciones exónicas sin cambio de sentido (missense) o
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sinónimas (30% para MLH1 y entre un 17 y un 25% para MSH2) (Heinen, 2010); (>50% MSH3, MSH6). Los grandes reordenamientos en genes MMR ocurren con un porcentaje que oscila entre el 5 y el 20%, con un mayor porcentaje en MSH2 (60%) y MLH1 (27%). Si se tiene en cuenta la totalidad de pacientes con síndrome de Lynch, aproximadamente un 80% de los hombres y un 40 % de las mujeres son portadores de mutaciones en alguno de los genes MMR. (Ashton, Meldrum, McPhillips, Kairupan, & Scott, 2005). Solo un 80% de los portadores de las mutaciones MMR desarrollarán cáncer antes de los 75 años; en este sentido el riesgo de padecer CCR se calcula en un 70 - 80%, en ausencia de métodos de tamizaje. (Baiocchi et al., 2014; E. M. Stoffel et al., 2010). El análisis molecular de las familias con síndrome de Lynch ha mostrado que las mutaciones en MSH6, PMS2 y MLH3 se asocian con fenotipos atípicos que cumplen los criterios de Bethesda; en cambio, los que tienen mutaciones en MLH1 y MSH, se asocian con un fenotipo típico que cumple con los criterios de Ámsterdam I, los cuales tienen más riesgo de desarrollar cáncer. (Schneider, Schneider, Kloor, Furst, & Moslein, 2012).
Los portadores de mutaciones MLH, presentan manifestaciones extracolónicas con frecuencia. En el ámbito mundial, los investigadores de esta patología han creado una base de datos denominada: “The International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumours Incorporated” (Thompson, 2014), en cuyo sitio web http://www.insight-group.org/mutations/, se reportan las nuevas variantes encontradas en los diferentes grupos de investigación (Heinen, 2010).
Otros investigadores han establecido, mediante regresión logística multivariada, predicciones estadísticas que permiten establecer un porcentaje de riesgo de ser portador de una mutación MMR, teniendo en cuenta la historia personal y familiar. Uno de los modelos se denomina PREMM 1, 2, 6, (Kastrinos et al., 2011), y se encuentra disponible en el sitio web del Instituto de Cancer Dana Farber (premm.dfci.harvard.edu); otro de los módelos se basa en predicciones bayesianas, y está disponinle en el sitio web del Centro Medico de la Universidad de Texas https://www4.utsouthwestern.edu/breasthealth/cagene (Underhill, Germansky, & Yurgelun, 2016).
Desde el punto de vista práctico, para el síndrome de Lynch se han descrito flujogramas que permiten determinar la ruta a seguir en caso
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ar de sospecha (Kastrinos & Syngal, 2011; Vindigni & Kaz, 2016); estos flujogramas, además de determinar el porcentaje en que se incrementa el riesgo de portar la mutación, estiman el riesgo a padecer CCR o cualquiera de los tipos de cáncer asociados y ofrecen recomendaciones de seguimiento a los portadores. Las guías de manejo de la “National Comprehensive Cancer Network Guidelines” (NCCN) suministran a los pacientes portadores recomendaciones específicas por tipo de cáncer y mutación, por ejemplo, la recomendación para CCR con mutaciones en MLH1 y MSH2 es realizar colonoscopias a la edad de 20-25 años y luego cada dos años para cáncer endometrial y ovárico, histerectomía y salpingooforectomía profiláctica, luego de tener los hijos deseados http://www.nccn.org (Lindor, 2014). Incluso se recomiendan métodos de tamizaje para los carcinomas extracolónicos, como endometrio y ovario. (A. M. Mills & Longacre, 2016). De otra parte, se ha intentado establecer un valor pronóstico a la quimioterapia, que se le suministre al paciente de acuerdo con su perfil genético. (Lastra et al., 2012) (Jiang et al., 2012). Es importante resaltar que se han encontrado fenotipos traslapados con otros síndromes de cáncer familiar, como el cáncer de ovario y el de glándula mamaria. (Saam et al., 2015).
1.8.2. Síndromes polipósicos
En el cáncer colorrectal con agregación familiar se han descrito los síndromes polipósicos, como responsables de la patología en cerca del 1% de los casos; aunque este porcentaje parece bajo, la posibilidad de identificar estas familias en riesgo, es muy importante dadas las ventajas que los tratamientos preventivos y de profilaxis podrían traer a los miembros de las mismas. (Castellsague et al., 2010) (Lynch & de la Chapelle, 2003; K. Wells & Wise, 2017). En la actualidad existe el simulador para tamizaje de pólipos teniendo en cuenta la edad y la historia familiar, disponible en: http://links.lww.com/EDE/B194. Este simulador brinda herramientas para el inicio del tamizaje en pacientes con poliposis (Thomas, 2017).
En la tabla 2 se pueden apreciar los diferentes síndromes polipósicos. (K. Jasperson & Burt, 2015).
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En muchos de los pacientes con síndromes polipósicos intestinales es posible establecer el diagnóstico por los datos clínicos y patológicos. Empero, en un creciente número de casos, se presentan manifestaciones fenotípicas sobrepuestas, que no permiten clasificarlos, por lo que varios autores recomiendan realizar secuenciación completa de alto rendimiento, que permite identificar los defectos genéticos etiológicos. (Lucci-Cordisco, Risio, Venesio, & Genuardi, 2013).
Poliposis Adenomatosa Familiar (FAP, OMIM #175100) Esta patología es la segunda causa en frecuencia de CCR familiar,
y representa alrededor del 1% de todos los casos de CCR. (Fatemi et al., 2010) (Jung, Gurzu, & Turdean, 2015; Morak, Laner, Bacher, Keiling, & Holinski-Feder, 2010). El primer reporte fue realizado por Sklifasowski en el año 1881. (Bulow, Berk, & Neale, 2006). Este desorden autosómico tiene como principal manifestación la presencia de más de 100 adenomas colorrectales, con mayor densidad en la zona distal del colon; debido a las alteraciones genéticas, la secuencia adenoma – carcinoma es acelerada. Puede también afectar el tracto gastrointestinal superior con adenomas en diferentes estadios. (Srinivasa & Wray, 2014; Wood, Salaria, Cruise, Giardiello, & Montgomery, 2014).
Los pacientes con esta enfermedad presentan CCR en la segunda o tercera década de la vida o en la adolescencia, cuando aparecen los primeros pólipos. La afectación -que va desde unos pocos a miles-, es igual en ambos sexos. (Novelli, 2015). La incidencia en Europa es de 3 a 10 personas por cada 100.000 habitantes y en Estados Unidos de 1 por cada 8.000 a 10.000 personas. (Claes et al., 2011), (Half et al., 2009) (Alkhouri, Franciosi, & Mamula, 2010) (Bulow et al., 2006) (Ballinger & Anggiansah, 2007).
Características clínicopatologicasEsta patología es asintomática hasta los 30 - 35 años; a la edad de 10
años, un 15% de los pacientes ya presentan adenomas, a los 20 años la probabilidad de CCR aumenta a un 75%, a los 30 años el 90% presenta pólipos y a los 39 años el 100% tiene pólipos en diferentes estados. (Jung et al., 2015; Kastrinos & Syngal, 2007). Inicialmente se describió una triada de manifestaciones extraintestinales (Groen et al., 2008) compuesta por
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ar quistes de tejidos blandos, osteomas y anormalidades dentarias, descritas dentro del contexto de la enfermedad de Gardner, en los que la prevalencia de osteomas es del 68 al 82%, generalmente localizados en los senos paranasales y en la mandíbula, mientras las anormalidades dentarias alcanzan un 30% al 75%. (Cankaya et al., 2012; Gómez García & Knoers, 2009; Shen et al., 2012). Actualmente se reportan diferentes manifestaciones del síndrome, a saber:
Carcinoma de tiroides: riesgo entre 1 y 2%; edad media de diagnóstico de 27 años, la cual aumenta particularmente en mujeres jóvenes, en las que el riego se incrementa hasta unas 160 veces, con respecto a los individuos normales. (Groen et al., 2008; Kennedy, Potter, Moir, & El-Youssef, 2014; Metzger & Milas, 2014).
Hepatoblastomas: compuestos por tejido epitelial maligno con diferenciación variable, a menudo de tipo embrionario o fetal. Estas neoplasias suelen presentarse en niños entre los seis meses y los tres años de edad. El riesgo de tener hepatoblastoma en las familias con FAP es considerablemente más grande que el de la población en general.
Tumores cerebrales: al igual que en el síndrome de Turcot, estos tumores resultan de mutaciones en los genes MMR y se han divido en dos tipos: 1. Variantes clínicas del síndrome de Lynch, que se presentan como astrocitomas y glioblastomas; 2. Meduloblastomas y más de 100 pólipos en los pacientes, los cuales son considerados como el verdadero síndrome de Turcot. Debido a que estos términos pueden resultar confusos, se ha adoptado, para estos tumores cerebrales el término poliposis-tumor cerebral (BTP brain-tumor polyposis). El tipo más frecuente en las familias con FAP es el meduloblastoma (80%), que afecta a los niños en la primera década de vida. También se han descrito tumores pancreáticos y adrenales. Los tumores Desmoides son causa de muerte en los pacientes con FAP; su presencia entre los 20 y 40 años se asocia con un incremento hasta de 1.000 veces en el riesgo CCR, frente la población en general. Estos tumores aparecen con mayor frecuencia en las regiones intra-abdominales y en la región del mesenterio, siendo su localización la razón de su alta tasa de mortalidad, ya que la resección y recurrencia pueden comprometer estructuras vitales, como los grandes vasos. (Groen et al., 2008).
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Variantes clínicas: De acuerdo con el número de pólipos que se presenten, la FAP se
divide en:
a) FAP o Poliposis Adenomatosa Familiar Clásica: los pacientes afectados presentan más de 100 pólipos, con frecuencia varios cientos en el colon y con predilección en el recto.
b) AFAP o Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada: los pacientes afectados presentan menos de 100 pólipos, que tienden a localizarse en la región proximal del colon. Las características genotípicas de esta patología presentan un espectro de mutaciones que producen al menos dos variedades de la enfermedad, dependiendo del perfil molecular presentado. En estos pacientes, el riesgo clínico de padecer CCR a los 80 años se ha estimado en un 70%; esta edad promedio de aparición es más tardía que la de los pacientes con FAP clásica, usualmente estimada entre los 50 y los 55 años, aunque más temprana que la de los casos esporádicos. (Spirio et al., 1993). Ver Figura 1.
A. Poliposis múltiple proximal (ciego) B. Poliposis múltiple (colon total)
Figura 1. Poliposis Adenomatosa familiar – aspecto macroscópico.Fuente: los autores.
La FAP presenta una variabilidad fenotípica, tanto intra como interfamiliar, muy probablemente relacionada con el perfil molecular y con la actuación de genes modificadores. (Hes et al., 2014; Nielsen, Morreau, Vasen, & Hes, 2011).
Histología: dado que el adenocarcinoma proviene de pólipos adenomatosos, ya sean tubulares, túbulo-vellosos o vellosos, se presenta un
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ar espectro en la apariencia microscópica del tumor bien diferenciado, en el cual las células tumorales forman glándulas muy similares a su contraparte normal, pero exhiben características propias de las células malignas, como aumento de la relación núcleo citoplasma, hipercromasia y pleomorfismo nuclear. Al perder diferenciación el tumor pierde arquitectura glandular y aparecen trabéculas y nidos tumorales, moderadamente diferenciados. Cuando no se aprecian glándulas bien formadas, sino sabanas y nidos de células tumorales, se adopta el término de mal diferenciado. (Ueno et al., 2012).
Perfil genético y molecular de la FAPMutaciones en el gen APC: La FAP es una enfermedad desencadenada
por una mutación de origen germinal en el gen APC, autosómico, de herencia mendeliana simple (Adenomatosous Polyposis Coli tumor suppresor gene, OMIM 611731, 5q21-q22). Este gen tiene una ORF de 8.535 pb distribuidos en 21 exones, de los cuales 15 son codificantes, con expresión en casi todos los tejidos. El exón 15 tiene un gran tamaño de 6.574 pares de bases y 2.843 aminoácidos y representa el 77% de la región codificante. Se describió inicialmente en el síndrome de Gardner - FAP con una deleción en la banda 5q21. (Herrera, Kakati, Gibas, Pietrzak, & Sandberg, 1986). Su mapeo se realizó en 1.987 en familias con FAP. (Leppert et al., 1987). En 1991 fue clonado en una región de 5,5 megabases asociada a FAP. Este gen presenta varios sitios de splicing (empalme) alternativo en el exón 1 y en los exones del 8 al 15, expresión facultativa del exón 9, pérdida del exón 14 y del exón 7; todos estos cambios son los responsables de la heterogeneidad del ARN mensajero. Como se ha descrito, el gen pertenece a la familia de los supresores tumorales y está implicado en la regulación de las señales apoptóticas a través de la vía wnt y la formación del huso mitótico. Las personas portadoras de una mutación en línea germinal en este gen (primer golpe Knudson´s two hit hypotesis) tienen una predisposición a presentar FAP. El desarrollo de adenomas ocurre luego de un segundo golpe o mutación del alelo silvestre del gen APC. Estas dos mutaciones pueden explicar la aparición de cientos de pólipos, de los cuales sólo unos pocos se malignizan, lo que indica que se necesita que se agreguen mutaciones en otros loci, implicados en la secuencia adenoma carcinoma. (Berger et al., 2011).
De acuerdo con lo anterior, los autores de este libro prefieren no calificar el fenotipo de este síndrome como dominante. En realidad, es un
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carácter controlado por varios genes de diferente impacto en el fenotipo, entre ellos el APC, de alto impacto, que sólo se expresa en el segundo golpe, es decir, cuando los dos alelos están mutados; después se van agregando las otras variantes de la secuencia.
Las mutaciones en la línea germinal del gen APC están presentes en el 80-90% de los pacientes con FAP. Se han reportado más de 300 mutaciones diferentes en el síndrome; la mayoría de ellas son mutaciones con corrimiento del marco de lectura “frameshit”, debidas a inserciones, deleciones o, mutaciones no sinónimas que producen proteínas truncadas. Las mutaciones en la región mutadora (MCR, mutation cluster region, por sus siglas en ingles), se asocian a fenotipos de pacientes muy jóvenes con gran cantidad de pólipos; en contraste, los de los extremos 5´y 3´ y las del exón 9 tienden a presentar un fenotipo con menos pólipos. (M. Jansen, 2014). Las mutaciones entre los codones 1.250 y 1.464 están asociadas a la presencia de más de 5.000 pólipos y, por lo tanto, mayor agresividad de la enfermedad. (Lung, Trainer, Campbell, & Lipton, 2015).
El gen APC codifica una proteína de 311,8 kDa, que presenta varias isoformas de diferente peso molecular, dentro de las que predomina la de siete dominios, que le permite interactuar con otras proteínas, teniendo cada dominio una función específica en el desarrollo de la actividad de la proteína. La proteína APC tiene descritas múltiples funciones, entre las que se destacan: 1. La regulación de los niveles de B-catenina y todas las señales inducidas por la misma, ya que forma parte de un complejo con axina y glicógeno sintasa-3-beta, complejo que fosforila la vía wnt de la B-catenina y la lleva a degradación proteosómica; las dos mutaciones APC en las células tumorales son coseleccionadas, hasta llegar a producir un nivel de B-catenina que resulta ser relevante para la tumorogénesis. (Qiao, Zhang, Gamper, Fujita, & Wan, 2010). 2. La regulación de la adhesión celular, a través de la B-catenina y la E-cadherina, dando como resultado la pérdida de adhesión celular en las células tumorales, con el subsecuente aumento de la probabilidad de metástasis. 3. La regulación de la migración celular y la estabilidad cromosómica, por la interacción con los microtubulos, promoviendo la polimerización de los mismos. 4. El bloqueo del ciclo celular, la sobreexpresión de APC inhibe la progresión de la célula desde la fase G0/G1 a la fase S, ejerciendo función de gen supresor tumoral en la regulación de la motilidad celular, ajustando la polaridad y la migración, a través del control del citoesqueleto de actina. (Qiao et al., 2010).
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ar Poliposis asociada a MUTYH (MAP, OMIM #608456)Esta enfermedad se describió en 2002 en una familia con fenotipo
AFAP, con ausencia de mutaciones en línea germinal de APC (Al-Tassan et al., 2002). Los autores observaron que las mutaciones se presentaban en los genes del sistema de reparación por escisión de bases (BER). En 2003 se expuso la forma de carácter recesivo y de alto impacto en el fenotipo de la poliposis asociada a mutaciones del gen MUTYH (MYH, 1p34,3-p32,1) o MAP. Su clínica es muy parecida a la FAP o AFAP, siendo de carácter recesivo, por lo que la historia familiar no registra los portadores como casos, pues se necesitan mutaciones en ambas copias del gen para que se exprese la enfermedad; por lo tanto, se describen portadores monoalélicos y bialélicos (Claes et al., 2011; O'Shea et al., 2008). En este punto, los autores de este texto consideran importante aclarar, que un heterocigoto suele ser portador de un alelo silvestre y de otro mutado; cuando los dos alelos son iguales, el término correcto es homocigoto, que puede ser silvestre o mutado. Además, se aclara que bialélico es un locus con sólo dos variantes.
Los pacientes que padecen MAP, presentan una edad promedio de 45 años (entre los 40 y los 60) y un número variable de adenomas distribuidos aleatoriamente en el colon. (Guarinos et al., 2014). Se han descrito algunas manifestaciones extracolónicas similares a las encontradas en FAP, como los osteomas, la hiperplasia congénita del epitelio retinal, los quistes dentales y los pólipos en otras localizaciones gastrointestinales. Se debe sospechar de pacientes con menos de 100 pólipos y sin una historia familiar clara. (Zorcolo et al., 2011). Otros autores han reportado manifestaciones extracolónicas semejantes a las del síndrome de Lynch, como el carcinoma de endometrio. (Sereno et al., 2014). Las características histopatológicas son similares a cualquier otro tipo de adenocarcinoma y no hay una característica patognomónica que permita predecir que se trate del síndrome. (O'Shea et al., 2008).
Perfil genético-molecular:El gen MUTYH (MN_012222), localizado en el brazo corto del
cromosoma 1, entre 1p32,1 - 34,3 (OMIM 604933), está constituido por 16 exones que codifican una proteína glucosilasa de 535 aminoácidos, perteneciente a la ruta de reparación BER, la cual está especializada en el reemplazo de adeninas, reparadas erróneamente con los derivados oxidados de la guanina (8-oxodG). (Fostira, Papademitriou, Efremidis, &
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Yannoukakos, 2010). La proteína se localiza en los organelos en los que se produce el estrés oxidativo (citoplasma, mitocondria), y ejerce su función integrándose a un péptido señal, acoplándose por alguno de sus seis dominios.
Del genotipo al fenotipo: síndromes polipósicos FAP y MAP
Estos síndromes presentan un alto espectro de mutaciones, cuya expresión fenotípica puede ser dominante, codominante o recesiva; en consecuencia, una cantidad importante de portadores pueden no manifestar la enfermedad. Se estima que las mutaciones germinales del gen APC se presentan en un 70% de los pacientes con FAP clásica y en un 10 a 20% de los pacientes con AFAP. Las mutaciones bialélicas del gen MUTYH se han encontrado en un 25% a 30% de los pacientes que tienen entre 10 y 100 adenomas, y en el 5% al 30% de los pacientes con más de 100 adenomas. (Balmana et al., 2010). La mayoría de las mutaciones en línea germinal del APC (98%) producen una proteína truncada no funcional. Las mutaciones más frecuentes son las de corrimiento del marco de lectura (48%), mientras las mutaciones de novo oscilan entre un 10% y un 40%. (Aretz, Vasen, & Olschwang, 2011). La FAP presenta multitud de manifestaciones extraintestinales estrechamente relacionadas con el sitio de mutación. (Groen et al., 2008).
Las mutaciones más frecuentes se presentan en las zonas denominadas puntos calientes, como los codones: 1.309 (11%), 1.061 (7%), 213 (3%), y 1.068 (2%). La gran mayoría de las mutaciones está localizada en la mitad 5` del gen. (Aretz et al., 2011). Existen programas de seguimiento o rastreo que relacionan las mutaciones con el riesgo a padecer uno u otro síndrome. Se han perfeccionado otros programas de prevención, cuya eficiencia depende de la información del fenotipo o manifestación considerada probable y de la mutación asociada. (Aretz et al., 2011; K. W. Jasperson et al., 2010).
El cáncer colorrectal es uno de los síndromes mejor descritos en términos genéticos; se le conocen varios loci asociados, sus respectivas funciones proteicas y los efectos carcinogénicos de las proteínas producto de variaciones. Así, por ejemplo, en síndromes con agregación familiar como el de Lynch se han estudiado mutaciones de alto impacto fenotípico
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ar que confieren a los portadores predisposición al cáncer colorrectal, entre ellas, las de los genes de reparación de apareamientos erróneos del ADN. Otro ejemplo es el de la poliposis adenomatosa familiar, para el cual se han reportado mutaciones en el gen supresor tumoral APC. Estos dos síndromes familiares representan alrededor del 5% de todos los casos de cáncer colorrectal, razón por la cual la determinación de las mutaciones que subyacen en ellos es importante para el diagnóstico, tratamiento y prevención. Recientemente, un grupo de trabajo del Colegio Americano de Genómica y Genética Médica (ACMG por sus siglas en inglés) ha desarrollado las guías y estándares para realizar el tamizaje del CCR con agregación familiar para los síndromes de alto impacto en el fenotipo. (Hegde et al., 2014). En el mismo sentido, diferentes asociaciones médicas como: la Sociedad Americana para la Endoscopía Gastrointestinal, el Colegio Americano de Gastroenterología (ACG) (Aubert et al., 2009) y la Sociedad Multitarea para Estados Unidos (USMTF) coinciden en que se debe realizar colonoscopia a la edad de 40 años a los familiares en primer grado de pacientes con CCR diagnosticado antes de los 60 años o, con más de un familiar en primer grado afectado. (Armelao & de Pretis, 2014).
De otra parte, las mutaciones de bajo impacto fenotípico representan una proporción considerable de todo el riesgo atribuible de CCR, tanto para los casos familiares como para los esporádicos. Estas mutaciones son más difíciles de identificar que las de alto impacto, pero, gracias a los Estudios Amplios de Asociación del Genoma (GWAS, por su sigla en inglés) y a los proyectos colaborativos internacionales, en los que los consorcios de genética comparten e intercambian muestras, se ha logrado identificar y caracterizar un mayor número de pacientes, aumentando el poder de las pruebas estadísticas y el número de SNP asociados a la predisposición a desarrollar el síndrome. (Schmit et al., 2016).
Síndromes de Poliposis HamartomatosaEstos síndromes son un grupo de trastornos que tienen en común
pólipos de aspecto benigno en el tracto gastrointestinal. También tienen riesgo de malignidades; incluyen los síndromes de: Peutz-Jeghers (PJS); poliposis juvenil (JPS); Bannayan-Riley-Ruvalcaba (BRRS); Cowden (CS); Cronkhite-Canada (Kuchenbaecker et al., 2015) y Poliposis Mixta Hereditaria (HMPS), (Calva & Howe, 2008). Estos síndromes polipósicos son menos frecuentes que los de Poliposis Adenomatosa y son responsables de menos
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del 1% de los casos de CCR con agregación familiar. La transformación maligna se produce por estímulo estromal al epitelio. (Gammon, Jasperson, Kohlmann, & Burt, 2009; Hisamuddin & Yang, 2006; Omundsen & Lam, 2012).
Síndrome de Peutz-Jeghers (OMIM#175200, PJS)Se presenta con una frecuencia que varía ampliamente entre
muestras (1/8.300 a 1/280.000 personas). Se caracteriza por el desarrollo de pigmentación mucocutánea, pólipos hamarto-matosos en el tracto digestivo y un riesgo aumentado de CCR. Este síndrome se describió desde 1896. En 1921, Peutz le asignó su nombre, luego de describir las alteraciones en una familia de 10 integrantes. En 1949, Jeghers describió 10 casos, y en 1954 se acuñaron los nombres de Peutz-Jegher, por Bruwer. (Calva & Howe, 2008).
Clínicamente se caracteriza por la presencia de máculas hiperpigmentadas en el 90% de los afectados, las cuales se localizan en los labios, la mucosa oral y en el área periorbitaria. Inician su aparición en la infancia, se decoloran en la adolescencia, pero persisten en la edad adulta, principalmente las de los labios; estás máculas no tienen potencial maligno. La edad media de aparición de los síntomas gastrointestinales es a los 13 años, y aproximadamente el 50% de los casos presenta alguna manifestación gastrointestinal a los 20 años. Los síntomas más frecuentes son la obstrucción e intususcepción intestinal, sangrado rectal y anemia. Los pólipos se presentan en el intestino delgado; cerca del 90% de las personas afectadas presentan pólipos en el yeyuno y con menor frecuencia en el íleon y en el duodeno; cerca del 30% los presentan en el colon y el 25% en el estómago; también se pueden presentar pólipos hamartomatosos en el útero, la vejiga, la cavidad nasal y el pulmón. (Gammon et al., 2009).
Los pacientes con PJS tienen un riesgo acumulado estimado de entre el 81% y el 93% para desarrollar cualquier tipo de cáncer. En ellos ciertos órganos son más susceptibles, como la glándula mamaria (45%-54%) y el tracto gastrointestinal (hasta 50%). (Campos, Figueiredo, & Martínez, 2015; Hearle et al., 2006). Los pólipos del intestino delgado se caracterizan por un patrón de arborización de la muscularis de la mucosa; estos haces de músculo se entremezclan con las glándulas.
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ar La etiología genética de este síndrome es debida a mutaciones en el STK11 (LKB1), un gen localizado en 19p13,3, el cual codifica para una serina/treonina kinasa, que funciona como un supresor tumoral; esta mutación está presente en el 50% - 90% de las personas afectadas por el síndrome. (Buchet-Poyau, Mehenni, Radhakrishna, & Antonarakis, 2002; Gammon et al., 2009). La edad media de presentación es de 46 años. (Calva & Howe, 2008).
Síndrome tumor hamartoma PTEN (PHTS)Aunque los síndromes de Cowden (CS, OMIM#158350) y Bannayan–
Riley-Ruvalcaba (BRRS, OMIM#153480) fueron descritos en la década de 1960, en la actualidad, con los avances en biología molecular, diferentes consensos clínicos han preferido considerarlos como un espectro fenotípico, debido a la expresión variable de las mutaciones en el gen PTEN (Calva & Howe, 2008). De acuerdo con estas diferencias de expresión, las manifestaciones clínicas de los pacientes afectados varían entre: bocio, carcinoma de tiroides, carcinoma ductal de glándula mamaria, triquilemoma, queratosis acral y lipoma, entre otra. El compromiso gastrointestinal alcanza del 27% al 29% de los pacientes, con pólipos hamartomatosos en el colon y el recto. El síndrome PHTS presenta mutaciones en el gen supresor tumoral PTEN, las cuales se detectan en el 80% de los pacientes con CS y en el 60% de los pacientes con BRRS. (Gammon et al., 2009). A continuación, se indican brevemente las características de los mismos:
a) Síndrome de Cowden (CS - OMIM#158350)Este desorden autosómico, descrito en 1963, tiene una incidencia
menor a 1 en un millón. Además de las manifestaciones mucocutáneas, los pacientes pueden presentar gangliocitoma del cerebelo, macrocefalia (40%), enfermedad fibroquística y adenomas de la glándula mamaria (75%), bocio multinodular y adenomas tiroideos (75%) y cáncer de tiroides (3% a 10. Estos tumores pueden estar presentes de forma individual o simultánea en los pacientes. Los pólipos hamartomatosos gastrointestinales se presentan hasta en el 60% de las personas afectadas. En algunas series se reportan casos con pólipos en diferentes estados, hasta en el 93% de los afectados. (Stanich et al., 2011). El mayor riesgo de malignidad se presenta en endometrio, glándula mamaria y tiroides. (Gammon et al., 2009; Trufant et al., 2012). Se han encontrado mutaciones puntuales en el gen PTEN asociadas al síndrome. (Jelsig et al., 2014).
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b) Síndrome Bannayan–Riley-Ruvalcaba (BRRS - OMIM#153480)Presenta manifestaciones clínicas que se sobreponen con las del
síndrome de Cowden CS. De igual forma, presentan macrocefalia, lipomatosis y máculas pigmentadas de las glándulas peneanas, discapacidad intelectual y poliposis intestinal hamartomatosa. (Jelsig et al., 2014). No hay un consenso clínico que permita establecer de manera certera las características propias de la enfermedad, que, como ya se dijo, formaría parte del espectro fenotípico del gen PTEN y del síndrome del síndrome PHTS.
Síndrome de poliposis juvenil (JFJP - OMIM #174900) Fue descrito en 1939. Se caracteriza por pacientes con presencia de
múltiples pólipos juveniles en el tracto gastrointestinal. La incidencia es de 1 en 100.000 personas. Los criterios clínicos establecidos para su diagnóstico son: al menos cinco pólipos juveniles en el colon o en cualquier localización gastrointestinal, o cualquier número de pólipos con historia familiar. (Jung et al., 2015). Este síndrome está asociado con el aumento del riesgo a padecer CCR, con un riesgo relativo del 34%. La patogénesis está relacionada con alteraciones genéticas en el cromosoma 10q22 (locus BMPR1A), principalmente en el estroma de los pólipos, favoreciendo un medio ambiente propicio para la tumorogénesis epitelial (landscaper mechanism). En algunos pacientes, se han identificado mutaciones en línea germinal del gen SMAD4. (Brosens, Langeveld, van Hattem, Giardiello, & Offerhaus, 2011) (Dahdaleh, Carr, Calva, & Howe, 2012).
Síndrome de poliposis mixta hereditaria (HMPS, OMIM #601228)
Fue descrito por primera vez en 1971, pero su nombre se adoptó en 1997 con la descripción de nuevos casos, caracterizados por presentar pólipos en el tracto gastrointestinal que, a diferencia de los síndromes antes descritos, presentaban una mezcla de pólipos aserrados, hiperplásicos, juveniles e, incluso, adenomas atípicos. En 2003, de acuerdo con estudios de ligamiento, se describió la característica mixta de los pólipos y, posteriormente, las alteraciones genéticas relacionadas con el gen CRAC1 del cromosoma 15q14-q22 (Calva & Howe, 2008). Otros autores han reportado duplicaciones en los dominios regulatorios de GREM1 y mutaciones en BMPR1A. (Rohlin et al., 2017).
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ar Síndrome Cronkhite-Canadá (CCS, OMIM #175500)Este síndrome, descrito en 1955, se caracteriza por la presencia
de poliposis hamartomatosa gastrointestinal, alopecia, onicodistrofia, hiperpigmentación cutánea y diarrea. Presenta diversas condiciones asociadas, como hipocalcemia, hipomagnesemia e hipocalemia. Se ha descrito que el 9% de los afectados presentan CCR y el 5% adenocarcinoma gástrico. (Calva & Howe, 2008).
Síndrome de poliposis aserradaLos pacientes con este síndrome presentan proliferación de pólipos
hiperplásicos que progresan, principalmente, por vía epigenética a carcinomas de tipo aserrado. (Tannapfel, Neid, Aust, & Baretton, 2010). Los criterios diagnósticos definidos en el año 2000 por la Organización Mundial de la Salud, incluyen a pacientes que presentan al menos una de las siguientes características: a) Al menos cinco pólipos aserrados proximales al sigmoide, dos de ellos mayores de 10 milímetros. b) Cualquier número de pólipos aserrados proximales al sigmoide, en personas con antecedentes de parientes en primer grado de pólipos aserrados. c) Más de 20 pólipos aserrados de cualquier tamaño distribuidos en cualquier parte del colon. Aunque se han definido diferencias fenotípicas, se establecen dos subgrupos: el primero con pocos pólipos, aunque grandes, que muestran mutaciones en BRAF, y el segundo con pólipos pequeños asociados con mutaciones en KRAS. Cerca del 90% de los pacientes presentan CCR con fenotipo metilado, mutaciones en BRAF o KRAS e inestabilidad microsatelital. (MSI) (Carvajal-Carmona et al., 2007; Guarinos et al., 2012; Lochhead et al., 2014; Yamane, Scapulatempo-Neto, Reis, & Guimaraes, 2014).
Poliposis asociada a polimerasa correctora de errores “proofreading”
CCR familiar con múltiples adenomas. Los pacientes con este síndrome presentan mutaciones en el gen de la polimerasa E (POLE) y D (POLD1). Se han encontrado dos mutaciones (POLE p.Leu424Val y POLD1 p.Ser478Asn) en pacientes con CCR de agregación familiar que, además, incrementan el riesgo de padecer carcinoma endometrial. Los criterios de inclusión se han pulido recientemente y se centran en el número de pólipos (entre 20 y 100 adenomas) y en el diagnóstico de CCR antes de los 50 años. (Ford, 2018; Rohlin et al., 2014; Valle, 2014).
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1.9. Diagnóstico molecular del CCR con agregación familiar
Cuando se sospecha, por su historia clínica y/o por sus antecedentes familiares, que una persona presenta riesgo de padecer un CCR con agregación familiar es fundamental identificar los miembros de su familia e involucrarlos en un programa de seguimiento y prevención, con el fin de disminuirles la morbimortalidad por CCR o por otros tipos de cáncer asociados a los diferentes síndromes. Es importante tener en cuenta que el diagnóstico de cualquier síndrome asociado a una mutación de herencia mendeliana o con agregación familiar debería realizarse en el contexto de una unidad de consejería genética. Por esta razón, los estados deberán generar políticas que contemplen en el POS (Plan Obligatorio de Salud) este tipo de servicio. En este proceso, una adecuada historia familiar, técnicamente hecha por expertos, con ayuda de alguno de los programas disponibles para tal fin, que conduzca a la realización de genealogías (pedigrí), se convierte en una herramienta fundamental para determinar la magnitud del riesgo que una determinada familia tenga de desarrollar el síndrome. Es necesario tener en cuenta que tanto las familias pequeñas como las que carecen de historia conocida, ofrecen limitaciones en el proceso, el cual, en estos casos, se tiene que completar forzosamente con la parte molecular. Una vez se tiene el familiograma, se realizan las pruebas moleculares que pueden ser positivas, informativas, no informativas o negativas. (Sánchez., 2006). Para llevar a cabo un enfoque individual del tratamiento del cáncer en cada paciente, es importante identificar y entender los cambios moleculares que conducen el proceso de tumorogénesis. (Bedeir & Krasinskas, 2011; De Rosa et al., 2015; Heinen, 2010; Soreide, Berg, Skudal, & Nedreboe, 2011). De acuerdo con los resultados, el análisis se debe hacer a la luz de las relaciones genotipo / fenotipo de los diferentes síndromes con agregación familiar.
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Capítulo 2
JUSTIFICACIÓN
Fuente: Freepik.es
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La mortalidad del CCR en los países en vía de desarrollo tiende a igualar la incidencia (Ferlay et al., 2010; WHO, 2018), debido, en parte, a que: 1. No se hacen diagnósticos basados en
estudios moleculares del perfil genético de los pacientes, para determinar su condición somática o familiar. 2. No existen programas oficiales -ya en funcionamiento en otros países- que permitan el diagnóstico precoz. 3. Los factores de riesgo ambientales no están plenamente establecidos.
El trabajo objeto de este texto se enmarcó dentro de los objetivos de “control del riesgo” y “detección temprana” propuestos por la Organización Mundial de la Salud y está en concordancia con las políticas de salud -del Plan Nacional Para el Control del Cáncer 2010-2019 (Cancerología, 2010) emanadas del Ministerio Colombiano de la Protección Social.
En cumplimiento del objetivo de evaluar los genes: MLH1, MSH2 -del grupo MMR-, APC, MUTYH y SMAD4, en una muestra de 1.278 pacientes colombianos con CCR, utilizando métodos moleculares, para evidenciar el componente genético particular de los casos con agregación familiar (casos índice), se utilizó la información derivada de las entrevistas para identificar los pacientes que cumplían con los criterios de Ámsterdam y Bethesda para síndromes de Lynch y poliposis familiar. Se extendieron los familiogramas de los casos índice, con el fin decidir a quiénes se les debían secuenciar los genes MMR y, entre los pacientes con poliposis, a los que se les debían secuenciar los MUTYH y APC. Las mutaciones encontradas en los casos índice se replicaron en los familiares informativos de las respectivas familias, con el fin de explorar la interacción genotipo-fenotipo e informar a los médicos tratantes para estudios confirmatorios. En los casos de las variantes nuevas se establecieron las predicciones funcionales de patogenicidad in silico, con el fin de ofrecer a la comunidad científica y médica una nueva posibilidad diagnóstica en las familias con síndrome de CCR con agregación familiar.
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ar Los resultados del trabajo permitieron fortalecer la investigación en el Grupo de Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones (GCFEP), el cual cuenta en la actualidad con un laboratorio dotado de modernos equipos y de personal capacitado para la implementación de procedimientos de inmunohistoquímica y genética molecular.
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Capítulo 3
MATERIALES Y MÉTODOS
Fuente: Autores
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3.1. Aprobaciones éticas
El programa “Análisis genético de enfermedades humanas” y el proyecto CHIBCHA (Genetic study of Common Hereditary Bowel Cancers in Hispania and the Americas),
en los que se inscribió el trabajo, contaron con la aprobación ética y bioética de la Universidad del Tolima y de las entidades de salud de donde provenían los pacientes (I.P.S – E.P.S). El consentimiento informado fue elaborado teniendo en cuenta la reglamentación internacional (http://www.wma.net/en/10home/index.html) y las regu- laciones nacionales al respecto.
En este sentido, se presentó a los participantes una carta de información que describe de manera clara y concisa los objetivos y alcances de la vinculación en la investigación; el protocolo de investigación y sus anexos fueron presentados para evaluación bioética y científica en los diferentes centros e instituciones hospitalarias vinculadas, en las regiones de Antioquia, Bogotá, Zona Cafetera, Tolima, Huila y Nariño, con el fin de cumplir los requisitos pertinentes para la aprobación del consentimiento informado, entrevista y toma de muestras. (Anexo C).
3.2. Selección de pacientes
Tanto en los consultorios de oncología como en los laboratorios de patología se seleccionaron pacientes con CCR (adenocarcinoma) diagnosticados del 2008 al 2013. Entre los criterios de inclusión se tuvieron en cuenta el haber sido diagnosticado con CCR en los últimos dos años, a partir del inicio de la toma de muestras (2010) y presentar reporte de
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ar patología conclusivo de malignidad. Se excluyeron los pacientes que presentaban cáncer de ano de tipo cloacogénico o neuroendocrino.
Una vez seleccionado el paciente, este se contactó, se le presentó la carta de información de la investigación, se aplicó el consentimiento informado y se diligenció la entrevista, la cual incluye datos demográficos, pedigrí y reporte de anatomía patológica, de acuerdo con el protocolo diseñando para tal fin en el laboratorio del GCFEP. Los documentos se conservan en custodia, en archivos tanto físicos como digitales (escaneados), en las instalaciones del laboratorio del GCFEP, en la Universidad del Tolima.
Los pacientes se seleccionaron en los centros oncológicos, hospitales, E.P.S (empresas sociales del estado), I.P.S (instituciones prestadoras de salud) y laboratorios de patología, de las ciudades de Ibagué, Neiva, Bogotá, Medellín y Pasto. Adicionalmente, a través de una colaboración con el Instituto Nacional de Cancerología (INC), se incluyeron pacientes de Barranquilla, Santa Marta, Cartagena y Cali.
3.3. Muestras de sangre periférica
Las muestras de sangre se tomaron por venopunción convencional y se almacenaron en tres tubos tapa lila (anticoagulante EDTA), previa anonimización, mediante la asignación de un código de identificación por ciudad. Todas las muestras se almacenaron a menos 20°C, pasando a formar parte de la colección de muestras bajo custodia del GCFEP, de acuerdo con los protocolos de procedimiento diseñados para manejo de muestras biológicas.
3.4. Selección de familias
Luego de la recepción, codificación y anonimización de las entrevistas y muestras de cada paciente, se procedió a realizar la tabulación de datos relevantes para el trabajo, que incluyen: edad, genero, tipo de adenocarcinoma, localización, criterios histológicos, familiograma y aplicación de los criterios clínicos para síndromes de CCR con agregación
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familiar, luego de lo cual se determinó cuáles de los pacientes cumplían con los criterios positivos para síndromes polipósicos o de Lynch (Ámsterdam I – II y Bethesda) (figura 2). Con dichos pacientes, se procedió de la siguiente manera: 1- Se informó al médico tratante, a través del cual se recontactó al paciente. 2-Previo consentimiento informado del paciente, y con su ayuda, se invitó a participar de la investigación a los parientes en primer y segundo grado, afectados o no por la enfermedad, y al resto de personas afectadas en la familia, sin importar el grado de consanguinidad. 3- A estas personas se les entregó la carta de información y se les diligenció el consentimiento informado de pacientes o de controles, según el caso 4- Con cada una de las muestras utilizadas en el estudio, se cumplió con las exigencias de protección de datos personales que se establecen en el consentimiento informado asociado a ellas.
Ámsterdam I Ámsterdam II
Al menos 3 familiares afectados con cáncer colorectal.
Al menos 3 familiares con síndrome de Lynch, CCR, cáncer de endomtrio, ovario, riñón,
uréter o intestino delgado.
Al menos uno de los familiares debe ser pariente en primer grado de los otros
dos.
Al menos uno de los familiares debe de ser pariente en primer grado de los otros dos.
Deben estar afectados por lo menos dos generaciones sucesivas.
Deben estar afectados por lo menos dos generaciones sucesivas.
En uno de los afectados el CCR debe presentarse antes de los 50 años.
En uno de los afectados el CCR debe presentarse antes de los 50 años.
Bethesda Bethesda Modificados
Individuos con cáncer en familias que cumplen con los criterios de Ámsterdam.
Individuos con cáncer en familias que cumplen con los criterios de Ámsterdam.
Individuos con dos cánceres asociados a HNPCC, incluidos CCR sincrónicos y
metacrónicos.
Individuos con dos displasias asociadas a HNPCC incluyendo CCR sincrónicos,
metacrónicos y cánceres extracolonicos (endometrio, ovario, gástrico, hepato-biliar,
intestino delgado, uréter o pelvis renal)
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arIndividuos con CCR y un familiar de
primer grado con CCR y/o cáncer extracolonico asociado a HNPCC y/o un adenoma colorectal, uno de los cánceres
diagnosticados antes de los años y el adenoma diagnosticado antes de los
años.
Individuos con CCR y un familiar de primer grado con CCR y/o cáncer extracolonico
asociado a NHPCC y/o un adenoma colorectal, uno de los cánceres diagnosticados
antes de los 50 años y el adenoma antes de los 40 años.
Individuos con CCR, o cáncer de endometrio diagnosticado antes de los
45 años.
Individuos con CCR o cáncer de endometrio diagnosticado antes de los 50 años.
Individuos con CCR localizado en el lado derecho, con patrón no diferenciado, diagnosticado antes de los 45 años.
Individuos con CCR del tipo células en anillo de sello (con más del 50% de células de este
tipo) diagnosticado antes de los 50 años.
Individuos con CCR del tipo célula en anillo de sello, diagnosticado antes de los
45 años.
Individuos con adenoma diagnosticado antes de los 40 años.
Figura 2. Criterios diagnósticos Síndrome de Lynch, adaptado y traducido de Rodríguez, Bigas et, al.
3.5. Extracción y cualificación de ADN
El ADN de sangre periférica se extrajo con el equipo de extracción automatizada Maxwell 16 y los kits Promega-Maxwell (ref. AS1011), usando las recomendaciones del fabricante, las cuales están detallados en el sitio web de Promega: http://worldwide.promega.com/products/dna-and-rna-purification/genomic-dna-purification-kits/maxwell-16-system-dna-purifi cation-kits/maxwell-16-blood-dna-purification-kit/.
Para este proceso de purificación de ADN (S. C. Tan & Yiap, 2009) se utilizan 430 μl de sangre completa o 250 de buffy coat, que se procesan en tandas de 16 muestras por 36 minutos. El proceso se basa en la utilización de las partículas magnéticas que se unen a los ácidos nucleicos de la muestra, permitiendo su separación mediante la atracción de estos por una barra metálica magnetizada; esto optimiza el proceso de purificación, evitando los restos de reactivos y proteínas que acompañan el ADN. El protocolo implica una fase de lisis y otra de purificación, en la que las barras magnéticas atrapan el ADN unido a las perlas hacia el buffer de elución; un cambio en los campos magnéticos libera el ADN. El volumen final es de
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120 microlitros, con un rendimiento promedio de 50 nanogramos (ng) /microlitro (µl). El ADN obtenido se almacena a -20°C. Los procedimientos se realizaron de conformidad con los protocolos de procedimiento interno: preparación de muestras de sangre para purificación de ADN en el maxwell-16, y procedimiento para usar el maxwell-16 en la purificación de ADN a partir de sangre.
La cuantificación se realizó por métodos espectrofotométricos con un NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer. (Thermo-Fisher, 2013). Este método, mide la absorbancia a las longitudes de onda UV y visible; tiene un rango de detección de 2 a 3700 ng/µl de ADN de doble cadena y requiere de 1,5 a 2 µl de la muestra sin diluir. Dicha muestra se coloca en el pedestal del NanoDrop y este mide la absorbancia a 230 nm, 260 nm y 280 nm, teniendo en cuenta que el ADN presenta su máxima absorbancia a 260 nm. Para determinar la concentración, se aplica la formula ADN (μg/μL) = (Abs260 x FD x 50) /1000, donde: Abs260 es la absorbancia de la muestra a 260nm; FD el factor de dilución de la muestra; 50 el factor que indica una absorbancia de 1,0, si se tienen 50 μg/mL de ADN de doble cadena y 1.000 como factor de conversión de ml a μl.
El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda mínima de absorbancia del ADN) está influenciado por la cantidad de sales presentes en la muestra, y la longitud de onda a 280nm es específica para las proteínas. Como consecuencia, atendiendo a las relaciones de absorbancia a 260/280 y 260/230, se puede establecer el grado de pureza de la muestra.
Los procedimientos se realizaron de conformidad con los protocolos internos: 1- General, para el uso del nanodrop nd-2000. 2- Para cuantificar ADN empleando el nanodrop ND-2000. 3- Para el uso de las micropipetas y 4- Normas de bioseguridad para trabajar en las áreas de purificación y cuantificación de ácidos nucleicos.
Al 10% de las muestras se les realizó la cuantificación mediante Qubit como control de calidad y se verifico su calidad mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, con bromuro de etidio.
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ar 3.6. Evaluación del perfil genético (línea germinal)
Este procedimiento se realizó utilizando para el análisis el ADN de los casos índice y el de sus parientes más informativos, seleccionándolos entre los que quisieron participar, a partir de los familiogramas. En algunos casos se contaba con ADN proveniente de tejido fresco, cuya calidad fue adecuada para el desarrollo de esta metodología.
Para la secuenciación de 250 exones de los genes APC, KRAS, TP53, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, POLE, POLD1, BUB1, SMAD4, LKB1, PTEN, MUTYH, STK11, se utilizó la tecnología “Fluidigm®” para el sistema de secuenciación masivo “Access ArrayTM” de la casa comercial Illumina http://www.fluidigm.com/access-array-system.html, el cual facilita la amplificación paralela de 48 muestras, generando 48 librerías para secuenciación. Cada reacción combina una muestra que se ha amplificado y etiquetado para ser compatible con los equipos de secuenciación de última generación y, además, con una identificación propia (código de barras o barcode).
Este procedimiento se realizó en el análisis del ADN de los casos índice, en el de los parientes (afectados o no) y en el de los casos con tejido fresco accesible para esta metodología.
Para llevar a cabo este proceso, las secuencias de los genes de interés reportadas en el Genome Browser de la Universidad de California Santa Cruz (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) se descargaron en formato FASTA, y se utilizó la herramienta bioinformática Primer 3Plushttp://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/ para realizar el diseño de un total de 442 pares de cebadores, de aproximadamente 24 pares de bases, a una temperatura de alineamiento de 59 a 61ºC. El producto de amplificación de cada cebador fue de entre 260 y 340 pares de bases, con el fin de abarcar completamente los exones de los genes mencionados. (Anexo D).
Para lograr la generación de "contigs" por solapamiento se dejaron aproximadamente 70 pb extra al inicio y final de la secuencia de interés. Se realizó una PCR in silico y se verificó que no se presentaran SNP
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comunes que pudieran interferir en el alineamiento para la PCR, usando las herramientas bioinformáticas de la Universidad de California, en San Francisco http://genome.ucsc.edu/. Previo a su síntesis, a cada cebador se le adicionó una secuencia barcode estándar en el extremo 5', CS1 para el cebador directo y CS2 para el reverso, específicas para la preparación de librerías de Illumina (Access Array-Generate Tagged Primers Workbook Fluidigm 100-3873). Luego de su diseño y síntesis, los cebadores fueron validados y su amplificación se confirmó por medio de un bioanalizador (Agilent 2100 Bionalyzer).
Posteriormente, se adicionó una secuencia de código de barras específica para cada cebador forward (CS1) y reverse (CS2), diseñada específicamente para ser usada con la librería de códigos de barras de Illumina (Access Array-Generate Tagged Primers,xls Workbook Fluidigm 100-3873). Finalmente, los cebadores fueron validados y su amplificación confirmada, por medio de un bioanalizador (Agilent 2100 Bionalyzer).
La solución de los cebadores se realizó a 20X; posteriormente, fueron mezclados para formar 48 mix de 10 pares de cebadores cada uno, teniendo en cuenta que el blanco de amplificación de cada uno estuviese a unas 1000 bases de distancia.
Los cebadores tuvieron una concentración inicial de 50uM y se agruparos en 48 mezclas o "primer-pools" de entre 9 y 10 pares, teniendo en cuenta que no produjeran dímeros o solapamiento de productos, para lo cual los cebadores de un mismo gen o exón se ubicaron en diferentes grupos, tratando de generar una distancia de al menos 5kb entre secuencias. Para generar los "primer-pools" se utilizaron 2 μl de cada primer y los reactivos descritos en la Tabla 3A, para un volumen final de 100 μl y una concentración de 1 μM de cada cebador.
Para la preparación de las muestras se realizó un pre-mix de reactivos (Tabla 3B); se distribuyeron 4 μl de este pre-mix en 48 pozos y se adicionó 1 μl de ADN, previamente normalizado a concentración de 50ng/ μl. Antes del montaje de las muestras se realizó una preparación del microchip, para lo cual se adicionaron 500 μl de solución Harvest Access Array 1X en los pozos H1 y H2 del microchip (Figura 3), y se realizó una pre PCR en el equipo IFC Controller AX, seleccionando la función Prime (151x).
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Figura 3. Access Array 48-48 IFC (High-throughtput LP 48-48 IFC).
Posteriormente, y evitando la formación de burbujas, se agregaron 4 μl de cada una de las muestras, utilizando una micropipeta multicanal en las primeras tres filas de pozos del array IFC (High-throughtput LP 48-48IFC, Figura 3) y en el segundo grupo de tres filas de pozos. Se adicionaron 4 μl de cada uno de los 48 "primer-pools" realizado con los cebadores. El microchip fue llevado al equipo pre-PCR IFC controller AX, para realizar la inyección de las muestras y cebadores, seleccionando en el array con la función Load Mix (151x). Al finalizar, el chip se llevó al equipo termociclador FC1 Cycler, seleccionando la opción de PCR protocolo estándar, con la cual es posible generar más de 23 mil reacciones de PCR en un solo array.
Una vez finalizado el proceso de PCR, se realizó la “cosecha” ("harvesting") de los segmentos amplificados. Para ello se removió la solución de Access Array Haverest 1X de los pozos, y se reemplazó por 600 μl de solución nueva. Se adicionaron 2 μl de solución Access Array Haverest 1X en cada pozo de muestras y se llevó al equipo de IFC Controller AX de post-PCR.
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Tabla 3. Protocolo para amplificación - Sistema Acces
A) Dilución y mezcla de cebadores ("primer pooling")
Volumen (μl) Concentración final
50 μM CS1-Tagged TS Forward Primer
2.0 1 Mm
50 μM CS2-Tagged TS Reverse Primer
2.0 1 Mm
20X Access Array Loading Reagent (Fluidigm) 5.0 1X
PCR Certified Water (TEKnova) 91.0
Volumen total 100.0
B) Preparación del “Sample Pre-Mix”
Volumen por Reacción (μl)
Volumen 60 Reacciones
(μl)
Concentración final
10X FastStart High Fidelity Reaction Buffer without
MgCl2 (Roche)0.50 30.0 1X
25 mM MgCl2 (Roche) 0.90 54.0 4.5 Mm
DMSO (Roche) 0.25 15.0 5%
10 mM PCR Grade Nucleotide Mix (Roche) 0.10 6.0 200 Mm
5 U/μL FastStart High Fidelity Enzyme Blend
(Roche)0.05 3.0 0.05 U/Ml
20X Access Array Loading Reagent (Fluidigm) 0.25 15.0 1X
PCR-Certified Water (TEKnova)
0.95 57.0
Volumen total 3.0 180.0
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Finalizado el proceso se recuperaron los productos de amplificación de la placa (480 amplicones por muestra) y se colocaron en placas de 96 pozos, trasfiriendo 10 μl del producto de PCR “Harvested”.
Los productos de amplificación “Harvested” se diluyeron 100 veces, adicionando 1 μl del producto de amplificación a 99 μl de agua certificada para PCR. Posteriormente, para la unión de las secuencias amplificadas con los códigos de barras, se preparó el pre mix (Tabla 4A) y, una vez distribuido en los 48 pozos correspondientes, se adicionó cada una de las muestras y códigos de barras (Tabla 4B). Esta mezcla de reacción fue llevada a un termociclador BioRad C1000 para la amplificación, usando el perfil térmico descrito en la Tabla 4C.
Tabla 4. Sistema Acces Array - Adición de códigos de barras
A) Preparación del “Sample Pre-Mix”
Volumen por Reacción
(μl)
Volumen 60 Reacciones
(μl)
Concentración final
10X FastStart High Fidelity Reaction Buffer without
MgCl2 (Roche)2.0 120.0 1X
25 mM MgCl2 (Roche) 3.6 216.0 4.5 mM
DMSO (Roche) 1.0 60.0 5%
10 mM PCR Grade Nucleotide Mix (Roche)
0.4 24.0 200 μM
5 U/μL FastStart High Fidelity Enzyme Blend
(Roche)0.2 12.0 0.05 U/μL
C) Preparación de las muestras para PCR
Volumen por Reacción (μl)
Concentración final
Sample Pre-Mix (B) 3.0
50 ng/μL Genomic DNA 1.0 10 ng/μl
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PCR-Certified Water (TEKnova)
7.8 468.0
Volumen total 15.0 900.0
B) Adición de códigos de barras Volumen (μl)
Sample Pre-Mix 15.0
Access Array Barcode Library for Illumina Sequencers - 384 (Single Direction)
4.0
Diluted Harvested PCR Product Pool 1.0
Total 20.0
C) Condiciones de amplificación
Número de ciclos Temperatura Tiempo
1 95°C 10 min
15
95°C 15 seg
60°C 30 seg
72°C 1 min
1 72°C 3 min
Por último, se realizó la purificación y cuantificación del amplicón post – PCR. Para ello se preparó una solución de etanol al 70% (para 15mL: 7ml de etanol al 100% y 3ml de agua certificada para PCR). Se preparó una mezcla de las 48 muestras amplificadas, previamente marcadas con sus correspondientes códigos de barras, adicionando 1 μl de cada muestra amplificadas, y se homogeneizó, pipeteando 10 veces. Se tomaron 12 μl del pool anterior, se agregaron 24 μl de búfer TE y 36μl de perlas Ampure XP (previamente homogeneizadas por vórtex). La mezcla se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente, se agitó y se colocó en un separador magnético durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante. Se adicionaron
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ar 180 μl de etanol al 70% y se homogeneizó por vórtex durante 5 segundos. Se repitió el procedimiento para un total de dos lavados. Las perlas se dejaron secar por 10 minutos y se adicionaron 40 μl de búfer de suspensión de ADN y se agitó por 5 segundos, se colocó el tubo sobre el separador magnético y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo.
Las librerías finales fueron cuantificadas mediante el equipo Agilent 2100 Bioanalyzer, usando 1 μl de muestra y 3 μl de búfer de corrida HS. El tamaño de los fragmentos amplificados fue de entre 200 y 400 pares de bases, con los picos más altos en 300pb.
Posteriormente, la secuenciación se realizó en la Facultad de Secuenciamiento de ADN de la Universidad de California-Davis (UC DNA Sequencing Facility), usando el sistema de secuenciamiento MIseq® de Ilumina, y se obtuvieron aproximadamente 416 mil lecturas por muestra.
La demultiplexación ("demultiplexing") fue realizada en la core facility de la Universidad de California Davis, a partir de las secuencias de los códigos de barras utilizados para cada muestra. Se realizó un control de calidad (FASTQ) para verificar la calidad de las secuencias y detectar posibles problemas durante la preparación de las librerías o de la secuenciación. Luego de pasar el control de calidad FASTQ, se realizó el alineamiento (usando el programa BWA-MEM con el genoma humano (hg19)) y la evaluación del rendimiento (NGSrich). Se analizó la cobertura del secuenciamiento y el llamado de las variantes con significado funcional en el programa Varscan2. Finalmente, se realizaron las anotaciones de dichas variantes, teniendo en cuenta las bases de datos dbSNP137, 1000 genomes, ESP6500, COSMIC, SIFT, PolyPhenv2 y Condel, mediante el software ANNOVAR. Las variantes candidatas fueron manualmente verificadas utilizando el programa IGV (integrative genomic viewer). Posteriormente, las secuencias candidatas, patogénicas, se confirmaron con primers diseñados para PCR convencional, y las secuencias obtenidas mediante el método de Sanger fueron manualmente inspeccionadas en el software 4Peaks Version 1,7,1 para Mac. (Copyright 2006 Mek&Tosj.com). Todos estos procedimientos se realizaron en el Centro de Genómica de la Universidad de California-Davis (UC-Davis), a cargo del doctor Luis Guillermo Carvajal Carmona, con el apoyo del personal de bioinformática. (San Lucas, Wang, Scheet, & Peng, 2012).
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3.7. Análisis estadístico
Toda la información consignada en las entrevistas y el reporte de patología se tabuló en una hoja de cálculo de Excel, teniendo en cuenta las variables de edad, género, diagnóstico clínico, localización, tipo de resección, tipo de tumor, estado TNM, número de ganglios linfáticos reportados y presencia de pólipos y tumores sincrónicos o metacrónicos. Posteriormente, se incorporaron los datos moleculares de MSI, IHC y las variantes génicas, tanto para familias como para pacientes. El análisis fue descriptivo y se contrastó la presencia de mutaciones respecto de las características clínicas y demográficas de los pacientes y controles portadores.
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Capítulo 4
RESULTADOS
Fuente: Freepik.es
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4.1. Características demográficas de la muestra
4.1.1. Región de procedencia
Se incluyeron 1.278 pacientes con reporte de patología de neoplasia maligna, y se excluyeron del análisis los casos con pólipos adenomatosos, hiperplásicos o hamartomatosos, que representaron el 0,9% (115). En la tabla 5 se aprecia la distribución de los pacientes captados en las diferentes regiones del país, por razones de logística y convenios.
Tabla 5. Distribución por región pacientes CCR
Región Casos N Porcentaje %
Norte 135 10,6
Noroccidente 308 24,1
Nororiente 380 29,7
Centro 338 26,4
Suroccidente 117 9,2
Total 1278 100%
Fuente: los autores
Las ciudades escogidas son todas capitales, a las cuales se remiten los diferentes pacientes para diagnósticos y tratamientos definitivos; las de mayor número de pacientes son Medellín (29%), Ibagué (21%) y Bogotá (18%). Esto obedece, entre otras causas, al hecho de que en estas ciudades se contó con un mayor apoyo logístico del cuerpo médico y a alianzas institucionales, como en el caso del INC y de los Hospitales Federico Lleras,
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Figura 4. CCR: Distribución por género y ciudad.
Fuente: los autores
B/quilla
CCR - Distribución por género y ciudad
Porc
enta
je
30.0
20.0
10.0
0.0Bogotá B/manga Cali C/gena Ibagué Medellín Neiva Pasto S/marta Eje
cafetero
La distribución por grupo etario, evidenció que el 30,8% (n=394) de los pacientes tenía entre 60 y 69 años y el 27,2% (n=347) entre 50 y 59 años (Figura 5). Llama la atención el hecho de que 339 pacientes (26,5%) presentaron CCR a una edad menor o igual a 50 años.
menor a 40 40 a 49 50 a 59 60 a 69 70 y más
CCR - Distribución por grupo etario
Núm
ero
de c
asos
3025201510
50
Figura 5. CCR: Distribución por grupo etario.
Fuente: los autores
de Ibagué, y Pablo Tobón Uribe, de Medellín, las cuales no siempre son fáciles de coordinar.
4.1.2. Género y edad
El CCR se presentó en 680 pacientes del género femenino (53,2%) y en 598 hombres (46,8%). (Figura 4). Se evidencia una disparidad ligeramente mayor entre géneros en las ciudades con mayor número de pacientes muestreados, como Medellín, Ibagué y Bogotá, aunque en las ciudades con menor cantidad de pacientes muestreados la diferencia fue proporcionalmente inferior.
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La media para la edad de diagnóstico fue de 57,43 años (rango 19-93), comportándose de manera similar en todas las ciudades, sin diferencias significativas entre géneros, con 56,95 años (rango 19-90) para las mujeres y 57,98 años (rango 20-93).
4.1.3. Aspectos clínico-patológicos
Distribución anatómicaLas frecuencias de localización respectiva de los tumores -teniendo
en cuenta únicamente los casos con el dato de localización fueron: recto (42,6%, n=397); región distal (30%) región proximal (27,3%). Si se tienen en cuenta todos los casos y cada una de las partes del colon, sigue predominando el recto como localización más frecuente (Figura 6).
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 450.0
CCR - Distribución por grupo etario
Sin dato
APÉNDICE CCAL
RECTO
SIGMOIDE
CIEGO
TRANSVERSO
DESCENDENTE
ASCENDENTE
Figura 6. CCR: Distribución anatómica detallada.
Fuente: los autores
4.1.4. Antecedentes familiares de cáncer
Un total de 155 pacientes (12,12%) reportaron antecedentes familiares de cáncer en primer y segundo grado; el 62,2% eran mujeres y el 37,4%, hombres; 57 pacientes con antecedentes de cáncer fueron menores de 50 años (Tabla 6).
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ar Tabla 6. Pacientes con antecedentes familiares de cáncer
Característica Pacientes (%) n=155
Edad
< 50 años 59 (38,1)
> 50 años 96 (61,9)
Promedio (rango) 52,7 (19 - 84)
Género
Mujer 97 (62,6)
Hombre 58 (37,4)
Tipo de tumor
Adenocarcinoma 141 (91)
Carcinoma mucinoso 14 (9)
Fuente: los autores
Entre los casos de CCR asociados con síndromes de agregación familiar se reportaron: tres casos de parientes con tumores sincrónicos, cuatro con tumores metacrónicos, dos con carcinoma de glándula mamaria, uno con carcinoma de tiroides, uno con carcinoma de células transicionales y uno con carcinoma de endometrio.
4.2. Síndromes familiares
Del total de casos, en los que se revisaron uno a uno los reportes de patología y las encuestas, y luego de la aplicación de los criterios para síndromes con agregación familiar (criterios de Ámsterdam, Bethesda, presencia de pólipos adenomatosos, hiperplásicos, hamartomatosos, etc.) o presencia del fenotipo MSI+ - BRAF-, se seleccionaron 69 familias, correspondientes al 5,4% del total de los casos (Tabla 7).
Si se tienen en cuenta los pacientes con antecedentes familiares de cáncer visceral asociado a síndromes, el porcentaje aumenta a 17,5% (224/1278).
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En relación con los casos índice de las familias a las cuales se les logró contactar y adicionar parientes al estudio, en Medellín se reportan 31 en Ibagué 17 y en Bogotá 10. Para los restantes casos índice, en 11 no hay parientes contactados, y sólo existen los datos de las entrevistas. En cuanto a los criterios clínicos, los más frecuentes fueron los de Bethesda, presentes en 42 familias.
Tabla 7. Síndromes familiares CCR – distribución por ciudad – criterios clínicos
CIUDAD# (%)
familiasCriterios clínicos # (%) familias
Medellín 31 (45)Ámsterdam 11 (16)
Ibagué 17 (24,6)
Bogotá 10 (14,5)Bethesda 43 (62)
Neiva 4 (5,8)
Bucaramanga 6 (8,7)Poliposis 15 (22)
Armenia 1 (1,4)
Total 69 Total 69
Fuente: los autores
Como se muestra en la Tabla 8, un total de 459 personas accedieron a participar en el estudio familiar, 52,9% fueron mujeres (n = 243) y 47,1% hombres (n = 216); de ellas un 71,7% correspondió a personas menores de 50 años (n = 329) y el 28,3% fueron mayores de 50 años (n = 130).
Tabla 8. Síndromes familiares CCR – distribución de individuos
Característica Personas (%) n=459
Edad
Edad < 50 años 329 (71,7)
Edad > 50 años 130 (28,3)
Edad promedio (rango) 36 (0 - 88)
Género
Mujer 243 (52,9)
Hombre 216 (47,1)
Fuente: los autores
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ar Del total de integrantes reportados en las familias, el 74% estaba fenotípicamente sano en el momento del estudio (n= 340); el 15,2% corresponde a los casos índice (n= 69); y el 11%, a los familiares con cáncer (n= 51) (Figura 7).
Familias CCR: distribución individuos n=459
Propósitus CCR
Fenotipicamente Sanas
Enfermos
74%
11% 15%
Figura 7. CCR: Distribución de individuos en familias.
Fuente: los autores
Excluyendo los casos índice, a partir de los familiogramas se obtuvo información de 51 personas con diagnóstico de enfermedades relacionadas con los síndromes asociados a CCR; de ellos, 22 son pacientes con adenomas, 14 con CCR, cuatro con cáncer de glándula tiroidea, tres con cáncer de glándula mamaria, dos con cáncer gástrico, uno con astrocitoma, uno con cáncer de próstata, uno con cáncer de laringe, dos con cáncer de piel y uno con hiperplasia endometrial simple sin atipias. Además, se reportaron 20 personas fallecidas por CCR en estas familias. (Figura 8).
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117
CCR - Distribución por grupo etario
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Casosíndice
PorcentajeNúmero
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1622
1014
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Cáncer deglándulamamaria
Cáncergástrico Otros Fallecidos
por CCR
10 20 30 40 50 60 70 80
Fallecidos por CCR
Otros
Cáncer gástrico
Cáncer de tiroides
CCR
Adenomas
Casos índice
Cáncer de glándulamamaria
34
23
12
46
1420
Figura 8. Distribución de enfermos en familias CCR
Fuente: los autores
4.2.1. Perfil molecular síndromes familiares
Inicialmente, para probar las mutaciones con la metodología de secuenciación de nueva generación, se seleccionaron los casos índice, los pacientes con antecedentes de cáncer y los menores de 50 años. Los genes evaluados son de alto riesgo para síndromes de cáncer con agregación familiar, como se puede apreciar en la tabla 9.
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Los casos índice presentaron un total de 48 mutaciones, la mayoría de ellas missense (30), 13 stop, tres indels, dos splicing. Las mutaciones nonsense que producen un codón de parada y, por lo tanto, cambios funcionales en la proteína se encontraron en los genes asociados a síndromes de herencia mendeliana y de alto impacto fenotípico, como APC, MLH1, MSH2, PTEN y SMAD4 (Tabla 10).
Tabla 10. Mutaciones encontradas en los casos índice, para 12 genes de riesgo examinados, asociados a síndromes de cáncer con agregación familiar.
Gen Tipo de mutación
Total Nonsense Missense Indels Splicing
APC 1 5 6
MLH1 1 8 9
MSH2 8 2 1 2 13
MSH6 1 1
MUTYH 1 1
PMS2 1 3 4
POLD1 2 2
POLE 6 6
PTEN 1 1
SMAD4 1 1
STK 11 2 1 3
TP53 1 1
TOTAL 13 30 3 2 48
Fuente: los autores.
Los genes con mayor proporción de mutaciones fueron, en su orden: MSH2, con 13; MLH1, con nueve; y APC y POLE, con seis. Como era de esperarse, los genes del grupo MMR (MSH2 y MLH1), asociados a síndrome de Lynch, presentan el mayor número de mutaciones. Teniendo en cuenta reportes en otros tipos de cáncer, se incluyeron en el estudio otros genes: POLE, STK11, POLD1, SMAD4 y PTEN, que también presentaron mutaciones,
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A pesar de ampliar el rastreo de mutaciones en los genes asociados a CCR con agregación familiar y de realizar una búsqueda en múltiples exones de los genes blancos, solo 14 casos índice presentaron mutaciones específicas para dichos los genes.
Las familias que no presentaron las mutaciones examinadas fueron 55, constituidas por 321 personas afectadas, con un promedio de edad de 38,1 años (173 mujeres y 148 hombres). Como se puede apreciar en la tabla 11, el 67% (217/321) corresponde a personas menores de 50 años. La mayoría de las familias (65%) tiene criterios clínicos de Bethesda (37/55); el 43% de estos pacientes con criterios Bethesda presentó el CCR antes de los 50 años (16/37); el 37,8% tiene familiares con CCR (14/37); el 54%, familiares con tipos de cáncer extracolónicos relacionados con Síndrome de Lynch (20/37); el 86% presenta historia de cáncer en 1ª o 2ª generación (32/37); y solo 13,5% de los pacientes no reporta antecedentes familiares de cáncer (5/37). Cabe resaltar que se reportan malignidades asociadas a Síndrome de Lynch, a saber: CCR de tipo histológico mucinoso, cáncer gástrico, carcinoma de endometrio, y otros no frecuentemente asociados, como cáncer de testículo, de próstata, de tiroides y astrocitoma.
Las familias con criterios de Ámsterdam fueron cinco, con mínimo tres casos de CCR en la familia, y compromiso en menores de 50 años en al menos dos generaciones. El 25% de ellas correspondió a familias con poliposis (14/55), que presentan CCR, adenomas y pólipos hiperplásicos, y más de un miembro de la familia afectado. El detalle de estas características se puede apreciar en la tabla 11.
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ar El análisis comparativo de las variables clínicas de los pacientes con antecedentes familiares de cáncer, incluidos los casos índice sin mutaciones, mostró diferencias significativas al comparar la edad en el rango de menores de 50 años con el grado histológico alto (19,4% vs 1%; p=0,000). Igual sucede con el tipo histológico mucinoso (5,8% vs 0). Las otras variables no presentaron diferencias estadísticamente significativas.
4.2.2. Mutaciones en genes conocidos encontradas en 20 pacientes con CCR y agregación familiar
En la tabla 12 se pueden apreciar las características clínicas y moleculares relacionadas con las mutaciones germinales asociadas a los síndromes descritos en 20 pacientes, la mayoría de los cuales, 80%, (16/20) fueron diagnosticados con CCR a los 50 años o menos, independientemente del síndrome o de la mutación presentada. En cuanto a los antecedentes familiares, también el más frecuente fue el CCR, seguido de los síndromes extracolónicos relacionados con síndrome de Lynch, como los que afectan estómago, páncreas y endometrio. En el momento de obtener la información familiar, los parientes con estos tipos de tumor ya habían fallecido en su mayoría. Otro cáncer identificado en los antecedentes fue el carcinoma papilar de tiroides.
De las 20 muestras analizadas, se tienen resultados del análisis de los tumores para siete, en cuanto al perfil MSI / IHC, de los cuales el 85% (6/7) presentó inestabilidad microsatelital y ninguno presentó perdida de la expresión de MLH1. No se realizaron las pruebas de MSI e IHC-MLH1 a 13 pacientes, debido a la imposibilidad de contar con tejido tumoral.
Los antecedentes familiares predominantes son los relacionados con los criterios de Bethesda (menores de 50 años, familiares afectados), 35%, (7/20), seguidos de los pacientes con varias generaciones afectadas por CCR, 30%, (6/20) (Ámsterdam). Con los pacientes con antecedentes desconocidos fue imposible el contacto posterior para ampliar la historia clínica. Solo un paciente con CCR, menor de 50 años, no tenía antecedentes
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de cáncer. El análisis de las mutaciones fue repetido al menos tres veces, y fue validado con muestras conocidas y probadas en los controles (n=200) del proyecto CHIBCHA, conformadas por personas sanas, mayores de 55 años, con los siguientes criterios de inclusión: que no padeciesen o hubiesen padecido de cáncer visceral y que no tuviesen antecedentes de cáncer en primero ni segundo grado de consanguinidad, luego de lo cual se excluyó de los siguientes análisis la mutación en PMS2.
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ar Luego de validadas, las variantes se buscaron en los parientes de los casos índice de los que se disponía muestra. Al analizar los porcentajes de las mutaciones en los afectados y los fenotípicamente sanos de las familias, se evidenció que de los 138 miembros de las familias en los que se probaron las diferentes variantes genéticas en estudio, el 22%, (29/138) es portador de una mutación y está afectado por la enfermedad, mientras el 15,9% (22/138) es portador de la mutación y no ha presentado la característica clásica de la enfermedad. Cabe anotar, que la edad media es de 32 años, con un rango de 9 a 46 años.
El detalle por mutación específica se puede apreciar en la tabla 13.
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La clasificación clínica de los pacientes indicaba que el 78% (54/69) de los casos índice de las familias presentaban el síndrome, teniendo en cuenta únicamente los criterios de Ámsterdam y Bethesda (tabla 7). Sin embargo, solo 13 casos índice o menores de 50 años con antecedentes familiares de cáncer presentaron mutaciones en algunos de los genes implicados en el síndrome (MLH1, MSH2). No se pudieron correlacionar todos los pacientes con los resultados de MSI o IHC, debido a que, en la mayoría de los casos, no se disponía de material tumoral de los pacientes. (Tabla 12).
En el análisis por mutación se evidenció que el gen MSH2 es el más frecuentemente afectado por variantes patogénicas (Clase 5), tanto en los casos índice, con siete pacientes, como en los CCR de inicio temprano y/o antecedentes de cáncer, con tres casos, en los cuales predominaron las mutaciones tipo nonsense (ocho casos), que producen codones prematuros de parada y, por lo tanto, proteínas no funcionales; las restantes corresponden a un tipo splicing y a un corrimiento del marco de lectura frameshit.
MLH1 presentó mutaciones en un caso índice y en dos casos menores de 50 años; dos de las mutaciones son tipo splicing y una nonsense. Dos de las mutaciones son reportadas como patogénicas clase 5, y la otra no ha sido clasificada aún.
Las mayoría de las variantes han sido reportadas y cumplen los criterios de patogenicidad establecidos por paneles de expertos, y han sido publicadas en las bases de datos del NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ y del InSight http://insight-group.org/variants/classifications/, excepto dos mutaciones en MSH2 c.2458+1G>T (splicing) y c.528_529delins-TG (frameshit), que son variantes nuevas en clasificación. Una mutación en MLH1 c.545+1G>C, aunque tiene reporte en el NCBI, no presenta aún clasificación de patogenicidad. Se intentó por análisis in silico caracterizar estas variantes con los software “Human Splincig Finder” http://www.umd.be/HSF/HSF.html y Net-Gene2 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2 sin resultados conclusivos.
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El aminoácido afectado con mayor frecuencia fue la glicina. Los resultados de comparar con otros estudios muestran que la mayoría de las referencias describen las características fenotípicas y los afectados en las familias, como se describirá en la discusión. Los detalles genotípicos se muestran en la tabla 14.
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Al encontrar la variante de MSH2 c.1552C>T(p.Gln518*) en tres familias no relacionadas, se realizaron investigaciones genealógicas que identificaron ancestros comunes en dos de estos pacientes. Los ancestros comunes provenían de Carolina del Príncipe, un municipio del norte antioqueño. Se procedió a probar esta variante en los casos de CCR nacidos en Carolina del Príncipe y municipios aledaños, entre ellos: Angostura, Guadalupe, Gómez Plata y Santa Rosa de Osos (16 pacientes en total), y también en aquellos pacientes con padres o abuelos de la misma región examinada (76 pacientes).
Para verificar la exclusividad de la mutación en los pacientes, se tipificaron 50 controles fenotípicamente sanos, nacidos o con padres o abuelos nacidos en los municipios mencionados, los cuales fueron seleccionados de la base de controles del proyecto CHIBCHA, pero no se encontró ninguno control positivo para dicha variante. Además, se destaca que ha sido reportada en casos de CCR de Europa y, de acuerdo con la revisión de literatura, este trabajo constituye el primer reporte para Colombia.
Los pacientes no se conocían entre sí. Tanto ellos como sus padres y abuelos paternos nacieron en Carolina del Príncipe. (Paciente 1. D-2- 275 – familia: D-3-30, paciente 2. I-2-202). Gracias al estudio genealógico se logró conectar a las abuelas materna y paterna de estos dos pacientes como hermanas. (Paciente 3. D-2-196, familia D-3-30, perdió contacto con la familia). Como se observa en la figura 9, hay miembros afectados en dos generaciones consecutivas.
En cuanto a las características clínicas, cumplen visiblemente los criterios de síndrome familiar, así: D-2-275 es un hombre de 60 años que asistió al médico por pérdida de peso, anemia, sangrado rectal; se diagnosticó adenocarcinoma de bajo grado con componente mucinoso en colon trasverso, se le realizó colectomía derecha, reportando estado IIB; este paciente tiene un hermano fallecido que fue diagnosticado con CCR a los 58 años y un sobrino con CCR a los 40 años. El segundo paciente,
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codificado como I-2-202, es un hombre de 48 años que consultó por dolor abdominal y se le diagnosticó adenocarcinoma sincrónico de bajo grado en recto, estado IIB, sin antecedentes de cáncer; no sabe de su familia hace 30 años. El tercer paciente D-2-196 es una mujer de 46 años que consultó por dolor abdominal y se le diagnosticó un adenocarcinoma de bajo grado en ciego, con colectomía derecha, estado IVA y metástasis hepática, tiene un hermano fallecido por CCR a los 50 años y su madre falleció a los 58 años con cáncer de cuello uterino.
Las genealogías que permitieron relacionar los ancestros comunes en dos de los pacientes. Se presentan en la figura 9. Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
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Figura 9. Síndrome de Lynch: mutación MSH2 c 1552C>T. Familias extendidas- D-2-275 e I-2-202.
Fuente: Los autores.
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Figura 10. CCR germinal: Familias - perfil molecular mutación MSH2 c.1552C>T. Id supuesto
Fuente: los autores
Los resultados de secuenciación se presentan en la figura 10: El panel izquierdo muestra el diagrama del programa IGV (Integrative Genomic Viewer), en el cual se evidencia que la secuencia de alineamiento muestra un cambio de citosina por timina en el ADN, originando un codón de parada prematuro en la síntesis de la proteína. El panel derecho representa el electroferograma de la secuencia en Sanger; la letra Y indica que podría ser C o T, evidenciando en estos pacientes que son heterocigotos para este cambio.
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ar MSH2 c.G1034A (p.Trp345*). Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
Los pacientes D-2-208 y A-2-032, son portadores de la misma mutación en MSH2 c.G1034A (p.Trp345*). Ambos pacientes tienen ancestros antioqueños. El primero vive hace más de 20 años en Medellín, el segundo en Buenaventura, y no hay registro de su historia familiar.
D-2-208 es el caso índice de la familia D-319; es un hombre de 58 años que presentó pérdida de peso y anemia, y posteriormente fue diagnosticado con un adenocarcinoma de bajo grado en colon derecho, estado IIB; reporta un hermano fallecido por CCR antes de los 50 años y un sobrino fallecido por cáncer gástrico. A-2-032 es un hombre de 42 años con un adenocarcinoma de bajo grado localizado en el colon derecho, los antecedentes son desconocidos. En la figura 11, se presenta el familiograma D-3-19, y se evidencian dos generaciones afectadas consecutivamente.
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141Figura 11. Síndrome de Lynch: mutación MSH2 c G1034A. Familia D-3-19.
Fuente: Los autores.
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ar Los resultados de las secuencias se presentan en la figura 12. En el panel izquierdo se ve el diagrama del programa IGV, gracias al cual se evidencia que la secuencia de alineamiento muestra un cambio de una guanina por una adenina, con el consecuente cambio del triptófano por un codón de parada. En el panel a la derecha se muestra la secuencia confirmatoria de Sanger.
Id Imagen IGV Electrofrograma Sanger
D-2 -208
A-2- 032
Figura 12. Síndrome de Lynch: Familias - perfil molecular mutación MSH2 c.G1034A (p.Trp345*). Los Id son supuestos..
Fuente: los autores
Esta mutación ha sido reportada en la población europea y, a excepción del presente trabajo, no se encontraron reportes para Colombia.
MSH2 c.C1801T (p.Gln601*). Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
El caso índice de la familia D-3-15 corresponde a una mujer con cuadro clínico de pérdida de peso, sangrado rectal, con CCR y cáncer de cuello uterino a los 42 años, codificada como D-2-245. Como antecedentes
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familiares presenta un tío fallecido por CCR a los 35 años. Es portadora de la mutación c.C1801T (p.Gln601*), reportada previamente como patogénica. Se muestrearon sus tres sobrinos y no son portadores de la mutación. Esta variante presenta anotación en las bases de datos descritas. No se han encontrado otros reportes para Colombia.
MSH2 c.C1477T (p.Gln493*). Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
La paciente D-2 -228 es una mujer que al momento de ser diagnosticada con CCR, tenía 48 años; presentó un CCR metacrónico tres años después en el recto. Es el caso índice de la familia D-3-24 y presenta como antecedentes tres hermanos con CCR, un hermano con cáncer de páncreas, dos hermanas con cáncer de útero, madre con cáncer hepático y una prima con CCR, todos fallecidos.
Es portadora de la variante c.C1477T (p.Gln493*), al igual que sus dos hijos, ambos menores de 40 años. Esta mutación es patogénica y, al igual que las anteriores, produce un codón de parada prematuro. Presenta anotación en las bases de datos descritas, pero no se han encontrado otros reportes para Colombia.
MSH2 c.528_529delins-TG (p.Cys176*). Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
La paciente O-2-118 es portadora de la mutación en MSH2 c.528_529delins-TG (p.Cys176*), variante patogénica clase 5, que también ocasiona un codón de parada prematuro y aunque la mutación esta reportada en la base del NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/91126/ se encontró un solo reporte de caso.
La paciente de 45 años, al momento de ser diagnosticada con un adenocarcinoma de bajo grado en colon derecho, en estado IVA con metástasis al cuello, reporta como antecedentes CCR en padre, hermano y primo paterno, todos fallecidos. Es el caso índice de la familia O-3-2, y tanto los hermanos como los sobrinos muestreados, fenotípicamente sanos, son negativos para la mutación.
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ar MSH2 c.C1216T (p.Arg406*). Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
El paciente D-2-016 es un hombre que a los 48 años consultó por dolor abdominal. Presenta un adenocarcinoma de bajo grado en colon derecho; se le realizó colectomía derecha y se clasificó en estado IIA. Es el caso índice de la familia D-3-17. Como antecedentes reportó CCR en su madre y tres hermanos. El paciente es portador de la mutación c.C1216T(p.Arg406*). Al igual que su madre, hermanos enfermos muestreados, e hijos sanos, como se puede apreciar en el familiograma de la figura 13.
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145Figura 13. Síndrome de Lynch: mutación MSH2 c C1316T. Familia D-3-17.
Fuente: Los autores.
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ar Variante en MSH2 c.2458+1G>T, no reportada: Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
El paciente O-2-195 es portador de una mutación en MSH2 con probabilidad de ser patogénica Chr2: NM_000251:c.2458+1G>T.
Esta variante es nueva, ya que en la búsqueda en las bases de datos InSiGHT (www.insight-group.org), base de datos de los genes MMR variantes no clasificadas “Unclassified Variants Database” (www.mmruv.info), base de datos de las variantes de los genes de reparación “Mismatch Repair Genes Variants Database” (www.med.mun.ca/MMRvariants) y en la base de datos de mutaciones en genes humanos “Human Gene Mutation Database” (www.hgmd.cf.ac.uk/ac) no se encontró reportado sino el cambio G>A en la misma posición.
En cuanto al paciente, se trata de un hombre de 39 años que al momento de presentar el CCR de tipo adenocarcinoma NOS en el recto, le realizaron proctocolectomía. Fue clasificado en estado IA; como antecedentes reporta un tío paterno con CCR a los 50 años. Sin embargo, fue imposible realizar el contacto posterior para ampliar la historia clínica, completar el familiograma y tomar muestra a sus parientes.
Análisis gen MLH1Los códigos de pacientes y familias son supuestos.El gen MLH1 presentó tres tipos de mutaciones, dos de tipo splicing y
una nonsense.
MLH1 c.C445T (p.Gln149*)La paciente H-2-030 consultó por anemia y sangrado rectal, y a los 42
años se le diagnóstico un CCR de bajo grado. Es portadora de la mutación
c.C445T (p.Gln149*). Como antecedentes, declaró que su madre falleció de cáncer gástrico a los 50 años (Figura 14). Esta mutación es reportada como patogénica en Holanda y Alemania. No se encontraron reportes previos en Colombia.
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Síndrome de Lynch - Mutación MLH1Familiograma H-2-030
Número central = edad a Junio 2016
21
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Muestra de Sangre Caso Indice
I
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Cáncer Colorrectal Cáncer Gástrico
Figura 14. Síndrome de Lynch: mutación MLH1 c C445T. Familia H-2-030.
Fuente: Los autores.
MLH1 c.545+1G>C variante no reportada. Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
La variante c.545+1G>C fue encontrada en el caso I-2-166, una mujer de 50 años con un adenocarcinoma de bajo grado. Presenta antecedentes de CCR en dos de sus hermanos, uno de ellos antes de los 50 años (Figura 15). No se encontraron reportes de esta variante, pero sí del cambio G>C en la misma posición. La búsqueda fue realizada en las bases de datos InSiGHT (www.insight-group.org), base de datos de los genes MMR variantes no clasificadas “Unclassified Variants Database” www.mmruv.info, base de datos de las variantes de los genes de reparación “Mismatch Repair Genes Variants Database” www.med.mun.ca/MMRvariants y en la base de datos de mutaciones en genes humanos “Human Gene Mutation Database” www.hgmd.cf.ac.uk/ac.
La paciente I-2-009, caso índice de la familia I-3I, es una mujer portadora de la mutación c.790+1G>A (p.Glu227_Ser295del), variante patogénica clase 5, reportada en varios países europeos y asiáticos, y en Colombia
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Figura 15. Síndrome de Lynch: mutación MLH1 c 545+1G>C. variante no reportada. Familia I-2-166.
Fuente: Los autores.
Síndrome de Lynch - Mutación MLH1Familiograma I-2-166
Número central = edad a Junio 2016
23
23
Caso Indice
I
II
1
1
2
2 3 4
Cáncer Colorrectal Cáncer de Hígado
desde hace más de 10 años. La historia personal de la paciente empieza a los 39 años, cuando realizó consultas por hemorragias uterinas anormales y se le diagnóstico carcinoma de endometrio, por lo cual se le realizó una histerectomía abdominal.
Cuatro años después presentó dolor abdominal; el ginecólogo, al descartar patología de este origen, ordenó una colonoscopia, cuyos resultados mostraron una masa en el ciego. Se le realizó una hemicolectomía derecha por adenocarcinoma de bajo grado en estado IIB, presentó MSI-L y tinción heterogénea en la IHC-MLH1. Entre sus antecedentes familiares se cuenta a su madre, quien presentó carcinoma de endometrio, cuatro de sus hermanos han padecido CCR, uno de ellos fallecido antes de los 50 años, un sobrino con CCR a los 24 años, una de sus hermanas fue diagnosticada con carcinoma de endometrio, y algunos de sus sobrinos son portadores sanos hasta el momento. Una hermana y la hija de la paciente presentan cáncer de cuello uterino relacionado a infección con virus del Papiloma Humano (VPH). Cabe resaltar que las dos hijas de la paciente no son portadoras de la mutación, como se puede apreciar en el familiograma presentado en la figura 16.
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149Figura 16. Síndrome de Lynch: mutación MLH1 c 790+1G>A. Familia I-3-1.
Fuente: Los autores.
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ar 4.2.4. Síndromes Polipósicos
Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
Las familias que presentaron síndromes de tipo poliposis representaron el 26% (18/69) del total. Solo se identificaron cuatro con mutaciones en genes relacionados con estos síndromes; se completaron las validaciones y correlaciones pertinentes en tres de ellas, a saber:
APC c.847C>T (p.Arg283*)Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
Se encontró la variante c.847C>T (p.Arg283*) del gen APC en el caso D-2-235, correspondiente a una mujer proveniente de una familia antioqueña, cuya madre tuvo 23 embarazos, seis de los cuales fueron múltiples. Todos estos gemelos murieron a temprana edad; el resto de hijos e hijas están vivos y sanos. Esta matrona tiene 11 nietos y cinco bisnietos. No se tienen antecedentes de cáncer en esta familia. El caso índice en cuestión consultó a los 42 años por sangrado rectal. Se le encontraron más de 100 adenomas tubulares y vellosos, el mayor de 1 cm de diámetro. Se le realizó una colectomía total y no presentó manifestación extraintestinales. Los dos hijos del caso índice son portadores de la mutación, pero no estaban afectados en el momento de la investigación, aunque se debe destacar que son jóvenes (17 años y 22 años de edad). La variante c.847C>T origina un codón de parada con la consecuente pérdida de función de la proteína truncada. Esta mutación ha sido reportada en otras latitudes como variante patogénica en poliposis múltiple familiar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/184999/), y da-da la ausencia de antecedentes familiares, se considera que esta variante puede ser una mutación de novo en la paciente. No se encontraron reportes previos de esta mutación para Colombia.
STK11 c.809_809delins-GALos códigos de pacientes y familias son supuestos.
El paciente D-2-240, portador de la variante en STK11 c.809_809delins-GA, es el caso índice de la familia D-3I y fue utilizado como validación de las pruebas de secuenciación de nueva generación, ya que había sido validada
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y publicada por uno de los investigadores del grupo. El caso MD-2- 58 también presentó dicha mutación, pero su familia (D-3-22-) fue excluida del análisis por voluntad del caso índice.
SMAD4 c.403C>T (p.Arg135*)Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
La familia D-3- 9 presenta como caso índice a la paciente D-2-335, mujer que a los 65 años presentó pérdida de peso y anemia. Como resultado de la consulta se le diagnosticó un adenocarcinoma. Es portadora de la variante c.403C>T (p.Arg135*), reportada previamente en España como patogénica. Tiene dos hermanas portadoras de la mutación, una con CCR y la otra con adenomas. Tuvo cuatro hijos, uno de ellos fallecido por CCR a los 41 años; los otros tres son portadores de la mutación, al igual que una sobrina, hija de una de las portadoras. Los detalles se pueden apreciar en la genealogía de la figura 17. No se encontraron reportes de esta variante en Colombia. Infortunadamente, no ha sido posible indagar los ancestros lejanos de esta familia.
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Figura 17. Poliposis asociada a SMAD4 mutación c.403C>T.Familiograma D-3-9
Fuente: Los autores.
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MUTYH c.1437_1439delGGA (p.Glu480del)Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
La variante c.1437_1439delGGA (p.Glu480del) fue encontrada en el paciente caso índice de la familia I-3-10. Se trata de un hombre de 32 años que presentó CCR de tipo adenocarcinoma de bajo grado con componente mucinoso en el ángulo esplénico del colon, estado IIA. Se le practicó colectomía radical derecha, con ileotransversostomía. Presenta una sobrevida de 13 años, en los que ha tenido siete resecciones de adenomas tubulares y túbulo-vellosos, con displasia de alto grado. La última, en 2011, presentó MSI+ y preservación en la expresión de la proteína MLH1. No reporta antecedentes familiares. Es homocigoto, al igual que su hermana, quien hasta el momento es asintomática. Sus padres e hijos son portadores heterocigotos, como se puede apreciar en la figura 18.
Poliposis asociada a MUTYH. Familiograma I-3-10
Número central = edad a Junio 201621
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Muestra de Sangre Caso Indice
Cáncer Colorrectal
Portador homocitogoto MUTYHc.1440_14140 delinsGGA
Portador homocitogoto MUTYH c.1440_14140 delinsGGA
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Figura 18. Poliposisi asociada a MUTYH mutación c.1440_1440delinsGGA. Familia I-3-10.
Fuente: Los autores.
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ar 4.3. CCR Familiar no sindrómico
Los códigos de pacientes y familias son supuestos.
Bajo esta denominación se agruparon las 55 familias en las que no se detectó mutación en los genes examinados. Cinco familias presentan criterios clínicos de Ámsterdam, 36 criterios de Bethesda y 14 poliposis, brevemente se destacan algunas de las familias con mayor número de antecedentes familiares.
La familia I-3-7 presenta como caso índice a una mujer de 60 años con CCR, cuya madre falleció de cáncer gástrico. También tiene una hija fallecida por CCR y otra hija con carcinoma de células claras del riñón.
La familia O-3-I tiene como caso índice a la paciente O-2-0045. Al momento del ingreso al estudio tenía 62 años y llevaba 35 años de sobrevida luego de ser sometida a colectomía total por poliposis múltiple. Como antecedentes, tanto la madre del caso índice como una tía fallecieron por CCR. Además, declaró tener una prima con CCR, así como tres hermanos y una hija con poliposis múltiple. Se reportan adenomas tubulares como el tipo histológico predominante en dichos familiares. El familiograma se ilustra en la figura 19.
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155Figura 19. CCR familiar no sindrómico. Familia O-3-I.
Fuente: Los autores.
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Figura 20. CCR familiar no sindrómico. Familia I-3-13.
Fuente: Los autores.
La familia D-3-8 presenta como caso índice a una mujer con CCR antes de los 50 años (D-2- 304), con antecedentes de carcinoma papilar de tiroides diagnosticado antes de los 50 años en dos de sus dos hermanas.
La familia I-3-13 presenta como caso índice una mujer codificada como I-2-0231, que desde los 15 años presentó sangrado rectal, evidenciando más de 100 pólipos. Le realizaron una colectomía total. Antecedentes: su tío paterno, una prima paterna y una hermana fallecieron por CCR, asociado a pólipos; un hermano con poliposis. Además, tiene dos sobrinas con pólipos de tipo mixto y hamartomatosos, las dos sometidas a colectomía total a los 15 y 16 años. Los detalles se pueden apreciar en la figura 20.
CCR familiar no sindrómico.Familiograma I-3-13
Número central = edad a Junio 201621
21Caso IndiceCáncer Colorrectal
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Poliposis
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1 2 3 4
Colectomíatotal 15
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Poliposa, colectomía
total 16 años
Poliposa, colectomíatotal 15 años
5 6 7 8
4
1 2
El caso índice I-2-109, de la familia I-3-3, es una mujer que presentó CCR a los 32 años. Como antecedentes, su padre falleció de CCR, dos hermanos padecen de cáncer gástrico con sobrevida mayor a 10 años y una hermana presenta CCR de tipo adenocarcinoma de bajo grado, como se puede apreciar en la Figura 21.
Resu
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CCR familiar no sindrómico.Familiograma I-3-3
Número central = edad a Junio 201621
21Caso Indice
Cáncer Colorrectal
I
II
III
1
1
1
2
2
2
3
3
4
4
5 6 78 9
Muestra de SangreCáncer Gástrico
2II 5II
78
30 13 13 18
38 52
9II
CCR70
años
CCR47
años
CCR32
años
Cáncergástrico50 años
Cáncergástrico45 años
Figura 21. CCR familiar no sindrómico. Familia I-3-3.
Fuente: Los autores.
En la figura 22 se describe la familia D-3-10. Tiene como caso índice a D-2-267, quien padeció CCR a los 63 años. Tiene como antecedentes una hermana con CCR a los 54 años, y otra hermana con carcinoma papilar de tiroides. Además, un sobrino con CCR falleció a los 40 años.
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Figura 22. CCR familiar no sindrómico. Familia D-3-10.Fuente: Los autores.
CCR familiar no sindrómico.Familiograma D-3-10
Número central = edad a Junio 201621
21Caso Indice
Cáncer Tiroides
I
II
III
Cáncer Colorrectal Muestra de Sangre
1 2
1 2
1 2
3 4 5 6 7
1I 2I
Adeno-carcinoma,
69 años
Adeno-carcinoma,
54 años
Ca Tiroides,69 años
65
CCR,40 años
76
48
La familia D-3-5 tiene como caso índice a D-2-0299, mujer con CCR a los 66 años, que presenta antecedentes de cáncer en dos tíos maternos fallecidos por CCR, un tío materno con cáncer gástrico y un hermano con cáncer de pulmón. Se realizó un familiograma extendido en el que se lograron identificar las relaciones de sus parientes cercanos con otros casos de CCR, cáncer de páncreas e hígado, pólipos hiperplásicos en el colon y cáncer gástrico. (Figura 23).
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1112
1314
1516
1718
1920
2122
2324
257
12
34
56
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12
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Figura 23. CCR familiar no sindrómico. Familia D-3-10.
Fuente: Los autores.
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Figura 24. CCR familiar no sindrómico. Familia D-3-22.
Fuente: Los autores.
En la familia D-3-22, con 11 hijos, el caso índice presentó CCR a los 50 años. Antecedentes: una hermana cáncer de tiroides antes de los 50 años y un hermano con poliposis. (Figura 24).
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La familia I- 3-7 está constituida por dos generaciones afectadas por CCR y cáncer gástrico. (Figura 25).
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Figura 25. CCR familiar no sindrómico. Familia I-3-7.
Fuente: Los autores.
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ar La familia D-3-24 presenta cuatro afectados por CCR, todos ellos hermanos y menores de 50 años. Además, presenta familiares en primer grado con cáncer hepático y de páncreas. (Figura 26).
CCR familiar no sindrómico.Familiograma D3-24
Caso Indice
I
II
III
Cáncer ColorrectalMuestra de Sangre
1 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3
Ca Hepatico,50 años
CCR,40
años
CCR,45
años
CaPancreas,38 años
CCR,44
años
CaUtero
34años
CCR, 40
años
Poliposen
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1I
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2224 25
Figura 26. CCR familiar no sindrómico. Familia D-3-24.
Fuente: Los autores.
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Capítulo 5
DISCUSIÓN
Fuente: Freepik.es
165
5.1. Aspectos clínicopatologicos
En este estudio, además del perfil genético de pacientes colombianos con CCR, cuya muestra abarca ciudades localizadas a lo largo del centro del país, se examinaron las características clínicopatologicas y las diferencias en presentación de los tumores, entre pacientes menores y mayores de 50 años, teniendo en cuenta aspectos tales como: el género (53,2% para mujeres y 46,8% en hombres); la edad de diagnóstico promedio (57,43 años), que es menor a la reportada en diferentes estudios a nivel mundial, especialmente en países desarrollados con medias desde 64 a 72 años (Brenner, Kloor, & Pox, 2014; Dodou & de Winter, 2012; Domingo et al., 2013; Ghazi, Berg, Lindblom, & Lindforss, 2013; Hansen & Jess, 2012; Karanikas & Esebidis, 2016; McKay et al., 2014; Millán et al., 2015; Purim, Gordon, & Brenner, 2013; Wu et al., 2012); y la localización más frecuente, que fue el recto (31,1%) y el colon distal (21,8%), en contraste con otros trabajos (G. H. Lee et al., 2015; Omranipour, Doroudian, & Mahmoodzadeh, 2012; Rozen, Liphshitz, & Barchana, 2012), que indican que hay un aumento en la prevalencia de los casos de CCR en el colon derecho.
5.2. Perfil molecular del CCR con agregación familiar
En 1966, en Lyon Francia, se fundó la Asociación Internacional de Registros de Cáncer, con el fin de reunir información de la ocurrencia y resultados de los pacientes con cualquier tipo de cáncer. Inicialmente contó con 29 países miembros; actualmente son 66 países y 290 registros a nivel mundial. Sur América contribuye con el 8% de los registros (Bray et al., 2015).
En Colombia se cuenta con cinco registros poblacionales de cáncer (Cali, Pasto, Manizales, Bucaramanga, Barranquilla). Los registros poblacionales de
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ar cáncer juegan un papel importante en la investigación de la enfermedad, ya que proveen datos de patrones, tendencias e interacciones epidemiológicas en pacientes con cáncer, y son el componente esencial en la planeación y monitoreo de las estrategias estatales para el control del cáncer, y para identificar las prioridades en salud pública. Igualmente necesarios son los registros de familias con cáncer (Casey et al., 2005; Garzón-Benavides et al., 2010), que se han implementado a nivel mundial e incluso en algunos países latinoamericanos, como Brasil, Puerto Rico y Uruguay (De Jesús-Monge et al., 2010; Dowty et al., 2013; Marques-Lespier, Diaz-Algorri, González-Pons, & Cruz-Correa, 2014; Vaccaro et al., 2016). Estos registros de familias con cáncer son ventajosos, porque gracias a su implementación se minimizan los diagnósticos tardíos y son efectivos en la prevención de la enfermedad de baja frecuencia, pero de alto impacto en el fenotipo.
En ausencia de estos registros poblacionales de cáncer en la región, se hace necesario colectar un número muy alto de pacientes para lograr identificar familias con síndromes de cáncer con agregación familiar, teniendo solo a la mano la historia familiar (Carney et al., 2013), que aunque es muy útil para los fines pertinentes, se pierde en muchos casos en el momento en que el ancestro más viejo, que usualmente es el abuelo del caso índice, fallece, como fue evidente en la mayoría de las familias analizadas. Aun con este panorama nacional, se lograron identificar y sumar al estudio 69 familias con historia de cáncer, cuyos familiogramas reflejan las generaciones afectadas y la línea de transmisión del gen. Dichas familias corresponden al 5,4% de la totalidad de los casos de la muestra; adicionalmente, se detectaron 155 casos de CCR con historia de cáncer visceral, asociado a síndromes, que sumados a los 69 casos índice elevan el porcentaje de casos con agregación familiar al 17,5% (224/1278). Este dato se aproxima a los de algunas publicaciones, en las que se indica que hasta en un 30% de los casos de CCR con algún tipo de agregación familiar la base genética que controla el fenotipo, aún no se conoce. (Esteban-Jurado et al., 2015; Hes et al., 2014).
La historia clínica y los antecedentes familiares son las herramientas más valiosas para detectar familias con síndromes de cáncer con agregación familiar. (Brosens, Offerhaus, & Giardiello, 2015). En el presente estudio, el análisis clínico de las familias evidenció que el 62% de los casos índice seleccionados presentaba criterios de Bethesda, CCR de inicio temprano
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(<50 años); el 22% fenotipos con poliposis; y el 16% cumplía con los criterios de Ámsterdam. Sin embargo, al realizarles a todos los casos índice seleccionados el análisis molecular de los genes candidatos, previamente asociados a los síndromes con agregación familiar más conocidos, el 82,6% no presentaban mutaciones en ellos. En este trabajo, para este 80%, se utiliza el nombre de CCR con agregación familiar no sindrómico, para diferenciarlo del 20% de casos asociados a los genes seleccionados como candidatos, a los cuales se les suele asignar el calificativo de sindrómicos. Este 80% es un porcentaje muy superior al reportado en otras publicaciones. (Mahon, 2016).
El valor predictivo positivo de los criterios de Ámsterdam para detectar el síndrome de Lynch fue del 54%, y el de los criterios de Bethesda fue del 16%. Estos valores concuerdan con los referenciados internacionalmente en los consensos de expertos. (Armelao & de Pretis, 2014; Saunders et al., 2012). Los datos se pueden correlacionar con los resultados de MSI/IHC y BRAF V600E, con el fin de completar un tamizaje que permita, a precios asequibles, buscar las mutaciones y prevenir la enfermedad en las personas de riesgo (Steinke et al., 2014; Vasen et al., 2007).
Con el uso de técnicas moleculares de última generación, se han logrado reducir los costos de los análisis, en la medida que cada vez es más fácil, desde el punto de vista técnico, probar múltiples genes al mismo tiempo en diferentes pacientes, con el fin de identificar la mayor cantidad de mutaciones en genes previamente asociados al riesgo de padecer enfermedades complejas como el CCR. (Bellcross et al., 2012). Las alianzas estratégicas y convenios con instituciones universitarias con experiencia en investigación, dotadas de laboratorios de biología molecular y científicos dispuestos a realizar transferencia de conocimientos y de tecnología de avanzada, permiten probar estas técnicas en las muestras de los pacientes colombianos y abren las puertas a la implementación de esta tecnología en el país.
En Colombia, el lograr acumular datos genotípicos suficientes, no sólo en portadores afectados sino en sanos, hace posible realizar comparaciones con la población en general y realizar estimaciones del riesgo de CCR en las familias, dependiendo del tipo de mutación presentada, lo cual acerca más los datos estimados a la realidad, dado que actualmente el
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ar riesgo es calculado con datos internaciones de poblaciones con diferentes condiciones genéticas y ambientales. (Cragun et al., 2014; Valle, 2014; Vijay, McIntyre, Mason, Greenfield, & Li, 2016).
Los estudios moleculares para condiciones genéticas con agregación familiar son muy escasos en países en vías de desarrollo. En Colombia existen algunos estudios previos para síndrome de Lynch, gracias a los cuales se han logrado identificar nuevas mutaciones en genes asociados al riesgo de la enfermedad y se ha reportado la frecuencia de las mutaciones previamente descritas en la población europea. (Dowty et al., 2013; E. Stoffel et al., 2009).
5.2.1. Síndrome de Lynch – Cáncer colorrectal no polipósico - HNPCC
103 años después de la primera descripción de una familia con HNPCC (Alonso-Espinaco et al., 2011; Domínguez-Valentin, Nilbert, et al., 2013; Giraldo et al., 2005; Gómez et al., 2005; Montenegro, Ramírez-Castro, Isaza, Bedoya, & Muneton-Pena, 2006), se han realizado avances significativos en el conocimiento de la enfermedad, sobre todo, en el espectro mutacional del síndrome. Las mutaciones en MSH2 y MLH1 se encuentran en el 70 al 90% de los casos; el 10% restante lo representan las mutaciones en los genes MSH6 y PMS2. (Kastrinos & Stoffel, 2014; Lindor, 2014).
En este trabajo, se estudiaron 69 familias no relacionadas. El espectro de mutaciones mostró 10 diferentes, que afectaron los genes MSH2 y MLH1 con un predominio del tipo puntual nonsense del 60%; las de tipo splicing (empalme) el 30%, y las de marco de lectura, frameshift, el 10% restante. Si se comparan los datos con reportes de la base de datos InSiGHT que recogen un número representativo de casos familiares en el mundo, ellos reportan 35,7% de mutaciones nonsense, 5,7% tipo splicing y 34% de missense. (F. Liu et al., 2014; Loizidou et al., 2014; Peltomaki, 2014). Estas diferencias pueden estar relacionadas con múltiples factores, entre los que se encuentran la ancestría, los genes modificadores y los factores medioambientales. El 77% de las mutaciones encontradas en este estudio han sido reportadas como patogénicas clase 5, por el InSiGHT (Plazzer et al., 2013) y/o, la base de datos de variantes clínicas del NCBI; las variantes de tipo missense deben ser sometidas a pruebas funcionales.
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En cuanto a la proporción de los genes mutados, en este estudio predominaron aquellos frecuentemente relacionados en el síndrome de Lynch. Se encontró una relación MSH2 con siete mutaciones, y una MLH1 con tres mutaciones.
Estos resultados son inversamente proporcionales con los reportados en estudios previos, en los cuales la frecuencia de mutaciones en MLH1 es mayor, incluso en nuestro propio país, en donde Giraldo y colaboradores reportaron siete mutaciones en MLH1, y una en MSH2. (Thompson, 2014). Otros ejemplos están en Brasil, con dos mutaciones en MSH2 y ocho mutaciones en MLH1 (Giraldo et al., 2005); Uruguay, una mutación en MSH2 y dos mutaciones en MLH1 (Rossi et al., 2002); China, 14 en MSH2 y 28 en MLH1 (Sarroca et al., 2005); y Chipre, una mutación en MSH2 y tres mutaciones en MLH1.
Incluso, dos estudios de recopilaciones de casos familiares en Sur América reportan, el uno, 14 mutaciones en MSH2 y 20 en MLH1 (Fu et al., 2013), y el otro, 40 en MSH2 y 60 en MLH1. (Valentin et al., 2011). La recopilación realizada en América Latina por Domínguez y colaboradores en 2017 reportó MSH2 (46% - 66%), seguida de MLH1 (25% – 43%) y MSH6 (7% – 8%), PMS2 (2%) y EPCAM (2%). (Domínguez-Valentin, Nilbert, et al., 2013). Sin embargo, en otras regiones del mundo es al contrario y con similares proporciones a los resultados de este estudio: En Estados Unidos encontraron las mutaciones, así: 39 en MSH2 y 12 en MLH1 (Rossi et al., 2017); en Argelia, dos MSH2 y una MLH1 (Baudhuin et al., 2005); en Israel, 26 en MSH2 y 15 en MLH1 (Ziada-Bouchaar et al., 2016); en Puerto Rico, 15 mutaciones en MSH2 y cinco en MLH1 (Goldberg et al., 2015).
En otros reportes de Estados Unidos se encontró una proporción muy similar entre el estatus mutacional para los dos genes: 24 mutaciones en MSH2 y 25 mutaciones en MLH1. (Cruz-Correa et al., 2015). El predominio de mutaciones en MLH1 en poblaciones latinoamericanas podría ser el reflejo de la estructura poblacional ancestral del continente. Para Colombia es necesario ampliar el muestreo de las familias afectadas, para confirmar las diferencias en las proporciones de mutaciones germinales en MSH2 / MLH1. Con la información obtenida hasta el momento se ha estimado el riesgo a padecer cáncer, tomando como base la edad, el género y el gen mutado. Esta información está disponible en la base de datos: http://lscarisk.org/ (Wagner et al., 2003).
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ar La prevalencia de los pacientes con cáncer extracolónico fue baja, representada por dos casos con cáncer de endometrio y tres con cáncer gástrico, uno con cáncer de tiroides y otro de páncreas. En otros reportes del seguimiento de pacientes con el síndrome y la frecuencia de presentación de estos tumores extracolónicos, se ha establecido el riesgo de cáncer de endometrio en un 12%, el de vejiga urinaria 2% y el de próstata 3%, entre otros. (Kanth et al., 2017). Los estudios que agrupan gran cantidad de casos de diferentes países presentan mayores porcentajes de riesgo para esos tumores relacionados con el gen afectado y el género. (Win, Lindor, et al., 2012).
MSH2 c.1552C>TLa población del departamento de Antioquia tiene una importante
ancestría española (Lindor, 2014), siendo además una población relativamente cerrada, en la cual han sido reportados, previamente, efectos fundadores relativos a la frecuencia, en enfermedades como Parkinson o Alzheimer. (Bedoya et al., 2006; Carvajal-Carmona et al., 2000). Estos antecedentes podrían explicar el porcentaje del 30% para la mutación en MSH2 c.1552C>T, representada en tres familias no relacionadas y con ancestros comunes en dos de ellas, originarios de Carolina del Príncipe. Esta variante patogénica localizada en el exón 10, origina un codón de parada que produce una proteína truncada, que ha sido reportada en población portuguesa en dos familias con criterios de Ámsterdam. (Lopera et al., 1997; Pineda-Trujillo et al., 2006). Las familias colombianas cumplían con los criterios Ámsterdam y Bethesda, con CCR sincrónico, afección del colon derecho, sin historia de cánceres extracolónicos. Se logró identificar la segregación de la mutación en un portador -sobrino del caso índice- afectado por CCR.
MSH2 c.G1034ALa variante c.G1034A es conocida por su efecto patogénico, clase 5.
(Fidalgo et al., 2000; Lage et al., 2004). Está localizada en el exón 6, genera un codón de parada y la consecuente proteína truncada. Se encontraron siete reportes de esta mutación, uno de ellos en Italia, en un sólo individuo con CCR de una familia, para la cual no se especifican detalles. (Thompson, 2014). Otro reporte se presenta en una familia con tíos y abuela materna con cáncer, y madre portadora. En Italia se reportó otro portador con CCR, MSI+ y pérdida de la expresión de MSH2 por IHC. (Ponz de Leon et
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al., 2004). Los casos colombianos con esta variante representan el 20% de las mutaciones en MSH2. Se trata de dos individuos no relacionados, uno de ellos con criterios de Bethesda para CCR, que presenta una hermana portadora también de la mutación, fenotípicamente sana; el otro caso también cumple con los criterios de Bethesda, pero sus antecedentes son desconocidos.
Otras variantes en MSH2 La variante c.C1477T, localizada en el exón 9, es conocida por su
efecto patogénico en siete estudios previos, también ocasiona un codón de parada prematuro. Los reportes localizados en las familias son: uno en Alemania que se asocia, además, con pérdida de expresión de la proteína MSH2 por IHC (Pedroni et al., 2007), otro reporte sin datos clínicos disponibles en USA (Mangold et al., 2005), y un tercero en Brasil, en una familia. (Hegde, Blazo, Chong, Prior, & Richards, 2005). Los otros reportes no presentan datos clínicos que permitan realizar una comparación con los casos colombianos.
El caso D-2-245 es portador de la variante c.C1801T, localizada en el exón 12, que produce un codón de parada prematuro y la consecuente proteína truncada. La correlación de esta variante con la enfermedad ha sido descrita en cinco oportunidades con clase patogénica 5, por Dunlop et., al, en Edimburgo. Se trata de una paciente de 20 años con CCR, sin otras especificaciones. (Valentin et al., 2011). Igualmente, se reportó en otro caso en Edimburgo, sin edad de diagnóstico (Dunlop et al., 1997). Algunos investigadores asocian esta mutación y otras del mismo gen a un inicio muy temprano del CCR. (Farrington et al., 1998). En USA fue relacionada con el síndrome de Muir-Torre. (B. Liu et al., 1995).
La variante c.C1216T, localizada en el exón 7, es de carácter patogénico clase 5. Se asocia a CCR por otros investigadores con 43 reportes en el “LOV-variant listings”. Se presentó en el paciente D-2-016, de 48 años, que cumple con los criterios de Ámsterdam. La mutación segregó en sus hermanos enfermos y sus hijos sanos; además, la madre también es portadora y tiene CCR. Los primeros reportes son de USA, en 1994 (Kolodner et al., 1994), y Suecia, en 1999. (B. Liu et al., 1994). La mayoría se reportan en el marco de la descripción de nuevas variantes y su relación con el fenotipo MSI o la IHC-MMR, y al igual que en nuestro caso, se ha asociado a criterios de
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ar Ámsterdam y a una edad de inicio temprano. (Wahlberg, Liu, Lindblom, & Lindblom, 1999).
El paciente O-2-118 es portador de la mutación en MSH2 c.528_529delins-TG, localizada en el exón 3, la cual es una deleción con corrimiento del marco de lectura, que ocasiona una proteína truncada, reportada en USA, en el marco de las comparaciones con MSI e IHC. (Lagerstedt Robinson et al., 2007).
El paciente O-2-195 es portador de una nueva variante c.2458+1G>T. Presenta criterios clínicos de Ámsterdam. En cuanto al cambio nucleotídico, fue el mismo reportado por Magnold, en el año 2005, G>A, en esa misma posición, y está catalogada en los estudios in silico como patogénica clase 4, al igual que la encontrada en el presente trabajo. (Terdiman et al., 2001). Sin embargo, se deben realizar estudios de segregación para concluir el significado clínico.
En diferentes poblaciones y etnias se han reportado mutaciones cuyo origen se asume como resultado de un efecto fundador, en el gen MSH2. Unas de las más reconocidas las presentan los judíos Ashkenazi: c.3984_3987dupGTCA y c.1906G>C (p.Ala636Pro). En el gen MSH6 se registra la c.3959_3962delCAAG. (Mangold et al., 2005). Estas mutaciones no se han reportado en Colombia, probablemente porque están relacionadas directamente con la colonización en América Latina. Otras han sido reportadas en Italia (Baris et al., 2016; Goldberg et al., 2015) y en estudios comparativos en Sur América, con porcentaje ligeramente superior en MSH2 (58%). (Cavallaro et al., 2014).
Variantes en MLH1Lozidou et., al, en 2014, en Chipre, analizaron 77 pacientes, habiendo
encontrado predominio de cuatro mutaciones patogénicas clase 3, consistentes en una mutación puntual y tres deleciones, una de ellas en el gen MLH1 c.790+1G>A, consistente en una sustitución intrónica que conduce a una deleción y corrimiento del marco de lectura de los exones 9 y 10 del gen MLH1. (Valentin et al., 2011). Esta mutación ha sido reportada en Colombia, en la población antioqueña. (Loizidou et al., 2014). También se ha reportado en Chile (Giraldo et al., 2005; Gómez et al., 2005) y en 40 oportunidades más en países como Alemania, China y
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Japón, todas ellas incluidas en la base InSiGHT “Colon Cancer Gene Variant Database – LOVD –Leiden Open Variation Database”. En este trabajo, la mutación se reporta en una familia tolimense que cumple con los criterios de Ámsterdam. Tiene cinco integrantes enfermos que la presentan y tres generaciones consecutivas afectadas de carcinomas extracolónicos, dos son mujeres con cáncer de endometrio, una de ellas fallecida. El caso índice presentó dos tipos diferentes de cáncer (CCR y endometrio). El individuo más joven afectado por CCR, tiene 24 años. La familia tiene, además, seis portadores sanos, los cuales deben someterse a programas de tamizaje para prevención de la enfermedad. Los resultados de IHC-MLH1 para el caso índice mostraron heterogeneidad en la tinción, lo que concuerda con datos de otros autores que reportan que hasta un tercio de los casos portadores de mutaciones en MLH1 presentan una tinción positiva o débil para la misma. (Domínguez-Valentin, Nilbert, et al., 2013). En la revisión de los reportes de la mutación se encontró que esta se asocia a familias con criterios de Ámsterdam y compromiso extracolónico con cáncer de endometrio en China (Mangold et al., 2005), e incluso con efecto fundador, en la publicación realizada en un reporte para Colombia hace 11 años. (Yap et al., 2009).
Hendriks y De Jong et al., 2004, en Holanda, describieron la mutación c.C445T en el gen MLH1, en familias con individuos con CCR, menores de 50 años, con alta inestabilidad microsatelital (Giraldo et al., 2005). Esta mutación se presenta en el exón 5, en el codón que codifica para el aminoácido Glicina. La consecuencia es un codón de parada que origina una proteína truncada, que generalmente es degradada por el sistema “nonsense-mediated RNA decay”. (De Jong et al., 2004). Al igual que los reportes de Hendriks y De Jong descritos, el caso H-2-030 analizado en este trabajo presentó CCR y antecedentes de cáncer gástrico, cumpliendo los criterios de Bethesda. Este primer reporte de la mutación para Colombia confirma que los criterios de Bethesda son eficientes para encontrar pacientes con síndrome de Lynch.
La nueva variante encontrada en el gen MLH1 (c.545+1G>C), presente en el caso I-2- 166, con antecedentes de cáncer, no había sido reportada. Para definir la patogenicidad de la misma es necesario realizar análisis de segregación de la enfermedad en otros afectados, ya que la interpretación de la patogenicidad in silico no fue conclusiva.
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ar Se han realizado reportes de mutaciones con carácter fundador en síndrome de Lynch, que se destacan por su mayor frecuencia. Se destacan las reportadas en el gen MLH1 en diferentes países europeos como Finlandia (Kurosaki & Maquat, 2016), Suiza (De la Chapelle & Wright, 1998; Moisio, Sistonen, Weissenbach, de la Chapelle, & Peltomaki, 1996), Italia (Hutter et al., 1996), lo mismo que en Argentina (Borelli et al., 2014) y en Asia, con reportes en China (Cajal et al., 2016). También se encuentran reportes de caso en Puerto Rico. (Chan et al., 2001).
5.2.2. Síndrome de Polipósis Múltiple Familiar: APC c.847C>T
En la base de datos LOVD, “Colon Cancer Gene Variant Databases”, se encontraron 45 reportes de la variante en APC c.847C>T, localizada en el exón 8. Se trata de una sustitución que produce un codón de parada prematuro en la proteína, con la consecuente pérdida de la función. El caso índice D-2-235 del presente estudio corresponde a una paciente sin reporte de antecedentes de cáncer familiar y con presencia de más de 100 adenomas, por lo que se postula la posibilidad de que la mutación se haya originado de novo. Varios de los reportes de esta variante la han asociado también a mutaciones de novo (Marques-Lespier et al., 2014), las cuales se han reportado hasta en el 25% de los casos. Además, el 20% de estos supuestos casos nuevos pueden corresponder a mosaicismos.
Se ha estimado que la rata de mutaciones de novo es de 4 x 106 a 9 x 106 mutaciones/gametos/generaciones y las formas mosaicas representarían 1/5 de estas mutaciones de novo. (Mandl et al., 1994). Uno de los investigadores reporta para esta mutación hasta el 42% de mosaicismo en sangre y 80% en los adenomas (K. W. Jasperson et al., 2010; Leoz, Carballal, Moreira, Ocana, & Balaguer, 2015); otros investigadores encontraron mosaicismo del 5% en pacientes holandeses. (Aretz et al., 2007). La mayoría de las mutaciones en APC se encuentran en la zona MCR; sin embargo, esta mutación está localizada por fuera dicha zona.
Algunos estudios reportan variantes de este tipo con fenotipos menos severos de la enfermedad. (Hes et al., 2008). Otros reportes han relacionado
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la variante con manifestaciones extracolónicas, y la no correlación del genotipo con el fenotipo, lo que dificulta las predicciones en las familias portadoras. (Kanter-Smoler et al., 2008; Mohamed et al., 2003). En un estudio realizado en España se encontró que esta variante y otras nuevas reportadas no presentan diferencias en cuanto a la edad de aparición y las manifestaciones extracolónicas. (Enomoto et al., 2000; Torrezan et al., 2013; Wallis, Morton, McKeown, & Macdonald, 1999). En el caso reportado en este trabajo se favorece la hipótesis de que se trata de una mutación de novo por la segregación de la variante en los hijos de la paciente; se plantea ampliar el muestreo a más integrantes de la familia.
5.2.3. Síndrome Poliposis Juvenil asociada a SMAD4: c.403C>T
Este síndrome es muy raro, razón por la cual, en estudios multicéntricos ha sido necesario muestrear un gran número de familias para identificarlo. (Rivera et al., 2011). El tipo de herencia es autosómica; se presenta en 1 de cada 100.000 a 160.000 individuos, con afección predominante en colon y recto, y con pólipos hamartomatosos que desarrollan malignidad hasta en un 20% de los casos. También se han reportado variedades polipoides gástricas. (Wain et al., 2014). La variante c.403C>T, localizada en el exón 3, fue asociada a poliposis juvenil en Barcelona, en un estudio de tejido neoplásico. (Blatter et al., 2015; Honda et al., 2013). Produce un codón de parada prematuro en la proteína que se ve truncada y con pérdida de la función.
Fenotípicamente hay tres afectados en una misma generación, dos con CCR y uno con adenomas tubulares y vellosos con displasia; no se reportaron pólipos hamartomatosos en estos pacientes. Se evidencia la segregación de la mutación en dos generaciones consecutivas; la última con un miembro de 18 años al momento del muestreo, todos sin endoscopias digestivas al momento del ingreso al estudio. Es necesario buscar manifestaciones extraintestinales y seguimiento endoscópico. La variable en cuestión solo tiene un reporte en el año 2005, y no hay reportes para Colombia. Se han identificado en los últimos años diferentes variantes nuevas. (Alazzouzi et al., 2005).
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ar 5.2.4. Síndrome Poliposis asociada a MUTYH: c.1437_1439delGGA
El paciente masculino de 32 años, caso índice de la familia I-3-10, es portador de la variante c.1437_1439delGGA, una deleción en el exón 14, sitio en el cual se producen la mayor cantidad de deleciones reportadas para este gen (Clendenning et al., 2013; Honda et al., 2013; Jee et al., 2013), con consecuencias funcionales probadas in silico, in vitro e in vivo en ratones (Gismondi et al., 2004; Out et al., 2010) y con pruebas de expresión proteica por métodos inmunohistoquímicos. (Goto et al., 2010; Molatore et al., 2010). El paciente en cuestión presentó adenomas recurrentes a lo largo de años diferentes, lo que se relaciona con mutaciones del MUTYH. (Di Gregorio et al., 2006). Esta variante ha sido anotada en 59 oportunidades en la base de datos LOVD “Colon Cancer Gene Variant Databases”, la mayoría en estudios provenientes de portadores de CCR, adenomas y en tamizaje de personas con riesgo de síndrome de Lynch. (Fostira et al., 2010; Halford et al., 2003). El paciente de este estudio no presentaba manifestaciones gastrointestinales en el momento de participar. Se reportan estudios con un porcentaje de 38% de manifestaciones extraintestinales (Aceto et al., 2005; Aretz et al., 2006; Cattaneo et al., 2007; Eliason et al., 2005), 24% de tumores sincrónicos en colon y recto, y en tracto gastrointestinal superior 16% (Vogt et al., 2009). El caso índice de este trabajo presentó CCR metacrónico; los portadores de la mutación no han sido afectados. Sin embargo, las investigaciones con estas familias arrojan un riesgo de padecer la enfermedad hasta 2,79 veces mayor, frente al de los controles sanos no portadores. (Olschwang, Blanche, de Moncuit, & Thomas, 2007). Esta variante no fue encontrada en los estudios de población hispánica. (Peterlongo et al., 2006; Theodoratou et al., 2010).
5.3. Cáncer colorrectal familiar no sindrómico
Históricamente, la evaluación de las familias con cáncer se ha enfocado en la búsqueda de síndromes conocidos con mutaciones en genes únicos asociados a un alto impacto fenotípico; sin embargo, la mayoría de los casos de CCR familiar no está asociado con mutaciones conocidas
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en línea germinal, lo cual sugiere la existencia de otros mecanismos involucrados en la patogénesis de la enfermedad (Cruz-Correa et al., 2013; Cruz-Correa et al., 2015; Torrezan et al., 2013). También puede ser que las técnicas utilizadas para buscar las mutaciones no son 100% sensibles o no se buscan en los pacientes adecuados. (E. M. Stoffel & Kastrinos, 2014). En el 80% de las familias muestreadas en este trabajo (55/69) no se encontraron mutaciones en genes conocidos alto impacto; de estas, el 9% (5/55) presenta criterios de Ámsterdam para síndrome de Lynch, con una historia fuerte de cáncer familiar. Diferentes autores han subdividido este tipo de familias desde la mirada de los fenotipos moleculares en dos: a) Aquellas que exhiben deficiencias en MMR, y b) Las que son competentes para MMR, sin presentar mutaciones conocidas en la línea germinal. Estas últimas generan problemas de diagnóstico, y para ellas se ha establecido que se presentan en: 1) Individuos afectados con CCR a edades ligeramente mayores que los del síndrome clásico. 2) El riesgo de tumores extracolónicos no está incrementado. 3) El riesgo de CCR en sus familiares se incrementa dos veces, en relación con los de las familias de pacientes que no presentan las dos primeras características. Para este tipo de familias se ha acuñado el término CCR familiar de tipo X. (Win et al., 2017). De acuerdo con esta clasificación y criterios, podría decirse que las familias D-3-18, I-3-2, I-3-3, I-3-7 y I-3-15 se ajustan parcialmente a la definición de CCR familiar de tipo X en un 73%, seguido de los que presentan adenomas, 16%, dado que presentan manifestaciones extracolónicas (carcinoma urotelial, cáncer de páncreas, cáncer de ovario). En estas familias el síndrome presenta generaciones consecutivas afectadas. El caso índice más joven tiene 32 años, y el mayor, 60. Se han realizado estudios de GWAS y de desequilibrio de ligamiento para 4p, 8q, 12q, 15q, 9q22 (Lindor et al., 2005; Peltomaki, 2016), y para 8q23, 8q24, 9p24, 11q23,18q21 (Cicek et al., 2012; Gray-McGuire et al., 2010), entre otros, sin resultados conclusivos, ya que las variantes, al parecer, son de efectos fenotípicos pequeños, o los SNP están localizados en regiones intrónicas, razones por las cuales se ha postulado que el riesgo no está asociado a un gen –no es monogénico-, sino a varios genes de bajo impacto en el fenotipo –es poligénico-. (Cancer Genome Atlas, 2012). Para las familias seleccionadas como tipo X en este trabajo se propone que el fenotipo de CCR es el resultado de un efecto poligénico. El promedio de edad es de 49 años (oscila entre 19 y 70); además, existe afectación en generaciones consecutivas, presencia de cánceres extracolónicos y sólo ocho casos no presentan antecedentes o son desconocidos.
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ar En este panorama también se deben considerar los eventos epigenéticos que afecten la expresión de oncogenes o de genes supresores tumorales, también objeto de estudio, comparando los perfiles de metilación de los casos de CCR, competentes y deficientes para MMR. Así, los tumores de las familias con síndrome CCR familiar tipo X con el fenotipo MMR competente tienen bajos niveles de metilación global en nucleótidos tipo LINE-1 (nucleótidos intercalados 1), cuando se comparan con los casos de CCR esporádico y con los tumores con MMR deficiente, asociados con Síndrome de Lynch. (Lindor, 2009). Otros investigadores han encontrado hipermetilación de MLH1 en línea germinal, en familias con clínica de síndrome de Lynch, pero sin mutaciones germinales en MMR. (Goel et al., 2010; Pavicic, Joensuu, Nieminen, & Peltomaki, 2012). Otros autores han propuesto que la hipometilación también puede estar implicada en la carcinogénesis de las familias con CCR. (Hitchins et al., 2007; Suter, Martin, & Ward, 2004). En algunos casos, el lograr tener material del tumor puede ayudar a clasificar de una manera más precisa los pacientes con este tipo de síndromes. (Antelo et al., 2012; Ogino et al., 2013).
Las 14 familias con fenotipo polipósico: D-3-2, D-3-3, D-3-10, D-3-11, D-3-23, D-3-28, I-3-5, I-3-8, I-3-11, I-3-13, H-3-4, O-3-1, U-3-5 y U-3-6, sin mutaciones en los genes examinados, presentaron más de cinco pólipos -hasta varios cientos de ellos-, con manifestaciones extracolónicas (carcinoma de tiroides y de glándula mamaria) y varias personas afectadas por CCR en diferentes generaciones. Para determinar el tipo de poliposis que presentaban se consideró el número de pólipos directamente relacionados con el tipo de gen afectado, así: pacientes con 20 a 99 adenomas, presentaron mutaciones en APC (10%) y MUTYH bialélicas (7%); pacientes con 10 a 19 adenomas, mutaciones en APC (5%) y MUTYH (4%). (Kravochuck & Church, 2016). Como se exploraron sólo estos dos genes, se tendría que pensar en un futuro en la posibilidad de la poliposis aserrada, recientemente reconocida con adenomas de tipo aserrado/hiperplásico asociadas con un riesgo estimado del 15 al 30% para CCR. (Grover et al., 2012). El mecanismo carcinogénico probable es la hipermetilación epigenética de las islas CpG (CIMP), con el consecuente silenciamiento de los genes supresores tumorales o del promotor del gen MLH1, con pérdida de la expresión de las proteínas MLH1 y PMS2. Sin embargo, en los casos índice de este trabajo, no fue posible caracterizar el tipo histológico aserrado o serrado, dado que este término aún no ha permeado totalmente a los patólogos, y los
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tumores siguen siendo clasificados como hiperplásicos (Rex et al., 2012), siendo imposible tener acceso a las láminas histológicas para su revisión. Las causas genéticas subyacentes, responsables de los casos sindrómicos de poliposis aserrada siguen sin dilucidarse, pero varias evidencias sugieren un componente genético de tipo germinal para: casos familiares de poliposis aserrada (Kalady et al., 2011), mutaciones bialélicas de MUTYH (Boparai et al., 2010; Win, Walters, et al., 2012) y desequilibrio de ligamiento en loci de cromosomas candidatos como 1p y 2p. (Boparai et al., 2008).
Los expertos en el tema plantean que la mayor parte, si no todos los genes de alto impacto en el riesgo relacionados con CCR familiar, ya han sido descubiertos y que gran parte de la variabilidad de dicho riesgo resulta de la combinación de alelos de riesgo de menor impacto fenotípico, con efectos aditivos (poligenia) y / o de la regulación epigenética de la expresión génica. (Rashid et al., 2000). De otra parte, algunos polimorfismos en diferentes genes que incluyen TGF-beta1, metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR), N-acetil transferasa 1 y 2 (NAT1 y NAT2 ) y glutatión -S -transferasa Mu (GSTM1) han sido implicados en un ligero aumento en el riesgo de cáncer a través de la interacción de genes con el medio ambiente y/o modificación de la expresión de otros genes asociados con el cáncer (Goel & Boland, 2010).
Por todo lo anterior, es importante clasificar estas familias como Cáncer Colorrectal Familiar sin otra especificación, hasta tanto no se considere ampliar el actual panel genético, a epigénetico y a genes de bajo impacto fenotípico.
Colombia es una población diversa, con ingresos per cápita bajos, con déficit en el sistema de salud subsidiado, la asesoría genética es de muy difícil acceso a los pacientes y más aún las pruebas genéticas moleculares para enfermedades poco frecuentes (K. W. Jasperson et al., 2010). Identificar mutaciones en enfermedades de baja frecuencia es importante, porque ayuda a realizar el tamizaje molecular en la población, facilitando el diagnóstico presintomático en miembros de familias afectadas, sobre todo en países con déficit en los registros poblacionales.
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Capítulo 6
CONCLUSIONES
Fuente: Freepik.es
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■ El CCR con agregación familiar está presente en un 17,5% en esta serie de pacientes colombianos.
■ Las familias con síndromes de CCR con agregación familiar asociada a genes conocidos constituyen el 5,4%. El síndrome familiar más frecuente es el de Lynch.
■ Las nuevas técnicas de secuenciación “next generation secuencing (NGS)” permitieron encontrar mutaciones en genes de alto riesgo para CCR con agregación familiar.
■ Este es el primer reporte, luego de 10 años, de la publicación de Giraldo et., al 2005, con datos genéticos y moleculares del síndrome de Lynch en Colombia. Se reportan 10 mutaciones en genes representativos del síndrome, así: siete en MSH2 y tres en MLH1. Estas frecuencias de mutaciones no se correlacionan con las observadas en otros trabajos, en los que la mutación más frecuente está en el gen MLH1.
■ Las mutaciones que más aparecieron fueron, en su orden: MSH2 c.1552C>T (30%) y c.G1034A (20%), ambas en pacientes de ascendencia antioqueña.
■ Se reportan dos mutaciones nuevas, una en MSH2 c.2458+1G>T y una en MLH1 c.545+1G>C, potencialmente patogénicas.
■ En el gen MSH2, se reportan para Colombia, por primera vez, las mutaciones c.1552C>T, c.C1801T, c.G1034A, c.C1216T, c.C1477T, c.528_529delins-TG. Y en el gen MLH1, la mutación c.C445T.
■ El 80% de las 69 familias estudiadas presenta CCR con agregación familiar no sindrómica, con varios antecedentes de cáncer (criterios clínicos de Ámsterdam y Bethesda) y poliposis, con un
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ar número de adenomas mayor a 10, lo cual genera la necesidad de buscar las causas genéticas asociadas al síndrome, con el fin de realizar una estimación del riesgo en dichas familias.
■ Este es el primer reporte para Colombia de síndrome polipósico asociado a SMAD4 c.403C>T y de poliposis asociada de MUTYH c.1437_1439delGGA.
Perspectivas y recomendaciones
En este estudio, la alta proporción de CCR en personas menores de 50 años (27%) puede corresponder a un síndrome algo diferente de “CCR de inicio temprano”. Se recomienda:
Realizar estudios epidemiológicos y de supervivencia para comprobarlo, ya que estos permitirían obtener una visión integrada de las alteraciones moleculares, de las asociaciones de las mismas con el fenotipo de la enfermedad, de sus consecuencias en la progresión tumoral, una mejor comprensión de la fisiopatología del CCR y la identificación de nuevas dianas terapéuticas, que darían lugar a un tratamiento más individualizado del paciente, de acuerdo con la edad de inicio.
Institucionalizar nuevos registros poblacionales de cáncer, ya que los mismos contribuyen, de manera importante, al control de la enfermedad, mediante la medición de la carga de la misma, y permiten acceder a información completa y confiable, que posibilita realizar estudios epidemiológicos para determinar los factores etiológicos que contribuyen a la incidencia del CCR en Colombia, especialmente en personas menores de 50 años, mediante la ejecución de proyectos relacionados con la genética básica del riesgo en diferentes tipos de cáncer.
Continuar con los bancos de tejido fresco, de tejido tumoral y de tejido normal, para análisis molecular, que con la evidencia actual permiten obtener mejor rendimiento en las técnicas moleculares. En este sentido, el grupo de Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones de la Universidad del Tolima, está dando sus primeros pasos, de la mano del Instituto Nacional de Cancerología, para generar el Biobanco Institucional de Sangre y Tejido Tumoral de la Universidad del Tolima, el cual optimizará las muestras en
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custodia del grupo y la información anexa, facilitando los procesos de investigación y las colaboraciones nacionales e internacionales.
Incluir dentro de los programas de tamizaje pruebas moleculares para CCR de riesgo asociado a agregación familiar de tipo germinal.
En este momento, en la mayoría de instituciones en el país, a los pacientes con CCR que son sometidos a resección colónica, se les está realizado el pronóstico y manejo de la enfermedad, basándose exclusivamente en el estado TNM, siendo evidente que hay una marcada variabilidad en los resultados de los mismos, con altas tasas de mortalidad. En consecuencia, se deben implementar clasificadores de pronóstico, con marcadores moleculares de fácil aplicación clínica y evidencia sustentada, que, sin duda, contribuirán a la toma de decisiones clínicas y, por lo tanto, mejorarán el pronóstico de los pacientes.
Ampliar el muestreo de pacientes con CCR a otras zonas del país, con el fin de comparar los resultados clínicos y moleculares.
Ampliar el análisis molecular en pacientes con CCR, para indagar variantes epigenéticas y los posibles fenotipos metilados, con el fin de dilucidar las vías carcinogénicas comprometidas con el inicio y con la progresión de la enfermedad.
Correlacionar el estatus mutacional de muestras más amplias de CCR con estudios de sobrevida y de respuesta a medicamentos, sobre todo en la enfermedad metastásica.
Realizar un estudio histopatológico de las diferentes variables de mal pronóstico (tamaño, angioinvasión, invasión vascular linfática, invasión perineural, pobre diferenciación, compromiso ganglionar, reacción linfocítica), relacionándolas en asociación con estudios de sobrevida.
Implementar dentro de los programas estatales de promoción y prevención del CCR las pruebas IHC y MSI, en relación con la identificación de las familias portadoras de alelos de alto riesgo para cáncer con agregación familiar, con lo cual, no sólo se establecerá la
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ar verdadera sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo o negativo de la prueba, sino que, además, se logrará una notable mejora en estos programas.
Los resultados exigen el establecimiento de un protocolo de análisis mutacional ajustado a la incidencia de mutaciones puntuales en el gen MSH2, que permitirá identificar las mutaciones causantes del síndrome en el país, facilitando a los terapeutas la consejería genética, para identificar personas en riesgo y portadores sanos, e incluirlos en los programas de prevención.
En las familias con CCR familiar no sindrómico se debe ampliar la búsqueda en genes de predisposición adicionales como EPCAM y/o estudios del exoma, que son necesarios para descifrar todo el espectro mutacional asociado a la predisposición del síndrome de Lynch en Colombia.
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REFERENCIAS
Fuente: Freepik.es
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227
ANEXOS
Fuente: Freepik.es
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Anexo A: abreviaturas
Abreviatura Significado
ACS American Cancer Society
ADN Ácido desoxirribonucleico.
AFAPAttenuated familial adenomatous polyposis - Poliposis familiar atenuada
AJCC American Joint Committee on Cancer
APCAdenomatous polyposis coli (APC). APC GENE; APC(MIM611731)
ARNm Ácido ribonucleico – mensajero
ASGE American Society for Gastrointestinal Endoscopy
ASR Age-standardised rate
BAX Gen BCL2-associated X protein (MIM600040)
BER Base excision repair - Reparación por escisión de bases
BMPR1ABone morphogenetic protein receptor, type IA (BMPR1A), mRNA
BRAFV-RAF MURINE SARCOMA VIRAL ONCOGÉNE HOMOLOG B1; BRAF (MIM164757)
BRRS Síndrome Bannayan-Riley-Ruvalcaba
BTP Brain-tumor polyposis
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arAbreviatura Significado
CAP Colegio Americano de Patólogos
CCR Carcinoma Colorrectal
CCS Síndrome Cronkhite-Canadá
CD Enfermedad de Crohn
CDH1 CADHERIN 1; CDH1 MIM(192090)
CHIBCHAGenetic study of Common Hereditary Bowel Cancers in Hispania and the Americas
CIMPCpG island methylator phenotype - Fenotipo metilador de islas CpG
CIMP-H CpG island methylator phenotype high
CIMP-L CpG island methylator phenotype low
CIN Chromosomal instability - Inestabilidad cromosómica
COSMIC Catalogue of somatic mutation un cáncer
CpG Island methylator phenotype
CS Síndrome de Cowden
CU Colitis ulcerativa
DAB Tetrahidrocloruro de 3,3´diaminobencidina
dbSNP Database SNP-NCBI
DCC DELETED IN COLORECTAL CARCINOMA (MIM120470)
DNMTs enzimas ADN-metiltransferasas
E.P.S Empresas sociales del estado
EDTA Ácido aminotetracético
EGFREPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR; EGFR (MIM131550.)
FAP Poliposis adenomatosa familiar
FD Factor de dilución
Ane
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Abreviatura Significado
FFPEFormalin Fixed Paraffin Embedded -Tejido incluido en parafina
G1, G2, G3 Grado 1, Grado 2, Grado 3.
GTP Guanosin-trifosfato
GWAS Genome-wide association studies
H-E Hematoxilina-Eosina
HGMD® The Human Gene Mutation Database
HMPS Síndrome de poliposis mixta hereditaria
HNPCCHereditary non-polyposis colorectal cancer Carcinoma colorrectal no polipósico hereditario
HP Poliposis hiperplásica
I.P.S Instituciones prestadoras de salud
IARCInternational agency for research on cancer - Agencia internacional del cáncer
ICG-HNPCC grupo colaborativo internacional de HNPCC
IGF-1R Insulin-like growth factor
IGV Integrative genomic viewer
IHC Inmunohistoquimica
IMC Índice de masa corporal
INC Instituto Nacional de Cancerología
InSIGHTThe International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumours Incorporated
JPS Síndrome de poliposis juvenil
K-Da Kilodalton
KRASV-KI-RAS2 KIRSTEN RAT SARCOMA VIRAL ONCOGÉNE HOMOLOG; KRAS (MIM190070)
LF Síndrome de Li-Fraumeni
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arAbreviatura Significado
LOH Loss of heterozygosity - pérdida de heterosigocidad
LOVD Leiden Open Variation Database
M Metástasis a órganos distantes
MAP Poliposis asociada al gen MUTYH
MCR mutation cluster region – APC
MeSH Medical Subject Heading
MGMT METHYLGUANINE-DNA METHYLTRANSFERASE; MGMT
MIMNúmero en el catálogo de un gen o carácter mendeliano en la base de datos OMIM
mL Mililitro
MLH1 MutL, E. COLI, HOMOLOG OF, 1; MLH1(MIM120436)
MLH3 MutL, E. COLI, HOMOLOG OF, 3; MLH3(MIM604395)
MMR Mismatch repair
MSH2 MutS, E. COLI, HOMOLOG OF, 2; MSH2(609309)
MSH6 MutS, E. COLI, HOMOLOG OF, 6; MSH6 (MIM600678)
MSI Microsatellite instability - inestabilidad microsatelital
MSI-H Alta inestabilidad microstaelital
MSI-L Baja inestabilidad en los microsatelites
MSS Estabilidad microsatelital
MTS Síndrome de Muir-Torre
MUTYH E. COLI, HOMOLOG OF; MUTYH(MIM604933)
N Compromiso de ganglios linfáticos
Ane
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Abreviatura Significado
NCBI National Center for Biotechnology Information
NCCN National Comprehensive Cancer Network Guidelines
NCI National Cancer Institute
ng Nanogramos
NGS Next generation sequencing
nm Nanómetros
NOS No especificado
NRASNEUROBLASTOMA RAS VIRAL ONCOGÉNE HOMOLOG; NRAS (MIM164790)
OMIM ON-line Mendelian Inheritance in Man
OMS Organización mundial de la salud
OR Odd Ratio
ORF Open reading frame - Marco Abierto de Lectura
P.C.RPolymerase Chain Reaction - reacción en cadena de la polimerasa.
PCR-FCE Fluorescent capillary electrophoresis
p16INK4aCYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 2A; CDKN2A(MIM600160)
PHTS Síndrome tumor hamartoma PTEN
PJS Síndrome de Peutz-Jeguer
PMS1POSTMEIOTIC SEGREGATION INCREASED, S. CEREVISIAE, 1; PMS1(MIM600258)
PMS2POSTMEIOTIC SEGREGATION INCREASED, S. CEREVISIAE, 2; PMS2 (MIM600259)
PNT Protocolo de normalización de trabajo
POLD1POLYMERASE (DNA-DIRECTED), DELTA 1, CATALYTIC SUBUNIT;(MIM174761)
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arAbreviatura Significado
POLE POLYMERASE, DNA, EPSILON; POLE (MIM174762)
PolyPhen-2 Polymorphism Phenotyping v2
PTENPHOSPHATASE AND TENSIN HOMOLOG; PTEN (MIM601728)
pTNM pathologic Tumor, Node, Metastasis
RETREARRANGED DURING TRANSFECTION PROTOONCOGÉNE; RET(MIM164761)
rpm revoluciones por minuto
SIFT sorts intolerant from toleran
SMAD4MOTHERS AGAINST DECAPENTAPLEGIC, DROSOPHILA, HOMOLOG OF, 4;(MIM600993)
SNPs Single nucleotide Polymorfism- polimorfismos de única base
SNVs Single nucleotides variants
STK11(LKB1) SERINE/THREONINE PROTEIN KINASE 11;(MIM602216)
Tm temperatura media
T Tamaño del tumor
TCGA The Cancer Genome Atlas
TGFβR transforming growth factor beta
Tis Carcinoma in situ
TNMTumor, Node, Metastasis: Tamaño del tumor, Gánglios linfáticos y Metastásis
TP53 TUMOR PROTEIN p53; (MIM191170)
UCSC University of California Santa Cruz
ug Microgramos
Ane
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Abreviatura Significado
UICC Unión Internacional Contra Cáncer
uL Microlitro
USMTF Sociedad multitarea para Estados Unidos
VPH virus del Papiloma Humano
WHO World Healt Organization
wnt wingless-type MMTV integration site family
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ar Anexo B: Consentimientos Informados
CONSENTIMIENTO INFORMADO CASOS CCR
Universidad del Tolima
Grupo de Investigación Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones
Entrevista del Programa de Investigación Análisis Genético de Enfermedades Humanas
Consentimiento Informado Casos CCR Código:
Por favor lea con detenimiento este documento y la carta "Información sobre la investigación", que lo acompaña. Si después de
ello, usted está interesado en participar en la investigación, señale con una X el cuadro de Sí (si acepta) o de No (si no acepta) en
cada uno de los enunciados que aparecen a continuación. Si no entiende completamente o si desea más información, por favor,
pregúntenos antes de firmar.
Investigación: Análisis genético de enfermedades humanas
Nombre del paciente: Fecha y lugar de nacimiento:
Yo confirmo que he leído y entendido la carta "Información sobre la investigación" y que tuve la
oportunidad de hacer preguntas y de solucionar todas las dudas al respecto.Sí No
Yo entiendo que mi participación es voluntaria y que puedo retirarme de la investigación si lo
deseo, sin necesidad de argumentar ninguna razón ante el investigador principal.Sí No
Yo autorizo al investigador principal y a las personas designadas por él para que revisen mi historia
clínica con el propósito de llevar a cabo la presente investigación. También autorizo a dicho
investigador y a las personas designadas por él para que fotocopien y archiven dicha información,
la cual solo podrá ser usada en análisis confidenciales.
Sí No
Yo autorizo a que el investigador principal y las personas designadas por él tengan acceso a las
muestras de tejido cancerígeno y normal previamente removidas en las biopsias, y tomen placas
de ellas.
Sí No
Yo autorizo, como pariente de primer grado, del paciente _____________________________
_______, ya fallecido, al investigador principal y las personas designadas por élpara que tengan
acceso a las muestras de tejido cancerígeno y normal previamente removidas en las biopsias y
tomen placas de ellas.
Sí No
Yo autorizo al investigador principal y a las personas designadas por él a que me tomen tres
muestras de sangre para que las almacenen y utilicen en la presente investigación. Una de
dichas muestras puede ser usada para establecer una línea celular. Yo entiendo que las muestras
proporcionadas serán anonimizadas. Sólo el investigador principal, y las personas autorizadas por
él tendrán acceso a dicha información y a los resultados obtenidos con ellas.
Sí No
Yo autorizo al investigador principal y a las personas designadas por él para que usen mis
muestras de sangre y otros tejidos, con el fin de investigar y entender los factores genéticos
involucrados en el cáncer.
Sí No
Yo entiendo que la presente investigación producirá beneficios para humanidad en general y
no necesariamente para mí como individuo. Sin embargo, si los hallazgos encontrados en mis
muestras son de interés, estoy de acuerdo en que mi médico tratante, el Dr. ________________
_________________, sea informado al respecto.
Sí No
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237
Yo autorizo a que las muestras de tejido y de sangre que he proporcionado sean almacenadas
y estudiadas por el investigador principal y por las personas designadas por él en futuras
investigaciones relacionadas con los aspectos genéticos del cáncer colorrectal y de otras
enfermedades humanas, así como de genética de poblaciones.
Sí No
Yo autorizo al investigador principal y a las personas designadas por él para que utilicen mis
muestras de tejido cancerígeno y de sangre en centros de investigación del país y del exterior.Sí No
Yo estoy de acuerdo en participar en la presente investigación. Sí No
Nombre del paciente y número de cédula Firma y fecha
Persona que obtiene el consentimiento (testigo 1) Firma y fecha
Persona que obtiene el consentimiento (testigo 2) Firma y fecha
Contacto en Colombia: Universidad del Tolima, Grupo de Citogenética, filogenia y evolución de poblaciones, Ibagué, Tolima,
Colombia, Tel. 3163033776. 3118488284, 3152430924.
Correo electrónico: [email protected] [email protected]
CONSENTIMIENTO INFORMADO CASO ÍNDICE – FAMILIAS
Universidad del TolimaGrupo de Investigación Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones
Entrevista del Programa de Investigación Análisis Genético de Enfermedades Humanas
Consentimiento informado para familias.
En mi calidad de paciente con cáncer COLORRECTAL, habiéndoseme explicado por parte de mi médico tratante la importancia de vincular al programa de investigación: “Análisis genético de enfermedades humanas”, a miembros de mi familia los cuales pueden ser informativos para enfermedades como el cáncer, autorizo al Grupo de Investigación Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones a contactar a mis familiares, con el fin de informarles del programa de investigación y visitarlos para informarles de la investigación.
Firma del paciente;
Nombre del paciente;
Testigo n1: Nombre y apellido cedula firma
Testigo n2: Nombre y apellido cedula firma
Ciudad y fecha:
Contacto en Colombia: Universidad del Tolima, Facultad de Ciencias, Grupo de Citogenética, filogenia y evolución de poblaciones, Ibagué, Tolima, Colombia, Tel. 3163033776. 3118488284.
Correo electrónico: [email protected] [email protected]
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arCONSENTIMIENTO INFORMADO CONTROLES
Universidad del TolimaGrupo de Investigación Citogenética, Filogenia y Evolución de Poblaciones
Entrevista del Programa de Investigación Análisis Genético de Enfermedades Humanas
Consentimiento informado controles Código:
Por favor lea con detenimiento este documento. Si después de ello, usted esta interesado en participar, como control, en la investigación, señale con una X el cuadro del Sí (si acepta) o del No (si no acepta) en cada uno de los enunciados que aparecen a continuación. Si no entiende completamente o si desea más información, por
favor, pregúntenos antes de firmar.
Programa de investigación: Análisis genético de enfermedades humanasAprobado por el comité de ética de la Universidad del Tolima mediante acta del 27 de junio de 2005.
Nombres y apellidos del control: Fecha y lugar de nacimiento:
Yo confirmo que he sido informado adecuadamente de los objetivos del proyecto y que tuve la oportunidad de hacer preguntas y de solucionar todas las dudas al respecto.
Sí No
Yo entiendo que mi participación es voluntaria y que puedo retirarme de la investigación si lo deseo, sin necesidad de argumentar ninguna razón ante el investigador principal.
Sí No
Yo autorizo al investigador principal y a las personas designadas por él, a que me tomen 10 centímetros cúbicos de sangre para que los almacenen y utilicen en la presente investigación. Una de dichas muestras puede ser usada para establecer una línea celular. Yo entiendo que las muestras proporcionadas serán anonimizadas. Solo el investigador principal y las personas autorizadas por él tendrán acceso a dicha información y a los resultados derivados de ellas.
Sí No
Yo autorizo a el investigador principal y a las personas designadas por él para que usen mis muestras de sangre con el fin de investigar y entender los factores genéticos involucrados en diversos tipos de carcinomas (colorrectal, de tiroides, entre otros) y de otras enfermedades genéticas humanas.
Sí No
Yo autorizo a que las muestras de sangre que he proporcionado sean almacenadas y estudiadas por el investigador principal y por las personas designadas por él en futuras investigaciones relacionadas con los aspectos genéticos del cáncer colorrectal y de otras enfermedades humanas.
Sí No
Yo autorizo al investigador principal y a las personas designadas por él para que utilicen mis muestras de sangre en centros de investigación del país y del exterior.
Sí No
Yo estoy de acuerdo con participar en la presente investigación. Sí No
______________________________________ ___________________ Nombre del participante y cédula Fecha Firma_____________________________________ ___________________ Persona que obtiene el consentimiento (testigo 1) Fecha Firma______________________________________ ____________________ Persona que obtiene el consentimiento (testigo 2) Fecha Firma
Contacto en Colombia: Universidad del Tolima, Facultad de Ciencias, Grupo de Citogenética, filogenia y evolución de poblaciones, Ibagué, Tolima, Colombia, Tel. 3163033776. 3118488284,
Correo electrónico: [email protected] [email protected]
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CARTA DE INFORMACIÓN INVESTIGACIÓN
Universidad del Tolima, grupo de Citogenética, filogenia y evolución de poblacionesUniversidad de California, grupo de Genética Humana
INFORMACIÓN SOBRE LA INVESTIGACIÓN
Análisis genético de enfermedades humanas, programa de Investigación aprobado por el Comité de Ética de la Universidad del Tolima mediante acta del 27 de junio del 2005.
Área: estudios genéticos de cáncer en Colombia El cáncer es una enfermedad cuya incidencia está creciendo en nuestra región. En ocasiones puede ser causada por factores genéticos, en algunos casos heredables y en otros, no. Nuestro grupo de investigación está estudiando personas con y sin historia familiar de cáncer, con el fin de identificar aquellos genes asociados con el riesgo a presentar dicha enfermedad. Los pacientes han sido identificados a través de nuestros colegas médicos en los hospitales.
Con el fin de desarrollar el programa solicitamos su colaboración para responder algunas preguntas relacionadas con la forma de presentación de la enfermedad y con sus antecedentes familiares de cáncer. Si usted tiene familiares con historia previa de cáncer, se le pedirá el favor de contactarlos para saber si ellos estarían interesados en participar en el estudio.
La participación en la investigación requiere la donación 15 ml de sangre, de los cuales se extraerá el material genético (ADN y ARN) y, de ser posible, se establecerá una línea celular. En esta investigación también se le harán preguntas relacionadas con su historial médico y se le pedirá autorización para revisar su historia clínica.
Si a usted le han extirpado tumores, se le preguntará en qué hospital se los extrajeron y, si nos autoriza la entrega de una parte de ellos, que a criterio de los medicos sea sobrante y no perjudique los estudios del paciente, dichos tumores también serán analizados en la investigación.
Es posible que nuestros estudios revelen hallazgos que tengan aplicaciones clínicas. Si esto sucede, le pediremos autorización para informar a su médico tratante al respecto.
Por favor, no dude en contactarnos si desea mayor información o si quiere discutir cualquiera de los aspectos relacionados con su participación en el estudio y con el uso de las muestras que usted donará. Nos puede contactar en los teléfonos y correos electrónicos del programa, que se encuentran al final de esta carta. Si usted desea participar en la investigación por favor déjenos la siguiente información y conserve una copia de esta carta:
MÉDICO TRATANTE ----------------------------------------------NOMBRE PACIENTE ----------------------- CÉDULA ____________________________DIRECCIÓN ---------------------------------------------------TELÉFONO celular______________ fijo ____________________
FIRMA _____________________________________
Muchas gracias por su colaboración. Estaremos atentos a sus comentarios.
Contacto en Colombia: Universidad del Tolima, Facultad de Ciencias, Grupo de Citogenética, filogenia y evolución de poblaciones, Ibagué, Tolima, Colombia, Tel. 3163033776. 3118488284, 3152430924.
Correo electrónico: [email protected] [email protected] [email protected]
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