GLICOSIDOS CARDIOTONICOS

DEFINICION

Los glicósidos cardiotónicos son sustancias amargas

constituidas de una porción esteroide, una

porción glicosídica y un anillo de gama-lactona ,

alfa,ß-insaturada o delta-lactona-alfa,ß-

insaturada, que actúan sobre el músculo

cardiaco y por tanto se utilizan como

medicamentos contra la insuficiencia cardiaca.

Se conocen entonces según el anillo lactónico dos

grandes clases de cardiotónicos: Los

CARDENOLIDOS, con anillo de gama-lactona,a

y los BUFANOLIDOS O ESCILANOLIDOS,

con anillo de delta-lactona.

Los glicósidos cardiotónicos son sustancias constituidas de una porción esteroide,

una porción glicosídica y un anillo de ¡-lactona a,ß-insaturada o d-lactona-a,ß-

insaturada, que actúan sobre el músculo cardiaco y por tanto se utilizan como

medicamentos contra la insuficiencia cardiaca. Se conocen entonces según el

anillo lactónico dos grandes clases de cardiotónicos: Los CARDENOLIDOS, con

anillo de ¡-lactona, y los BUFANOLIDOS O ESCILANOLIDOS, con anillo de d-

lactona. La figura 24 muestra la estructura estereoquímica general de ambas

clases de sustancias.

glicósidos cardiotónicos: incrementan la fuerza de contracción del corazón

actúan sobre el corazón fortaleciendo el trabajo cardiaco. La fracción de hidratos de carbono que constituyen los glicosidos, contienete de 3 a 5 monosacaridos , por lo general desoxiazucares o azucares especiales. Para que el compuesto resulte activo, deben estar presentes al menos un OH en el C3 en ß (que constituye el glicosido) y otro en el C14 en ß, metilos en ß, en C10 y C13; una lactona unida al C17 correspondiente a una g-lactona a –insaturada (cardenolido), o una d-lactona a, ß-insaturada ( bufadienolido), y los anillos A/B y C/D deben estar en cisBIOSINTESIS

La progesterona formada se condensa con una unidad C2 para dar origen a una cadena lateral de 4 carbonos típica de los cardenólidos.La posterior oxidación y deshidratación origina el anillo γ-lactonaα,ß-insaturada.Posteriormente ocurre la glicosilación.

DISTRIBUCION NATURAL

Principalmente en las hojas de plantas de las familias Scrofulariaceae, Apocynaceae, Liliaceae, Ranunculaceae y Moraceae.Los bufanólidos se han encontrado también en ranas del género Bufus, y en las alas de mariposas monarca, han sido considerados de interés por su potencial anticancerígeno.

DISTRIBUCION NATURAL

• Cardenólidos: familias

Scrofulariaceae, Apocynaceae,

Liliaceae, Ranunculaceae y

Moraceae

• Bufanólidos: en ranas del género

Bufus, y en las alas de mariposas

monarca

 ENSAYOS DE RECONOCIMIENTO

Los cardenólidos se pueden reconocer en muestras biológicas mediante los ensayos de coloración con varios reactivos nitro, tal como se anotó para las sesquiterpenlactonas; específicamente con los reactivos de Kedde, Legal y Raymond. Al igual que las saponinas esteroides, dan resultados positivos con el reactivo de Liebermann-Burchard, lo que permite diferenciarlos de las terpenlactonasy las cumarinas.

Kedde

Legal

Raymond

Liebermann-Burchard

Ensayosparacarbohidratos

(Molisch, antrona, etc.)

• Keller-Kiliani:

Para 2-deoxiazúcares

A.- ENSAYO DE KEDDE (PARA CARDIOTONICOS)Precaución: La

formación del color violáceo no dura sino algunos pocos

segundos.Ensayo: Tomar 1 ml de la fase orgánica. Llevar a sequedad.

Redisolver en 1 ml dealcohol. Añadir 0.5 ml de reactivo de Kedde recién

prepa rado (Mezcla de partes igualesde las soluciones A y B). Se

considera positiva la prueba si aparece una coloraciónpúrpura o

violácea. Como referencia se puede compa rar con el color producido

con 1ml de KOH al 5% en alcohol.

B.- HIDROLISIS

Los glicósidos cardiotónicos se hidrolizan fácilmente en soluciones

ácidas liberando la sapogenina y los carbohidratos ligados. En medio

alcalino, además de liberarse la sapogenina ocurre la apertura del anillo

lactónico.

10. HECHOS ESTRUCTURALESLos cardiotónicos naturales en su

gran mayoría, poseen:Un anillo lactónicoa,ß-insaturado en posición

17ßUn grupo hidroxilo o glicosilo en posición 3ßUn grupo hidroxilo

en posición 14ßConfiguración cis entre los anillos A/B y C/DOtros

grupos hidroxilo en 1, 5, 12, 16, etc.El grupo metilo 19 algunas veces

oxidado hasta alcohol o aldehído1 a 4 unidades de carbohidrato

ligadas al oxígeno del carbono 3Los carbohidratos ligados son

principalmente glucosa y desoxiazúcarescomo digitoxosa, cimarosa,

etc.Los desoxiazúcares son una característica importante de los

glicósidos cardiotónicos, ya que esta clase de carbohidratos se

encuentra prácticamente restringida a estas sustanciasnaturales.

HECHOS

ESTRUCTURALES

Un anillo lactónico alfa,ß-insaturado en posición 17ß.

Un grupo hidroxilo o glicosilo en posición 3ß.

Un grupo hidroxilo en posición 14ß.

Configuración cis entre los anillos A/B y C/D

Otros grupos hidroxilo en 1, 5, 12, 16, etc.

El grupo metilo 19 algunas veces oxidado hasta

alcohol o aldehído.

1 a 4 unidades de carbohidrato ligadas al oxígeno del

carbono 3.

Los carbohidratos ligados son principalmente glucosa

y desoxiazúcares como digitoxosa, cimarosa, etc.

Los desoxiazúcares son una característica importante

de los glicósidos cardiotónicos, ya que esta clase de

carbohidratos se encuentra prácticamente restringida

a estas sustancias naturales.

11. EXTRACCION Y AISLAMIENTOAl igual que las saponinas

esteroides y otros glicósidosterpenoides, los cardiotónicos pueden

aislarse en forma glicosídica o como sapogeninas.En el primer caso

se utiliza el método ya descrito para las saponinas esteroides

(desengrase, extracto polar, resina de intercambio iónico,

Sephadexy cromatografía), mientras que en el segundo caso se

realiza una hidrólisis ácida seguida de partición con un solvente

orgánico (generalmente cloroformo) y cromatografía en sus

diferentes formas, especialmente con sílica gel.Para el

fraccionamiento por cromatografía en columna con sílica gel pueden

utilizarse mezclas de solventes comDiclorometano/Metanol/Agua

91:22:683.Luego de este fraccionamiento e hidrólisis ácida, las

geninas pueden analizarse y separarse por HPLC-fase

reversa4,5,6,7; mientras que los carbohidratos ligados pueden

analizarse por cromatografía en papel eluyendo con la mezcla

Butanol/Acido Acético/Agua 4:1:58.Recientemente y gracias al

avance de las denominadas técnicas "on-line" y el desarrollo de

interfaces HPLC-Espectrometría de masas se pueden analizar

extractos crudos que contienen glicósidos cardiotónicos o saponinas,

mediante técnicas combinadas como LC-TMS (HPLC combinada

con Espectrometría de masas con interfasetermospray) y

LC-CF/FAB (HPLC combinada con Espectrometría de masas FAB

de flujo continuo)9.

12. VALORACION EN PRODUCTOS FARMACEUTICOSLa mejor

técnica para valorar los glicósido cardiotónicos en extractos

vegetales y productos farmacéuticos es HPLC.Otros métodos de

valoración de los cardiotónicos son la colorimetría con el Reactivo de

Kedde y métodos biológicos en los que se determina la Dosis Letal

Mínima (DL-50), el volumen de vómito en palomas, el paro cardíaco

en gatos y con el corazón aislado de ranas, y los métodos

enzimáticos.

13. ACCION FARMACOLOGICA Y RELACION ESTRUCTURA-

ACTIVIDADTienen acción inotrópica positiva, es decir, incrementan

las fuerzas de contracción del músculo cardíaco. Por otro lado, las

hojas de digital tienen un efecto diurético. Por estas razones se les

utiliza en tratamientos de nefritis, edemas y algunas enfermedades

infecciosas. Se ha establecido que para que los cardiotónicos

manifiesten su actividad requieren además del ciclo lactónicoa,ß-

insaturado, que:La configuración sea 14ß,3ß,17ßconfiguración A/B

cisAdemás, se ha observado que la presencia de azúcares ligados y

el número de hidroxilos tienen capacidad en aumentar la actividad

farmacológica.

Extracción y aislamiento

Glicósidos: Extracción ídem a lo descrito para las

saponinas esteroides (desengrase, extracto polar, resina

de intercambio iónico, Sephadex y cromatografía)

Sapogeninas: Extracción con hidrólisis ácida seguida de

partición con un solvente orgánico (generalmente

cloroformo) y cromatografía en sus diferentes formas,

especialmente con sílica gel.

Cromatografía en columna (Sílica gel, Diclorometano-

Metanol/Agua 91:22:68)

Extracción con hidrólisis ácida, las geninas pueden

analizarse y separarse por HPLC-fase reversa; mientras

que los carbohidratos ligados pueden analizarse por

cromatografía en papel eluyendo con la mezcla

Butanol/Acido Acético/Agua 4:1:5.

HPLC-Espectrometría de masas

LC-TMS (HPLC combinada con Espectrometría de

masas con interface termospray)

LC-CF/FAB (HPLC combinada con Espectrometría de

masas FAB de flujo continuo).

CARACTERISTICAS

ESPECTRALES

• Espectroscopia Infrarrojo: Los

cardiotónicos además de las bandas

características de la funcionalidad

esteroide, presentan bandas de

absorción características del grupo

carbonilo lactónico alfa,ß-insaturado

alrededor de 1715-1725 cm-1.

• b. Espectroscopia UV: El

cromóforo gama-lactona-alfa ,ß-

insaturada muestra un máximo de

absorción alrededor de 215-220 nm.

• c. Espectrometría de masas 70 eV:

Agliconas m/z 111, M-44.

Glicósidos: Espectrometría de masas

FAB en modo positivo o negativo.

PRINCIPALES DROGAS VEGETALES QUE CONTIENEN CARDIOTONICOS

Hojas de digital

La droga la constituyen las hojas desecadas de Digitalis purpurea (Fam.

escrofulariácea). Esta planta es cultivada en Europa, pero en nuestro país es más

bien escasa y se utiliza con fines ornamentales. Se la conoce con el nombre

vulgar de "campanitas" o "dedalera" y crece silvestre en localidades como a orillas

de la autopista Medellín-Bogotá en el sector de Sasaima. Los principios activos

son una mezcla de glicósidos cardiotónicos denominados purpureaglicósidos, en

los cuales la sapogenina es la digitoxigenina. Uno de estos es el

purpureaglicósido A:

La especie relacionada Digitalis lanata, también contiene glicósidos cardiotónicos

pero con la característica particular de que uno de los carbohidratos ligados posee

un grupo hidroxilo acetilado. Esta especie contiene los denominados lanatósidos

como por ejemplo:

La especie D. lanata, aunque es originaria de Europa, también se encuentra en

nuestro país, específicamente en la sabana de Bogotá.

Estas drogas vegetales se comercian en Europa bajo nombres comerciales como

DigitalinaÔ, CardinatinaÔ, CristalloxinaÔ, DigoxinaÔ, etc.

Para el análisis HPLC de esta droga puede consultarse el trabajo de Ikeda y

col.26, y este autor también ha reportado el análisis cuantitativo mediante

Cromatografía en Capa Fina de Fase Reversa 27.

El género Isoplexis fam. Escrofulariáceas contiene cardenólidos similares a los de

Digitalis28.

Estrofanto

Esta droga la constituyen las semillas desecadas de varias especies de plantas

del género Strophantus, y es usada como veneno de flechas por los nativos de

algunas tribus de Africa. Esta droga contiene el glicósido estrofantina:

Azuceno de la habana

Corresponde al Nerium oleander (Fam. Apocináceas). Esta planta es cultivada

para fines ornamentales, y es común verla en diferentes sitios de la ciudad de

Medellín, con flores rosadas o blancas. La variedad de flores blancas tiene

reportados usos como antídoto, antibacterial, antiepiléptico, anticancerígeno,

cardiotónico y como depresor del Sistema Nervioso Central (SNC). De las raíces, Huq y col., aislaron un cardenólido que además de cardiotónico es antibacterial29.

Las hojas contienen varios cardenólidos con acción depresora sobre el SNC 30.

Thevetia peruviana

Las semillas de esta planta contienen cardiotónicos como el peruvósido:

Lirio de los valles

La droga la constituyen las partes aéreas de Convallaria majalis (Fam. liliáceas).

Esta contiene varios cardiotónicos, entre ellos la convalatoxina:

Bulbo de escila

La droga la constituyen los bulbos de Drimia maritima (Fam. liliáceas). Contiene

bufanólidos como el escilareno-A el cual produce irritación gástrica la que a su vez

induce la secreción de los bronquiolos, por lo cual se usa como expectorante.

Heléboro negro

Corresponde al Helleborus niger (Fam. Ranunculáceas).

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

 INTRODUCCIÓN

La insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) aparece cuando el corazón es incapaz

de atender las necesidades del organismo mediante un funcionamiento normal. El

corazón     aumenta   de   tamaño, pierde fuerza de contracción y por tanto, la

capacidad de bombear sangre con la eficacia requerida.

El tratamiento clásico de la ICC va dirigido a reducir los factores que la provocan y

a mejorar la función del miocardio, lo cual se puede alcanzar incrementando la

eficacia por aumento de la fuerza contráctil y el vaciado del corazón con agentes

inotrópicos positivos (cardiotónicos).

La especie vegetal

Thevetia peruviana, originaria de la América tropical y naturalizada en la región del

Valle de Aburrá sintetiza metabolitos secundarios tipo glicósidos cardiotónicos, los

cuales almacena en hojas y semillas. Esta premisa fue la motivación para llevar a

cabo la extracción, purificación, identificación y cuantificación de este tipo de

glicósidos presentes en la planta mencionada.

Los glicósidos cardiotónicos son de estructura esteroidal y se caracterizan por

llevar en el C-17 del núcleo   esteroideo un anillo de lactona insaturado. Las

diferentes sustituciones del C-17 dan lugar a diversas actividades o funciones, que

son   aprovechadas para la elucidación estructural. 

Entre los glicósidos cardiotónicos se encuentran los cardenólidos, productos

naturales que aparecen en diversas plantas, estos compuestos   poseen un anillo

pentagonal con un doble enlace conjugado con el carbonilo en C-17. Además,

ellos presentan azúcares como sustituyentes, entre los más importantes se puede

mencionar   la glucosa y 6-desoxiazúcares (ramnosa, mucosa, digitalosa), así

como 2,6-desoxiazúcares (digitoxosa, cimanosa).

El presente trabajo incluye el proceso de extracción sólido-líquido de los glicósidos

cardiotónicos de las hojas de Thevetia peruviana a través de una metodología

optimizada de separación y purificación, así como su respectiva identificación

estructural y cuantificación.

La cromatografía de columna fue la técnica implementada para la separación de

los componentes de la mezcla, en tanto que la elucidación estructural fue

alcanzada con la ayuda de   la espectroscopia   de Resonancia Magnética Nuclear

(1H- y 13C-RMN) y

su cuantificación se logró mediante cromatografía de alta resolución acoplada a

masas, (HPLC-MS), permitiendo determinar por primera vez la cantidad de

principios activos presentes en estos compuestos.

Para las mediciones espectroscópicas y de cuantificación contamos con el apoyo

del Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear de la Universidad Nacional de

Colombia – Sede Bogotá y del Laboratorio de de Cromatografía Líquida de la

Sede de Investigaciones Universitarias, SIU, de la Universidad de Antioquia.

 Thevetia peruviana

Seguidamente se detallan algunas características específicas de la especie

vegetal de estudio.

Familia: Apocynáceae 

Sinónimos: Cerbera peruviana , Thevetia neriifolia 

Nombre común: Catape, cascabel, azuceno 

Lugar de origen: México y América tropical

Etimología: Thevetia, en honor a André Thévet (1502-1590), misionero francés

que colectó plantas en Suramérica. Peruviana, del latín peruvianus-a-um,

procedente de Perú. 

Cultivo y usos: Se multiplica por semillas, es una planta de rápido crecimiento y

muy resistente a condiciones adversas. Se suele cultivar más como arbusto que

como árbol. Su látex y semillas son venenosas. Las hojas y semillas contienen

glucósidos que actúan como estimulantes cardíacos; aunque es utilizada en

medicina

popular su empleo inadecuado es muy peligroso.

Los criterios para la selección de la Thevetia peruviana que se utilizará en el

presente trabajo de grado se basaron en su disponibilidad geográfica y en el alto

contenido de glicósidos cardiotónicos reportado para esta familia.

Figura 6. Thevetia peruviana

      3.5. Propiedades químicas

Las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos corresponden a las

esperadas de su estructura y considerable tamaño, así, ellos son sólidos

cristalizables, insolubles ó poco solubles en agua, solubles en alcoholes y en

cloroformo. La solubilidad depende de la naturaleza de la aglucona y de la cadena

de azúcares, entre mayor sea el número de residuos de azúcar, mayor será la

solubilidad.

HIPÓTESIS

Dado que muchas reacciones y compuestos que intervienen en el metabolismo en

los diferentes grupos de organismos vivos son casi idénticos, se les denomina

reacciones y productos metabólicos primarios. Sin embargo, una amplia variedad

de rutas bioquímicas son exclusivas de unas pocas especies de organismos y se

conocen colectivamente como “metabolismo secundario”, y a los compuestos

generados como metabolitos secundarios, los cuales usualmente son señalados

por los químicos como “productos naturales”.

La formación de productos naturales es una característica común de células

especializadas, originada por la acción de enzimas específicas que juegan un

papel decisivo en el desarrollo y función del organismo productor como un

conjunto. Actualmente se reconoce que muchos de estos compuestos

desempeñan un papel vital como mediadores de interacción biológica, asegurando

la supervivencia de un organismo en un medio hostil y competitivo. Tales

interacciones incrementan el interés por el estudio de los productos naturales,

imprimiendo a este campo un carácter interdisciplinario, que abarca la química, la

biología y la botánica, entre otras áreas. La razón principal de estos estudios

radica en la utilización de los productos naturales en medicina, conduciendo a la

búsqueda de nuevas plantas potencialmente útiles por parte de químicos y

biólogos, así como de compañías farmacéuticas que enfocan sus investigaciones

en las propiedades de plantas muy reconocidas en la medicina popular.

Con relación a las enfermedades

cardíacas, la frecuencia de cardiopatías congénitas constituye un problema de

salud que va en aumento en la medida que la población es más longeva; para su

tratamiento se utilizan glicósidos cardiotónicos, especialmente cardenólidos,

causando un efecto que se manifiesta en el sistema cardiovascular ocasionando el

aumento de la contracción sistólica, lo que se denomina acción inotrópica positiva.

Los glicósidos cardiotónicos están presentes en especies vegetales de las familias

de las Apocynáceas y Asclepydáceas, donde la especie vegetal más importante e

investigada para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el corazón es

la Digitallis purpurea2, conocida como Digital, de la cual se extraen compuestos

como la digitoxina que posee una gran cantidad de estos cardenólidos

encaminados a producir el efecto inotrópico positivo mencionado.

Kyeremematen y Hagos3, de la Facultad de Farmacia del Centro Biomédico

Uppsala en Suecia, realizaron un estudio de los compuestos presentes en las

especies Thevetia ovata y Thevetia nereifolia, encontrando tres glicósidos

cardiotónicos tipo cardenólido, para los cuales se caracterizó una estructura

formada por un anillo esteroidal y residuos de glucosa en la posición del C-3 y un

compuesto lactonizado en la posición del C-17.

En este marco de referencia y señalando que pese al gran interés práctico de las

plantas de Thevetia peruviana, el estudio de su química ha sido muy limitado, el

presente trabajo de investigación centra su interés en el estudio de los

compuestos químicos presentes en las hojas de la especie vegetal Thevetia

peruviana, perteneciente a la familia

de las Apocynáceas, originaria de la América tropical y naturalizada en el Valle de

Aburrá. Se espera que los metabolitos secundarios aislados puedan ser

aprovechados a futuro en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Acorde con estas expectativas se han fijado los siguientes objetivos:

3.1 OBJETIVO GENERAL

Extraer, purificar, identificar y cuantificar los glicósidos   cardiotónicos presentes en

las hojas de la especie vegetal Thevetia peruviana, naturalizada en la región del

Valle de Aburrá.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

  * Seleccionar y adecuar un método eficiente para la extracción y purificación de

los glicósidos cardiactivos existentes en las hojas de Thevetia peruviana.

  * Utilizar ensayos conocidos para la identificación cualitativa de las partes  

componentes de los glicósidos cardiotónicos.

  * Llevar a cabo la identificación estructural de los compuestos de interés con la

ayuda de técnicas espectroscópicas convencionales.

  * Cuantificar mediante cromatografía HPLC-Masas la cantidad de metabolitos

cardiotónicos presentes en las hojas de Thevetia peruviana con el fin de disponer

de estándares puros de glicósidos cardiotónicos de esta especie, aún no

disponibles y que serán de gran ayuda como indicadores en la identificación de

cultivos provenientes de esta planta.

  4. EQUIPOS

Figura 10. Rotaevaporador

Figura 11. Muestras extraidas y purificadas listas a analizar

Figura 12. Cromatografía de columna

Figura 13. Esquema de la cromatografía de columna

Figura 14. TLC (Thin Layer Chromatography)

  5. METODOLOGIA

5. METODOLOGIA

La secuencia

de etapas que permitieron extraer, separar, purificar y cuantificar los glicósidos

cardiotónicos presentes en las hojas de Thevetia peruviana, se esquematizan en

el diagrama 1 (ver final del capítulo).

Después de un tratamiento preliminar de la muestra se efectuó un tamizaje

fitoquímico, etapa inicial de toda investigación fitoquímica que permite determinar

cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos

(fundamentalmente metabolitos secundarios) presentes en una planta, y a partir

de esta información, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos

para el aislamiento de los grupos de mayor interés. Específicamente, el tamizaje

fitoquímico consiste en la extracción de los componentes químicos de la planta

con disolventes apropiados y la aplicación de reacciones de coloración que

permitan la evaluación rápida, sensible, reproducible y de bajo costo de los

mismos.

El desarrollo de la secuencia de etapas específicas de la metodología

implementada se describe a continuación.

5.1. Recolección y tratamiento preliminar de la muestra

La recolección del material vegetal se llevó a cabo en las riberas de la quebrada

La Iguana, localizada en el sector urbano de la ciudad, en cercanías de la

Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín. 

La Thevetia peruviana es un arbusto de 3 a 5 m de altura, con la corteza grisácea,

lenticelada, algo rugosa con los años. Hojas de linear-lanceoladas a lanceoladas,

de 10-15 x 0,5-1,2 cm, con la base atenuada, el margen entero y el ápice corta o

largamente acuminado; son glabras, algo coriáceas, de color verde lustroso en el

haz, algo

más claras en el envés, con el nervio central destacado y la nerviación secundaria

poco visible.

Después de su respectivo lavado, se procedió a su   secado durante dos días a

temperatura ambiente, luego se trituró de tal forma que el material vegetal tuviera

un tamaño promedio de 0.5 cm.

5.2. Preparación de la muestra

En esta etapa se incluyeron los procesos de licuado, filtración desgrasado, lavado,

cromatografía de capa delgada y rotaevaporación, que se detallan seguidamente.

Licuado: 250 g de hojas de Thevetia peruviana (TP) previamente seca y triturada

se someten a un licuado con 400 mL de éter de petróleo durante 10 minutos para

aumentar el área superficial y así poder extraer la mayor cantidad de

cardenólidos. 

5.3. Extracción

Una vez que la TP se ha licuado, se procede a realizar una filtración al vacío para

recolectar el extracto etéreo y eliminar los residuos de las hojas.

Dicho concentrado se lavó tres veces con metanol en una relación de volumen

(metanol / éter de petróleo) 3:1 para retirar las grasas en suspensión que se

forman durante este proceso y que son retenidas en un embudo de separación

buchner.

Después se concentran las muestras por medio de rotaevaporación y se realiza un

seguimiento de los compuestos por medio de cromatografía de capa fina para

verificar la presencia de los cardenólidos en la muestra.

5.4.   ANALISIS CUALITATIVO

Después del lavado y una filtración al vacío se debe comprobar la existencia de

cardenólidos en el compuesto extraído, para ello se realizó un análisis cualitativo.

Para comprobar de forma cualitativa la presencia de cardenólidos en

el extracto obtenido, se realizaron los siguientes ensayos con reacciones

coloreadas: 

  * Presencia de azúcares (desoxiazúcares).

  * Presencia del núcleo esteroideal.

  * Reacciones del anillo de lactona.

5.4.1. Desoxiazúcares

Para comprobar la presencia de azúcares utilizamos la reacción de Keller Killiani: 

En un tubo de ensayo se disuelve un poco del extracto metanólico (1 mL) en ácido

acético con algo de tricloruro de hierro. Sobre esta disolución se deja caer por las

paredes ácido sulfúrico y tricloruro de hierro. En la superficie de contacto aparece

un anillo pardo y una capa acética azul verdosa, que muestra la presencia de los

desoxiazúcares. Este ensayo resultó positivo para la muestra analizada.

Reacción de Keller-Killiani

CH3COOH + FeCl3 + H2SO4     TP     Color verde azul (Fase acética)

5.4.2. Anillo esteroidal

Para comprobar la presencia del anillo esteroidal se llevó a cabo la reacción

Liebermann-Burchnard.

A 1 mL de muestra disuelta en etanol, se le adiciona anhídrido acético (5 mL) y

ácido sulfúrico concentrado (5 mL), recién preparados, se agita con acido acético y

se deja reposar en un baño de hielo. La aparición de un color violeta verde es

indicativo de la presencia del anillo esteroidal.

La reacción de Liebermann-Burchard se realiza en un medio ácido fuerte

constituido por ácido sulfúrico, ácido acético y anhídrido acético. En la reacción, el

esteroide sufre una oxidación gradual, formándose en cada etapa una molécula de

colestapolieno, que posee un doble enlace adicional con respecto al compuesto

del cual deriva. La etapa inicial de esta reacción consiste en la

protonación del grupo OH del colesterol con la consiguiente pérdida de agua,

obteniéndose el ión carbonio 3,5-colestadieno que constituye el primer paso de la

reacción del color. La oxidación secuencial de este ión carbonio alílico por el SO2-

produce un ácido colesta-hexano-sulfónico con características cromofóricas. 

Al igual que en los pruebas anteriores, este ensayo arrojó un resultado positivo

sobre la muestra de estudio.

5.4.3. Anillo pentagonal de lactona

Reactivo de Raymond-Marthoud.

Este reactivo se prepara a partir de 1 g de m-dinitrobenceno en 100 mL de etanol

y la adición de hidróxido de potasio. La presencia de un color violeta confirma la

estructura del anillo lactónico.

Reactivo de Kedde

Para preparar este reactivo se requiere ácido 3,5-dinitrobenzoico (al 3% en

metanol) y la adición de hidróxido de potasio (al 6% en H2O). Un color rojo violeta

señala la presencia del anillo lactónico. 

Estos dos ensayos también dieron resultados positivos, confirmando la presencia

del anillo lactónico.

5.5. Cromatografía de columna

          5.5.1. Separación a través de cromatografía de columna

Con el extracto vegetal concentrado se realizaron   placas cromatográficas con

diferentes combinaciones de solventes para poder determinar la mejor separación

de los compuestos de interés, el mejor resultado fue obtenido para la relación

tolueno/acetato de etilo (3:1).

Con esta combinación de solventes y con el fin de separar los compuestos del

extracto vegetal, ese efectuó el montaje de columnas cromatográficas con silica

gel 60, en tanto que la cromatografía de capa fina fue utilizada para

controlar la pureza de las fracciones obtenidas.

Al realizar la columna cromatográfica se observan dos franjas bien diferenciadas

por su color, de la primera franja de color verde oscuro se recolectaron las

fracciones 3-11, las cuales dieron lugar   a un compuesto puro.   Las placas

cromatográficas de las fracciones 12-23, no presentaron ningún compuesto.

La segunda franja de color pardo, correspondiente a las fracciones 24-30 presentó

impurezas en   las placas cromatográficas tomadas en tolueno/acetato de etilo

(3:1), por lo que se procedió a realizar una   nueva columna cromatográfica

modificando la proporción de disolventes (tolueno/acetilo de etilo en relación de

volumen 5:1) dando un compuesto puro, pero en cantidad mínima.

Las dos muestras fueron rotuladas y enviadas al laboratorio de Resonancia

Magnética Nuclear de la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá para

su identificación espectroscópica.

Resultados

La caracterización espectroscópica de los cardenólidos se apoya principalmente en la resonancia magnética nuclear de protones y carbono (1H- y 13C-RMN), en la espectrometría de masas y en los espectros simulados; es de resaltar que todas las señales experimentales concuerdan con las predichas. Dado que el glicósido Thevetin A   solo puedo aislarse en una cantidad mínima, que permitió la comprobación de su estructura por medio de masas, la discusión de resultados está referida a la molécula de   Thevetin B.

Conclusiones

1. Se comprobó la presencia de metabolitos secundarios tipo glicósidos

cardiotónicos en la planta de Thevetia peruviana naturalizada

en nuestra región.

2. Mediante técnicas tradicionales de separación y purificación como son, la

extracción, filtración y cromatografía en columna, se logró aislar y purificar dos

metabolitos secundarios tipo glicósidos cardiotónicos en las hojas de la planta

Thevetia peruviana, naturalizada la región de Antioquia. Su elucidación estructural

se efectuó con espectroscopia de RMN y cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC-MS) acoplado a masas.

3. Además, mediciones de UV-VIS permitieron la cuantificación del cardenólido  

Thevetin B en la especie vegetal de estudio.

4. El método desarrollado para extraer y caracterizar los glicósidos cardioactivos

fue eficiente y condujo a resultado satisfactorios, por tanto puede implementarse  

para el análisis de   glicósidos cardiotónicos de otras especies vegetales.

Bibliografía

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