Hondakin koipetsuen ustiapena entzimen bidez · Laborategiko erreaktoreak (0.5 L) 48 3.2. Bost...

Hondakin koipetsuen ustiapena entzimen bidez

Jakintza-arloa: Biokimika

Egilea: EVA MARIA FERNANDEZ DE LABASTIDA AMURRIO

Urtea: 2006

Zuzendariak: MAILO VIRTO LEKUONA, MERCEDES RENOBALES SCHEIFLER

Unibertsitatea: UPV/EHU

ISBN: 978-84-8438-500-4

Hitzaurrea

Ikerlan honetan erabilitako hondakin koipetsuak bi motatakoak izan ziren. Alde batetik, hiltegietatik jasotako animalia-gantzak, eta bestaldetik, erabilitako landare-olioak. Substratu hauen ezberdintasunik nagusienak euren konposaketa gantz-azidotan (ase-gehiago animalia-gantzetan) eta hasierako hidrolisi-mailak (altuagoa animalia-gantzetan) izan ziren. Koipeen eraldaketa nahiko ikertu bada ere, hondakin koipetsuen ustiapena era entzimatikoan, berriz, ez da hain ohikoa.

Aztertutako tratamenduak bi izan ziren: hidrolisia (gantz-azido askeak eta glizerola lortzeko) eta transesterifikazioa edo esterifikazioa ester metilikoak ekoizteko. Tratamendu hauek gantz eta olio komertzialekin askotan erabili badira ere, hondakinekin, esan bezala, ez hainbeste, eta horrez gain, literaturan lipasa komertzialen arteko alderaketak aurkitzea ez da ohikoa. Hidrolisi erreakzioak burutzeko 6 lipasa aztertu ziren; ester metilikoak ekoizteko, berriz, 3 lipasa immobilizatu. Lipasa hauen guztien ezaugarriak ikertu ziren tratamenduen baldintzarik egokienak zehaztu baino lehen. Lipasa hauen arteko alderaketa bi eratan egin zen. Alde batetik, euren ezaugarri fisiko-kimikoak ikertu ziren. Bestaldetik, euren erabilera tratamenduetan aztertu zen.

Lan hau garatzeko ezinbestekoa izan zen nire tesi-zuzendarien laguntza. Izan ere, nire tesi-zuzendarien aurreko ikerketa-lerro beretik jarraitzen du ikerlan honek. Kasu horretan gantz komertzialen hidrolisi entzimatikoa ikertu bazen ere. Honez gain, INASMET Fundazioari eskertu behar diot hiltegietatik jasotako animalia-gantzen hidrolisia ikertzeko aukera ematea. Bukatzeko, tesi hau ez zatekeen posiblea izango EHUko Euskara Errektoreordetzaren “Euskarazko tesiak sustatzeko beka”-ri gabe. Beka honek izugarrizko bultzada eman zion tesiari eta euskaraz egiteko asmoa buruan banuen ere, ekimen honek tesia euskaraz egitera animatu ninduen.

Eva Fernandez de Labastida2014

HONDAKIN KOIPETSUEN

USTIAPENA

ENTZIMEN BIDEZ

Elikagaien Zientzia eta Teknologian Doktore gradua eskuratzeko

aurkeztutako memoria

Eva Maria Fernandez de Labastida Amurrio

Vitoria-Gasteiz, 2006.

Aurkibidea

i

I. SARRERA 1

1. HONDAKIN KOIPETSUAK 3

1.1. Jatekoak ez diren animalia-gantzak 4

1.2. Erabilitako landare-olioak 5

2. HONDAKIN KOIPETSUEN KUDEAKETA 8

2.1. Araudia 8

3. HONDAKIN KOIPETSUEN BERRERABILERA 12

3.1. Hidrolisia 14

3.2. Biodieselaren ekoizpena 17

4. LIPASAK 22

4.1. Ezaugarri nagusiak 22

4.2. Lipasen erabilera industrialak 27

HELBURUAK 31

II. MATERIAL ETA METODOAK 33

MATERIALAK 35

1. GANTZAK ETA OLIOAK 35

1.1. Hondar-gantzak 35

1.2. Erabilitako landare-olioak 35

1.3. Gantz eta olio komertzialak 36

2. LIPASAK 36

2.1. Hidrolisi-erreakzioak 36

2.2. Esterifikazio-erreakzioak 37

3. ERREAKTIBO ETA DISOLBATZAILEAK 38

Aurkibidea

ii

METODOAK 39

1. GANTZ ETA OLIOEN KARAKTERIZAZIOA 39

1.1. Azidotasun indizea (AI) 39

1.2. Saponifikazio indizea (SI) 39

1.3. Hidrolisi-maila 40

1.4. Konposaketa gantz-azidotan 41

1.5. Hondakin koipetsuen lipidoen determinazioa 42

2. LIPASEN KARAKTERIZAZIOA 42

2.1. Aktibitate lipolitikoaren determinazioa 42

2.2. Esterifikazio aktibitatearen determinazioa 45

3. HIDROLISI ERREAKZIOAK 48

3.1. Laborategiko erreaktoreak (0.5 L) 48

3.2. Bost litroko erreaktorea 49

3.3. Berrogei litroko erreaktorea 50

4. METILAZIO ERREAKZIOAK 51

4.1. Erreakzio etenak 51

4.2. Erreakzio jarraiak 52

5. HIDROLISI ETA ESTERIFIKAZIO PRODUKTUEN

KARAKTERIZAZIOA 53

5.1. Gantz-azido askeak (GAA) 53

5.2. Hidrolisi eta esterifikazio produktuen karakterizazioa gas-

kromatografiaren bidez 53

5.3. Glizerolaren determinazio entzimatikoa 54

III. EMAITZAK 57

GANTZ ETA OLIOEN EZAUGARRIAK 59

1. AZIDOTASUN ETA SAPONIFIKAZIO INDIZEAK. HASIERAKO

HIDROLISI-MAILA 59

2. KOIPEEN LIPIDOAK 60

Aurkibidea

iii

3. KONPOSAKETA GANTZ-AZIDOTAN 60

LIPASEN KARAKTERIZAZIOA 65

1. GANTZ ETA OLIOEN HIDROLISI OSORAKO EGOKIAK DIREN

LIPASEN KARAKTERIZAZIOA 65

1.1. Aktibitate lipolitikoa 66

1.2. pH-ren eragina aktibitate lipolitikoan 68

1.3. Tenperaturaren eragina aktibitate lipolitikoan 71

1.4. pH-ren eragina lipasen egonkortasunean 75

1.5. Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean 80

1.6. Substratu-ereduen hidrolisia 85

1.6.1. Gantz-azidoen ekoizpena 86

1.6.2. Glizerido partzialen determinazioa 89

2. ESTER METILIKOAK EKOIZTEKO ERABILITAKO LIPASEN

KARAKTERIZAZIOA 94

2.1. Esterifikazio aktibitatea 94

2.2. Tenperaturaren eragina aktibitatean 97

2.3. Substratuen kontzentrazioaren eragina aktibitatean 99

2.4. Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean 109

2.5. Ester metilikoen eragina egonkortasunean 112

2.6. Metanolaren eragina lipasen egonkortasunean 113

HONDAKIN KOIPETSUEN TRATAMENDUAK 115

1. HONDAR-GANTZEN ETA OLIOEN HIDROLISIA 115

1.1. Animalia-gantzen hidrolisia 116

1.1.1. Gantza:ura proportzioaren eragina 116

1.1.2. Tenperaturaren eragina 118

1.1.3. Gehitutako lipasaren eragina 120

1.1.4. Saio erdi-pilotoa 122

1.1.5. Glizerolaren determinazioa ur-fasean 123

1.2. Erabilitako landare-olioen hidrolisia 124

Aurkibidea

iv

1.2.1. Gehitutako lipasaren eragina 125

1.2.2. Tenperaturaren eragina 127

1.2.3. Saio erdi-pilotoa 129

2. ESTER METILIKOEN SINTESIA 131

2.1. Erreakzio etenak 132

2.1.1. Olioaren transesterifikazioa 133

2.1.1.1. Metanolaren eragina 133

2.1.1.2. Lipasen kontzentrazioaren eragina 135

2.1.2. Esterifikazioa 147

2.1.2.1. Lipasen kontzentrazioaren eragina 149

2.2. Erreakzio jarraiak 152

2.2.1. Transesterifikazioa 153

2.2.2. Esterifikazioa 154

3. EMAITZEN LABURPENA 157

IV. ONDORIOAK 163

V. BIBLIOGRAFIA 167

Laburdurak

LABURDURAK AEB Ameriketako Estatu Batuak AI Azidotasun Indizea ASTM American Society for Testing and Materials (Ameriketako

Saioetarako eta Materialetarako Elkartea) BAUN Batch Acidolysis Unit Novo (Novo Azidolisi unitateak) BOE Boletín Oficial del Estado (Estatuaren Aldizkari Ofiziala) BSA Bovine Serum Albumin (Behi Seroalbumina) BSE Bovine Spongiform Encephalopathy (Behi entzefalopatia

espongiformea) BSTFA N,O-Bis-(trimethylsylyl)-trifluoroacetamide (N,O-Bis-

(trimetilsilil)-trifluoroazetamida) DG Diglizeridoak DOCE Diario Oficial de las Comunidades Europeas (Europako

Batasunaren Aldizkari Ofiziala) Ea Aktibazio energia EB Europar Batasuna EBB European Biodiesel Board (Europako Biodiesel Elkartea) EC European Commission (Europako Batzordea) EHAA/BOPV Euskal Herriko Agintaritzaren Aldizkaria/Boletín Oficial del

País Vasco EM Ester metilikoak FAO Food and Agriculture Organization (Elikagaien eta

Nekazaritza Erakundea) FAOSTAT FAO Statistical Databases (FAO-ren datu-base estatistikoak) GA Gantz-azidoak GAA Gantz-azido Askeak GAT Gantz-azido Totalak

Gantz-azidoak

C4

C12

C14:0

C16:0

C16:1 Δ9

C18:0

cC18:1 Δ9

tC18:1 Δ9

cC18:2 Δ9, 12

cC18:3 Δ9,12, 15

Azido butirikoa

Azido laurikoa

Azido miristikoa

Azido palmitikoa

Azido palmitoleikoa

Azido estearikoa

Azido oleikoa

Azido elaidikoa

Azido linoleikoa

Azido linolenikoa

IUN Interesterification Unit Novo (Novo Interesterifikazio

Laburdurak

Unitateak) K Kelvin graduak K.a. Kristo aurretik K.o. Kristo ondoren ki Inhibizio konstantea MG Monoglizeridoak PLU Propyl Laurate Units (Propil-laurato unitateak) PNRU Plan Nacional de Residuos Urbanos (Hiri hondakinen nazio

plana) RPdH Residuos Peligrosos del Hogar (Etxeetako hondakin

arriskutsuak) rpm Revolutions per minute (Bira minutuko) SI Saponifikazio indizea TG Triglizeridoak U Unitateak UHKPI/PIGRM Udal Hondakinak Kudeatzeko Plan Integrala/Plan Integral

de Gestión de Residuos Municipales USDA United States Department of Agriculture (Estatu Batuetako

Nekazaritza Saila)

I. SARRERA

I. Sarrera

3

Elikagai-industriak sortzen dituen hondakinen kudeaketa oso

garrantzitsua da gaur egun. Mundu osoan hondakin guztien kudeaketa

jasangarriaren aldeko apustua dago, halaber elikagai-industriak sortutako

hondakinena. Hondakinek ingurumenari egindako kalteek eta gero eta

murritzagoak diren ingurumen-legeriek interes handia sortu dute gai honetan.

Hondakinak kudeatzeko hainbat aukera aurki daitezke: hondakinen

murrizketa jatorrian, berrerabilera, berreskurapena eta ezabapena (Bates eta

Phillips, 1999). Aukera hauek ingurumen-legeria berrietan agertzen diren

printzipioekin bat datoz. Administrazioak hondakinen murrizketa sorlekuan

hobesten badu ere, kasu gehienetan hori ez da posible. Horregatik, guztiz

beharrezkoak dira berrerabilerapen- edo berreskurapen-estrategiak sortutako

hondakinak balioztatzeko. Horrela industriek, ingurumen-legeriak betetzeaz

gain, hondakinak tratatzetik etekin ekonomikoa atera daitekeela ikusiko dute.

Hala ere, kontuan hartu behar da berreskurapena nola egingo den,

ingurumenari ahalik eta kalte gutxien egiteko. Hori dela eta, entzimen bidezko

hondakinen tratamendua nabarmentzen ari da (Karam eta Nicell, 1997).

1. HONDAKIN KOIPETSUAK

Azken hamarkadetan gantz eta olioen ekoizpen mundiala izugarri

handitu da. Honen ondorioz, hondakin koipetsuak ere handitu dira eta

etorkizunean are gehiago handituko direla espero daiteke, FAOSTAT-ren

(FAOSTAT, 2005) datuen arabera, 1. irudian ikus daitekeen bezala. Aipatzekoa

da landare-koipeen eta olioen ekoizpenaren igoera, azken 20 urteetan bikoiztu

dena. Gantzen eta olioen kontsumo mundialaren %14 industriagintza

oleokimikoan erabiltzen da (Gunstone, 1999).

I. Sarrera

4

0102030405060708090

100

1961 1970 1980 1990 2000Urtea

Gan

tz e

ta o

lioen

eko

izpe

na

(tona

x10

6 )

1. irudia. Azken hamarkadetan munduan ekoitzitako: animalia-gantz eta landare-koipe eta olioak (FAOSTAT, 2005).

Gantzen eta olioen ekoizpen eta kontsumo handiek azpiproduktu eta

hondakin asko sortzen dituzte. Hondakin hauen artean, almazaretan eta hazi

koipetsuen tratamendu-lantegietan sortutakoak, jatekoak ez diren animalia-

gantzak eta elikagai-industrietan erabilitako landare-olioak aurki daitezke,

ikerlan honetan erabilitakoak aipatutako azken bi mota hauek izanik.

1.1. Jatekoak ez diren animalia-gantzak

Animalia-elikagaiak ekoiztean azpiproduktu ugari sortzen dira,

Ockerman eta Hansen-en (1994) arabera produktuaren hasierako pisutik %50

arte hel daitezkeenak. Izan ere, Europar Batasunean urtean 16 milioi tona

inguru animalia-azpiproduktu sortzen dira (EB, 2004). Azpiproduktu hauek

hainbat motatakoak izan daitezke (proteikoak, koipetsuak,...) eta guztiz

beharrezkoa da haien aprobetxamendua haragi-industriak ekonomikoki

lehiakorrak izateko eta ingurumenaren kutsadura saihesteko. Azpiproduktu

hauek jangarriak edo ez-jangarriak izan daitezke.

I. Sarrera

5

Animalia-azpiproduktu jangarri koipetsuen kasuan, bilgorrak eta

margarinaren ekoizpenean, gozogintzan eta kuzinatzeko erabiltzen diren

hainbat mailatako gantzak ditugu. Jangarriak ez diren gantzak, ezpurutasunak

(odol, hezur edo proteina-hondarrak) dituztenak, hainbat prozesu

industrialetan erabili dira maiz, neumatikoen, labaingarrien eta intsektiziden

ekoizpenean (Ockerman eta Hansen, 1994). Esate baterako, jangarria ez den

bilgorra era industrialean erabili izan da gantz-azido askeen ekoizpenean, gero

beste produktu kimiko eta kosmetiko batzuen ekoizpenerako erabil

daitezkeenak; baita kalitate handiko olio industrialak, xaboiak eta glizerina

ekoizteko ere.

Jangarriak ez direnei dagokienez, orain dela hainbat urte arte, giza-

elikakatean sartzen ez ziren animalia-azpiproduktu ugari animalia-

elikadurarako erabiltzen ziren pentsu eta haragi-irinak ekoitziz. Produktu hauei

gantzak gehitzen zitzaizkien hainbat helburu betetzeko: balio energetikoa

handitzeko, hautsaren ekoizpena saihesteko, kolorea eta testura hobetzeko,

palatabilitatea handitzeko eta granulazioa hobetzeko (Ockerman eta Hansen,

1994). Baina azken urteotan hainbat elikagai-segurtasuneko alarma gertatu eta

gero (Behien Entzefalopatia Espongiformea (BSE), dioxinek eragindako

kutsadura, sukar aftosoa eta txerri-sukarra), animalia-azpiproduktuen erabilera

giza- eta animalia-elikakatetan murriztu da.

1.2. Erabilitako landare-olioak.

Azken urteotan frijitzeko olioen erabilera handitu da, batez ere, etxetik

kanpo gero eta gehiago jaten delako eta “fast food” delako janariaren

kontsumoa ugaldu delako. Frijitutako elikagaiak oso azkar prestatzen dira eta

jaten errazak dira, euren urre-kolorea, testura kurruskaria eta palatabilitate ezin

hobea direla eta (Dobarganes eta lank., 2002). Horregatik, erabilitako landare-

olioaren kantitatea asko handitu da azken denboraldietan. Japonian urtean 400

I. Sarrera

6

tona inguru olio ezabatzen da (Watanabe eta lank., 2001) eta AEBn urtean 3800

milioi litro hondar-olio ekoizten omen dira (Wilson, 2002).

Elikagaiak frijitzean hainbat aldaketa fisiko-kimiko gertatzen dira.

Honen ondorioz, olioaren kalitatea gutxitzen da eta olioaren egitura aldatzen

da. Olioan zerbait frijitzean gertatzen diren erreakzioak 2. irudian laburtzen

dira. Esate baterako, elikagaiak duen hezetasunak olioaren hidrolisia eragiten

du, oxigenoak konposatu oxidatuak sortzen ditu eta tenperatura altuek

eraldaketa termikoa eragiten dute. Prozesu hauek guztiek hainbat eraldaketa

eragiten diete olioei: olioen biskositatea eta dentsitatea handitzen dituzte, pisu-

molekular altuko polimeroak sortzen direlako; kolorea iluntzen da, Maillard

erreakzioak gertatzen direlako; aparra sortzen da, sortutako polimeroen

ondorioz; ultramore absortzioa handitzen da; konposaketa gantz-azidotan

aldatzen da erabili gabeko olioarenarekin alderatuta, gantz-azido intsaturatuen

degradazioaren ondorioz, gantz-azido saturatuen kopurua handitzen delako,

eta azidotasun maila handitzen da, triglizeridoen hidrolisiaren ondorioz

(Dobarganes eta lank., 2002).

Erabilitako landare-olioek arazoak sortzen dituzte udal-sareko ur-

arazketan. Izan ere, oso ohikoa da olioak isurbidetik botatzea, batez ere,

etxekoetatik. Elikagaien industrietan, “catering” enpresatan eta jatetxetan gero

eta ohikoagoa da hondakin hauek biltzea. Enpresa espezializatuek erabilitako

olioak biltzen eta birziklatzen dituzte, araztu ondoren, xaboiak, olio labaingarri

edo jariakin hidraulikoak sortuz (Dorado eta lank., 2002). Honez gain,

ingurumen-arautegi berriak erabilitako olioen bilketaren eta ondorengo

balioztapenaren alde daude. Lehen, hondakin hauek pentsuen ekoizpenerako

eta industria kosmetikorako (xaboiak eta eratorriak sortzeko) erabiltzen ziren.

Orain, berriz, olio hauek aprobetxatzeko bide berriak bilatzen ari dira, adibidez,

biodieselaren sintesia.

I. Sarrera

7

2. irudia. Elikagaiak frijitzean olioan eta janarian gertatzen diren erreakzioen eskema, Quaglia eta lankideek (1998).

I. Sarrera

8

2. HONDAKIN KOIPETSUEN KUDEAKETA

Hondakin koipetsuak bildu eta tratatu ezean, ibaien uretara iristen dira,

ura kutsatuz eta arazo ekologiko larriak sortuz (Canler eta lank., 2001). Ibaietara

iristen den olioak oxigenazioa eta gasen trukaketa ekiditen duen eta uren

arazketa egokia zailtzen duen azaleko geruza fina sortzen du. Honez gain,

olioek eta gantzek hainbat arazo sor dezakete hondar-uren tratamenduetan

(Stoll eta Gupta, 1997):

Olioak eta gantzak likatsuak direnez, estolderia eta hoditeria buxatzeko

joera dute. Halaber, zikinkeria-usainak sortzen dituzte eta hainbat

mikroorganismoren garapena sustatzen dute.

Araztegietara heltzean ur-azalean gelditzen dira geruza moduan eta

hodietara eta hormetara itsasten dira iragazkiak buxatuz. Honez gain, aparrak

sortzen dituzte.

Oxigenoaren transferentzia-koefizientzea murrizten dute.

Lohietan adsorbitutako koipeek lohien materia lehorra gutxitzen dute,

uraren ezabapena zailduz. Honek guztiak lohiaren dekantazioa zailtzen du.

Horregatik guztiagatik, guztiz beharrezkoa da gantzak eta olioak

hondar-uretatik bereiztea, jatorrian biltzea eta tratatzea arazo horiek guztiak

saihesteko.

2.1. Araudia

Indarrean den ingurumen-legeriaren barnean hainbat erregulazio-maila

daude, Europar Batasuneko arautegitik udal-hondakinak kudeatzeko planetara.

Hondakinak kudeatzeko EBko estrategiak hurrengo gaiak nabarmentzen ditu:

Prebentzioa sustatzea (hondakinak sorlekuan gutxitzea).

I. Sarrera

9

Balioztapena sustatzea (birziklapena, berrerabilera eta balioztapen

energetikoa ezartzea).

Ezabapena gutxitzea (esaterako, isurketan behin-betiko ezabapen

optimoa eta kontrol handiagoa sustatzea).

Europar Batasunean ingurumen-legerik garrantzitsuena 156/1991/EB

zuzentaraua, “Hondakinen zuzentaraua”, (DOCE, 1991) da. Bere xedapen

nagusiak honako hauek dira: Definizioak (hondakin etab., 1. artikulua);

hondakin-kudeaketaren printzipioen hierarkia: prebentzioa, balioztapena eta

ezabapen kontrolatua (3. eta 4. artikuluak); behin-betiko ezabatu behar diren

hondakinei aplikatutako hurbiltasun eta autosufizientzia printzipioa eta

hondakinak ezabatzeko instalazioen sare integratuaren sorrera (5. artikulua);

estatuek hondakinen kudeaketa-planak ezarri beharra (7. artikulua); ezabapen

eta balioztapen operazioak egiten dituzten enpresei baimena ematea (9. eta 10.

artikuluak); eta “kutsatzen duenak, ordain dezala” printzipioa (15. artikulua).

Espainian 10/1998 legeak, apirilaren 21ekoak (BOE, 1998), indarrean

ziren testuak batu eta Europako arautegiaren arabera moldatu zituen, gaur

egungo lege-markoa eratuz. Lege honek hondakinen ekoizpena, jabetza eta

kudeaketa zein erregimenera egokitu behar diren ezartzen du. Estatuaren eta

autonomia-erkidegoen arteko eskubimenen banaketa kontuan hartzekoa da.

Izan ere, autonomia-erkidego gehienek euren ingurumen-arautegi propioa

ezarri dute. Euskal Autonomia Erkidegoak 3/1998 legea, otsailaren 27koa,

Euskal Autonomia Erkidegoko ingurugiroa babesten duena (EHAA, 1998),

ezarri zuen. Lege honek hondakinen bilketa selektiboaren sistemen ezarpena

sustatzen du, hondakinen birziklapena edo beste balioztapen modu batzuk, eta

hondakinen balioztatzeko eta berreskuratzeko azpiegituren ezarpena bultzatuz.

Espainiako 10/1998 legetik (BOE, 1998) Ingurumen Ministerioak Hiri-

hondakinen Nazio-plana 2000-2006 (PNRU, Plan Nacional de Residuos

Urbanos, 2000-2006) garatu zuen (Ministerio de Medio Ambiente, 2000). Plan

I. Sarrera

10

honen oinarrizko helburuen barruan hurrengo bi hauek daude: hondakinek

duten materia organikoaren balioztapena (konposta, biometanizazioa, eta beste

energia mota batzuen ekoizpenaren bidez) eta 2006ko abenduaren 31 baino

lehen 1000 biztanle baino gehiago duten herri eta hiri guztietan hondakin

bilketa selektiboa ezartzea. PNRU-k olio eta koipeen bilketa selektiboa

aurreikusten du zenbait baliabideen bidez: edukiontzi espezifikoak jarriz,

sentsibilizazio-kanpainak eginez, eta tratamendu eta birziklapen-enpresekin

akordioak eratuz. Erabilitako olioaren %50 biltzea espero zen 2002 urterako eta

2006rako %80ra iristea aurreikusten da.

PNRU-z gain, 10/1998 legeak udal hondakin-kudeaketa planen garapena

ere aurreikusten zuen. Honen adibidea Gasteizko “Udal hondakinak

kudeatzeko plan integrala” (“Plan Integral de Gestión de Residuos Municipales

de Vitoria-Gasteiz”, PIGRM) dugu. Plan honek lehen aipatu hondakin

balioztapenerako urrats guztiak garatzen ditu eta erabilitako landare-olioak

“Etxeko Hondakin Arriskutsuak (Residuos Peligrosos del Hogar, RPdH)”

multzoaren barruan sailkatzen ditu eta euren bilketa selektiboa ezartzen du.

Hondakin hauen bilketa kamioi baten bidez egiten da, “Puntu Berde

Mugikorra” delakoaren bidez, hain zuzen ere. Kamioi hau hiritik ibiltzen da

etxeko hondakin arriskutsuak bilduz. Hondakin hauek baimendutako

kudeatzaile batek jasotzen ditu. Eredu moduan, 1999n 12.1 tona erabilitako

landare-olio bildu ziren (Vitoria-Gasteizko Udala, 2000: PIGRM, 2000-2006).

Ingurumenari buruzko araudiez gain, elikagaiei buruzko araudiak ere

kontuan hartzekoak dira, batez ere, azpiproduktuei edo hondakinei buruzkoak.

Izan ere, elikagaien segurtasuna bermatzeko hainbat ekimen jarri dira martxan.

Adibidez, “El libro Blanco sobre la Seguridad Alimentaria” (EC, 2000) zeinen

helburua elikagaien arloko Europar Batasunaren araudia berritzeko eta

osatzeko beharrezkoak diren ekintzak deskribatzea baita. Araudia

koherenteagoa, ulergarriagoa eta malguagoa egin nahi da, bere ezartze egokia

bermatzeko eta kontsumitzaileei gardentasun gehiago eskaintzeko, era berean

I. Sarrera

11

elikagaien segurtasun maila handia bermatzeko. Halaber, “Entzefalopatia

espongiforme transmitigarri jakin batzuk prebenitzeko, kontrolatzeko eta

erauzteko xedapenak” 999/2001/EB (DOCE, 2001) eta “Giza-kontsumorako ez

diren animalia-azpiproduktuekiko osasun arauak” 1774/2002/EB (DOCE,

2002) arautegiak onartu dira.

Gaur egun eta 1774/2002/EB (DOCE, 2002) arautegiaren arabera

animalia-azpiproduktuak animalia beraientzako, pertsonentzako edo

ingurumenerako arrisku potentzialen arabera hiru mailatan sailkatzen dira:

1. maila. Hurrengo baldintzetan egon daitezkeen animalia-

azpiproduktuak: Entzefalopatia espongiforme transmitigarriek edo

ikarak jota egon daitezkeenak, debekatutako substantzien hondakinak

izan ditzaketenak (e.b. hazkundearen hormona), edo ingurumenaren

kutsatzaileak izan ditzaketenak (e.b. dioxinak, polifenilo kloratuak).

Hondakin hauek guztiz ezabatu behar dira erraustuz edo lurperatuz,

tratamendu termiko egokia jasan ondoren.

2. maila. Hurrengo baldintzetan egon daitezkeen animalia-

azpiproduktuak: beste animalia-gaixotasun batzuk kutsatuta izan

daitezkeenak, etxaldetan hildako animaliak edota albaitari-hondakinez

kutsatutako edo gaixotasunak prebenitzeko hildako animaliak.

Hondakin hauek hainbat erabileratarako birzikla daitezke (e.b. biogasa,

konposta, produktu oleokimikoak, etab. sortzeko), tratamendu egokia

jasan ondoren.

3. maila. Giza-kontsumorako hildako animalia osasuntsuen

azpiproduktuak. Hondakin hauek pentsuen ekoizpenerako erabil

daitezke onartutako prozesatzeko instalazioetan tratamendu egokia izan

ondoren.

Honen guztiaren arabera, animalia-azpiproduktu koipetsuak industrian

erabili nahi badira, ezin dira 1. mailakoak izan.

I. Sarrera

12

Aipatutako 1774/2002/EB (DOCE, 2002) arautegia, giltza da hildako

animaliak eta giza-elikakatetik baztertutako animalia-materialak ezabatzeko,

baita EBn sortutako animalia-azpiproduktuen prozesatze segururako eta

ezabapenerako ere. Arautegi honen pean, bakarrik albaitarien inspekzioa

gainditu ondoren, giza-kontsumorako egokiak diren animaliak erabil daitezke

pentsuen ekoizpenerako. Honez gain, espezie barneko birziklapena,

kanibalismo delakoa, debekatzen da. Horregatik ere, debekatuta dago frijitzeko

olioak animalia-elikadurarako erabiltzea, animalia-produktuekin kontaktuan

egon zitezkeelako eta ezin denez trazabilitatea bermatu, ezin da ziurtatu

espezie barneko kanibalismoari buruzko araudia beteko denik. Arautegiak oso

argi esaten du baztertutako animalien materialekin zer egin behar eta ahal den,

identifikazio zehatza eta trazabilitate-sistema ezarriz. Esaterako, ezabatuta

izango diren materialak era iraunkorrean markatu behar dira. Horrela

iruzurrak eta desbideratze-arriskuak (baimenduta ez dauden materialak berriro

giza-elikakatera edo pentsuen ekoizpenera sartzea) saihestuko dira. Halaber,

material hauek ezabatzeko metodo alternatibo berriak aurkezten ditu, hala

nola, biogasaren ekoizpena, konposta eta ko-errausketa.

Bestalde, Europako Batzordeak hondakin biologikoei buruzko

zuzentaraua prestatuko duela esan du. Bertan jatetxetan sortutako hondakinak

(“catering”-ekoak) ere arautuko dira. Zuzentarauaren helburua hondakin

hauen erabilera segurua, berreskurapena, birziklapena eta ezabapena, eta gerta

daitekeen kutsaduraren kontrola arautzea da.

3. HONDAKIN KOIPETSUEN BERRERABILERA

Bilgorra antzinatik erabili da larruzko tresnak biguntzeko eta

iragazgaizteko, baita lanparak elikatzeko ere. Honez gain, bilgorraren bidezko

xaboiaren ekoizpena sumeriarren garaikoa da, K.a. 3000n jada xaboi-

I. Sarrera

13

disoluzioak erabiltzen baitzituzten. Hala ere, xaboi solidoa ez zen ezagutu K.o.

800era arte, Italiako Savonan, hain zuzen ere (Salzberg, 1991). Koipeak argia

sortzeko ere erabili izan dira, bai argizari moduan bai kriseiluetan (Ockerman

eta Hansen, 1994).

Gantzen eta olioen erabilera industrialak (teknikoak) ugariak dira,

esaterako, detergente sintetikoak, gomak, margoak eta estaldurak,

elikadurarako gehigarriak, labaingarriak eta metal-babesgarriak ekoizteko

(Uhlig, 1998). Hainbat purutasun-mailatako gantzen eta olioen erabilera

teknikoak xaboien, gantz-azidoen eta glizerolaren ekoizpenean edo industria

kimikorako hainbat esterren sintesian dautza. Gehienetan hurrengo prozesuak

erabiltzen dira: saponifikazioa, hidrolisia eta esterifikazioa.

Betiko produktuez gain, gaur egun hondakin koipetsuetatik produktu

berrien ekoizpena ikertzen ari da, adibidez, biodiesela (aurrerago deskribatuko

den erregai biodegradagarria); ramnolipidoak (Haba eta lank., 2000a), euren

mikrobioen aurkako ezaugarriak aztertu eta frogatu baitira (Haba eta lank.,

2003); eta erabilitako landare-olioak, substratu moduan erabilita jatorri

mikrobianoko lipasa industrialak ekoizteko hartzidura bidez (Haba eta lank.,

2000b).

Halaber, beste prozesu batzuk ikertu dira: hainbat motatako esterren eta

poliesterren sintesia lipasak erabiliz (Linko eta lank., 1998); zetonen sintesi

kimikoa, substratu moduan animalia-gantzen eta koltza-olioaren bidez

ekoitzitako gantz-azidoen esterrak erabiliz (Klimkiewicz eta lank., 2001), edo

polialkoholen esterren ekoizpena animalia- eta landare-koipeak erabiliz

(Gryglewicz eta lank., 2003) labaingarri moduan erabiltzeko. Esterifikatutako

koltza-olioa plastifikatzaile moduan ere erabili izan da plastikoen

prozesamenduan (Wehlmann, 1999). Bestaldetik, Bednarski eta lankideek (1994)

monoglizeridoak ekoitzi zituzten substratu moduan hegazti-gantzak eta

bilgorra eta katalizatzaile moduan Candida lipolytica erabiliz. Honekin lotuta,

I. Sarrera

14

Adamczak eta lankideek (2000) Rhizopus cohnii-ren lipasaren bidez hegazti eta

behi-gantzen hondarren biodegradazioa ikertu zuten GAA lortzeko.

Ikerlan honetan aztertutako bi prozesuak hurrengoak izan ziren: gantzen

eta olioen hidrolisia, gantz-azido askeak eta glizerola lortzeko, eta biodieselaren

sintesia erabilitako landare-olioak erabiliz. Prozesu hauek eta aurrera

eramateko aukerak jarraian deskribatzen dira.

3.1. Hidrolisia

Ohiko metodoa

Gantzen eta olioen hidrolisi osoa, gantz-azido askeak eta glizerola

lortzeko, oso aztertutako prozesua da. Triglizerido gehienak nahiko erraz

hidrolizatzen dira gainberotutako lurruna presiopean, 250 ºC eta 60 bar

(Colgate-Emery metodoa (Gunstone, 1994)), erabiliz. Metodo hau asko

erabiltzen da guztiz optimizatuta dagoelako, ez delako oso garestia eta

hidrolisi-maila altuak (>%98) denboratarte motzetan (ordubete baino gutxiago)

lortzen direlako. Metodo honek dituen desabantailak hurrengoak dira:

Metodo honen bidez lortutako produktuak kalitate baxuko gantz-

azidoak, gantz-azido poliinsaturatuen oxidazioaren ondorioz, eta

glizerolaren ur-disoluzioa dira.

Tenperatura altuek sortutako albo-produktuak ezabatzeko beharrezkoa

da gantz-azido askeen destilazioaren bidezko arazketa.

Honez gain, erreaktore indartuak eta erresistenteak behar dira presio

altuak jasateko, honen ondorioz gastua handitzen da eta energia-kostua

ere altua da.

Energia-kontsumoa eta produktuetan tenperatura altuek eragindako

degradazioa gutxitzeko, azken urteotan lipasek katalizatutako gantzen eta

olioen hidrolisia ikertzen ari da.

I. Sarrera

15

Metodo entzimatikoa

Jada XX. mendearen hasieran akain-belarraren hazien lipasak

katalizatutako olioen hidrolisia ikertu zen (Schmid eta Verger, 1998). Azken

hamarkadetan lipasak erabiliz gantzen eta olioen hidrolisi osoa lor daitekeela

ikusi da. Energia-kontsumoa kontuan hartuz gero, metodo entzimatikoen

garapena bultzatzen da, metodo kimikoek baino energia gutxiago behar baitute

(Ghandi, 1997). Metodo hau ohiko metodoarekin alderatuz gero, hainbat

abantaila aurki daitezke:

Energia-kostu baxuko prozesua da, presio atmosferikoan eta tenperatura

epeletan egin daitekeena (30-50 ºC). Horregatik erreaktoreak ez dira

indartuak izan behar.

Erreakzio-baldintzak direla eta, produktuen kalitate hobea lortzen da.

Honez gain, ez dira albo-produktu kutsakorrik sortzen. Honen ondorioz,

produktuak ez dira araztu behar.

Prozesua abian jartzeko beharrezkoa den hasierako inbertsioa

(erreaktorearen kostua…) askoz txikiagoa da.

Japoniako hainbat enpresak Candida rugosa-ren lipasa erabiltzen dute

liho-hazien olioaren hidrolisirako eta xaboi-hautsa ekoizteko (Kosugi eta lank.,

1988). Hala ere, oraindik badaude trabak industrian egiten diren ohiko prozesu

oleokimikoetan hidrolisi entzimatikoa erabiltzeko. Traba hauetariko batzuk

entzimen prezioa eta erreakzio-denbora luzeak dira. Azken urteotan zelulaz

kanpoko lipasa mikrobianoak ekoizteko aukera sortu da, nahikoa era

ekonomikoan. Honek entzimak industrian erabiltzeko aukera berriak sortu

ditu.

Prozesu entzimatikoa industrian errentagarria izan dadin, hainbat

baldintza bete behar dira:

I. Sarrera

16

Etekin handia lortu behar da, ohiko metodoenarekin alderagarria. Hau

da, hidrolisi-maila handia (%97 inguru) ahalik eta lipasa kantitate

gutxien erabilita.

Lipasak koipea guztiz hidrolizatu behar du. Horretarako glizerolaren

ester-lotura guztiak hidrolizatu behar ditu, hau da, lipasa inespezifikoa

izan behar da.

Lipasaren prezioa arrazoizkoa izan behar da, prozesu osoa ez

garestitzeko.

Hainbat autorek gantz eta olio komertzialen hidrolisi osoa (>%97) lortu

dute Candida rugosa-ren lipasa (Virto eta lank., 1991; de Renobales eta lank.,

1992; Virto eta lank., 1994; Albasi eta lank., 1997), eta C. rugosa-ren eta Mucor

miehei-ren lipasak (Uhlig, 1998) erabiliz. Hala ere, hondar-gantzen eta olioen

hidrolisiari buruzko ikerketa gutxi daude. Bednarski eta lankideek (1994)

hegazti-gantza eta bilgorra substratu moduan erabiliz monoglizeridoak ekoitzi

zituzten Candida lipolítica-ren kultibo baten bidez. Adamczak eta lankideek

(2000) behi eta hegazti-gantzak hidrolizatu zituzten Rhizopus cohnii-ren lipasa

baten bidez.

Hondakin koipetsuen tratamendu entzimatikoak arazoak aurki ditzake,

esaterako, degradazio-produktuek nolabaiteko eragina izan dezakete

erreakzioan. Animalia-gantzen kasuan, oxidazio-erreakzioak gertatzeaz gain,

ehun-hondarrak egon daitezke eta hauek lipasak inhibi edo inaktiba ditzakete,

adibidez, proteasen bidez. Erabilitako landare-olioen kasuan, janaria frijitzean

hainbat degradazio-konposatuak sor daitezke eta hauek entzimen aktibitatean

eragina izan dezakete. Agerbo eta lankideek (1992) arrain-olioen bigarren

mailako auto-oxidazio produktuek glukosa 6-fosfatasa mikrosomialaren

inhibizioa eragiten zutela aurkitu zuten. Hala ere, lipasa pankreatikoak arrain-

olioen polimerizatutako triglizeridoak “in vitro” hidroliza zitzakeela frogatu

zuten, ez-polimerizatutako triglizeridoak baino gutxiago hidrolizatzen bazituen

ere (Henderson eta lank., 1993). Arroyo eta lankideek (1996) lipasa

I. Sarrera

17

pankreatikoak erabilitako landare-olioa hidroliza zezakeela ere ikusi zuten,

nahiz eta olioa frijitzeko behin eta berriro erabili. Horrez gain, Dandik eta

lankideek (1993) usagariaren (Nigella sativa) hazien lipasak katalizatutako

erabilitako olioaren hidrolisia ikertu zuten. Lortutako emaitzen arabera olioaren

degradazio-produktuek ez zutela lipasa inaktibatzen ondorioztatu zen.

3.2. Biodieselaren ekoizpena

ASTM-k (American Society for Testing and Materials) biodiesela era

honetan definitzen du: lehengai koipetsu berriztagarrietatik, animalia-

gantzetatik edo landare-olioetatik, eratorritako kate luzeko gantz-azidoen

monoalkil esterrak. “Bio” aurrizkiak jatorri berriztagarri eta biologikoa

adierazten du, petroliotik ateratako diesel erregaiarekin alderatuta;; “diesela”-k

bere erabilerari, diesel-motorretan, egiten dio erreferentzia. Ordezko erregai

moduan, biodiesela bera bakarrik edo petroliotik eratorritako dieselarekin

nahastuz erabil daiteke (Zhang eta lank., 2003).

Biodieselak, ordezko erregaia den neurrian, abantaila ugari ditu. Erregai

hau herri-barneko baliabide berriztagarrietatik eratorria da. Beraz, petrolio-

erregaien inportazioen menpekotasuna arin zezakeen. Biodiesela

biodegradagarria eta ez-toxikoa da. Petroliotik eratorritako dieselarekin

alderatuz gero, biodieselak errekuntza-isuri profil hobea du, esaterako, karbono

monoxidoaren, gai partikulatuen eta ez-erretako hidrokarburoen isuri baxuak.

Biodiesela erretzean sortutako karbono dioxidoa fotosintesiaren bidez errezikla

daiteke. Modu horretan biodieselaren errekuntzak berotegi-efektuan izan

dezakeen eragina gutxituz (Körbitz, 1999; Agarwal eta Das, 2001). Biodieselak

dieselak baino flash-puntu altuagoa du (150 ºC). Honen ondorioz, ez da hain

hegazkorra eta garraiatzeko edo maneiatzeko seguruagoa da (Krawczyk, 1996).

Honez gain, labaingarria da eta motorren higadura gutxi dezake, motorren

bizia luzatuz (Von Wedel, 1999). Laburbilduz, biodieselaren abantaila hauek

ohiko dieselaren ordezko egokia egiten dute eta bere erabilera bultzatu dute

I. Sarrera

18

lurralde askotan, batez ere, babestu behar diren gunetan, esaterako, AEBko

Yellowstone parke nazionalean (Taberski eta lank., 1999).

Landare-olioak diesel motorretan erregai moduan erabiltzea ez da ideia

berria. Izan ere, diesel motorraren asmatzaileak, Rudolf Diesel-ek, kakahuete-

olioa erabili zuen bere lehen saioetan, 1900ean Paris-eko Mundu-Erakusketan

(Krawczyk, 1996). Hala ere, olioen biskositatea altua dela eta, guztiz

beharrezkoa da olioak eraldatzea erregai moduan erabili ahal izateko. Olioen

biskositatea gutxitzeko hainbat aukera saiatu dira: olioak berotu, gasolioarekin

nahastu, alkoholekin edo esterrekin mikroemultsionatu, alkoholekin

esterifikatu…Aukera hauek guztiek olioen biskositatea gutxitzen badute ere,

landare-olioen ester alkilikoak gasolioarekin alderatuz gero, antzeko

biskositatea dutela ikus daiteke eta honen ondorioz, diesel motorretarako

erregai egokiak izan daitezkeela ondorioztatu da (Ma eta Hanna, 1999).

Biodiesela ekoizteko bide ohikoena transesterifikazioa da, hau da,

koipearen eta alkohol baten arteko erreakzio kimikoa gantz-azidoen ester

alkilikoak (biodiesela) eta glizerola (albo-produktua) emateko. Gehien

erabiltzen den alkohola metanola izaten da, merkeagoa da eta. Oro har,

metanola soberan gehitzen da erreakzioaren oreka esterren ekoizpenerantz

bultzatzeko. Beste alkohol mota batzuk ere erabil daitezke gantz-azidoen

esterrak ekoizteko. Izan ere, ekoitzitako esterren kristalizazio-tenperatura

gutxitzeko eta eguraldi epeleko eta hotzeko gunetan biodieselaren erabilera

bultzatzeko, kate luzera ezberdinak eta adarkadurak dituzten alkoholak erabili

dira esterrak sortzeko (Lee eta lank., 1995; Nelson eta lank., 1996).

AEBko Nekazaritza Saileko txosten baten arabera (USDA, 2003), EBn

azken urteetan olio-hazietatik ekoitzitako biodiesela aintzat hartzekoa da,

koltza-merkatuaren portzentaje garrantzitsua baita. Urtean milioi bat tona

inguru biodiesel ekoitzi ziren 2003n, horretarako 2.7 milioi tona olio-hazi behar

izan zirelarik. Europak ekoizten duen biodieselak gora egin du, 2004n 2 milioi

I. Sarrera

19

tona sortuz (European Biodiesel Board-EBB, 2005). EBko ekoizpen erdia

Alemaniak egiten du, hurrengo ekoizleak Frantzia eta Italia izanik. Hiru

herrialde hauen artean EBko biodieselaren %90 inguru ekoizten dute.

Gantz-azidoen iturri bezala olio eta koipe ugari erabil daitezke (1. taula).

1. taula. Biodiesela ekoizteko erabilitako koipeak.

Substratuak Erreferentziak

Trioleina eta kartamo-olioa Iso eta lank. (2001).

Soja-olioa Kildiran eta lank. (1996); Ban eta lank. (2001, 2002); Kaieda eta lank. (1999, 2001); Matsumoto eta lank. (2001); Samukawa eta lank. (2000).

Koltza-olioa Saucedo (2001).

Soja eta koltza-olioen nahasketak Shimada eta lank. (1999); Watanabe eta lank. (2000).

Ekilore-olioa Antolín eta lank. (2002); Bélafi-Bakó eta lank. (2002); Mittelbach (1990).

Palma-olioaren erdiko frakzioa Basri eta lank. (1997).

Kotoi-olioa Köse eta lank. (2002).

Palma eta koko-olioak (C12) Abigor eta lank. (2000).

Hondar-gantzak

Jantokietatik jasotako erabilitako olioak

Soja-olioa birfintzean sortutako azpiproduktu azidoa

Watanabe eta lank. (2001); Alcántara eta lank. (2000); Leung (2001); Mittelbach eta lank. (1992); Dorado eta lank. (2002); Shimada eta lank. (2002); Zhang eta lank. (2003); Nelson eta lank. (1996); Hsu eta lank. (2001, 2002); Lee eta lank. (2002).

Haas eta lank. (2003).

I. Sarrera

20

Europan, batez ere, koltza-olioa erabiltzen da, AEBn, berriz, soja-olioa

eta ekialdeko lurraldetan bertako olioak erabiltzen dituzte, esaterako, palma-

edo koko-olioak. Biodieselaren ekoizpenak petroliotik ekoitzitako

gasoliorenarekin lehiakorra izateko laguntzak eta zerga-salbuespenak behar

ditu, oso muturreko egoerak izan ezean, hau da, petrolioaren oso prezio altuak

eta landare-olioen oso prezio baxuak. Horregatik oso interesgarria izan daiteke

erabilitako landare-olioen erabilera biodiesela ekoizteko.

Gantz-azidoen ester alkilikoak, biodiesela, sortzeko hainbat aukera

daude: katalizadore azidoak edo basikoak erabiliz, edo lipasak erabiliz. Gaur

egun, industrian aukerarik erabiliena sodio hidroxidoak katalizatutako

transesterifikazio kimikoa da (Ma eta Hanna, 1999).

Metodo kimikoak

Ester metilikoak katalizadore kimikoen bidez sortzeko hainbat aukera

daude (Saucedo, 2001):

a) Olioa metanolarekin transesterifikatzea, katalizadore basikoa (NaOH

o KOH), edo azidoa (H2SO4) erabiliz.

b) Bi urratsetan egindako erreakzioa: Lehenengoa, olioaren hidrolisia,

gantz-azidoak lortuz eta bigarrena, gantz-azidoen esterifikazioa

metanolarekin erreakzio-giro azidoan.

Katalizadore basikoek katalizatutako erreakzioa asko erabiltzen da,

merkea eta azkarra delako, albo-erreakzioak (saponifikazioa) gutxitzen direlako

eta %98ko konbertsioak lortzen direlako. Honez gain, tenperatura ez oso altuak

(30-65 ºC), presio atmosferikoa eta erreakzio-denbora laburrak (ordu batzuk)

erabiltzen dira. Hala ere, erabilitako landare-olioa erabiltzen bada, gantz-azido

askeak eta ura egon daitezke. Kasu hauetan ezin dira katalizadore basikoak

erabili, laginaren saponifikazio partziala gertatzen baita, uraren eta gantz-azido

I. Sarrera

21

askeen ondorioz. Kasu horietarako katalizadore azidoak erabil daitezke, baina

erreakzioa luzeagoa da (Ma eta Hanna, 1999).

Prozesu kimikoen desabantailak hurrengoak dira: glizerola bereiztea

zaila da, erreakzio-produktuak araztu behar dira baita katalizadoren hondarrak

kendu ere (Mittelbach, 1990).

Metodo entzimatikoak

Metodo entzimatikoak metodo kimikoekin alderatuz gero, hainbat

abantaila aurki daitezke:

Erreakzio-baldintzak, erreakzio entzimatiko gehienetan bezala, ez

dira muturrekoak, tenperatura epelak eta presio atmosferikoa

erabili baitaitezke.

Ez dira albo-produkturik sortzen, horregatik glizerolaren

bereizketa askoz errazagoa da (Mittelbach, 1990).

Gastu energetikoa ez da oso altua, erreakzio-baldintzak direla eta.

Katalizadorea erreakzio-girotik bereizteko erraztasuna, batez ere,

lipasa immobilizatuen kasuan

Lipasek katalizatutako biodieselaren sintesia asko ikertu da azken

hamarkadan, lipasarik erabilitakoenak Candida antarctica-ren B lipasa (Shimada

eta lank. 1999; Watanabe eta lank., 2000; Bélafi-Bakó eta lank., 2002; Köse eta

lank., 2002; Du eta lank., 2004), Rhizomucor miehei-ren lipasa (Nelson eta lank.,

1996; Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a eta b), Pseudomonas spp.-en lipasak

(Hsu eta lank., 2001 eta 2002; Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a eta b) eta

Thermomyces lanuginosa-ren lipasa (Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a eta b; Du

eta lank., 2003; Xu eta lank., 2004) izanik. Honez gain, lipasek katalizatutako

biodieselaren sintesia erabilitako landare-olioak erabiliz ere ikertu izan da

(Watanabe eta lank., 2001; Hsu eta lank., 2002; Lee eta lank., 2002), nahiz eta ez

olio komertzialak bezain beste. Horregatik oso interesgarria izan daiteke

I. Sarrera

22

erabilitako landare-olioa erabiltzea biodiesela ekoizteko hainbat lipasa

komertzialak erabiliz eta euren ester metilikoak ekoizteko gaitasuna alderatuz.

4. LIPASAK.

Lipasek (glizerol-ester hidrolasak, EC 3.1.1.3) animalia-, landare- eta

mikrobio-jatorrizko entzima multzoa osatzen dute. Haien funtzio biologiko

nagusia triazilglizerolen hidrolisia katalizatzea da, gantz-azido askeak,

diazilglizerolak, monoazilglizerolak eta glizerola emateko. Erreakzio hau

itzulgarria da, uraren kontzentrazioa oso baxua denean lipasak glizerola eta

gantz-azidoekin triglizeridoen ekoizpena katalizatzen baitu. Lipasen substratu

naturalak azilglizerolak badira ere, beste ester batzuk ere hartzen dituzte

substratu moduan, esaterako, tioesterrak eta amidak (Gandhi, 1997).

4.1. Ezaugarri nagusiak

Lipasak, oro har, 20.000 eta 60.000 Dalton tarteko pisu molekularra duten

glikoproteina azidikoak dira. Lipasa gehienen konposaketaren %2-15

karbohidratoak izan ohi dira, karbohidrato gehiengoduna manosa izanik.

Lipasen aktibitate-espektroa oro har oso zabala da. Bibliografian

aktibitatea garatzeko pH optimoa 4-9 tartean duten lipasak deskribatu dira.

Lipasa mikrobiano gehienen aktibitate optimoa pH 5.6-8.5 tartean ematen da.

Lipasa batzuk aktiboagoak dira erreakzio-giro alkalinoetan (pH > 8) eta

ezaugarri honetaz baliatzen dira enpresak detergenteetan erabiltzeko. Saxena

eta lankideek (2003) Aspergillus carneus-en lipasa alkalinoa araztu eta

karakterizatu zuten. Lipasa honen pH eta T optimoak 9.0 eta 37 ºC izan ziren,

hurrenez hurren. Lipasa egonkorra zen (%85-90eko hondar-aktibitatea) pH 8.0-

10.0 tartean 24 orduz eta 70 ºC-tan 5 minutuz ez zuen aktibitaterik galtzen.

Erreakzio-giro azidoetan aktiboagoak diren lipasak ere aurkitu dira, esaterako

I. Sarrera

23

urdail-lipasa eta lipasa pregastrikoa. Mahadik eta lankideek (2002) Aspergillus

niger NCIM 1207-ren lipasa azidikoa karakterizatu zuten. Lipasa honen

aktibitate maximoa pH 2.5en eta 45 ºC-tan lortzen da eta pH 1.5en ere aktiboa

da (aktibitate maximoaren %75). Honez gain, pH 2.5eko disoluzio indargetzaile

batean 24 orduz eta giro-tenperaturan utzita bere aktibitatearen %70 mantendu

zuen.

Entzima baten tenperatura optimoak bi prozesuen orekarekin dauka

zerikusia: tenperaturak erreakzio-abiadura handitzen du eta era berean

entzimen egitura tridimentsionalaren galera eragiten du (desnaturalizazioa).

Lipasa ugarien tenperatura optimoa 30-40 ºC tartean badago ere, badaude

hainbat lipasa tenperatura altuetan aktiboagoak direnak eta honez gain,

termoegonkorrak direnak, adibidez, Thermomyces lanuginosa-ren lipasa

(Svendsen, 2000).

Triglizeridoak, lipasen substratu naturalak, ez dira uretan disolbagarriak

eta modu naturalean elkartzen dira geruza unimolekularrak, mizelak edo

emultsioak eratzeko urarekin nahasten direnean. Elkarte honen ondorioz,

lipolisia lipido/ura interfasean gertatzen da. Sarda eta Desnuelle-k (1958) esan

zuten bezala, esterasen eta lipasen arteko ezberdintasun nagusia lipasek

garatzen duten interfase-aktibazioa da. Hau da, aktibitate handiagoa dute

substratu emultsionatuekin. Fenomeno honen arrazoia lipasak lipido/ura

interfasean jasaten duen aldaketa konformatzionalean dagoela frogatu da.

Lipasa gehienen gune aktiboa estalki hidrofobiko baten pean dago (Ikus

gezia 3. irudian). Lipolisian aktibazio interfazialak estalkiaren posizio-aldaketa

eragiten du. Honen ondorioz, estalkia irekitzen da eta substratua gune aktibora

hel daiteke. Aktibazio interfaziala lipasen ezaugarria bada ere, badaude

aktibitate lipolitikoa duten entzima batzuk fenomeno hau jasaten ez dutenak,

adibidez, Fusarium solani-ren kutinasa, Pseudomonas aeruginosa-ren lipasa eta

Candida antarctica-ren B lipasa (Villeneuve eta Foglia, 1997). Entzima hauek ez

I. Sarrera

24

dute estalkirik euren egituran eta honen ondorioz ez dute aktibazio

interfazialarik jasaten. Entzima hauek lipasen eta esterasen arteko entzima-

multzo batean egongo lirateke.

3. irudia. Thermomyces lanuginosa-ren (lehen Humicola lanuginosa) lipasaren egitura, Svendsen-en arabera (2000). Geziak gune aktiboaren sarreran dagoen estalkia seinalatzen du.

Lipasen espezifizitatea

Villeneuve eta Foglia-ren (1997) arabera lipasak 5 multzo ezberdinetan

sailka daitezke (2. taula): a) Substratu-espezifizitatea duten lipasak, b) Posizio-

espezifizitatea dutenak (edo regioespezifikoak), c) Espezifizitatea ez dutenak, d)

Gantz-azido espezifizitatea dutenak (edo azilespezifikoak), eta e)

Estereoespezifikoak (edo sn-glizerol-espezifikoak).

I. Sarrera

25

2. taula. Lipasek izan ditzaketen espezifizitateak. Espezifizitatea Lipasa

Substratu-espezifizitatea

Monoglizeridoak Arratoiaren gantz-ehuna

Mono- eta diglizeridoak Penicillium camembertii

Triglizeridoak Penicillium spp.

Regioespezifizitatea

sn-1 eta sn-3

Aspergillus niger

Rhizopus arrhizus

Mucor miehei

sn-2 Candida antarctica A

Ez espezifikoak

Penicillium expansum

Aspergillus spp.

Pseudomonas cepacia

Candida rugosa

GA-ren espezifizitatea

Kate-motzeko gantz-azidoak Penicillium roqueforti

Garai aurreko umeen urdail-lipasa

Hausnarkarien lipasa pregastrikoa

cis-9 intsaturatutako GA Geotrichum candidum

Kate-luzeko intsaturatutako GA Botrytis cinerea

Estereoespezifizitatea

sn-1 Thermomyces lanuginosa

Pseudomonas aeruginosa

sn-3 Fusarium solani-ren kutinasa

Untxiaren urdail-lipasa

Villeneuve eta Foglia (1997).

I. Sarrera

26

a) Substratu-espezifizitatea duten lipasak. Azilglizeridoak lipasen

ohiko substratuak dira. Honen arabera lipasek triglizeridoen ester loturak

hidrolizatzeaz gain, diglizeridoenak, monoglizeridoenak eta fosfolipidoenak

ere hidroliza ditzakete. Substratu-espezifizitatearen definizioa hurrengoa da:

lipasa batek duen gaitasuna bereziki azilglizerol mota bat lehentasunez

hidrolizatzeko. Adibidez, digestioan are-lipasak ez du triglizeridoen hidrolisi

osoa lortzen. Gelditzen diren diglizeridoak monoglizerido bihurtzen dira, baina

monoglizeridoen hidrolisia oso motela da. Triglizeridoak ere landare- eta

mikrobio-lipasa gehienen substratu gustukoenak dira. Hala ere, lipasa gutxi

batzuek glizerido partzialak triglizeridoak baino azkarrago hidrolizatzen

dituzte. Adibidez, Penicillium camembertii–ren lipasa monoglizerido eta

diglizeridoentzat espezifikoa da, triglizeridoekin aktibitate baxua izanik

(Villeneuve eta Foglia, 1997). Zenbait bakterio azido-laktikok ere antzeko

jokabidea erakutsi dute, glizerido partzialak (MG eta DG) triglizeridoak baino

askoz azkarrago hidrolizatuz (Stadhouders eta Veringa, 1973).

b) Posizio-espezifizitatea duten lipasak (edo regioespezifikoak).

Regioselektibitatea lipasek triglizeridoen barruko (ester-lotura sekundarioa) eta

kanpoko (ester-lotura primarioak) posizioak bereizteko duten gaitasuna da.

Triglizeridoen lipolisian, 1,3-regioselektiboak diren lipasek sn-1 eta sn-3 loturak

hidrolizatzen dituzte lehentasunez. Modu horretan, 1,2-DGen eta 2,3-DGen

nahasketa ekimolarra lortzen da eta euren ondorengo hidrolisiak 2-MG ematen

ditu. Txerrien lipasa pankreatikoa 1,3-regioselektiboa da. Espezifizitate mota

hau lipasa batzuetarako deskribatu da, esaterako, Aspergillus niger-ek eta

Rhizopus arrhizus-ek sortutakoak. Benetako sn-2 regioselektibitatea ez da ohikoa,

C. antarctica-ren A lipasa deskribatu da sn-2 espezifikoa den lipasa gutxienetako

bat bezala triglizeridoen hidrolisian (Rogalska eta lank., 1993).

c) Espezifizitatea ez duten lipasak. Lipasa batzuek ez dute ia posizio-

espezifizitaterik eta triglizeridoen ester-lotura guztiak hidrolizatzen dituzte

substratuen gantz-azidoen konposaketa kontuan izan gabe, adibidez,

I. Sarrera

27

Penicillium expansum-en, Candida rugosa-ren eta Aspergillus spp-en hainbat

lipasa.

d) Gantz-azido espezifizitatea duten lipasak (edo azilespezifikoak).

Lipasak gantz-azidoentzat espezifikoak ere izan daitezke, gantz-azido zehatz

batekiko edo sarriago gantz-azido mota batekiko. Lipasa hauek aipatutako

gantz-azido horien esterrak hidrolizatzen dituzte, triazilglizerolean duten

posizioa kontuan izan gabe. Mota honetako lipasarik ikertuena Geotrichum

candidum-ena da. Lipasa hau oso espezifikoa da lehen lotura bikoitza 9-cis

konfigurazioarekin duten gantz-azido intsaturatuekiko. Zenbait jatorritako

lipasa batzuk, Penicillium roqueforti-ren eta hainbat animaliaren urdail-lipasak,

kate motzeko gantz-azidoentzat espezifikoak dira eta oso aktibitate baxua dute

kate luzeko gantz azidoekin.

e) Estereoespezifikoak (edo sn-glizerol-espezifikoak). Espezifizitate

mota hau lipasek triglizeridoen sn-1 eta sn-3 posizioak bereizteko duten

gaitasuna da. Espezifizitate-mota honetako ikerketak nahiko berriak dira eta

giza-mingain lipasek sn-3 estereoespezifizitatea aurkezten dute. Rogalska eta

lankideek (1993) sn-1 esteroespezifizitatea Thermomyces lanuginosa-ren eta

Pseudomonas fluorescens-en lipasetarako eta behi-esnearen lipoprotein-lipasarako

deskribatu dute, eta sn-3 estereoespezifizitatea, berriz, C. antarctica-ren B

lipasarako, txakurren urdail-lipasarako eta F. solani-ren kutinasarako.

Lipasen estereoespezifizitatea konposatu kiralak bereizteko erabiltzen ari

da. Hidrolisi edo sintesi selektiboaren bidez azido edo alkoholen

enantiomeroak bereiz daitezke (Gandhi, 1997).

4.2. Lipasen erabilera industrialak

I. Sarrera

28

Lipasek hainbat erreakzio kataliza ditzakete 4. irudian ikus daitekeenez

eta honen ondorioz erabilera anitz dituzte. Lipasek katalizatutako erreakzioak

bi mailetan sailka daitezke: hidrolisian eta sintesian. Sintesizko erreakzioen

artean esterifikazioa, interesterifikazioa, alkoholisia (honen barruan, industria

oleokimikoan nabarmena den glizerolisia) eta azidolisia, azken hiru erreakzioak

askotan termino bakar baten barruan sailkatzen direnak, transesterifikazioan,

alegia. Era berean, lipasen erabilera industrialak erreakzio hauen arabera sailka

daitezke.

4. irudia. Lipasek kataliza ditzaketen erreakzioak (Vulfson, 1994)

I. Sarrera

29

“Hondakin koipetsuen berrerabilera” atalean (11. orr.) azaldu bezala,

lipasek gantz eta olioen hidrolisia kataliza ditzakete modu industrialean gantz-

azido askeak eta glizerola emateko. Bestaldetik, lipasek ere esterifikazio eta

transesterifikazio erreakzioak kataliza ditzakete ester metilikoak, biodiesela

alegia, ekoizteko. Erabilera hauetaz gain, lipasek ere beste erabilera industrial

batzuk dituzte, aipagarrienak 3. taulan biltzen direnak izanik.

3. taula. Lipasen erabilera industrial nagusiak (Gandhi, 1997).

Prozesua Produktua - erabilera

H

I

D

R

O

L

I

S

I

A

Hidrolisi osoa GAA, glizerola

Detergenteen formulazioetan Orbanak kentzeko

Hondakinen tratamendua Hondakin koipetsuak degradatzeko

Zaporen garapena Gaztak, esnegaina,…

Monoglizeridoen ekoizpena Okintzan, emultsifikatzaileak bai elikagai-gradukoak bai kosmetikoetarako

Erabilera medikoak Digestioa egiten laguntzeko

Hidrolisi selektiboa Nahasketa errazemikoen bereizketa

Gantz-azidoen zatikapena

S

I

N

T

E

S

I

A

Alkoholisia

Lipido estrukturatuak

Biodieselaren ekoizpena

Koipeen ezaugarriak aldatzeko (Interesterifikazioak/Transesterifikazioak)

Zaporeen eta usainen ekoizpena Pisu molekular baxuko esterrak ekoizteko

Esterifikazio selektiboa Nahasketa errazemikoen bereizketa

Gantz-azidoen zatikapena

I. Sarrera

30

Ikerlan honetan taula honetan agertzen diren erabileretatik bi besterik ez

badira ikertu ere, argi dago lipasek erabilera anitz dituztela eta segur aski

etorkizunean ugariago izango direla.

I. Helburuak

31

HELBURUAK

Ikerketa-lan hau INASMET FUNDAZIOAK koordinatutako ENV4-CT98-

0774 proiektu Europarraren barruan kokatzen da eta bere helburua elikagaien

industrietako hondakin koipetsuen entzimen bidezko balioztapena da, batez

ere, hiltegitik jasotako animalia-gantzen eta erabilitako landare-olioen

balioztapena, kontuan izanik indarrean dagoen ingurumen-araudia. Araudi

honek hondakin eta azpiproduktuen ezabapen eta balioztapenaren artean

balioztapena hobesten du.

Tesi honen helburu nagusia elikagaien industrietako hondakin

koipetsuen balioztatzeko proiektuak duen helburu bera da, bereziki hiltegitik

jasotako animalia-gantzen eta erabilitako landare-olioen entzimen bidezko

balioztapena (hidrolisia eta esterifikazioa).

Helburu nagusi hau betetzeko ikerketa-lan honen helburu zehatzak

honako hauek izango dira:

1. Merkatuan dauden zenbait lipasaren aktibitate entzimatikoen aldaketen

azterketa, hidrolisi eta esterifikazio erreakzioen baldintzetan eta lipasa

hauen artean egokienak aukeratzea.

2. Gantz eta olioen hidrolisi maximoa lortzeko erreakzio entzimatikoen

baldintzak ezartzea.

3. Laborategi mailan lortutako hidrolisi emaitzak, maila erdi-pilotoan

egiaztatzea.

4. Gantz-azidoen ester metilikoen ekoizpen maximoa lortzeko, erreakzio

entzimatikoen baldintzak ezartzea.

II. MATERIAL ETA METODOAK

II. Material eta metodoak

35

MATERIALAK

1. GANTZAK ETA OLIOAK

Ikerketa-lan honetan erabilitako hondakin koipetsuak bi motatakoak

izan ziren. Alde batetik, hiltegietatik jasotako animalia-gantzak, eta bestaldetik,

erabilitako landare-olioak. Halaber, gantz eta olio komertzialak substratu-eredu

moduan erabili ziren aktibitate entzimatikoko entseguak egiteko.

1.1. Hondar-gantzak

Lagin guztiak, Frantziako hiltegietatik jasotakoak, Inasmet Fundazioak

(Donostia) bidali zizkigun. Gantzak marroi-ilun kolorekoak eta usain bortitz eta

ezatseginekoak ziren. Giro-tenperaturan solidoak ziren. Hasierako hidrolisi-

erreakzioak tratatu-gabeko gantzarekin, hiltegitik jaso bezala, egin baziren ere,

ondorengo laginak Inasmet Fundazioak azidoekin garbitu ondoren jaso

genituen. Garbiketa hidrolisi-erreakzioetan arazoak sor zitzaketen konposatuak

ezabatzeko egin zen. Garbiketaren ondorioz, jasotako gantzak garbiketaren

hondar-ura (pH 5) zekarren, laginaren %30 (b:p) inguru.

1.2. Erabilitako landare-olioak

Bi jatorri ezberdineko frijitzeko olioak erabili ziren. A olioa elikagai-

industria batekoa zen eta azidoekin garbitu zuten, hondar-gantzen moduan,

Inasmet Fundazioan. Kasu honetan hondar-ur gutxi zegoen eta gainera

ontziaren beheko aldean gelditu zen. Olioa hori-ilun kolorekoa zen eta giro-

tenperaturan ez zen guztiz gardena, baina tenperatura igotzean garden

gelditzen zen. B eta C olioak Arabako Campuseko jantokitik (UPV-EHU,

Vitoria-Gasteiz) jaso ziren. Biak likidoak eta gardenak ziren, anbar kolorekoak.

Olio hauek hondar solidoak kentzeko iragaztea izan ezik, tratamendurik gabe

erabili ziren.


36

1.3. Gantz eta olio komertzialak

Oliba-olioa, gehienezko azidotasuna 0.4º, Aceites Coosur, S.A. (Jaén).

Ekilore-olioa, gehienezko azidotasuna 0.2º, Aceites Coosur, S.A. (Jaén).

Birfindutako hazi-olioa azido oleikoz aberastua (Frijiontzietarako

berezia), gehienezko azidotasuna 0.2º, Koipe, S.A. (Jaén).

Txerri iberikoaren gantza, Campofrío, S.A. (Madril).

Koipe hauek guztiak Gasteizko dendetan erosi ziren.

2. LIPASAK

2.1. Hidrolisi-erreakzioak

Ikerketa-lan honetan erabilitako lipasak mikroorganismoek ekoitzitakoak

ziren eta entzima-enpresek hidrolisi-erreakzioetarako gomendatutakoak izan

ziren.

Erabilitako lipasak hauek izan ziren:

1. Candida rugosa-ren, lehen Candida cylindracea-ren, prestakin

entzimatikoak (lipasa inespezifikoa):

Meito Sangyo Co., Ltd.-ren OF® Lipasa (Japonia)

Biocatalysts Ltd.-ren Lipomod 34PTM (Britainia Handia)

2. Thermomyces lanuginosus-en, lehen Humicola lanuginosa-ren, prestakin

komertzialak (triglizeridoen sn-1 eta sn-3 posizioetarako espezifikoak):

Novo Nordisk-en LipolaseTM 100L (Danimarka). Detergenteetan

erabiltzeko diseinatua. Lan egiteko pH-rik egokiena 8 eta 11 tartean

dago. Prestakin likidoa da. (B434 fitxa, Novo Nordisk, 1999a).


37

Novo Nordisk-en LipopanTM BG (Danimarka). Okintzan erabilitako

prestakin entzimatikoa (Novozym 677, B986c-GB fitxa, Novo

Nordisk, 1999b).

3. Humicola insolens-en prestakin komertziala (triglizeridoen sn-1 eta sn-3

posizioetarako espezifikoa):

Novo Nordisk-en Novo 398TM (Danimarka). Lan egiteko pH-rik

egokiena 6 eta 11 tartean dauka. Prestakin likidoa da (B 470c-GB fitxa,

Novo Nordisk, 1999c).

4. Candida antarctica-ren A lipasaren prestakin komertziala (ez du posizio

espezifitaterik):

Novo Nordisk-en Novo 868TM (Danimarka), prestakin likidoa da.

2.2. Esterifikazio-erreakzioak

Atal honetan erabilitako lipasak Novozymes-ek bidalitakoak ziren.

Guztiak lipasa immobilizatuak ziren.

Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei). Lipasa honek esterifikazio eta

interesterifikazio erreakzioak katalizatzen ditu. Oso erabilgarria da

triglizeridoen sn-1 eta sn-3 loturen arteko interesterifikazio erreakzioetan.

Jatorrizko lipasa Rhizomucor miehei-rena da eta bere euskarria truke anionikoko

erretxina makroporosoa da. Lan egiteko tenperatura 30-70 ºC tartean dago. Bere

aktibitatea neurtzeko azidolisi entsegua erabiltzen da, azido dekanoikoaren eta

ekilore-olioaren arteko erreakzioa, olioaren sn-1 eta sn-3 posizioetan gehitutako

azido dekanoikoa neurtuz (BAUN, hau da, Batch Acidolysis Units Novo) (347d-

GB fitxa, Novo Nordisk, 2000a).

Lipozyme TL IM (T. lanuginosus). Lipasa hau elikagai-graduko koipe eta

olioen interesterifikazio erreakzioetarako diseinatuta dago, oso erabilgarria

baita triglizeridoen sn-1 eta sn-3 loturen arteko interesterifikazio erreakzioetan.

Jatorrizko lipasa Thermomyces lanuginosus-ena da eta bere euskarria silika


38

granulatua da. Lan egiteko tenperaturarik egokiena 55-70 ºC tartean dago. Bere

aktibitatea neurtzeko interesterifikazio entsegua erabiltzen da soja-olioa eta

guztiz hidrogenatutako soja-olioaren arteko interesterifikazio erreakzioa

neurtuz (IUN, hau da, Interesterification Unit Novo) (1276b-GB fitxa, Novo

Nordisk, 2000b).

Novozym 435 (Candida antarctica-ren B lipasa). Lipasa termoegonkor

baten prestakin entzimatikoa da. Esterrak eta amidak ekoizteko erabiltzen da.

Substratu espezifitate zabala dauka, hau da, azido karboxiliko eta alkohol

ugarien arteko erreakzioak katalizatzen ditu. Jatorrizko lipasa Candida

antarctica-ren B lipasa da eta bere euskarria erretxina makroporoso akrilikoa da.

Substratuaren araberako posizio espezifizitatea izan dezake. Aktibitaterik

handiena 70-80 ºC tartean lor dezake, baina inaktibazio termikoa dela eta 40-

60 ºC tartean lan egitea gomendatzen da. Bere aktibitatea neurtzeko azido

laurikoaren eta propanolaren arteko erreakzioa erabiltzen da propil-lauratoren

ekoizpena neurtuz (PLU, hau da, Propyl Laurate Units) (B606d-GB fitxa, Novo

Nordisk, 2000c).

3. ERREAKTIBO ETA DISOLBATZAILEAK

Erabilitako erreaktibo eta disolbatzaile guztiak HPLC kalitatezkoak ziren

eta bestelako arazketarik gabe erabili ziren.


39

METODOAK

1. GANTZ ETA OLIOEN KARAKTERIZAZIOA

1.1. Azidotasun indizea (AI)

I.U.P.A.C.-en II.D.1. metodoa (1979) erabili zen.

Gramo batek koipe dituen gantz-azido askeak neutralizatzeko

beharrezkoak diren potasio hidroxidoaren miligramoak dira.

Koipea 115 ºC-tan lehortu zen, 5 0.01 g koipe pisatu, 25 mL isopropanol

eta tanta batzuk fenoftaleina (%1 etanolean, p:b) gehitu eta nahasketa berotu

zen koipea ondo disolbatzeko. Koipea behin disolbatuta, eta artean bero

zegoela, potasio hidroxidoarekin (0.5 N isopropanolean) baloratu zen

adierazlearen kolorea aldatu arte.

Azidotasun indizea formula honen bidez lor daiteke:

mBNAI

1.56

Non, 56.1 potasio hidroxidoaren pisu molekularra baita, B erabilitako

potasio hidroxidoaren mililitroak baitira, N potasio hidroxido disoluzioaren

normalitatea baita, eta m laginaren pisua, gramotan, baita.

1.2. Saponifikazio Indizea (SI)

I.U.P.A.C.-en II.D.2 metodoa (1979) erabili zen.


40

Gramo bat koipe saponifikatzeko behar diren potasio hidroxidoaren

miligramoak dira. Koipea potasio hidroxidoarekin saponifikatu eta soberan

gelditzen den potasio hidroxidoa azido batekin baloratuz lortzen da indize hau.

Koipea 115 ºC-tan lehortu zen, 5 0.01 g koipe pisatu eta 25 mL

isopropanol, tanta batzuk fenoftaleina (%1 etanolean, p:b) eta 40 mL potasio

hidroxido (0.5 N isopropanolean) gehitu ziren. Nahasketa 30 minutuz berotu

zen, errefluxupean, eta soberan gelditzen zen potasio hidroxidoa H2SO4 0.5 N

disoluzio batekin baloratu zen adierazlearen kolorea desagertu arte.

Saponifikazio indizea formula honen bidez lor daiteke:

mBBNSI )(1.56 10

Non, 56.1 potasio hidroxidoaren pisu molekularra baita, B0 gehitutako

potasio hidroxido 0.5 N-ren mililitroak baitira, B1 erabilitako azido

sulfurikoaren mililitroak baitira, N azido sulfuriko disoluzioaren normalitatea

baita, eta m laginaren pisua, gramotan, baita.

1.3. Hidrolisi-maila

Aurreko bi indizeak behin neurtuta, lagin baten hidrolisi-maila formula

honen bidez lor daiteke:

100(%) SIAImailaHidrolisi

Non, hidrolisi-maila (%) mol GAA/ 100 mol GAT baita.


41

1.4. Konposaketa gantz-azidotan

Gantz eta olioen konposaketa gantz-azidotan aztertzeko gantz-azido

guztiak metil ester bihurtu ziren boro trifluoruroa (BF3) metanolean erabiliz eta

lortutako esterrak gas-kromatografiaren bidez neurtuz, Hamilton eta lankideek

(1992) azaldu bezala.

Tapoi hariduneko hodietan 10 mg gantz edo olio pisatu, 2 mL KOH (%5

metanolean, p:b) gehitu eta harea-bainuan utzi ziren, 90-100 ºC-tan 5-10 minutu,

olio tantak desagertu arte. Hodiak giro tenperaturan utzi, 2mL BF3 metanolean

(%14 p:b, Sigma) gehitu eta berriro harea-bainuan utzi ziren, 90-100 ºC-tan 5

minutu. Hodiak giro tenperaturatan utzi eta 2 mL ur-distilatu gehitu ziren.

Ekoitzitako metil esterrak (ME) 3 mL hexano erabiliz erauzi ziren. Disoluzio

honen mikrolitro bat injektatu zen gas-kromatografoan, Hewlett-Packard (Palo

Alto, Kalifornia, AEB) 5890 Series II. Kromatografo honek sugar-ionizaziozko

detektorea (FID-GC) zuen eta esterrak bereizteko HP-FFAP zutabea (Agilent

Technologies, AEB) erabili zen, elkargurutzatutako polietilenglikolezkoa (25 m

x 0.32 mm b.d.; geruzaren lodiera 0.52 m) gantz-azidoen metil esterrak eta

gantz-azido askeak bereizteko egokia zena. Gas-eramailearen (Helioaren)

fluxua 2 mL/min-koa izan zen, eta labearen tenperatura horrela programatu

zen: 60 ºC-tatik 150 ºC-tara 10 ºC minutuko, 150 ºC-tatik 240 ºC-tara 3 ºC

minutuko, 240 ºC-tan 10 minutu mantenduz. Injektorearen eta detektorearen

tenperaturak 325 ºC eta 275 ºC izan ziren, hurrenez hurren. Erabilitako “split”

1:10 izan zen. Metil esterrak identifikatzeko ezagututako patroien erretentzio

denborak erabili ziren. Kuantifikazioa konposatuen tontorren azaleraren

ehunekoan kalkulatu zen, konposatu guztien azalerak kontuan izanda. Datuak

HP ChemStation (rev 02.04) programarekin analizatu ziren.

1.5. Hondakin koipetsuen lipidoen determinazioa

Lipido-mota ezberdinak (TG, DG, MG, GAA...) geruza-fineko

kromatografiaren bidez banandu ziren Henderson eta Tocher-ek (1992) azaldu


42

bezala. Gantza edo olioa 100 L dietil eterrean disolbatu eta kapilare baten

bidez silika-gel plaka batean (Silica gel 60, lodiera 0.5 mm, 20x20 cm, Merck,

Alemania) aplikatu zen. Laginez gain, kolesterolaren, trioleinaren, lezitinaren,

azido oleikoaren eta kolesterol-esterren disoluzio patroiak ere aplikatu ziren.

Plakaren garapena aurrera eramateko plaka fase higikorraz saturatutako kubeta

kromatografiko batean sartu zen. Fase higikorra hexano: dietil eter: azido

formiko (80:20:1; b:b:b) nahasketa zen eta plaka bi aldiz garatu zen. Behin

laginak bananduak, plaka Rodamina G metanolean (%0.05, p:b, Sigma)

disoluzioarekin busti zen eta banandutako lipidoak argi ultramorepean ikusi

ziren. Lipidoak lehen aipatutako patroien Rf-ekin alderatuz identifikatu ziren.

2. LIPASEN KARAKTERIZAZIOA

2.1. Aktibitate lipolitikoaren determinazioa

Aktibitate lipolitikoa neurtzeko entsegu entzimatiko etenak egin ziren

oliba-olioa substratu-emultsifikatu moduan erabiliz. Bi entsegu ezberdin erabili

ziren, emultsio ezberdinak eginez. Ikerketa-lan honen hasieran Virto eta

lankideek (1994) deskribatutako metodoa erabili zen, baina OF lipasaren

aktibitatea egiaztatu nahi izan zenean Meito-Sangyok aitortutako aktibitatea

baino emaitza baxuagoak lortu ziren. Horregatik, Meito-Sangyok bere lantegian

aktibitate lipolitikoa neurtzeko erabiltzen zuen metodoa bidali zigun.

A metodoa

Hau Meito-Sangyo-k bidalitako metodoa eta Naka-k (1987)

deskribatutakoa zen. Substratuaren emultsioa polibinil-alkoholak

emultsifikatzaile moduan erabiliz egin zen. Hirurogeita hamabost mL polibinil-

alkoholen disoluzioa (18.5 g Poval 117 eta 1.5 g Poval 205 (Kuraray Co., Ltd.

(Japonia) litro bat ur-distilatuan) eta 22.9 g oliba-olio nahastu ziren Polytron®

PT-K (PCU-8, Kinematika AG, Suitza) homogeneizagailu batean, 5 minutuko 2


43

zikloetan, 11000 rpm-eko abiaduran, tartean 5 minutuko geldialdia eginez.

Horrela egindako emultsioa izotz-bainu batean utzi zen, gutxienez ordubete,

erabili baino lehen.

Entsegu entzimatikoak 50 mL-ko tapoi-esmerilatuzko erlenmeyer

matrazetan egin ziren. Bertan 5 mL oliba-olio emultsio eta 4 mL fosfato 0.1 M

(pH 7.0) disoluzio indargetzaile nahastu eta 10 minutu utzi ziren 37 ºC-tan ur-

bainu batean. Nahasketa honi mililitro bat lipasaren disoluzio (0.01 mg/mL)

gehitu zitzaion, 15 segundu irabiatu eta 37 ºC-tako ur-bainuan sartu zen. Hogei

minutu pasa eta gero, erreakzioa gelditzeko 20 mL azetona-metanol (1:1; b:b)

eta 5 tanta fenoftaleina gehitu ziren pixkanaka. Behin hau eginda askatutako

gantz-azidoak baloratu ziren NaOH 0.05 M-ekin, kontuan harturik erabilitako

mol bat NaOH eta erreakzio-nahasketan zegoen mol bat gantz-azido

baliokideak zirela. Erreakzioaren zurizko saiakuntza egiteko 5 mL oliba-olio

emultsio, 4 mL fosfato 0.1 M (pH 7.0) disoluzio indargetzaile eta 20 mL

azetona:etanol nahastu ziren eta gero mililitro bat disoluzio entzimatiko gehitu

zen. Entsegu bakoitza 3 aldiz egin zen.

B metodoa

Virto eta lankideek (1994) deskribatutako metodoa da eta emultsioa behi-

seroalbumina emultsifikatzaile moduan erabiliz prestatu zen.

Oliba-olioa, potasio fosfato 0.1 M pH 7.0 disoluzio indargetzailea eta

behi-seroalbumina (BSA, %0.01 (p:p) gantz-azido baino gutxiagokoa, Sigma)

25 mg/mL disoluzio indargetzaile berean prestatuta nahastu ziren. Emultsioa

prestatzeko honako proportzioak erabili ziren: oliba-olio: BSA disoluzio:

disoluzio indargetzaile (1:1:2.7; p:b:b). Nahasketa 25 mL-ko prezipitatu-ontzi

batean jarri eta sonikatu zen (MSE Soniprep 150 sonikadorea, SANYO, Japonia)

3 minutuz, 20 segundoko sonikazio zikloekin eta 10 segundoko geldialdiekin.


44

Saio-hodi batean mililitro bat substratu emultsio eta 0.9 mL fosfato 0.1 M,

pH 7.0 disoluzio indargetzaile, nahastu ziren. Erreakzio-nahasketa, entzimarik

gabe, 37 ºC-tako ur-bainu batean utzi zen 5 minutu. Erreakzioa hasteko entzima

(0.1 mL disoluzio entzimatiko, 1.0 mg/mL) gehitu zen. Hamar minutu pasa eta

gero, erreakzioa gelditzeko 5 mL geldiera-nahasketa, isopropil alkohol: hexano:

H2SO4 (0.2 M) (40:20:1, b:b:b), gehitu ziren. Erreakzio-produktuak erauzteko 3

mL ur-distilatu eta 3 mL hexano erabili ziren. Nahasketa irabiatu ondoren, fase

organikoaren (goiko fasearen) 2 mL hartu ziren eta potasio hidroxidorekin (0.01

M isopropanolean) baloratu ziren. Erabilitako mol bat KOH eta erreakzio-

nahasketan zegoen mol bat gantz-azido baliokideak zirela kontuan hartu

behar da. Erreakzioaren zurizko saiakuntza egiteko mililitro bat oliba-olio

emultsio, 0.9 mL fosfato disoluzio indargetzaile eta 5 mL geldiera-nahasketa

nahastu ziren eta gero 0.1 mL disoluzio entzimatiko gehitu zen. Entsegu

bakoitza 3 aldiz egin zen.

Aurreko bi kasuetako lipasa-aktibitatea modu berean definitzen da: mol

bat gantz-azido minutuko askatzen duen entzima kantitatea, metodo

bakoitzean adierazten diren baldintzetan.

pH-ren eragina lipasen aktibitatean neurtzeko erabilitako fosfato

disoluzio indargetzailearen pHa aldatu zen (5, 6, 7 eta 8), bestelako baldintzak

era berean utziz.

Tenperaturaren eragina lipasen aktibitatean neurtzeko erreakzioaren

tenperatura aldatu zen, ur-bainuaren tenperatura 25-50 ºC tartean aldatuz, eta

erreakzioaren bestelako baldintzak era berean utziz.

Lipasen egonkortasuna hurrengo baldintzetan aztertu zen:

pH-aren eragina lipasen egonkortasunean aztertzeko lipasen

disoluzioak hainbat pHtako fosfato disoluzio indargetzailetan


45

(250 mg/mL inguru, pH 5-7 tartean) mantendu ziren. Disoluzio

bakoitza beratzen utzi zen 37 ºC-tan ur-bainu batean 24 orduz.

Denbora tarte zehatzetan laginak hartu eta gelditzen zen

aktibitatea neurtu zen.

Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean aztertzeko

lipasen disoluzioak (250 mg/mL inguru, fosfato disoluzio

indargetzailean pH 7.0) beratzen utzi ziren 24 orduz hainbat

tenperaturatan (25-45 ºC-tan) zeuden ur-bainuetan. Denbora tarte

zehatzetan laginak hartu eta gelditzen zen aktibitatea neurtu zen.

2.2. Esterifikazio aktibitatearen determinazioa

Esterifikazio aktibitatea neurtzeko Novozymes-ek (Madril) bidalitako

SM0342 (Novo Nordisk, 2000d) metodoa egokitu zen. Azido laurikoaren eta 1-

propanolaren arteko erreakzioa erabili zen propil-lauratoren ekoizpena neurtuz

(PLU, hau da, Propyl Laurate Units), jarraian adierazitako baldintzak jarraituz.

Hodi batean substratuak, azido laurikoa (200.3 mg) eta 1-propanola

(75 L), proportzio estekiometrikoetan (1:1, mmol:mmol) eta substratuak

disolbatzeko 4 mL hexano gehitu ziren. Hodiak 30 ºC-tan zegoen eta irabiatze

orbitala zuen ur-bainu batean (Selecta® Unitronic OR) sartu eta 10 minutu utzi

ziren, substratuak ondo nahasteko eta erreakzio-tenperaturara egokitzeko.

Erreakzioa hasteko 10 mg inguru lipasa immobilizatu gehitu ziren. Hogei

minutu pasa eta gero 5 L-ko laginak hartu eta mililitro bat hexanon disolbatu

ziren. Erreakzio-nahasketa gas-kromatografiaren bidez analizatu zen.

Erabilitako gas-kromatografoa eta zutabea lehen (ikus 41. orr.) aipatutakoak

izan ziren. Gas eramailearen (Helioaren) fluxua 2 mL/min izan zen eta labe-

tenperatura 50 ºC-tan 2 minutu izan eta gero, 240 ºC-tara igo zen 25 ºC/min eta

han 10 minutu mantendu zen. Injektore eta detektorearen tenperaturak 325 ºC

eta 275 ºC izan ziren, hurrenez hurren. Propil-lauratoaren kuantifikazioa


46

egiteko aurretik kanpo-patroiaren metodoaren bidezko kalibrazioa egin zen,

propil-laurato eta azido laurikoaren kantitate ezberdinak injektatuz eta

tontorren azaleran oinarrituz.

Propil-laurato esterifikazio-aktibitatearen unitatea (PLU) mol bat

propil-laurato minutuko ekoizten duen entzimaren kantitatea da, adierazitako

erreakzio-baldintzetan.

Tenperaturaren eragina esterifikazio-aktibitatean aztertzeko erreakzioak

30-80 ºC-tan zeuden ur-bainutan egin ziren.

Substratu inhibizioa ikertzeko zenbait entsegu egin ziren 1-propanol

erabili ordez metanola eta kate-luzera ezberdineko gantz-azidoak erabiliz. Izan

ere, biodiesela ekoiztean metanola erabili zen eta erabilitako landare-olioen

gantz-azido gehienak kate-luzekoak ziren. Substratuen kontzentrazioaren

eragina ikertzeko substratu baten kontzentrazioa finkoa mantentzen zen

bitartean, bestearena aldatzen zen. Horrela, metanolaren eta gantz-azidoen

arteko erreakzioak egiteko ikertutako kontzentrazioak hauek izan ziren:

Lipasa guztiak erabiliz, metanolaren eragina ikertzeko, C12ren

kontzentrazioa aldatu gabe (250 mM),

o Metanola: 37.5, 75, 125, 187.5, 250, 312.15, 375, 437.5 eta 500

mM

Lipasa guztiak erabiliz, gantz-azidoen eragina ikertzeko,

metanolaren kontzentrazioa aldatu gabe (250 mM),

o Azido butirikoa (C4): 62.5, 125, 250, 375 eta 500 mM

o Azido laurikoa (C12): 6.25, 12.5, 25, 37.5, 75, 125, 187.5, 250,

312.15, 375, 437.5 eta 500 mM

o Azido oleikoa (C18:1) : 62.5, 125, 250, 375 eta 500 mM

Novozym 435 erabilita, metanolaren eta C12ren arteko

erreakzioaren mekanismoa ikertzeko, substratu bien


47

kontzentrazioen eragina aztertu zen (37.5, 75, 125, 187.5, 250,

312.15, 375, 437.5 eta 500 mM).

Lipasen egonkortasuna ikertzeko entsegu guztietan lipasek beraiek

katalizatutako erreakzioaren substratu edota produktu izan daitezkeen

likidoetan (olioan, ester metilikoen nahasketa batean eta metanolean) beratzen

utzi ziren hainbat denbora tartetan, gero gelditu zitzaien aktibitatea neurtu

zelarik.

Tenperaturaren eragina egonkortasunean aztertzeko 3 lipasak

aldez aurretik 60 ºC-tan lehortutako eta sodio sulfato anhidroaren

zehar pasatutako ekilore-oliotan beratzen utzi ziren hainbat

tenperaturatan (30, 40, 50 eta 60 ºC) 24 orduz. Laginak denbora

tarte ezberdinetan hartu, n-hexanorekin garbitu eta N2-pean

lehortu ziren giro-tenperaturan. Gelditzen zitzaien aktibitatea

lehen azaldutako esterifikazio metodoaren (PLU/g) bidez neurtu

zen.

Metanolaren eragina lipasen egonkortasunean ikertzeko lipasak

metanolean (0.5 mL) beratzen utzi ziren 30 ºC-tan. denbora tarte

ezberdinetan (15, 30, 60, 120 eta 240 minututan) laginak hartu, n-

hexanorekin garbitu eta N2-pean lehortu ziren giro-tenperaturan.

Gelditzen zitzaien aktibitatea lehen azaldutako esterifikazio

metodoaren (PLU/g) bidez neurtu zen.

Ester metilikoen eragina egonkortasunean aztertzeko lipasak

aldez aurretik 60 ºC-tan lehortutako eta sodio sulfato anhidroaren

zehar pasatutako kate luzeko ester metilikoen nahasketa batean

beratzen utzi ziren 30 ºC-tan. Hainbat denbora tartetan (2, 4, 6 eta

24 ordu) laginak hartu, n-hexanorekin garbitu eta N2-pean lehortu


48

ziren giro-tenperaturan. Gelditzen zitzaien aktibitatea lehen

azaldutako esterifikazio metodoaren (PLU/g) bidez neurtu zen.

3. HIDROLISI ERREAKZIOAK

Animalia-gantzak erabili baino lehen zeukaten hondar-ura kendu

zitzaien. Horretarako laginak urtu eta geldi utzi ziren bi fase banandu arte,

goikoa koipetsua eta behekoa urtsua.

Hidrolisi-erreakzio guztietan erabilitako fase urtsua kanilako ura izan

zen.

3.1. Laborategiko erreaktoreak (0.5 L)

Laborategian eginiko hidrolisi-erreakzio arruntak litro bateko ontzietan

egin ziren, 500 mL-ko erreakzio-bolumena erabiliz (5a. irudia). Erreakzio-

nahasketa prestatzeko beharrezkoa zen animalia-gantza (45 ºC-tan urtua) edo

olioa, erreakzio-nahasketan nahi zen koipe proportzioaren arabera (10:90; 25:75;

50:50; 60:40; 75:25, p:b), pisatu eta urarekin nahastu zen 360 rpm-ko abiadura

erabiliz (Heidolph RZR 1 motorrak (Alemania), 5b. irudia), aztertutako

entseguaren tenperaturan (25–40 ºC-tako tartean) emultsioa lortu arte. Orduan

kasu bakoitzean beharrezkoa zen entzimaren kantitatea gehitu zen uretan

disolbatuta irabiaketa mantenduz. Denbora tarte zehatzetan laginak hartu (50

mL inguru) eta 80 ºC-tan zegoen ur-bainu batean sartu ziren, faseak banantzeko

eta entzima inaktibatzeko. Ondoren fase koipetsua (goikoa) hartu zen eta

hidrolisi-maila azidotasun indizea (AI) neurtuz zehaztu zen. Esperimentu

bakoitza bi aldiz egin zen.


49

5. irudia: a) Laborategian erabilitako erreaktoreen argazkia, b) Irabiagailuaren xehetasuna.

3.2. Bost litroko erreaktorea

Hidrolisi-erreakzio batzuk bost litroko beirazko termostatizatutako

erreaktore batean (Afora, Espainia) egin ziren (6a. irudia). Erreaktore honetan

erabilitako landare-olioen hidrolisi-erreakzioak egin ziren, erreakzioaren

baldintzak honako hauek izanik: olio:ura proportzioa 50:50 (p:b), OF lipasaren

180 U /g olio, 360 rpm-ko irabiatzea (6b. irudia). Erreakzioak 25 ºC-tan egin

ziren.

Zehaztutako denboratan (1, 3, 5, 7 eta 24 ordu) laginak (50 mL) hartu eta

80 ºC-tan zegoen ur-bainu batean sartu ziren, faseak banantzeko eta entzima

inaktibatzeko. Ondoren fase koipetsua (goikoa) hartu zen eta hidrolisi-maila

azidotasun indizea (AI) neurtuz zehaztu zen.

a) b)


50

6. irudia: a) 5 litroko erreaktorea barruan erabilitako olioaren emultsioa duelarik, b) Laborategiko eta bost litroko erreaktoreen irabiagailuen arteko konparaketa.

3.3. Berrogei litroko erreaktorea

Hiltegitik jasotako animalia-gantzen hidrolisirako 40 L-ko

termostatizatutako erreaktorea erabili zen (7a. irudia). Erreakzio-baldintzak:

355 rpm-ko irabiatzea (7b. irudia), 32º C, OF lipasa 180 U/g gantz eta

gantza:ura proportzioa 50:50 (p:b).

Zehaztutako denbora tartetan (3, 7, 21.5, 24, 28 eta 48 ordu) 2 lagin (50

mL) hartu eta 80 ºC-tan zegoen ur-bainu batean sartu ziren, faseak banantzeko

eta entzima inaktibatzeko. Ondoren fase koipetsua (goikoa) hartu eta hidrolisi-

maila azidotasun indizea (AI) neurtuz zehaztu zen.

a)

b)


51

7. irudia: a) 40 L-ko erreaktorea, b) Irabiagailuaren xehetasuna.

4. METILAZIO ERREAKZIOAK

4.1. Erreakzio etenak

Erreakzioak 50 mL-ko tapoi esmerilatuzko erlenmeyer matrazetan egin

ziren, bertan olioa (jatorrizkoa edo hidrolisatua) pisatu eta kasu bakoitzean

beharrezkoa zen metanola gehitu zitzaion. Denbora labur batean, (10 minutu

inguru) nahasten utzi ondoren, lipasa gehitzen zen. Erreakzioak 30 ºC-tan eta

irabiaketa orbitala (100 U/min) zuen ur-bainu batean (Selecta® Unitronic OR)

egin ziren. Hainbat denbora tartetan bi lagin (50 L) hartu eta erreakzio-

produktuak gas-kromatografiaren bidez aztertu ziren. Erreakzio bakoitza bi

aldiz egin zen.

a)

b)


52

4.2. Erreakzio jarraiak

Termostatizatutako beirazko zutabe bat (XK16, 20 cm-ko luzera eta 16

mm-ko barne-diametroa, Pharmacia, Suedia) 3 gramo Novozym 435-ekin

(C. antarctica, B lipasa) bete eta ohantze finkoko erreaktore moduan erabili zen.

Substratuen nahasketa, 175 mL inguru (olioa edo hidrolisatutako olioa eta

metanolaren kantitate ezberdinak), zutabetik pasarazi zen ponpa baten bidez

(LC Gradient pump, LKB 2249, LKB Produkter AB, Bromma, Suedia), 8. irudian

ikus daitekeen bezala. Produktuak ez ziren erreziklatzen. Erabilitako fluxua

7.2 L/ordu izan zen eta erreakzioa 30 ± 2 ºC-tan egin zen. Ateratzen zen

produktuaren laginak hartu ziren hainbat denbora tartetan eta euren

konposaketa gas-kromatografiaren bidez analizatu zen.

8. irudia. Ohantze finkoko erreaktorearen eskema.

Produktuak: Ester metilikoak

Ura, erreakzio-tenperaturan

Immobilizatutako lipasa

Substratuak: Metanola + olioa edo olio-hidrolisatua

Ura, erreakzio-tenperaturan


53

5. HIDROLISI ETA ESTERIFIKAZIO PRODUKTUEN KARAKTERIZAZIOA

5.1. Gantz-azido askeak (GAA)

GAA beste konposatu lipidikoetatik (TG, fosfolipidoak,…) banantzeko

Sep-Pak Vac 3cc (500 mg, Waters, AEB) amilopropilozko trukatze anionikoko

zutabeak erabili ziren Kaluzny eta lankideek (1985) azaldu bezala. Zutabeak

atontzeko 10 mL heptano pasarazi ziren eta ondoren 10 mg lagin dietil

eter:heptano (1:1, b:b) mililitro batean disolbatuta pasarazi zen, barne-patroi

moduan C17 (0.25 mg/mL) gehituta zuelarik. Lipido neutroak kanporatzeko 10

mL kloroformo:isopropanol (2:1, b:b) pasarazi ziren. Ondoren GAA kanporatu

ziren 5 mL azido formiko dietil eterrean (%2, b:b) pasaraziz eta GAA gas-

kromatografiaren bidez analizatu ziren. GAA-en banantzeko lehen (ikus 41.

orr.) deskribatutako gas-kromatografoa eta HP-FFAP zutabe kapilarra erabili

ziren, hurrengo baldintzak erabiliz: Gas eramailearen (Helioaren) fluxua 2

mL/min-koa, eta labearen tenperatura 65 ºC-tatik 240 ºC-tara 10 ºC/min-ko,

240 ºC-tan 20 minutu mantenduz, “split” 1:10. GAA kuantifikatzeko barne-

patroi metodoa erabili zen eta GA bakoitzaren erantzun-faktorea determinatu

zen GA bakoitzaren kantitate ezagunak kromatografoan injektatuz eta

tontorren azaleran oinarrituz.

5.2. Hidrolisi eta esterifikazio produktuen karakterizazioa gas-kromatografiaren bidez.

Erreakzio-nahasketetan zeuden lipido-mota ezberdinak (TG, DG, MG,

GAA eta EM) eratorkin sililatu moduan banandu eta kuantifikatu ziren Plank

eta Lorbeer-ek (1995) eta Nelson eta lankideek (1996) azaldu bezala. Hodi

batean barne-patroia (tricaprina 0.4 mg) zuen 10 mg erreakzio-nahasketa 100 L

tetrahidrofuranon disolbatu zen, 100 L BSTFA (N,O-Bis-(trimetilsilil)-


54

trifluoroazetamida, FLUKA) gehitu ziren eta 15 minutuz 95-100 ºC-tan zegoen

harea-bainu batean utzi zen. Hodia giro-tenperaturan utzi eta 7 mL hexano

gehitu zitzaion. Disoluzio honen L bat injektatu zen DB1-ht (%100

dimetilpolisiloxano, 15 m, 0.32 mm-ko barne-diametroa eta 0.1 m fase, J&W

Scientific, AEB) zutabea zuen gas-kromatografoan. Honako baldintzetan: Labe-

tenperatura 50 ºC-tan minutu bat egon eta gero, 180 ºC-tara igo zen 15 ºC/min,

230 ºC-tara 7 ºC/min eta 370 ºC-tara 20 ºC/min, azken tenperaturan 10 minutu

egonik. Konposatuen identifikazioa patroien (azido oleikoa, metiloleatoa,

monooleina, dioleina, trioleina) errententzio-denborekin alderatuz egin zen eta

kuantifikazioa patroien erantzun-faktoreen bidez, tontorren azaleran oinarrituz.

5.3. Glizerolaren determinazio entzimatikoa

Glizerola hidrolisi-erreakzioen fase urtsuan kuantifikatzeko Boehringer

Mannheim-en (Alemania) glizerola neurtzeko kit-a erabili zen. Kit hau

hurrengo erreakzioetan datza:

Glizerola adenosin-5’-trifosfatoarekin (ATP) fosforilatzen da L-glizerol-3-

fosfato sortuz glizerol kinasa-k (GK-k) katalizatutako erreakzioan (1).

Glizerol + ATP --------------> L-glizerol-3-fosfato + ADP (1)

Horrela sortutako ADP-a fosfoenolpirubato-rekin (PEP) erreakzionatzen

du pirubato kinasa-ren (PK) laguntzarekin ATPa eta pirubatoa sortuz (2).

ADP + PEP ------------> ATP + pirubato (2)

L-laktato deshidrogenasa-ren (L-LDH) aurrean pirubatoa L-laktato

bihurtzen da NADH-aren oxidazioaren bidez NAD-a sortuz (3).

Pirubato + NADH + H+ --------------> L-laktato + NAD+ (3)

GK

PK

L-LDH


55

Azken erreakzioan oxidatutako NADH-a laginan dagoen glizerolaren

baliokide estekiometrikoa da. NADH-aren desagerpena 340 nm-tan

absorbantziaren bidez neurtzen da.

Laginan dagoen glizerolaren kontzentrazioa (g/L) formula honen bidez

kalkulatzen da:

AxxdxbxBxPMK

1000

Non,

ΔA = 340 nm-tan neurtutako lagina eta zurizkoaren (ur-distilatuaren)

arteko absorbantzien diferentzia,

B = erreakzioaren bolumen osoa (3.020 mL),

b = laginaren bolumena (0.100 mL),

PM = glizerolaren pisu molekularra (92.1 g/mol),

d = kubetaren argi-igarobidea (1 cm) eta

= NADH-aren absortibitate molarraren koefizientea 340 nm-tan (6.3 L x

mmol-1 x cm-1),

baitira.

Beraz, formula horrela gelditzen da:

K = 0.441 x ΔA (g glizerol/L lagin)

III. EMAITZAK

III. Emaitzak

59

GANTZ ETA OLIOEN EZAUGARRIAK

Lehen esan bezala (“Material eta Metodoak” atalaren “Gantzak eta

olioak” azpiatalean, 35. orr.), ikerketa-lan honetan erabilitako hondakin

koipetsuak animalia-gantzak eta erabilitako landare-olioak izan ziren.

Animalia-gantzak hiltegietatik jaso ziren, eta gehienetan behi-gantzak ziren.

Landare-olioak, frijitzeko erabilitako olioak ziren eta euren jatorriaren arabera

ezaugarri ezberdinak zituzten. Landare-olio hauen jatorria “Material eta

Metodoak” atalean azalduta dago eta 3 olio ezberdin erabiltzearen arrazoiak bi

dira. Alde batetik, saio guztiak egiteko olio bakoitzaren kantitate nahikorik ez

zegoen eta beste aldetik, ezaugarri ezberdinak izan zitzaketen olioak aztertzea

interesgarria izan zitekeen. Ezaugarri horiek nolabaiteko eragina izan

baitzezaketen katalizatutako erreakzioetan edota erabilitako entzimetan.

1. AZIDOTASUN ETA SAPONIFIKAZIO INDIZEAK.

HASIERAKO HIDROLISI-MAILA.

Gantzak eta olioak laborategian jasotzen zirenean euren azidotasun- eta

saponifikazio-indizeak eta hasierako hidrolisi-mailak neurtzen ziren. Horrela

ikus zitekeen aldez aurretiko hidrolisia jasan zuten.

4. taula. Hondakin koipetsuen ezaugarriak. Animalia-gantza A olioa B olioa C olioa

Azidotasun indizea (AI)

40.8 ± 0.4 2.0 ± 0.1 1.0 ± 0.2 1.8±0.0

Saponifikazio indizea (SI)

190.3 ± 1.8 197.3 ± 0.9 193.3 ± 0.1 192.2±2.9

Hidrolisi-maila (%)*

21.4 ± 0.8 1.1 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.9±0.3

* Non % mol GAA/ 100 mol GAT baita.

III. Emaitzak

60

Ikus daitekeenez (4. taula), animalia-gantzak hasierako hidrolisi-mailarik

altuena zuen, laborategian jaso zenean %21.4 GAA izanik. Izan ere, animalia-

ehunetan entzima ugari daude eta haien artean gantzen hidrolisia kataliza

dezaketen lipasak (Padley eta lank., 1994). Horrexegatik animalia-gantzak ondo

maneiatzen ez badira, hidrolisi-maila altuak izan ditzakete, kasu honetan

gertatu zen bezala. Erabilitako landare-olioek, berriz, ez zuten hasierako

hidrolisi-maila handirik. Horrek esan zezakeen ez zirela askotan erabili. Janaria

frijitzean elikagaietan dagoen urak eta tenperatura altuek triglizeridoen

hidrolisia eragiten dute, gantz-azido askeen kantitatea handiagoa izanik olioa

behin eta berriro erabiltzen denean (Dobarganes eta lank., 2002; Gertz, 2000;

Tyagi eta Vashishtha, 1996).

1.2. KOIPEEN LIPIDOAK

Lipido mota ezberdinak geruza fineko kromatografiaren bidez aztertu

ziren. Espero bezala, lagin guztien konposatu gehiengodunak triglizeridoak

izan ziren. Animalia-gantzak triglizeridoez gain, gantz-azido askeak eta

glizerido partzialak zituen, hasierako hidrolisi partzialaren ondorioz, eta

kolesterola. Emaitza hauek aurreko atalean azaldutakoarekin bat datoz, batez

ere, aurkitutako gantz-azido askeen kantitatea animalia-gantzan.

1.3. KONPOSAKETA GANTZ-AZIDOTAN

Gantz eta olio guztien (hondakin-koipetsuen eta txerri-gantz eta olioen)

konposaketa gantz-azidotan ikertu zen gas-kromatografiaren bidez. Hondakin-

koipetsuen portzentajezko konposaketa gantz-azidotan (%1ean edo portzentaje

altuagoetan daudenak) 9. irudian biltzen da eta 5. taulan erositako gantz eta

olioen konposaketaz gain bibliografian aurkitutako datu batzuk aurki daitezke.

III. Emaitzak

61

Animalia-gantzaren konposaketa idi-gantzaren antzekoa zen (9. irudia

eta 5. taula). Gantz-azido gehiengoduna azido oleikoa zen (%37), bibliografian

agertzen diren datuekin bat datorrena (%26-50), hurrengoak azido palmitikoa

%27rekin (%17-37) eta estearikoa %22rekin (%6-40) izanik. Tarteak oso zabalak

badira ere, bibliografian aurkitzen diren bilgorraren gantz-azidoen diferentziak

elikadura eta arrazaren araberakoak direla diote adituek (Padley eta lank.,

1994).

0

10

20

30

40

50

60

C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 tC18:1 cC18:1 cC18:2 cC18:3

GA

(%

)

9. irudia. Aztertutako hondakin-koipetsuen konposaketa gantz-azidotan: Animalia-gantza, A olioa, B olioa, ≡ C olioa. (Gantz-azido bakoitzaren portzentajea tontor kromatografikoaren azaleran oinarrituz kalkulatu zen gantz-azido guztiak kontuan izanda).

Gantz-azido gehiengodunez gain, C18:1-ren trans isomeroak ere aurkitu

ziren. Isomero hauek animalia-gantzetan aurkitzea ez da arraroa (Padley eta

lank., 1994), errumeneko bakterioek gantz-azido asegabeak hidrogenatzen

baitituzte.

III. Emaitzak

62

Part

zial

ki

hidr

ogen

atut

ako

soja

-olio

a c

0.1

9.9

4.5

45.3

37.0

2.4

1.2 --

Ant

zar-

gant

za c

0.5 21

2.5

6.5 58

9.5 2 0

Txer

ri-

gant

za b

0.5

– 2.

5

20 –

32

1.7

– 5

5 –

24

35 –

62

3 –

16

< 1.

5

--

Ard

i-ga

ntza

b

2 –

5.5

21 –

25.

8

1.5

– 3

28 –

30.

5

30 –

37

1.4

– 4

0 –

0.2

--

Bilg

orra

b

1.4

– 7.

8

17 -

37

0.7

– 8.

8

6 –

40

26 –

50

0.5

– 5.

0

< 2.

5

--

Haz

i a

olio

a

d.g.

4.38

0.09

4.84

72.2

7

17.7

1

0.18

0.52

Ekilo

re a

olio

a

0.09

6.87

0.15

4.23

30.0

6

58.0

7

0.07

0.45

Olib

a a

olio

a

d.g.

9.63

0.69

3.62

78.4

1

6.25

0.67

0.73

Txer

ri-

gant

za a

1.68

25.2

4

1.88

19.0

9

42.4

6

7.55

0.43

1.67

Gan

tz-

azid

oa

C14

:0

C16

:0

C16

:1

C18

:0

C18

:1

C18

:2

C18

:3

Best

e

batz

uk

5. ta

ula.

Gan

tz et

a ol

io b

atzu

en k

onpo

sake

ta g

antz

-azi

dota

n.

d.g.

Det

ekta

tu g

abea

. a “

Mat

eria

l eta

Met

odoa

k” a

tale

an a

zald

u be

zala

(41.

orr

.).

b Pad

ley

eta

lank

., 19

94.

c Bel

itz &

Gro

sch,

199

9.

III. Emaitzak

63

Erabilitako landare-olioek gure artean erabiltzen diren landare-olioen

ohizko konposaketa zuten, azido oleiko eta linoleikoaren kopuru altua, alegia.

A olioaren gantz-azido gehiengoduna azido oleikoa zen (%44), hurrengoak

linoleikoa (%28) eta palmitikoa (%18) izanik. Portzentaje hauek bibliografian

aurkitzen diren partzialki hidrogenatutako soja-olioaren baloreekin bat etor

daitezke (Belitz eta Grosch, 1999). Olio hau, batez ere, elikagaiak modu

industrialean frijitzeko erabiltzen da. Beste aukera bat A olioa olioen nahasketa

izatea izan zitekeen. Izan ere, frijitzeko erabilitako olioak batzuetan nahasketak

dira eta palma-olioa erabiltzea ez da arraroa, azido palmitikoaren portzentajea

igoz. Dena den, ez da ahaztu behar elikagaien eragina frijitzeko olioan.

Elikagaien lipidoak oliotan barreia baitaitezke olioen konposaketa aldatuz

(Pokorný, 1998). Frijitutako elikagaiaren arabera, esaterako haragia edo arraina,

barreiatutako gantz-azidoak guztiz ezberdinak izan daitezke baita olioaren

bukaerako konposaketa gantz-azidotan ere. Gainera, A olioak C18:1-ren trans

isomeroen kopuru txikia (%1.2) zuen, isomero hauek frijitzean sor daitezke

hidrogenazioaren ondorioz (Tyagi eta Vashishtha, 1996).

B olioa ekilore-olioarekin alderatuz gero, biak oso antzekoak zirela ikus

daiteke. B olioaren gantz-azido gehiengoduna linoleikoa zen (%56), hurrengoak

oleikoa (%28) eta palmitikoa (%8) izanik, balore hauek lan honetan

aurkitutakoekin (5. taula) eta bibliografian dagoen ekilore-olioaren konposaketa

gantz-azidotan bat etorriz (Belitz eta Grosch, 1999, Padley eta lank., 1994).

Bibliografian agertzen diren ezberdintasunak ekoizpen-tokien eta barietateen

araberakoak dira (Padley eta lank., 1994). C olioak B olioaren jatorri bera ba

zuen ere, Arabako Kanpuseko jantokia, bere konposaketa gantz-azidotan ez zen

guztiz antzekoa. Izan ere, gantz-azido gehiengoduna linoleikoa izan zen (%42),

hurrengoak oleikoa (%36) eta palmitikoa (%16) izanik. Bi olio hauetan gantz-

azido gehiengodunak hiru gantz-azido hauek ziren eta orden bera jarraitzen

zuten, baina proportzioak ez ziren mantentzen. Agian, olio bera zen, baina

jasandako baldintzak guztiz ezberdinak izan zitezkeen, hau da, frijitutako

elikagaiak, frijitzeko erabilitako tenperaturak eta zenbat aldiz erabili ziren.

III. Emaitzak

65

LIPASEN KARAKTERIZAZIOA

Bibliografia aztertu eta hainbat entzimen ekoizleri koipeen hidrolisi eta

esterifikaziorako erabiltzen ziren lipasei buruzko informazioa eskatu eta gero,

6. taulan biltzen diren lipasen ezaugarriak aztertzea erabaki zen. Azterketa

hauen helburua hondakin koipetsuen ustiapenerako egokiak izan zitezkeen

lipasak karakterizatzea zen. Ekoizleek lipasa batzuen fitxa teknikoak helarazi

zizkiguten eta bertan lipasen ezaugarri batzuk deskribatzen ziren (Ikusi

“Material eta Metodoak” atala, 36. orr.).

6. taula. Hondakin koipetsuen ustiapenerako aztertutako prestakin entzimatikoak.

Prozesua Lipasa Jatorria Ekoizlea

Hidrolisia

OF Candida rugosa Meito Sangyo

(Japonia)

Lipomod Candida rugosa Biocatalysts

(Britainia Handia)

Lipopan Thermomyces lanuginosus

Novo Nordisk (Danimarka)

Lipolase Thermomyces lanuginosus

Novo 398 Humicola insolens

Novo 868 Candida antarctica

(A lipasa)

Esterifikazioa

Novozym 435 Candida antarctica (B lipasa)

Novozymes (Espainia)

Lipozyme RM IM Rhizomucor miehei

Lipozyme TL IM Thermomyces lanuginosus

1. GANTZ ETA OLIOEN HIDROLISI OSORAKO EGOKIAK DIREN LIPASEN KARAKTERIZAZIOA

Lipasak karakterizatzeko euren aktibitate lipolitikoa neurtu zen.

Aktibitate lipolitikoa neurtzeko oliba-olioa substratu-eredu moduan erabili zen,

bi emultsio ezberdin erabiliz. Honez gain, pH-ren eta tenperaturaren eragina

III. Emaitzak

66

aktibitatean eta lipasen egonkortasunean ikertu zen. Karakterizazioa osatzeko

substratu-ereduen (hazi-olioa eta txerri-gantza) hidrolisi-erreakzioak garatu

ziren. Erreakzio hauetan hidrolisiaren bitartekoak, askatutako gantz-azidoak

eta ekoitzitako glizerido partzialak, neurtu ziren hainbat denbora tartetan.

1.1. Aktibitate lipolitikoa

Aktibitate lipolitikoa neurtzeko “Material eta Metodoak” atalean (42.

orr.) deskribatutako entseguak erabili ziren. Bertan azaldu bezala, bi entsegu

ezberdin erabiltzearen arrazoia hurrengoa da. Gure laborategian erabiltzen zen

entsegua Virto eta lankideena (1994) zen, baina Meito-Sangyo-ren OF lipasaren

aktibitatea egiaztatzen saiatzean lortutako aktibitatea ekoizleak deklaratutakoa

baino txikiagoa zen. Horregatik, Meito-Sangyo-k bidalitako entsegua erabili zen

aktibitate lipolitikoa neurtzeko eta OF lipasaren aktibitatea egiaztatzeko. Lipasa

bakoitzak lortutako aktibitateak 7. taulan biltzen dira.

Erabilitako entseguaren arabera emaitza ezberdinak lortu ziren. A

metodoa erabiliz aktibitate handiagoak lortu ziren, ia magnitude-ordena

batekoak kasu gehienetan. Aktibitate gehien zuten lipasak C. rugosa-renak izan

ziren 300-400 kU/g eta 65-100 kU/g lortuz, A metodoa edo B metodoa erabiliz,

hurrenez hurren. Novo Nordisk-en prestakin komertzialek, Lipolase eta Novo

398, antzeko aktibitatea izan zuten edozein metodo erabilita. Ekoizleak bientzat

aktibitate bera deklaratzen zuen (100 kU/g), baina datu hauek ez datoz bat

ikerlan honetan erabilitako bi metodoekin lortutako emaitzekin: Novo Nordisk-

ek aktibitate lipolitikoa neurtzeko AF95 metodoa, tributirina substratu moduan

duena, erabiltzen baitu (pH-statoz egindako entsegua, hain zuzen ere).

Novo 868-k (C. antarctica-ren A lipasa) oso aktibitate lipolitiko baxua dauka, bi

metodoekin lortutako emaitzak enpresak emandakoak baino txikiagoak izanik.

Lipopan (T. lanuginosus-en lipasa) prestakin entzimatikoak A metodoa erabiliz

aktibitate handiagoa eman zuen, baina ez dago ekoizlearen emaitzekin

alderatzerik, ez baitugu datu hori.

III. Emaitzak

67

7. taula. Erabilitako lipasen aktibitatea metodo ezberdinak erabiliz.

Lipasa Jatorria kU*/g edo mL (A metodoa 1)

kU/g edo mL (B metodoa 2)

Ekoizleak adierazitako aktibitatea

(kU/g)

OF (Meito Sangyo)

C. rugosa 392.1±10.0 97.1±4.6 360.0 1

Lipomod (Biocatalysts)

C. rugosa 319.5±8.9 66.7±3.4 115.0 3

Lipopan

(Novo Nordisk) T. lanuginosus 68.9±4.8 12.5±0.1 --

Lipolase (Novo Nordisk)

T. lanuginosus 28.6±0.3 1.5±0.1 100.0 4

Novo 398 (Novo Nordisk)

H. insolens 29.1±1.5 1.7±0.3 100.0 4

Novo 868 (Novo Nordisk)

C. antarctica

(A Lipasa) 2.0±0.4 0.3±0.0 6.0 4

*U: 1 mol gantz-azido minutuko. 1 A metodoa: Oliba-olioa eta polibinil alkoholaz egindako emultsioa (Naka, 1987). Ikusi “Material eta Metodoak” atala (42. orr.). 2 B metodoa: Oliba-olioa eta behi-seroalbuminaz (BSA) egindako emultsioa (Virto eta lank., 1994). Ikusi “Material eta Metodoak” atala (43. orr.). 3 Oliba-olioa erabiltzen dute substratu moduan, baina ez dute metodoa zehazten (Biocatalysts

Limited, 1999). 4 Novo Nordisk-en AF95 metodoa. Tributirina substratu moduan erabiliz, askatutako gantz-

azidoak pH-stato baten bidez neurtzen dira.

Neurtutako aktibitate lipolitikoaren emaitza ezberdinak lortzea entsegu

ezberdinak erabiliz gauza normala da hainbat autorek adierazi dutenez.

Adibidez, Garou-k (1998), AF95 (tributirina) eta Worthington (oliba-olioa)

metodoak erabili zituen lipasa batzuen aktibitatea neurtzeko, bi metodoekin

emaitza ezberdinak lortuz. Vorderwülbecke eta lankideek (1992) honako hau

frogatu zuten: lipasa gehienen aktibitate hidrolitikoa substratuaren eta

eratutako emultsioaren araberakoa da. Autore hauek, hainbat entsegu erabiliz,

60 lipasen aktibitatea neurtu zuten eta lipasa bakoitzak bere metodo optimoa

zuela aurkitu zuten. Halaber, hainbat lipasa, adibidez Aspergillus niger eta

A. oryzae-ren lipasa batzuk, substratu artifizialak (paranitrofenilpalmitato eta

butiratoa, S,O,O’-tributiril-tioglizerol (TBTG) eta azido 1,2-O-dilauril-rac-

III. Emaitzak

68

glizero-3-glutariko-erresorufinester (DGGR)) erabiliz aktiboagoak zirela aurkitu

zuten.

Eratutako emultsioaren eragina oso garrantzitsua da lipasa gehienen

aktibitate entzimatikoaren neurketetan eta aktibazio interfatzialean. Izan ere,

substratu-emultsioaren partikula-tamaina emultsioaren araberakoa da eta

partikula-tamainak substratuaren eta entzimaren arteko ukipen-azala

baldintzatzen du (Virto eta lank., 1994; Albasi eta lank., 1997; Schmid eta

Verger, 1998; Beisson eta lank., 2000).

Lipasen ezaugarririk nagusienetakoa ura-lipido interfasean katalizatzen

dituzten erreakzioen izaera fisiko-kimiko berezia da, Sarreran aipatu bezala (23.

orr.). Katalisia gertatu baino lehen entzima interfasean adsorbitzen da eta

ondoren katalisia gertatzen da. Katalisiaren izaera heterogeneoak (Benzonana

eta Desnuelle, 1965) interfasean dauden entzimaren eta substratuaren kantitate

zehatzak (lipolisia baldintzatzen dutenak) neurtzea zailtzen du. Substratuak

uretan emultsionatzeko konposatu anfipatikoak, detergenteak edota proteinak,

behar dira. Konposatu hauek aktibitate-lipolitikoaren neurketan eragin handia

izan dezakete (Beisson eta lank., 2000). Adibidez, B metodoan emultsionatzaile

moduan erabilitako seroalbuminak gantz-azido askeekiko afinitate handia

dauka eta baliteke gantz-azido hauen erauzketa osoa ez izatea. A metodoan,

berriz, askatutako gantz-azidoak erreakzio-nahasketan baloratzen dira

zuzenean, horrela erauzketaren arazoak saihestuz. Honek guztiak A

entseguarekin lortutako aktibitate altuagoak azal zitzakeen.

A entseguak aktibitate altuagoak eman zituenez, hortik aurrera erabili zen

entsegua izan zen.

1.2. pH-ren eragina aktibitate lipolitikoan.

Lipasen aktibitate lipolitikoan pH-ren eragina ikertzeko erreakzio-

giroaren pHa aldatu zen 5-8 tartean fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailea

III. Emaitzak

69

erabiliz. Lipasa guztien aktibitaterik altuena pH 5-7 tartean aurkitu zen, pH 8n

aktibitatea gutxituz kasu guztietan (10. irudia).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

4 5 6 7 8 9pH

Ak

tib

itat

ea (

%)

10. irudia. Lipasen aktibitate lipolitikoa pHaren arabera (lipasa bakoitzaren aktibitate maximoaren ehunekoak): OF, o Lipomod, ∆ Lipolase, ◊ Novo 398, x Novo 868 eta + Lipopan.

Lipomod eta OF lipasek, Candida rugosa-ren lipasek, aktibitate altuei eutsi

zizkioten pH 5, 6 eta 7n (aktibitate maximoaren %90-100), pH 8n aktibitatea

gutxitu zen, batez ere, Lipomod lipasaren kasuan (%42). Hainbat autorek

Candida rugosa-ren lipasen pH optimoa 7 inguruan dagoela aurkitu dute, oliba-

olioa substratu moduan erabiliz. Adibidez, Montero eta lankideek (1993) OF

lipasaren aktibitate optimoa pH 6.2-7.7 tartean aurkitu zuten eta maximoa 6.8n.

Honek Pereira eta lankideek (2001) aurkitutakoarekin bat dator, aktibitate

maximoa 6.5-7 tartean aurkitu baitzuten eta pH 8n aktibitatea gutxitu zen

aipatutako bi ikerlan hauetan (%80 eta 60, hurrenez hurren), gure emaitzekin

ere bat datorrena. Garou-k (1998) eta Wang eta lankideek (1988) ere ikerlan

honen antzeko aktibitate-profilak lortu zituzten, pH optimoak 5 eta 7 inguruan,

C. rugosa-ren lipasa baterako oliba-olioa substratu moduan erabiliz.

III. Emaitzak

70

Lipolase eta Novo 398 lipasek antzeko portaera izan zuten erreakzio-

giroaren pH aldatzean, aktibitate maximoa pH 7n izanik. Novo Nordisk-ek

bidalitako Novo 398-ren eta Lipolase-ren fitxa teknikoen arabera entzima hauen

aktibitate maximoa pH 11n ematen da (AF 95 metodoa erabiliz), detergenteen

formulazioetan erabiltzekoak dira eta. Novo Nordisk-en AF 95 entseguak

tributirina erabiltzen du substratu moduan, eta ikerlan honetan oliba-olioa

erabili dugu gero ikertuko diren laginen antza handia duelako. Baliteke

entzimek pH-ren eragina aktibitate-profilean ezberdina izatea substratu

ezberdinak erabiltzen direnean. Izan ere, Wang eta lankideek (1988) C. rugosa-

ren lipasa batek pH-ren arabera eta substratuaren arabera aktibitate ezberdina

zuela aurkitu zuten, oliba-olioa eta tributirina erabiliz. Oliba-olioa erabiliz bi

aktibitate-maximo aurkitu zituzten, pH 5 eta 7n, baina tributirina erabiliz, bat

bakarrik pH 7n.

Novo 398 lipasaren karakterizazioa egitean, Garou-k (1998) ia aktibitate

bera aurkitu zuen pH 5-11 tartean (Novo Nordisk-en AF95 metodoa erabiliz).

Hau ez dator bat guk aurkitutakoarekin ezta Novo Nordisk-ek

adierazitakoarekin. Crooks eta lankideek (1995a) Lipolase-ren aktibitatearen

aldaketa p-nitrofenilbutiratoren mikroemultsioetan aztertu zuten pH-aren

arabera eta Novo Nordisk-ek adierazitakoarekin bat datozen emaitzak lortu

zituzten, pH optimoa 9.3-10.4 tartean. Hala ere, emaitza hauek ez datoz bat

ikerlan honetan lortutakoekin oliba-olioa erabilita, lipasaren aktibitate maximoa

pH 7n baitzegoen. Beraz, entzimen ezaugarriak ikertzean, ondoren erabilera

industriala eman nahi bazaie, guztiz beharrezkoa da erabilera industrialean

erabiliko den substratuaren antza handia duen substratua aukeratzea

karakterizaziorako. Askotan, ekoizleek ez dute kontuan hartzen ondorengo

erabilera industriala. Gehienetan metodo errazak eta azkarrak erabiltzen

dituzte loteen arteko aktibitateen ezberdintasunak neurtzeko.

Novo 868 lipasa aktiboagoa izan zen pH 5-6 tartean (%100-96), baina

erreakzioa pH 8n egiten zenean aktibitatea gutxitzen zen maximoaren %26ra

III. Emaitzak

71

iritsi arte. Lipopan lipasak aktibitate maximoa pH 6n zuen (%100), pH 7 eta 8n

era nabarian gutxituz (%53 eta 13, hurrenez hurren).

Aintzat hartzekoa ere bada, lipasen prestakin komertzial gehienak

prestakin gordinak direla eta lipasa bat baino gehiago izan dezaketela

(isozimak), selektibitate ezberdinak izan ditzaketenak, edo pH profil

ezberdinak dituztenak. Kasu hauetan, neurtutako aktibitatea prestakin horretan

dauden aktibitate ezberdinen batez bestekoa litzateke. Ezaguna da C. rugosa-k

lipasaren 7 gene kodeatzaile dituela (Plou eta lank., 1997) eta hauetatik 5 guztiz

karakterizatu direla. Rúa eta lankideek (1993) C. rugosa-ren bi lipasa (A eta B)

araztu eta karakterizatu zituzten. Bien artean substratu espezifizitate

ezberdinak aurkitu zituzten: B lipasak aktibitate lipasa handiagoa zuen, A

lipasak, berriz, aktibitate esterasa handiagoa. Bi lipasek antzeko pH profilak

bazituzten ere, optimoa 7 inguruan izanik, aktibitate jaitsiera pH 8n nabariagoa

zen B lipasaren kasuan.

Neves Petersen eta lankideek (2001) lipasek zergatik zuten pH optimo

ezberdinak ikertu zuten. Esaterako, C. rugosa-ren (6.5-7.5) eta Humicola

lanuginosa-ren (gaur egun, T. lanuginosus, pH 11-12) pH optimoak ikertu

zituzten. Lipasa bien pH optimoen ezberdintasunari azalpena emateko gune-

aktiboaren hondarren balorazio-kurbak erabili zituzten. C. rugosa-ren lipasaren

gune-aktiboaren inguruak negatiboki kargatzen ziren pH 3n (entzimaren

konformazio irekirako eta itxirako), eta T. lanuginosus-enak, berriz, bakarrik 8.5-

9.0 baino pH altuagoetan. Honek azalduko luke zergatik lipasek pH optimo

ezberdinak izan ditzaketen.

1.3. Tenperaturaren eragina aktibitate lipolitikoan.

Entzimek katalizatutako erreakzioetan tenperatura igo ahala bi kontrako

ondorio ikusten dira (Uhlig, 1998): erreakzioaren abiadura tenperatura igo

ahala igotzen da (honen ondorioz aktibitatea handiagoa da), baina tenperatura

III. Emaitzak

72

altuek entzimaren egonkortasuna gutxitzen dute, desnaturalizazio termikoa

dela eta. Honen ondorioz, entzima aktiboaren kopurua gutxitzen da, baita

erreakzioaren abiadura ere. Normalean 30-50 ºC-tako tartean, abiaduraren

igoera desnaturalizazioaren gainetik nagusitzen da eta aktibitate entzimatikoa

tenperatura igo ahala igotzen da, baina 50 ºC gainetik, kasu gehienetan,

desnaturalizazioa nagusitzen da eta aktibitate entzimatikoa gutxitzen da.

Lipasen aktibitate lipolitikoa 25-50 ºC-tako tartean ikertu zen (11a.

irudia). Kasu gehienetan tenperatura optimoa 37-40 ºC tartean egon zen. Soilik

C. antarctica-ren (A lipasa) Novo 868-k eta H. insolens-en Novo 398-k izan zuten

aktibitate maximoa ikertutako tenperaturarik altuenean (50 ºC).

Abiaduraren logaritmoa eta tenperaturaren alderantzizkoa erlazionatzen

duten kurbak irudikatzen badira, Arrhenius irudikapena lortzen da (11b.

irudia). Horrela lortutako zuzenaren maldarekin erreakzioaren aktibazio-

energia (Ea) kalkula daiteke ekuazio honen arabera (Segel, 1976):

ATR

Ev

alog

1

3.2log

OF, Lipomod, Lipolase eta Lipopan lipasek bi zati ezberdin ematen

zituzten Arrhenius irudikapenean, bata malda positiboa duena eta bestea

negatiboa. Novo 398 eta Novo 868 lipasek, berriz, nahiz eta bi zati izan, bi

zatiek malda negatiboa dute. Honen arrazoia, lipasa hauen tenperatura

optimoan egon daiteke. Izan ere, bi lipasa hauen tenperatura maximoa 50 ºC

zen eta agian 25-50 ºC tartea ez da nahikoa desnaturalizazio termikoa ikusteko.

Lehen esan bezala, erabilitako erreakzio-baldintzetan lipasa gehienen

tenperatura optimoa 37-40 ºC tartean zegoen. Hortik aurrera aktibitatea

gutxitzen da eta zuzenaren malda positiboa da. Horrek azaltzen du Arrhenius

irudikapenak bi zati ezberdin izatea. Kalkuluetarako malda negatiboko zatia

erabiliko da.

III. Emaitzak

73

0

20

40

60

80

100

20 25 30 35 40 45 50 55

T (ºC)

Ak

tib

itat

ea (

%)

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

3.0 3.2 3.4

T-1 x103 (K-1)

Lo

g (

v0)

11. irudia. Aktibitate entzimatikoa tenperaturaren arabera a) Aktibitate erlatiboa (Lipasa bakoitzaren aktibitate maximoaren ehunekoak), b) Arrhenius irudikapena: OF, o Lipomod, ∆ Lipolase, + Lipopan, ◊ Novo 398 eta x Novo 868.

Maldaren aldaketa bi arrazoiengatik izan daiteke: entzimaren

inaktibazioa (jaitsiera oso nabarmena denean) edo emultsioaren ezaugarrien

aldaketak tenperatura igotzean (Segel, 1976). Tenperatura igotzean, biskositatea

a)

b)

III. Emaitzak

74

gutxitzen da, baita ura-lipido interfasearen gainazal-tentsioa ere (Al-Zuhair eta

lank., 2003).

Askotan tenperaturaren eragina erreakzio-abiaduran Q10 koefizientearen

bidez adierazten da. Q10 koefizientea tenperatura 10 ºC igotzen denean

erreakzio-abiadura biderkatzen duen faktorea da.

10

log3.2 1012 QTRTEa

Q10 koefizienteen, aktibazio-energien eta tenperatura optimoen emaitzak

8. taulan biltzen dira. Aktibazio-energiaren eta Q10 koefizientearen datuak

zuzenen malda negatiboaren emaitzekin kalkulatu ziren, desnaturalizazio

termikoa nabarmena izan baino lehen. Ikus daitekeenez, Novo 868 lipasak

aktibazio-energiarik altuena zuen ikertutako tenperatura tarte horretan (25-

37 ºC). Honez gain, tenperaturaren eragin nabarmenena jasaten duena ere bada,

ikertutako lipasen artean Q10 koefizienterik altuena duena izanik.

8. taula. Ikertutako lipasen tenperatura optimoak eta Arrhenius irudikapenetik kalkulatutako aktibazio-energia (Ea) eta Q10 koefizientea.

Lipasa T optimoa (ºC) Ea (kJ/mol) Q10

Lipolase 40 12.67 1.18

Lipopan 40 13.05 1.19

OF 37 14.51 1.21

Lipomod 40 15.73 1.23

Novo 398 50 19.51 1.29

Novo 868 50 34.56 1.57

Ea = Aktibazio-energia Q10 = Tenperatura 10 ºC igotzean erreakzio-abiadura biderkatzen duen faktorea.

Zanin eta de Moraes-ek (1998) erreakzio entzimatiko gehienen aktibazio-

energia 105 kJ/mol baino gutxiagokoa dela adierazi zuten. Al-Zuhair eta

lankideen (2003) esanetan lipasen aktibazio-energiak normalean 10-20 kJ/mol

III. Emaitzak

75

tartean daude, ikerlan honen emaitzekin bat datorrena. Montero eta lankideek

(1993) eta Pereira eta lankideek (2001) C. rugosa-ren lipasen aktibazio-energia

kalkulatu zuten 40 kJ/mol-eko emaitzak lortuz, ikerlan honetan OF eta

Lipomod lipasentzat kalkulatutakoa baino 2.5 bider handiagoak. Crooks eta

lankideek (1995b) Lipolase (H. lanuginosa) eta Lipozyme (R. miehei) aztertu

zituzten hainbat erreakzio-tenperatura erabiliz. Lipolase-k katalizatutako

tributirinaren hidrolisian aktibazio-energia 15 kJ/mol zen, hemen lortutakoaren

antzekoa. Dandik eta lankideek (1993) usagariaren (Nigella sativa) hazien

lipasak katalizatutako olioaren hidrolisiaren aktibazio-energia 26.79 kJ/mol

zela aurkitu zuten, erreakzio-baldintza optimoetan (pH 6 eta birrindutako

haziaren %60 pisuan entzima moduan erabiliz).

1.4. pH-ren eragina lipasen egonkortasunean.

Hondakin-koipetsuen hidrolisi-erreakzioak disoluzio indargetzailerik

erabili gabe garatu ziren (Ikusi “Material eta Metodoak” 48. orr.), xaboien

ekoizpena saihesteko eta hondakinen tratamenduen kostua gutxitzeko, gero

erabilera industrial erakargarria izateko. Horregatik fase urtsua udal-saretik

jasotako ura (Vitoria-Gasteiz) izan zen. Uraren pHa 7.4 ingurukoa izan zen eta

erreakzioa garatu ahala fase urtsuaren pHa jaisten joan zen 5.0era heldu arte,

12. irudian ikus daitekeenez.

Entzima fase urtsuan dagoenez, pH-ren eragina lipasen egonkortasunean

ikertzeko pH 5, 6 eta 7ko fosfato disoluzio indargetzaileak erabili ziren, 37 ºC-

tan eta 24 orduz (13. eta 14. irudiak).

OF lipasa (13a. irudia) nahiko egonkorra da, aktibitatearen %60

mantenduz pH 6n eta 7n, eta %50 inguru pH 5en, 24 orduz beratzen utzi

ondoren. Montero eta lankideek (1993) OF lipasak, ordubetez pH 3-7 tarteko

disoluzio indargetzailetan beratzen uzten zenean, bere aktibitatearen %75

mantentzen zuela aurkitu zuten. OF eta Lipomod lipasek, C. rugosa-ren lipasek,

III. Emaitzak

76

oro har, antzeko egonkortasuna mantendu zuten. Hala ere, Lipomod

egonkorragoa zen pH 6n, ia aktibitatearen %80 mantenduz. Lipasa bien arteko

ezberdintasunak gerta daitezke, lehen azaldu bezala eta bibliografian aurki

daitekeen moduan, C. rugosa-k isozima ezberdinak ekoizten dituelako,

substratu-espezifizitate eta pHaren eta tenperaturaren eragin ezberdinekin.

Hainbat autoreren arabera (Rúa eta lank., 1993; Plou eta lank., 1997; Jonzo eta

lank., 2000) A lipasa egonkorragoa da pH eta tenperaturen aldaketen pean.

Beraz, honek entzima horren prestakinek isozimen proportzio ezberdinak eta

izaera ezberdinak izan ditzaketela adieraz zezakeen.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

denbora (ordu)

pH

12. irudia. OF lipasak katalizatutako erreakzioaren fase urtsuaren pHa hidrolisia garatu ahala (48 ordu pasa eta gero %95eko hidrolisi-maila lortu zen).

Novo 868 eta Lipopan lipasek (13c. eta 14c. irudiak) egonkortasun

handiagoa azaldu zuten pH 5en eta 6n (%80 24 ordu ondoren), hurrenez

hurren, pH 7n baino. Novo 868 lipasa ez zen hain egonkorra pH 7n,

aktibitatearen %60 mantendu zuen 24 ordu pasa eta gero.

III. Emaitzak

77

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

13. irudia. Lipasen hondar-aktibitatea, pH-ren arabera: a) OF, b) Lipomod, c) Novo 868. Lipasak beratzen utzi ziren fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailean: …o… pH 5, - - - - pH 6, --∆--- pH 7 (37 ºC-tan).

a)

b)

c)

III. Emaitzak

78

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

14. irudia. Lipasen hondar-aktibitatea, pH-ren arabera: a) Novo 398, b) Lipolase, c) Lipopan. Lipasak beratzen utzi ziren fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailean: …o… pH 5, - - - - pH 6, --∆--- pH 7 (37 ºC-tan).

a)

b)

c)

III. Emaitzak

79

Disoluzioan lipasarik egonkorrenak Novo 398 eta Lipolase izan ziren, pH

7n euren aktibitateen %97 eta 93 mantenduz, hurrenez hurren (14. irudia).

Lipasa hauen egonkortasuna jaitsi zen disoluzioen pHa jaistean (pH 5 eta 6),

nahiz eta Novo 398-ren kasuan jaitsiera oso txikia izan, 24 orduz pH 5eko

disoluzioan beratzen utzi ondoren aktibitatearen %90 mantendu baitzuen.

Lipolase lipasa ez zen hain egonkorra, pH 5en eta 6n 24 orduz beratzen utzi

ondoren, bere aktibitatearen %80 mantendu baitzuen.

Lipasa bakoitzarekin lortutako egonkortasun-emaitza esperimentalak

eredu matematikoetara egokitu ziren. Modu horretan lortutako ekuazioekin

entzima bakoitzaren erdibizitza lortu zen, hau da, entzimaren aktibitatearen

%50era jaisteko behar den denbora. Kasu guztietan eredu matematikorik

egokiena esponentziala izan zen (“Single exponential decay model” EnzFitter

Biosoft, 1999) 0.9 baino handiagoko erregresio-koefizientearekin kasu guztietan.

Lortutako emaitzak 9. taulan biltzen dira.

9. taula. Ikertutako lipasen erdibizitza (orduak) 37 ºC-tan, hainbat pH-tako disoluzio indargetzailetan beratzen utzi ondoren.

Lipasak

pH OF Lipomod Novo 398 Lipolase Lipopan Novo 868

5 21.2 29.8 207.3 84.2 36.8 93.2

6 33.3 50.2 417.1 80.2 83.5 91.2

7 28.2 24.0 530.1 251.9 39.2 34.8

Kalkulatutako erdibizitzetatik eta 13. eta 14. irudietatik ondoriozta

daitekeenez, Novo 398 lipasa ikertutakoen artean egonkorrena zen eta

egonkortasun gutxien zutenak, berriz, OF eta Lipomod, C. rugosa-ren lipasak.

Lipasa gehienak egonkorragoak izan ziren pH 6n, Novo 868 izan ezik, pH 5en

baitzen egonkorragoa. Novo 398 eta Lipolase lipasen egonkortasuna pHa

handitu ahala handitu zen. Hidrolisi erreakzioetan pH basikoak ematen ez

direnez, ez ziren aztertu, baina litekeena da lipasa hauek pH basikoetan

egonkorrak izatea, izan ere, detergenteetan erabiltzeko egokitu dira.

III. Emaitzak

80

1.5. Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean

Sarreran (14. orr.) azaldu bezala, lipasek katalizatutako koipeen

hidrolisia tenperatura epeletan egin daiteke, albo-produktuen ekoizpena

saihesteko eta energia-kostua gutxitzeko. Horregatik, tenperaturaren eragina

lipasen egonkortasunean ikertzeko lipasak beratzen utzi ziren pH 7ko disoluzio

indargetzaileetan 25-45 ºC-tan (15. eta 16. irudiak).

Novo 398 (H. insolens) eta Lipolase (T. lanuginosus) lipasak (16. irudia)

izan ziren lipasarik termoegonkorrenak. Izan ere, 45 ºC-tan 24 ordu pasa eta

gero, euren aktibitateen %92 eta 62 mantendu zuten, hurrenez hurren. Bi lipasa

hauek detergenteetan erabiltzen dira eta termoegonkortasuna guztiz

beharrezkoa dute garbiketa-tenperaturak jasateko. Lipasa hauek ingeniaritza

genetikoaren bidez hobetu dira. Zenbait hondar aminoazidiko espezifiko

ordezkatuz, termoegonkorragoak diren lipasen aldaerak lortu dira. Esaterako

T. lanuginosus-en termoegonkortasuna 4 ºC handitu da (Minning eta lank.,

2002). Era berean Svendsen-ek (2000) lipasen ingeniaritza proteikoari buruzko

errebisio batean ikerketa batzuk bildu zituen eta prolina ordezkatuz

T. lanuginosus-en termoegonkortasuna 2 ºC-tan handitu zela azaldu zuen.

OF lipasak (15a. irudia) bere aktibitatearen %60 gordetzen zuen 37 ºC-tan

24 orduz. Tenperatura altuagoetan, 45 ºC-tan, aktibitatea oso azkar jaitsi zen eta

4 orduetarako aktibitatearen %60 galdu zuen, 24 orduetarako bere hondar-

aktibitatea %5 besterik ez izanik. Montero eta lankideek (1993) ere 37 ºC-tan

ordubetez beratzen utzi ondoren OF lipasa guztiz aktiboa zela ikusi zuten,

baina tenperatura altuagoetan aktibitatea gutxitu zen, 40 ºC-tan %50, 45 ºC %20

eta 50 ºC baino gehiagoko tenperaturetan bere aktibitatea guztiz desagertuz.

III. Emaitzak

81

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

15. irudia. Lipasen hondar-aktibitatea tenperaturaren arabera: a) OF, b) Lipomod, c) Novo 868.

Lipasak beratzen utzi ziren pH 7ko fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailean: .... 25 ºC, --—

30 ºC, ---- 37 ºC, - -∆ - - 40 ºC, –х-- 45 ºC-tan.

a)

b)

c)

III. Emaitzak

82

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

16. irudia. Lipasen hondar-aktibitatea tenperaturaren arabera: a) Novo 398, b) Lipolase, c)

Lipopan. Lipasak beratzen utzi ziren pH 7ko fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailean: .... 25 ºC, ---- 30 ºC, ---- 37 ºC, - -∆ - - 40 ºC, –х-- 45 ºC-tan.

a)

b)

c)

III. Emaitzak

83

C. rugosa-ren bi lipasak alderatuz gero (15a. eta 15b. irudiak), OF lipasak

Lipomod lipasak baino egonkortasun handiagoa gordetzen zuela 37 ºC arte

ikus daiteke, baina 40 ºC-tik aurrera biek antzeko egonkortasuna izan zuten.

Lipomod lipasaren aktibitatea nahiko azkar jaitsi zen 25-37 ºC tartean, baina 24

orduz 40 eta 45 ºC-tan egon ondoren aktibitatearen %42 eta %21 gorde zituen,

hurrenez hurren. OF lipasaren aktibitatea, berriz, azkarrago jaitsi zen 40-45 ºC-

tako tartean. Honez gain, hondar-aktibitate baxuagoak gorde zituen 24 orduz

40 eta 45 ºC-tan egon ondoren, %36 eta %5, hurrenez hurren. Ezberdintasun

hau, lehen azaldu bezala, C. rugosa-k hainbat isozima ekoizten duelako eta

isozimen egonkortasuna ez delako bera, C. rugosa-ren A lipasa egonkorragoa

izanik tenperaturaren aldaketarekiko (Rúa eta lank., 1993).

Novo 868 lipasa (C. antartica-ren A lipasa, 15c. irudia) nahiko egonkor

mantendu zen aztertutako tenperaturetan. Novo 398 eta Lipolase lipasak bezain

egonkorra ez bazen ere, bere aktibitatearen %80 gorde zuen 25 eta 30 ºC-tan eta

tenperatura igotzean 40 eta 45 ºC-taraino, aktibitatearen %50 gorde zuen 24

orduz beratzen utzi ondoren. Lipopan lipasak (16c. irudia) Novo 868 lipasaren

antzeko profila zuen 25 eta 37 ºC-tako tartean, bere aktibitatearen %70 gordez

24 orduz. Beratze-tenperatura igotzean entzimaren egonkortasuna gutxitu zen

%50era 40 eta 45 ºC-tako tartean, nahiz eta aktibitatearen jaitsiera Novo 868

lipasarena baino motelagoa izan.

Lipasa bakoitzarekin lortutako egonkortasun-emaitza esperimentalak

eredu matematikoetara egokitu ziren. Modu horretan lortutako ekuazioekin

entzima bakoitzaren erdibizitza lortu zen (10. taula). Kasu guztietan eredu

matematikorik egokiena esponentziala izan zen (Single exponential decay

model, EnzFitter, Biosoft 1999) 0.9 baino handiagoko erregresio-

koefizientearekin kasu gehienetan. Kontuan hartu behar da erdibizitza

kalkulatzeko aztertutako denbora-tarteak (24 ordu) lipasa batzuentzat oso motz

gelditzen direla, esaterako Novo 398 eta Lipolase lipasen kasuetan.

III. Emaitzak

84

10. taula. Ikertutako lipasen erdibizitza (ordu) hainbat tenperaturatan eta pH 7n beratzen utzitakoak.

Lipasak

T (ºC) OF Lipomod Novo 398 Lipolase Lipopan Novo 868 25 72.9 45.9 223.9 189.3 44.3 54.3

30 39.4 18.0 164.0 155.9 39.4 71.7

37 28.2 24.0 530.1 251.9 39.2 34.8

40 11.0 11.4 763.5 69.6 15.0 34.8

45 3.2 4.7 231.6 40.5 12.9 34.4

Izan ere, Novo 398 eta Lipolase lipasak oso egonkorrak dira eta euren

erdibizitzak luzeegiak dira era horren bidez neurtzeko. Emaitza hauek lipasa

hauen datuekin egokitze onak lortzeko zailtasunak islatzen dituzte, bi lipasa

hauen desaktibazioa oso txikia baita aztertutako baldintzetan eta aldakortasun

esperimentalak aktibitatean aurkitutako jaitsiera baino handiagoak izan

baitaitezke (Zanin eta de Moraes, 1998). Horregatik Novo 398 eta Lipolase

lipasentzat lortutako emaitzak lipasa hauek oso egonkorrak direla egiaztatzeko

besterik ez dira eta esan daitekeen gauza bakarra aztertutako baldintzetan

lipasa horiek oso egonkorrak izan zirela da.

Ikertutako lipasa gehienen erdibizitza, Novo 398rena izan ezik, 37 ºC-

tatik aurrera azkarrago gutxitu zen. Dirudienez, 37 ºC-tatik aurrera lipasak ez

ziren hain egonkorrak eta azkarrago desnaturalizatu ziren, euren aktibitate

entzimatikoa galduz. Pereira eta lankideek (2001) C. rugosa-ren lipasa baten

egonkortasun termikoa ikertu zuten eta 45 ºC-tan 1.33 ordutako erdibizitza

lortu zuten, ikerlan honetan OF eta Lipomod lipasentzat lortutakoen antzekoa,

45 ºC-tan 3.2 eta 4.7 orduko erdibizitzak lortu ziren, hurrenez hurren.

III. Emaitzak

85

1.6. Substratu-ereduen hidrolisia

Ikertutako lipasek katalizatutako erreakzioen ezaugarriak hobeto

aztertzeko eta lipasa horien artean hondakin-koipetsuak tratatzeko egokiena

aukeratzeko, hazi-olioa eta txerri-gantza erabili ziren hondakin-koipetsuen bi

motatako substratu-eredu moduan eta koipe horiek erabiliz hidrolisi-

erreakzioak egin ziren.

Hidrolisiaren baldintzak gero sakonago aztertu baziren ere, hasierako

erreakzioak lipasarik egokiena aukeratzeko jarraian adierazten diren

baldintzetan egin ziren:

Substratuen proportzioa: 50:50 gantz edo olio:ura (pisu:bolumena).

Koipeen proportzio handiegiak hidrolisi-maila baxuagoa eragin

baitzezakeen erreakzio-denbora bera erabiliz.

Erreakzio-tenperatura: 37 ºC, lipasa gehienen tenperatura optimoa baitzen.

Tenperatura honetan lipasa guztiek euren aktibitatearen %60 gorde zuten

24 ordutako egonkortasun azterketetan.

Gehitutako lipasa unitateak: 90 U lipasa/g substratu (A metodoa erabiliz

neurtuta). Virto eta lankideen (1991) eta Albasi eta lankideen (1997; 1999)

arabera, lipasa-unitate hauek hidrolisi-maila altuak lortzeko, %90 inguru

24 ordutan, eta hasierako orduetan erreakzioaren eboluzioa aztertzeko

nahikoak dira.

Erreakzio-bolumena: 500 mL.

Erreakzio-giro indargetu gabea, xaboien ekoizpena saihesteko. Udal-

sareko ura erabiltzea erabaki zen kostuak gutxitzeko. Virto eta lankideen

(1991) arabera udal-sareko uraren erabilerak ez zuen hidrolisi-maila

gutxitu eta antzeko emaitzak lortu ziren ur destilatu edo desionizatua

erabiliz.

Irabiaketa: 360 rpm, nahikoa emultsio egonkor eta homogeneoak

mantentzeko 24 orduz.

III. Emaitzak

86

“Material eta Metodoak” atalean (53. orr.) azaldu bezala, erreakzio-

nahasketaren laginak hartu ziren hainbat denbora tartetan hidrolisiaren

eboluzioa aztertzeko gantz-azido askeen ekoizpena eta hidrolizatu gabe

gelditzen ziren monoglizerido, diglizerido eta triglizeridoak neurtzeko.

1.6.1. Gantz-azidoen ekoizpena

Txerri-gantza eta hazi-olioa substratu moduan erabiliz hidrolisian

askatutako gantz-azidoak gas-kromatografiaren bidez neurtu ziren. Lortutako

datuekin erreakzioaren hasierako abiadura (mol askatutako GA minutuko)

kalkulatu zen hasierako 5 minututako datuekin (11. taula).

11. taula. Hidrolisi-erreakzioen hasierako abiadura (mol GAA/min) substratuen arabera.

Lipasa Hazi-olioa Txerri-gantza

Lipolase 123.05 ± 6.05 159.58 ± 7.98

Lipopan 107.42 ± 5.07 67.64 ± 3.38

OF 85.08 ± 4.25 56.55 ± 2.83

Lipomod 38.64 ± 1.93 41.57 ± 2.79

Novo 398 103.92 ± 5.20 123.10 ± 6.16

Novo 868 91.51 ± 4.58 68.63 ± 3.43

Neurtutako abiaduren arteko ezberdintasunak nabariak ziren, bai

entzimen artekoak bai substratuen artekoak, kasu guztietan lipasa-unitate

kopuru bera gehitu bazen ere (90 U/g koipe). OF, Lipopan eta Novo 868 lipasen

erreakzioaren hasierako bost minututan neurtutako abiadura handiagoa zen

hazi-olioaren hidrolisirako; Lipolase eta Novo 398 lipasen kasuan, berriz,

erreakzio-abiadura handiagoa zen txerri-gantzaren hidrolisirako. Lipomod

lipasak, bestaldetik, erreakzio-abiadura antzekoa izan zuen bi substratuekin.

Ezberdintasunen arrazoiak honako hauek izan daitezke: 1) lipasen aktibitatea

neurtzeko erabilitako entsegua oliba-olioa, polibinil-alkohola emultsifikatzaile

moduan eta pH 7n mantentzeko fosfato disoluzio indargetzailea erabiliz egin

zen, hidrolisi-erreakzioak, berriz, emultsifikatzailerik eta disoluzio

III. Emaitzak

87

indargetzailerik gabe egin ziren. Beraz, emultsioak guztiz ezberdinak ziren; 2)

honez gain, irabiaketa ere ezberdina zen eta honek eragin handia du eratutako

emultsioan. Aktibitate-entseguan irabiaketa orbitala erabili zen, hidrolisi-

erreakzioetan, berriz, helizezko irabiagailua.

OF eta Lipomod lipasen arteko ezberdintasunak hazi-olioaren hidrolisian

aztertzea interesgarria da. Izan ere, OF lipasak Lipomod lipasaren hasierako

erreakzio-abiadura bikoiztu zuen. Honen arrazoia C. rugosa-k sortzen dituen

isozima ezberdinetan egon daiteke. Lipasen prestakin komertzialak isozima

hauen nahasketak izan ditzakete eta honen ondorioz espezifizitate ezberdinak

erakutsi ditzakete. Esaterako, C. rugosa-ren A lipasak esterasa aktibitate

(tributirinarekin) handiagoa dauka; B lipasak, berriz, aktibitate handiagoa

erakusten du trioleinarekin (Rúa eta lank., 1993).

Lipasek nolabaiteko substratu-espezifizitatea zuten ala ez ikusteko,

erreakzioaren hasierako 5 minututan askatutako gantz-azido bakoitzaren

kantitatea neurtu eta une horretan askatutako gantz-azido guztiei zegokien

ehunekoa kalkulatu zen. Gantz-azido bakoitzaren askatutako portzentajea

substratu bakoitzak berez duen gantz-azido portzentajearekin alderatu zen (17.

irudia). Bi substratuak erabiliz gauza bera ikusi zen, lipasa guztiek azido

linoleikoa (C18:2) lehentasunez askatzen zutela, substratuetan baino portzentaje

handiagoan agertzen baitzen. Oro har, gantz-azido asegabeak lehentasunez

askatu ziren, substratuen berezko konposaketari zegokionez.

Txerri-gantzaren gantz-azidoak (C18:1 izan ezik) substratuaren berezko

konposaketari zegokion portzentaje antzekoekin askatzen zituen lipasa bakarra

Novo 868 (C. antarctica-ren A lipasa) izan zen. Aipatzekoa da lipasa honek

gainontzeko lipasek baino gantz-azido aseen proportzio handiagoa askatu

zuela.

III. Emaitzak

88

0

10

20

30

40

50

60

C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2

GA

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

C16:0 C18:0 C18:1 C18:2

GA

(%

)

17. irudia. Askatutako gantz-azido nagusien portzentajea (une horretan askatutako gantz-azido guztiei dagokienez) erreakzioaren hasierako 5 minututan: a) txerri-gantza edo b) hazi-olioa substratu moduan (beltzez dagoen zutabea) erabiliz. Ikurrak: substratuaren konposaketa gantz-azidotan; Lipasak: OF; Lipomod; || Lipolase; ≡ Novo 398; Novo 868; \\ Lipopan. Erreakzio-baldintzak: 50:50, koipe:ura proportzioa (pisu:bolumen), lipasa 90 U/g substratu, 37 ºC eta 360 rpm.

a)

b)

III. Emaitzak

89

Candida rugosa-ren (OF eta Lipomod) lipasek gantz-azidoak era berean

askatu zituzten. Lipasa hauek ez dute posizio-espezifizitaterik (Sonnet, 1988),

baina gantz-azido asegabeekiko espezifizitatea azaltzen dute. Novo Nordisk-ek

adierazi zuenez, T. lanuginosus-en lipasek (Lipolase eta Lipopan) sn-1 eta sn-3

posizioetarako espezifikoak dira, baita Novo 398 (H. insolens) ere. Candida

antarctica-ren A lipasa (Novo 868), berriz, sn-2 posizio-espezifizitatea duela

adierazi izan da (Rogalska eta lank., 1993). Lipolase, Lipopan eta Novo 398

lipasek ere era berean askatu zituzten gantz-azidoak eta C. rugosa-ren lipasekin

alderatuz gero, txerri gantzatik azido palmitiko eta palmitoleiko gutxiago

askatu zituztela ikus daiteke; eta oliotik, berriz, azido linoleiko gutxiago.

Azido linoleikoa TGen 3 posizioetan aurkitzen bada ere, landare olioetan

ugariago da sn-2 posizioan eta txerri-gantzan, berriz, sn-1 eta sn-3 posizioetan.

Bestalde, azido palmitikoa eta palmitoleikoa, batez ere, txerri gantzaren sn-2

posizioan aurki daitezke (Padley eta lank., 1994). Hau guztia lortutako

emaitzekin bat dator.

Bestaldetik, lehen esan bezala, Novo 868 lipasak gainontzeko lipasek

baino gantz-azido ase gehiago askatu zituen. Landare-oliotan eta koipetan

gantz-azido aseak kanpoko posizioetan (sn-1 eta sn-3) aurkitzen dira

normalean, Belitz eta Grosch-ek (1999) azaldu bezala. Txerri-gantzan, berriz,

azido palmitikoa, batez ere, sn-2 posizioan aurki daiteke (Padley eta lank.,

1994). Honek guztiak, lehen esan bezala, lipasa hau sn-2 posizio-espezifikoa

izateaz gain, gantz-azido aseekiko espezifizitatea duela pentsarazi dezake.

1.6.2. Glizerido partzialen determinazioa

Hazi-olioaren eta txerri-gantzaren hidrolisian zehar laginak ere hartu

ziren erreakzio-nahasketaren konposaketa karakterizatzeko, hau da, substratu,

bitarteko eta produktuak neurtzeko denboratarte ezberdinetan. Aztertutako

lipasek jokabide ezberdinak izan zituzten hidrolisian zehar 18. eta 19. irudietan

III. Emaitzak

90

ikus daitekeen bezala. Adibidez, 180 minututako erreakzioaren ondoren OF eta

Lipomod lipasak erabiliz, hazi-olioaren hidrolisi-nahasketan gantz-azidoak

%70-80 (pisuan) ziren eta %60-70 txerri-gantzarenak. Gainontzeko lipasek,

berriz, gantz-azidoen %30 edo %40 inguru besterik ez zuten askatu, kasu

guztietan gehitutako lipasa-unitateak berdindu baziren ere.

Erreakzioaren hasierako minututan, OF lipasak gantz-azidoak eta

diglizeridoak era paraleloan sortzen zituen, gero diglizeridoak pixkanaka

gutxitu ziren, monoglizeridoak, berriz, kontzentrazio minimoetan mantendu

ziren. Emaitza hauek bat datoz lipasa honen inespezifizitatearekin (Sonnet,

1988). Antzeko jokabidea Lipomod lipasaren kasuan aurki daiteke. Lipomod

Candida rugosa lipasaren beste prestakin komertziala baita. Bi lipasa hauek

landare-olioetan ugariago diren gantz-azido asegabeekiko nolabaiteko

espezifizitatea izan dezakete, hori dela eta landare-olioaren hidrolisi-

erreakzioak azkarragoak dira (Sonnet, 1988; Virto eta lank., 1994).

Gainontzeko lau lipasek antzeko jokabidea izan zuten: Erreakzioaren

hasierako minututan gantz-azidoak azkar askatu ziren (%20), honekin batera

diglizeridoen ekoizpena handituz (%30-40). Erreakzioaren 30 minututik aurrera

gantz-azido gutxi askatu ziren %35era iritsiz. Triglizeridoen degradazio motela

gertatzen bada ere, gantz-azido eta diglizeridoak sortuz, azken hauek

kontzentrazio finkoan mantentzen dira, pixkanaka hidrolizatzen baitira

monoglizeridoak emateko. Lipolase, Novo 398 eta Lipopan lipasek posizio-

espezifizitate nabaria dutela, baina ez dutela gantz-azido espezifizitate argirik

ematen du, bitartekoen eboluzioa oso antzekoa baita bi substratuak erabiliz.

Emaitza hauek Fu eta lankideek (1995) lortutakoekin bat datoz. Autore hauek

Aspergillus spp. eta Lipolase lipasek katalizatutako gantzen eta olioen hidrolisia

ikertu zuten eta Lipolasek %25eko hidrolisia lortu zuen bitartean, besteak %70

lortu zuen. Autore hauek emaitza hauei eman zioten azalpena T. lanuginosus-en

lipasak (Lipolase) duen sn-1 eta sn-3 posizio-espezifizitatean aurkitzen da.

III. Emaitzak

91

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

Err

eak

zio

nah

ask

etar

en

ko

np

osa

ket

a (%

)

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

Err

eak

zio

nah

ask

etar

en

ko

np

osa

ket

a (%

)

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

Err

eak

zio

nah

ask

etar

en

ko

np

osa

ket

a (%

)

18. irudia. Lipasek katalizatutako erreakzioen substratu (x TG), bitarteko (∆ DG, MG) eta produktuen (◊ GAA) eboluzioa denboran zehar: …….….Hazi-olioa eta ____ txerri-gantza; Erreakzio-baldintzak: 50:50 koipe:ura proportzioa (pisu:bolumen), lipasa 90 U/g, 37 ºC, 360 rpm eta erreakzio-bolumena 500 mL. Lipasak: a) OF, b) Lipomod eta c) Novo 868.

a)

b)

c)

III. Emaitzak

92

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

Err

eak

zio

nah

ask

etar

en

ko

np

osa

ket

a (%

)

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

Err

eak

zio

nah

ask

etar

en

ko

np

osa

ket

a (%

)

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

Err

eak

zio

nah

ask

etar

en

ko

np

osa

ket

a (%

)

20. irudia. Lipasek katalizatutako erreakzioen substratu (x TG), bitarteko (∆ DG, MG) eta produktuen (◊ GAA) eboluzioa denboran zehar: …….….Hazi-olioa eta ____ txerri-gantza; Erreakzio-baldintzak: 50:50 koipe:ura proportzioa (pisu:bolumen), lipasa 90 U/g, 37 ºC, 360 rpm eta erreakzio-bolumena 500 mL. Lipasak: a) Lipolase, b) Novo 398 eta c) Lipopan.

a)

b)

c)

a)

b)

c)

III. Emaitzak

93

Azkenik, produktibitatea kalkulatu zen entzimaren aktibitatea

erdibizitzaz biderkatuz (12. taula). Emaitzak kontuan hartuz gero, oso argi

ikusten da produktibitaterik handiena OF lipasarekin lortutakoa izan zela. Izan

ere, bere erdibizitza txikia izan arren, bere aktibitatea oso altua da eta egin nahi

den prozesua denbora laburrean (gehienez 24 orduetan) egin nahi dela kontuan

hartuta, hondakin koipetsuen hidrolisirako hau aukeratu zen.

12. taula. Ikertutako lipasen produktibitatea 30 ºC-tan.

Lipasak Aktibitatea

(kU/g) Erdibizitza

(ordu)

Produktibitatea

(mol GA/ g entzima)

OF 392 39.4 15444.8

Lipomod 320 18.0 5760.0

Novo 398 29.1 164.0 4772.4

Lipolase 28.6 155.9 4433.0

Lipopan 69 39.4 2718.6

Novo 868 2 71.7 143.4

III. Emaitzak

94

III. Emaitzak

95

2. ESTER METILIKOAK EKOIZTEKO ERABILITAKO LIPASEN KARAKTERIZAZIOA

Esterifikazio erreakzioak katalizatzeko hiru lipasa immobilizatu erabili

ziren. Lipasa hauek Novozymes-ek (Madril) bidali zizkigun gure

esterifikaziorako lipasen eskariari erantzunez: Novozym 435 (Candida

antarctica-ren B lipasa), Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus-en lipasa)

eta Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei-ren lipasa). Novozymes-ek lipasekin

batera euren fitxa teknikoak ere bidali zizkigun, bertan ezaugarririk

nabarmenenak eta ohiko erabilerak azaltzen zirelarik (“Material eta Metodoak”,

37. orr.). Lipasa hauek ester metilikoen sintesirako erabili dira, esaterako,

C. antarctica-ren eta R. miehei-ren lipasak (Nelson eta lank., 1996; Shimada eta

lank., 1999) eta T. lanuginosus-en lipasak (Lipozyme TL IM), Xu eta lankideek

(2004) deskribatu zuten bezala.

2.1. Esterifikazio aktibitatea

Bibliografian esterifikazio aktibitatea neurtzeko hainbat metodo egon

arren (13. taula), haien artean ez dago homogeneotasunik eta honen ondorioz

emaitzen alderaketa oso zaila izaten da. Batzuetan hidrolisi entseguak ere

erabili izan dira esterifikazio erreakzioetan erabiliko ziren lipasen aktibitatea

neurtzeko, baina kasu horietan jasotzen den informazioa guztiz ezberdina da ez

baita neurtzen esterifikazio aktibitatea (Domínguez eta lank., 2002). Gainera

hidrolisian esterifikazioan baino aktibitate handiagoa lortu ohi da lipasa bera

erabilita. Esaterako, Vaysse eta lankideek (2002) metanolarekin neurtutako

esterifikazio abiadura hidrolisi abiadura baino txikiagoa zela aurkitu zuten,

beste batzuen artean Candida antarctica eta Rhizomucor miehei-ren lipasak erabili

zutelarik. Ikertzaile hauen esanetan, ezberdintasun horren arrazoia esterifikazio

erreakzioetan gertatzen den uraren eta metanolaren arteko konpetentzian aurki

daiteke (hidrolisian gertatzen ez dena), edota azilo emailearen (gantz-azidoa

III. Emaitzak

96

ester metilikoaren ordez) ezaugarrietan. Ester metilikoen eta gantz-azido

askeen arteko ezberdintasun nabarmen bat disoziatutako gantz-azidoen eta

lipasaren gune aktiboaren karga negatiboen arteko elkarrekintza errepultsiboa

izan daiteke, Neves Petersen eta lankideek (2001) euren katapulta

elektrostatikoaren ereduan proposatu zuten bezala. Honek hidrolisiaren alde

egingo luke, baina esterifikazio erreakzioak oztopatu.

13. taula. Esterifikazio aktibitatea neurtzeko erabili diren hainbat erreakzio.

Erreakzioa Erreferentziak

Esterifikazioa (Azidoa + Alkohola→Esterra + Ura) o C12+propanola→propil-lauratoa o C8+oktanola→oktanil-oktanoatoa

o (Novo Nordisk, 2000c) o Hult eta Holmquist (1997)

Azidolisia (TG + GA→TG’ + GA’) o Ekilore-olioa+C10→TG C10rekin

o (Novo Nordisk, 2000a)

Interesterifikazioa (TG + TG’→TG’’) o Soja-olioa+triestearina→ TG’’

o (Novo Nordisk, 2000b)

Alkoholisia (TG+Alkohola→Esterra + Glizerola) o TriC18:1+metanola→MetilC18:1+glizerola

o Soumanou eta

Bornscheuer (2003a)

Goiko taulan ikus daitekeenez, esterifikazio erreakzioetan aktibitatea

neurtzeko oso metodo ezberdinak erabil daitezke eta lortzen dugun

informazioa erabat desberdina da. Horregatik, lipasa hauek alderatzeko

entsegu bakarra egitea erabaki zen eta zeudenen artean azido laurikoaren eta

propanolaren arteko erreakzioa neurtzen duena aukeratu zen (“Material eta

Metodoak”, 45. orr.). Entsegu horren bidez lortutako emaitzak eta ekoizleak,

Novozymes-ek, adierazitako aktibitateak 14. taulan ikus daitezke. Argi dago

adierazitako aktibitatearen eta neurtutakoaren artean ez dagoela harreman

zuzenik, batez ere, interesterifikazio entseguetan lortutako emaitzekin

alderatuta. Izan ere, enpresatan normalean aktibitatea ez da neurtzen lipasen

III. Emaitzak

97

arteko alderaketak egiteko, baizik eta lipasa bakoitzaren loteen arteko

ezberdintasunak ikusteko.

14. taula. Erabilitako lipasen esterifikazio aktibitatea.

Izen komertziala Jatorrizko

mikroorganismoa

Neurtutako aktibitatea

(PLU/g)a

Novozymes-ek adierazitako aktibitatea

Novozym 435

C. antarctica

(B lipasa)

3033.9±79.7 10000 PLU/ga

Lipozyme TL IM T. lanuginosus 498.3±95.5 75 IUN/gb

Lipozyme RM IM

R. miehei

1593.7±298.1 5-6 BAUN/gc

aPLU: Propil-Laurato Unitateak, “Material eta Metodoak” atalean (45. orr.) azalduta. bIUN: Interesterifikazio Unitateak (%0.01 (pisuan) eraldatutako triestearina/min (hasierako abiadura) hurrengo erreakzio-baldintzetan: substratua (guztiz hidrogenatutako soja-olioa/soja-olioa; 27/73, p:p), 70 ºC. Disolbatzaile organikorik gabe. Entzimaren kopurua: %10 (p:p) (1276b-GB fitxa, Novo Nordisk, 2000b). cBAUN: Batch Acidolysis Units Novo. Substratuak: Azido oleikoan aberastutako ekilore-olioa eta C10. Erreakzio-baldintzak: 70 ºC eta 60 minutuko erreakzio-abiadura olioaren sn-1 eta sn-3 posizioetan gehitutako azido dekanoikoa neurtuz lortzen da (347d-GB fitxa, Novo Nordisk, 2000a).

Emaitzen arabera erreakzio-baldintza hauetan aktibitaterik altuena izan

zuena C. antarctica-ren prestakin entzimatikoa, Novozym 435, izan zen. Bere

fitxa teknikoak dioenez oso egokia da ester eta amiden sintesirako. Taula-

oinean dauden oharretan ikus daitekeenez, Lipozyme RM IM eta Lipozyme

TL IM interesterifikazio eta azidolisi erreakzioetarako erabili izan dira, koipeen

konposaketa gantz-azidotan aldatzeko. Euren fitxa teknikoen arabera,

Lipozyme RM IM eta Lipozyme TL IM oso erabilgarriak dira triglizeridoen sn-1

eta sn-3 loturen arteko interesterifikazio erreakzioetan, esaterako, lipido

estrukturatuak eta koipe bereziak, kakao-mantekaren ordezkoaren bezalakoak,

ekoizteko (Xu eta lank., 1998; Zhang eta lank., 2001; Kim eta lank., 2002; Torres

eta lank., 2002; Xu eta lank., 2002).

III. Emaitzak

98

2.2. Tenperaturaren eragina aktibitatean

Esterifikazio aktibitatean tenperaturaren eragina neurtzeko

esperimentuak erreakzioaren tenperatura aldatuz, 30 ºC-tatik 80 ºC-tara, egin

ziren (20a. irudia). Kasu guztietan tenperatura handitu ahala aktibitatea

handitu zen, tenperatura jakin batera heldu arte (60-70 ºC). Hortik aurrera

aktibitatea jaitsi zen kasu guztietan, Lipozyme TL IM eta Lipozyme RM IM-ren

kasuetan nabarmenago izanik. Lipasen aktibitaterik altuenak 50-60 ºC tartean

aurki daitezke. Novozym 435-en aktibitaterik altuena, 4000 PLU/g inguru,

60 ºC-tan lortu zen, Lipozyme RM IM-k 2700 PLU/g inguru lortu zituen 50 ºC

eta 60 ºC tartean. Bestalde, Lipozyme TL IM-k bazeukan tenperatura

optimoaren tarte handiagoa, 40-60 ºC tartean lortu baitzuen aktibitaterik

handiena, 700 PLU/g inguru. Kasu guztietan 80 ºC-tan aktibitatea gutxitu zen.

Aktibazio-energia eta Q10 koefizientearen datuak Arrhenius

irudikapenen bidez kalkulatu ziren (15. taula). Horretarako zuzenaren

maldaren tarte negatiboa erabili zen (20b. irudia). Lehen aipatu bezala, 60 ºC-

tatik gora entzima guztien aktibitatea gutxitu zen, Lipozyme TL IM-ren kasuan

nabariago izanik.

Gandhi eta lankideek (1995) eta Yong eta Al-Duri-k (1996) aktibazio-

energia kalkulatu zuten R. miehei-ren lipasek katalizatutako esterifikazio

erreakzioetan 36.25 eta 24.7 kJ/mol lortuz, hurrenez hurren, gure ikerketa-

lanean lortutakoekin bat datozenak. Novozym 435-entzat lortutako Ea izan

ezik, besteak entzima disolbagarriekin katalizatutako erreakzioentzat

lortutakoak baino altuagoak dira.

III. Emaitzak

99

0

25

50

75

100

20 40 60 80

T (ºC)

Ak

tib

itat

ea (

%)

3.5

4.0

4.5

5.0

2.8 3.0 3.2 3.4

T-1 x103 (K-1)

Lo

g (

v0)

20. irudia. Aktibitate entzimatikoa tenperaturaren arabera: a) Aktibitatea eta tenperatura erlazionatzen duen kurba; b) Arrhenius irudikapena. Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM.

15. taula. Arrhenius irudikapenaren bidez kalkulatutako aktibazio-energia (Ea) eta Q10 koefizientearen datuak

Lipasa T optimoa (ºC) Ea (kJ/mol) Q10

Novozym 435 60 8.8 1.1

Lipozyme TL IM 60 24.6 1.4

Lipozyme RM IM 70 20.1 1.2

a)

b)

III. Emaitzak

100

2.3. Substratuen kontzentrazioaren eragina aktibitatean

Azken urteotan gantz-azidoen eta alkoholen arteko esterifikazioaren

erreakzio-mekanismoa ikertzeko hainbat azterketa zinetiko egin dira.

Chulalaksananukul eta lankideek (1990) proposatu zuten lehen aldiz Ping Pong

Bi Bi mekanismoan oinarritutako eredua lipasak katalizatutako azido

oleikoaren eta etanolaren arteko esterifikaziorako. Erreakzioa katalizatzeko

R. miehei-ren lipasa immobilizatua (Lipozyme, 200 U/g, Novo Industri) erabili

zuten eta substratuak ondo disolbatzeko n-hexanoa gehitu zuten. Erreakzio

mota honetan (21. irudia), bi substratu eta bi produktu barne dituen Bi Bi

erreakzioan, entzimak lehen substratuarekin (kasu honetan azidoarekin)

erreakzionatzen du era kobalentean eraldatutako entzima sortzeko (azil-

entzima bitartekoa); jarraian ura askatzen da (lehenengo produktua), eta

alkohola (bigarren substratua) entzimarekin batzen da esterra askatuz bigarren

produktu bezala (Ping Pong mekanismoa):

21. irudia. Ping Pong Bi Bi erreakzio-mekanismoaren eskema, bi substratuen inhibizioa agertzen denean. E: entzima, F: eraldatutako entzima (azil-entzima), Segel (1975) moldatuta.

Autore beraiek alkoholak inhibizio konpetitiboa eragiten zuela frogatu

zuten. Azido oleikoak, ordea, ez zuen inhibiziorik eragiten aztertutako

kontzentrazioetan (60 mM arte). Ramamurthi eta McCurdy-k (1994) C. antartica-

E

C12 Ura

F

Metanola

Metanola C12

E-C12 F + ura F-metanola E + metilC12

ki1 ki2

E

MetilC12

E-metanola (inaktiboa) F-C12 (inaktiboa)

III. Emaitzak

101

ren lipasaren prestakin bat (Randozyme SP-435, Novo Industri) erabili zuten

azido oleiko eta metanolaren arteko esterifikazioaren zinetika ikertzeko. Ikerlari

horiek ere metanolak inhibizioa eragiten zuela ikusi zuten, azido oleikoak,

ordea, ez zuen inhibiziorik eragiten. Ikerketa horretan erabilitako

kontzentrazioa (200 mM) Chulalaksananukul eta lankideek (1990) erabilitakoa

(60 mM) baino altuagoa izan arren. Oktanolak ere inhibizioa eragiten zuen

C. antarctica-ren lipasa batek katalizatutako azido oktanoikoaren esterifikazioan

(Martinelle eta Hult, 1994). Hori guztia kontuan izanda, metanolaren eta azido

laurikoaren kontzentrazioen eragina lipasen erreakzio-abiaduran ikertu zen.

Azido laurikoaren, C12-ren, kontzentrazio finkoa mantenduz eta

metanolaren hainbat kontzentrazio (37.5-500 mM) erabiliz erreakzioaren

hasierako abiadura nola aldatzen zen 22. irudian ikus daiteke. Metanolaren

kontzentrazioa igo ahala, hasierako abiadura era proportzionalean igo zen

neurri bateraino. Hortik aurrera, metanolaren kontzentrazioa gehiago igoz

gero, abiadura igo beharrean jaitsi zen. Lipasa guztien hasierako abiadurarik

handienak substratuen gutxi gorabeherako proportzio ekimolarrak erabiliz

lortu ziren. Lineweaver-Burk, erreziproko bikoitzen, irudikapenean kurba

gorantz tolesten zen 1/v ardatzera hurbiltzen zenean. Metanolaren

kontzentrazio altuak erabiltzean kurba oso argi tolesten zen gorantz,

Ramamurthi eta McCurdy-ren (1994) arabera, metanolak eragindako substratu-

inhibizioa erakutsiz. Atal honetako irudietan bi emaitza mota ikus daitezke:

puntuak datu esperimentalak dira; marrak, berriz, Enzfitter programa

informatikoak (Biosoft, 1999) egindako egokitzeak. Azpimarratzekoa da

metanolak antzeko eragina duela 3 lipasengan, lortutako irudiak oso antzekoak

baitira.

III. Emaitzak

102

22. irudia. Lipasek katalizatutako esterifikazio erreakzioaren hasierako abiadura (1) metanolaren kontzentrazioaren arabera, C12ren kontzentrazio finkoa (250 mM) mantenduz, (2) Lineweaver-Burk irudikapena: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM eta c) Lipozyme TL IM erabilita. Erreakzio-baldintzak: Substratuak 4 mL hexanon disolbatu ziren, 30 ºC-tan, 100 min-1 irabiaketa orbitala eta 10 mg entzima.

a1) a2)

b1) b2)

c1) c2)

III. Emaitzak

103

Azido laurikoaren (C12) kontzentrazioaren eragina, 6.25-500 mM tartean,

esterifikazioaren hasierako abiaduran metanolaren kontzentrazioa finkoa

mantentzen zenean, 23. irudian ikusten da. Azido laurikoak ere inhibizioa

eragiten zuen, metanolak egiten zuen moduan. Azido laurikoaren

kontzentrazioa igo ahala, hasierako abiadura igotzen zen maximo batera heldu

arte, hortik aurrera azido laurikoaren kontzentrazioaren igotzeak ez zuen

abiadura igotzen, jaitsi baizik. Lipasa guztien hasierako abiadurarik handienak

substratuen gutxi gorabeherako proportzio ekimolarrak erabiliz lortu ziren.

Segel-en (1975) esanetan, Ping Pong sistematan substratu biek

eragindako inhibizio konpetitiboa ohikoa da. Hau antzemateko, Lineweaver-

Burk irudikapenak egin ziren, substratu baten kontzentrazioa finkoa

mantenduz eta bestearena aldatuz Novozym 435 lipasa erabiliz (24. irudia).

Ikus daitekeenez, bi irudiak antzekoak dira. Kasu bietan, substratu finkoko

kontzentrazioa handitzearekin, zuzenaren malda ere handitu egiten da. Hau

inhibizio konpetitiboaren adierazle argia da. Gainera, substratu aldagarriaren

kontzentrazioa handitzearekin, zuzenak, 1/v ardatzera hurbiltzen direnean,

gorantz tolesten dira, substratu aldagarriaren inhibizioaren eraginez. Tolestura

edo kurba nabarmenagoa da substratu finkoaren kontzentrazio baxuetan, eta ia

desagertzen da kontzentrazio handienetan, inhibizio konpetitiboa denez, gaindi

daitekeelako. Metanolaren kontzentraziorik egokiena ez zen bera izan

ikertutako kasu guztietan, azido laurikoaren kontzentrazioaren araberakoa

baizik eta alderantziz. Hasierako abiaduraren eta metanolaren edo C12-ren

kontzentrazioaren alderantzizkoen irudikapena eratzen bada (25. irudia),

inhibitzaileak ez diren C12ren eta metanolaren kontzentrazio bakoitzeko

grafiko zuzenak lortzen dira eta metanolaren eta C12-ren kontzentrazio

baxuetan (37.5-125 mM) zuzen hauek paraleloak dira. Honek Ping Pong

erreakzio-mekanismoa egiaztatzen du (Segel, 1975). Metanolaren kontzentrazio

handiagoetan zuzenek bat egiten dute 24. iruditik antzeman daitekeen moduan.

Emaitza hauek erakusten dute Ping Pong Bi Bi erreakzio mekanismoan

III. Emaitzak

104

23. irudia. Lipasek katalizatutako esterifikazio erreakzioaren hasierako abiadura (1) C12-ren kontzentrazioaren arabera, metanolaren kontzentrazio finkoa (250 mM) mantenduz, (2) Lineweaver-Burk irudikapena: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM eta c) Lipozyme TL IM erabilita. Erreakzio-baldintzak: Substratuak 4 mL hexanon disolbatu ziren, 30 ºC-tan 100 min-1 irabiaketa orbitala eta 10 mg entzima.

a1) a2)

b1) b2)

c1) c2)

III. Emaitzak

105

24. irudia. Novozym 435-ek katalizatutako esterifikazio erreakzioen Lineweaver-Burk irudikapena: a) Metanolaren kontzentrazioaren arabera C12ren hainbat kontzentrazio (mM) eta b) C12ren kontzentrazioaren arabera metanolaren hainbat kontzentrazio (mM) erabiliz: • 37.5, • 75, • 125, 187.5, ♦ 250, • 312.5, • 387.5, 437.5, ♦ 500 mM. Puntuak emaitza esperimentalak dira eta marrak Enzfitter (Biosoft, 1999) programa informatikoak Ping Pong ereduari egindako egokitzeak.

a)

b)

III. Emaitzak

106

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

-250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250

[metanol]-1 x104 mM-1

1/

v0

x1

04 (

mo

l m

etil

C1

2*m

in-1

)*g

-1

0

20

40

60

80

100

120

140

-350 -250 -150 -50 50 150 250 350

[C12]-1x104 mM-1

1/

v0

x1

04 (

mo

l m

etil

C1

2*m

in-1

)*g

-1

25. irudia. Esterifikazio erreakzioaren hasierako abiadura Lineweaver Burk-en arabera inhibitzaileak ez diren metanolaren edo C12-ren kontzentrazioetan eta metanolaren (a) edo C12-ren (b) kontzentrazio baxuak erabiliz: o 31.25 mM, x 62.5 mM eta + 125 mM.

alkoholak eta azidoak entzimarekin konplexu inaktibo bat era dezaketela (E-

metanola edo E-azidoa, 21. irudia) (Chulalaksananukul eta lank., 1990;

Bousquet-Dubouch eta lank., 2001).

Inhibizioa dela eta, oso zaila egiten da erreakzio parametroak

kalkulatzea eredu-egokitzeak erabili gabe. Horregatik, Enzfitter (Biosoft, 1999)

a)

b)

III. Emaitzak

107

programa informatikoa erabili zen Novozym 435 lipasaren Vmax, Kmmet, KmC12,

kimet eta kiC12 lortzeko. Horrela lortutako baloreak 6081.12 molxmin-1xg-1,

563.99 mM, 371.47 mM, 238.74 mM y 208.28 mM izan ziren, hurrenez hurren.

kimet-ren balorea bigarren mailako irudikapenen bidez ere lor zitekeen eta

lortutako emaitza antzekoa zen, 206 mM.

Hanes irudikapena eginez gero, ([metanol]/v0 eta [metanol], 26. irudia),

C12ren kontzentrazio baxuak erabiliz, grafikoek bi zati ezberdin zituzten,

erabilitako prestakin entzimatikoan entzima bat baino gehiago egon zitekeela

adieraz zitekeena (Cadenas eta Sols, 1960).

0

1

2

3

4

5

6

7

0 100 200 300 400 500

[metanol] mM

[met

ano

l]/

v0

(

mo

l m

etil

C12

*min

-1)*

g-1

26. irudia. Hanes irudikapena, Novozym 435-ek katalizatutako azido laurikoaren eta metanolaren arteko esterifikaziorako, azido laurikoaren hainbat kontzentrazio (mM) erabilita: o 31.25, x 62.5.

Lehen esan bezala, Chulalaksananukul eta lankideek (1990), Ramamurthi

eta McCurdy-k (1994) eta Yong eta Al-Duri-k (1996) ez zuten ikertutako

kontzentrazioetan (60, 200 eta 20 mM, hurrenez hurren) azido oleikoak

eragindako inhibiziorik aurkitu. Kate-motzeko gantz-azidoek eragiten dute

inhibizioa. Esate baterako, Khrisna eta lankideek (2000) eta Khrisna eta

Karanth-ek (2001) isoamilbutiratoaren sintesia ikertu zuten alkohol

III. Emaitzak

108

isoamilikoak eta azido butirikoak eragindako inhibizioa aurkituz. Güvenç eta

lankideek (2002) lipasa immobilizatuen bidezko (Novozym 435 eta Lipozyme

RM IM) isoamilazetatoren ekoizpena ikertu zuten. Autore hauek bi substratuek

eragindako inhibizioa deskribatu zuten. Stamatis eta lankideek (1993)

Penicillium simplicissimum-en lipasa batek katalizatutako mentol eta C12ren

esterifikazioan C12k eragindako inhibizioa deskribatu zuten. Vázquez Lima eta

lankideek (1995) ere azido laurikoak eragindako inhibizioa aurkitu zuten. Kasu

honetan ikertzen zutena R. miehei-ren lipasa batek katalizatutako C12ren eta

geraniolaren arteko esterifikazioa zen eta C12k inhibizioa eragiten zuen 0.25 M

baino kontzentrazio handiagoan zegoenean. Ghandi eta lankideek (1995),

ordea, ez zuten C12k eragindako inhibiziorik aurkitu R. miehei-ren lipasa batek

katalizatutako C12ren (100-200 mM) eta butanolaren arteko esterifikazioan.

Hau guztia kontuan izanda, kate-luzera ezberdineko gantz-azidoen

kontzentrazioen eragina aztertzea erabaki zen. Horretarako azido laurikoaz

gain, azido butirikoa eta oleikoa erabili ziren. Emaitzak 27. irudian biltzen dira.

Espero zenez, azido butirikoak inhibizioa eragin zuen hiru lipasetan

aztertutako kontzentrazio guztietan (62.5-500 mM). Azido oleikoak, berriz, ez

zuen inhibiziorik eragin ikertutako kontzentrazioetan. Emaitza hauek ikusita

erabilitako gantz-azidoen kate-luzeraren garrantzia nabarmentzen da. Ikusten

denez, esterifikaziorako erabilitako gantz-azidoaren kate-luzera handitu ahala,

eragindako inhibizioa gutxitu edo desagertu egiten da.

III. Emaitzak

109

27. irudia. Lipasek katalizatutako esterifikazio erreakzioaren hasierako abiadura azido butirikoaren (1) eta oleikoaren (2) kontzentrazioen arabera, metanolaren kontzentrazio finkoa (250 mM) mantenduz: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM eta c) Lipozyme TL IM erabilita. Erreakzio-baldintzak: Substratuak 4 mL hexanon disolbatu ziren, 30 ºC-tan 100 min-1 irabiaketa orbitala eta 10 mg entzima.

a1) a2)

b1) b2)

c1) c2)

III. Emaitzak

110

2.4. Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean

Lipasen egonkortasuna ikertzeko lipasek beraiek, ester metilikoak

sortzeko, katalizatutako erreakzioen substratu edota produktu izan daitezkeen

likidoetan (oliotan, ester metilikoen nahasketa batean eta metanolean) beratzen

utzi ziren denbora tarte ezberdinetan gelditzen zitzaien aktibitatea neurtzeko.

Tenperaturaren eragina aktibitatearen egonkortasunean aztertzeko 3

lipasak ekilore-oliotan beratzen utzi ziren hainbat tenperaturatan (30, 40, 50 eta

60 ºC) 24 orduz eta zehaztutako denbora tartetan laginak hartu ziren (28.

irudia). Entsegu hauetan lipasek ez zioten ohiko desaktibazio termikoko

ereduari jarraitu. Kasu batzuetan aktibitatea gutxitu ordez, handitu egin zen.

Aztertutako tenperaturarik baxuena, 30 ºC, hartzen badugu aztergai, Novozym

435-en kasuan, aktibitatea lehenengo 4 orduetan jaisten bazen ere, hortik

aurrera aktibitatea igotzen zen, nahiz eta inoiz %100era iritsi ez. Lipozyme

RM IM-ren aktibitatea hasieran igotzen bazen ere (%140), bigarren ordutik

zortzigarren ordura arte %70era jaitsi zen, 24 ordu pasa eta gero berriro %80ra

igotzeko. Benetako aktibitate igoera izan zuena Lipozyme TL IM zen, hasierako

bi orduetan jaitsiera txikia bazuen ere, zortzi ordu pasa eta gero %180ko

aktibitatea zeukan, 24 ordu pasa eta gero %140n gelditzeko.

Hiru lipasen jokabidea guztiz ezberdina izan zen. Novozym 435-en

kasuan hasierako bi orduetan aktibitatea gutxitu zen tenperatura guztietan,

%85 30 ºC-tan eta %45 60 ºC-tan, gero aktibitatea berreskuratzeko. Esaterako,

60 ºC-tan 24 ordu beratzen utzi ondoren aktibitatearen %75 lortzen zen.

Lipozyme RM IM-ren kasuan, berriz, hasieran aktibitatearen igoera nabaritu

zen, 24 orduz beratzen utzi eta gero hondar-aktibitatearen %85-120 lortuz

tenperaturaren arabera. Bestaldetik, Lipozyme TL IM-k aktibitaterik altuena 8

ordu pasa eta gero lortu zuen %140 inguru mantenduz 24 ordu pasa ondoren

eta 30-50 ºC-tako tartean.

III. Emaitzak

111

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

50

100

150

200

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

0

50

100

150

200

250

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

28. irudia. Lipasen egonkortasuna tenperaturaren arabera: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM eta c) Lipozyme TL IM, ekilore-oliotan beratzen utzita: ◊ 30 ºC, 40 ºC, Δ 50 ºC eta x 60 ºC-tan.

a)

b)

c)

III. Emaitzak

112

Arrazoi ezberdinak egon daitezke jokabide hauetarako. Alde batetik,

azalpena substratuaren barreiapenean egon daiteke. Izan ere, lipasa

immobilizatuak oliotan beratzen uztean, substratuaren barreiapena

euskarriaren barnean erraz daiteke. Samukawa eta lankideek (2000) ester

metilikoak sortzeko ikerlanean aurkitu zuten moduan: Novozym 435 beratzen

uzten zenean hasieran metiloleaton eta gero soja-olioan, guztira 12 ordu, ester

metilikoen ekoizpena %10-20 inguru igotzen zen. Autore hauek ematen zuten

azalpena euskarria metiloleatoz eta soja-olioz blai geratzen zela izan zen.

Chen eta Wu-k (2003) ere %6-8 inguruko igoera lortu zuten ester

metilikoen ekoizpenean, Novozym 435 oliotan eta ester metilikoetan beratzen

utzita 30 ºC-tan, hainbat denbora tartetan. Honekin lotuta, autore beraiek,

ekoizpen handiagoak lortu zituzten lipasa hainbat disolbatzailetan (hexano,

isopropanol, 2-butanol eta tert-butanol) eta soja-oliotan beratzen utzita.

Emaitzarik onenak, %20ko igoera, lipasa tert-butanolen ordubete eta gero soja-

oliotan beste ordubete beratzen utziz lortu ziren. MacKenzie eta Stevenson-ek

(2000) Novozym 435 bilgorrean utzi zuten hainbat egun 60 ºC-tan eta bere

aktibitatea igo zen bilgor-zatikapenean. Ban eta lankideek (2002) Rhizopus

oryzae-ren zelulaz kanpoko lipasa batek ez zuela ia aktibitaterik galtzen soja-

oliotan 96 ordu eta 35 ºC-tan uzten zenean aurkitu zuten.

Beste aldetik, Novozymes-ek (2005) Lipozyme TL IM-ri buruzko

liburuxka batean azaldu bezala, lipasa erabili baino lehen oliotan beratzen utzi

behar da euskarrian dauden aire-burbuilak kentzeko, era horretan lipasak bere

aktibitate osoa erakuts zezakeen.

Jokabide arraro honen ondorioz, ezin izan zen desaktibazioa eredu

matematiko bati egokitu, ezta erdibizitzarik kalkulatu. Dena den, irudietan

ikusten denez lipasak oso egonkorrak ziren.

III. Emaitzak

113

2.5. Ester metilikoen eragina egonkortasunean

Ester metilikoen eragina lipasen egonkortasunean ikertu zen, biodiesela

ekoizteko erreakzio etenetan pilatzen zirelako. Honen eragina aztertzeko

lipasak kate luzeko ester metilikoen nahasketa batean beratzen utzi ziren 30 ºC-

tan. Ikusten den bezala (29. irudia), ester metilikoen eragina ekilore-olioaren

eraginarekin alderatuz gero, hainbat datu interesgarri aurki dezakegu.

Adibidez, Lipozyme TL IM-ren kasuan aktibitatea igotzen zen hasierako 2-4

orduetan (%150) eta gero jaisten zen %100-120n geldituz. Baina, Novozym 435-

ek eta Lipozyme RM IM-k ez zuten inolako aktibitate-igoerarik jasaten. Izan ere,

bi kasu hauetan aktibitatea jaisten zen %75era Lipozyme RM IM-ren kasuan, eta

Novozym 435-enean %50 baino gutxiagora.

0

25

50

75

100

125

150

175

0 6 12 18 24

denbora (ordu)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

29. irudia. Lipasen egonkortasuna ester metilikoen nahasketa batean beratzen utzita 30 ºC-tan: Novozym® 435, Lipozyme® RM IM eta Δ Lipozyme® TL IM.

Baldintza berdinak erabiliz, baina ekilore-oliotan beratzen utzi zirenean

(28. irudia), lipasen 24 orduko hondar-aktibitateak altuagoak ziren: %140

Lipozyme TL IM-rentzat, %90 Lipozyme RM IM-rentzat eta %80 Novozym 435-

entzat. Ping Pong Bi Bi erreakzio-mekanismoa (Chulalaksananukul eta lank.,

1990) kontuan hartuz gero, erreakzio-giroan ester metilikoak daudenean azil-

III. Emaitzak

114

entzima konplexua sor zitekeen metanola askatuz eta honek entzima inaktiba

zezakeen. Entzima oliotan beratzen uzten denean, berriz, azil-entzima

konplexua sor bazitekeen ere, askatutako bitartekoak glizerido partzialak edo

glizerola izango lirateke. Lipozyme TL IM-ren kasuan, silika gelezko euskarria

duena, silika gelak askatutako metanol kopuru txikia adsorbi zezakeen eta

lipasaren aktibitatea mantenduko litzateke. Edo agian aurreko atalean azaldu

bezala, ester metilikoen nahasketa batean beratzean aire-burbuilak askatuko

lirateke eta horrexegatik hasierako orduetan aktibitatearen igoera ikusi zen.

Ban eta lankideek (2002) aurkitu zuten Rhizopus oryzae-ren zelulaz

kanpoko lipasa batek ere metiloleaton beratzean, aktibitatea oso azkar galdu

zuela, hasierako aktibitatearen %60 mantenduz 20 ordu pasata eta %10

mantenduz 96 ordu igaro eta gero.

2.6. Metanolaren eragina lipasen egonkortasunean

Metanolaren eragina lipasetan bi motatakoa izan daiteke: Alde batetik,

erreakzioaren substratua da eta kontzentrazio handietan substratu inhibizioa

gertatzen da. Bestaldetik, erreakzio giroan beste disolbatzailerik egon ezean,

metanola disolbatzaile hidrofilikoa izanik, lipasek behar duten ur-geruza bahi

dezake lipasak inaktibatuz. Metanolaren eragina egonkortasunean ikertzeko

lipasak metanolean beratzen utzi ziren hainbat denbora tartetan 30 ºC-tan.

Metanolak lipasak inaktibatzen zituen 30. irudian ikusten den bezala. Lipozyme

RM IM-k hasieratik galdu zuen bere aktibitate osoa. Lipozyme TL IM-ren

aktibitatea hasierako 30 minututan ia guztiz desagertu bazen ere, %5eko

hondar-aktibitatea gelditu zela ematen du. Novozym 435-en kasuan metanolak

denbora gehiago behar zuen lipasa inaktibatzeko, baina 60 minutu pasa eta

gero aktibitatearen %10 baino ez zen gelditu.

III. Emaitzak

115

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 30 60 90 120 150 180 210 240

denbora (min)

Ho

nd

ar-a

kti

bit

atea

(%

)

30. irudia. Lipasen egonkortasuna metanolean beratzen utzita 30 ºC-tan: Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM.

Disolbatzaileak eta orokorrean konposatu likidoen polaritatea neurtzeko

erabiltzen den neurri bat log P partizio koefizientea da, P balorea

konposatuaren 1-oktanolaren eta uraren arteko partizio koefizientea izanik.

Erreakzio giroa soilik substratuek eta produktuek eratzen dutenean, fase

organikoaren log P-a substratuek eta produktuek beraiek ezartzen dute.

Goldberg eta lankideek (1990) eta Pirozzi eta Greco-k (2004) adierazi zutenez,

disolbatzailerik gabeko erreakzio-giroko log P-a substratuen polaritatearen

araberakoa da (e.b. metanola eta triglizeridoena erreakzioaren hasieran eta

bitartekoena erreakzioak aurrera egin ahala). Erreakzioaren konposatu

bakoitzaren polaritateak lipasaren eta fase likidoaren arteko uraren banaketa

alda dezake eta honek entzimaren aktibitatea alda dezake ere. Horregatik, eta

metanolak eragindako substratu-inhibizioagatik, esterifikazio esperimentuak

egitean guztiz garrantzitsua da metanolaren kontzentrazioaren kontrol zehatza

izatea.

III. Emaitzak

117

HONDAKIN KOIPETSUEN TRATAMENDUAK

1. HONDAR-GANTZEN ETA OLIOEN HIDROLISIA

Hidrolisi-erreakzioen hainbat baldintza ikertu ziren bi motatako

hondakin koipetsuen ahalik eta hidrolisi altuena lortzeko. Lehenik animalia-

gantzen hidrolisia ikertu zen eta ondoren erabilitako landare-olioena. Kasu

guztietan gutxienez %95eko hidrolisia lortu nahi zen ahalik eta entzima gutxien

erabilita. Gutxieneko hidrolisi-maila altua lortu behar da, bestela gantz-azido

askeen arazketa beharrezkoa litzateke.

Aurreko ataleko emaitzak eta prozesuaren erabilera industriala izan

daitekeela kontuan harturik, hurrengo hasierako baldintza orokorrak ezarri

ziren abiapuntu bezala:

Erreakzio tenperatura epelak, giro-tenperaturatik gertu eta 40 ºC baino

baxuagoak, kostu energetikoak gutxitzeko eta entzimaren desnaturalizazioa

saihesteko.

Fase urtsua indargetu gabe, udal-sareko ura erabiliz kostuak gutxitzeko.

Erreakzio denbora 48 ordu baino laburragoa, prozesua era industrialean

garatzeko.

Koipe:ura proportzio altua, koipeen kantitaterik handiena tratatu ahal

izateko eta fase urtsuan glizerolaren kontzentrazio altua lortzeko.

Ahalik eta entzima gutxien koipe gramoko, kostuak gutxitzeko. Izan ere,

entzimen prezioa altua izan daiteke.

III. Emaitzak

118

1.1. Animalia-gantzen hidrolisia

Lipasa guztien karakterizazioa egin eta gero, OF lipasa aukeratu zen

ikerlan honen erreakzio-baldintzetarako egokiena izan zitekeelakoan.

Animalia-gantzen hidrolisirako aztertu ziren baldintzak hurrengoak izan ziren:

- Gantza:ura proportzioa (p:b).

- Erreakzio-tenperatura (ºC).

- Gehitutako lipasa (U lipasa/g substratu).

- Erreakzio-denbora.

1.1.1 Gantza:ura proportzioaren eragina

Hau ikertzeko hainbat gantza:ura proportziorekin (10:90, 25:75, 50:50,

60:40, 75:25; p:b) egindako emultsioen hidrolisi-maila neurtu zen, erreakzioen

gainontzeko baldintzak honako hauek izan zirelarik: OF lipasaren 360 U/g

gantz (gure laborategian neurtutako unitateak, Meito Sangyo-k bidalitako

entseguaren araberakoak), 37 ºC eta 360 rpm-ko irabiaketa. Emaitzak 16. taulan

biltzen dira. Ikus daitekeenez, erreakzioaren hasierako orduetan gantza:ura

proportzioa igo ahala hidrolisia igo zen 50:50 proportziora heldu arte, hortik

aurrera hasierako hidrolisia ez zen hain altua izan gainontzeko baldintzak

finkoak mantendu arren. Proportzio hau erabiliz 7 ordutan %90 baino

gehiagoko hidrolisi-maila lor zitekeen eta 24 ordutan %97koa. Proportzio

altuagoekin, 60:40 eta 75:25, lortutako emaitzak ere aipatzekoak izan ziren, 24

ordu pasa ondoren, %96ko eta %94ko hidrolisi-mailak lortu baitziren, hurrenez

hurren. Gantzaren proportzio txikiagoekin (10:90 eta 25:75) hasierako erreakzio-

orduetan hidrolisi-maila baxuagoak lortu arren, %55 inguru, 24 ordu pasa eta

gero, proportzio handiagoekin lortutako emaitzen antzekoak ziren, %95 eta

%97, hurrenez hurren. Honen arrazoia gantzaren proportzio handiagoekin

(>25:75) eratutako emultsioa egonkorragoa zela izan daiteke, emultsio-mota

III. Emaitzak

119

solidoa eratuz eta hain egonkorra izanik, non irabiaketa ez baitzen beharrezkoa.

Erreakzio hauetan erabilitako irabiaketa, 360 rpm, nahikoa zen nahasketa

homogeneoak lortzeko eta mantentzeko gantzaren proportzio guztiekin. Albasi

eta lankideek (1999) ekilore-olioaren hidrolisia ikertu zuten eta irabiaketaren

eragina, 200-600 rpm, aztertu zuten. Irabiaketa-abiadura handitu ahala,

emultsio finagoa, ukipen-azal handiagoa eta hasierako abiadura handiagoa

lortzen zen. Hala ere, erreakzioa gelditu zutenean (150 min) lortutako hidrolisi-

mailak antzekoak izan ziren irabiaketa guztiekin, %80-90 tartean, hain zuzen

ere. Irabiaketa-abiadura 600 rpm baino gehiagokoa zenean, 150 minutu pasa eta

gero lortutako hidrolisi-maila %70 izan zen. Irabiaketa handiak zizaila-efektua

eta zurrunbiloak handi zitzakeen, horren ondorioz entzimaren egonkortasuna

gutxituz.

16. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) erabilitako gantza:ura proportzioaren arabera.

Denbora

(ordu)

Gantza:ura (p:b)

10:90 25:75 50:50 60:40 75:25

2 54.89.1 58.32.7 82.70.6 73.11.6 71.61.6

4 -- 68.50.5 88.32.1 -- 83.70.9

7 69.53.9 -- 92.20.6 90.81.6 90.10.0

24 95.12.5 97.20.4 96.70.4 96.00.2 93.80.4

48 --** 97.60.3 97.80.2 96.20.5 93.90.2

Erreakzio-baldintzak: Lipasa OF 360 U/g gantz, 37 ºC, 360 rpm eta bolumen osoa 0.5 L.

* Non %, mol GAA/100 mol GAT baita. ** Datu hau ezin izan zen hartu, 24 orduko erreakzioa eta gero erreakzio-nahasketa ez baitzen homogeneoa, faseak bereizi ziren eta.

Hasierako bi orduetan lortutako hidrolisi-maila gantza:ura proportzioa

igo ahala igo zen 50:50 (p:b) proportziora heldu arte, hortik aurrera gutxitu

zen. Honek interfasearen eta emultsioaren ezaugarrien aldaketaren eragina

edota gantzaren kontzentrazio handiak eragindako substratu inhibizioaren

eragina adieraz zezakeen. Albasi eta lankideek (1997) olio uretan emultsioen

ezaugarriak aztertu zituzten. Autore hauen arabera olioa %60 baino gehiagoko

III. Emaitzak

120

pisu-portzentajean zegoenean fase-inbertsioa gertatzen zen, hau da, olio uretan

emultsioa izatetik ura oliotan emultsioa izatera pasatu zen, C. rugosa-ren

aktibitatea baldintza hauetan gutxituz. Al-Zuhair eta lankideek (2003) ere fase-

inbertsioa kontzeptua aipatu zuten, nahiz eta kasu honetan palma-olioa

erabiliz, fase inbertsioa %43 baino proportzio handiagoekin gertatuz. Autore

hauen arabera, fase-inbertsioa gertatzean entzimaren dispertsioa interfasean

murrizten da, entzima ur-tantatxoetan helduta baitago.

Kontuan hartzeko beste gauza bat gehitutako lipasa-unitateak gantz

gramoko kalkulatzen direla da. Beraz, substratu kontzentrazio baxuko

emultsioetan entzimaren kontzentrazioa fase urtsuan txikiagoa da eta honek

bere kokapena interfasean zail zezakeen. Era berean, fase urtsuaren bolumena

gutxitzeak interfase-azal txikiagoa eta entzima substratura iristeko traba

gehiago sor zitzakeen. Honez gain, gantzaren proportzioa igotzean eta urarena

jaistean, alderantzizko erreakzioa (pilatutako glizerolaren eta gantz-azido

askeen arteko esterifikazioa) eman daiteke (Iwai eta Tsujisaka, 1984), hidrolisi

erreakzioaren etekina jaitsiaraziz.

Gainontzeko erreakzio-baldintzak aztertzeko 50:50 (p:b) proportzio

finkoa erabiltzea erabaki zen, ikerlan honetan hidrolisi-mailarik altuenak

denbora laburrean eman zuelako eta jangarriak ziren zenbait animalia-gantzen

(de Renobales eta lank., 1992; Virto eta lank., 1991 y 1994) eta ekilore-olioaren

(Albasi eta lank., 1997; 1999) hidrolisi-erreakzioen ikerlanetan ere egokitzat

eman zutelako.

1.1.2. Tenperaturaren eragina

OF lipasaren erreakzio-tenperatura optimoa 35-40 ºC tartean dago,

“Lipasen karakterizazioa” atalean (71. orr.) azaldu bezala. Prozesua industrian

erabiltzekotan erreakzio-giroa berotzearen kostua kontuan hartu beharko

litzateke. Horregatik, oso interesgarria da erreakzioak giro-tenperaturan (25 ºC-

III. Emaitzak

121

tan) egiteko aukera izatea. Horregatik, animalia-gantzen hidrolisi-erreakzioak

25 eta 37 ºC-tan egin ziren, tenperatura optimoan eta giro tenperaturan

egindako erreakzioen emaitzak alderatzeko. Erreakzioaren hasieran hidrolisi-

mailak altuagoak ziren 37 ºC-tan, baina lortutako hidrolisi-mailarik altuena

antzekoa zen bi tenperaturatan (%95-97 inguru), 360 U/g gantz erabiliz 24

ordutan eta 180 U/g gantz erabiliz 48 ordutan (31. irudia).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48

denbora (ordu)

Hid

roli

si-m

aila

(%

)

31. irudia. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) tenperaturaren arabera: 25 ºC eta 180 U/g gantz, Δ 25 ºC eta 360 U/g gantz, 37 ºC eta 180 U/g gantz, 37 ºC eta 360 U/g gantz; 50:50 gantz:ur

(p:b) eta 360 rpm. * Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.

Tenperatura baxuenean (25 ºC-tan) emultsioa solidoa, homogeneoa eta

egonkorra zen eta, behin emultsioa eratu, ez zen irabiaketarik behar. Lortutako

hidrolisi-mailen arabera ez du ematen irabiaketak eragin handirik duenik

bukaerako hidrolisi-mailetan. Hasierako abiaduran, berriz, eragina handia izan

dezake entzimaren, substratuen eta produktuen barreiapen motelagoa ematen

baita erreakzio-nahasketan. De Renobales eta lankideek (1992) animalia-gantz

komertzialen hidrolisia ikertu zuten gantzen fusio-puntua baino baxuagoko

tenperaturetan. Horretarako irabiatuz emultsio solidoak eratu zituzten eta

III. Emaitzak

122

ondoren erreakzio-nahasketa erreakzio-tenperaturan uzten zuten irabiatu gabe.

Autore hauek ikerlan honetan lortutako antzeko emaitzak lortu zituzten, %94ko

hidrolisi-maila idi-bilgorra erabiliz eta %97ko hidrolisi-maila txerri-gantza

erabiliz, OF lipasaren 180 U/g gehituz erreakzioa 30 ºC-tan eginez eta

ura:gantza proportzioa 50:50 (b:p) izanik, 24 orduko erreakzioan.

Ondorengo erreakzioak 37 ºC-tan egitea eta erreakzio-denbora 24

orduetara murriztea erabaki zen.

1.1.3. Gehitutako lipasaren eragina

Animalia-gantzen hidrolisirako gehitutako OF lipasaren kantitateak 90-

720 U/g gantz tartean egon ziren (17. taula). Lipasaren kantitaterik txikiena (90

U/g gantz) erabiliz %80ko hidrolisia baino ez zen lortu, nahiz eta 48 orduz utzi

erreakzionatzen. Substratu hau guztiz hidrolizatzeko behintzat 180 U/g gantz

behar ziren. Izan ere, 24 orduetarako %94ko hidrolisi-maila lortu zen. Lipasaren

kantitate handiagoa erabiltzean antzeko hidrolisi-mailak lor zitezkeen denbora

laburragoetan, adibidez, %95-96ko hidrolisia 6 ordutan, 540 edo 720 U/g gantz

erabiliz.

17. taula. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) gehitutako lipasa-unitateen arabera.

Denbora

(ordu)

Gehitutako OF lipasaren unitateak (U/g gantz)

90 180 360 540 720

2 40.1±1.0 50.0±1.2 82.7±0.6 86.8±1.2 90.0±0.3

6 56.8±0.9 79.1±1.3 92.2±0.6 94.9±0.15 96.4±0.2

24 65.2±1.1 94.1±0.3 95.6±0.7 96.7±0.3 97.5±0.4

Erreakzio-baldintzak: gantza:ura proportzioa 50:50 (p:b), 37 ºC, 360 rpm eta bolumen osoa 0.5 L.

* Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.

De Renobales eta lankideek (1992) %97 eta 94ko hidrolisi-mailak lortu

zituzten txerri-gantza jangarrirako eta idi-bilgor industrialerako, hurrenez

III. Emaitzak

123

hurren, OF lipasaren 180 U/g gantz erabiliz, 24 orduko erreakzioetan, gantz:

ura proportzioa 50:50 (p:b) eta 30 ºC-tan. Lipasa gehiago gehituta (360 U/g

gantz) hasierako orduetan hidrolisi-maila altuagoak lortu zituzten, baina 24

orduko erreakzioetan antzeko emaitzak lortu zituzten lipasaren bi kantitateak

erabilita. Ikerlan honetan erabilitako hondakin koipetsuak ez zirela hain

araztuak kontuan hartuta, antzeko emaitzen aurrean gaudela pentsa dezakegu.

Aurreneko bi orduetan hidrolisi maila igo egiten da entzimaren

kantitatea igo ahala. Albasi eta lankideek (1997) gehitutako OF lipasaren

eragina ekilore-olioaren hidrolisian ikertu zuten. Autore hauen arabera,

erreakzioaren hasierako abiadura entzimaren kontzentrazioarekin

proportzionala izateak, interfasean adsortzio-egoera egonkorra islatzen du,

asetasunera iritsi gabe. Kontzentrazio altuetan, aldiz, oreka lortzen da,

interfasea asetu egiten da, fase urtsuan dagoen gehiegizko entzima ezin da

interfasean kokatu eta ezin du erreakzioa katalizatu. Beraz, gehiegizko entzima

horrek ez du hidrolisi-maila handituko. Autore hauek asetasun-

kontzentrazioak kalkulatu zituzten hainbat olio-frakziotarako. Hala nola, %20,

35 eta 50 frakzioetarako 1000, 750 eta 500 U/g, hurrenez hurren. Dirudienez,

fase urtsu gehiago egotean entzima gehiago adsorbi daiteke. Gure kasuan eta

nahiz eta erreakzioen hasierako abiadura neurtu ez, gehitutako 360 U/g-tara

arte aurreneko bi orduetan hidrolisi-maila handitzen zela ikus daiteke. Hortik

aurrera, nahiz eta lipasa-unitate gehiago erabili, handitze hori ez da hain

nabarmena. Beraz, OF lipasaren 360 U/g baino gehiago gehitzeak ez zuen

hidrolisi-maila era nabarian hobetzen erreakzioaren lehenengo bi orduetan.

Emaitzak kontuan izanda eta erreakzio-denbora 48 ordu baino

laburragoa izan behar zela kontuan hartuta, lipasaren kantitaterik egokiena

gutxienez %95eko hidrolisi-maila lortzeko 180 U/g gantz izan zitekeela erabaki

zen.

III. Emaitzak

124

1.1.4. Saio erdi-pilotoa.

Aurreko ataletan lortutako emaitzak kontuan harturik, eskala

handiagoko hidrolisia aurrera eramateko hurrengo baldintzak egokiak izan

zitezkeela pentsatu zen: gantza:ura proportzioa 50:50 (p:b), OF lipasaren

180 U/g gantz, 25-37 ºC tarteko tenperatura eta emultsioa mantentzeko nahikoa

zen irabiaketa.

Gantzaren hidrolisia Inasmet Fundazioak duen 40 L-ko, palazko

irabiagailua zuen tanga-erreaktore batean egin zen. Azkenean bertan

erreakziorako aukeratutako baldintzak honako hauek izan ziren: 32 ºC, OF

lipasaren 180 U/g gantz, gantza:ura proportzioa 50:50 (p:b) eta 355 rpm-ko

irabiaketa, nahikoa zena emultsio homogeneoa mantentzeko. Kontuan hartu

behar da irabiaketa ez zela laborategiko erreaktoreen guztiz bezalakoa. Palazko

irabiagailua zuen 40 L-ko erreaktoreak eta laborategikoek, berriz, helizezkoak,

“Material eta Metodoak” atalean (48. eta 50. orr.) agertzen diren argazkietan

ikus daitekeen bezala. Hori dela eta, eratutako emultsioaren ezaugarriak ere

ezberdinak izan zitezkeen.

Ikus daitekeenez (18. taula), lortutako emaitzak laborategian lortutakoen

antza handia dute eta hobetu ere egin zituzten. Izan ere, laborategian 37 ºC-tan

eta 180 U/g gantz erabiliz %94 eta 95eko hidrolisia lortu zen 24 eta 48 ordutan,

hurrenez hurren. Berrogei litroko erreaktorean, aldiz, 7 ordutarako %94 eta 21.5

ordutarako %97ko hidrolisia lortu zen. Honen arrazoia irabiaketa-mota izan

daiteke. Izan ere, 40 L-ko erreaktorearen irabiagailuak emultsio finagoa sor

zezakeen, interfasean azalera handiagoa sortuz eta lipasak hobeto helduz

substratuari eta substratuaren eta entzimaren elkartrukatzea erraztuz. Honen

guztiaren ondorioz erreakzio-abiadura handiagoa litzateke.

III. Emaitzak

125

18. taula. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) 40 L-ko erreaktorea erabiliz.

Denbora (ordu) Hidrolisi-maila (%)

0 24.90.2

3 86.80.2

7 93.80.1

21.5 96.90.1

24 96.90.1

28 96.80.0

48 97.20.1

Erreakzio-baldintzak: OF lipasaren 180 U/g gantz eta gantz:ura proportzioa 50:50 (p:b), irabiaketa 355 rpm, 32º C. Erreaktorearen lau gune ezberdinetatik hartutako

laginak denbora bakoitzeko. * Non %, mol GAA/100

mol GAT baita.

De Renobales eta lankideek (1992) 30 L-ko erreaktore batean egindako

erreakzioetan %98ko hidrolisia lortu zuten 24 ordutan txerri-gantza substratu

moduan erabiliz 30 ºC-tan OF lipasaren 180 U/g gantz gehituz, ikerlan honetan

lortutakoarekin bat datorrena. Albasi eta lankideek (1999) ekilore-olioaren

hidrolisia ikertzen zutelarik, erreakzioa eskala handiagoan errepikatzean

erreaktorearen geometria mantenduz gero, lortutako hidrolisi-mailak

mantenduko liratekeelako hipotesia eratu zuten.

1.1.5. Glizerolaren determinazioa ur-fasean

Glizerola oso interes handiko produktua da industria kimikoan (Young

eta lank., 1994) eta bere berreskurapena oso garrantzitsua da erreakzioaren

ikuspuntu ekonomikotik. Oro har, glizerolaren disoluzioak %95-98 inguruko

kontzentrazioa lortu arte kontzentratzen dira. Gantzaren hidrolisi

entzimatikoak Colgate-Emery metodoak baino albo-produktu gutxiago sortzen

duenez, hidrolisi entzimatikoa eginez glizerolaren berreskurapena errazagoa

III. Emaitzak

126

eta merkeagoa da. Honez gain, glizerolaren disoluzioa nahiko gardena zen,

nahiz eta animalia-gantza marroi-iluna zen, Colgate-Emery metodoak, berriz,

disoluzio ilun koloreduna sortzen du.

Lipasen bidezko hidrolisian sortutako glizerola neurtu zen %97ko

hidrolisirako glizerolaren kontzentrazioa fase urtsuan %12 ingurukoa

(120±4.5 g/L) izan zen. Emaitza hauek kalkulu teorikoekin bat datoz, formula

estekiometrikotik kalkula daitekeen moduan. Erreakzioa 250 g gantz edo olio

eta 250 mL ur nahastuz eginez gero, 0.29 mol TG (gantz) izango genuke.

Gantzaren %97 hidrolizatzen bada, 0.2853 mol glizerol lortuko lirateke, hau da,

26.25 g glizerol fase urtsuan (250 mL) disolbatuta egongo zirenak. Beraz,

glizerolaren kontzentrazioa 104.99 g/L litzateke. Glizerola neurtzeko metodo

entzimatikoak hainbat motatako laginen (ardoak, xaboiak…) glizerolaren

kontzentrazio baxuak neur dezake. Kasu honetan, fase urtsuko glizerola nahiko

kontzentratuta zegoen (>100 g/L) eta lagina diluitu behar izan zen (1/1000)

bere kuantifikaziorako (Boehringer-Mannheim, 1999), espero zenaren eta

emaitzaren arteko aldea azal zezakeena.

1.2. Erabilitako landare-olioen hidrolisia

Erabilitako landare-olioen hidrolisi-erreakzioak egiteko 50:50 (p:b)

olio:ura proportzioa erabili zen, animalia-gantzen hidrolisian emaitzarik

onenak lortu baitziren. Honez gain, hainbat autorek %40-60ko olio-

kontzentrazioen emultsioetan fase-inbertsioa aurkitu zuten (Albasi eta lank.,

1997; Al-Zuhair eta lank., 2003). Hau da, olio uretan emultsioa izatetik, ura

oliotan izatera pasatzen da. Egoera honetan, entzima ur-tantatxoetan helduta

dago eta lipasen aktibitatea gutxitu egiten da. Beraz, ikertu beharreko

baldintzak gehitutako OF lipasaren kantitatea eta erreakzio-tenperatura izan

ziren.

III. Emaitzak

127

1.2.1. Gehitutako lipasaren eragina

A olioaren hidrolisirako OF lipasaren 72-360 U/g olio erabili ziren.

Lipasaren kantitate txikienarekin lortutako hidrolisi-maila nabarmen gutxitu

zen (32a. irudia). B olioaren hidrolisirako gehitutako lipasaren kantitatea 36

U/g olio arte gutxitu zen, 24 ordutan %94ko hidrolisi-maila lortuz. Lipasaren 72

U/g olio erabiliz, berriz, %96ko hidrolisi-maila lortu zen. Beraz, A olioarekin

lortutako hidrolisi-mailekin alderatuz gero, B olioa erabiliz hidrolisi-maila

altuagoak lortzen zirela lipasa gutxiago gehituz ikus daiteke (32b. irudia).

Emaitza hauetan olioen ezaugarrien eragina nabari daiteke, hala nola,

konposaketa gantz-azidotan (A olioak B olioak baino gantz-azido aseen

kantitate bikoitza baitzuen), gutxiengo konposatuen eragina (konposatu

polarrak eta), eta abar. Erabilitako landare-olioen hidrolisia animalia-gantzen

hidrolisiarekin alderatuz gero, argi dago hidrolisi-maila berdinak lortzeko

lipasa gutxiago behar dela (17. taula, 122. orr.). Honen arrazoia OF lipasak

gantz-azido asegabeak, gantz-azido aseak baino errazago askatzen dituelako

izan daiteke (Ikusi “Lipasen karakterizazioa”, 86. orr.). Emaitza hauek

substratu-ereduen (txerri-gantza eta hazi-olioa) hidrolisian aurkitutakoekin bat

datoz. Hainbat autorek C. rugosa-ren lipasak azido oleikoarekiko eta cis-9 lotura

bikoitza duten beste gantz-azido batzuekiko nolabaiteko espezifizitatea duela

aurkitu dute (Sonnet, 1988; Virto eta lank., 1994), oliba-olioa entzima

honetarako substraturik egokiena izanik.

Honez gain, A olioaren hidrolisiaren erreakzioa eten eta gero, behin fase

urtsua eta fase koipetsua bereiztuta, hidrolizatutako laginak solidoak ziren

giro-tenperaturan. Erreakzioan zehar ere, biskositatearen gehikuntza nabaritu

zen hidrolisi-maila handitu ahala (%80ko hidrolisi-maila gainditu eta gero

agertzen zen fenomeno hau). Hoshino eta lankideek (1990) ere laginen

solidifikazioa nabaritu zuten kontzentratutako PUFA lortzeko Aspergillus niger-

en lipasa batek katalizatutako bakailao-gibelaren olioaren hidrolisian, hidrolisi-

maila %60 ingurura iristen zenean. Autore hauek fenomeno honi eman zioten

III. Emaitzak

128

0102030405060708090

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Hid

roli

si-m

aila

(%

)

0102030405060708090

100

0 4 8 12 16 20 24

denbora (ordu)

Hid

roli

si-m

aila

(%

)

32. irudia. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) A (a) eta B (b) erabilitako landare-olioen hidrolisian gehitutako OF lipasaren unitateen (U/g olio) arabera: ∆ 36, 54, ◊ 72, 90, x 180, o 360 eta

720; 50:50 (p:b) olio:ura, 25 ºC eta 360 rpm. * Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.

azalpena askatutako gantz-azido aseen lehentasunezko kristalizazioa gertatzen

zela izan zen. Izan ere, bakailao-gibelaren olioaren konposaketa gantz-azidotan

nahiko berezia da eta konposaketa gehiengoduna gantz-azido monoasegabe eta

poliasegabeek osatzen badute ere, gantz-azido aseen portzentaje aipagarriak ere

izan dezake, %21 inguru, Padley eta lankideen (1994) arabera. Honez gain,

hidrolisian zehar erreakzio-produktuen nahasketa (GAA; MG; DG; TG)

a)

b)

III. Emaitzak

129

portzentaje ezberdinetan sor zitekeen, fase eta fusio-puntu ezberdinetako

nahasketak sortuz (Larsson eta Quinn, 1994).

Erreakzioaren lehen orduan lortutako hidrolisi-maila eta bi olioei

gehitutako lipasaren kantitatea aztertuz gero, lipasaren kantitatea handitu ahala

hidrolisi-maila era berean handitzen zela ikus daiteke 100 U/g olio gehitu arte,

hortik aurrera gantz-azido askeen gehikuntza ez zen gehitutako lipasa-

unitatekiko proportzionala. Honek, lehen animalia-gantzen hidrolisian azaldu

bezala, interfasea entzimaz asetuta zegoela adieraz zezakeen. Honen ondorioz,

100 U/g olio baino gehiagoko entzima gehiegizkoa izango litzateke, ezin izango

lukeelako hidrolisi-maila era proportzionalean handitu, ez lukeelako

interfasean kokatzerik izango (Albasi eta lank., 1997). Kasu honetan interfasea

animalia-gantzen kasuan baino entzima gutxiagorekin asetuko litzateke. Yan

eta lankideek (2001) ere antzeko egoera bat aurkitu zuten OF lipasak

katalizatutako tuna-olioaren hidrolisian. Autore hauek OF lipasaren 360 U/g

olio baino gehiago gehitzean hidrolisi-maila ez zela handitu aurkitu zuten,

orekara iritsi baizik. Autore hauetaz gain, Noor eta lankideek (2003) SP 398

lipasak katalizatutako palma-olioaren hidrolisian eta Al-Zuhair eta lankideek

(2003) C. rugosa-ren lipasa batek katalizatutako palma-olioaren hidrolisian

gauza bera aurkitu zuten.

Olioak hidrolizatzeko animalia-gantzak hidrolizatzeko baino lipasa

gutxiago behar zela kontuan izanik, tenperaturaren eragina aztertzeko

lipasaren 90 U/g olio erabiltzea erabaki zen, bi olioen hidrolisirako egokia

baitzen 24 ordu edo gutxiago erabili behar izanik.

1.2.2. Tenperaturaren eragina

Tenperaturaren eragina aztertzeko hurrengo tenperaturak erabili ziren:

25, 30, 35 eta 40 ºC, A olioaren hidrolisia tenperatura guztietan aztertu zelarik

eta B olioa bakarrik 25 eta 30 ºC-tan. Hidrolisi-mailarik altuenak tenperatura

III. Emaitzak

130

baxuetan lortu ziren (25 eta 30 ºC, 19. taula), tenperatura horietan emultsioak

egonkorragoak zirelako segur aski. Tenperatura altuagoetan (>30 ºC) lan

egiteko, irabiaketa handitu behar zen (420 rpm) emultsioa homogeneoa

mantentzeko. Honez gain, lehen azaldu bezala, A olioaren emultsioa, behin

%80 inguruko hidrolisi-maila lortuta, partzialki solidifikatzen zen eta irabiaketa

arazoak agertzen ziren.

19. taula. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) tenperaturaren arabera A eta B olioak erabilita.

Denbora (ordu) Olioa

T

(ºC) 1 2 3 5 8 24 48

25 43.1±1.8 -- 70.6±1.9 81.8±1.8 -- 94.8±1.9 95.1±1.6

30 46.4±2.5 -- 74.7±0.6 83.7±0.3 -- 92.7±0.6 91.2±2.5

35 46.3±0.9 -- 74.1±0.5 82.6±1.0 -- 90.3±1.0 87.3±1.2 A

40 49.4±2.5 -- 73.3±0.2 80.2±0.4 -- 87.4±0.4 80.9±0.9

25 -- 33.9±3.5 -- -- 78.5±0.5 94.4±0.6 93.8±0.4 B

30 -- 51.7±3.1 -- -- 88.3±0.3 94.2±0.6 91.6±2.4

Erreakzio-baldintzak: A olioaren hidrolisirako: OF lipasaren 90 U/ g olio, 50:50 (p:b) olio:ur eta 360 rpm-ko irabiaketa, 30 eta 40 ºC erabilita 420 rpm-ko irabiaketa; B olioaren hidrolisirako: OF lipasaren

54 U/ g olio, 50:50 (p:b) olio:ur eta 360 rpm-ko irabiaketa. * Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.

Lehen esan bezala, A olioa hidrolizatzeko OF lipasaren 90 U/g olio

erabili ziren, B olioa hidrolizatzeko, berriz, 54 U/g olio besterik ez ziren erabili.

Bi olioen hidrolisiaren hasierako hidrolisi-maila altuagoa zen 30 ºC 25 ºC-tan

baino. Baina, erreakzio-denbora luzatzean erreakzioa moteldu zen eta honen

ondorioz, antzeko emaitzak lortu ziren 24 orduko erreakzioetan. Tenperatura

altuagoetan (>35 ºC) A olioaren hidrolisiaren errebertsioa ikus daiteke, 48

ordutan 24 ordutan baino hidrolisi-maila txikiagoak lortuz. Honen arrazoia

gantz-azido askeen kontzentrazioa handitzean alderantzizko erreakzioa,

esterifikazioa, alegia, hobestu zelako izan daiteke (Iwai eta Tsujisaka, 1984)

prestakin entzimatikoan isozima bat baino gehiago egon daitezkeenez (Rúa eta

lank., 1993), horietariko bat esterifikaziorako espezifikoagoa izan daitekeelako.

III. Emaitzak

131

1.2.3. Saio erdi-pilotoa

Erabilitako olioen hidrolisirako egokiak izan zitezkeen baldintzak behin

aztertuta, olioak aingurazko irabiagailua duen 5 L-ko tanga-erreaktorean

hidrolizatzea erabaki zen (6. irudia, 50. orr.). Erreakzioak A eta B olioekin egin

ziren, 25 ºC-tan, olio:ura 50:50 (p:b) proportzioa erabilita eta OF lipasaren

90 U/g olio gehituta. Emaitzak 33. irudian ikus daitezke. Erreaktore

txikiagoetan (500 mL-ko erreaktoretan) lortutako emaitzak lortu ziren, 24

ordutan %95eko hidrolisia lortuz. Hala ere, bi olioen hidrolisi-maila lehenengo

orduetan antzekoa bazen ere, A olioa hidrolizatu ahala erreakzio nahasketen

biskositatea handitu zen eta honek irabiatzeko arazoak sortu zituen. Honen

ondorioz, A olioaren hidrolisi-maila B olioarena baino txikiagoa izan zen

denboran zehar 0.5 L-ko erreakzioetan gertatu bezala.

0102030405060708090

100

0 3 6 9 12 15 18 21 24

denbora (ordu)

Hid

roli

si-m

aila

(%

)

33. irudia. Lortutako hidrolisi-maila (%*) 5 L-ko tanga-erreaktorea eta A eta ∆ B olioak erabiliz. Erreakzio-baldintzak: OF lipasaren 90 U/g olio, 25 º C, 50:50 (p:b) olio:ur, irabiaketa

360 rpm. * Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.

Beraz, baldintzarik egokienak erabilitako olioen hidrolisirako honako

hauek izan zitezkeen: 50:50 (p:b) olio:ura proportzioa, 25 ºC, OF lipasaren

III. Emaitzak

132

90 U/g olio eta 360 rpm-ko irabiaketa, nahiz eta olio batzuekin, euren

ezaugarrien arabera, gehitutako lipasaren kantitatea jaitsi daitekeen, B

olioarekin gertatu bezala.

III. Emaitzak

133

2. ESTER METILIKOEN SINTESIA

Sarreran esan bezala, erabilitako landare-olioak biodieselaren

ekoizpenerako erabiltzeak interes handia sortu du, batez ere ingurumenarekin

lotutako onurak direla eta. Horrez gain, biodiesela entzimen bidez sortzeko

aukera are interesgarriagoa izan daiteke, lehen (“Sarrera” atalean, 17. orr.)

aipatutako ingurumenarekiko abantailak direla eta. Ester metilikoak

(biodiesela) sortzeko hainbat bide egon daitezke, ikerlan honetan erabilitakoak

34. irudian biltzen direnak izanik:

34. irudia. Ester metilikoak lipasen bidez ekoizteko erabilitako erreakzioak: a) Olioaren transesterifikazioa, b) Olio hidrolisatuaren (gantz-azido askeen) esterifikazioa. R’=CH3, R=gantz-azido hondarrak.

Erreakzioak disolbatzaile organikoak erabili gabe egin ziren, gero

prozesua industrian erabiltzeko aukera balego, ez bailitzateke gomendagarria

izango euren erabilera. Izan ere, disolbatzaile organikoak desabantaila ugari

dituzte: garestiak eta sukoiak izateaz gain, segurtasun neurriak betetzeak eta

bukaerako produktutik desagerrarazteak prozesua garestitzen baitute (Linko

eta lank., 1995; Dossat eta lank., 2002).

III. Emaitzak

134

2.1. Erreakzio etenak

Etenean egindako erreakzioak nola egin ziren “Material eta Metodoak”

atalean (51. orr.) azaltzen da. Erabilitako lipasek aktibitaterik handiena 50-

60 ºC–tako tartean bazuten ere (Ikusi “Lipasen karakterizazioa”, 98. orr.),

erreakzioak 30º C-tan egin ziren metanolaren lurrunketa saihesteko eta energia

gastua gutxitzeko.

Erreakzio bakoitzean prestakin entzimatiko bakoitzaren erabilitako

lipasa-unitateak berdindu nahi ziren, lipasen arteko emaitzak alderatu ahal

izateko, eta kasu bakoitzean gehitu behar zen entzimen kantitatea kalkulatzeko

euren esterifikazio aktibitateaz (PLU/g-z) baliatu ginen. Gehitutako lipasa-

unitateen eta gehitutako lipasa kantitateen (g lipasa/100 g olio) arteko

harremana 20. taulan ikus daiteke. Argi gelditzen denez, oso ezberdinak dira

gehitu behar diren lipasa bakoitzaren kantitateak, oso ezberdinak baitira

lipasen aktibitateak (PLU/g).

20. taula. Gehitutako lipasa-unitateen eta lipasa-kantitateen (g lipasa/100 g olio) arteko harremana.

Gehitutako lipasa (%, g lipasa/100 g olio)

Gehitutako lipasa-unitateak*

Novozym 435 Lipozyme RM IM Lipozyme TL IM

120 0.4 0.75 2.40

300 1 1.88 6.02

600 2 3.76 12.04

900** 3 5.65 18.06

1200 4 7.53 24.08

* Prestakin entzimatikoen batez besteko aktibitatea (PLU/g): Novozym 435 3033.9±79.7; Lipozyme RM IM 1593.7±298.1; Lipozyme TL IM 498.3±95.5 (“Lipasen karakterizazioa” 95. orr.). ** Esterifikazio erreakzioetarako bakarrik.

Bibliografian agertzen diren erreferentzietan gehitutako lipasen

kantitateak pisuaren ehunekoetan eman ohi dira. Hori dela eta, emaitzak beste

autore batzuen emaitzekin alderatzeko eta eztabaidatzeko aurreko taulan

agertzen diren lipasen ehunekoak erabiliko dira.

III. Emaitzak

135

2.1.1. Olioaren transesterifikazioa

Lipasek katalizatutako olioaren transesterifikazioa aztertzeko

erreakzioan eragina duten bi baldintza ikertu ziren: Alde batetik, metanola

gehitzeko eraren eragina eta beste aldetik, gehitutako lipasa-unitateen eragina.

2.1.1.1. Metanola gehitzeko eraren eragina

Transesterifikazio erreakzioaren estekiometria 1:3 (mol olio:mol metanol)

da. Metanolak lipasek katalizatutako esterifikazio erreakzioetan eragindako

substratu inhibizioa egiaztatu zenez (Ikus “Substratu kontzentrazioaren

eragina” atala (100. orr.)), metanolaren eragina ikertzeko 1, 2 edo 3 mol-

baliokide metanol gehitu ziren C oliora eta 24 ordu pasa eta gero, beharrezkoa

zenean, erreakzioa osatzeko falta zen metanola gehitu zen.

Erreakzioak katalizatzeko lipasa bakoitzaren 1200 PLU erabili ziren.

Erreakzioa osatzeko beharrezkoa den metanol guztia (3 mol-baliokide) batera

gehituz gero (35. irudia), soilik Lipozyme TL IM-k sor zitzakeen ester

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 3 6 9 12 15 18 21 24

denbora (ordu)

EM

(%

)

35. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (Erreakzio nahasketaren % pisuan) lipasa bakoitzaren 1200 PLU gehituta eta C olioaren eta metanolaren arteko proportzio estekiometrikoa (1:3; mol:mol) erabilita, 10 g olio, 100 oszilazio/min-ko irabiaketa eta 30 ºC. Erabilitako lipasak: Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM.

III. Emaitzak

136

metilikoen kantitate handiak ikertutako baldintzetan (%96 EM 7 ordutan eta

%98 EM 24 ordutan). Novozym 435-ekin eta Lipozyme RM IM-rekin, berriz, 24

ordutan %31 eta %20 EM baino ez ziren lortu, hurrenez hurren.

Mol-baliokide bat metanol gehituta 3 lipasek %33 EM ekoitzi zuten,

baina denbora tarte ezberdinetan (36a. irudia). Lipozyme TL IM-k eta Lipozyme

RM IM-k hasierako orduetatik ekoitz zitezkeen ester metiliko guztiak ekoitzi

zituzten. Novozym 435-k, berriz, 6-24 ordu behar izan zuen erreakzioa

osatzeko. Honez gain, 24 ordu pasa ondoren gehitutako metanolak (beste 2

mol-baliokide) eragin ezberdina izan zuen 3 lipasengan. Lipozyme TL IM-k

%95 EM ekoitzi zuen metanola gehitu eta 5 ordutara, Novozym 435-k, berriz,

%80 EM ekoitzi zuen 24 ordu pasa eta gero. Lipozyme RM IM-k emaitzarik

baxuena eman zuen. Izan ere, bigarren aldiz gehitutako metanolak lipasa

inhibitu edo inaktibatu zuela ematen du, ester metilikoen ekoizpena %49n

geldituz.

Metanola gehitzeko era aldatuz gero, hasieran 2 mol-baliokide gehituz

(36b. irudia), bakarrik Lipozyme TL IM-k eta Novozym 435-k ekoitzi zituzten

%66 EM, 3 eta 24 ordutan, hurrenez hurren. Lipozyme RM IM-k, berriz,

inhibituta zegoela ematen du, %20 EM baino ez zuen ekoitzi eta. Erreakzioa

osatzeko falta zen metanola gehitzean (beste mol-baliokide bat metanol)

Lipozyme TL IM-k eta Novozym 435-k %90 baino gehiagoko ekoizpena eman

zuten, %95 eta %91, metanola gehitu eta ordubetera eta 24 ordutara, hurrenez

hurren.

III. Emaitzak

137

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48

denbora (ordu)

EM

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48

denbora (ordu)

EM

(%

)

36. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (Erreakzio nahasketaren % pisuan) metanola zatika gehitu zenean a) 1+2 mol-baliokide metanol eta b) 2+1 mol-baliokide metanol; 10 g C olio, 30 ºC, 100 oszilazio/min. Lipasak (1200 PLU): Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM. Geziek falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.

2.1.1.2. Gehitutako lipasa-unitateen eragina

Aurreko atalean lortutako emaitzek metanola gehitzeko erak eragin

handia duela ekoitzitako ester metilikoetan egiaztatzen dute. Horrexegatik

gehitutako lipasa-unitateen eragina aztertzeko metanola kantitate txikiagotan,

mol-baliokide bat metanol 24 orduro, gehitzea eta erreakzioa hainbat lipasa-

a)

b)

III. Emaitzak

138

unitate (120, 300 eta 600 PLU) erabilita egitea erabaki zen, 37. irudian ikus

daitekeen bezala. Aztertutako lipasen 120 PLU-k ez ziren nahikoak erreakzioak

osatzeko, %30, 35 eta 55 ester metiliko besterik ez baitziren ekoitzi, Novozym

435, Lipozyme RM IM eta Lipozyme TL IM erabilita, hurrenez hurren. Lipasen

unitateak 300 PLU-tara igoz gero, ester metilikoen ekoizpena hobetu zen %45,

%50 eta 85era iritsi zirelarik, Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Lipozyme TL

IM erabilita, hurrenez hurren. Hala ere, ez ziren %95era iritsi. Ester metilikoen

%95eko ekoizpenak edo handiagoak lortzeko gutxienez 600 PLU behar ziren.

Lipasa-unitate horiek erabilita, Lipozyme TL IM-k %98, Novozym 435-ek %90

eta Lipozyme RM IM-k %75 EM ekoitzi zuten.

Novozym 435-en kasuan, nahiz eta erreakzioaren hasierako unetan

edozein kantitate erabilita ezberdintasun handirik egon ez, 300 eta 600 PLU

gehituta %33 lortu zen, baina 120 PLU gehituta %30 besterik ez zen lortu. Gero

erreakzioa osatzeko falta zen metanola (mol-baliokide bat 24 orduro) gehitzean,

120 eta 300 PLU erabilita ez zen hobekuntza handirik lortu, bakarrik %30 eta 40

EM ekoitzi baitziren, hurrenez hurren. Unitate gehiago, 600 PLU, gehituta %90

EM lortu ziren.

Lipozyme RM IM-ren kasuan, 120 PLU erabilita %35eko ekoizpena

besterik ez zen lortu eta erreakzioa bertan gelditu zen, aldaketarik izan gabe

metanol gehiago gehitu arren. Lipasa-unitate gehiago gehituta mol-baliokide

bat metanol guztiz agortu zen ekoizpen osoa lortuz, baina bigarren mol-

baliokidea gehitu eta gero 300 PLU erabilita ez zen %66ra iritsi, %50ean gelditu

zen eta azken mol-baliokidea gehitu ondoren ez zen aldaketarik ikusi. Lipasa-

unitate gehiago erabilita, 600 PLU erabilita, alegia, bigarren mol-baliokidea

gehitu ondoren ekoizpen osoa (%66) lortu zen 24 ordutan, baina azken mol-

baliokidea gehitzean erreakzioa gelditu zen, ester metiliko gehiago ekoitzi gabe.

III. Emaitzak

139

0102030405060708090

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

EM

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

EM

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

EM

(%

)

37. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (Erreakzio-nahasketaren % pisuan) gehitutako lipasa-unitateen arabera. Erreakzio-baldintzak: mol-baliokide bat metanol 24 orduro gehituta, 10 g C olio, 30 ºC eta 100 oszilazio/min. Lipasak: Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM: a) 120, b) 300 eta c) 600 PLU. Geziek falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.

a)

b)

c)

III. Emaitzak

140

Lipozyme TL IM-ren hiru kantitateak erabilita lehenengo mol-baliokidea

gehituta ahal ziren EM guztiak ekoitzi ziren (%33 inguru) 6 ordu igaro baino

lehen. Bigarren mol-baliokidea gehituta soilik 300 eta 600 PLU erabilita lortu

zen ekoizpen osoa (%66), 120 PLU erabilita %50 besterik ez zen lortu eta.

Bigarren mol-baliokidea gehitu eta gero erreakzio-abiadura moteldu zen, 300

PLU erabilita 24 ordu behar ziren erreakzioa osatzeko eta 600 PLU erabilita 3-6

ordu. Hirugarren mol-baliokidea gehituta 600 PLU behar ziren ekoizpen osoa

lortzeko, %95 3-6 orduko erreakzioan eta %98 24 orduko erreakzioan.

Emaitza hauetatik ondoriozta daitekeenez metanola gehitzeko erak

eragin handia du lortutako emaitzetan. Novozym 435 erabilita, metanola

gehitzeko erak badu eragina ekoitzitako ester metilikoetan: %90 lortu ziren 600

PLU erabilita (metanola 1+1+1 gehituta) eta %95 1200 PLU erabilita (metanola

2+1), 72 eta 48 ordutan, hurrenez hurren. Emaitza hauek zenbait autoreren

emaitzekin bat datoz. Shimada eta lankideek (1999) eta Watanabe eta lankideek

(2000) Novozym 435 (%4, g/100 g substratu) erabili zuten soja eta koltza-olioen

metanolisia katalizatzeko eta metanola 3 zatitan gehituta %95eko konbertsioa

lortu zuten. Shimada eta lankideek (1999) erabilitako Novozym 435-en

kantitatea gutxitu zuten (%2) eta antzeko emaitzak lortu zituzten, nahiz eta

erreakzioa osatzeko denbora luzatu 6 ordutatik (%4 lipasa erabilita) 24

ordutara. Autore beraiek lipasaren inaktibazioa ikusi zuten metanolaren 1.5

mol-baliokide baino gehiago batera gehitzen zirenean. Watanabe eta lankideek

(2001) antzeko emaitzak lortu zituzten erabilitako olioaren metanolisian

Novozym 435-en %4 erabiliz eta metanola hiru unetan gehituz (0, 10, eta 24

ordu), %90.4 EM lortu zutelarik.

Lipozyme RM IM-rentzat metanola gehitzeko erak izugarrizko eragina

du eta oso baliagarria izan daiteke mol-baliokide bat metanol hainbat orduro

gehitzea ester metilikoen ekoizpena hobetzeko lipasa kantitate gutxiago

erabilita. Bibliografian agertzen diren Lipozyme RM IM-ren bidez

katalizatutako metanolisi gehienetan gutxienez prestakin entzimatiko honen

III. Emaitzak

141

%10 (g lipasa/100 g substratu) erabili izan da (Nelson eta lank., 1996;

Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a/b). Bakarrik Stevenson eta lankideek (1994)

erabili zituzten entzima honen kantitate askoz txikiagoak (%1.25) bilgorraren

metanolisia ikertzean, metanola 10 zatitan gehitzen zutelarik eta %91eko

konbertsioa lortuz. Hala ere, ikerketa-lan horretan erreakzio-girora silika-gel

gehitu zen ekoitzitako glizerola euskarriari ez itsasteko, eta era horretan

substratu eta produktuen barreiapen arazoak ekiditeko.

Lipozyme TL IM-k berriz, 1200 edo 600 PLU erabiliz emaitza bera lortu

zuen (>%95 EM), metanola gehitzeko erak eragina bakarrik zuela erreakzio-

denboran. Soumanou eta Bornscheuer (2003 a/b) Lipozyme TL IM-ren %10

erabili zuten ekilore-olioaren (a) eta kotoi-olioaren (b) metanolisian, mol-

baliokide bat metanol gehituta 5 orduro, %60ko konbertsioa lortuz 30 orduko

erreakzioetan, ikerketa-lan honetan lortutako emaitzak baino askoz baxuagoak.

Xu eta lankideek (2004), berriz, soja-olioaren metanolisia Lipozyme TL IM-ren

bidez katalizatu zuten, metanola 3 zatitan gehituz eta lipasaren %4

(g lipasa/100 g substratu) erabiliz. Lehenengo bi erreakzioak guztiz osatzen

baziren ere, azken mol-baliokide metanol gehitu ondoren ester metilikoen

%98ra iristeko lipasaren %10 behar zen, gure emaitzekin bat datorrena.

Ikerlan honetan gehitutako lipasa-unitateak berdindu baziren ere,

gehitutako lipasa bakoitzaren kantitatea (ikusi 20. taula) oso ezberdina zen eta

honek transesterifikazio-erreakzioetan ikusitako ezberdintasunak azal ditzake

neurri batean. Honekin lotuta ez litzateke ahaztu behar euskarriaren eragina,

oso gutxi ikertu bada ere. Rosevear eta lankideen (1987) arabera euskarriaren

ezaugarriek erreaktiboen faseen arteko zatikatzea baldintza dezakete.

Euskarriak eta erreaktiboren bat antzeko karga izanez gero, errepultsioa gerta

daiteke eta erreaktibo horren kontzentrazioa baxuagoa izango da euskarriaren

alboan, eta alderantziz.

III. Emaitzak

142

Adlercreutz-en (1996) arabera euskarri ezberdinak erabiliz aurkitutako

aktibitate ezberdinak masa-transferentzia arazoei edo ura, substratu edo

produktuen zatikapen eraginei egotzi ahal zaizkie. Honez gain, Rosevear eta

lankideekin (1987) bat datozen ondorioak aurkitu zuen, hala nola, substratua

eta euskarria hidrofobikoak badira, substratua euskarrian kontzentratuko da.

Honek aktibitatea handi dezake edo gutxitu substratu inhibizioa gertatuz gero.

Halaber, Du eta lankideek (2005) euskarriaren eragina frogatu dute soja-

olioaren transesterifikazioan, Lipozyme TL IM lipasa erabiliz eta metanola 3

unetan gehituz. Autore hauen arabera, prestakin entzimatiko honen kantitatea

handitu ahala, lortutako EM handitu ziren. Izan ere, lipasaren %2-10 bitarteko

kantitateak erabili zituzten lortutako emaitzak hurrengoak izanik: %50 EM, %60

EM, %75 EM, >%90, lipasaren %2, %4, %6, eta %8 edo 10 erabiliz. Euskarriaren

eragina aztertzeko %6 silika gel gehitu zen erreakzio girora bertan lipasaren %4

egonik. Erreakzioaren abiadura hobetzeaz gain, lortutako emaitzak lipasaren

%10ekin lortutakoen bezain altuak izan ziren (>%90). Honek guztiak, erreakzio

girora gehitutako euskarriaren eragina nabarmentzen du. Beraz, gure

ikerlanean, nahiz eta gehitutako lipasa unitateak berdindu, lipasa bakoitzaren

gehitutako kantitate (% pisuan) ezberdinek lortutako emaitzen arteko

ezberdintasun hau azal dezakete, neurri batean.

Erreakzioen eboluzioa ikusteko eta emaitzei azalpena emateko DG eta

TG-en eboluzioa erreakzioan zehar aztertu zen. Aztertutako erreakzioak lipasa

bakoitzaren 1200 PLU erabilita eta metanola 3 eratan gehituta eta 600 PLU

erabilita eta mol-baliokide bat metanol 24 orduro gehituta egin ziren. Emaitzak

38, 39 eta 40. irudietan biltzen dira Novozym 435, Lipozyme RM IM eta TL IM-

rentzat, hurrenez hurren.

Novozym 435-ek katalizatutako erreakzioetan (38. irudia) hasierako

unetan ia gauza bera gertatu zen aztertutako 4 egoeratan: TG erdiraino jaitsi

ziren (600 mol/g olio ingurura) eta 400 mol/g olio inguru DG ekoitzi ziren.

Erreakzioa aurrera joan ahala ezberdintasunak agertu ziren. Esaterako, 3 mol-

III. Emaitzak

143

baliokide metanol batera gehitzean TGen degradazioa eten egin zen, baita

DGena ere. Dirudienez, entzima inaktibatu egin zen metanolaren eraginez.

Metanola zatika gehitzean TG degradatu ziren erreakzio osoan zehar, hasierako

degradazio azkarraren ondoren degradazio mantsoagoa eman zelarik. DGen

kasuan antzeko egoera ikus daiteke. Ekoitzitako DG poliki poliki degradatu

ziren EM sortuz eta erreakzio guztietan oso MG gutxi ekoitziz (<%3).

Lipozyme RM IM-k katalizatutako erreakzioetan (39. irudia)

ezberdintasun ugari ikus daitezke metanola gehitzeko eraren arabera:

Erreakzioen hasierako unetan ia TG guztiak oso azkar degradatu ziren mol-

baliokide metanol bakarra gehitzean, baina 2 edo 3 mol-baliokide metanol

gehituz gero, TGen erdia baino ez zen degradatu eta honez gain, erreakzioa

aurrera joan ahala TG gehiago sortu ziren (agian interesterifikazioak eraginda)

eta erreakzioa eten egin zela ematen du. Mol-baliokide bakarra metanol

gehitzean DG pilatu ziren (600 mol/g olio inguru) falta zen metanola gehitu

arte. Dena den, azken kasu honetan 600 PLU ez ziren nahikoak erreakzioa

erabat osatzeko. Bi edo hiru mol-baliokide metanol gehituz gero, DGen

ekoizpena txikiagoa izan zen eta pilatu egin ziren, erreakzioa gelditu zelarik.

Lipozyme RM IM-k DGez gain MG ere ekoitzi zituen.

Lipozyme TL IM-k katalizatutako erreakzioetan (40. irudia) TG ia guztiz

degradatu ziren hasierako unetatik aztertutako lau egoeretan. Kasu guztietan

DG pilatu ziren erreakzio giroan, nahiz eta hauek ere guztiz degradatu

erreakzioa joan ahala eta kasu bakoitzean falta zen metanola gehitu ahala.

DGez gain MG ere pilatu ziren erreakzioaren hasieran gero guztiz

degradatzeko.

III. Emaitzak

144

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

DG

(

mo

l/g

oli

o)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

TG

(

mo

l/g

oli

o)

38. irudia. Novozym 435-ek katalizatutako erreakzioen a) DG-en eta b) TG-en eboluzioa denboran zehar. Erreakzio-baldintzak: 10 g C olio, 30 ºC, 100 oszilazio/min. Erabilitako lipasa-unitateak eta gehitutako metanola: 1200 PLU erabilita: mol-baliokide bat metanol eta 24 ordu ondoren beste 2, bi mol-baliokide metanol eta 24 ordu ondoren beste bat, Δ 3 mol-baliokide metanol batera, x 600 PLU erabiliz mol-baliokide bat metanol 24 orduro. Geziek erreakzioa osatzeko falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.

a)

b)

III. Emaitzak

145

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

DG

(

mo

l/g

oli

o)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

TG

(

mo

l/g

oli

o)

39. irudia. Lipozyme RM IM-k katalizatutako erreakzioen a) DG-en eta b) TG-en eboluzioa denboran zehar. Erreakzio-baldintzak: 10 g C olio, 30 ºC, 100 oszilazio/min. Erabilitako lipasa-unitateak eta gehitutako metanola: 1200 PLU erabilita: mol-baliokide bat metanol eta 24 ordu ondoren beste 2, bi mol-baliokide metanol eta 24 ordu ondoren beste bat, Δ 3 mol-baliokide metanol batera, x 600 PLU erabiliz mol-baliokide bat metanol 24 orduro. Geziek erreakzioa osatzeko falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.

a)

b)

III. Emaitzak

146

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

DG

(

mo

l/g

oli

o)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

denbora (ordu)

TG

(

mo

l/g

oli

o)

40. irudia. Lipozyme TL IM-k katalizatutako erreakzioen a) DG-en eta b) TG-en eboluzioa denboran zehar. Erreakzio-baldintzak: 10 g C olio, 30 ºC, 100 oszilazio/min. Erabilitako lipasa-unitateak eta gehitutako metanola: 1200 PLU erabilita: mol-baliokide bat metanol eta 24 ordu ondoren beste 2, bi mol-baliokide metanol eta 24 ordu ondoren beste bat, Δ 3 mol-baliokide metanol batera, x 600 PLU erabiliz mol-baliokide bat metanol 24 orduro. Geziek erreakzioa osatzeko falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.

a)

b)

III. Emaitzak

147

Emaitza hauetatik guztietatik Lipozyme RM IM eta Lipozyme TL IM

lipasa posizio-espezifikoak direla ondoriozta daiteke, TGen kanpo loturak

degradatzen dituzte eta honen ondorioz DG eta MG pilatzen dira erreakzio

giroan. Novozym 435-k, berriz, TGen lotura guztiak degradatzen ditu eta

horregatik TG guztiak ez dira degradatzen erreakzioaren hasieran eta nahiz eta

erreakzio giroan DG egon, ez dira aurreko bi kasuetan beste pilatzen eta ez dira

ia MGrik sortzen.

Lehen esan bezala, koipe eta olioen metanolisia osatzeko 3 mol-baliokide

metanol behar dira. Hala ere, ikerketa-lan ugarik (21. taula), baita lan honek ere,

erakutsi dute koipeen metanolisia aurrera eramateko behar den metanol guztia

batera gehitzen denean, lortutako EM teorian ekoitz zitezkeenak baino askoz

gutxiago direla kasu gehienetan. Taulan ikus daitekeen bezala EM-en ekoizpen

handiak lortzeko (>%80) lipasa kantitate handiak erabili dira (>%10, g lipasa/g

substratu), Köse eta lankideek (2002) eta Du eta lankideek (2003) egin zuten

bezala Novozym 435-en %30 erabiliz kotoi-olioaren metanolisia katalizatzeko

eta Lipozyme TL IM-ren %30 erabiliz soja-olioa metanolizatzeko, hurrenez

hurren. Halaber, ekoizpen handiak lortu ziren Pseudomonas-en lipasak erabilita.

Hsu eta lankideek (2001, 2002) eta Kaieda eta lankideek (2001) P. cepacia-ren

lipasak, edo Soumanou eta Bornscheuer-ek (2003a, b) P. fluorescens-en lipasa

erabiliz egin zuten moduan. Dirudienez, Pseudomonas-en andui batzuek

metanola jasaten dute (Heipieper eta lank., 1994). Gainera, Hsu eta lankideek

(2001) ziotenez, P. cepacia-ren PS-30 lipasa filosilikatoen sol-gel matrize batean

immobilizatzeak bere aktibitatea eta egonkortasuna hobetzen zituen.

III. Emaitzak

148

21. taula. Lipasa immobilizatuen bidez lortutako gantz eta olioen EM (%) 3 mol-baliokide metanol batera gehitzen zirenean eta disolbatzaile organikorik gabeko erreakzio-giroa erabilita.

Lipasa

(%, g lipasa/g olio)

Olioa/gantza Denbora (ordu)

EM (%)

Erreferentzia

R. miehei (%1.25) Bilgorra 48 <1 Stevenson eta lank. (1994) c

R. miehei (%10) Bilgorra 8 19.4 Nelson eta lank. (1996) b

C. antarctica (%4) Soja eta koltza-olioa

24 <10 Shimada eta lank. (1999)eta Watanabe eta lank. (2000)

C. antarctica (%4) Soja-olioa 4 <10 Samukawa eta lank. (2000)

P. cepacia (%5.75) Bilgorra/ erabilitako gantza

24 92/94 Hsu eta lank. (2001) c, d

C. antarctica (%6) Ekilore-olioa 12 <20 Bélafi-Bakó eta lank. (2002) c, d

C. antarctica

(%10-30) Kotoi-olioa 7 70.5-84 Köse eta lank. (2002) a, e

C. antarctica,

T. lanuginosus,

P. cepacia (%10)

Jantokietatik jasotako gantza

48

75

4

98

Hsu eta lank. (2002) a, d

C. antarctica (%10) Bilgorra 24 2.7 Lee eta lank. (2002)

T. lanuginosus (%30) Soja-olioa 12 85 Du eta lank. (2003)

P. fluorescens

R. miehei

T. lanuginosus (%10)

Ekilore-/Kotoi-olioa

24

55

40/30

35/10

Soumanou eta Bornscheuer (2003 a/b) a

C. antarctica (%4) Soja-olioa 10 <5 Du eta lank. (2004) a

T. lanuginosus (%4) Soja-olioa 24 <5 Xu eta lank. (2004) a

Beste lekuren batean adierazi ezean, erreakzio baldintzak honako hauek izan ziren: 30 ºC, TG:metanol (1:3; mol:mol) eta irabiaketa orbitala 100 eta 200 rpm tartean. a) 40 ºC; b) 45 ºC; c) 50 ºC d) TG:metanol (1:4; mol:mol) e) Irabiaketa magnetikoa 700 rpm

III. Emaitzak

149

Alkoholisi erreakzioetan ikusitako substratu inhibizioaz gain (metanolak

eraginda Samukawa eta lankideek (2000) ikusi zuten bezala eta ikerlan honetan

frogatu bezala; butanolak eraginda Dossat eta lankideek (2002) aurkitu bezala),

autore batzuek metanola eta olioak, metanolisia aurrera eramateko behar diren

mol-proportzioetan, ez direla guztiz nahaskorrak ikusi dute (Stevenson eta

lank., 1994; Nelson eta lank., 1996; Shimada eta lank., 1999; Watanabe eta lank.,

2000; Iso eta lank., 2001; Chen eta Wu, 2003). Honen inguruan badago hipotesi

bat. Hipotesi honen arabera erreakzio-giroan ondo nahasten ez diren metanol-

tantak gelditzen dira, eta tanta hauek lipasak inaktibatzen dituzte. Shimada eta

lankideen (1999) eta Watanabe eta lankideen (2000) arabera, 1:1.5 (TG:metanol;

mol:mol) baino handiagoko proportzioa erabiltzen zenean Novozym 435

inaktibatzen zen.

Chen eta Wu-k (2003) metanola eta etanola soja-olioarekin gaizki

nahasten zirela ikusi zuten. Olioari alkoholaren mol teorikoen 1/9 baino

gehiago gehitzen zitzaionean, nahasketa emultsio bihurtzen zen. Alkohol

tantatxoak ikusten ziren eta entzima desaktibatzen zen. Entzima

immobilizatzeko erabilitako materiala erretxina akrilikoa zen eta metanol eta

etanol bezalako konposatu polarrak adsorbi zitzakeen. Nahasketan kate-

motzeko alkoholen kontzentrazioa altua zenean, alkoholek tantatxoak eratzen

zituzten eta hauek erretxina partikulei eransten zitzaizkien. Alkohola

immobilizatutako entziman adsorbatzen zenez, triglizeridoen sarrera

eragozten zen eta honen ondorioz erreakzioa gelditzen zen.

Metanolisi erreakzioak aurrera eramateko eta aipatutako arazoak

ekiditeko hainbat konponbide deskribatu dira. Alde batetik, disolbatzaile

organikoak erabili daitezke substratuak hobeto nahasteko eta lipasen

inaktibazioa gutxitzeko, horrela %95 EM lortuz (Nelson eta lank., 1996;

Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a/b). CO2 superkritikoa ere erabili da

substratuak disolbatzeko (Jackson eta King, 1996). Bestaldetik, metanol guztia

batera gehitu beharrean, kantitate txikiagotan gehitzen bada denboran zehar,

III. Emaitzak

150

ekoitzitako ester metilikoek, metanol eta olioaren arteko nahaskortasuna

hobetzen dute eta lipasa ez da inaktibatzen (Watanabe eta lank., 2000). Argi

dago guztiz beharrezkoa dela metanolaren kontzentrazioa kontrolatua izatea

erreakzio-giroan.

Azken aukera hori, ikerlan honetan erabilitakoa izan da eta ikusi denez

EM-en ekoizpena hobetzen da, %95 EM inguru lortuz Novozym 435 eta

Lipozyme TL IM erabiliz. Emaitza hauek 21. taulan dauden autore batzuen

emaitzekin bat datoz metanola zatika gehituta %90 EM baino gehiago ekoitzi

zirelarik (Stevenson eta lank., 1994; Shimada eta lank., 1999; Watanabe eta lank.,

2000; Bélafi-Bakó eta lank., 2002; Xu eta lank., 2004).

Ikerlan gutxi batzuetan biodiesela ekoizteko lipasa batzuk erabili dira

entzimen arteko alderaketak egiteko. Deng eta lankideek (2005) 6 lipasa

komertzial immobilizatu erabili zituzten ekilore-olioaren alkoholisirako.

Lipasez gain alhokol ezberdinen eragina ikertu zuten. Metanolaren kasuan

(kantitate estekiometrikoa 4 unetan gehituta) eta lipasa bakoitzaren %10

(g lipasa/100 g olio) erabiliz, 24 ordutan %92, 90, 68, 59, 28 eta 8 EM ekoitzi

zuten, Novozym 435, Lipozyme TL IM, LA201 lipasa (T. lanuginosa-ren lipasa

polipropilenozko euskarrian immobilizatua), Lipozyme RM IM, PS-C lipasa

(Pseudomonas cepacia-ren lipasa zeramikazko partikuletan immobilizatua) eta

AK-C lipasa (P. fluorescens-en zeramikazko partikuletan immobilizatua)

erabilita, hurrenez hurren. Ikus daitekeenez, gure emaitzen antza handia dute,

baina lipasa gehiago erabilita. Aipatzekoa da T. lanuginosa-ren bi lipasek

lortutako transesterifikazioak. Izan ere, euskarri ezberdina erabiltzeak

immobilizaziorako eragin handia izan dezake lipasak erakutsitako aktibitatean.

Honez gain, Wu eta lankideek (2003) ikerlan honetan aztertutako 3

lipasak erabili zituzten erabilitako olioa eta metanola transesterifikatzeko.

Lipasa guztiek (%10, g lipasa/100 g olio) mol-baliokide metanol bat gehituta

katalizatu zuten erreakzioa arazorik gabe. Lipozyme TL IM merkeena zenez,

III. Emaitzak

151

erreakzio osoa garatu eta erreakzioaren baldintzak ikertzeko aukeratu zuten.

Metanola lau zatitan gehitu zuten eta %90.2 EM lortu zuten. Gure emaitzekin

alderatuz, errendimendu txikiagoa lortu zuten, agian olioaren ezaugarriek

eraginda.

2.1.2. Esterifikazioa

Lehen, “Lipasen karakterizazioa” atal barruan “Substratuen

kontzentrazioaren eragina aktibitatean” atalean (100. orr.), azaldu bezala,

metanol eta hainbat kate-luzerako gantz-azidoen (C4, C12 eta C18:1) arteko

esterifikazio-erreakzioetan, hexanoa disolbatzaile moduan erabilita, metanolak

substratu inhibizioa eragiten zuen, metanol eta gantz-azidoen arteko

proportzioa 1:1 (GA:metanol; mol:mol) baino handiagoa zenean. Azido

oleikoak, ordea, ez zuen inhibiziorik eragin ikertutako kontzentrazioetan (62.5-

500 mM). Erabilitako olioen gantz-azido gehiengodunak C18:1 eta C18:2 ziren.

Hasierako erreakzioak Novozym 435 (1200 PLU) erabilita egin ziren azido

lauriko eta propanolaren arteko esterifikazioan emaitzarik altuenak lortu zituen

eta. Metanolaren hainbat proportzio gehitu ziren, karakterizazio erreakzioetan

lortutako emaitzekin bat zetozen ikusteko. Entsegu hauek Araba Campuseko

jantokian bildutako olioarekin (B olioa) egin ziren. Olioa jaso ondoren hondakin

solidoak kentzeko iragazi eta hidrolizatu egin zen OF lipasak katalizatutako

erreakzioan (“Material eta Metodoak” atalean, 48. orr.).

Erreakzio-girora metanolaren hainbat proportzio (1:0.3-1.5; mol GA:mol

metanol) gehituz gero, erreakzioaren hasierako 5 orduetan ester metilikoen

ekoizpena metanolaren kontzentrazioa igo ahala igo zen 1:1.25 proportziora

arte (41. irudia). Erreakzioaren lehenengo orduan eta 1:0.3 proportzioa erabilita,

ekoitz zitezkeen ester metiliko guztiak ekoitzi ziren (%33 EM), eta gauza bera

gertatu zen 1:0.6 proportzioa erabiliz (%66 EM). Emaitzarik onenak proportzio

III. Emaitzak

152

estekiometrikoa baino pixka bat altuagoak diren proportzioak erabiliz (1:1.25;

mol GA:mol metanol) lortu ziren, lehenengo erreakzio orduan %95 EM lortuz.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 3 5 24

denbora (ordu)

EM

(%

)

41. irudia. Novozym 435-ek (%4 pisuan=1200 PLU) katalizatutako hidrolisatutako olioaren metanolisian ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) gehitutako metanolaren arabera. 10 g hidrolisatutako B olio, 30 ºC, irabiaketa orbitala 100 oszilazio/min eta gantz-azido aske:metanol

hainbat proportzio erabiliz: 0.3, 0.6, 1.0, 1.25 eta 1.5.

2.1.2.1. Gehitutako lipasa-unitateen eragina

Entsegu hauek Araba Campuseko jantokian bildutako olioarekin

(C olioa) egin ziren. Olioa jaso ondoren hondakin solidoak kentzeko iragazi eta

hidrolizatu egin zen OF lipasak katalizatutako erreakzioan (“Material eta

Metodoak” atalean, 48. orr.). Entseguak lipasa bakoitzaren hainbat lipasa-

unitate (120-1200 PLU) eta gantz-azido:metanol (1:1.25 mol:mol) proportzioa,

lehengo atalean egokia aurkitu zena, erabiliz egin ziren.

Novozym 435 erabilita (42a. irudia), espero zenez, gehitutako lipasa-

unitateak igo ahala ester metilikoen ekoizpena handitu zen erreakzioaren

hasierako unetan, gero erreakzioaren bukaeran (180 minututan) orekara

heltzeko. Kasu guztietan %90 baino gehiagoko ekoizpena lortu zen 300 PLU

baino gehiago erabiltzean.

III. Emaitzak

153

Bestaldetik, Lipozyme RM IM-ren kasuan (42b. irudia) gehitutako

lipasaren kopurua igo ahala ester metilikoen ekoizpena handitu bazen ere,

%90eko ekoizpena ez zen inolako kasuan lortu, ekoizpenik altuena %80koa

izanik. Dirudienez, kasu guztietan erreakzioa 60-90 minutu pasa eta gero

gelditu zen.

Honekin lotuta, Lipozyme TL IM-k (42.c irudia) ere jokabide berezia izan

zuen. Erreakzioaren hasierako unetan (15 minututan) lipasa kopuru guztiek

ekoizpen bera lortu baitzuten, esterifikazio-abiadura Novozym 435-ena eta

Lipozyme RM IM-rena baino txikiagoa izanik. Erreakzioen bukaeran bakarrik

900 eta 1200 PLU erabilita lortu ziren %30eko baino handiagoko ekoizpenak.

900 PLU erabilita %50eko ekoizpena lortu zen 180 minututan eta 1200 PLU

gehituta %95 EM lortu zen 90 minututan.

Gehitutako lipasa-unitateen eragina alderatuz gero, honako hau aurki

daiteke: 120 PLU gehituta bakarrik Novozym 435-ek lor zezakeen %90eko baino

gehiagoko ekoizpena aztertutako erreakzioaren gehienezko denboran (180

min). Lipozyme RM IM-k %50 besterik ez zuen lortu eta 90 minutu igarota

bertan gelditu zen. Lipozyme TL IM-k %20 baino ez zuen lortu eta gainera

ekoizpen hori hasierako unetatik lortua zuen. Era berean 300 PLU gehituta

bakarrik Novozym 435-ek lortu zuen %95 EM, Lipozyme RM IM-k %50ean eta

Lipozyme TL IM-k %20n geldituz. 600 PLU edota PLU gehiago gehituz gero,

Novozym 435-ek %95eko ekoizpena lortu zuen 90 minututan kasu guztietan, 60

minututan jada emaitza berdinak emanik.

Watanabe eta lankideek (2002) tuna-oliotik C22:6 lortzeko sortutako

gantz-azido askeak metanolarekin (GAA:metanol, 1:2 mol:mol) esterifikatu

zituzten Novozym 435 erabilita. Autore hauen arabera, %0.5 (g lipasa/100 g

GAA) baino gehiago erabilita %95 EM ekoitzi zitezkeen 24 orduetan. Lipasaren

kantitatea igo ahala, erreakzio denbora murriz zitekeen eta %1-2 (g lipasa/100 g

GAA) nahikoa zen 3 orduetan %95 inguru lortzeko.

III. Emaitzak

154

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

EM

(%

)

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

EM

(%

)

0102030405060708090

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (minutu)

EM

(%

)

42. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) gehitutako lipasa-unitateen arabera hidrolisatutako C olioaren metanolisian, 10g olio hidrolisatua, gantz-azido:metanol (1:1.25; mol:mol), 30 ºC eta 100 oszilazio/min: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM, c) Lipozyme TL IM; ◊ 120, 300, Δ 600, x 900, 1200 PLU.

a)

b)

c)

III. Emaitzak

155

Honez gain, Lai eta lankideek (2005) eta Watanabe eta lankideek (2005)

Novozym 435 erabilita olio azidoen metanolisia katalizatu zuten. Lai eta

lankideek (2005) arrozaren zahiaren olioa birfintzean sortutako GAA

esterifikatu zituzten %98 EM lortuz ordubetean eta lipasaren %5 (g lipasa/100 g

GAA) gehituz. Olioaren, transesterifikaziorako, berriz, 6 ordu behar izan

zituzten. Watanabe eta lankideek olio azido baten eredua sortu zuten TG eta

GAA proportzio ezberdinak erabiliz. Esterifikaziorako nahikoa zen lipasaren

%0.5 (g lipasa/100 g substratu), transesterifikaziorako, aldiz, %6 behar izan

zuten 10 orduetan %90 EM baino gehiago ekoizteko.

Gehitutako lipasa-unitateen eraginez gain, badago azpimarratzekoa den

beste gai bat. Izan ere, bi olio hidrolisatuekin lortutako emaitzak alderatuz gero

(43. irudia), ezberdintasun nabarmenak ikus daitezke.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 30 60 90 120 150 180

denbora (min)

EM

(%

)

43. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) erabilitako olioaren arabera. Ikur hutsak hidrolisatutako B olioa adierazten dute, ikur beteak, berriz, hidrolisatutako C olioa. Emaitzak alderatu ahal izateko bi olioak esterifikatzeko erabilitako lipasa bakoitzaren unitateak berdindu ziren: Novozym 435 (1200 PLU), Lipozyme RM IM (600 PLU) eta Δ Lipozyme TL IM (300 PLU).

Novozym 435-ek eta Lipozyme RM IM-k emaitza hobeak lortu zituzten B

olio hidrolisatuaren metanolisian. Novozym 435-en kasuan erreakzioa askoz

III. Emaitzak

156

azkarragoa zen, 15 minututan jada %95 EM lortu zuelarik eta Lipozyme RM IM

erabilita ere, antzeko kantitatea lortzeko 180 minutu behar baziren ere, %95 EM

lor zitekeen. Bestaldetik, Lipozyme TL IM-ren kasuan C olio hidrolisatua

erabiliz %20 EM lortzen zen, B olioa erabilita baino pixka handiagoa. Hala ere,

erreakzioaren profila antzekoa zen, erreakzioa gelditu baitzen hasierako

ekoizpena lortu eta gero. Ezberdintasunen arrazoia olioen konposaketa gantz-

azidotan izan daiteke. Izan ere, C olioak B olioak baino C16:0 gantz-azidoaren

kantitate bikoitza zuen, guztira gantz-azido saturatuen %21 eta 12 izanik,

hurrenez hurren. Gainera, hidrolisatutako C olioa giro-tenperaturan solidoa

zen. Beste arrazoi bat frijitzeko olioetan agertzen diren degradazio

konposatuetan egon daiteke. Izan ere, Lipozyme RM IM fitxa teknikoaren

arabera (Novo Nordisk, 2000a) koipetan ager daitezkeen oxidazio produktuek

entzimaren aktibitatea gutxi dezakete. Honen ondorioz, entzimaren

produktibitatea substratuen ezaugarriekin eta kalitatearekin lotuta egon

daiteke. Honez gain, Lipozyme RM IM-ren euskarria ioi-trukaketa erretxina

denez, konposatu polarrak bertan adsorbi daitezke substratuen barreiapena

zailduz (Rosevear eta lank., 1987).

2.2. Erreakzio jarraiak

Erreakzio jarraiak garatzeko Novozym 435 erabili zen, prestakin

entzimatiko honek bi substratuen, olioaren eta olio hidrolisatuaren, metanolisia

lipasa kantitate txikienekin katalizatzen zuelako.

Erreakzio jarraiak egiteko termostatizatutako beirazko zutabea (XK16,

Pharmacia, Suedia) erabili zen. Erreakzio substratuak, aldez aurretik nahastuta

eta erreakzio-tenperaturan zeudela, zutabetik pasarazteko ponpa peristaltikoa

erabili zen eta elikatzea behetik gora egin zen. Behetik egindako elikatzearen

abantailak honako hauek dira: entzima eta jariakinaren arteko kontaktu ona

sortzen da eta erreaktorean barruko presio-jaitsierak gutxitzen dira (Xu, 2000).

III. Emaitzak

157

Zutabea paketatzeko, ohantze finkoa sortzeko, alegia, entzima substratu-

nahasketari gehitu eta lortutako nahasketa zutabean sartu zen goiko aldetik.

Entzima pixkanaka beheko aldean jalkitzen joan zen, bitartean beirazko

hagaxka baten bidez pixka bat irabiatu zen aire-burbuilak kentzeko. Entzima

beheko aldean jalki zenean eta ohantzea sortua zegoenean soberan zeuden

substratuak pipeta baten bidez kendu ziren. Paketatzeko metodo hau hautatu

zen lehen egindako entseguetan trabatze arazoak sortu zirelako entzima lehorra

sartu zenean eta erreakzio-nahasketak entzima bustitzen zuenean. Traba hauek

metanol eta olioaren arteko nahasketaren biskositate altuari egotzi zitzaizkion.

2.2.1. Transesterifikazioa

Etenean egindako erreakzioetan metanolak, proportzio

estekiometrikoetan, batera gehituta lipasa inaktiba zezakeenez, metanola zatika

gehitzea erabaki zen, transesterifikazio esperimentuak egiteko bi urrats eman

zirelarik. Lehena, olio:metanol 1:1 (mol:mol) proportzioa erabiliz egin zen.

Horrela, erreakzio-nahasketa hau zutabetik pasa eta gero, produktua (%30 ester

metiliko inguru) mugitu gabe utzi zen gau osoa faseen bereizketa gertatzen zen

ikusteko eta horrela glizerola kentzeko. Kasu honetan ez zen horrela gertatu eta

ez zen faseen bereizketa ikusi. Hurrengo goizean erreakzioa osatzeko behar zen

metanola (2 mol-baliokide) gehitu zitzaion erreakzio-nahasketari eta zutabetik

pasatzen utzi zen. Lortutako ester metilikoak %67 izan ziren. Emaitza baxu

hauen arrazoia glizerolak eragiten duen inhibizioan aurki daiteke. Izan ere,

glizerola ez zen bereiztu eta zutabearen beheko aldean pilatzeko joera izan

dezake (Dossat eta lank., 1999 eta Watanabe eta lank., 2000). Dirudienez,

glizerolak euskarriari itsasten zaion geruza sortzen du. Honen ondorioz,

erreakzio-girotik entzimarako substratu hidrofobikoaren barreiapena ekiditen

da (Dossat eta lank., 1999). Etenean egindako erreakzioetan irabiaketak arazo

hau saihesten laguntzen du.

III. Emaitzak

158

Lehen esan bezala, gure entseguetan ez zen posible izan glizerola

bereiztea. Shimada eta lankideek (1999) eta Watanabe eta lankideek (2000),

ordea, erreakzio-nahasketa uzten zuten irabiaketarik gabe eta bi fase bereizten

ziren, goikoa ester metilikoen eta lipidoen fasea eta behekoa fase urtsua

glizerolarekin nahastuta. Gure kasuan glizerola erreakzio-nahasketan gelditzen

zen eta ziurrenez, honen ondorioz entzimaren euskarrian pilatu zen.

2.2.2. Esterifikazioa

Olioa erabiliz ez bezala, gantz-azido askeen esterifikazioa urrats bakar

batean egin daiteke, ester metilikoen ekoizpen altuak lortuz erreakzio etenetan

frogatu den bezala. Era honetan inhibizio arazoak ekidin zitezkeen, bai

metanolak bai glizerolak sortuak. Prozesua askoz errazagoa da, nahasketaren

(gantz-azidoen eta metanolaren) biskositatea txikiagoa delako, zutabe barruko

presioa txikiagoa izanik. Lortutako emaitzak 44. irudian ikus daitezke. Bertan B

olio hidrolisatuaren eta metanolaren arteko esterifikazioa (1:1; mol:mol) ikertu

zen lipasa berria eta lipasa berrerabilia erabilita.

Ikus daitekeenez, lipasa berria erabiliz hasieran ekoizpena igo zen %93

ester metiliko lortu arte 3 ordutan, gero ekoizpena jaitsi zen %89ra ekoitzitako

uraren ondorioz. Erreakzioan ura sortzen zenez, euskarriak ura adsorbi

zezakeen eta honen ondorioz hidrolisia eragin. Urak hidrolisia eragiteaz gain,

konposatu hidrofilikoa izanik substratu hidrofobikoen, GAA-en barreiapena

zail zezakeen (Dossat eta lank., 1999). Ekoitzitako ura zutabearen beheko aldean

pilatu zen. Hori dela eta erreakzioa bukatu eta gero, erreaktorea hustu eta

lipasa hexanoarekin garbitu eta iragazi zen. Zutabea berriro bete eta erreaktorea

martxan jarri zen. Bigarren erabileraren emaitzak pixka baxuagoak ziren,

ekoizpenik altuena %88 izanik eta 24 ordutan %85 mantenduz. Watanabe eta

lankideek (2001) ziotenez, nahiz eta hasieran ur kantitate txikia egon erreakzio-

giroan, lipasa bera erabilita substratu berriarekin ura desagerraraz zezakeen

(euskarritik kanporarazi) eta aktibitatea hobetu.

III. Emaitzak

159

0102030405060708090

100

0 3 6 9 12 15 18 21 24

denbora (ordu)

EM

(%

)

44. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) ohantze finkoko erreaktorean. Erreakzio baldintzak: 30 ºC, gantz-azido:metanol (1:1; mol:mol). Fluxua 7.2 mL/ordukoa izan zen. Novozym 435 lipasaren lehen erabilera , Δ Novozym 435 lipasa berrerabilia.

Horrexegatik, lipasa bera erabili zen ohantze finkoko erreaktorean

metanolaren proportzioa igo zen (1:1.25, mol GA:mol metanol), erreakzio

etenetan emaitzarik onenak eman zituelako eta gainera metanola soberan

gehituta erreakzioa esterifikaziorantz zuzentzen duelako. Erreakzioaren

garapena 45. irudian ikus daiteke.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

EM GAA MG DG TG

Err

eak

zio

nah

ask

etar

en

ko

np

osa

ket

a (%

)

45. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) ohantze finkoko erreaktorean Novozym 435 lipasa erabilita. 30 ºC-tan eta gantz-azido:metanol proportzioa (1:1.25; mol:mol). Fluxua 7.2

mL/ordukoa izan zen. Denbora tarte ezberdinetan (ordu) hartutako laginak: 1, 3, 5, 7 eta 24.

III. Emaitzak

160

Kasu honetan ekoizpena %95era igo zen hasierako 5 orduetan, gero

%90era jaitsiz 24 orduetan, ekoitzitako uraren ondorioz. Arazo teknikoak zirela

eta ez ziren bestelako entsegurik egin gainontzeko entzimekin.

Emaitza hauek guztiek frogatzen dute EM sor daitezkeela zenbait lipasa

immobilizatu erabiliz (Novozym 435 eta Lipozyme TL IM, batez ere) bai era

etenean bai jarrian.

III. Emaitzak

161

EMAITZEN LABURPENA

Ikerlan honetan erabilitako hondakin koipetsuak bi motatakoak izan ziren.

Alde batetik, hiltegietatik jasotako animalia-gantzak, eta bestaldetik, erabilitako

landare-olioak. Substratu hauen ezberdintasunik nagusienak euren

konposaketa gantz-azidotan (saturatu gehiago animalia-gantzetan) eta

hasierako hidrolisi-mailak (altuagoa animalia-gantzetan) ziren. Koipeen

eraldaketa nahiko ikertu bada ere, hondakin koipetsuen berrerabilera era

entzimatikoan, berriz, ez da hain ohikoa eta jarraian aipatutako lanak besterik

ez dira aurkitu, animalia-gantzen eta erabilitako landare-olioetarako. Autore

batzuek hidrolisia erabili zuten (Adamzack eta lank., 2000; Dandik eta lank.,

1993), beste batzuek, berriz, ester metilikoen sintesia ikertu zuten (Hsu eta

lank., 2001 eta 2002; Lee eta lank., 2002; Watanabe eta lank., 2001, 2002 eta 2005;

Wu eta lank., 2003).

Koipe hauek erabiliz aztertutako tratamenduak bi izan ziren: hidrolisia

(gantz-azido askeak eta glizerola lortzeko) eta ester metilikoak ekoizteko

transesterifikazioa edo esterifikazioa. Tratamendu hauek gantz eta olio

komertzialekin askotan erabili badira ere, hondakinekin ez hainbeste, esan

bezala, eta honez gain, ez da ohikoa lipasa komertzialen arteko alderaketak

aurkitzea. Hidrolisi erreakzioak egiteko 6 lipasa aztertu ziren eta ester

metilikoak ekoizteko, 3 lipasa immobilizatu. Lipasa hauen guztien ezaugarriak

ikertu ziren tratamenduen baldintza egokienak zehaztu baino lehen. Lipasa

hauen arteko alderaketa bi eratan egin zen. Alde batetik, euren ezaugarri fisiko-

kimikoak ikertu ziren. Beste aldetik, euren erabilera tratamenduetan ikertu zen.

Hidrolisirako lipasarik egokiena aukeratzeko irizpide nagusienak

aktibitate altua edukitzea eta erreakzio-denboran zehar (gehienez 24 orduz)

egonkorra izatea izan ziren. Candida rugosa-ren OF eta Lipomod lipasek

aktibitaterik altuena izan zuten oliba-olioa substratu moduan erabilita,

hidrolisi-aktibitatea neurtzeko erabilitako bi metodoekin. Bi lipasa hauen

III. Emaitzak

162

ondoren Lipopan (Thermomyces lanuginosus), Novo 398 (Humicola insolens) eta

Lipolase (Thermomyces lanuginosus) lipasak zeuden, aktibitate gutxien zuen

lipasa Novo 868 (Candida antarctica-ren A lipasa) izan zelarik. Aztertutako

lipasa guztiek pH 5-7 tartean izan zuten aktibitaterik altuena eta aktibitate

gutxiago pH 8n. Aztertutako entzima gehienek aktibitate optimoa 37 eta 40 ºC

tartean izan zuten, Novo 398 eta Novo 868 izan ezik, euren aktibitaterik altuena

ikertutako tenperaturarik altuenean izan zutelarik (50 ºC).

Prestakin entzimatikorik egonkorrenak, bai pH-ren bai tenperaturaren

eraginpean, Novo 398 eta Lipolase lipasak izan ziren. OF eta Lipomod lipasak

egonkorragoak izan ziren pH 6n eta 37 ºC-tan utzita, baldintza hauetan 24

ordutan bere aktibitatearen %60 baino gehiago mantendu zutelarik. Aktibitate

balioak eta egonkortasuna kontutan hartuta lipasen produktibitatea kalkulatu

zen. Candida rugosa-ren prestakinek eman zuten produktibitaterik altuena. Izan

ere, bere egonkortasuna oso altua ez izan arren, gainontzeko entzimak baino

aktibitate askoz altuagoa dute.

Substratu-ereduen, txerri-gantza eta hazi-olioa, hidrolisian bi jokabide

ezberdin aurkitu ziren. C. rugosa-ren prestakin entzimatikoek (OF eta Lipomod)

eman zuten koipeen hidrolisi mailarik altuena (>%60 substratuaren arabera 3

ordutan), segur aski ez dutelako posizio-espezifizitaterik. Gainontzeko

entzimak mota ezberdineko espezifizitatea azaldu zuten : Lipolase, Novo 398

eta Lipopan lipasek sn-1 eta sn-3 posizio-espezifizitate nabaria azaldu zuten;

Novo 868 lipasa, berriz, sn-2 posizio-espezifikoa izateaz gain, gantz-azido

saturatuekiko espezifizitatea duela ematen du; eta eman zuten hidrolisi altuena

%30 ingurukoa izan zen.

Emaitza hauek guztiak kontuan harturik, koipeen hidrolisi osorako

C. rugosa-ren lipasak aukeratzea erabaki zen, aktibitaterik altuena eta hiru

orduetan hidrolisi-mailarik altuenak eman zituztenak izan zirelako. Bien artean,

OF lipasak erreakzio-baldintzetan ezaugarri egokienak aurkeztu zituen. Hala

III. Emaitzak

163

nola, hidrolisi-maila altuak denbora laburretan (%70-80, 3 orduetan eta 90 U/g

koipe erabilita); aktibitate entzimatiko altua (390 U/mg); ez zen lipasarik

egonkorrena, baina %60ko aktibitatea gorde zuen 37 ºC-tan 24 orduz.

Horregatik guztiagatik, hondakin koipetsuen hidrolisirako erabiliko zena izan

zen.

Behin hidrolisirako lipasarik egokiena aukeratuta, hidrolisi-

erreakzioaren baldintzak ikertu ziren bi substratu erabilita, animalia-gantza eta

erabilitako landare-olioak. Animalia-gantzen hidrolisirako baldintza egokiak

honako hauek izan ziren: 50:50 (p:b) gantza:ura proportzioa, OF lipasaren

180 U/g gantz, 25-37 ºC tarteko tenperatura eta emultsioa mantentzeko nahikoa

zen irabiaketa, 360 rpm. Baldintza hauek erabiliz %95 baino gehiagoko

hidrolisia lortu zen 24 ordutan 0.5 L-ko erreaktorean. Halaber, 40 L-ko

erreaktorean emaitzak errepikatu ziren. Erabilitako olioen hidrolisirako

baldintzarik egokienak honako hauek izan ziren: 50:50 (p:b) olio:ura

proportzioa, 25 ºC, OF lipasaren 36 U/g olio eta 360 rpm-ko irabiaketa.

Baldintza hauekin, 24 ordutan B olioaren %95eko hidrolisia lortu zen. Hala ere,

zenbait kasutan entzima kantitate handiagoak erabili behar dira olioen

ezaugarrien arabera, edota tarte laburragoetan antzeko hidrolisi-mailak lortu

nahi baldin badira. Eskala handiagoan ere, 5 L-ko erreaktorean, emaitzak

errepikatu ziren. Adamzack eta lankideek (2000) %72ko hidrolisi-maila besterik

ez zuten lortu Rhizopus cohnii-ren lipasaren 360 U/g erabiliz hegazti-gantzen

hidrolisian. Bestaldetik, Dandik eta lankideek (1993) usagariaren (Nigella sativa)

hazien lipasak katalizatutako erabilitako olioaren hidrolisian %94ko hidrolisi-

maila lortzeko %60 hazi (p:p) erabili behar izan zuten.

Hidrolisiaz gain, ester metilikoen ekoizpena ere ikertu zen. Ester

metilikoak sortzeko erabilitako lipasen kasuan, Novozym 435 lipasak

aktibitaterik altuena izan zuen ikerlan honetan erabilitako entseguarekin,

3000 PLU/g inguru lortuz, Lipozyme RM IM-k 1500 PLU/g eta Lipozyme

III. Emaitzak

164

TL IM-k 500 PLU/g lortu zutelarik. Lipasen tenperatura optimoa 60 ºC

inguruan zegoen, hortik aurrera aktibitatea jaitsi zen kasu guztietan.

Substratuen kontzentrazioaren eragina lipasen aktibitatean nabaria zen.

Erreakzioaren mekanismoa Ping Pong Bi Bi dela frogatu zen, substratu bien

(alkohola eta azidoa) inhibizio konpetitiboarekin. Gantz-azidoen kasuan, azido

butiriko, lauriko eta oleikoa ikertu ziren substratu bezala, kate-luzerak

inhibizioan duen garrantzia argi ikusi zelarik. Izan ere, azido butirikoak

inhibizioa eragin zuen ikertutako kontzentrazio guztietan (62.5-500 mM). Azido

laurikoak, berriz, inhibizioa eragin zuen kontzentrazio altuagoetan (>250 mM)

eta azido oleikoak, aldiz, ez zuen inhibiziorik eragin aztertutako

kontzentrazioetan.

Bestalde, metanolaren eragina ikertutako lipasetan bi motatakoa izan

zitekeela ikusi zen: 1) substratu moduan, kontzentrazio altuetan (>200 mM)

inhibitzailea zen; 2) konposatu hidrofilikoa izanik, entzimek duten ur-geruza

bahi dezake entzima desnaturalizatuz eta aktibitatea galduz.

Lipasen egonkortasunari dagokionez, oso emaitza ezberdinak lortu

ziren. Tenperaturaren eragina aztertzeko, lipasak oliotan beratzen uztean

substratuaren barreiapen aldaketak edo eragin ziren eta honen ondorioz ezin

izan zen tenperaturaren eragina egonkortasunean ongi aztertu. Dena den,

lipasa immobilizatuak zirenez, gutxienez bere aktibitatearen %80 mantendu

zuten 24 ordutan beratzen utzi ondoren. Metanolaren eragina egonkortasunean

ikertzeko lipasak metanolean beratzen utzi ziren. Metanolak lipasak

inaktibatzen zituen. Novozym 435 lipasa egonkorrena izan zen eta metanolak

denbora gehiago behar zuen lipasa inaktibatzeko, baina 60 minutu pasa eta

gero aktibitatearen %10 baino ez zuen mantendu.

Lortutako emaitzen arabera ez zegoen ester metilikoak ekoizteko

lipasarik egokiena zein zen erabakitzerik. Horregatik ester metilikoak ekoizteko

III. Emaitzak

165

hiru lipasak erabili ziren. Biodieselaren sintesirako lipasek katalizatutako bi

erreakzio ezberdin burutu ziren: transesterifikazioa eta esterifikazioa.

Transesterifikazio prozesurako substratuak hondakin koipetsuak eta metanola

izan ziren. Esterifikaziorako, berriz, hondakin koipetsuen hidrolisien ondorio

diren gantz azido askeak eta metanola erabili ziren.

Transesterifikazio erreakzioetan metanola gehitzeko erak garrantzi

berezia izan dezakeela, entzimaren arabera, frogatu zen. Hala nola,

erreakzioaren estekiometriaren arabera gehitu behar zen metanola (3 mol-

baliokide) batera gehituz gero, soilik Lipozyme TL IM-k sor zitzakeen ester

metilikoen kantitate handiak ikertutako baldintzetan (%96 EM 7 ordutan eta

%98 EM 24 ordutan). Beste bi entzimak erabiliz metanolak lipasak inaktiba

zitzakeenez, metanola zatika gehitu behar izan zen. Novozym 435-en kasuan

emaitza onak (>%80 EM) lortu ziren metanola bi zatitan gehituz gero (%80 eta

%90, 1+2 edo 2+1 mol-baliokide gehituz, hurrenez hurren), baina

Lipozyme RM IM-ren kasuan emaitza erlatiboki onak lortzeko (%75 EM),

metanola beti hiru zatitan gehitu behar zen (1+1+1mol-baliokide).

Honez gain, lipasa bakoitzaren gehitutako unitateen eragina ikertu zen

metanola 3 zatitan gehituta. Ester metilikoen %95eko edo handiagoko

ekoizpenak lortzeko gutxienez 600 PLU behar ziren. Lipasa unitate horiek

erabilita, Lipozyme TL IM-k %98, Novozym 435-ek %90 eta Lipozyme RM IM-k

%75 EM ekoitzi zuten. Gehitutako lipasa-unitateak berdindu baziren ere,

gehitutako lipasa bakoitzaren euskarri kantitatea oso ezberdina zen eta honek

transesterifikazio erreakzioetan ikusitako ezberdintasunak azal zitzakeen neurri

batean. Euskarriak erreakzioaren emaitzetan izan dezakeen eraginari buruzko

aipamen gutxi aurkitu da bibliografian. Du eta lankideek (2005) euskarriaren

eragina aztertzeko %6 silika gel gehitu zioten erreakzio girora bertan Lipozyme

TL IM-ren %4 egonik. Erreakzioaren abiadura hobetzeaz gain, lortutako

emaitzak lipasaren %10ekin lortutakoen bezain handiak izan ziren (>%90).

III. Emaitzak

166

Bestalde, esterifikazio erreakzioetan, esan bezala, erabilitako olioen

hidrolisian lortutako gantz-azidoak erabili ziren substratu gisa prozesua

ikertzeko. Kasu honetan metanola eragin dezakeen inaktibazioa saihesten zen,

prozesuaren estekiometria 1:1 delako eta gantz azidoen solugarritasuna

metanolean triglizeridoena baino hobea delako, erreakzioa urrats bakar eta

azkar batean burutzen delarik.

Honela, gehitutako lipasa-unitateen eragina alderatu zen. Novozym 435

erabilita gehitutako lipasa-unitateak igo ahala, ester metilikoen ekoizpena

handitu zen erreakzioaren hasierako unetan. Kasu guztietan %95eko ekoizpena

lortu zen 300 PLU baino gehiago erabiltzean. Bestaldetik, Lipozyme RM IM-ren

kasuan gehitutako lipasaren kopurua igo ahala ester metilikoen ekoizpena

handitu bazen ere, lortutako ekoizpenik altuena %80koa izan zen. Lipozyme

TL IM-k jokabide berezia izan zuen. Izan ere, erreakzioaren hasierako unetan

(15 minututan) lipasa kopuru guztiek ekoizpen bera lortu zuten, baina denbora

luzeagotan bakarrik 900 eta 1200 PLU erabilita lortu ziren %30eko baino

handiagoko ekoizpenak. Hortik aurrera, 900 PLU erabilita %50eko ekoizpena

lortu zen 180 minututan eta 1200 PLU gehituta %95 EM lortu zen 90 minututan.

Beraz, Lipozyme TL IM transesterifikazio erreakzioa urrats bakar batean

eta denbora laburrean katalizatzeko gai den entzima bakarra da, ikertutakoen

artean, ester metilikoen %95 baino gehiago emanez. Badirudi prestakin

entzimatikoaren izaeraren menpean dagoela emaitza, euskarriaren kantitateak

bere gain eragin garrantzitsua izan dezakeelarik. Dena den, honek guztiak

ikerkuntza sakonagoa eskatzen du.

Halaber, esterifikazio erreakziorako emaitzarik onenak ematen duen

prestakin entzimatikoa Novozyme 435 da, entzima kantitate baxuenekin,

denbora laburrenean ester metilikoen %95 ematen baitzuen.

III. Emaitzak

167

Transesterifikazio eta esterifikazio emaitzak ikusita Novozym 435 lipasa

aukeratu zen erreakzio jarraiak aztertzeko. Izan ere, lipasa honek EM-en

ekoizpen altuak eman zituen bai olio bai gantz-azido askeak substratu moduan

erabilita. Erreakzioak ohantze finkoko erreaktore batean egin ziren.

Transesterifikazioan %66 EM baino ez ziren lortu, ziurrenik glizerola

euskarriari itsasten zitzaiolako. Azkenik, esterifikazio saioetan %95 EM baino

gehiago lor zitezkeen oso denbora laburrean.

Beraz, hondar koipetsuen ustiapena bi urrats xinpleetan burutua izan

zitekeen: 1) hidrolisia, ur-fasean glizerolaren berreskuratzea ahal egingo

lukeena, eta 2) gantz-azido askeen esterifikazioa, jarraian, era honetan

metanolak eragin zitzakeen arazoak ekidinez.

IV. ONDORIOAK

IV. Ondorioak

169

1. Animalia- eta landare-hondakin koipetsuen birziklapen entzimatikoa

hidrolisiaren bidez GAA eta glizerola emateko eta transesterifikazio edo

esterifikazioaren bidez EM (biodiesela) emateko posible da. Aipatutako

tratamenduen bidez %95eko edo gehiagoko errendimendua lortuz.

2. Hidrolisi-erreakzioetarako 6 lipasa komertzial aztertu dira, Meito Sangyo-k

komertzializatutako Candida rugosa-ren OF lipasa egokiena izanik hurrengo

arrazoiengatik:

Aktibitaterik (392.1±10.0 kU/g) eta produktibitaterik (15000

mol GA/g entzima) altuena zuen.

Txerri-gantza eta hazi-olioa substratu-eredu moduan erabiliz %70-

80ko hidrolisi-mailak lortu ziren 90 U/g koipe erabiliz 3 ordutan.

3. Hondakin koipetsuen %95eko hidrolisia lortu da. Erreakzio-baldintza

orokorrak honako hauek izanik, gantza:ura proportzioa 50:50 (p/b),

erreakzioaren tenperatura 25 edo 37 ºC eta erreakzio denbora 24 ordu.

Baldintza garrantzitsuena gehitutako lipasaren kantitatea izan zen.

Animalia-gantzen hidrolisian %95eko hidrolisi-maila lortzeko lehen

aipatutako erreakzio-baldintzetan OF lipasaren 180 U/g gantz erabili ziren.

Erabilitako landare-olioen hidrolisirako, berriz, OF lipasaren 90 U/g olio

edo gutxiago nahikoak ziren olioaren kalitatearen arabera.

4. Aipatutako baldintzak erreaktore semi-pilotoan egiaztatu ziren emaitzak

errepikatuz.

5. Esterifikazio erreakzioaren mekanismoa Ping Pong Bi Bi dela frogatu da,

substratu bien (alkohola eta azidoa) inhibizio konpetitiboarekin, kate labur

eta ertaineko gantz-azidoak inhibitzaileak izan daitezkeelarik, baina kate

luzekoak ez.

6. Ester metilikoen ekoizpenerako 3 lipasa komertzial immobilizatu aztertu

dira. Horietatik, hondar olioen transesterifikazio erreakzioetan, soilik

Lipozyme TL IM prestakin entzimatikoak ematen du, urrats bakar batean

IV. Ondorioak

170

eta denbora laburrean, ester metilikoen %95 baino gehiagoko ekoizpena.

Novozym 435 eta Lipozyme RM IM prestakin entzimatikoek metanola

zenbait urratsetan gehitzea behar dute %90 eta 75 baino ekoizpen altuagoak

emateko, hurrenez hurren.

7. Transesterifikazio erreakzioetan lortutako emaitzek adierazten dute entzima

immobilizatzeko erabiltzen den euskarriaren izaerak edota kantitateak

nolabaiteko eragina duela substratuen barreiapenean eta entzimak azaltzen

duen aktibitate katalitikoan.

8. Gantz-azido askeen eta metanolaren arteko esterifikazio erreakzioetan

prestakin egokiena Novozym 435 da, %95eko edo gehiagoko

errendimenduak ematen baitu lipasa kantitate gutxien erabilita.

9. Esterifikazio emaitza berdinak lortzen dira prozesua era jarraian, ohantze

finkoko erreaktore batean, burutuz gero. Honela, hondar koipetsuen

ustiapena bi urrats xinpleetan burutua izan daiteke:

1) hidrolisia, ur-fasean glizerolaren berreskuratzea ahal egingo lukeena, eta

2) gantz-azido askeen esterifikazioa, jarraian, era honetan metanolak eragin

zitzakeen arazoak ekidinez.

V. BIBLIOGRAFIA

V. Bibliografia

175

ABIGOR, R.D., UADIA, P.O., FOGLIA, T.A., HAAS, M.J., JONES, K.C., OKPEFA, E., OBIBUZOR, J.U., BAFOR, M.E. (2000) “Lipase-catalysed production of biodiesel fuel from some Nigerian lauric oils” Biochemical Society Transactions 28 (6), 979-981 ADAMCZAK, M., BEDNARSKI, W., SAWICKA-ZUKOWSKA, R., KRAKOWIAK, A., JEDRYCHOWSKA, B. (2000) “The application of lipase preparation from Rhizopus cohnii to animal waste fat biodegradation” Mededelingen- Faculteit Landbouwkundige en toegepaste Biologische Wetenschappen (Universiteit Gent) 65 (3b), 623-626. ADLERCREUTZ, P. (1996) “Modes of using enzymes in organic media” Enzymatic reactions in organic media. A.M.P. Koskinen & A.M. Klibanov eds. Blackie Academic and Professional-Chapman and Hall. Glasgow. AGARWAL, A.K., DAS, L.M. (2001) “Biodiesel development and characterization for use as a fuel in compression ignition engines” Transactions of the American Society of Mechanical Engineers 123, 440-447. AGERBO, P., JØRGENSEN, B.M., JENSEN, B., BØRRESEN, T., GUNHILD, H. (1992) “Enzyme inhibition by secondary lipid autoxidation products from fish oil” Journal of Nutritional Biochemistry 3, 549-553. ALBASI, C., BERTRAND, N., RIBA, J.P. (1999) “Enzymatic hydrolysis of sunflower oil in a standardized agitated tank reactor” Bioprocess Engineering 20, 77-81. ALBASI, C., RIBA, J.P., SOKOLOVSKA, I., BALES, V. (1997) “Enzymatic Hydrolysis of Sunflower Oil: Characterisation of Interface” Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 69, 329-336. ALCANTARA, R., AMORES, J., CANOIRA, L., FIDALGO, E., FRANCO, M.J., NAVARRO, A. (2000) “Catalytic production of biodiesel from soy-bean oil, used frying oil and tallow” Biomass and Bioenergy 18, 515-527. AL-ZUHAIR, S., HASAN, M., RAMACHANDRAN, K.B. (2003) “Kinetics of the enzymatic hydrolysis of palm oil by lipase” Process Biochemistry 38, 1155-1163. ANTOLIN, G., TINAUT, F.V., BRICEÑO, Y., CASTAÑO, V., PÉREZ, C., RAMÍREZ, A.I. (2002) “Optimisation of biodiesel production by sunflower oil transesterification” Bioresource Technology 83, 111-114. ARROYO, R., SÁNCHEZ-MUNIZ, F.J., CUESTA, C., BURGUILLO, F.J., SÁNCHEZ-MONTERO, J.M. (1996) “Hydrolysis of used frying palm olein and sunflower oil catalyzed by porcine pancreatic lipase” Lipids 31 (11), 1133-1139.

V. Bibliografia

176

BAN, K., HAMA, S., NISHIZUKA, K., KAIEDA, M., MATSUMOTO, T., KONDO, A., NODA, H., FUKUDA, H. (2002) “Repeated use of whole-cell biocatalysts immobilized within biomass support particles for biodiesel fuel production” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 17, 157-165. BAN, K., KAIEDA, M., MATSUMOTO, T., KONDO, A., FUKUDA, H. (2001) “Whole cell biocatalyst for biodiesel fuel production utilizing Rhizopus oryzae cells immobilized within biomass support particles” Biochemical Engineering Journal 8, 39-43. BASRI, M., HENG, A.C., RAZAK, C.N.A., WAN YUNUS, W.M.Z., AHMAD, M., RAHMAN, R.N.A., AMPON, K., SALLEH, A.B. (1997) “Alcoholysis of palm oil mid-fraction by lipase from Rhizopus rhizopodiformis” Journal of the American Oil Chemists’ Society 74 (2), 113-116. BATES, M.P., PHILLIPS, P.S. (1999) “Sustainable waste management in the food and drink industry” British Food Journal 101 (8), 580-589 BEDNARSKI, W., ADAMCZAK, M., KOWALEWSKA-PIONTAS, J., ZADERNOWSKI, R. (1994) “Biotechnological methods for the up-grading and modification of animal waste fats” Acta Biotechnologica 14 (4), 387-393 BEISSON, F., TISS, A., RIVIÈRE, C., VERGER, R. (2000) “Methods for lipase detection and assay: a critical review” European Journal of Lipid Science and Technology 102, 133-153. BÉLAFI-BAKÓ, K., KOVÁCS, F., GUBICZA, L., HANCSÓK, J. (2002) “Enzymatic biodiesel production from sunflower oil by Candida antarctica lipase in a solvent-free system” Biocatalysis and Biotransformation 20 (6), 437-439. BELITZ, H.D., GROSCH, W. (1999) “Food Chemistry” 2nd edition. Springer-Verlag, Alemania. BENZONANA, G., DESNUELLE, P. (1965) “Kinetic study of the action of pancreatic lipase on triglycerides in emulsion. Enzymic action in a heterogeneous medium” Biochimica et Biophysica Acta 105 (1), 121-136. BIOCATALYSTS LIMITED (1999) “LipomodTM 34P – L034P-ren fitxa teknikoa” Pontypridd, Wales, UK. BIOSOFT (1999) “EnzFitter”, Biosoft, Britainia Handia. BOEHRINGER-MANNHEIM (1999) “UV method for the determination of glycerol in foodstuffs and other materials” Cat. No. 148270, Biopharm GmbH Darmstadt, Germany. BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO (BOE) (1998) nº 96, de 22 de abril de 1998,

V. Bibliografia

177

Ley 10/1998, de 21 de abril, de residuos. BOUSQUET-DUBOUCH, M.P., GRABER, M., SOUSA, N., LAMARE, S., LEGOY, M.D. (2001) “Alcoholysis catalyzed by Candida antarctica lipase B in a gas/solid system obeys a Ping Pong Bi Bi mechanism with competitive inhibition by the alcohol substrate and water” Biochimica et Biophysica Acta 1550, 90-99. CADENAS, E., SOLS, A. (1960) “Ketokinase activity of the intestinal mucosa” Biochimica et Biophysica Acta 42, 490-498. CANLER, J.P., ROYER, C., DUCHÈNE, PH. (2001) “Aerobic biological treatment of grease from urban wastewater treatment plants” Water Science and Technology 44 (2-3), 219-226. CHEN, J-W., WU, W-T. (2003) “Regeneration of immobilized Candida antarctica lipase for transesterification” Journal of Bioscience and Bioengineering 95 (5), 466-469. CHULALAKSANANUKUL W., CONDORET, J.S., DELORME, P., WILLEMOT, R.M. (1990) “Kinetic study of esterification by immobilized lipase in n-hexane” FEBS Letters 276 (1-2), 181-184 CROOKS, G.E., REES, G.D., ROBINSON, B.H., SVENSSON, M., STEPHENSON, G.R. (1995a) “Comparison of Hydrolysis and Esterification Behavior of Humicola lanuginosa and Rhizomucor miehei Lipases in AOT-Stabilized Water-in-Oil Microemulsions: 1. Effect of pH and Water Content on Reaction Kinetics” Biotechnology and Bioengineering 48, 78-88. CROOKS, G.E., REES, G.D., ROBINSON, B.H., SVENSSON, M., STEPHENSON, G.R. (1995b) “Comparison of Hydrolysis and Esterification Behavior of Humicola lanuginosa and Rhizomucor miehei Lipases in AOT-Stabilized Water-in-Oil Microemulsions: 2. Effect of Temperature on Reaction Kinetics and General Considerations of Stability and Productivity” Biotechnology and Bioengineering 48, 190-196. DANDIK, L., ARIOGLU, G., AKSOY, H.A. (1993) “The Enzymatic Hydrolysis of Used Frying Oil by Native Lipase” Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 119-126. DE RENOBALES, M., AGUD, I., LASCARAY, J.M., MÚGICA, J.C., LANDETA, L.C., SOLOZABAL, R. (1992) “Hydrolysis of animal fats by lipase at temperatures below their melting points” Biotechnology Letters 14 (8), 683-688. DENG, L., XU, X., HARALDSSON, G.G., TAN, T., WANG, F. (2005) “Enzymatic production of alkyl esters through alcoholysis: A critical evaluation of lipases and alcohols” Journal of the American Oil Chemists’ Society 82 (5), 341-

V. Bibliografia

178

347. DOBARGANES, M.C., VELASCO, J., MÁRQUEZ-RUIZ, G. (2002) “La calidad de los aceites y grasas de fritura” Alimentación, Nutrición y Salud 9 (4), 109-118. DOCE (1991) L nº 078 2613/1991. Directiva 91/156/CEE del Consejo de 18 de marzo de 1991 por la que se modifica la Directiva 75/442/CEE relativa a los residuos. DOCE (2001) L nº 147 de 31/5/2001. Reglamento (CE) nº 999/2001 del Parlamento Europeo y del Consejo de 22 de mayo de 2001 por el que se establecen disposiciones para la prevención, el control y la erradicación de determinadas encefalopatías espongiformes transmisibles. DOCE (2002) L nº 273 de 10/10/2002. Reglamento (CE) nº 1774/2002 del Parlamento Europeo y del Consejo de 3 de octubre de 2002 por el que se establecen las normas sanitarias aplicables a los subproductos animales no destinados al consumo humano. DOMÍNGUEZ DE MARÍA, P., MARTÍNEZ-ALZAMORA, F., PÉREZ MORENO, S., VALERO, F., RÚA, M.L., SÁNCHEZ-MORENO, J.M., SINISTERRA, J.V., ALCÁNTARA, A.R. (2002) “Heptyl oleate synthesis as useful tool to discriminate between lipases, proteases and other hydrolases in crude preparations” Enzyme and Microbial Technology 31, 283-288. DORADO, M.P., BALLESTEROS, E., DE ALMEIDA, J.A., SCHELLERT, C., LÖHRLEIN, H.P., KRAUSE, R. (2002) “An alkaly-catalyzed transesterification process for high free fatty acid waste oils” Transactions of the American Society of Agricultural Engineers 45 (3), 525-529. DOSSAT, V., COMBES, D., MARTY, A. (1999) “Continuous transesterification of high oleic sunflower oil in a packed bed reactor: influence of the glycerol production” Enzyme and Microbial Technology 25, 194-200. DOSSAT, V., COMBES, D., MARTY, A. (2002) “Efficient lipase catalysed production of a lubricant and surfactant formulation using a continous solvent-free process” Journal of Biotechnology 97, 117-124. DU, W., XU, Y., LIU, D., LI, Z. (2005) “Study on acyl migration in immobilized Lipozyme TL catalyzed transesterification of soybean oil for biodiesel production” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 37, 68-71. DU, W., XU, Y., LIU, D. (2003) “Lipase-catalysed transesterification of soya bean oil for biodiesel production during continuous batch operation” Biotechnology and Applied Biochemistry 38, 103-106. DU, W., XU, Y., LIU, D., ZENG, J. (2004) “Comparative study on lipase-

V. Bibliografia

179

catalyzed transformation of soybean oil for biodiesel production with different acyl acceptors” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 30, 125-129. EHAA/BOPV (1998) 3/1998 LEGEA, otsailaren 27koa, Euskal Herriko ingurugiroa babesteko lege orokorra. EUROPEAN BIODIESEL BOARD (EBB) (2005) “Statistics: The EU biodiesel industry” http://www.ebb-eu.org/stats.php [2005eko urrian kontsultatuta]. EUROPEAN COMMISSION (EC) (2000) “Libro Blanco de la Seguridad Alimentaria”. EUROPEAN COMMISSION (EC) (2004) DG Health and Consumer Protection “Food and Feed Safety-BSE-Animal By-Products” http://europa.eu.int/comm/food/food/biosafety/bse/byproducts_en.htm [2004ko ekainean kontsultatuta].

FAOSTAT (2005) Agricultural Data “Agricultural Production” htpp://apps.fao.org/page/collections?subset=agriculture&language=ES [2005eko urtarrilean kontsultatuta].

FU, X., ZHU, X., GAO, K., DUAN, J. (1995) “Oil and fat hydrolysis with lipase from Aspergillus sp.” Journal of the American Oil Chemists’ Society 72 (5), 527-531. GANDHI, N.N. (1997) “Applications of Lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 74 (6), 621-634. GANDHI, N.N., SAWANT, S.B., JOSHI, J.B. (1995) “Studies on the Lipozyme-catalyzed synthesis of butyl laurate” Biotechnology and Bioengineering 46, 1-12. GAROU, D. (1998) “Immobilisation de lipases sur supports synthétiques et application à l’hydrolyse de l’huile d’olive en réacteur de laboratoire. Traitement enzymatique des effluents gras industriels par des lipases en solution” Thèse présentée pour l’obtention du grade de Docteur ès Sciences de l’Université de Technologie de Compiègne.. GERTZ, C. (2000) “Chemical and physical parameters as quality indicators of used frying fats” European Journal of Lipid Science and Technology 102, 566-572. GOLDBERG, M., THOMAS, D., LEGOY, M-D. (1990) “The control of lipase-catalysed transesterification and esterification reaction rates: Effect of substrate polarity, water activity and water molecules on enzyme activity” European Journal of Biochemistry 190, 603-609. GRYGLEWICZ, S., PIECHOCKI, W., GRYGLEWICZ, G. (2003) “Preparation of polyol esters based on vegetable and animal fats” Bioresource Technology 87, 35-39.

V. Bibliografia

180

GUNSTONE, F. D. (1999) “Enzymes as biocatalysts in the modification of natural lipids” Journal of the Science of Food and Agriculture 79, 1535-1549. GUNSTONE, F.D. (1994) “Fatty acid structure” The Lipid Handbook, 2nd ed. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., & Padley, F.B. Chapman & Hall. London. GÜVENÇ, A., KAPUCU, N., MEHMETOGLU, Ü. (2002) “The production of isoamyl acetate using immobilized lipases in a solvent-free system” Process Biochemistry 38, 379-386. HAAS, M.J., MICHALSKI, P.J., RUNYON, S., NUNEZ, A., SCOTT, K.M. (2003) “Production of FAME from acid oil, a by-product of vegetable oil refining” Journal of the American Oil Chemists’ Society 80 (1), 97-102. HABA, E., BRESCO, O., FERRER, C., MARQUÉS, A., BUSQUETS, M., MANRESA, A. (2000a) “Isolation of lipase-secreting bacteria by deploying used frying oil as selective substrate” Enzyme and Microbial Technology 26, 40-44. HABA, E., ESPUNY, M.J., BUSQUETS, M., MANRESA, A. (2000b) “Screening and production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oils” Journal of Applied Microbiology 88, 379-387. HABA, E., PINAZO, A, JAUREGUI, O., ESPUNY, M.J., INFANTE, M.R., MANRESA, A. (2003) “Physicochemical characterization and antimicrobial properties of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCBIM 40044” Biotechnology and Bioengineering 81 (3), 316-322. HAMILTON, S., HAMILTON, R.J., SEWELL, P.A. (1992) “Extraction of lipids and derivative formation” Lipid Analysis: A Practical Approach. R.J. Hamilton & S. Hamilton. IRL Press. Oxford. HEIPIEPER, H.J., WEBER, F.J., SIKKEMA, J., KEWELOH, H., DE BONT, J.A.M. (1994) “Mechanisms of resistance of whole cells to toxic organic solvents” TIBTECH 12, 409-415. HENDERSON, R.J., BURKOW, I.C., MILLAR R.M. (1993) “Hydrolysis of fish oils containing polymers of triacylglicerols by pancreatic lipase in vitro” Lipids 28 (4), 313-319. HENDERSON, R.J., TOCHER, D.R. (1992) “Thin-Layer Chromatography” Lipid Analysis: A Practical Approach. R.J. Hamilton & S. Hamilton. IRL Press. Oxford. HOSHINO, T., YAMANE, T., SHIMIZU, S. (1990) “Selective hydrolysis of fish oil by lipase to concentrate n-3 polyunsaturated fatty acids” Agricultural and Biological Chemistry 54 (6), 1459-1467.

V. Bibliografia

181

HSU, A.F., JONES, K., FOGLIA, T.A., MARMER, W.N. (2002) “Immobilized lipase-catalysed production of alkyl esters of restaurant grease as biodiesel” Biotechnology and Applied Biochemistry 36, 181-186. HSU, A.F., JONES, K., MARMER, W.N., FOGLIA, T.A. (2001) “Production of alkyl esters from tallow and grease using lipase immobilized in a phyllosilicate sol-gel” Journal of the American Oil Chemists’ Society 78 (6), 585-588. HULT K., HOLMQUIST M. (1997) “Kinetics, molecular modeling, and synthetic applications with microbial lipases” Methods in Enzymology. Vol. 286. Lipases. Part B. Enzyme characterization and utilization. Edited by Byron Rubin and Edgard A. Dennos. ISO, M., CHEN, B., EGUCHI, M., KUDO, T., SHRESTHA, S. (2001) “Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 16, 53-58. IUPAC (1979) Método II.D.1. “Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives”. 6th Edition. Pergamon Press. Oxford. IUPAC (1979) Método II.D.2. “Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives”. 6th Edition. Pergamon Press. Oxford. IWAI, M., TSUJISAKA, Y. (1984) “Fungal lipase” Lipases. B. Borgström & H.L. Brockman. Elsevier, Amsterdam. JACKSON, M.A., KING, J.W. (1996) “Methanolysis of seed oils in flowing supercritical carbon dioxide” Journal of the American Oil Chemists’ Society 73 (3), 353-356. JONZO, M.D., HIOL, A., ZAGOL, I., DRUET, D., COMEAU, L-C. (2000) “Concentrates of DHA from fish oil by selective esterification of cholesterol by immobilized isoforms of lipase from Candida rugosa” Enzyme and Microbial Technology 27, 443-450. KAIEDA, M., SAMUKAWA, T., KONDO, A., FUKUDA, H. (2001) “Effect of methanol and water contents on production of biodiesel fuel from plant oil catalyzed by various lipases in a solvent-free system” Journal of Bioscience and Bioengineering 91 (1), 12-15. KAIEDA, M., SAMUKAWA, T., MATSUMOTO, T., BAN, K., KONDO, A., SHIMADA, Y., NODA, H., NOMOTO, F., OHTSUKA, K., IZUMOTO, E., FUKUDA, H. (1999) “Biodiesel fuel production from plant oil catalyzed by Rhizopus oryzae lipase in a water-containing system without an organic solvent” Journal of Bioscience and Bioengineering 88 (6), 627-631. KALUZNY, M.A., DUNCAN, L.A., MERRITT, M.U., EPPS, D.E. (1985) “Rapid

V. Bibliografia

182

separation of lipid classes in high yield and purity using bonded phase columns” Journal of Lipid Research 26, 135-140. KARAM, J., NICELL, J.A. (1997) “Potential applications of enzymes in waste treatment” Journal of Chemical Technology and Biotechnology 69, 141-153. KILDIRAN, G., YÜCEL, S.O., TÜRKAY, S. (1996) “In-situ alcoholysis of soybean oil” Journal of the American Oil Chemists’ Society 73 (2), 225-228. KIM, I-H., KIM, H., LEE, K-T., CHUNG, S-H., KO, S-N. (2002) “Lipase-catalyzed acidolysis of perilla oil with caprylic acid to produce structured lipids” Journal of the American Oil Chemists’ Society 79 (4), 363-367. KLIMKIEWICZ, R., FABISZ, E., MORAWSKI, I., GRABOWSKA, H., SYPER, L. (2001) “Ketonization of long chain esters from transesterification of technical waste fats” Journal of Chemical Technology and Biotechnology 76, 35-38. KÖRBITZ, W. (1999) “Biodiesel production in Europe and North America, an encouraging prospect” Renewable Energy 16, 1078-1083. KÖSE, O., TÜTER, M., AKSOY H.A. (2002) “Immobilized Candida antarctica lipase-catalyzed alcoholysis of cotton seed oil in a solvent free medium” Bioresource Technology 83, 125-129. KOSUGI, Y., SUZUKI, H., FUNADA, T. (1988) “Hydrolysis of beef tallow by lipase from Pseudomonas sp.“ Biotechnology and Bioengineering 31 (4), 349-56. KRAWCZYK, T. (1996) “Biodiesel. Alternative fuel makes inroads but hurdles remain” INFORM 7 (8), 800-815. KRISHNA, S.H., KARANTH, N.G. (2001) “Lipase-catalyzed synthesis of isoamyl butyrate: A kinetic study” Biochimica et Biophysica Acta 1547, 262-267. KRISHNA, S.H., PRAPULLA, S.G., KARANTH, N.G. (2000) “Enzymatic synthesis of isoamyl butyrate using immobilized Rhizomucor miehei lipase in non-aqueous media” Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 25, 147-154. LAI, C.C., SITI, Z., VALI, S.R., JU, Y.H. (2005) “Lipase-catalyzed production of biodiesel from rice bran oil” Journal of Chemical Technology and Biotechnology 80, 331-337. LARSSON, K., QUINN, P.J. (1994) “Physical properties: structural and physical characteristics” The Lipid Handbook, 2nd ed. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., & Padley, F.B. Chapman & Hall. London. LEE, I., JOHNSON, L.A., HAMMOND, E.G. (1995) “Use of branched-chain

V. Bibliografia

183

esters to reduce the crystallization temperature of biodiesel” Journal of the American Oil Chemists’ Society 72 (10), 1155-1160. LEE, K.T., FOGLIA, T.A., CHANG, K.S. (2002) “Production of alkyl ester as biodiesel from fractionated lard and restaurant grease” Journal of the American Oil Chemists’ Society 79 (2), 191-195. LEUNG, D.Y.C. (2001) “Development of a clean biodiesel fuel in Hong Kong using recycled oil” Water, Air and Soil Pollution 130, 277-282. LINKO, Y-Y., LÄMSÄ, M., HUHTALA, A., RANTANEN, O. (1995) “Lipase biocatalysis in the production of esters” Journal of the American Oil Chemists’ Society 72 (11), 1293-1299. LINKO, Y-Y., LÄMSÄ, M., WU, X., UOSUKAINEN, E., SEPPÄLÄ, J., LINKO, P. (1998) “Biodegradable products by lipase biocatalysis” Journal of Biotechnology 66, 41-50. MA, F., HANNA, M.A. (1999) “Biodiesel production: a review” Bioresource Technology 70, 1-15. MACKENZIE, A.D., STEVENSON, D.E. (2000) “Production of high-oleic acid tallow fractions using lipase-catalyzed directed interesterification, using both batch and continuous processing” Enzyme and Microbial Technology 27, 302-311. MAHADIK, N.D., PUNTAMBEKAR, U.S., BASTAWDE, K.B., KHIRE, J.M., GOKHALE, D.V. (2002) “Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid state fermentation” Process Biochemistry 38 (5), 715-721. MARTINELLE M., HULT K. (1994) "Kinetics of triglyceride lipases" Lipases: Their structure, biochemistry and application. Paul Wolley & Steffen B. Petersen. Cambridge University Press. MATSUMOTO, T., TAKAHASHI, S., KAIEDA, M., UEDA, M., TANAKA, A., FUKUDA, H., KONDO, A. (2001) “Yeast whole-cell biocatalyst constructed by intracellular overproduction of Rhizopus oryzae lipase is applicable to biodiesel fuel production” Applied Microbiology and Biotechnology 57, 515-520. MINISTERIO DE MEDIO AMBIENTE (2000) “Plan Nacional de Residuos Urbanos (2000-2006)”. MINNING, S., VIND, J., SCHROEDER GLAD, S. O., DANIELSEN, S., BORCH, K. (2002) “Lipolytic enzyme variant” WO02055679 patent. MITTELBACH, M. (1990) “Lipase catalyzed alcoholysis of sunflower oil” Journal of the American Oil Chemists’ Society 67 (3), 168-70.

V. Bibliografia

184

MITTELBACH, M., POKITS, B., SILBERHOLZ, A. (1992) “Production and fuel properties of fatty acid methyl esters from used frying oil” Liquid Fuels and Renewable Resources. Proceedings of the Alternative Energies Conference 74-8. MONTERO, S., BLANCO, VIRTO, M. D., LANDETA, L.C., AGUD, I., A., SOLOZABAL, R., LASCARAY J.M., DE RENOBALES, M., LLAMA, M.J., SERRA, J.L. (1993) “Immobilization of Candida rugosa lipase and some properties of the immobilized enzyme” Enzyme and Microbial Technology 15, 239-247. NAKA, Y. (1987) “Study on the assay of lipase with emulsified substrate” Yukagaku 36 (10), 821-825. NELSON, L.A., FOGLIA, T.A., MARMER, W.N. (1996) “Lipase-catalyzed production of biodiesel” Journal of the American Oil Chemists’ Society 73 (8), 1191-1195. NEVES PETERSEN, M.T., FOJAN, P., PETERSEN, S.B. (2001) “How do lipases and esterases work: the electrostatic contribution” Journal of Biotechnology 85, 115-147. NOOR, I.M., HASAN, M., RAMACHANDRAN, K.B. (2003) “Effect of operating variables on the hydrolysis rate of palm oil by lipase” Process Biochemistry 39, 13-20. NOVO NORDISK (1999a) LipolaseTM-ren fitxa teknikoa (B434-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (1999b) LipopanTM BG-ren fitxa teknikoa. Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (1999c) Novozym SP 398-ren fitxa teknikoa (B 470c-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (2000a) Lipozyme® RM IM-ren fitxa teknikoa (B 347d-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (2000b) Lipozyme® TL IM-ren fitxa teknikoa (B 1276b-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (2000c) Novozym 435®-ren fitxa teknikoa (B 606d-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (2000d) Lipase Activity. PLU assay. Determination by capillary-GC (B 1322a-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVOZYMES (2005) “Enzymatic interesterification using Lipozyme TL IM in laboratory scale batch reactors” 030206 Cookbook for enzymatic interesterification.

V. Bibliografia

185

OCKERMAN, H.W., HANSEN, C.L. (1994) Industrialización de subproductos de origen animal. Ed. ACRIBIA, S.A. Zaragoza. PADLEY, F.B., GUNSTONE, F.D., HARWOOD, J.L. (1994) “Ocurrence and characteristics of oils and fats” The Lipid Handbook, 2nd ed. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., & Padley, F.B. Chapman & Hall. London. PEREIRA, E.B., DE CASTRO, H.F., DE MORAES, F.F., ZANIN, G.M. (2001) “Kinetic studies of lipase from Candida rugosa” Applied Biochemistry and Biotechnology 91-93, 739-752. PIROZZI, D., GRECO G. Jr. (2004) “Activity and stability of lipases in the síntesis of butyl lactate” Enzyme and Microbial Technology 34, 94-100. PLANK, C., LORBEER, E. (1995) “Simultaneous determination of glycerol, and mono-, di- and triglycerides in vegetable oil methyl esters by capillary gas chromatography” Journal of Chromatography A 697, 461-468. PLOU, F.J., SOGO, P., CALVO, M.V., BURGUILLO, F.J., BALLESTEROS, A. (1997) “Kinetic and enantioselective behaviour of isoenzymes A and B from Candida rugosa lipase in the hydrolysis of lipids and esters” Biocatalysis and Biotransformation 15, 75-89. POKORNÝ, J. (1998) “Substrate influence on the frying process” Grasas y Aceites 49 (3-4), 265-270. QUAGLIA, G., COMENDADOR, J., FINOTTI, E. (1998) “Optimization of frying process in food safety” Grasas y Aceites 49 (3-4), 275-281. RAMAMURTHI, K., McCURDY, A.R. (1994) “Lipase-catalyzed esterification of oleic acid and methanol in hexane-A kinetic study” Journal of the American Oil Chemists’ Society 71 (9), 927-930. ROGALSKA, E., CUDREY, C., FERRATO, F., VERGER, R. (1993) “Stereoselective hydrolysis of triglycerides by animal and microbial lipases” Chirality 5 (1), 24-30. ROSEVEAR, A., KENNEDY, J.F., CABRAL, J.M.S. (1987) Immobilised enzymes and cells. Adam Hilger ed. Bristol. RÚA, M.L., DÍAZ-MAURIÑO, T., FERNÁNDEZ, V.M., OTERO, C., BALLESTEROS, A. (1993) “Purification and characterization of two distinct lipases from Candida cylindracea” Biochimica et Biophysica Acta 1156, 181-189. SALZBERG, H.W. (1991) From Caveman to Chemist: Circumstances and Achievements. American Chemical Society, Washington, D.C.

V. Bibliografia

186

SAMUKAWA, T, KAIEDA, M., MATSUMOTO, T., BAN, K., KONDO, A., SHIMADA, Y., NODA, H., FUKUDA, H. (2000) “Pretreatment of immobilized Candida antarctica lipase for biodiesel fuel production from plant oil” Journal of Bioscience and Bioengineering 90 (2), 180-183. SARDA, L., DESNUELLE, P. (1958) “Action de la lipase pancréatique sur les esters en émulsion” Biochimica et Biophysica Acta 30 (3), 513-521. SAUCEDO, E. (2001) “El biodiesel” Ingenieria Química 20, 19-29. SAXENA, R.K., DAVIDSON, W.S., SHEORAN, A., GIRI, B. (2003) “Purification and characterization of an alkaline thermostable lipase from Aspergillus carneus” Process Biochemistry 39 (2), 239-247. SCHMID, R.D., VERGER, R. (1998) “Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications” Angewandte Chemie International Edition 37, 1608-1633. SEGEL, I.H. (1975) Enzyme kinetics: Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme-systems. Wiley Interscience, New York. SEGEL, I.H. (1976) Biochemical Calculations: How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry. 2nd Ed. Wiley Interscience, New York. SHIMADA, Y., WATANABE, Y., SAMUKAWA, T., SUGIHARA, A., NODA, H., FUKUDA, H., TOMINAGA, Y. (1999) “Conversion of vegetable oil to biodiesel using immobilized Candida antarctica lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 76 (7), 789-793. SHIMADA, Y., WATANABE, Y., SUGIHARA, A., TOMINAGA, Y. (2002) “Enzymatic alcoholysis for biodiesel fuel production and application of the reaction to oil processing” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 17, 133-142. SONNET, P.E. (1988) “Lipase selectivities” Journal of the American Oil Chemists’ Society 65 (6), 10-14. SOUMANOU, M.M., BORNSCHEUER, U.T. (2003a) “Improvement in lipase-catalyzed synthesis of fatty acid methyl esters from sunflower oil” Enzyme and Microbial Technology 33, 97-103. SOUMANOU, M.M., BORNSCHEUER, U.T. (2003b) “Lipase-catalyzed alcoholysis of vegetable oils” European Journal of Lipid Science and Technology 105, 656-660. STADHOUDERS, J., VERINGA, H.A. (1973) “Fat hydrolysis by lactic acid bacteria in cheese” Netherlands Milk Dairy Journal 27, 77-91. STAMATIS, H., XENAKIS, A., MENGE, U., KOLISIS, F.N. (1993) “Kinetic

V. Bibliografia

187

study of lipase catalyzed esterification reactions in water-in-oil microemulsions” Biotechnology and Bioengineering 42, 931-937. STEVENSON, D.E., ROGER, A.S., FURNEAUX, R.H. (1994) “Near-quantitative production of fatty acid alkyl esters by lipase-catalyzed alcoholysis of fats and oils with adsorption of glycerol by silica gel” Enzyme and Microbial Technology 16, 478-483. STOLL, U., GUPTA, H. (1997) “Management strategies for oil and grease residues” Waste Management & Research 15, 23-32. SVENDSEN, A. (2000) “Lipase protein engineering” Biochimica et Biophysica Acta 1543, 223-238. TABERSKI, J.S., PETERSON, C.L., THOMPSON, J., HAINES, H. (1999) “Using biodiesel in Yellowstone National Park – Final report of the “Truck in the Park” project” Society of Automotive Engineers Technical Paper Series 1999-01-2798. TORRES, C.F., MUNIR, F., BLANCO, R.M., OTERO, C., HILL Jr., C.G. (2002) “Catalytic tranesterification of corn oil and tristearin using immobilized lipases from Thermomyces lanuginosa” Journal of the American Oil Chemists’ Society 79 (8), 775-781. TYAGI, V.K., VASISHTHA, A.K. (1996) “Changes in the characteristics and composition of oils during deep-fat frying” Journal of the American Oil Chemists’ Society 73 (4), 499-506. UHLIG, H. (1998) Industrial enzymes and their applications. John Wiley and Sons, Inc., Nueva York. USDA (2003) Foreign Agricultural Service “Production Estimates and Crop Assessment Division” http://www.fas.usda.gov/pecad/highlights/2003/09/biodiesel3/index.htm [2003ko irailean kontsultatuta].

VAYSSE, L., LY, A., MOULIN, G., DUBREUCQ, E. (2002) “Chain-length selectivity of various lipases during hydrolysis, esterification and alcoholysis in biphasic aqueous medium” Enzyme and Microbial Technology 31, 648-655. VÁZQUEZ-LIMA, F., PYLE, D.L., ASENJO, J.A. (1995) “Factors affecting the esterification of lauric acid using an immobilized biocatalysts: Enzyme characterization and studies in a well-mixed reactor” Biotechnology and Bioengineering 46, 69-79. VILLENEUVE, P., FOGLIA, T.A. (1997) “Lipase specificities: Potential application in lipid bioconversions” INFORM 8 (6), 640-650.

http://www.fas.usda.gov/pecad/highlights/2003/09/biodiesel3/index.htm

V. Bibliografia

188

VIRTO, M. D., AGUD, I., MONTERO, S., BLANCO, A., SOLOZABAL, R., LASCARAY, J.M., LLAMA, M.J., SERRA, J.L., LANDETA, L.C., DE RENOBALES, M. (1994) “Hydrolysis of animal fats by immobilized Candida rugosa lipase” Enzyme and Microbial Technology 16, 61-65. VIRTO, M.D., LASCARAY, J.M., SOLOZABAL, R., DE RENOBALES, M. (1991) “Enzymic hydrolysis of animal fats in organic solvents at temperatures below their melting points” Journal of the American Oil Chemists’ Society 68 (5), 324-327. VITORIA-GASTEIZko UDALA (2000) “Udal Hondakinak Kudeatzeko Plan Integrala (UHKPI, 2000-2006) - Plan Integral de Gestión de Residuos Municipales de Vitoria-Gasteiz (PIGRM, 2000-2006)”. VON WEDEL, R. (1999) Technical handbook for marine biodiesel in recreational boats. Prepared for National Renewable Energy Laboratory, US Department of Energy. VORDERWÜLBECKE, T., KIESLICH, K., ERDMANN, H. (1992) “Comparison of lipases by different assays” Enzyme and Microbial Technology 14, 631-639. VULFSON, E.N. (1994) “Industrial applications of lipases” Lipases: their structure, biochemistry & application. Paul Wolley & Stephen B. Petersen. Cambridge University Press. 271-288. WANG, Y.J., SHEU, J.Y., WANG, F.F., SHAW, J.F. (1988) “Lipase-catalyzed oil hydrolysis in the absence of added emulsifier” Biotechnology and Bioengineering 31, 628-633. WATANABE, Y, SHIMADA, Y., SUGIHARA, A., NODA, H., FUKUDA, H., TOMINAGA, Y. (2000) “Continuous production of biodiesel fuel from vegetable oil using immobilized Candida antarctica lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 77 (4), 355-360. WATANABE, Y, SHIMADA, Y., SUGIHARA, A., TOMINAGA, Y. (2001) “Enzymatic conversion of waste edible oil to biodiesel fuel in a fixed-bed bioreactor” Journal of the American Oil Chemists’ Society 78 (7), 703-707. WATANABE, Y., PINSIRODOM, P., NAGAO, T., KOBAYASHI, T., NISHIDA, Y., TAKAGI, Y., SHIMADA, Y. (2005) “Production of FAME from acid oil model using immobilized Candida antarctica lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 82 (11), 825-831. WATANABE, Y., SHIMADA, Y., BABA, T., OHYAGI, N., MORIYAMA, S., TERAI, T., TOMINAGA, Y., SUGIHARA, A. (2002) “Methyl esterification of waste fatty acids with immobilized Candida antartica lipase” Journal of Oleo Science 51 (10), 655-661.

V. Bibliografia

189

WEHLMANN, J. (1999) “Use of esterified rapeseed oil as plasticizer in plastics processing” Fett/Lipid 101 (7), 249-256. WILSON, E.K. (2002) “Biodiesel revs up” Chemical and Engineering News 27, 46-49. WU, H., ZONG, M.I., LUO, Q., WU, H. (2003) “Enzymatic conversion of waste oil to biodiesel in a solvent-free system” Preparation Paper-American Chemistry Society. Division Fuel Chemistry 48 (2), 533-534. XU, X. (2000) “Production of specific-structured triacylglycerols by lipase-catalyzed reactions: a review” European Journal of Lipid Science and Technology 287-303. XU, X., BALCHEN, S., HØY, C-E., ADLER-NISSEN, J. (1998) “Production of specific-structured lipids by enzymatic interesterification in a pilot continuous enzyme bed reactor” Journal of the American Oil Chemists’ Society 75 (11), 1573-1579. XU, X., PORSGAARD, T., ZHANG, H., ADLER-NISSEN, J., HØY, C-E. (2002) “Production of structured lipids in a packed-bed reactor with Thermomyces lanuginosa lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 79 (6), 561-565. XU, Y., DU, W., ZENG, J., LIU, D. (2004) “Conversion of soybean oil to biodiesel fuel using Lipozyme TL IM in a solvent-free medium” Biocatalysis and Biotransformation 22 (1), 45-48. YAN, H., NORITOMI, H., NAGAHAMA, K. (2001) “Concentration of DHA in tuna oil using lipase catalysed hydrolysis” 6th World Congress of Chemical Engineering Melbourne, Australia 23-27 September 2001. YONG, Y.P., AL-DURI, B. (1996) “Kinetic studies on immobilised lipase esterification of oleic acid and octanol” Journal of Chemical Technology and Biotechnology 65, 239-248. YOUNG, F.V.K., POOT, C., BIERNOTH, E., KROG, N., DAVIDSON, N.G.J., GUNSTONE, F.D. (1994) “Processing of oils and fats” The Lipid Handbook, 2nd ed. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., & Padley, F.B. Chapman & Hall. London. ZANIN, G.M., DE MORAES, F.F. (1998) “Thermal stability and energy of deactivation of free and immobilized amyloglucosidase in the saccharification of liquefied Cassava starch” Applied Biochemistry and Biotechnology 70-72, 383-394. ZHANG, H., XU, X., NILSSON, J., MU, H., ADLER-NISSEN, J., HØY, C-E. (2001) “Production of margarine fats by enzymatic interesterification with silica-granulated Thermomyces lanuginosa lipase in a large-scale study” Journal of the American Oil Chemists’ Society 78 (1), 57-64.

V. Bibliografia

190

ZHANG, Y., DUBÉ, M.A., McLEAN, D.D., KATES, M. (2003) “Biodiesel production from waste cooking oil: 1. Process design and technological assessment” Bioresource Technology 89, 1-16.

Hondakin koipetsuen ustiapena entzimen bidez · Laborategiko erreaktoreak (0.5 L) 48 3.2. Bost...

Documents

Transcript of Hondakin koipetsuen ustiapena entzimen bidez · Laborategiko erreaktoreak (0.5 L) 48 3.2. Bost...