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8/18/2019 identificacionmicrobiana-160413185618

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PRACTICA No. 5

ESTRUCTURA DE LOS MICROORGANISMOSIDENTIFICACION MICROBIANA

OBJETIVO

Dar a conocer al estudiante los diferentes métodos de laboratorio para la identificación

bacteriana, medios de cultivos, morfología macroscópica, morfología microscópica y técnicas

para la realización de frotis directos (extendidos de muestras clínicas), frotis indirectos

(extendidos a partir de cultivos), coloraciones simples y compuestas.

Paciente

Historia clínica y exploraciónocalización de la infección

!studio "ematológico y !x#menes microbiológicos

$io%uímico

&m#genes diagnosticas' Métodos directos, *+, !xamen microscópico +ultivo, identificación y antibiograma Detección de antígenos específicos

Detección de D-, - especifico

Métodos Idirectos

/ruebas serológicas en suero

DIAGNOSTICO ETIOLOGICO


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Mor!o"o#$% &%crosc'(ic%. Medios de c)"ti*o

as bacterias para su crecimiento deben tener las condiciones necesarias para desarrollar un

nuevo protoplasma, estos re%uerimientos est#n dados por'

- edios de cultivo- tmosfera- pH especifico- *emperatura- *iempo suficiente para su reproducción

*odo material en el cual los microorganismos puedan reproducirse es un medio de cultivo, estos

medios se preparan sobre una sustancia o base llamada agar %ue se extrae de algas marinas al

%ue se puede adicionar sustancias nutritivas como 0angre de cordero, vitaminas, extracto de

levadura, cloruro de sodio, colorantes e indicadores,

Ti(os de &edios de c)"ti*os+

1. 0eg2n la consistencia dada por la cantidad de agar'

- So"idos- L$,)idos -- Se&is'"idos

3. 0eg2n el aporte nutritivo y la utilidad en el laboratorio'

- Bsicos+ Dise4ados para el crecimiento y el mantenimiento de poblaciones bacterianas.os m#s comunes son' *ripticasa soya, agar nutritivo y ueller Hinton.

- Eri,)ecidos+ edios altamente nutritivos compuestos por un medio b#sico ysuplemento nutritivo como sangre o "emoglobina.

- Se"ecti*os+ !specíficos para bacterias %ue se desarrollan en presencia de compuestosagregados al medio de cultivo, in"ibiendo el crecimiento de otros.

- Se"ecti*os di!ereci%"es+ estos medios se adicionan colorantes o sustancias %uímicas,m#s un indicador de pH, permitiendo la diferenciación de distintos tipos de bacterias y

la selección de diferentes géneros.

- Medios di!ereci%"es+ o pruebas bio%uímicas. 0on medios con diferentes sustratosutilizados para conocer el comportamiento metabólico de las bacterias y poderlos

clasificar en género y especie.

Mor!o"o#$% &icrosc'(ic%. Co"or%cioes


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Prici(%"es co"or%cioes )ti"i/%d%s e &icro0io"o#$%

- Co"or%cioes si&("es+ *inción de las bacterias por la aplicación de una sola solucióncolorante. 0e utiliza para observar morfología.

- Co"or%ci' co&()est% o di!ereci%"+ /one de manifiesto diferencias entre variascélulas bacterianas o las partes de una bacteria, se utilizan varios colorantes. !5.'

coloración de 6ram, coloración de 7ie"l -eelsen.

- Tici' e#%ti*%+ *écnica por la cual las células bacterianas o f2ngicas sin te4ir se"acen visibles sobre una película oscura como la tinción de tinta c"ina

Co"or%cioes co&()est%s+ Co"or%ci' de GRAM

os métodos de coloración de los extendidos de diferentes muestras, fueron inicialmente

descritas por /aul !rlic" y obert 8oc", %uienes al aplicarlos, observaron numerosas

estructuras %ue no "abían sido vistas anteriormente. !n 199:, +"ristian 6ram ideo una de las

coloraciones m#s importantes, la cual le permitió distinguir bacterias %ue tenían morfología

similar, pero %ue se coloreaban diferente.

!n 1;31 Huc


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a coloración de 6ram se basa en las diferencias existentes en la composición %uímica de la

pared celular de las bacterias, lo %ue les confiere o no la capacidad de retener el cristal violeta,

colorante inicial del procedimiento..

a pared celular de las bacterias 6ram positivas, est# compuesta en un =>?@>A por el

peptidoglucano y en un :>.=>A por #cidos teicoicos y polisac#ridos. !l peptidoglucano(llamado también mureina, capa de glicopeptido o mucopeptido) est# compuesto de -?

acetilglusamina y -?acetil muramico.

!n las bacterias 6ram positivas, el cristal violeta se fi5a a la pared celular y con la adición del

lugol %ue act2a como mordiente, se produce el comple5o cristal violeta.iodo, el cual es resistente

a la decoloración

a pared celular de las bacterias 6ram negativas est# compuesta por una delgada capa de

petidoglucano el cual constituye el =?1>A de la pared celular, recubriendo esta capa se

encuentra una membrana externa comple5a, constituida por fosfolípidos (3>.B>A),

lipopolisacaridos (B>A) y proteínas (:>?=>A),

!l decolorante act2a como un solvente, sobre los lípidos presentes en las membranas de las

bacterias 6ram negativas, los poros se aumentan de tama4o y se libera el comple5o cristal

violeta?iodo y la bacteria toma el colorante secundario o de contraste (safranina).

Ctros microorganismos como las levaduras se colorean r#pidamente de color violeta cuando se

aplica la coloración de 6ram a una preparación seca las células inflamatorias (leucocitos)

aparecen de color rosado y las células epiteliales de color rosado o violeta dependiendo de lo

grueso del extendido y del fibrinógeno presente en el moco y los glóbulos ro5os se colorean de

rosado.

1. Pri&er co"or%te+ crist%" *io"et%. !s un colorante b#sico %ue en contacto con lascélulas cargadas negativamente, reacciona con ella coloreBandolas de color violeta.

3. So")ci' &ordiete1 ")#o"+ Ei5a las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante ylas células.

B. A#ete deco"or%te1 %"co2o" %ceto%+ !s un disolvente org#nico:. Co"or%te de cotr%ste1 s%!r%i%+ !s un colorante b#sico.

Procedi&ieto de "% co"or%ci' de Gr%&

1. /reparar un frotis delgado a partir de cultivos (utilizar solución salina estéril), o de

especímenes clínicos (abscesos, esputos, secreciones, lí%uidos etc.,) en una l#mina

portaob5etos nueva y limpia.

3. De5ar secar al medio ambiente

B. Ei5ar al calor

:. +olocar cristal violeta sobre el portaob5etos y de5ar actuar por un minuto

=. !n5uagar con agua y escurrir

@. gregar la solución de lugol y de5ar actuar por un minuto

F. !scurrir la solución y en5uagar con agua

9. Decolorar con alco"ol?acetona por 9 segundos y en5uagar con agua

9. gregar la solución de safranina y de5ar actuar por 30 segundos, enjuagar,

escurrir y secar al aire

Gna vez te4ido se observa con lente de inmersión (1>>), usando aceite de inmersión.


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!n extendidos directos de material org#nico (muestras clínicas o especímenes) se eval2a las

células bacterianas, su morfología y comportamiento frente al 6ram, su disposición o

agrupación y otros elementos como leucocitos, "ematíes y células epiteliales.

C"%si!ic%ci' de "%s 0%cteri%s

a coloración de 6ram es usada en el laboratorio de microbiología para clasificar las bacterias

con base en su'

- FORMA- TAMA3O- DISPOSICION O ARREGLO- REACCION AL GRAM

For&%+ as bacterias pueden tener forma de'

- !sférica denominadas cocosI

- +ilíndrica o en forma de barras denominadas bacilosI o cocobacilosI- !n espiral o "elicoidales

T%&%4o+ !ste par#metro est# relacionado con el di#metro de los cocos o la longitud de los bacilos. !stos 2ltimos pueden observarse cortos, largos o como filamentos.

Disposición o arreglo: Se refiere a la agrupación o arreglo de las bacterias.

os cocos pueden estar dispuestos en:

- /ares (diplococos)- +adenas, características del genero Streptococcus

- acimos, características del genero Staphylococos- *étradas, (dispuestas en cuatro)

os bacilos no se agrupan con la variedad de modelos de los cocos, pero pueden presentarse en

forma de empalizadas, letras c"inas o cadenas cortas.

as bacterias de forma "elicoidal se presentan como células individuales, las diversas especies

ofrecen notables diferencias en longitud, en el n2mero y amplitud de las espirales y en la rigidez

de las paredes celulares.

Re%cci' %" Gr%&

0eg2n la reacción al 6ram, las bacterias se dividen en Gr%& (ositi*%s1 las %ue se ti4en de color violeta, y en Gr%& e#%ti*%s1 las %ue se ti4en de color rosado,

a división de las bacterias en 6ram positivas y en 6ram negativas est# dada por las diferenciasfísicas %uímicas en la composición de la pared celular.,


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UTILIDAD

!0*! !!- *&!-! JC D&6-C0*&+C K !0 D! &-EC! &-!D&*C !-

0 0&6G&!-*!0 G!0*0'

- + - !0/G*C- C&-- 0-6!- $0+!0C0- 0!+!+&C-!0L

-C *&!-! JC D&6-C0*&+C !-'

- G!0*0 E&-6!0- -0CE&-6!0- !0 D! G0C &&*DC !- G!0*0 D! *!& E!+.(0olo en el 6ram

modificado, para el diagnóstico presuntivo de infecciones por +ampylobacter sp.)

-PROCEDIMIENTO+!s importante estandarizar los métodos de coloración para obtener resultados confiables

y reproducibles.

E"e&etos- aminas portaob5etos, ,lavadas y desengrasadas- 0olución salina estéril (>.9@A)- /ipetas pasteur o aplicadores de algodón estéril- sas microbiológicas- ec"eros- ceite de inmersión

NOTA+ as l#minas portaob5etos utilizadas para la coloración de 6ram, deben ser nuevas, sinrayas y limpias. !s recomendable mantener las l#minas portaob5etos en alco"ol y antes de

usarlas de5arlas secar al aire.

Pre(%r%ci' de" etedido (%r% co"ore%r co Gr%&

os extendidos para colorear con 6ram pueden ser'

- uestras clínicas- +ultivos en caldo- +olonias crecidas en medios solidos

Etedidos de &)estr%s c"$ic%s

0e toman con escobillón, rótelo suavemente sobre la l#mina portaobjeto, en forma circular,

empezando del centro hacia afuera, para evitar dañar las celulas y la disposición de

las bacterias.

Etedidos % (%rtir de c)"ti*os e c%"do

- ezcle el cultivo

- +on una pipeta pasteur, transfiera una gota o dos a una l#mina portaob5eto.- !xtienda la gota para formar una película delgada.


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Etedidos % (%rtir de co"oi%s e &edios de c)"ti*os so"idos

- &ncinere el asa a la llama coloc#ndola en forma vertical- !nfríela en una parte del agar donde no "aya crecimiento bacteriano- *ome una colonia con el asa y extiéndala sobre un portaob5eto al %ue previamente "a

colocado una gota pe%ue4a de solución salina, ezcle por movimientos circulares.

!vite "acer preparaciones muy gruesas.

- De5e secar al aire y fí5ela por el calor pas#ndola suavemente por la llama.- note la morfología y tinción de las bacterias observadas

.

Frotis idirectoGr%& (ositi*os

Frotis idirectoGr%& e#%ti*os

E%&e directo

Not%s+1>. ane5e el asa como si fuera un l#piz. !sto le de5a dos dedos libres para manipular

tapones de algodón u otras funciones.

11. +uando esterilice el asa contaminada con lí%uidos o particular de cultivos, "#galo

con mesura, pasando poco a poco por encima de la llama, "asta %ue %uede al ro5o.

De esta manera se evita %ue partículas mal incineradas caigan en su mesa de

traba5o, contamin#ndola.

Co"or%cioes e#%ti*%s6 Tit% c2i%

+oloración utilizada para visualizar capsulas.

a capsula es una estructura externa %ue presentan algunas bacterias, compuesta por una

sustancia viscosa %ue forma una cubierta o envoltura alrededor de la célula aumentando su

capacidad infecciosa (virulencia)

&mportantes microorganismos formadores de capsula' 6énero, Klebsiella

6enero Streptococcus !specie pneumoniae

Procedi&ieto


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1. 0obre una l#mina portaob5etos nuevo y limpio colocar una gota c"ina y "acer una

suspensión de la muestra clínica del microorganismo. as partículas de carbón y de la

tinta no pueden penetrar en la capsula de manera %ue solo se ennegrece el fondo.

3. De5ar secar la preparación, fi5arla al calor y aplicar cristal violeta durante 1 minuto para

visualizar el microorganismo.

B. avar y de5ar secar.:. Cbservar al microscopio la capsula como una zona clara alrededor de la bacteria.

Dibu5e la capsula y la morfología bacteriana

Di("ococos ec%(s)"%dos B%ci"os ec%(s)"%dos

Co"or%ci' de Sc2e)!!er F)"to (%r% es(or%s

lgunas bacterias 6ram positivas como $acillus y +lostridium ba5o condiciones adversas tales

como alta temperatura, ba5a "umedad, radiaciones y agentes %uímicos pueden pasar de su estado

vegetativo a% un estado latente o de espora (endospora) permitiendo la supervivencia del

microorganismo durante largo tiempo.

a forma y localización de la espora dentro del bacilo son criterios importantes para la

clasificación taxonómica.

Procedi&ieto

- ealizar una suspensión colocando una gota de solución salina en una l#mina

portaob5etos nueva y limpia y una pe%ue4a cantidad de la colonia a partir de cultivo

vie5o (mínimo (:9 "oras) de $acillus, de esta manera aseguramos la presencia de

endosporas bacterianas.

- De5ar secar al medio ambiente.- Ei5arla al calor - gregar solución de verde de mala!uita al "#.- Gtilizando un mec"ero, calentar durante B minutos, "asta %ue salgan vapores pero

evitando %ue se se%ue el colorante, de5ar enfriar.

- avar con abundante agua y aplicar safranina como colorante de contraste durante 1

minuto.

- Cbservar al microscopio las endosporas de color verde y el bacilo de color rosado.

Dibu5e la espora y la morfología bacteriana.


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A)toe*%")%ci'

encione las estructuras de las bacterias 6ram positivas y la función de cada una

MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM



MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM

encione las estructuras de las bacterias 6ram negativas y la función de cada una




MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM

+omplete el siguiente cuadro seg2n las características descritas.

+aracterísticas 6ram positivos 6ram negativos

/ared celular


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0ensibilidad a la penicilina

esistencias a los medios

físicos

0ensibilidad a la lisozima

&n"ibición por colorantes

Eormación de esporas

MATERIALES+ /ara cada grupo de :?= estudiantes

•edios de cultivo con diferentes crecimientos de colonias bacterianas(gar)' 1

• edios de cultivo b#sicos, enri%uecidos y diferenciales ' 1 de cada uno

• edios de cultivo li%uido( +aldo)' 1

• 0olución salina estéril. 1 frasco

• aminas portaob5etos' 3

• sas microbiológicas' 1

• ec"ero

• ceite de inmersión' 1

• icroscopio' 1

• +oloración de 6ram

CONSULTA

1.‐ Escriba el fundamento de las siguientes coloraciones también aplicadasen el campo de lamicrobiología.

Coloración Ziehl Neelsen y Gram GE!"# $inta china.

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