IMPLEMENTACIÓ DE LA MEDICINA PERSONALITZADA

BASADA EN LA SUSCEPTIBILITAT GENÈTICA I

SIGNATURES MOLECULARS EN EL TUMOR EN EL

MELANOMA CUTANI: IDENTIFICACIÓ DE NOVES

DIANES PER AL TRACTAMENT DEL MELANOMA

Susana Puig Sardà

IDIBAPS Institut d'Investigació Biomèdica August Pí i Sunyer

Rosa M. Martí Laborda

Hospital Universitari Arnau de Vilanova Lleida

Àngels Fabra Fres

IDIBELL Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge

Santiago Nonell Marrugat

Institut Químic de Sarrià URL

Joaquín Dopazo Blázquez

Centro de Investigación Príncipe Felipe Valencia

2

3

4

1. Resum del projecte

El melanoma, el més agressiu dels càncers de pell comuns, és un model adequat per

aplicar-hi una medicina personalitzada a causa de la seva heterogeneïtat molecular.

L’estratificació dels pacients de melanoma segons la susceptibilitat genètica, les

característiques moleculars del tumor i la capacitat de resposta al tractament, millorarà

el sistema d’estadificació utilitzat en la pràctica clínica, la qual cosa permetrà fer una

predicció més precisa del desenvolupament de metàstasi o recurrència i individualitzar

el tractament per millorar la qualitat de vida i supervivència dels pacients. És per això

que el nostre projecte tenia com a objectiu principal desenvolupar nous algoritmes que

condueixin a un pronòstic i tractament individualitzat. Els subobjectius del projecte

eren els següents:

- Quantificar el risc de desenvolupar melanoma, tenint en compte factors clínics i

genètics.

- Estimar el risc de desenvolupar metàstasis i recurrències. Aquest subobjectiu incloïa

tres punts:

i) La identificació d’algoritmes que permetin predir el pronòstic dels pacients de

melanoma.

ii) La identificació de variants genètiques associades al pronòstic del melanoma.

iii) L’anàlisi del transcriptoma complet de mostres de tumors primaris i metàstasis de

melanoma, així com el seu perfil genètic.

- Avaluar els biomarcadors o les seves dianes i desenvolupar noves teràpies

experimentals.

2. Resultats

Quantificació del risc de desenvolupar melanoma

Gràcies a aquest projecte, hem caracteritzat la prevalença de la variant p.E318K a

MITF (que incrementa el risc de desenvolupar melanoma i càncer renal) en la nostra

població, i gràcies a això hem identificat un 2% de portadors entre els pacients d’alt

risc de melanoma. Vam observar que alguns d’aquests pacients desenvolupaven

melanomes de ràpid creixement (en un dels casos, una lesió nova de tan sols 15 dies

d’evolució) que, si no es detecten a temps, poden ser altament agressius, de manera

5

que s’avisa els portadors que, en cas de detectar una nova lesió, poden acudir

d’urgència al servei de dermatologia. Aquests resultats els hem publicat a la revista

internacional JAMA Dermatology (1r decil de DERMATOLOGY, JCR 2016, IF: 5,817). A

més, hem identificat mutacions probablement patogèniques en el gen POT1 en un 2%

de les famílies CDKN2A-negatives, i hem trobat el principal gen causant de la

susceptibilitat a melanoma en aquestes famílies (resultats pendents de publicar).

Hem realitzat l’anàlisi de lligament genòmic massiu en 11 famílies de melanoma. Hem

identificat una nova regió associada a melanoma familiar (11q) amb un resultat de het-

TLOD estadísticament significatiu (het-TLOD > 3,300). A més, una de les famílies

analitzades mostrava 3 regions amb significació nominal (TLOD > 1,900) a 1q31.1-

q32.1, 6p24.3-p22.3 i 11q13.3-q21, cosa que la fa molt bona candidata per a futurs

estudis de seqüenciació massiva que tinguin l’objectiu d’identificar el gen implicat en la

susceptibilitat que es troba en aquesta regió. Aquests resultats han estat acceptats per

a la seva publicació a la revista internacional European Journal of Human Genetics (1r

quartil de GENETICS & HEREDITY, JCR 2016, IF: 4,287).

Estimació del risc de desenvolupar metàstasis i recurrències

i) Durant aquest projecte hem identificat que els factors clínics (sexe) i dermatoscòpics

(absència de reticle pigmentat, presència d’ulceració i de taques de pigment)

s’associen a la positivitat del gangli sentinella. Això va permetre la creació d’algoritmes

(SCOREBRESEX) per predir amb més precisió la positivitat a gangli sentinella. Aquests

resultats els hem publicat a la revista internacional Brithish Journal of Dermatology (1r

decil de DERMATOLOGY, JCR 2016, IF: 4,706). A més, hem demostrat que la

monitorització intensiva mitjançant tècniques d’imatge, anàlisis, exploració clínica

sistemàtica i autoexploració, en pacients en estadi IIB, IIC i III, permet identificar

recaigudes en etapes asimptomàtiques que permeten un millor tractament en els tres

grups. Aquests resultats els hem publicat a la revista internacional Journal of the

American Academy of Dermatology (1r decil de DERMATOLOGY, JCR 2016, IF: 7,002).

ii) En un estudi clínic vam observar que els pacients amb un alt nombre de nevus,

malgrat ser un dels principals trets fenotípics associats al risc de desenvolupar

melanoma, tenen una millor supervivència a melanoma. Això va generar la hipòtesi

que els gens implicats en desenvolupament de nevus podrien alhora estar implicats en

el pronòstic del melanoma. Vam identificar que l’SNP funcional rs12203592 del gen

IRF4, que està implicat en la regulació del nombre de nevus, modula la supervivència

6

del melanoma. De manera que l’al·lel associat a un nombre baix de nevus es

correlaciona amb un pitjor pronòstic. A més, dues variants funcionals del gen CD5, un

regulador negatiu de les cèl·lules T, també modulen la supervivència del melanoma.

Així, l’haplotip que conformen les dues variants associat a un sistema immunològic més

actiu confereix un millor pronòstic del melanoma; en aquest àmbit, ressalta el paper de

les variants germinals en gens del sistema immune en la supervivència del melanoma.

Aquests tres treballs els hem publicat a la revista internacional International Journal of

Cancer (1r quartil d’ONCOLOGY , JCR 2016, IF: 6,513).

iii) Hem analitzat el transcriptoma del melanoma mitjançant arrays d’expressió de 39

tumors primaris (dels quals teníem 47 biòpsies diferents), 19 de bon pronòstic i 20 de

mal pronòstic. A més, hem analitzat el transcriptoma de 36 metàstasis cutànies de 19

pacients. De 32 d’aquests tumors (15 de bon pronòstic i 17 de mal pronòstic), s’ha

realitzat la seqüenciació de l’exoma complet. A més, hem seqüenciat 30 metàstasis

cutànies de 18 pacients. Aquestes dades s’estan treballant i els resultats encara no han

estat publicats.

També vam analitzar l’expressió del gen SPARC i miR-29 en biòpsies de tumors

primaris de melanoma i vam estudiar el seu paper en el desenvolupament del tumor

(resultats pendents de publicació).

Avaluació dels biomarcadors o de les seves dianes i desenvolupament de

noves teràpies experimentals

Vam observar que la sobreexpressió d’AURKA s’associa a pitjor pronòstic a melanoma

en 3 cohorts independents, i a més hi ha una correlació entre l’expressió d’AURKA i

FOXM1 (que està sobreexpressat en els tumors amb la mutació V600E a BRAF).

Finalment, la inhibició tant d’AURKA com de FOXM1 inhibeix el creixement i

supervivència de les cèl·lules de melanoma in vitro, cosa que suggereix que es podrien

estudiar com a dianes terapèutiques. Aquests resultats els hem publicat a la revista

internacional Journal of Investigative Dermatology (1r decil de DERMATOLOGY, JCR

2016, IF: 6,287).

Hem analitzat la producció d’exosomes d’un ampli repertori de línies cel·lulars de

melanoma, els hem caracteritzat per microscòpia electrònica i marcadors proteics, hem

determinat la presencia de microRNA i proteïnes d’interès i els hem emprat en estudis

7

d’invasió de cèl·lules endotelials de la microvasculatura de pulmó in vitro i en la

colonització metastàtica in vivo (resultats pendents de publicació).

Hem establert xenoempelts per inoculació intradèrmica de 10 línies cel·lulars de

melanoma a ratolins HL-NOD SCID, per a estudis preclínics posteriors. S’han establert

dos grups de tractament (vehicle i droga) iniciats quan el tumor primari feia 80 mm3.

Els fàrmacs emprats han estat dos activadors de l’autofàgia (vemurafenib, inhibidor de

BRAF, i bortezomib, inhibidor del proteasoma) i MLN 8237, que s’ha fet servir com a

inductor de senescència (resultats pendents d’anàlisi i de publicació).

A més, hem identificat que els canals de calci de tipus T poden ser noves dianes

terapèutiques i marcadors per a la progressió del melanoma. També hem pogut

observar que Snail1 té un paper molt important en la migració cel·lular i en el procés

de transició epiteli-mesènquima. Aquests resultats els hem publicat a la revista

internacional Pigment Cell and Melanoma Research (1r decil de DERMATOLOGY, JCR

2016, IF: 5,170).

Finalment, hem estat treballant en l’estudi de l’ús de molècules fluorescents capaces de

generar espècies d’oxigen reactiu sota l’ús de teràpia fotodinàmica, amb l’objectiu de

desenvolupar noves estratègies terapèutiques per a aquells tumors que no podem

tractar amb inhibidors de la via de les MAPK o que no responen a immunoteràpia. Hem

estat treballant amb la flavoproteïna miniSOG i alguns dels seus derivats, tot i que

finalment no s’ha pogut demostrar el seu possible ús en el tractament del melanoma.

3. Rellevància i implicacions futures

Quantificació del risc d’un individu de desenvolupar melanoma

La identificació de noves regions genòmiques implicades en la susceptibilitat a

melanoma permetrà la caracterització de nous gens i la millora del consell genètic.

Actualment es desconeix el principal gen o gens de susceptibilitat en més d’un 70% de

les famílies amb melanoma familiar. En les famílies en què s’identifiquen les variants

implicades en la susceptibilitat, s’estén l’estudi a la resta de membres de la família,

cosa que permet la identificació de portadors asimptomàtics. Els estudis realitzats

durant aquest projecte han tingut una repercussió directa en pacients en seguiment. La

8

identificació de variants germinals en els gens MITF i POT1 ha permès ampliar l’estudi

a la resta de familiars i identificar individus amb un risc genètic incrementat a

desenvolupar melanoma, de manera que els hem pogut incloure en programes de

detecció precoç de melanoma. Això permet identificar melanomes in situ o de Breslow

molt baix, que es correlacionen amb un pronòstic excel·lent de la malaltia. Com a

resultat, tant el pacient com el sistema sanitari públic es beneficien d’aquest diagnòstic

precoç.

Estimació del risc de desenvolupar metàstasis i recurrències

L’aplicació de l’algoritme SCOREBRESEX en la pràctica clínica permetria reduir més

d’un 40% els procediments quirúrgics d’extirpació de gangli sentinella. La identificació

de variants associades al pronòstic del melanoma ens permetrà incloure-les en futurs

scores de predicció. A més a més, obren la porta al seu estudi en la capacitat de

resposta a teràpia. Tenir biomarcadors de bon i mal pronòstic i de resposta als

tractaments serà clau per a la selecció de protocols de seguiment i teràpies per

administrar a cada pacient. Ens cal dur a terme estudis en més profunditat per

identificar la implicació dels resultats dels estudis de transcriptoma i genòmica a la

pràctica clínica.

Avaluació dels biomarcadors o de les seves dianes i desenvolupament de

noves teràpies experimentals

Els resultats obtinguts en l’estudi d’AURKA en desvelen el valor com a factor pronòstic

del melanoma i alhora com a diana terapèutica per a aquells pacients BRAFmutats

resistents a vemurafenib o no tributaris a aquest tractament. Ara ens plantegem

explorar règims terapèutics combinats amb els inhibidors de RAF i d’AURKA o FOXM1.

D’altra banda, les nostres dades amb relació als reguladors de l’expressió de SPARC i

dels microRNA presents en sèrum/plasma de malalts de melanoma esperem que

tindran un impacte en el diagnòstic precoç o risc de metàstasi mitjançant un mètode

mínimament invasiu que facilitarà la gestió i tractament apropiat per a cadascun dels

pacients amb melanoma.

Podem considerar els canals de calci tipus T com a marcadors de progressió tumoral en

melanoma. Podem afirmar que existeix una correlació entre l’expressió de Cav3.2 i la

presència d’hipòxia i l’expressió de Cav3.1 amb els processos d’autofàgia. D’altra

banda, els canals de calci poden ser una bona línia de recerca per caracteritzar-los com

9

futures dianes terapèutiques del melanoma metastàtic, específicament per als tumors

BRAFmutats. A més els nostres resultats assenyalen que la inhibició de l’autofàgia i la

pèrdua de Snail1 poden reduir les capacitats metastàtiques del melanoma BRAFmutat,

fet que podria plantejar-ne l’ús com a prevenció a l’aparició de melanomes resistents a

teràpies utilitzades actualment.

4. Bibliografia científica generada

1. González-Álvarez T et al.

Dermoscopy structures as predictors of sentinel lymph node positivity in cutaneous

melanoma. Br J Dermatol. 2015;172(5):1269-77.

2. Ribero S et al.

High nevus counts confer a favorable prognosis in melanoma patients.

Int J Cancer. 2015 Oct 1;137(7):1691-8.

3. Potrony M et al.

Update in genetic susceptibility in melanoma.

Ann Transl Med. 2015 Sep;3(15):210.

4. Potrony M et al.

Prevalence of MITF p.E318K in Patients With Melanoma Independent of the Presence of

CDKN2A Causative Mutations.

JAMA Dermatol. 2016 Apr 1;152(4):405-12.

5. Carrera C et al.

Validity and Reliability of Dermoscopic Criteria Used to Differentiate Nevi From

Melanoma: A Web-Based International Dermoscopy Society Study.

JAMA Dermatol. 2016 Jul 1;152(7):798-806.

6. Potrony M et al.

Inherited functional variants of the lymphocyte receptor CD5 influence melanoma

survival.

Int J Cancer. 2016 Sep 15;139(6):1297-302.

10

7. Podlipnik S et al.

Performance of diagnostic tests in an intensive follow-up protocol for patients with

American Joint Committee on Cancer (AJCC) stage IIB, IIC, and III localized primary

melanoma: A prospective cohort study.

J Am Acad Dermatol. 2016 Sep;75(3):516-24.

8. Puig-Butillé JA et al.

AURORA A overexpression (AURKA) is driven by FOXM1 and MAPK/ERK activation in

melanoma cells harbouring BRAF or NRAS mutations: Impact on melanoma prognosis

and therapy. J Invest Dermatol. 2017 Jun;137(6):1297-1310.

9. Puig-Butille JA, et al. Genomic expression differences between cutaneous cells

from red hair color individuals and black hair color individuals based on bioinformatic

analysis.

Oncotarget. 2017 Feb 14;8(7):11589-11599.

10. Rabbie R et al.

Genomic analysis and clinical management of adolescent cutaneous melanoma.

Pigment Cell Melanoma Res. 2017 May;30(3):307-316.

11. Maiques O et al.

Immunohistochemical analysis of T-type calcium channels in acquired melanocytic

naevi and melanoma.

Br J Dermatol. 2017 May;176(5):1247-1258.

12. Potrony M et al.

IRF4 rs12203592 functional variant and melanoma survival.

Int J Cancer. 2017 Apr 15;140(8):1845-1849.

13. Carrera C et al.

Prognostic role of the histological subtype of melanoma on the hands and feet in

Caucasians.

Melanoma Res. 2017 Aug;27(4):315-320.

11

14. Boada A et al.

Sentinel lymph node biopsy versus observation in thick melanoma: A multicenter

propensity score matching study.

Int J Cancer. 2018 Feb 1;142(3):641-648.

15. Maiques O et al.

T-type calcium channels drive migration/invasion in BRAFV600E melanoma cells

through Snail1.

Pigment Cell Melanoma Res. 2018 Jan 31.

16. Potrony M et al.

Genome-wide linkage analysis in Spanish melanoma-prone families identifies a new

familial melanoma susceptibility locus at 11q.

Eur J Hum Genet 2018 (Acceptat).

En revisió

Rodríguez-Pulido A et al.

Fluorescent flavoprotein heterodimers: combining photostability with singlet oxygen

generation.

ChemPhotoChem

Endres S et al.

An optogenetic toolbox of LOV-based photosensitizers for light-driven killing of

bacteria.

Scientific Reports

En preparació

Ferreres JR et al.

Prognostic and predictive value of Melanoma-related MicroRNAs in serum.

Vinyals A et al.

SPARC and miR-29 regulatory axis mediate melanoma progression and metastatic

colonization.

12

Potrony M et al.

POT1 germline mutations but not TERT promoter mutations are implicated in

melanoma susceptibility in a large cohort of Spanish melanoma families.