Importancia de la detección de variantes minoritarias de mutaciones de resistencia

Federico GarcíaUnidad de Microbiología Molecular

H. Universitario San Cecilio Granada

Variantes minoritarias

Poblaciones minoritarias. Detección ultrasensible de

mutaciones de resistencia. No se trata de detectar mutaciones

en pacientes con baja carga viral. No confundir con detección ultrasensible de viremia.

Mutaciones de resistencia

VIRUS SALVAJE

Mutación primariaNueva infección

TARR

esis

ten

te a

AR

RESISTENCIA PRIMARIA

Mutaciones de resistencia

VIRUS SALVAJE

TAR

Nueva infección

Res

iste

nte

a A

R

RESISTENCIA PRIMARIA

Tiempo sin TAR

0

10

20

30

40

50

60

70

2 4 6 8 10

Time (days)

p24

Ag

(p

g/m

l)

WT

K103N

P236L

Gerondelis et al. J Virol. 1999 vol.73:5803

0

100

200

300

400

500

2 4 6 8 10

Time (days)

p24

Ag

(n

g/m

l) WT

V106A

Y181C

Archer et al. J Virol. 2000 vol.74:8390

Persisten aquellas mutaciones con capacidad replicativa similar a los WT

Secuenciación de ADN en pacientes con más de 1 año de infección

0

10

20

30

40

50

60

70

2 4 6 8 10

p24

Ag

(p

g/m

l)

WT

K103N

0

10

20

30

40

50

60

70

80

2 4 6 8 10

p24

Ag

(n

g/m

l) WT

L74V

K65R

M184V

>20%Secuenciación

Clonación de productos de PCR: técnica de referencia

>20%Secuenciación

Tiempo sin TAR

Inconvenientes

Muy Laboriosa Tardamos entre 2-5 días más. Elevado coste:

20-100 reacciones de secuenciación

Alternativas En el XV International HIVDR Workshop

(Sitges, Junio 2006) se presentaron 15 comunicaciones en las que se describen las distintas plataformas disponibles para la detección de variantes minoritarias (Abst #33, 34, 43-45, 56, 66, 69, 70, 80, 96, 117, 152, 161, 169)

En el V European Resistance Workshop (Cascais, Marzo 2007) hubo una sesión plenaria dedicada a la detección ultrasensible de mutaciones de resistencia, y 5 comunicaciones (Abst #20, 57-59, 78)

Plataformas disponibles PCR alelo específica a tiempo real Oligonucleotide ligation assay (OLA) LigAmp Secuenciación de genoma único Ultra-deep sequencing o 454 sequencing Multi-genome sequencing (MGS) MultiCode RTx PASS

PCR alelo-específica a tiempo real: flujo de trabajo

RT-PCR

aacaat

aacaat

K103K

K103N

AAC Asn (N) AAT Asn (N)

En Tiempo Real..... Detectamos variantes por debajo del

1%. Pero....

A veces un aminoácido lo codifican más de un codón

R: ArgCgT, CgC, CgA, Cgg, AgA, ACg V: Val gTT, gTC, gTA, gTg N: Asn AAT, AAC

Sólo podemos detectar una mutación por ensayo

Detección de mutaciones de resistencia

RT-PCR

Secuenciación Clonación PCR tiempo real

Ventajas ProcesividadTodas las mutaciones

Detecta cualquier variante

Detecta 0.1-2%Adaptable a Lab. Asistencial

Inconven.

No detecta <20% Laborioso/Tiempo para resultado/Coste

Mutaciones puntuales

Interés clínico de la determinación de Variantes Minoritarias

En Terapia de Inicio: para la correcta elección

del acompañante de los NUCs (y de los NUCs).

En Rescate: para mejorar la interpretación del

genotipo de resistencia.

Variantes Minoritarias y Terapia de Inicio

Análisis retrospectivo de 138 pacientes que participaron en ZODIAC

Johnson J et al. XV Int HIVDRW. Sitges 2006.

Variantes Minoritarias y Terapia de Inicio

K103N Y181C M184V Tiempo

11 POS

2 nunca <50 4 a 2 meses2 a 4 meses2 a 6 meses

19 POS

25 POS

31 POS

41 POS POS POS

44 POS

47 POS

63 POS

65 POS

67 POS

Johnson J et al. XV Int HIVDRW. Sitges 2006.

Variantes Minoritarias y Terapia de Inicio

Pacientes naïve < 18 meses de infección

Variantes minoritarias en 18 pacientes más (9.9%): M184V n=16; K103N n=3; ninguna L90M.

Relación con falta de respuesta sólo cuando se tienen en cuenta variantes mayoritarias.

Peuchant O et al. CROI 2007. Abstract 666.

Variantes minoritarias:Seroconvertores 49 Acute seroconverters

Secuenciación n (%)

PCR alelo específica n (%)

Total n (%)

K103N 4 (8) 1 (2) 5 (10) M184V 1 (2) 5 (10) 6 (12) L90M 0 1 (2) 1 (2)

TOTAL 5 (10) 6 (12) 11 (22)

Metzner et al, AIDS 2005, 19:1819-1825

Variantes Minoritarias ¿en todos los pacientes naïve?

Seroconvertores vs Nuevos diagnósticos o Naïve de larga evolución

¿de todas las mutaciones?

0

10

20

30

40

50

60

70

2 4 6 8 10

Time (days)

p24

Ag

(p

g/m

l)

WT

K103N

0

10

20

30

40

50

60

70

80

2 4 6 8 10

Time (days)

p24

Ag

(n

g/m

l)

WT

L74V

K65R

M184V

Rescatabilidad, Secuenciación

1er FracasoM184V

1er RescateFACIL

Inicio IPr1,2

1. Ananworanich et al. 3rd IAS 2005. Poster WePe4.4C12; 2. Slim J, et al. 8th International Congress on Drug Therapy in HIVInfection, Glasgow, UK, 12-16 November 2006, Oral and Poster PL2.5. 3. 3.- ZODIAC: Moyle G, et al. J Acquir Immune Defic Syndr 2005;38:417

1er FracasoM184V+K103N

1er RescateFACIL, peroInicio EFV3

1er FracasoM184V+L74V ó K65RK103N, K101E, V179D

1er RescateDIFICIL

Inicio EFV

Para evitar este fracaso

1er FracasoM184V+L74V ó K65RK103N, K101E, V179D

1er RescateDIFICILInicio EFV

K103NL74V

M184VK65R

Investigar Resistencias Basales Investigar Variantes Minoritarias

TDFddIABC

EFVATV/RTV*FPV/RTV**SQV/RTV**

Alternativas Actuales para Tratamientos una vez al día

3TC

FTC+ NUCs

Tercer brazo

* No aprobado en Europa para terapias de inicio

** No aprobado en Europa para administración QD

Panel on Clinical Practices for Treatment of HIV Infection convened by the U.S.Department of Health and Human Services (DHHS). Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-Infected Adults and Adolescents - October 6, 2005. http://AIDSinfo.nih.gov .

K65R

L74V

K103NATV/RTV*FPV/RTV**SQV/RTV**

Alternativas Actuales para Tratamientos una vez al día

M184V+ NUCs

Tercer brazo

* No aprobado en Europa para terapias de inicio

** No aprobado en Europa para administración QD

Panel on Clinical Practices for Treatment of HIV Infection convened by the U.S.Department of Health and Human Services (DHHS). Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-Infected Adults and Adolescents - October 6, 2005. http://AIDSinfo.nih.gov .

Nuestra Experiencia (CoRAO)

155 nuevos diagnósticos CoRAO 2/155 (1.3%) K103N 5/155 (3.3%) K103N Var. Minoritarias.

Martin L et al (CoRAO). XII Reunión SEIMC

Secuenciación PCR alelo específica

Total

K103N 2/155 (1.3%) 5/155(3.3%) 7 casos

Variantes minoritarias y Rescate

Descamps D, et al. IV European HIV Drug Resistance Workshop. Monte Carlo, 2006. Poster 64. K65R persistance.

Moffatt A, et al. 45th ICAAC. Washington, 2005. Poster H-1067. K65R.

Flys T, et al. J Infect Dis. 2005;192:24-29. Single dose NVP & K103N.

Metzner KJ et al. JID 2003;188:1433-1443. M184V y STI. Roquebert B, et al. AIDS 2006; 20(2):287-9. PI &

resistencia a NFV Lecossier D, et al. J Aquir Immune Defic Syndr.

2005;38:37-42. K103N en fracaso a NVP.

Main Findings K103N detected in 4 of 16 patients who failed

nevirapine Clones expressing K103N for each pt: 1%, 5%, 33%, 76% No mutations detected in control samples

2 of 4 patients with K103N virus subsequently received efavirenz

Both failed treatment K103N detectable by standard genotyping after second

failure 5 of 12 patients who failed nevirapine but did not

have K103N subsequently received efavirenz 4 failed efavirenz salvage therapy New NNRTI resistance mutations detected in all 4

patients

Lecossier D, et al. J Aquir Immune Defic Syndr. 2005;38:37-42.

Key Conclusions Minority populations of HIV-1 expressing K103N

undetected by standard genotyping prevalent in patients failing nevirapine therapy

Patients with K103N virus failed salvage therapy with efavirenz

K103N emergence also detected in patients prematurely discontinuing nevirapine

New strategies accounting for the contribution of minority variants on drug resistance necessary

More sensitive viral detection methods should be developed

Lecossier D, et al. J Aquir Immune Defic Syndr. 2005;38:37-42.

Variantes Minoritarias y Rescate

Consejos iniciales para guiar la interpretación del genotipo de resistencia en el paciente pretratado:

1. No predice el éxito2. Considerar Historia antirretroviral3. Considerar Historia genotípica:

genotipo combinando

Lectura del genotipo de resistencias:

ITIAN

TAMs No TAMs Otras

Ruta 1

T215Y

M41L

L210W

D67N

Ruta 2

T215F

K7OR

D67N

K219QEN

TAMs+ M184V

M184VI K65R L74VI

K65R + M184V

ITINAN

IPs

M230L

G190CEQST

Y188L

K103N

1 mutación de:

Resistencia a EFV, NVP

K101P

V106A

Y181CIV

Y188C

Resistencia a NVP

G190A

2 mutaciones de ITINAN

Resistencia a EFV, NVP

Resistencia a TMC 125

≥ 3 mutaciones de ITINAN

Mutaciones clave

G48V SQV

M46IL IDV

I50V APV/FosAPV

I50L ATV

V32I+I47A LPV

FosAPVV32I+I47V

Sin mutaciones clave, o con mutaciones clave + otras mutaciones

score

FosAPVr

SQVr

Resistencia a todos o imposibilidad de usarlos

Ruta 1:

> 3 no se afecta

Ruta 2:revierte

parcialmente

LPVr

ATVr

1 mutación de:

L74VI + M184V

scoreTPVr

DRVr

D30N NFV

Consejos iniciales para guiar la interpretación del genotipo de resistencia en el paciente pretratado:

1. No predice el éxito2. Considerar Historia antirretroviral3. Considerar Historia genotípica:

genotipo combinando

Lectura del genotipo de resistencias:

ITIAN

TAMs No TAMs Otras

Ruta 1

T215Y

M41L

L210W

D67N

Ruta 2

T215F

K7OR

D67N

K219QEN

TAMs+ M184V

M184VI K65R L74VI

K65R + M184V

ITINAN

IPs

M230L

G190CEQST

Y188L

K103N

1 mutación de:

Resistencia a EFV, NVP

K101P

V106A

Y181CIV

Y188C

Resistencia a NVP

G190A

2 mutaciones de ITINAN

Resistencia a EFV, NVP

Resistencia a TMC 125

≥ 3 mutaciones de ITINAN

Mutaciones clave

G48V SQV

M46IL IDV

I50V APV/FosAPV

I50L ATV

V32I+I47A LPV

FosAPVV32I+I47V

Sin mutaciones clave, o con mutaciones clave + otras mutaciones

score

FosAPVr

SQVr

Resistencia a todos o imposibilidad de usarlos

Ruta 1:

> 3 no se afecta

Ruta 2:revierte

parcialmente

LPVr

ATVr

1 mutación de:

L74VI + M184V

scoreTPVr

DRVr

D30N NFV

Variantes Minoritarias, Ya disponemos de algunas plataformas para

su detección Aunque existen preguntas por contestar, cada

vez existen más datos a favor de la utilidad de su detección para la correcta selección de los ARVs en la terapia de inicio

Para el rescate, la detección ultrasensible de mutaciones de resistencia supondrá una mejora en los criterios de interpretación del genotipo

Necesidades

Una plataforma que permita detectar variantes minoritarias, con la máxima sensibilidad y precisión

y, además, que permita detectar varias mutaciones en un solo ensayo

Agradecimientos

Miembros de CoRAO (Almería, Granada y Jaén)

Personal de la Unidad de Microbiología Molecular del HU San Cecilio

B. Hernández y C. Gutiérrez, Ramón y Cajal.