Agosto 2017

Dr. Juan Mateo Anchordoquy

Laboratorio de Nutrición Mineral y Fisiología de la Reproducción

(FCV-UNLP)

Importancia del zinc en la reproducción bovina

Introducción General

El Zinc (Zn) es un mineral traza esencial.

(Bray y Bettger, 1990; Powell SR, 2000 Prasad, 1998, 2003; Prasad y Kucuk, 2002)

El Zn forma parte funcional y/o estructural “metaloproteínas”.

En todos los casos, la ausencia de zinc en su sitio de acción puede llevar a la pérdida de actividad de la “metaloproteína”.

Deficiencia de Zn (provocada por una carencia nutricional)

Disminución en la actividad metaloproteínas

Manifestaciones subclínicas y clínicas de la deficiencia

HipoZn. Moderada

89 - 40 µg/dl 40 µg/dl

Normozincemia

> 90 µg/dl 90 µg/dl

HipoZn. Severa

< 40 µg/dl 0 µg/dl

Zn-plasma

Diagnóstico serológico

Evolución de la carencia Kincaid (1999) y Underwood y Sutlle (1999)

Las consecuencias

Clínicas

Subclínicas

Menores ganancias de peso

Menor resistencia a infecciones

Menor eficiencia reproductiva

• Retraso de la maduración sexual

• Retención placentaria

• Alteración del ciclo estral

• Aumenta el riesgo de aborto espontáneo

(Grahn y col., 1994, 2001; Falchuk y Montorzi, 2001)

Consecuencias reproductivas de la deficiencia de Zn:

Zn++

Maduración del ovocito Desarrollo embrionario temprano

Concentración de Zn

Plasma 1,32 µg/ml ± 0,22a

Licor folicular (FG) 1,49 µg/ml ± 0,37a

Licor folicular (FP) 1,55 µg/ml ± 0,33a

TCM 199 + 10% SFB 0,3 µg/ml ± 0,02b

Los valores con distintas letras dentro de cada columna son estadísticamente diferentes (p < 0,01)

Se establecieron cuatro condiciones de maduración:

Control (TCM 199 + 10% SFB): 0,3 μg/ml Zn

Zn1: 0,7 μg/ml Zn

Zn2: 1,1 μg/ml Zn

Zn3: 1,5 μg/ml Zn Estatus en bovino Zn en plasma μg/ml

Deficiente 0,2 a 0,39

Deficiente marginal 0,4 a 0,89

Adecuado 0,9 a 1,9 Kincaid, 1999

Maduración del ovocito

Maduración nuclear

Maduración citoplasmática

Tasa de apoptosis en CC

Integridad del ADN de CC

Concentración intracelular de GSH

Actividad SOD del COC

Nivel de ROS del COC

Concentración intracelular de GSH/GSSG en ovocitos y células del cúmulus bovinos maduradas con diferentes

concentraciones de Zinc.

(p < 0,001)

Control Zn1 Zn2 Zn3

GSH-GSSG en ovocito

(pmol/ovocitos) 3,0 ± 0,9a 1,8 ± 0,5b 3,7 ± 0,4a 4,0 ± 0,5a

GSH-GSSG en cúmulus

(nmol/106 células) 0,3 ± 0,05a 0,2 ± 0,02b 0,5 ± 0,04c 0,5 ± 0,04c

Se maduraron 800 COC, colectados en días diferentes (n= 4 repeticiones), 200 COC por día (50/tratamiento).

Actividad SOD del complejo ovocito-cúmulus luego de la MIV

con y sin el agregado de zinc.

0

1

2

3

4

5

6

7

Control Zn3

Un

idad

es

SOD

/CO

C 1

0-3

b

a

Nivel de ERO de CC luego de la MIV con y sin el agregado de zinc

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Control Zn3N

ivel

ERO

s (in

tens

idad

fluo

resc

enci

a)

a

b

Olive Tail Moment (OTM) en células del cúmulus.

Efecto de diferentes concentraciones de zinc sobre la tasa de apoptosis en células del cúmulus evaluado con Anexina V-FLUOS.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Control Zn1 Zn2 Zn3

OTM

a

b

b b

Maduración del ovocito

Maduración nuclear

Maduración citoplasmática

Tasa de apoptosis en CC

Integridad del ADN de CC

Concentración intracelular de GSH

Actividad SOD del COC

Nivel de ROS del COC

Control Zn1 Zn2 Zn3

N° Ovocitos 313 339 309 304

% de Clivados 66,63a 71,46a 75,30a 73,08a

% Blastocistos/ovocitos 17,99a 21,28a 30,48b 31,37b

% Blastocistos/clivados 27,07a 28,99a 40,60b 42,97b

Capacidad de desarrollo de ovocitos bovinos madurados in vitro con diferentes concentraciones de zinc.

La tasa de blastocistos se incrementa un 26,4 % por cada aumento de 0,4 μg/ml Zn en el medio de MIV.

0

10

20

30

40

50

60

Control Zn1 Zn2 Zn3

% H

atch

ing

a

b b

c

Efecto del zinc en el medio de MIV sobre el porcentaje de blastocistos eclocionados

(hatching).

Número de células por blastocisto al Día 8 de cultivo.

0

20

40

60

80

100

120

140

Control Zn1 Zn2 Zn3

N°c

élul

as/b

last

ocis

to

aa

b b

Concentración de Zn

Plasma 1,32 µg/ml ± 0,22a

Licor folicular (FG) 1,49 µg/ml ± 0,37a

Licor folicular (FP) 1,55 µg/ml ± 0,33a

TCM 199 + 10% SFB 0,3 µg/ml ± 0,02b

Los valores con distintas letras dentro de cada columna son estadísticamente diferentes (p < 0,01)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 50 100 150 200 250

Zn Plasma

Zn L

F (F

< 10

mm

) R2 ajustado 0.09 pendiente 0.43

intercepción 93.45

0

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250

Zn L

F (F

> 10

mm

)

Zn Plasma

R2 ajustado 0.17 pendiente 0.52

intercepción 59.7

El objetivo fue estudiar el rol de las CC en el transporte de Zn entre el medio externo y el ovocito.

Material y Métodos

COC

Ovocito + CC

Ovocito

Control

Zn3

Maduración (24hs)

Rol de las CC durante la MIV de ovocitos bovinos en presencia de Zn sobre la capacidad de desarrollo posterior

a b

a b a

b

número de células por blastocisto al Día 8

60

80

100

120

140

COC DO+CC DO

N°c

élul

as/b

last

cist

o

Control

Zn3

b

c

d d

aa

Fecundación del ovocito

Seminal plasma zinc concentrations from infertile males are lower than those from normal controls

Zinc supplementation → ↑semen volume, sperm motility and % normal sperm morphology

Estabilización de la membrana celular

Estabilización de la cromatina

Propiedad antioxidante (SOD)

Participa en la capacitación (RZn- EGFR)

Actividad antibacteriana (semenogelin)

Participa en la RA (RZn- EGFR)

500 ml semen = Zn Volemia total

0 1 2 3

500 ml semen = Zn Volemia total Curvas de nivel plasmático

0 h 7 h 24h D7 D14 D 21 D28

Curvas de nivel plasmático

0 h 7 h 24h D7 D14 D 21 D28

Estudio Cinético (So4Zn)

• Efecto de concentraciones “Adecuadas” y deficientes de Zn sobre:

▫ Integridad de la membrana plasmática (eosina-nigrosina;

HOST).

▫ Motilidad progresiva (método subjetivo).

▫ Estatus acrosomal (Pisum sativum)

▫ Capacidad de unión a la zona pelúcida (Hoeschst 33342).

Percoll Medio FIV 2 x10⁶ esp/ml

Control 40 µg/dl 80 µg/dl

120 µg/dl

Evaluaciones

0 Hs. 3 Hs. 6 Hs.

50,0

55,0

60,0

65,0

70,0

75,0

80,0

85,0

90,0

0hs 3hs 6hs

control

0.4

0.8

1.2

a a a a

bc bc b b

c cd de

e

Viability (%)

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

0 hs 3 hs 6 hs

Control

0.4

0.8

1.2

a a a a

b bc

c

b b

c

bc bc

HOST positive (%)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 hs 3 hs 6 hs

Control

0.4

0.8

1.2

a a a a

b b

c c

d d d e

Progressive Motility (%)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 hs 3 hs 6 hs

Control

0.4

0.8

1.2

a a a a

b c

d

c

b b b b

Acrosomal status (acrosome integrity)

Sperm-zona pellucid binding

0

10

20

30

40

50

60

Control 0.4 0.8 1.2

Espe

rmat

ozoi

des/

zona

pel

úcid

a

a

b

c

a b

• Efecto del Zn durante la FIV sobre la formación de pronúcleos.

MIV 24 Hs.

FIV 18 Hs.

Control 40 µg/dl 80 µg/dl 120 µg/dl

S/F 1P 2P 2P+ DegControl 23.1 15.4 53.8 2.6 5.11.2 Zn 22.2 6.3 65.1 0.0 6.3

%

↑ Viabilidad ↑ Mot. Progr. ↑ unión E-ZP ↑ FECUNDACIÓN

ACTIVACIÒN

Desarrollo Temprano Zinc supplementation (µg/mL Zn)

0 0.4 0.8 1.2

No. Oocytes 97 87 89 87

Cleaved (%) 58,9 ± 4,3 64,6 ± 4,3 67,4 ± 4,3 70,0 ± 4,3

Blastocyst/oocyte (%) 15,6 ± 4,5 20,7 ± 4,5 21,7 ± 4,5 17,4 ± 4,5

Hatched (%) 42,6 ± 7,3 29,2 ± 7,3 22,4 ± 7,3 33,4 ± 7,3

Homeostasis del zinc

FSH, LH, E2 E2 y P4

Resultados preliminares

Tipo celular

T=0 de maduración

Suplementación hormonal

Sin suplementación hormonal

Con Zn Sin Zn Con Zn Sin Zn Zip6 Ovocitos + - + + +

Cúmulus - - - - - Znt3 Ovocitos - - - - -

Cúmulus - + - + - Znt7 Ovocitos - - - - -

Cúmulus - - - - - Znt9 Ovocitos - - - + +

Cúmulus - + - - -

Expresión génica de transportadores de zinc en el complejo ovocito-cúmulus bovino: influencia de tres hormonas reproductivas

Concentración de zinc “libre” en el ovocito bovino luego de MIV

Rol antioxidante del zinc en el sistema reproductor bovino: efecto de tres hormonas reproductivas en las células del cúmulus

A) Control -H -Zn

B) -H +Zn

C) 3H -Zn

D) 3H +Zn B) Niv

eles

de

ERO

s (in

tens

idad

rela

tiva

de

fluor

esce

ncia

)

C) D) A)

a a

b

c

Relevamiento del estatus de Zn en rodeos de la CDS

1) Conocer el nivel de Prevalencia de la carencia de zinc en la CDS

• Cuatro estaciones • 3 Establ. (un partido) • Medición de Zn en el suelo,

forraje y hembras en edad reproductiva.

Relación suelo-planta-animal

Causa ↓Zn

• Toma de muestra • 2 mg BE

Establecer el riesgo de pérdidas reproductivas.

DIB (1g P4)

• 150 μg d-cloprostenol • 0.5 mg CE IATF

7 días 52-56 Hs.

Diagnóstico de preñez a los 40 días.

Consecuencias reproductivas de la carencia de Zn

2025303540455055606570

< 110 110-139 140-169 170-199 200-300

Preñ

ez (%

)

140 - 169 > 170

140 - 169 < 139

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