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José Luis Cortés et al. Criterios de Valoración Morfológica.

INTRODUCCIÓN

Los estudios sobre células madreconstituyen en la actualidad uno de loscampos con más expectativas de labiomedicina. Cuando en noviembre de1998, el grupo estadounidense lideradopor James Thomson publicó los datossobre la derivación de una línea decélulas madre embrionarias humana(hESCs, siglas inglesas de humanembryonic stem cells) a partir de unblastocisto en fase de preimplantación,se abrió una nueva puerta de esperanzapara la curación de enfermedades hasta

ahora incurables (Thomson y cols.,1998). Estas células suponen unaherramienta de enorme valor para el“screening” de nuevos fármacos, asícomo un modelo para estudiar laetiología de las enfermedades quetienen su origen durante la etapaembrionaria, o como fuente futura decélulas en medicina regenerativa(Menendez et al., 2006).

La legislación en España respecto al usode preembriones humanos sobrantes deciclos de fecundación “in vitro” (FIV)está actualmente regulada por la Ley

14/2006, sobre técnicas de reproducciónasistida, por el Real Decreto 1301/2006,sobre células y tejidos humanos, y por laLey 14/2007, sobre investigaciónbiomédica. En nuestra interpretación deestas leyes, la pareja sometida a un cicloFIV puede dar un destino final a aquellospreembriones sobrantes que seencuentren crioconservados ennitrógeno líquido, independientementedel tiempo de congelación, siempre bajoconsentimiento informado de la pareja.Los diferentes destinos posibles quepueden darse a los preembrionessobrantes crioconservados son:

Criterios de Valoración Morfológicos de Oocitos, Preembrionestempranos y Blastocistos Humanos propuestos por ASEBIRMorphological Assessment of Human Oocytes, early Embryos and Blastocystsproposed by ASEBIR

José Luis Cortés*, Gertrudis Ligero, Laura Sánchez, Ana Nieto, Clara Bueno, Rosa Montes, Pablo Menéndez.Banco Andaluz de Células Madre. Centro de Investigación Biomédica. Universidad de Granada. Campus de la Salud. Granada.*Correspondencia: josel.cortes.sspa@juntadeandalucia.es

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RESUMEN

ASEBIR ha publicado en sus Cuadernos de Embriología Clínica los Criterios de Valoración Morfológicos de Oocitos, Preembrionestempranos y Blastocistos Humanos, buscando poder consensuar los criterios de calidad entre todas las clínicas de reproducciónasistida españolas. Sin embargo, estos criterios no sólo deben ser útiles para los embriólogos clínicos, sino que pueden servir alos embriólogos pertenecientes a centros de investigación como ayuda para facilitar la derivación de líneas celulares embrionariashumanas así como para estudios moleculares y genéticos básicos de embriología humana. El objetivo de este trabajo es mostrarsi los criterios publicados por ASEBIR son extrapolables a preembriones congelados donados a investigación con células madre,utilizando para ello los preembriones autorizados para un proyecto de investigación del Banco Andaluz de Células Madre.

Palabras clave: Calidad blastocitaria, Calidad embrionaria, célula madre embrionaria humana, masa celular interna, preembrióncongelado.

SUMMARY

ASEBIR proposed in its Clinical Embryology Notebooks the Morphological Assessment for Human Oocytes, early Embryos andBlastocysts, aiming at reaching an agreement on the quality criteria between all Spanish assisted reproduction clinics.Nevertheless, these proposed criteria not only will be useful to clinical embryologists, but can also be useful to embryologistsmoving into basic research to help facilitate the derivation of human embryonic stem cells and further basic molecular andgenetic studies on human embryo development. The aim of this work is to discuss if the criteria published by ASEBIR are usefuland can be extrapolated to cryopreserved embryos which are donated to stem cell research using the authorized embryos foran ethically and scientifically approved research project to be carried out at the Andalusian Stem Cell Bank.

Key words: Blastocyst quality, embryonic quality, human embryonic stem cell, inner cell mass, cryopreserved embryo

Aplicabilidad en preembriones crioconservados donados para investigación con células madre.Applicability in cryopreseved embryos donated to stem cell research.

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> Su utilización por la propia mujero cónyuge.

> La donación con fines reproductivos.> La donación con fines de investigación.> El cese de su conservación sin otra

utilización.

Respecto a la utilización de preembrionescon fines de investigación, sólo seautorizará si se atiene a varios requisitos:

> Posesión del consentimiento informado.> Que el preembrión no se haya

desarrollado in vitro más allá de 14 días después de la fecundación.

> Que la investigación se realice en centros autorizados.

> Que la investigación se realiceen base a un proyecto debidamente presentado y autorizado por las autoridades competentes

> Que se especifiquen las posibles relaciones de interés entre centros.

Esta legislación deja a España en untérmino medio de permisividad,englobándola en el grupo de paísesdonde está permitido investigar conpreembriones sobrantes de ciclos de FIVpara derivar hESC (Canadá, Holanda,Australia, Suecia), lejos del grupo depaíses donde está prohibido utilizarpreembriones para investigación conhESC (Irlanda, Austria, Noruega),aunque un peldaño por debajo del grupode países donde se pueden generarpreembriones con fines únicos deinvestigación (Reino Unido, Bélgica,Israel, Singapur).

Para la evaluación de la calidadembrionaria de aquellos preembrionescrioconservados que han sido donados ainvestigación, el Centro de ReproducciónAsistida facilita al Banco Andaluz deCélulas Madre (BACM) toda lainformación referente a cadapreembrión; desde la calidad que poseíaprevio a la congelación, el método decongelación utilizado, así como eltiempo que llevan los preembrionescongelados, entre otros datos.

ASEBIR, dentro de la Colección deCuadernos de Embriología Clínica, hapublicado los Criterios de ValoraciónMorfológicos de Oocitos, EmbrionesTempranos y Blastocistos Humanos. Estapropuesta ha sido diseñada debido a lafalta de consenso en este aspecto clave

de la embriología clínica y que conllevaproblemas tan comunes como laimposibilidad de generar estudiosmulticéntricos con valoraciones decalidad embrionaria común, deinterpretar informes clínicos delaboratorios ajenos, o de comparardatos bibliográficos.

Desde el BACM hemos querido sumarnosa esta propuesta, para ver si estoscriterios de valoración morfológicos sonextrapolables a los preembrionescrioconservados que son donados anuestro proyecto de investigación paraderivación de hESC.

MATERIAL Y MÉTODOS

Para poder disponer de materialbiológico para nuestras investigaciones,el BACM ha realizado durante los años2006 y 2007 una campaña derecuperación de preembrionessobrantes, tanto en hospitales públicosandaluces como en clínicas privadas(Cortes y cols., 2007). Estospreembriones han pasado los Comitésnecesarios (Comité de Investigación conPreembriones Humanos de Andalucía yla Comisión de Seguimiento y Control dela Donación del Instituto de Salud CarlosIII), que han dado la autorizaciónpertinente para su uso en investigacióna nuestro proyecto de investigación.

A nivel de infraestructura y organizacióndel espacio, disponemos de un completolaboratorio de embriología, dentro desalas GMP (siglas inglesas de GoodManufacturing Practice), conequipamiento y personal cualificadopara realizar la manipulación de estospreembriones y su posterior derivación ahESCs (Cortes y cols., 2006a, b).

Para la configuración del laboratorio deembriología evaluamos las guíaspropuestas por distintas asociaciones dereproducción asistida, observando queel único enfoque fue el reproductivo,haciéndose necesaria una actualizaciónde dichas guías, debido a la existenciade laboratorios de embriología que nose dedican a realizar técnicas dereproducción (Cortes y cols., 2006b).

Los Centros de Reproducción Asistida dedonde proceden los preembrionesdonados a investigación han facilitado al

BACM toda la información referente a cadapreembrión, desde la calidad que poseíaprevio a la congelación, el método decongelación utilizado, así como el tiempoque llevan los preembriones congelados,entre otros datos. Los preembrionesfueron congelados en estadio de divisióntemprana (Día +2/+3), y fueronclasificados cualitativamente por lasClínicas de Reproducción de origensiguiendo los sistemas de evaluación de lacalidad embrionaria tradicionales(Calderón y cols., 2002). Para lospreembriones que llegaron al estadio deblastocisto utilizamos como criterio declasificación tradicional el propuesto porGardner (Gardner y cols., 1998).

Según los criterios propuestos porASEBIR, la valoración morfológica enestos estadios ha constituidotradicionalmente la base de ladeterminación de la calidadembrionaria. Sin embargo, aunque haycierto consenso entre la definición de unpreembrión de buena o mala calidad, noexiste consenso entre laboratorioscuando se trata de valorar preembrionesde calidades intermedias. El objetivo deASEBIR ha sido poder consensuar loscriterios de calidad, creando una nuevatabla de clasificación embrionaria,cuando se trata del estadio de oocitos,preembriones tempranos, o cuando setrata de blastocistos. Nosotros nosvamos a centrar en los dos últimosestadios.

La calidad embrionaria fue evaluada porun embriólogo del BACMinmediatamente después del proceso dedescongelación, y en los días sucesivoshasta su evolución a blastocisto, aunquesólo mostramos en este trabajo lasituación inicial postdescongelación(Tabla 1) y la calidad de aquellospreembriones que llegaron al estadio deblastocisto (Tabla 2).

Una vez descongelados lospreembriones fueron lavados en medioG-MOPS (Vitrolife, Suecia) y colocadosen medio de cultivo (G-1 y G-2 V.5 plus,Vitrolife, Suecia). A continuación seevaluó la calidad embrionaria en base alos criterios de evaluación tradicionalesy también en base a los nuevos criteriosASEBIR, y además se compararon con lacalidad embrionaria precongelación,según los datos facilitados por los

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Centros de Reproducción de procedencia(Tabla 1).

Los 52 preembriones que hemosutilizado para este estudio fueroncongelados mediante dos métodosdistintos de crioconservación. Por unaparte, se utilizó el protocolo decongelación denominado decongelación ultrarrápida (Trounson ycols., 1988), y que consiste en lainmersión directa de los preembriones,

incluidos en dimetil sulfóxido (DMSO),en nitrógeno líquido. Por otra parte seutilizó el protocolo de congelación lenta(Freeze-kit1, Vitrolife, Suecia), queconsiste en el tratamiento de lospreembriones con un crioprotector queocupa el lugar del agua que hay en lascélulas mediante procesos osmóticos,seguido de un programa de congelaciónllevado a cabo por un congeladorprogramable (Nicool plus, Air Liquide,España).

El objetivo de nuestro proyecto deinvestigación es poder derivar hESC apartir de estos preembriones. Estaderivación consiste en el desarrollo delos preembriones hasta estadio deblastocisto, la liberación de la zonapelucida mediante el uso de ácido Tyrode(Irvine Scientific, CA, USA), la posteriorcolocación del blastocisto desnudosobre una superficie de células desoporte (feeders), y el posterioraislamiento mecánico de la masa celular

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Tabla 1: Tabla de asignación de calidad preembrionaria según los diferentes criterios en función de las variables consideradas.

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interna (MCI), donde se encuentran lashESCs.

RESULTADOS

Día de desarrollo embrionario de lospreembriones utilizados y métodos decongelación/descongelación utilizados

Para realizar nuestros experimentoshemos utilizado 52 preembrionesquefueron congelados en estadio de divisióntemprana (D+2 y D+3). Diecisietepreembriones fueron congelados en Día +2 (32,7%), mientras que 35 fueroncongelados en Día +3 (67,3%). En todoslos casos se utilizó para descongelarel protocolo de descongelacióncomplementario al utilizado para lacongelación.

Cinco preembriones (Preembriones 1-5)fueron congelados por el método decongelación ultrarrápida (9,6%). Lospreembriones restantes (Preembriones6-52) fueron congelados por el métodode congelación lenta (90,4%).

Calidad embrionaria de los preembrionespre- y post-descongelación siguiendo losdiferentes criterios de clasificación.

Para poder derivar nuevas hESC,partimos de 9 preembriones que poseíanantes de la congelación calidad I(17,3%), 32 preembriones que poseían

calidad II (61,5%) y 11 preembrionesque poseían calidad III (21,2%). Tras elproceso de descongelación, nuestraevaluación con criterios tradicionales diolos siguientes resultados: 5 preembrionescon calidad I (9,6%), 23 preembrionescon calidad II (44,2%), 9 preembrionescon calidad III (17,3%), 10 preembrionescon calidad IV (19,3%), y tuvimos 5preembriones que se lisaron por completoy que no pudieron ser evaluados (9,6%).Según los nuevos criterios propuestos porASEBIR y tras la descongelación de lospreembriones obtuvimos los siguientesresultados: 2 preembriones de categoríaA (3,8%), 4 preembriones con categoría B(7,7%), 11 preembriones con categoría C(21,1%), y 30 preembriones con categoríaD (57,8%) (Tabla 1). Queremos destacarque en 19 preembriones (36,5%)observamos la lisis de alguna blastómeraque no comprometió la supervivencia delos preembriones, pero que se tuvo encuenta a la hora de reclasificar su calidad.

Fase experimental de descongelación yestablecimiento de hESCs: datospreliminares.

De los 52 preembriones descongelados,12 preembriones llegaron al estadio deblastocisto (23,1%), siendo en todos loscasos preembriones descongelados conel método de descongelación lenta y endía +3 de desarrollo. Estos blastocistosprocedían de preembriones de categoría

A en dos ocasiones (16,7%), depreembriones de categoría C en 3ocasiones (25,0%) y de preembriones decategoría D en 7 ocasiones (58,3%). Enninguna ocasión el blastocisto seoriginó a partir de un preembrión decategoría B.

Respecto a la calidad blastocitariaevaluada con los criterios de Gardner,obtuvimos 2 blastocistos con calidad4AA (16,7%), 2 blastocistos con calidad4BB (16,7%), 3 blastocistos con calidad3BB (25,0%), 4 blastocistos con calidad3CC (33,3%), y un blastocisto concalidad 2BB (8,3%). Atendiendo a lanueva clasificación de ASEBIR obtuvimosun solo blastocisto con categoría A(8,3%), un solo blastocisto concategoría C (8,3%), y 10 blastocistos concategoría D (83,4%). Ninguno de losblastocistos se evaluó con categoría B(Tabla 2).

Los 12 blastocistos fueron liberados dela zona pelucida utilizando ácido Tyrodey puestos sobre “feeders” para procedera la derivación de hESCs. En 7 de losblastocistos (58,3%) se pudo aislar lamasa celular interna. En el momento deescribir este trabajo, pequeñas coloniascon morfología similar a hESCs seguíanen cultivo y desarrollo buscando elestablecimiento de la línea celular,correspondiendo al preembrión número24 y al preembrión número 27.

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Tabla 2: Tabla de asignación de calidad del blastocisto según los diferentes criterios en función de las variables consideradas.

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DISCUSIÓN

En este estudio hemos intentadocomparar la calidad embrionaria de lospreembriones antes y después de lacongelación, siguiendo los criteriostradicionales, con la clasificación quetendrían estos preembriones utilizandolos nuevos criterios de ASEBIR, con el finde observar si esta nueva clasificaciónes extrapolable a los criterios de calidadembrionaria que se deducen seríannecesarios para derivar una línea dehESCs. Para poder realizar estacomparación hemos tenido que obviar ytransformar algunos términos que sóloson aplicables al campo reproductivo:

i) Derivación de hESCs en vez de capacidad de implantación

ii) Día de descongelación en lugar de díade transferencia

Además, hemos observado que enlos nuevos criterios de valoración deASEBIR no se contempla informaciónsobre los preembriones congelados, noatendiéndose por tanto a la posibilidadde que alguna blastómera resulte lisadadurante el proceso de descongelación.Cuando este hecho ha ocurrido ennuestro laboratorio, lo hemos tenido en

cuenta a la hora de determinar la calidaddel preembrión (Tabla 1). De estamanera y según el sistema de graduaciónde ASEBIR, la categoría A sería para elpreembrión de óptima calidad conmáxima capacidad de derivar a hESCs, lacategoría B de buena calidad conelevada capacidad de derivar a hESCs, lacategoría C de calidad regular con unaprobabilidad de derivar a hESCsmedia/baja, y la categoría D para elpreembrión de mala calidad con unaprobabilidad de derivar a hESCsbaja/nula. Este hecho nos hacesospechar que algunos preembrionesque hubieran podido tener categoría A óB previo a la congelación, pasaron apreembriones de categoría C ó D al serdescongelados, como el preembriónnúmero 28, que habiendo sufrido lisis dedos de sus blastómeras (5morfológicamente normales+2 lisadas)(Figura 1A), con la consecuente bajadaen el criterio de valoración ASEBIR decategoría B a categoría D (Tabla 1), llegóal estadio de blastocisto (CategoríaASEBIR D), aunque después no fuimoscapaces de aislar la MCI (Tabla 2).Además, somos conscientes que lapresencia de estos restos de lisis celularpueden dificultar, aún más que lapresencia de fragmentos citoplasmáticos,

la formación de blastocistos de buenacalidad (Figura 1B).

Con respecto a los parámetrosmorfológicos a evaluar por ASEBIR enel estadio de D+2 y D+3, vimosconcordancia entre los diferentescriterios de valoración en todas lasvariables consideradas, excepto en laque se refiere a número celular y ritmode división. Aunque la hora de lacongelación no es un dato que noshayan facilitado los Centros deReproducción, obviamos que estuvo entodos los casos dentro de los intervalosde observación recomendados porASEBIR, siendo en D+2: 44-47 horaspost-inseminación, y en D+3: 67-71horas post-inseminación. En nuestraexperiencia tuvimos el claro ejemplodel preembrión 27, que teniendocalidad 5CI por los criteriostradicionales, se clasificó con categoríaD según ASEBIR debido a un ritmo dedivisión algo más lento (Tabla 1), llegóal estadio de blastocisto, y tuvimoséxito en el aislamiento de la MCI para intentar la derivación de hESCs(Tabla 2).

Nos ocurrió lo mismo a la hora decomparar los distintos criterios de

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Figura 1 Ejemplos representativos de preembriones descongelados en el BACM. 1A: Preembrión en día +3 inmediatamentedespués de ser descongelado, y que pasó deser 7CII a 5CIII, con lo que bajó según loscriterios de ASEBIR de categoría B acategoría D.

1B: Ejemplo representativo de unpreembrión en día +5 donde se observa quelos restos de células lisadas están impidiendoque el blastocele pueda ocupar todo elvolumen del preembrión. La flecha blancaindica los restos de la célula lisada.

1C: Preembrión en día +3 inmediatamentedespués de ser descongelado, y que poseíacalidad tipo II debido a la forma elíptica de lazona pelucida. Según los criterios de ASEBIRse trata de un preembrión con categoría D,debido al bajo número de células.

1D: Preembrión en día +6, donde se observóla evolución a un blastocisto de calidad 4AAsegún Gardner, y que debido a que no llegó aorganizarse en blastocisto en día +5 pasó atener calidad C según los criterios de ASEBIR.

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valoración de la calidad cuandoobservamos el estadio de blastocisto.Mientras que vimos concordancia a lahora de evaluar las variablesconsideradas por ASEBIR como elaspecto de la zona pelucida, aspecto ytamaño de la MCI y del trofoectodermo,y el grado de expansión, cuandoevaluamos el día de organización delblastocisto pudimos comprobar quealgún preembrión que alcanza unacalidad blastocitaria óptima respecto alas demás variables, pasó a sercategoría C solamente porque seorganizó en blastocisto en D+6, enlugar de en D+5. Esto le ha ocurrido ennuestro trabajo al preembrión 13(Tabla 2). Teniendo en cuenta queprocedía de un preembrión yacatalogado como categoría D cuandoestaba en D+3, es lógico pensar que ibaa llevar acumulado este retardo en sudesarrollo (Figura 1C, D). Por tanto lavariable de número celular y ritmo de división es para nosotros

independiente de la calidadmorfológica que se consiga, ya que alpreembrión 13 también pudimosaislarle la MCI. Además, el hecho de quetodos los preembriones que llegaron ablastocisto fueran congelados en día +3corrobora los estudios reproductivos enlos que mantener en cultivo lospreembriones un día más antes de lacrioconservación (Día+2 vs. Día+3)permite seleccionar mejor la calidad deestos (Sifer et al., 2006). Esto puedetener implicaciones importantes para laselección de preembriones congeladosdestinados a derivar hESCs.

La tasa de éxito en la derivación dehESCs sigue siendo baja actualmente,necesitándose un gran número depreembriones para poder derivar unnúmero bajo de líneas establecidas ycaracterizadas, sobre todo cuando lospreembriones a los que se puede optarson los sobrantes de las técnicas dereproducción asistida, y que, por tanto,

no fueron prioritarios a la hora derealizar la transferencia. Este hecho ha dado lugar a que muchos grupos de investigación inmersos en laderivación de hESCs utilizando tanto preembriones frescos comocongelados, comiencen a tener encuenta la calidad embrionaria de estospreembriones (Zhang et al., 2006;Lerou et al., 2008). En nuestraexperiencia, las colonias que tenemosactualmente han procedido de unpreembrión de categoría A, y queevolucionó a un blastocisto decategoría D, en el caso del preembrión24 (Figura 2), y de un preembrión decalidad D, que evolucionó a unblastocisto de categoría D, en el casodel preembrión 27 (Figura 3), lo quenos hace ver una vez más que el númerocelular y el ritmo de división en nuestraexperiencia puede no ser un factorlimitante sobre la posibilidad de éxitoen derivación.

Figura 2 Evolución a blastocisto y aislamiento de la MCI del preembrión 24.

1A: Preembrión 24 en día +3 inmediatamente después de ser descongelado, y que pasó de ser 8CI a 7CII, aunque mantuvo la categoría Asegún los criterios de ASEBIR.

1B: Preembrión 24 en día +4, donde observamos la compactación en mórula.

1C: Preembrión 24 en día +6 donde ha alcanzado el estadio de blastocisto con una calidad 4BB según Gardner, y que debido a que no llegó aorganizarse en blastocisto en día +5 pasó a tener calidad D según los criterios de ASEBIR.

1D: Colonia primaria del preembrión 24 en día +9, una vez liberado de la zona pelucida y colocado en “feeders”. La flecha negra indica dondeestaría situada la MCI.

1E: Colonias con morfología similar a hESCs del preembrión 24 tras pase a “feeders” frescos una vez aislada la MCI.

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Desde el BACM opinamos que lapropuesta de ASEBIR para estandarizarlos criterios de valoración morfológicosde oocitos, embriones tempranos yblastocistos humanos es muy positiva y extrapolable en su mayor parte a la manipulación de estas células parapropósitos diferentes de lareproducción, aunque creemos que esnecesario publicar un anexo que serefiera concretamente a lospreembriones congelados, y que no seatan exigente con la variable de númerode células y ritmo de división. Esteanexo específico para estospreembriones sería útil tanto para elpropósito de derivación de hESCs,donde la evolución de los preembrionesal estadio de blastocisto es necesaria,como para los programas decriotransferencia que se realicen dentrode los Centros de ReproducciónAsistida.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por laConsejería de Salud de la Junta deAndalucía (Proyecto 0030/2006 TC yMR). Queremos agradecer al ServicioAndaluz de Salud, a la FundaciónProgreso y Salud, a ANACER y al Institutode Salud Carlos III su continuacolaboración.

BIBLIOGRAFÍA

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Figura 3 Evolución a blastocisto y aislamiento de la MCI del preembrión 27.

1A: Preembrión 27 en día +3 inmediatamente después de ser descongelado, y que conservó una calidad de 5CI. Según los criterios de ASEBIRse trata de un preembrión con categoría D, debido al bajo número de células.

1B: Preembrión 27 en día +4, donde observamos división celular.

1C: Preembrión 27 en día +6 donde ha alcanzado el estadio de blastocisto con una calidad 3BB según Gardner, y que debido a que no llegó aorganizarse en blastocisto en día +5 pasó a tener calidad D según los criterios de ASEBIR .

1D: Colonia primaria del preembrión 27 en día +8, una vez liberado de la zona pelucida y colocado en “feeders”. La flecha negra indica dondeestaría situada la MCI.

1E: Colonias con morfología similar a hESCs del preembrión 27 tras pase a “feeders” frescos una vez aislada la MCI.

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