Facultad de Ciencias, Laboratorio de Genética Humana, Universidad de los Andes, Bogotá, D. C., Colombia. Departamento de Radiología, Grupo de Física medica, Hospital Universitario Fundación Santa Fe de Bogotá, Bogotá, D. C., Colombia. Trabajo de grado. Luisa F. Olaya A.

Evaluación de daño de ADN in vitro inducido por Rayos X a baja dosis. Introducción. Los rayos X son radiaciones ionizantes que pueden actuar de una manera directa o indirecta sobre el material genético y causar daño dependiendo de la dosis que sea suministrada. Dosis bajas de rayos X han sido estudiadas durante varios años y están siendo utilizadas en diferentes tratamientos, algunas de estas dosis se han considerado como no genotoxicas.

Objetivo. El objetivo de esta investigación fue evaluar los efectos genotóxicos in vitro, por medio del ensayo de Micronúcleos y Cometa en linfocitos humanos, inducidos por rayos X a bajas dosis.

Materiales y métodos. La sangre completa de un individuo sano, fue expuesta a tres diferentes dosis de rayos X 0.1, 0.2 y 0.3 Gy. Para determinar la genotoxicidad de estas muestras se les realizó el EC y la prueba de Micronúcleos con bloqueo de citocinesis (CBMN), a los datos obtenidos se les realiza una prueba de Kruskal-Wallis y Mann-Whitney.

Resultados. Por medio del ensayo de Micronúcleos con bloqueo de citocinesis (CBMN) se encontró que cuando la dosis de rayos X se aumenta la frecuencia de micronúcleos y de células micronucleadas aumenta y que hay diferencias entre cada una de las dosis evaluadas y el control. Para el Ensayo de Cometa (EC) se encontró que el daño aumenta conforme aumenta la dosis. También se encontró que el EC presenta un umbral menor que el de CBMN (0.1 y 0.2 respectivamente). Conclusiones. El presente estudio demuestra que los efectos genotóxicos de ADN in vitro están altamente relacionados con la dosis utilizada. El umbral de detección de la prueba de cometa es 0.1 Gy siendo más bajo que el de la prueba con CBMN con 0.2 Gy. El mejor indicador para medir el daño en el ADN con el EC es La intensidad de la cola. La frecuencia de Micronúcleos y de células Micronucleadas es muy similar a bajas dosis. Palabras claves. rayos X, ensayo de micronúcleos por bloque de citocinesis, ensayo de cometa, dosis bajas, genotoxicidad, cultivos celulares in vitro.

Introducción

Los rayos X hacen parte de la radiación electromagnética son considerados radiación ionizante. Este tipo de radiación tiene la energía necesaria para causar la separación de los electrones de los átomos, moléculas, proteínas y los del ADN. Al separar el electrón del átomo este queda ionizado, dándole la capacidad de ionizar más átomos (1-2). Los rayos X son el resultado de una interacción entre electrones, llevada a cabo en un tubo de rayos catódicos, éstos rayos se producen mediante la aceleración de electrones que son frenados por un material denso y son desviados, esta aceleración es debida a la diferencia en voltajes del ánodo y el cátodo, la desaceleración de los electrones producen una liberación de energía en la forma de rayos X. Este tipo de radiación tiene una longitud de onda mas pequeña que la luz visible pero tiene una mayor frecuencia, lo que los hace mas penetrantes; de la misma forma estos rayos pueden viajar grandes distancias y atravesar diferentes tipos de materiales, permitiéndoles llegar fácilmente, ionizar e inestabilizar a moléculas como el ADN (1,3).

Los rayos X pueden actuar sobre el ADN de dos formas, de forma indirecta y de forma directa, cuando actúan de forma directa ionizan directamente el ADN, mientras que cuando actúan de forma indirecta primero inciden en otras moléculas ionizandolas, generando radicales libres, que luego actuarán sobre el ADN (1). El efecto indirecto se ha estudiado con soluciones acuosas que contienen ADN, indicando que los radicales hiroxilo (OH+) producidos por la radiólisis del agua inducen rompimiento de cadena doble y de cadena sencilla (4). El efecto directo a sido evaluado en plásmidos en donde se encontró daño de cadena sencilla (SSB) (5).

La ionizacion que estos rayos pueden causar durante un periodo determinado y a ciertas dosis puede resultar en daños a nivel molecular del tejido expuesto, las dosis altas pueden causar diferentes efectos como quemaduras en la piel, perdida de cabello, malestar, etc (1). De la misma manera las dosis bajas también tienen efectos sobre el individuo, estudios han demostrado que con bajas dosis pueden causar daño en el ADN (6-7). Las radiación a bajas dosis producen rearreglos en el ADN y en ocasiones mutaciones (8). Algunos estudios han demostrado que a partir del aumento de las dosis el daño aumenta (6,9-11). Las radiaciones causan inestabilidad en el ADN, produciendo daños, los cuales si no son reparados y la célula sigue siendo viable serán pasados a su progenie, y el daño puede persistir después de varias divisiones celulares (12). El ADN puede ser alterado por diferentes agentes, ya sean agentes físicos y/o químicos, en el caso de la radiación ionizante, esta induce un rompimiento de cadena sencilla (SSB) en G0/G1 en el ciclo celular, que da a una aberración de tipo cromático, que puede ser rápidamente reparada pero al no ser reparada puede volverse un rompimiento de cadena doble (DSB) que sería visualizada como una aberración cromosómica, también causar entrecruzamientos entre ADN-ADN y ADN-Proteína y daño en las bases purinicas y pirimidicas (13-14). Los DSB son una de las lesiones de ADN más tóxicas y pueden llevar a la muerte celular o a la inestabilidad genética (15). A bajas dosis de radiación se ha encontrado que hay una mayor frecuencia de SSB que de DSB (16).

Algunos estudios han mostrado que las radiaciones ionizantes no solo causan daño a las células blanco, sino que también están causando un efecto en las células no irradiadas, por medio del efecto bystander, efecto que está relacionado con la comunicación célula-

célular (17 -20). Este tipo de efecto, más los daños ya anteriormente mencionados que causan los rayos X, los hacen un buen precursor para aumentar el riesgo de cáncer en las personas constantemente expuestas (21-22).

Para el estudió de este tipo de daños se han utilizado diferentes metodologías, una de ellas es el ensayo de Micronúcleos por bloqueo de citocinesis (CBMN) el cual a probado ser un indicador en el riesgo de cáncer en humanos muy efectivo (23-25). Los Micronúcleos (MN), son cuerpos extra nucleares que pueden ser cromosomas completos o fragmentos de los mismos que no fueron incluidos en el núcleo de las células hijas, y por lo tanto son el resultado de lesiones no reparadas en el material genético. Puede tratarse de cromosomas completos y/o los fragmentos que quedaron afuera en la anafase, los cuales asumen un morfología de núcleo normal en interfase, sin embargo siendo éstos más pequeños que los núcleos normales (26-27). El ensayo de CBMN es un buen biomarcador para evaluar la inestabilidad inducida por agentes genotóxicos (28-29). En algunos estudios que utiliza el ensayo de CBMN se comprueba que este es un buen indicador para detectar el daño inducido por los rayos X, detectando así mismo los efectos genotóxicos inducidos a dosis bajas, tanto in vitro como in vivo (11-10,30-33).

Otras técnicas han sido utilizadas para detectar los efectos en el ADN causados por sustancias con actividad genotóxica como la radiación ionizante. Uno de los cuales es el ensayo de cometa (EC), el cual detecta lesiones en el ADN que pueden ser corregidas por los mecanismos de reparación de la célula, este método involucra la detección de rompimientos de cadena sencilla (SSB) y sitios alcali-lábiles (ALS) en poblaciones celulares (34). En un medio alcalino (pH>13), la longitud de la migración del ADN en la electroforesis nos permite identificar los niveles de rompimiento de cadena sencilla, sitios álcali-labiles y rompimientos de cadena sencilla producidos por sitios de reparación por excisión incompleta (14,34-35). Debido a que la mayoría de agentes genotóxicos inducen más rompimientos de ADN de cadena sencilla que rompimiento de cadena doble, esta versión del ensayo del cometa, ofrece un aumento de sensibilidad en la identificación de posibles agentes genotóxicos (34,36-38).

El propósito de esta investigación fue evaluar los efectos genotóxicos en cultivos celulares in vitro, por medio del ensayo de Micronúcleos y Cometa en linfocitos humanos, inducidos por rayos X a bajas dosis. Y Correlacionar los resultados obtenidos con el ensayo de CBMN y el EC, luego de la exposición de sangre periferica a rayos X. Así mismo, este estudio nos permite tener un primer acercamiento a un análisis posterior de población ocupacionalmente expuesta. Materiales y métodos

Toma de muestra Se utilizó muestras de sangre periférica de un individuo, se escogió un individuo del sexo masculino, que no sea fumador, que tenga una buena alimentación, que no haya estado expuesto a rayos X y que este en un rango de edad entre los 23 y 30. El individuo seleccionado firmó un consentimiento informado y diligenció la encuesta (ver Anexo 1). La muestra de sangre fue tomada en la Universidad de los Andes, en tubos al vacío de BD vacutainer de 10 ml con Heparina. Para la toma de muestra primero se limpió con

antibiótico y luego con alcohol (de afuera hacia adentro) el área del brazo y se tomo la muestra de sangre en esta sección. Esta sangre fue dividida en 4 tubos Barcode de 5 ml, 2ml por tubo. Tres de los tubos fueron expuestos a una dosis de rayos X y el otro tubo fue el control (ver Anexo 2). De cada tubo se utilizó 1 ml para EC y 1 ml para el ensayo de Micronúcleos. Se realizaron dos experimentos con la misma metodología. Irradiación La sangre fue transportada a temperatura ambiente al Instituto de Oncología Carlos Ardila Lulle del Hospital Universitario Fundación Santa Fe de Bogotá. Los tubos se cerraron, se sellaron con cinta de enmascarar y fueron envueltos en papel absorbente. Inicialmente se realizó la estandarización de los métodos utilizando el mismo protocolo de irradiación pero con una dosis alta de 2 Gy. Para el estudio el control negativo es la sangre no expuesta a rayos X, la cual fue sometida a las mismas condiciones de transporte. Las dosis utilizadas para este estudió fueron: 0.1, 0.2 y 0.3 Gy. Estas dosis fueron escogidas a partir de Streffer 1998 (27)y He 2000 (20). El calculo de las dosis se realizó por medio del programa Eclipse, el cual nos permitió conocer la cantidad de unidades monitor que se debían implementar para cada una de las dosis (ver Anexo3). Para cada una de las dosis, la sangre fue irradiada por medio de un ClinaclX, con un colimador de 25 x 25 cm, con electrones y con una energía de 20 MeV. Las muestras de sangre fueron aisladas con bolsas de agua de un espesor de 4.5 cm, a una distancia de 100 cm desde la fuente y para cada dosis se utilizó un tiempo diferente (Tabla 1). La irradiación se llevó a cabo por los dos lados del tubo para que los dos lados tengan la misma dosis de rayos X. Las muestras de sangre irradiadas fueron trasportadas a la Universidad de los Andes en una nevera con una temperatura de 4ºC. (ver Anexo 2).

Tabla 1: Tiempo de exposición para cada una de las dosis Dosis (Gy) Tiempo (UM unidades monitor)

0 0 0.1 11 0.2 21 0.3 32

Ensayo de Micronúcleos Para cada una de las dosis y para el control se realizaron 2 cultivos en los cuales se adicionaban 500 µl de sangre al medio de cultivo RPMI 1640 , el cual contiene un activador metabólico (PHA), suero bovino fetal, antimicóticos y antibióticos. Posteriormente, se adicionó Citocalasina B a las muestras después de 44 horas del cultivo, para bloquear la citocinesis.. A las 72 horas después de la adición de la sangre al medio, las células fueron tratadas con solución hipotónica de 0.075 M KCl durante 5 min, luego fueron prefijadas y fijadas con una solución de metanol y ácido acético (3:5) y (5:1) respectivamente. Para cada uno de los cultivos se realizaron 4 láminas. Las láminas se tiñeron con Giemsa (ver Anexo 4). El análisis de la frecuencia de MN se realizó con 4000 células binucleadas por cada una de las dosis utilizadas. Se determinó el índice de división nuclear (NDI), 500 células viables analizadas y se saco la frecuencia de células

micronucleadas (FCMN) y la frecuencia de micronúcleos (FMN) (26). Las células fueron analizadas de acuerdo con el criterio de Fenech (39). Ensayo de Cometa Inicialmente se prepararon las láminas base, con agarosa de punto de fusión normal (NMA) y se dejaron secar. A parte se diluyeron 30 µl de sangre total en PBS (1:1), a la cual se le adicionó agarosa a bajo punto de fusión (0.5%, 37ºC). Para cada una de las dosis y para el control se realizaron dos soluciones de sangre diluida y agarosa, de las cuales se adicionaron 100 µl a la lámina base, por cada solución de sangre con agarosa se realizaron 2 láminas. Luego, se le adicionó otra capa de agarosa de bajo punto de fusión. Luego las láminas se llevaron a solución de lisis durante 24 horas a 4ºC. Posteriormente se lavaron con PBS libre de Ca++ y Mg++.Las láminas se pusieron en reposo alcalino, en donde se cubrieron lentamente con buffer de electroforesis y se dejaron durante 25 min a 4ºC. Después se corrió la electroforesis a 25 V, 290 mA por 35 min. Se lavaron con bueffer neutralizante (5 min, 3 veces). Luego se le adicionaron a las láminas metanol y se dejaron secar. Finalmente fueron teñidas con Bromuro de Etidio (20 µg/mL) durante 5 min. Las láminas fueron observadas en un microscopio de fluorescencia con filtro de excitación BP546/10nm y un filtro de barrido de 590nm a un aumento de 250x. Se leyeron 25 células por lámina (Anexo 5). Por cada célula encontrada se tomo una foto, la cual fue analizada con Comet assay IV, el cual nos da la longitud de la cola (la medida horizontal desde el centro de la célula hasta el final de la cola), el porcentaje de intensidad de la cola (la intensidad de la cola con respecto a la intensidad del cometa expresada en %) y el momento de la cola (es el producto del % de intensidad de la cola y el desplazamiento que hay entre el centro de la cabeza al centro de la cola) de cada uno de los cometas encontrados. Análisis estadístico Para el análisis de los datos de Micronúcleos y de Cometa de realizó una prueba de normalidad, para saber si los datos presentaban una distribución normal (SPSS, versión 16.0). Después, se realizó una prueba de t, para saber si los dos experimentos tenía medidas significativamente diferentes. Se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para saber si existía alguna diferencia entre las diferentes dosis en estudio, también se realizó una prueba de Mann-Whitney para comparar los resultados obtenidos para cada una de las dosis con el control y para comparar las dosis entre ellas. Para el caso del CBMN se realizó una regresión, para saber cual es la tendencia que mejor se ajusta a los datos. Resultados Por medio de la prueba de t para el EC se pudo comprobar que los dos experimentos realizados eran iguales para cada una de las variables analizadas (Intensidad de la cola (%); P > 0.05; Longitud de la cola (µm): P > 0.05; Momento cola: P > 0.05). En la tabla 2 se muestra el daño (analizado desde tres variables) de las diferentes dosis para la prueba de cometa. Por medio de la prueba de Mann-Whitney se obtuvo que todas las dosis analizadas tenían una diferencia significativa con el control (P<0.01), como se muestra en

la tabla 2, de la mimas forma nos permite evidenciar que entre las dosis también hay diferencias (P<0.01). La menor dosis de rayos X en la que se presento un incremento tanto en las tres variables fue la dosis de 0.1.

Tabla 2: Porcentaje de ADN, longitud de la cola y momento de la cola en linfocitos que han sido irradiados con Rayos X.

Dosis (Gy) No. células analizadas

Intensidad de la cola (%)

Longitud de la cola (µm)

Momento cola

0 200 28.07 ± 3.26 2.72 ± 2.19 0.57 ± 0.49 0.1 200 36.07 ± 7.38* 8.93 ± 5.02* 2.12 ± 1.28* 0.2 200 38.92 ± 8.49* 14.58 ± 5.47* 3.46 ± 1.55* 0.3 200 41.49 ± 9.60* 21.49 ± 6.06* 5.19 ±2.21*

* Comparado con 0 Gy, P<0.01

En la grafica 1 se puede observar la distribución de los datos encontrados con las tres variables, en donde se observa la tendencia de los datos.

a) b)

c) Gráfica 1: Daño en células de sangre periférica, analizado por medio del EC, para tres variables.

a) Intensidad de la cola (%); b) Longitud de la cola (µm); c) Momento de la cola.

Para el ensayo de CBMN la prueba de t permitió visualizar que los dos experimento realizados eran iguales para cada una de las variables analizadas (FCMN: P > 0.05; FMN: P > 0.05). Como se observa en la Tabla 3 las dosis 0.2 y 0.3 Gy presentan una diferencia significativa en comparación contra el control (P < 0.05), mientras que la dosis de 0.1 Gy no presenta ninguna diferencia con respecto al control (P >0.05) . Por el contrario para la comparación entre las dosis de 0.2 y 0.3 Gy si se presento diferencia (P < 0.05). La menor dosis de rayos X en la que se presento un incremento tanto en FMN como en la FCMN es la dosis de 0.2 Gy.

Tabla 3. Numero de MN en células con CB después de haber sido irradiadas con Rayos X y cultivadas durante 72 hª.

Dosis (Gy) No. células analizadas

No. de células positivas con MN

No. de células con uno o mas MN FCMN ‰ FMN ‰

1 2 0 8000 17 17 2.13 ± 0.48 2.13 ± 0.48

0.1 8000 22 22 2.75 ± 0.5 2.75 ± 0.5 0.2 8000 54 51 3 7.13 ± 2.1* 7.5 ± 2.39* 0.3 8000 102 98 4 13.25 ± 9.54* 13.75 ± 3.42*

* Comparado con 0 Gy, P<0.05

En la grafica 2 se muestran las curvas de dosis-respuesta para FMN y para la FCMN contra las tres dosis estudiadas y el control. Este análisis se realizó con los cuatro datos obtenidos de los diferentes cultivos en los dos experimentos. En donde se encontró que los datos tiene una correlación exponencial, ya que esta es la que mejor se ajusta a los datos (r2= 0.879, P < 0.01), los datos se comportan por medio de la ecuación (y=0.002*0.659x) .

a) b)

Gráfica 2: Daño en células de sangre periférica, analizado por medio del ensayo de CBMN. a)

Frecuencia de micronúcleos (FMN) b) Frecuencia de células micronucleadas (FCMN)

Discusión El objetivo de esta investigación era identificar el daño en el ADN producido por diferentes dosis bajas de rayos X en linfocitos de sangre periférica, por medio del ensayo de CBMN y del EC.

La técnica de Micronúcleos con bloqueo de citocinesis CBMN a sido utilizada como un buen indicaron del daño producido por los rayos X (6,10,40-41). Los resultados en este estudio nos permiten ver que a medida que la dosis aumenta la frecuencia de células micronuceladas y la frecuencia de micronúcleos aumenta. Entre estas dos variables no existe diferencia ya que para las dosis estudiadas no es muy frecuente encontrar células con mas de un Micronúcleo, en dosis mas altas la frecuencia de Micronúcleos es considerablemente diferente a la de las células micronucleadas (42).

Para las curvas de dosis respuesta encontradas por el ensayo de CBMN (Grafica 2) se puede observar que las dos variables se ajustan a un crecimiento exponencial (y=0.002*0.659x, r2= 0.879). A diferencia de otros artículos los cuales manejan crecimiento lineales o cuadráticos (29). Para la realización de estos análisis se debe tener en cuenta que la curva de dosis respuesta fue realizada con cuatro datos para cada una de las dosis, cada uno de ellos representa el análisis de 2000 células binucleadas.

El EC también ha demostrado ser una buena prueba para la detección de daño en el ADN (18,30,32,36,43). Los resultado encontrados para esta prueba demuestran que al igual que para la prueba de CBMN el daño en las diferentes variables aumenta con respecto al aumento de las dosis estudiadas, lo cual es comparable con el estudio de He, 2000 y Jiling, 2000. De las tres variables utilizadas para medir el daño en el ADN es el momento de la cola, ya tiene en cuenta la relación de la cabeza con respecto a la cola, pero al tener unidades arbitrarias se le da mas importancia a el porcentaje de intensidad de la cola (36), esta variable es la que muestra una tendencia mas marcada en los resultados encontrados.

Los resultados encontrados permiten visualizar que la dosis minima para la prueba de CBMN, en el cual existe un aumento significativo de las frecuencias encontradas, es de 0.2 Gy, este umbral encontrado es mas bajo que los encontrados en estudios como Streffer 1998 con 0.3 Gy (27)y He 2000 con 0.25 (20). Mientras, en del EC se encontró que la dosis minima a partir del cual aumenta la dosis es después de 0.1 Gy, en comparación con He 2000 que encontró que era con 0.05 Gy (29). Las diferencias encontradas son debidas a que en la las dosis analizadas por He no incluye la dosis de 0.2, en donde en este estudio se encontró que la dosis minima con CBMN y para el EC en este estudio no se analizaron dosis mas bajas de 0.1 Gy.

Los resultados encontrados en este estudio soportan la investigación realizada por He en el 2000, en lo referente al aumento del daño con respecto a la dosis. De la misma manera que en estudio de He podemos observar que el umbral de detección de daño para la prueba de cometa es mas bajo que el que presenta la prueba de CBMN. Esta diferencia en el umbral puede ser causada por que el EC identifica el daño de cadena sencilla (SSB) mientras que el ensayo de CBMN detecta los MN que provienen de fragmentos de cromosomas y de cromosomas completos. A radiaciones bajas solo se induce el

rompimiento de cadena sencilla, el cual puede terminar o no en fragmentos de cromosoma, si termina este puede ser visualizado como un Micronúcleo, pero si no, este daño puede ser detectado por el EC que detecta niveles bajos (SSB//DSB) de daño (36), por esto es que se recomienda que se utilicen las dos metodologías, para que se puedan detectar los diferentes tipos de daño (6)

Tanto el EC como el de CBMN son buenos indicadores de los daños inducidos por radiación ionizante (30). Se puede ver que los dos ensayos son altamente reproducibles en el mismo individuo (30), pero al variar tanto las condiciones de los diferentes individuos es bueno realizar un estudio con más individuos en donde se pueda ver la variabilidad de una pequeña muestra de población y mirar la capacidad de reparación de los linfocitos. En conclusión, el presente estudio demuestra que los efectos genotóxicos in vitro están altamente relacionados con la dosis de rayos X utilizada. El umbral de detección de la prueba de cometa es mas bajo que el de la prueba con CBMN.

Agradecimientos A mi Padre y a Martín miles de millones de gracias por estar conmigo y por TODO. A Helena Groot por aceptarme en el laboratorio, por su paciencia y enseñanzas. A María Cristina por ayudarme, enseñarme y colaborarme. A las niñas de LGH y a los integrantes de LA ZOEA. A Diana y Lina por todas las veces que las moleste y por toda la ayuda que me brindaron. A mis amigos Catica, Cesitar, Adri, Dieguito, Filip y Jorgito por su gran ayuda y compañía. Y a todos los que me colaboraron de una u otra forma.

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Anexo 1 Titulo: Evaluación de los efectos genotóxicos in vitro inducido por Rayos X a baja dosis. Tipo de consentimiento: Estudios genéticos. Investigadores: Drá Helena Groot., Drá María C., Plazas., Diana M. Narváez. CONSENTIMIENTO Y AUTORIZACIÒN El Instituto de Oncología Carlos Ardila Lulle del Hospital Universitario Fundación Santa Fe de Bogota y el Laboratorio de Genética Humana de la Universidad de los Andes, lo invitan a participar en el programa de investigación “Evaluación de los efectos genotóxicos in vitro inducido por Rayos X a baja dosis”. El propósito de esta investigación es evaluar los efectos genotóxicos en cultivos celulares in vitro, por medio del ensayo de micronúcleos y cometa en linfocitos humanos, inducidos por Rayos X a bajas dosis. Esta información nos permitirá ampliar el conocimiento sobre los efectos que tienen los rayos X a bajas dosis en el ADN y nos provee información sobre los efectos potencialmente genotóxicos que afronta el personal de los servicios médicos expuesto a constantes niveles bajos de radiación. Su participación en el proyecto es completamente voluntaria. Si usted decide hacer parte del mismo, se procederá a diligenciar un consentimiento informado, así como la realización de un cuestionario, para suministrar información personal referente a su edad, estado de salud y estilo de vida, y, a tomar una muestra de sangre que será utilizada en la elaboración de los ensayos pertinentes. Este formato de consentimiento cuenta con información que lo ayudará a decidir si desea participar. Tome el tiempo que requiera, lea cuidadosamente este formato, y formule las preguntas que tenga al médico o personal del estudio. ¿Por qué se me esta pidiendo que proporcione sangre para estos análisis? Se le esta solicitando que done una muestra de sangre, por que en las células que ella contiene, se encuentra el material genético o ADN, con el cual se van a realizar los diferentes ensayos. La información obtenida permitirá evaluar los posibles efectos de las irradiaciones a bajas dosis con Rayos X. ¿Qué efectos adversos (negativos) puedo sufrir al donar esta muestra de sangre? Se extraerá una cantidad de sangre venosa de 13 ml para los diferentes análisis correspondientes a tres tubos de ensayo; este procedimiento es considerado como un riesgo mínimo, puede sentirse además del dolor natural de la punción una leve molestia ó un pequeño hematoma en el sitio de punción, procedimiento que no pondrá en peligro la su vida y salud. ¿Cómo se guardará esta sangre y quien podrá utilizar la información que se obtenga de los resultados? La muestras de sangre serán procesadas en el laboratorio y será almacenada en forma segura y se etiquetará. La información que usted suministre en la encuesta serán manejadas confidencialmente, y no serán utilizadas para fines distintos a los científicos. Adicionalmente usted puede contar con la libertad de retirar su consentimiento en cualquier momento y dejar de participar en el estudio si así lo desea. ¿Tendré algún beneficio inmediato del resultado de estos análisis? No, estos análisis se llevaran a cabo como parte de una investigación y no proporcionan ningún beneficio económico; sin embargo, su participación servirá de ayuda para alcanzar nuevos conocimientos sobre el efecto de las bajas dosis de Rayos X.

He leído la información que contiene este formulario de consentimiento. He preguntado al personal las dudas que he tenido en este momento sobre mi participación en la investigación en la recolección de la muestra, y sobre la conservación de la muestre de sangre. Nombre del participante Firma del participante Nombre del testigo Firma del testigo Firma del investigador que administra el consentimiento Fecha

CUESTIONARIO PERSONAL Nombre 1. Edad 2. Fecha de nacimiento / / 3. ¿Fuma? ( ) Si ( ) No – Si su repuesta es NO, pase a la pregunta 8. 4. ¿Cuántos años lleva fumando? 5. ¿Todavía fuma? ( ) Si ( ) No – Si su respuesta es NO, ¿hace cuántos años lo dejó? 6. Si su respuesta es afirmativa, ¿Cuántos cigarrillos al día fuma? ( ) Menos de medio paquete ( ) De medio a un paquete ( ) Uno a dos paquetes ( ) Más de dos paquetes 7. Fuma también: ( ) Pipa ( ) Tabaco - ¿Cuántas veces al día? 8. Medicamentos utilizados rutinariamente / Indicar la frecuencia: ( ) Vitaminas y suplementos ( ) Píldoras para presión ( ) Antibióticos ( ) Insulina; Tranquilizantes ( ) Relajantes musculares ( ) Otros 9. Está bajo algún tipo de tratamiento ( ) Si ( ) No ¿Cuál? 10. ¿Consume bebidas alcohólicas? ( ) Si ( ) No ¿Cuál? 11. Con que frecuencia consume bebidas alcohólicas? Si su repuesta es NO, pase a la pregunta 12. ( ) Una ves por semana ( ) Mas de una ves por semana ( ) Una ves al mes ( ) Mas de una ves por mes ( ) Otros 12. ¿Ingiere frutas y verduras? ( ) Si ( ) No ¿Cuáles? 13. ¿Realiza algún tipo de deporte? ( ) Si ( ) No ¿Cuál? 14. ¿Cuando fue la ultima ves que estuvo expuesto a Rayos X? ( ) Hace una semana ( ) Hace mas de una semana ( ) Hace un mes ( ) Hace más de un mes ( ) Otros 15. Caso de cáncer en la familia: ( ) Si ( ) No – Grado de parentesco: 16. Tipos de cáncer: ( ) Piel ( ) Mama ( ) Leucemia ( ) Esófago Otros

Anexo 2 Toma de muestra de sangre 1. Se escoge un individuo el cual no fuma, no consume alcohol regularmente, ni ningún tipo de

droga y que tenga una alimentación balanceada. Este individuo se le hara firmar un conocimiento informado y realizara una encuesta.

2. Se realiza la toma de muestra de sangre periférica en la Universidad de los Andes, en la cual se le extraen 10 ml de sangre. Este proceso se llevara a cabo por medio de un tubo al vacío de BD vacutainer de 10 ml. Para la toma de muestra primero se limpia con antibiótico y luego con alcohol (desde adentro hacia fuera) y se toma la muestra de sangre.

3. La sangre obtenida se divide en 8 tubos de barcode de 5 ml, en cada uno de los tubos se deposita 1ml de sangre. Para cada dosis de rayos X se tiene un tubo. Este proceso se realiza en la cámara de extracción para que la sangre no sea contaminada.

4. La sangre será trasportada a temperatura ambiente, al Instituto de Oncología Carlos Ardila Lulle del Hospital Universitario Fundación Santa Fe de Bogota. Los tubos se encuentran cerrados, sellados con cinta de enmascarar, envueltos en papel absorbente.

Irradiación El acelerador lineal es utilizado para realizar radioterapia de pacientes enfermo de cáncer, este suministra una dosis uniforme de rayos X de alta energía al la región tumoral. En el acelerador lineal se lleva a cabo la aceleración de electrones y el desvío de los mismo por medio de un metal pesado, El acelerador lineal es manejado por radioterapeutas.

1. Para cada una de las diferentes dosis, la sangre fue irradiada por medio de un acelerador lineal Clinac iX, con un colimador de 25 x 25 cm, con electrones y con una energía de 20 MeV. La muestra de sangre es aislada con bolsas de agua con un espesor de 4.5 cm, las bolsas fueron puestas en una caja de icopor de 10 cm de ancho con 30 cm de largo y 25,5 cm de alto (ver Figura 1), a una distancia de 100 cm desde la fuente y para cada dosis se utilizó tiempos diferente (Tabla 1). El calculo de las dosis se realizó por medio del programa Eclipse, el cual nos permitió conocer la cantidad de unidades monitor que se debían implementar para cada una de las dosis (ver Anexo3). La irradiación se lleva a cabo por los dos lados del tubo para que los dos lados tengan la misma dosis de rayos X.

2. Se irradia a 0.1, 0.2 y 0.3 Gy. 3. Las muestras de sangre irradiadas son trasportadas a la Universidad de los Andes en una nevera a

4ºC.

Figura 1: Caja de icopor en la cual fueron puestas las muestras he irradiadas.

Anexo 3

Datos obtenidos por medio del programa eclipce para conocer la cantidad de unidades monitor que se debían implementar para cada una de las dosis (a) 0.1 Gy; b) 0.2 Gy; c) 0.3 Gy)

a)

b)

c)

Anexo 4 Protocolo del ensayo de micronúcleos por bloqueo de Citosinesis (Basado en el Test de Micronúcleos en linfocitos humanos de Claudia Bolognesi, Junio del 2006. Laboratorio de Genética Humana)

• Preparación del cultivo - Primera etapa (en condiciones de esterilidad)

1) En un tubo Flacon de 15ml se adicionan 4.7ml de medio previamente descongelado a 37 ºC. Por cada dosis se utilizan 2 tubos.

2) Se adiciona 75 µl de PHA (Se hace un poco de vortex). 3) Se le adiciona 300 µl la sangre (Se mezcla delicadamente por inversión). 4) Los cultivos se guardan inclinados en incubadora de 37 ºC, durante 44 horas. 5) A las 24 horas los cultivos deben ser mezclados delicadamente por inversión.

- Tratamiento con Citocalasina B (después de las 44 horas) 6) Descongelar las alícuotas (estas no deben ser recongeladas) 7) Adicionar 100 µl de Citocalacina B y se dejan en incubadora de 37 ºC, durante 28 horas.

- Segunda etapa (después de 72 horas)

Preparar antes: - Poner la solución hipotónica en baño de Maria a 37ºC. - Preparar solución prefijadora y fijadora. - Poner metanol a -20ºC - Tener listas las pipetas Pasteur largas y cortas, chupas y puntas azules. - Se conecta la bomba de vació - Se pone la centrifuga a 4ºC - Por último se traen las muestras

1) Se sacan los cultivos y se resuspenden por inversión. 2) Se ponen en la centrifuga por 10 minutos en 1000 rpm. 3) Se aspira el sobrenadante con la pipeta Pasteur larga que está conectada a la bomba de

vació, dejando aproximadamente 500 µl. El pellet se resuspende delicadamente con vortex. (Se puede reutilizar la misma pipeta Pasteur por que esta no toco el cultivo).

4) Se adicionan 5 ml de solución hipotónica, se deja que actúe durante 5 min máximo. 5) Se resuspende 2 o 3 veces con pipeta Pasteur corta. 6) Se le adiciona 400 µl de prefijador y se resuspende por inversión. 7) Se vuelve a centrifugar inmediatamente por 10 minutos en 1000 rpm. 8) Se aspira el sobrenadante con la pipeta pasteur larga que esta conectada a la bomba de

vació, dejando aproximadamente 500 µl. El pellet se resuspende delicadamente con vortex. - En este punto del proceso se tienen dos posibilidades: si se desea guardar las muestras sigue con el paso 9 o si se va a continuar sigue con el paso 12.

9) Se adicionan 5 ml de metanol frió. 10) Se ponen en la centrifuga por 10 minutos en 1000 rpm. 11) Se aspira el sobrenadante con la pipeta pasteur larga que esta conectada a la bomba de

vació, dejando aproximadamente 500 µl. El pellet se resuspende delicadamente con vortex. 12) Se adicionan 5 ml de fijador y se resuspende por inversión. 13) Se ponen en la centrifuga por 10 minutos en 1000 rpm. 14) Se aspira el sobrenadante con la pipeta pasteur larga que esta conectada a la bomba de

vació, dejando aproximadamente 500 µl. El pellet se resuspende delicadamente con vortex. 15) Se vuelve a adicionan 5 ml de fijador y se resuspende por inversión. 16) Se ponen en la centrifuga por 10 minutos en 1000 rpm.

17) Se aspira el sobrenadante con la pipeta pasteur larga que esta conectada a la bomba de vació, dejando aproximadamente 500 µl. El pellet se resuspende delicadamente con vortex.

• Preparación de láminas Preparar antes:

- Lavar las laminas con metanol frió y guárdalas a -20 ºC. 1) Se resuspende con un gotero (Fisher brand 13-711-20) y se ponen 3 gotas en cada lamina

que esta a 20 º C y se deja secar. 2) Se ponen en la gradilla de coloración la cual contiene Giemsa durante 10 min. 3) Se pasan por una gradilla con agua desionozada. 4) Se dejan secar en la oscuridad durante 24 h y se leen.

• Lectura de laminas

Para la leer láminas de linfocitos binucleados se debe realizar por medio de un microscopio óptico con un aumento de 40X. Para cada uno de los tubos re realizan 4 laminas. Para el análisis de cada una de las láminas se debe obtener la siguiente información de acuerdo con los criterios estandarizados (Fenech et al. 2003):

1. El numero de micronúcleos en 1000 células binucleadas, por lamina. 2. El numero de MN por célula binucleada, en una sola célula binucleada debe haber de 0 a

3 MN en linfocitos de un individuo sano, pero este puede ser mayor dependiendo de la exposición.

3. La frecuencia de células binuceladas con MN en 1000 células binucleadas. 4. La frecuencia de puentes nucleoplasmicos en 1000 células binucleadas. 5. La proporción de células mononucleadas, vinculadas, tri-nucleadas y tetra-nucleadas por

500 células observadas. Por medio del índice de proliferación celular (PI). PI= N (Mono) + 2(Bi) + 3(Tri) + 4 (Tetra)

N N= numero de celulas viables observadas, se espera que sean mayor o igual a 500. La frecuencia de micronucleos se expresa como el número de células binucleadas que contienen micronucleos por 1000 células binucleadas analizadas.

• Preparación de las soluciones - Medio de cultivo (Para 250 ml de medio) Porcentajes RPMI 1640 (Gibco, N°Cat. 1333032) se debe conservar a 4 ºC Suero Bovino Fetal se debe conservar a -20 ºC 10% Fitohemaglutinina (PHA) (Gibco, N°Cat. 1279645) se debe conservar a 4 ºC 1.5% Pen / STRP (Gibco, N°Cat. 15070-063) 1%

1) Pesar 2.4g de medio RPMI y se le adicionan 225 ml de H2O destilada 2) Se filtra el medio por bomba de vació. 3) Se le adiciona 25ml de suero bovino fetal y 2.5ml de Pen / STRP.

La fitohemaglutinina se adiciona antes de la sangre (El medio de cultivo sin fitohemaglutinina se conserva por meses a -20 º C, pero con fitohemaglutinina el medio se conserva máximo durante una semana)

4) El medio se conserva a 37 ºC - Citocalasina B (Sigma, C6762-50M6)

1) Preparación de la solución fisiológica:

Se pesan 0.9g de NaCl y se mezclan con 100ml de H2O desionizada. Para esterilizar la solución se ponen en autoclave durante 30 min.

2) Preparación de Citocalasina B: Se pesan 5 mg de citocalasina y se mezclan con 1,25 ml de DMSO, luego se le adicionan (concentración final: 6 µg / ml) Disolver primero en DMSO, luego se adicionan 15,4 ml de solución fisiológica estéril. Luego este se debe conservar a -20 ºC en alícuotas de 1 ml. (concentración final: 6 µg / ml)

- Solución Hipotónica 1) Se mezclan 2,8 gm en 500 ml H2O destilada

- Soluciones de Fijación (se deben prepara 30 min antes de ser utilizado) 2) Solución prefijadora: se mezclan metanol y ácido acético en una proporción de 3:5

respectivamente. 3) Solución fijadora: se mezclan metanol y ácido acético en una proporción de 5:1

respectivamente.

Anexo 5 Protocolo del ensayo del Cometa (Basado en el EC de Tice 1993, Hartmann 2003. Laboratorio de Genética Humana)

• Preparación de láminas base 1) Preparar agarosa de bajo punto de fusión (LMA) al 0.5% (500 mg en 100 mL de PBS sin Ca++ ni

Mg++) y agarosa de punto de fusión normal (NMA) al 1 % (500mg por 50 ml PBS sin Ca++ ni Mg++). Se ponen en el microondas hasta que la agarosa se disuelva. Limpiar las con metanol y páselas sobre la llama azul para remover aceite y polvo.

2) Mientras que la agarosa a punto de fusión norma este caliente, sumerja las láminas hasta un tercio de la lamina y remuévala de uno de los lados. Seque la agarosa sobre la estufa y deje la lámina en una superficie plana para que se seque. Deje la lamina en un cuarto a temperatura ambiente hasta que esta sea utilizada; evite condiciones con alta humedad.

• Para sangre total 1) Adicione 30 µl de Sangre Total diluida con PBS (1:1) a 470 µl de agarosa a bajo punto de fusión

(0.5%; 37ºC). Se cubre el gel con una laminilla y se pone a 4ºC durante 8 min. 2) Gentilmente adicione otra capa de agarosa (100 µl de agarosa a bajo punto de fusión) a la lámina,

cúbrala con una laminilla 4ºC durante 8 min 3) Se retira la laminilla y introducir en un coplin que contiene buffer de lisis. Llevar a 4ºC durante

24 horas.

• Electroforesis 1) Después de que las laminas son sacadas de la solución de lisis, y se lavan con PBS libre

de Ca++ y Mg++. 2) Ubique las laminas en la cámara de electroforesis, estas deben estar con la parte del gel

hacia el ánodo de la cámara, dejándolas lo mas pegadas posible. 3) Adicione el buffer de electroforesis lentamente, para evitar daño en los geles, y dejar

durante 25 min a 4ºC (reposo alcalino) 4) Corra la electroforesis horizontal a 25 V, 290 mA por 35 min. 5) Retirar el buffer con pipeta. Sacar las laminas y adicionar Buffer neutralizante (Tris- HCl

pH:7.5 ) utilizando el gotero y dejando por 15 min (5minutos x 3 veces) 6) Adicionar 2 mL de metanol absoluto con el gotero y dejar por 5 minutos. 7) Adicionar 20µL de la solución de trabajo de Bromuro de Etidio (20 µg/mL) a cada

lámina que va a ser leída. Poner laminilla y dejar durante 5 minutos. 8) Retirar cuidadosamente la laminilla. Introducir la lámina horizontalmente en un Beaker

con dH2O fría para lavar el Bromuro de Etidio. Repetir 2 veces más. 9) Poner la laminilla y dejar las láminas sobre papel húmedo hasta su lectura. 10) Observar en microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación BP 546/10nm y un

filtro de barrido de 590nm a un aumento de 250x o 400x. 11) Se leen 25 células por lámina y se toma una foto, la cual es analizada con Comet assay IV

(34), el cual nos da la longitud de la cola (la medida horizontal desde el centro de la célula hasta el final de la cola), el porcentaje de intensidad de la cola (la intensidad de la cola con respecto a la intensidad del cometa expresada en %) y el momento de la cola (es el producto del % de intensidad de la cola y el desplazamiento que hay entre el centro de la cabeza al centro de la cola)de cada uno de los cometas encontrados.

• Preparación de las soluciones

1) PBS (Libre de Ca++ , Mg++ ):

Reactivo Cantidad (gr) NaCl 8 4 2 KCl 0.2 0.1 0.05

KH2PO4 0.2 0.1 0.05 Na2HPO4 *7H2O 2.3 1.15 0.575

Agua Desionizada (ddH2O)

990mL 480mL 225mL

Volumen Total 1000mL 500mL 250mL

* Ajustar pH a 7.4 completar al volumen final con ddH2O. Almacenar a temperatura ambiente 2) Solución de Lisis:

SOLUCIÓN STOCK

Reactivo Cantidad (gr) NaCl 2.5M 146.1 73.05 36.525

EDTA 100mM 37.2 18.6 9.3 Tris 10mM 1.2 0.6 0.3

NaOH 12 6 3 Agua destilada (dH2O) 800mL 300mL 150mL

Volumen final 1000mL 500mL 250mL *Dejar disolver los reactivos por 20 minutos y ajustar el pH a 10 con HCl concentrado o NaOH. Completar el volumen final con dH2O. Esterilizar por filtración y guardar a temperatura ambiente. SOLUCIÓN DE TRABAJO (Se hace cada vez que se va a trabajar)

Reactivo Cantidad (mL) Solución stock 445 178 89

Dimetilsulfoxido 10% 50 20 10 Triton X-100 1% 5 2 1

Volumen final 500mL 200mL 100mL * Poner la solución de trabajo en los coplins, aproximadamente 50 ml por cada uno (cada coplin tiene capacidad para 8 láminas). Refrigerar mínimo 1 hora antes de introducir las láminas para que alcance una temperatura de 4ºC. El DMSO previene la oxidación generada por el Hierro liberado cuando se usa sangre o tejido animal durante la incubación en sln de lisis. 3) Buffer de Electroforesis:

SOLUCIÓN STOCK

NaOH 10N

Reactivo Cantidad (gr) NaOH 200 80 40 20 dH2O 500mL 200mL 100mL 50mL

*La vida útil de este reactivo es 15 días. Almacenamiento a temperatura ambiente. EDTA 200mM

Reactivo Cantidad (gr) EDTA 9.924 4.964 2.482 dH2O 200mL 100mL 50mL

* pH 10. Almacenamiento a temperatura ambiente. SOLUCIÓN DE TRABAJO (Se hace cada vez que se va a trabajar)

Reactivo Cantidad (mL) NaOH 10N 150 90 75

EDTA 200mM 25 15 12.5 dH2O 5000mL 3000mL 2500mL

*Mezclar muy bien con ayuda de un magneto. pH mayor a 13. La cámara de electroforesis se trabaja con un volumen de 2200 mL aproximadamente. Enfriar (4ºC) por 20 minutos antes de poner las láminas en la cámara.

4) Solución Neutralizante:

Reactivo Cantidad (gr) Tris 0.4M 48.5 24.25 12.125

dH2O 800mL 300mL 150mL Volumen Final 1000mL 500mL 250mL

*Ajustar el pH a 7.5 con HCl, completar el volumen final con dH2O. Almacenar a temperatura ambiente.

5) Solución de Bromuro de Etidio: SOLUCIÓN STOCK 10X

Reactivo Cantidad (mg) Bromuro de Etidio 20µg/mL 10 5

dH2O 50mL 25mL * Manejar el Bromuro de Etidio con precaución!!!! Almacenar a temperatura ambiente en un frasco oscuro y envuelto en papel aluminio. SOLUCIÓN DE TRABAJO 1X (2µg/mL)

Reactivo Cantidad (mL)

Solución Stock 2.5 1 dH2O 22.5 9

Volumen final 25mL 10mL *Almacenar a temperatura ambiente en frasco oscuro y envuelto en papel aluminio.