INDICE.

1. INTRODUCCIÓN 1

1.2. Objetivo 2 1.3. Objetivos específicos 2

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3

2.1. El hierro en el suelo 3 2.2. Causas edáficas de la falta de disponibilidad de hierro para la planta 3 2.3. Mecanismo de reacción contra la clorosis férrica por parte de las plantas 6 2.4. Importancia fisiológica del hierro en la planta 6 2.5. Experiencia de extracción de hierro activo en otras especies vegetales 7

3. MATERIALES Y MÉTODOS 8

3.1. Determinación del tiempo de extracción 8 3.2. Ensayos de extracción en paltos y cítricos 9 4.1. Resultados de tiempo de extracción 12 4.3.1. Resultados en palto 14 4.3.2. Resultados en limonero 19 4.4. Comparación de costos para ambos métodos de extracción 25

4. CONCLUSIONES 26

5. RESUMEN 27

6.-ABSTRACT 28

LITERATURA CITADA 29

ANEXOS 31

1

1. INTRODUCCIÓN

La clorosis férrica es un problema común en los suelos calcáreos, los cuales impiden

la absorción de hierro por parte de la planta (KRAUSKOPF, 1983). Éste tipo de suelo

se presenta ocasionalmente en la parte baja de la cuenca del Aconcagua, lugar con

una acentuada dominancia de cultivos subtropicales como son; paltos y cítricos

(ODEPA, 2004). En la zona antes mencionada, para la medición de la concentración

de este microelemento el método más usado es la medición de hierro total. En este

estudio se propone un método que mide el nivel de hierro activo, el cual

proporcionaría una medición más exacta del nivel de hierro fisiológicamente activo,

cuya deficiencia produce clorosis férrica (BONILLA 2000, SALISBURY y ROSS

1992), éste se basa en estudios anteriores que señalan que el método realiza una

extracción selectiva de hierro, no extrayendo las moléculas oxidadas que constituyen

la gran mayoría del hierro fisiológicamente inactivo (KATYAL y SHARMA, 1980.

VILLANUEVA, 1992).

En el caso de este método, no se tienen referencias de estudios realizados con paltos

(Persea americana Mill.), por lo tanto, se ha elegido ésta especie dada su importancia

económica en la zona (ODEPA, 2004) y la alta incidencia de clorosis férrica que

existe en cultivos realizados en suelos calcáreos. En el caso del limonero (Citrús

limón) este se escogió, además de su importancia económica, porque en esta especie

existen datos de publicaciones anteriores (MOHAMMAD, NAJIM y KHERSAT

1998), que entregan una idea previa de la metodología a seguir.

El Laboratorio de Suelos y Análisis Foliar de la Facultad de Agronomía de la

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso actualmente realiza la medición de

hierro en hojas por medio del método de hierro total descrito por SADSAWKA

(2004).

2

El problema del uso del método de medición de hierro total es que, originalmente éste

no fue creado para su uso en diagnóstico nutricional, sino para observar contenido

porcentual de hierro en material vegetal, de ahí su baja confiabilidad (VALDES,

2004; MOHAMMAD, NAJIM y KHERSAT, 1998; VILLANUEVA, 1992.

KATYAL y SHARMA, 1980, entre otros) en comparación al método de medición de

hierro activo. Por esto el método ocupado debe ser el que mida hierro activo y debe

ser calibrado para la zona, lo que permitirá su uso de manera cotidiana y confiable.

El presente estudio pretende hacer una adaptación y/o validación del método de

análisis de hierro activo a las condiciones de la zona de Quillota y hacer estas pruebas

en los cultivos frutales más importantes como son paltos y limonero.

1.2. Objetivo

• Comparar y comprobar las distintas metodologías de extracción de hierro

activo, tanto en paltos como en limonero en la zona de Quillota.

1.3. Objetivos específicos

• Determinar el tiempo óptimo de extracción de hierro activo foliar, tanto en

palto como en limonero.

• Determinar si existe una correlación significativa entre el nivel de color y de

hierro activo para las distintas metodologías de extracción usadas.

• Hacer una comparación de las distintas metodologías y determinar cuál es la

técnica que entrega la información más ajustable a la sintomatología

entregada por las hojas.

3

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. El hierro en el suelo Según FASSBENDER (1987), el hierro es el cuarto elemento más abundante en la

corteza terrestre superior. Su carácter de elemento absorbido en cantidades pequeñas,

se debe a la escasa solubilidad de la gran mayoría de sus compuestos en el estado

trivalente, este es el estado del hierro que se presenta en suelos bien aireados.

También en suelos con pH alto, el hierro no se encuentra disponible para los

vegetales, porque precipita como óxidos e hidróxidos (KRAUSKOPF, 1983).

2.2. Causas edáficas de la falta de disponibilidad de hierro para la planta

La clorosis férrica ocurre en suelos que tienen un alto contenido de carbonatos de

calcio (y alto pH), que puede ser agravado por malos manejos de riego, dando por

resultado una pobre aireación del sistema radicular. Inicialmente el pH alto del suelo

reduce la disponibilidad de hierro, dando origen a la clorosis férrica (AGUSTI, 2000).

El origen de la clorosis férrica en más detalle puede ser explicado desde el origen

edáfico del hierro activo según HEM y CROOPER (1960) de la siguiente forma,

desde el desgaste de silicatos u óxidos de hierro que es un proceso que puede ser

ejemplificado mediante las siguientes reacciones:

4

Fe2SiO4 + 4H2O 2FeII + H4SiO4 + 4OH-

Ó

Fe2SiO4 + 4H2O + 4CO2 2FeII + H4SiO4 + 4HCO3-

Según la concentración de CO2 en las soluciones de desgaste. Siempre y cuando la

solución permanezca en estado no oxidante y por lo menos ligeramente ácida, el

hierro es estable, ya sea como ion simple o formando complejos, pudiendo ser

transportado así a grandes distancias. Sin embargo, la migración en esta forma no es

común, debido a que las soluciones de desgaste generalmente captan oxigeno, estas

reaccionan con suelo o rocas que aumentan su pH, o fluyen a través de materiales

capaces de adsorber cationes. El efecto del oxigeno es generalmente la precipitación

de óxido férrico hidratado:

4FeII + O2 + 10H2O 4Fe (OH)3 + 8H+

Ó

4FeII + O2 + 8HCO3- + 2H2O 4Fe (OH)3 + 8CO2

A pH mayor de 5, no puede existir el hierro en forma estable en soluciones oxidantes

mayores de 0,01 ppm, excepto en la forma de complejos orgánicos o de Fe(OH)3

coloidal. Un incremento en el pH sin oxidación puede propiciar la precipitación de

uno o más compuestos insolubles de hierro activo, siendo los más comunes

carbonato, sulfuro o silicato hidratado. Esto se ve ilustrado de una manera simple en

la Figura 1.

5

Fuente: Lindsay and Norvell(1978)

Figura 1. Relación de actividad de micronurtrientes con relación al pH.

6

2.3. Mecanismo de reacción contra la clorosis férrica por parte de las plantas Según MARSHNER (2003), las dicotiledóneas se caracterizan por dos distintas

respuestas ante la deficiencia de hierro. Estas además se caracterizan por un aumento

en la excreción de protones al exterior de las raíces. Esta función se ve ayudada por la

quelación de iones de hierro en el suelo por compuestos orgánicos que facilitan la

entrada del hierro a la planta. Estas respuestas antes mencionadas producen cambios

anatómicos y morfológicos en las raíces particularmente en la formación de células

transportadoras y estructuras rizodermales.

La mayor actividad de la membrana debido a la mayor excreción de protones supone

el aumento de actividad en dos reductasas; la primera en funcionamiento constante y

de baja capacidad y la segunda de alta capacidad reductora que es inducida por la

deficiencia de hierro (MARSHNER, 2003).

Si bien el bombeo protónico transmembranal hecho por las reductasas contribuye a la

red de excreción de protones bajo deficiencia de hierro, existe también la teoría que

sugiere que un aumento de la actividad membranal seria el gran responsable del

aumento exterior de la concentración de protones. Altas concentraciones de HCO3-

inhiben este sistema de defensa contra la clorosis férrica (MARSHNER, 2003).

2.4. Importancia fisiológica del hierro en la planta

El hierro en la planta es importante, principalmente por dos funciones: la primera,

forma parte de los grupos catalíticos de muchas enzimas redox del tipo

hemoproteínas, como son: citocromos (tanto mitocondriales como cloroplastidicas),

catalasas, peroxidasas, etc., que presentan un grupo hierro porfirina como núcleo

7

prostético del grupo hemo. En segundo lugar, el hierro se encuentra unido a grupos

tiólicos de la cisteina en otras proteínas, hierro azufre, las sulfoferroproteínas. Estas

proteínas son clave en la fotosíntesis, como es el caso de ferredoxina, la nitrito

reductasa; en la fijación del nitrógeno (nitrogenasa) y en la respiración. En los estados

de oxidación FeII y FeIII. Explican su presencia en estos sistemas enzimáticos, al

actuar como transportador de electrones en los mismos (BONILLA, 2000).

2.5. Experiencia de extracción de hierro activo en otras especies vegetales En experiencias efectuadas en duraznero, VALDES (2004) concluyó que la

concentración de hierro total en el brote no presentó diferencia significativa entre los

árboles, tampoco tuvo relación con el nivel de clorofila en la hoja. Por lo tanto según

este estudio se descarta el análisis de hierro total en este tejido como indicador de

clorosis férrica en duraznero.

En estudios realizados en limones por MOHAMMAD, NAJIM y KHERSAT (1998),

se concluyó que el método de medición de hierro total no es valido, pero sin embargo

el método que cuantifica hierro activo generó una relación significativa entre el grado

de clorosis y el nivel de hierro activo. En esta experiencia también se llegó a la

conclusión que señala que el mejor método de extracción de hierro activo es el que

se realiza empleando 1N HCl en hojas secas.

Estudios realizados por KATYAL y SHARMA (1980) sobre muestras de arroz

concluyeron que la extracción de hierro activo relaciona el uso de fenantrolina con el

contenido de clorofila (R²=0.69), al igual que concluyeron que el tiempo óptimo de

extracción era de 20 horas.

8

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Determinación del tiempo de extracción

Para determinar el tiempo mínimo u optimo de extracción de hierro activo en cítricos

se utilizó el estudio realizado en limones por MOHAMMAD, NAJIM y KHERSAT

(1998), el cual arrojó que un tiempo mayor a 16 horas es suficiente para extraer el

hierro activo de las hojas de limonero.

En el caso del palto el tiempo óptimo se determino según métodos descritos por

SADZAWKA (2005). MOHAMMAD, NAJIM y KHERSAT (1998), KATYAL y

SHARMA (1980), adaptados de la siguiente forma: se muestrearon sesenta hojas

nuevas de palto de un árbol sano sin síntomas de deficiencia de hierro. Estas muestras

fueron lavadas con agua destilada, el material vegetal fue triturado en un procesador

de alimentos marca Moulinex durante 30 segundos a toda potencia. Luego, se pesaron

2 g de material vegetal fresco, los cuales se depositaron en un matraz Erlenmeyer

donde se agregaron 20 ml de solución de 1,5%-fenantrolina o 1N HCl, el proceso se

hizo en duplicado. Estas muestras se dejaron en extracción 16, 24 y 32 horas, a

temperatura ambiente, para luego filtrar con papel de tamaño de poro de 11 µm. En

este filtrado se determinó la concentración de hierro usando un espectrofotómetro de

absorción atómica. Para el caso de la extracción en fresco con, 1N HCl el

procedimiento se hizo de manera similar pero, en vez de Fenantrolina esta se

reemplazo con una de solución de 1N HCl.

El análisis de datos se hará mediante el uso de gráficos de barra con el objetivo de

observar a simple vista si existe alguna tendencia clara en extracción con respecto al

tiempo.

9

3.2. Ensayos de extracción en paltos y cítricos

El muestreo se hizo a distintos grados de clorosis, en brotes nuevos del año en curso,

en ambas especies; limonero, y palto. Se escogieron dos huertos, con suelos calcáreos

(se comprobó esta condición en terreno de manera cualitativa mediante la simple

aplicación de ácido clorhídrico al suelo), ubicados en la Quinta Región, Valle de

Quillota, sector de San Isidro (71º’ W. y 32º S); Ambos huertos presentaban evidente

sintomatología de clorosis férrica. Se muestrearon; 18 árboles en limonero y 17 en

palto, 20 hojas por árbol. Con fecha; 1 de mayo de 2005 y 19 de mayo 2005

respectivamente. El criterio de muestreo para el estudio fue el siguiente; en

subtropicales y en plantas en general, la clorosis férrica se manifiesta como una

tonalidad inicialmente verde amarillenta y finalmente amarilla, que adquieren las

hojas de las brotaciones jóvenes a excepción de las nervaduras, las cuales permanecen

verdes (AGUSTI, 2000, BONILLA, 2000, SALISBURY y ROSS, 1992).

Las muestras fueron posteriormente transportadas al Laboratorio de Suelos y Análisis

Foliar de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de

Valparaíso y se almacenaron durante 24 horas a 7ºC antes de comenzar las

mediciones.

Una vez en el laboratorio, se midieron las unidades SPAD traducibles en

concentración de clorofila, de manera no destructiva, en todas las hojas de la muestra,

para esto se hicieron cuatro mediciones por hoja, a un promedio de 15 hojas por

muestra, usando un medidor de clorofila SPAD Minolta 502, este aparato permite

relacionar el color con el contenido de clorofila (PORRO et al., 2001).

10

Por esto, los valores de contenido de clorofila que se mostraran mas adelante estarán

expresados en unidades SPAD, asumiendo que estas unidades indican solo una

relación directa y no el contenido de clorofila.

Las hojas se lavaron con agua destilada y se secaron con papel absorbente antes de

comenzar la extracción, luego el material de análisis fue fraccionado en tres partes; la

primera fue usada para la extracción con 1,5%-fenantrolina. Para dicho efecto, se

trituró el material vegetal de la misma manera que el procedimiento anterior. Luego,

se pesaron 2 g de material vegetal fresco, los cuales se depositaron en un matraz

Erlenmeyer donde se agregaron 20 ml de solución de 1,5%-fenantrolina, el proceso se

hizo en duplicado. Estas muestras se dejaron en extracción 24 horas para limonero y

40 para paltos a temperatura ambiente, para luego filtrar con papel microporo de

tamaño de poro de 11 µm. En este filtrado se determino la concentración de hierro

usando un espectrofotómetro de absorción atómica. Para el caso de la extracción en

fresco con 1N HCl el procedimiento se hizo de manera similar.

La segunda parte de la muestra de hojas fue usada para la extracción con 1N HCl en

seco. El proceso comenzó con el material en una estufa a 80ºC durante 40 horas,

luego este se trituró, se depositaron 2 gramos de material seco en un matraz y se

agregaron 20 ml de 1N HCl; este proceso se hizo en duplicado. Estas muestras se

dejaron en extracción 24 horas para limonero y 40 para paltos a temperatura

ambiente, para luego filtrar con papel microporo de tamaño de poro de 11 µm. En

este filtrado se determinó la concentración de hierro usando un espectrofotómetro de

absorción atómica.

La tercera parte de la muestra de hojas, fue usada para la extracción de hierro total, en

este caso se secó el material en una estufa a 80ºC durante 48 horas. Luego se calcinó

en una mufla a 800º C durante 24 horas, posteriormente se retiró, se aplicaron 5 ml.

de agua destilada, luego se aplicaron 20 ml. de 1 N HCl para luego filtrar con papel

11

microporo de tamaño de poro de 11 µm en un matraz y aforar a 50 ml. En este

filtrado se determinó la concentración de hierro usando un espectrofotómetro de

absorción atómica. Además con el fin de poder discriminar, entre distintas

deficiencias de micronutrientes poco disponibles a pH básico y con sintomatología de

clorosis se determinó la concentración en las hojas el nivel de los siguientes

microelementos: Zn, Mn, Mg.

Una vez obtenidas las lecturas se harán los descartes correspondientes a: diferencia

entre los duplicados, valores porcentuales mayores en coeficientes de variación en las

mediciones con SPAD. Para el análisis de datos estas se llevaran a un modelo de

relación lineal que indicará cual es la relación que el contenido de hierro tiene con el

nivel de clorosis férrica, también se harán análisis de significancía para corroborar

que dichas relaciones lineales son válidas. Para respaldar este análisis se realizo

también una regresión lineal múltiple (Anexo 6).

La calidad de cada uno de los procesos de extracción e incidencia de otras

deficiencias, será visualizada mediante el valor del coeficiente de correlación (R²),

estos valores se encuentran entre 0 y 1, siendo 0 una nula relación entre la variable

dependiente e independiente y 1 la relación completa entre las variables.

Adicionalmente se verá si el método es válido mediante un análisis de significancía,

el cual indicara si dicha relación entre la clorosis y el contenido elemental es válida a

un nivel de significancía del 95%.

En el eje X se presenta el contenido elemental, en el eje Y se presenta el color, esto,

por dos motivos; el primero indica que el contenido elemental es el que determina el

color de las hojas, el segundo con fines de vista prácticos, ya que al hacer una

correlación lineal múltiple hay una sola variable dependiente y varias independientes.

12

4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1. Resultados de tiempo de extracción En el Cuadro 1 se presentan los resultados de extracción de hierro activo (mg/kg)

mediante dos métodos y tres tiempos de actividad de los distintos métodos (ver

resultados en Figura 2y 3).

Cuadro 1. Tiempo de extracción y concentraciones de hierro activo obtenidos a partir

de dos sistemas de extracción en palto.

Tiempo(hr) Fenoltralina(mg/kg) HCl(mg/kg) 16 13,4 36,6 24 16,6 32,8 42 16,5 35,7

Hipotéticamente el tiempo de extracción podía influir en los valores de concentración

de hierro, pero según los resultados expuestos se puede observar a simple vista que no

existe una tendencia clara que determine un tiempo de extracción distinto a los demás

en palto, este punto ya había sido comprobado con similares resultados en otras

especies, como por ejemplo en limones MOHAMMAD, NAJIM y KHERSAT (1998)

llegaron a concluir que no existe una tendencia clara al respecto al hacer las

extracciones . También en estudios realizados por KATYAL y SHARMA (1980) en

India, se concluyó un tiempo óptimo de extracción en arroz de 20 horas. Para fines

prácticos se recomienda dejar las muestras en extracción de un día para otro.

13

Tiempo de extraccion fenantrolina.

0

10

20

16 24 42

Tiempo

(mg/

kg)

Figura 2: Concentración de hierro activo en distintos tiempos de extracción con

fenantrolina.

Tiempo de extraccion Hcl fresco.

0

20

40

16 24 42

Tiempo

(mg/

kg)

Figura 3: Concentración de hierro activo en distintos tiempos de extracción con HCl.

14

4.3. Resultados para proceso de extracción

4.3.1. Resultados en palto A continuación en el Cuadro 2 se presentan los resultados de las extracciones hechas

en palto, muestreados en la zona de San Isidro, habiéndose realizado los descartes

bajo los siguientes criterios: diferencia entre los duplicados, valores porcentuales

mayores en coeficientes de variación en las mediciones con SPAD. Los resultados

presentados corresponden a los promedios entre los duplicados, es importante

mencionar que las concentraciones de Zn, Mn y Mg se encuentran deficientes según

los rangos normales para hojas adultas(Anexo 1), los rangos del Anexo 1 (LAHAV y

WILEY, 2002) son solo de referencia ya que las hojas muestreadas son nuevas. Las

tablas con duplicados, varianza, Coeficiente de variación, criterios de descarte antes

del descarte se encuentran en el Anexo 2.

También se presenta (Figuras 4 y 5) el comportamiento de las variables de manera

gráfica y con su correspondiente coeficiente de correlación y ecuación de la recta. En

este caso cada una de las repeticiones fue usada como un punto individual.

15

Cuadro 2: Resultados de color de hoja, concentración de hierro con distintos métodos zinc, manganeso y magnesio. f = fresco, s= seco, U. SPAD = Unidades Spad.

Color Fen HCl f. HCl s. Fe total Zn Mn Mg

Nº (U. SPAD) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (%) A 19,3 15,5 6,9 11,2 23,8 12,7 56,7 0,78 B 39,3 21,1 11,2 16,1 34,5 14,7 42,1 0,61 C 47,4 22,2 12,8 14,7 31,6 20,8 61,3 0,57 D 26,8 20,9 8,3 14,2 33,8 18,4 73,4 1,22 E 22,7 13,1 6,2 8,5 18,9 17,4 31,9 0,49 F 33,4 19,9 8,7 14,2 31,4 15,0 40,8 0,57 G 22,0 16,3 6,3 13,3 27,3 13,5 41,1 0,60 H 51,3 25,0 10,0 14,2 34,8 15,3 49,7 0,63 I 22,7 12,7 5,9 7,3 25,0 20,7 86,1 0,83

A continuación en la Cuadro 3 se presentan los coeficientes de correlación para cada

método de extracción de hierro y elementos totales. Las tablas fueron hechas a partir

de la correlación simple de cada uno de los datos con el nivel de color (SPAD).

16

Extraccion con fenontralinay = 4,2081x - 3,978

R2 = 0,769

-102030405060

- 5 10 15Fe+2 (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Extraccion con HCl en frescoy = 2,3742x - 12,307

R2 = 0,7462

-102030405060

- 10 20 30Fe+2 (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Extraccion con HCl secoy = 2,4745x + 0,4676

R2 = 0,3952

-102030405060

- 5 10 15 20Fe+2 (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Extraccion de hierro totaly = 1,4595x - 10,693

R2 = 0,4995

-102030405060

- 10 20 30 40Fe (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Figura 4: Regresion entre el color verde en hoja de palto(unidades spad) y el contenido de hierro. Según distintos métodos de extracción.

17

Zn y = 0,6386x + 21,129R2 = 0,0268

-102030405060

- 10 20 30Zn (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Mny = -0,0714x + 35,492

R2 = 0,0113

-102030405060

- 50 100Mn (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Mgy = -0,0147x + 41,929

R2 = 0,079

-102030405060

- 500 1.000 1.500Mg (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Figura 5: Regresión entre el color verde en hojas de palto (Unidades spad) y el

contenido de micro nutrientes.

18

Cuadro 3: Coeficientes de correlación para distintos métodos de extracción y concentración de nutrientes.

Elemento o método Coeficiente de

correlación Fenantrolina 0,77* HCl fresco 0,75* HCl seco 0,4 Hierro total 0,5* Zinc total 0,03 Manganeso total 0,01 Magnesio total 0,08 * Significativo al 95%

Se puede concluir después de revisar la Figura 4 y el Cuadro 3 que los métodos de

mejor comportamiento fueron aquellos en donde la extracción se hizo en fresco, o sea

la extracción con fenantrolina y con HCl en muestras frescas, como lo demuestran los

coeficientes de correlación exhibidos en la Cuadro 3. También en este caso se

hicieron correlaciones múltiples (Anexo 3) para ver el efecto de los otros

micronutrientes en la explicación de la clorosis. Se llegó también a la conclusión

según la Figura 5 y el Cuadro 3 que Zn, Mn y Mg no explican significativamente la

clorosis, en cambio el hierro si lo explica, esto quiere decir que se pueden establecer

conclusiones validas en base al hierro de este ensayo.

También cabe destacar que en estudios hechos por otros autores en duraznero y

limonero se llegaron a distintas conclusiones, como por ejemplo: BASAR (2003)

llego a la conclusión que los métodos de extracción que miden hierro activo

(extracción con fenoltralina en fresco, HCl en muestras frescas y HCl en muestras

secas) resultaron similares. MOHAMMAD, NAJIM y KHERSAT (1998) trabajando

en limonero llegaron a la conclusión que el mejor método es el que mide el HCl en

muestras secas. Adicionalmente este fue el método (HCl seco) que resulto peor

evaluado en palto.

19

Es posible que en palto este sea mas claro en presentar deficiencias de manera visual

y esto ayudo a tener un buen muestreo, lo que lleva a tener resultados confiables y

directamente dependientes del contenido de hierro.

4.3.2. Resultados en limonero A continuación en la Cuadro 4, se presentan los resultados correspondientes a

limonero muestreados en la zona de San Isidro, habiéndose hecho los descartes de

muestras, correspondientes a los siguientes criterios: diferencia entre los duplicados,

coeficiente de variación en las mediciones con SPAD, es importante mencionar que

las concentraciones de Zn, Mn y Mg se encuentran en los rangos normales según

AGUSTI (2000) (Anexo 4). Los resultados presentados corresponden a los promedios

entre los duplicados. Los cuadros con duplicados, varianza, coeficiente de variación,

los criterios de descarte, y las tablas sin descarte se encuentran en el Anexo 5.

También se presentan las Figuras 6 y 7 que indican el comportamiento de las

variables de manera gráfica con su correspondiente coeficiente de correlación. En

este caso, cada una de las repeticiones fue usada como un punto individual.

20

Cuadro 4: Concentración de hierro en limonero según distintos métodos mas zinc, manganeso y magnesio.. f= fresco, s=seco, spad= Unidades spad, (-) = Muestra insuficiente

Spad Fen HCl f. HCl s. Fe total Zn Mn Mg (U. SPAD) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) L 25,6 9,8 13,8 30,6 41,1 14,2 14,0 1.505 M 69,9 18,4 27,0 66,5 103 17,5 27,2 1.193 N 29,1 10,7 13,8 30,3 45,3 9,5 13,7 1.085 O 37,4 13,8 17,1 31,1 50,9 13,9 12,4 1.115 P 26,3 10,0 14,4 - 43,5 16,8 13,2 1.091 Q 68,3 17,0 23,5 51,3 69,5 17,8 27,7 1.131 R 28,8 10,1 15,5 28,0 54,1 12,1 12,7 1.162 S 63,2 14,8 20,7 50,1 78,6 21,7 17,9 1.379 T 25,1 11,8 13,9 34,8 64,1 11,1 15,4 1.264 U 75,6 19,1 44,5 111 142 15,1 24,6 2.818

A continuación en la Cuadro 5 se presentan los coeficientes de correlación para cada

método de extracción de hierro.

Cuadro 5: Coeficientes de correlación para distintos métodos de extracción y concentración de nutrientes en limonero.

Elemento o método Coeficiente de

correlación. Fenantrolina 0,90* HCl fresco 0,70* HCl seco 0,67* Hierro total 0,66* Zinc 0,45* Manganeso 0,80* Magnesio 0,23

* Significativo al 95%

21

Extraccion con fenontralinay = 5,5464x - 30,194

R2 = 0,8958

-20406080

100

- 10 20 30Fe+2 (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Extraccion con HCl fresco

y = 1,8574x + 7,0359R2 = 0,7021

-20406080

100

- 20 40 60Fe+2 (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Extraccion con HCl en secoy = 0,6531x + 15,484

R2 = 0,6734

-20406080

100

- 50 100 150Fe+2 (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Extraccion de hierro total

y = 0,5373x + 7,7684R2 = 0,6567

-20406080

100

- 50 100 150 200Fe (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Figura 6: Correlaciones entre el color verde en hojas de limonero (unidades spad) y el contenido de hierro. Según distintos métodos de extracción.

22

Zinc y = 3,719x - 11,348R2 = 0,4455

-

20

40

60

80

- 10 20 30Zn (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Manganeso

y = 3,0793x - 10,13R2 = 0,8017

-20406080

100

- 10 20 30Mn (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Magnesio y = 0,0197x + 17,922

R2 = 0,2338

-

20

40

60

80

0 1000 2000 3000Mg (mg/kg)

Col

or (U

. Spa

d)

Figura 7. Correlación entre el color verde en hojas de limonero (unidades spad) y el contenido de micronutrientes.

23

Después de revisar el Cuadro 5, se pudo concluir que existe una correlación

significativa entre el contenido de hierro y clorofila en las hojas, lo que indica que el

análisis es valido; pero también indica que tanto el zinc como el manganeso son

significativos. Para buscar cual es la importancia de estos elementos en la

sintomatología, se realizó una correlación múltiple (Anexo 6), entre los métodos de

extracción de hierro individualmente con los otros microelementos. El resultado

arrojó que tanto el hierro como el zinc y manganeso explican la clorosis en todos los

casos. En consecuencia se puede concluir que si bien, existe una alta correlación entre

el nivel de hierro activo y la clorosis; esta clorosis no es explicada solo por la

deficiencia de hierro. Este comportamiento si bien no se esperaba se sabe que: el

lugar de muestreo se encontraba en una zona con suelos calcáreos en donde todos los

nutrientes medidos están poco disponibles para la planta, (KRAUSKOPF 1983) ver

Figura 1. También, hay que tomar en cuenta que el limonero es muy sensible a este

tipo de deficiencia y demuestra sintomatologías de deficiencia y exceso fácilmente

(AGUSTI, 2000). Por lo tanto, se puede concluir que existe una alta probabilidad de

que las dificultades en este experimento se hallan producido a nivel de muestreo, ya

que al muestrar en brotes jóvenes otras sintomatologías similares (Anexo 7) y con

causas también similares pudieron haber provocado alguna confusión al momento de

hacer el muestreo.

Este hecho, también indica que la metodología tiene una gran posibilidad de ser

exitosa, aunque los resultados no sean lo suficientemente robustos para llegar a

conclusiones validas. En este escenario es importante mencionar que existen otros

estudios donde se llego a conclusiones similares, por ejemplo, el estudio realizado en

limonero por MOHAMMAD, NAJIM y KHERSAT (1998) donde el mejor método

era el que se realizaba con HCl en muestras secas, En este método las muestras sufren

oxidación y por lo tanto el hierro también. Es posible que debido a las sustancias

antioxidantes que poseen las hojas de limonero, como por ejemplo el ácido ascórbico

24

(MAGDHAL, 2005*)1en alguna medida aminoren el efecto oxidante que se produce

en el secado de las hojas y por esto los resultados fueron mejores en este caso.

Diferente al presente estudio, donde tanto en limonero como en palto los mejores

métodos fueron: fenantrolina en limonero y fenantrolina y HCl en muestras frescas en

palto. También cabe en esta discusión mencionar que; en estudios hechos en manzano

por SOMEZ y KAPLAN (2004) en Turquía, se compararon distintas extracciones en

hojas secas, en este estudio tuvo mejor resultado la realizada con HCl. En duraznero

se realizaron experiencias similares (BASAR, 2003) llegando a la siguiente

conclusión: los métodos de extracción con HCl en muestras secas, frescas y la

extracción con fenantrolina resultaron significativamente efectivos.

Finalmente podemos decir; no se descarta el método de análisis de hierro mediante la

extracción de hierro activo ya que, todos las formas de extracción son validas, aunque

se pude observar claramente que la de mejor correlación es la extracción con

fenantrolina en fresco, aun así es necesario hacer otros ensayos en limonero debido a

que el hierro no era la única causa de la clorosis, éstos deben hacerse tomando mayor

cantidad de precauciones con el muestreo, pues es muy fácil caer en confusiones, es

por eso, que tal vez para futuras investigaciones seria optimo dar a los árboles una

fertilización que incluya los microelementos en conflicto (Zn y Mg) antes de

muestrear; esto, para asegurarse que sí se está midiendo una deficiencia de hierro.

*Magdhal C, Ing. Agr. M.Sc, 2005. Facultad de Agronomía, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Comunicación personal.

25

4.4. Comparación de costos para ambos métodos de extracción

Para ambas especies es importante destacar que; como lo mencionó BASAR (2003)

en su estudio en durazno, el mejor método es: el menos costoso, más sencillo y que

permita llevar muestras desde lugares lejanos al laboratorio usando los extractantes

más económicos, es por eso que el mejor método, a similar efectividad es el que

ocupa muestras secas.

De acuerdo a esta afirmación, según el Cuadro 6 y tomando en cuenta que el precio

en materiales (Anexo 8) por análisis, es; en el caso de la fenoltralina es de app. $1020

y en el caso de HCl son app. $20, se puede decir que a similar calidad de extracción

de hierro activo el mejor método seria la extracción de hierro con HCl.

Cuadro 6. Método de Determinación de costo de extractante por análisis.

P(X)= A * D B * C P(X) = Precio por análisis.

A = Precio unidad comercial.

B = Cantidad de análisis por litro de extractante.

C = Cantidad de litros de extractante por unidad comercial.

D = Replicas del análisis en laboratorio (Duplicado).

26

4. CONCLUSIONES

• El tiempo mínimo u óptimo de extracción determinado para hierro activo en

paltos y en limonero fue de 16 horas.

• En palto existió correlación significativa para los métodos fenantrolina y HCl

en fresco, como métodos de extracción de hierro activo.

• En limonero existe correlación significativa en todos los métodos que extraen

hierro activo, al igual que el método que determina hierro total.

• En el caso de limonero a diferencia de palto, no es posible concluir que

método usar para el diagnostico de deficiencia de hierro, ya que hay otros

nutrientes que también determinan color en esta especie.

27

5. RESUMEN

La clorosis férrica es uno de los desordenes nutricionales mas comunes en suelos

calcáreos. Este desorden se presenta en la zona de Quillota con mucha frecuencia. La

experiencia muestra que lecturas de hierro total en hojas con síntomas claros de

deficiencias presentan muchas veces altos niveles de hierro total. Además se sabe que

el hierro fisiológicamente activo es el FeII, por lo tanto el presente estudio tiene por

objetivo validar las metodologías existentes que determinan el contenido de FeII.

Como metodología se usaron cuatro tipo de extracciones tanto en palto como en

limón: 1,5% fenantrolina en muestras frescas, HCl en muestras frescas, HCl en

muestras secas y extracción de hierro total. Estas mediciones de hierro obtenidas

mediante distintas extracciones, fueron correlacionadas linealmente con el color de

las hojas.

Los resultados arrojaron que en palto los dos métodos de extracción en fresco

alcanzaron los mayores coeficientes de correlación y fueron significativamente

superiores. En cambio en limón, resultó mejor la 1.5% fenantrolina en fresco, pero los

resultados no son concluyentes ya que se observó que la clorosis que presentaba fue

explicada por las deficiencias de Fe, Zn y Mn.

28

6.-ABSTRACT

Iron chlorosis is a very common disorder of crops grown in calcareous soils. This

disorder is frequent in Quillota valley. The experience shows that determination of

total iron in leaves with symptoms of deficiencies frequently shows high

concentrations of total iron. Also, it is known that the physiological active iron is FeII.

That is why, this study have for objective to validate methodologies for determination

of FeII .

In this study we used four kinds of extractions in avocado and in lemon trees, 1.5%

phenanthroline (pH 3), 1 N HCl in fresh samples, 1N HCl extraction from dry

samples and total iron extractions. Relationships between the total and extractable

iron concentrations in the leaves with the leaf color were examined by linear

regression analysis.

The correlation coefficients suggest that extraction from fresh leaves was superior

over other methods for diagnosis of iron chlorosis in avocado. On the other hand, in

the lemon trees, The 1,5% phenanthroline (pH 3) in fresh samples was better, but the

results were not conclusive, the chlorosis in the lemon tree is was due to Fe, Zn, and

Mn deficiencies.

29

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31

ANEXOS