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Extracción de esencias y separación de pigmentos naturales(Clorofila, xantofilas y carotenos)

Dayana Cuta1*, Carolina Banquez2, Andres Diaz3.Universidad de América.

ResumenSe extrajeron esencias de origen vegetal, por los métodos para extracción de tipo soxhlet y destilación por arrastre de vapor (extracción continua) con disolventes orgánicos, donde se identificaron características organolépticas de las mismas tales como el olor y color.Tras la obtención de las esencias, se procedió a realizar los protocolos 1 (acetona) y 2 (etanol) para la extracción de pigmentos con solventes, para cuantificar por cromatografía los porcentajes de clorofila y carotenoides encontrados en la muestra vegetal. Finalmente, se calcula la concentración de clorofila en las muestras, que fueron resultado de los protocolos ya establecidos utilizando métodos espectrofotométricos. Palabras claves: Esencias, cromatografía, soxhlet, arrastre de vapor, pigmentos.

AbstractEssences extracted from plants, by soxhlet and steam distillation methods (continuous extraction) with organic solvents, where the same organoleptic characteristics such as odor and color were identified.After obtaining essences, we proceeded to perform Protocols 1 (acetone) and 2 (ethanol) pigment extraction with solvents, chromatography to quantify the percentages chlorophyll and carotenoids found in plant sample. Finally, the chlorophyll concentration in the samples was calculated protocols established using spectrophotometric methods. Keywords: Essences, chromatography, soxhlet, steam stripping, pigments.

1. Introducción

En lo últimos años el estudio de los aceites esenciales ha llamado la atención de la ciencia, convirtiéndose en un área de investigación y desarrollo, por su gran acogida en la industria farmacéutica, cosmética y de alimentos, entre otras. La extracción de las diferentes esencias y pigmentos de tipo vegetal se pueden realizar empleando técnicas y protocolos de extracción. Los aceites esenciales por ser volátiles y encontrarse distribuidos en los frutos y plantas, pueden ser retirados utilizando destilación con arrastre de vapor de agua donde se utiliza principalmente para extraer esencias de limón y naranja que se aprovechan para la fabricación de bebidas refrescantes, o con equipo de tipo soxhlet. Los pigmentos de materiales verdes se extraen utilizando los protocolos 1 donde se utiliza la acetona y el 2 con el etanol, donde los dos son disolventes orgánicos y que son útiles

para separar pigmentos naturales (clorofilas, xantofilas y carotenos). La cromatografía es una técnica utilizada para analizar e identificar los pigmentos naturales presentes en una muestra problemas. Con la realización de esta técnica se obtienen resultados cromatógrafos y espectrofotométricos donde se calculan porcentajes (clorofila a y b, carotenoides) y concentraciones respectivamente, presentes en una muestra problema.

2. Marco teórico

ESENCIAS:Son compuestos químicos intensamente aromáticos, no grasos (por lo que no se enrancian), volátiles por naturaleza (se evaporan rápidamente), livianos (densidades de 0.9-0.8), insolubles en agua, levemente solubles en vinagre, y solubles en disolventes orgánicos como alcohol, benceno, cloroformo,

1. Estudiante 4to semestre de Ing. Química 2015(yo_liseth@hotmail.com)2. Estudiante 4to semestre de Ing. Química 2015(carolab-1997@hotmail.com)3. Estudiante 4to semestre de Ing. Química 2015(anderson19951@hotmail.es)

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éter, hexano, grasas, ceras, aceites vegetales, resinas. Son sustancias oleosas, odoríferas y de origen vegetal.

EXTRACCIÓN:Constituye una de las técnicas de separación de compuestos más utilizada en el laboratorio químico. El principal objetivo de la extracción es separar selectivamente el producto de una reacción, o bien eliminar las impurezas que lo acompañan en la mezcla de reacción, gracias a sus diferencias de solubilidad en el disolvente de extracción elegido.

Extracción discontinua: Se la llama también “extracción líquido-líquido”, en este caso el procedimiento consiste en la transferencia de una sustancia de una fase a otra y se desarro-lla entre dos líquidos inmiscibles, esto quiere decir que son incapaces de ser mezclados sin la división de fases. Las dos fases líquidas de la extracción son la acuosa y orgánica. (Equipo tipo soxhlet o destilación por arrastre de vapor)

Extracción continua: Conocida también como “extracción sólido-líquido”, en este tipo se divi-den uno o más componentes de una mezcla sólida a través de un disolvente líquido.  Se desarrolla en dos etapas distintas. Se lleva a cabo un contacto del disolvente con el sólido que permite la mezcla del soluto o componente soluble al disolvente. Esto se realiza a una tem-peratura ambiente o cálida pero en este caso para impedir la pérdida del disolvente se efec-túa una ebullición a reflujo. (Agitando el disol-vente en el embudo de decantación)

CLOROPLASTOS: Los cloroplastos fueron identificados como los orgánulos encargados de la fotosíntesis, en ellos se transforma la energía lumínica en ener-gía química, que puede ser aprovechada por los vegetales.

Clorofilas: Las Clorofilas son compuestos del tipo tetrapirrol, al mismo grupo pertenecen las ficocianinas y las ficoeritrinas (pigmentos acce-sorios en algas azules y rojas). Constan de cuatro anillos de pirrol unidos por medio de puentes de metilo (--CH=) lo que constituye una porfirina.

- La clorofila b se diferencia de la clorofila a solamente por estar sustituido el grupo metilo (--CH3) del carbono 3 en el segundo anillo pi-rrólico, por un grupo aldehido (--CHO). Esta diferencia es suficiente para causar un cambio notable en la coloración como también en el es-pectro de absorción de esta molécula. La cloro-fila a es verde azulada, la clorofila b es de color verde amarillento.

Fuente: http://www.scielo.br/img/revistas/cr/v35n3/a43fig01.jpg

CAROTENOIDES:Los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomos de carbono derivados biosintéticamente a partir de dos unidades de geranil-geranilpirofosfato, en su mayoría son solubles en solventes apolares y de coloraciones que oscilan entre el amarillo (por ejemplo el ß-caroteno) y el rojo (por ejemplo el licopeno). L. Se clasifican en dos grupos: carotenos y xantofilas. Los carotenos solo contienen carbono e hidrógeno, mientras que las xantofilas contienen además oxígeno.

CROMATOGRAFÍA:La cromatografía es un método físico de sepa-ración en el que los componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra (fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección definida.-De acuerdo con el estado físico la cromatogra-fía se clasifica:

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Cromatografía de gases: Con fase móvil gaseo-sa.

Cromatografía gas-líquido Cromatografía gas-sólido

Cromatografía líquida: Con fase móvil líquida. Cromatografía líquido-líquido Cromatografía líquido-sólido

-Dependiendo de la naturaleza de la fase está-tica y de la fase móvil se pueden distinguir dis-tintos tipos de cromatografía

   a) Cromatografía sólido-líquido. La fase está-tica o estacionaria es un sólido y la móvil un líquido.

   b) Cromatografía líquido-líquido. La fase está-tica o estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido.

   c) Cromatografía líquido-gas. La fase estática o estacionaria es un líquido no volátil impregna-do en un sólido y la fase móvil es un gas.

   d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacio-naria es un sólido y la móvil un gas.

-De acuerdo con el método de separación. Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre:

   a) Cromatografía de adsorción. La fase esta-cionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante inte-racciones de tipo polar.

   b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases esta-cionaria y móvil, que son ambas líquidas.      c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva ancla-dos grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones pre-sentes en la fase móvil.

3. Metodología

Materiales

-2 Erlenmeyer de 250 mL-1 Condensador- 1 Balón de fondo plano esmerilado de 250 mL- 1 Soxhlet- 1 Aro- 3 Nueces- 2 Pinzas para balón- 1 Mortero y mazo- 2 Mallas de asbesto- 1 Te en vidrio- 2 Mangueras- Papel de filtro- Papel para cromatografía- Mortero- Tubo de centrífuga plástico

Equipos

- Centrífuga - Espectrofotómetro- Equipo soxhlet- Cámara de cromatografía

Reactivos

- Alcohol etílico del 96% p- Etanol al 80%- Agua destilada- Pétalos de rosas, limones, naranjas, flores frutos u hojas, espinacas o hierbas. El estudiante debe traerlas.- Acetona al 80%- Éter de petróleo

4. Procedimientos

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5. Análisis y Cálculos.

5.1 Distinga en su muestra ¿A qué pigmento corresponde cada mancha?- Las manchas observadas en la placa de cromatografía son de color verde oliva (claro) , verde oscuro, amarillo (claro) y rojo (claro) que corresponden a clorofilas tipo b , clorofilas tipo a , Xantófilas y Carotenos respectivamente.

5.2 Calcular la movilidad relativa de los distintos pigmentos RF

%PIGMENTOS=( RsRf )*100

Rf: altura máxima alcanzada por el solvente – línea de referenciaRs: altura de la línea de referencia a la mancha

ACETONA

%Clorofila tipo B =( 2.85.4 )*100 = 51.85%

%Clorofila tipo A =( 3.45.4 )*100 = 62.96%

%Caroteno =( 5.15.4 )*100 = 94.44%

%Xantófilas =( 4.25.4 )*100 = 77.77%

ETANOL

%Clorofila tipo A =( 3.15.4 )*100 = 57.4%

%Clorofila tipo B =( 3.55.4 )*100 = 64.8%

%Caroteno =( 5.25.4 )*100 = 96.2%

%Xantófilas =( 4.95.4 )*100 = 90.7%

5.3 ¿Qué factores pueden afectar al coeficiente de particion? - El coeficiente de partición (Rf) se puede ver afectado por la pureza (concentracion) del solvente orgánico en la cámara cromatografía, puesto que esto afecta en el arrastre de los pigmentos.Por otro lado, dependiendo de la concentración de pigmentos que posea la hoja la altura de las manchas se verán afectadas, debido a que al poseer una alta concentración la mancha tiende a ascender.

5.4 Calcular los µg de clorofila que hay por gramo de hoja, extraida con cada uno de los protocolos.

ETANOL

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ppm clorofila = (absorbancia)*13,14ppm clorofila = (1.975)*13,14 = 25,96ppm

0.02596g de clorofila 0.55g de hojas Xg de clorofila 1g de hojas X=0.0472g clorofila/ g hoja

ACETONAppm total de clorofila = (20.2*A645 ) + (8.02*A663 )ppm=(20.2*1.992)+(8.02*1.976) = 56.07ppm ppm acetona=ppm total – ppm etanolppm acetona = 56.07 – 25.96 = 30.11ppm

0.03011g de clorofila 0.55g de hojas Xg de clorofila 1g de hojas X=0.0547g clorofila/ g hoja

5.5 Comparar los resultados obtenidos entre sí y con el resto de los grupos ¿Qué protocolo es el más adecuado para el tipo de material vegetal empleado? Razonar la respuesta

Al comparar las concentraciones de clorofila obtenidos, se logra deducir que utilizar el protocolo 1 (acetona) es más conveniente al obtener una mayor concentración que al utilizar el protocolo 2 (etanol), puesto que se obtiene una mejor extracción de pigmentos.

5.6 Calcular la concentración de clorofila (a) en el extracto inicial de la hoja de espinaca por formula de Marker. ¿Cuántos mg de clorofila a se han extraído de la hoja de espinaca?

ppm= 1.976*13.14 clorofila a ppm= 25.96clorofila total [ppm] = (20.2*1.992)+(8.02*1.976) clorofila total [ppm] = 56.07

5.7 ¿Se han extraido todos los pigmentos?

En esta práctica, utilizando acetona y etanol no se extrajeron en su totalidad los pigmentos fotosintéticos debido a que no son procedimientos muy eficaces, dependiento el método usado cambiara la concentración de los pigmentos.

5.8 ¿Qué es 13.14 en la fórmula de Marker?

El número 13.14 que aparece en la ecuación de Marker para la determinación de concentración de clorofila (ppm=A(a 665 nm) *

13.14) no es más que una relación (razón) que existe entre la concentración y la absorbancia (depende del coeficiente de absortividad molar), es decir que por cada 13.14 ppm la muestra tendrá una absorbancia equivalente a 1.

5.9 ¿Interfieren el resto de pigmentos en la determinación de clorofila a?

6. Conclusiones

1. Se comprendió la importancia de los diferentes métodos de extracción de esencias utilizados a nivel de laboratorio e industrial.

2. Se identificaron los compuestos orgánicos presentes en las esencias extraídas.

3. Se clasificó, identificó y relación los diferentes tipos de esencias que se pueden encontrar en el reino vegetal.

4. Se extrajeron y separaron los diferentes tipos de pigmentos de cloroplastos por cromatografía de papel en función de su polaridad relativa.

5. Se extrajeron los pigmentos de cloroplastos de una material vegetal y se determinó la cantidad de clorofila contenida en el mismo.

7. Cuestionario

1. ¿Qué normatividad existe en el país para las esencias?

- En Colombia no hay una farmacopea nacional, por lo tanto se recurre a las siguiente farmacopeas oficialmente aceptadas en el país, como consta en el Parágrafo Primero del Artículo 22 del decreto 677 de 1995: “United State Pharmacopeia (USP), a la Brittish Pharmacopeia (Inglaterra), al Codex Francés, a la Farmacopea Alemana (DAB), a la Europea e internacional (OMS) o a la que en su momento rija para la Unión Europea. En todos los

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casos se aplicarán las técnicas establecidas en la edición vigente de la farmacopea respectiva”.

- DECRETO NÚMERO 677 DE 1995 (abril 26) Por el cual se reglamenta parcialmente el Régimen de Registros y Licencias, el Control de Calidad, así como el Régimen de Vigilancia Sanitaria de Medicamentos, Cosméticos, Preparaciones Farmacéuticas a base de Recursos Naturales, Productos de Aseo, Higiene y Limpieza y otros productos de uso doméstico y se dictan otras disposiciones sobre la materia.

- En el caso de los alimentos se usan los Códigos Alimenticios siendo el más universal el Codex Alimentarius, que es una publicación de la FAO y la OMS y el Food Chemical Codex de los EEUU.

- El CAS NUMBER es una guía internacional que describe los ingredientes estudiados y aprobados para uso cosmético.

- Normas internacional ISO 855:2003.

2. Componentes químicos que proporciona el olor de la esencia, fórmulas estructurales

3. Elaborar un paralelo entre esencia natural y sintética 

  

Esencia Natural  Esencia sintética 

-Se obtiene de plantas o animales por procedi-mientos artesanales 

-Son llamados aceites esenciales 

-Tieneaparenciaaceito-sa concentrado 

-volatilespor naturale-za, livianos, insolubles en agua 

- Son mezclas de diversos productos obteni-dos por procesosquimicos. 

-Sonmaseconomicosque las esencias naturales. 

- Se utilizan en lapreparacionde sustancias aromatizantes y sabori

- Solo se obtiene de las plantas herbaceas, arbustos y arboles 

zantes. 

-Se sintetiza a partir de una sustanciaprimaria como alcohol o áci-doorganico. 

 4. Investigar en que consiste la extracción

de esencias por disolución de aceites fijos 

 Los aceites son solubles en grasas y alcoholes de alto porcentaje. Sobre una capa de vidrio se coloca una fina película de grasa y sobre ella los pétalos de flores extendidas. La esencia es absorbida por la grasa, hasta saturación de la grasa. Posteriormente con alcohol etílico, se extrae el aceite esencial.

5. Explique en que consiste la extracción por fluidos supercríticos y de ejemplos industriales de compuestos que se puedan extraer por esta técnica.

Los fluidos súper ricos presentan ventajas en los procesos de extracción, ya que al comportarse como un líquido facilita la disolución de los solutos, a la vez que, su comportamiento como gas permite una fácil separación de la matriz. Esto conlleva un proceso de extracción más rápido, eficiente y selectivo que en el caso de la extracción líquido-líquido. Además, se pueden usar "disolventes verdes" como el CO2 evitando el uso de los habituales disolventes clorados de las extracciones líquido-líquido.Al tratarse los alimentos de mezclas altamente complejas lo más habitual es que los extractos también lo sean por lo cual es muy habitual hablar de fraccionamiento de extractos. El fraccionamiento en condiciones supercríticas consiste en una caída en cascada de la densidad con la consiguiente precipitación en cascada de los compuestos extraídos en los separadores donde se produce esta disminución de densidad. 6. Explique en que consiste el proceso de

enflorado.

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El enflorado es un proceso utilizado para cap-tar las fragancias de las plantas utilizando grasas inodoras, y sólidas a temperatura am-biente. El proceso puede ser enflorado en frío en caliente. 

ENFLORADO EN FRIO: En el enflorado en frío, se utiliza una placa de vidrio, que se unta con una capa de grasa animal, sobre la grasa, se colocan las materias vegetales, como flores o pétalos o flores. Al paso de 1 a 3 días, la grasa se habrá impregnado con su aroma. El proceso se repite sustituyendo los vegetales utilizados por otros más frescos, y así hasta llegar al punto deseado de saturación de fra-gancia en la grasa llamada “Pomada enflora-da”. También puede continuarse el proceso limpiando o empapando la grasa con alcohol etílico con el fin de extraer de la grasa las mo-léculas de fragancia y transferirlas al alcohol. Luego se deja evaporar el alcohol. Los restos de grasa todavía con restos de aromas, pue-den utilizarse para la fabricación de jabones aromáticos.  ENFLORADO EN CALIENTE En el enflorado en caliente, las grasas sólidas se calientan mientras las materias vegetales se agitan resolviéndolas con la grasa impreg-nándola con su aroma. Al igual que en el enflo-rado en frio se sustituyen los vegetales utiliza-dos por otros más frescos, hasta conseguir la “Pomada enflorada”. También puede conti-nuarse el proceso limpiando o empapando la grasa con alcohol etílico con el fin de extraer de la grasa las moléculas de fragancia y trans-

ferirlas al alcohol.  

8. Referencias

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