INFORME BIOCATALISIS Nº2 Noviembre 2012

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAISO

FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Laboratorio de Biocatalisis

Nombres: Yailán Godoy Jimenez

Francisco Ocares Briceño

Christian Pinilla Herrera

Profesora: Zaida Cabrera

Irene Martínez

8 de Noviembre 2012

1

Resumen

En el presente informe, se realizaron tres diferentes experiencias relacionadas con la cuantificación de proteínas a partir de la enzima β-galactosidasa en Kluyveromyces marxianus, determinación de actividad enzimática de preparado comercial con actividad lactásica (Biolactasa-NTL) proveniente de la bacteria Bacillus circulans y cálculos de los parámetros cinéticos de una enzima soluble con actividad lactásica proveniente también de la bacteria Bacillus circulans.

En la práctica de cuantificación de proteínas se tuvo como objetivo la obtención de la enzima β-galactosidasa de la levadura y a su vez medir el contenido de proteínas de preparados enzimáticos. Para poder obtener las concentraciones resultantes luego de la extracción y purificación se debió construir una la curva de calibrado con una proteína estándar (BSA, Ovoalbúmina) por medio del método de Bradford, el cual consiste en el acoplamiento del colorante con la proteína determinándose colorimétricamente y existiendo una relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas. El resultado de esta curva logró ser Y (ABS) = 5,581x – 0,0202. Se realizó la extracción de la proteínas por medio de la disrupción cuantificando la cantidad de proteína presente, siendo este valor 4,5635 (g/L) de proteínas. Luego se aplicó la purificación del extracto crudo (Sobrenadante obtenido) por medio de una precipitación de proteínas por Etanol. La medición de la cantidad de proteínas que se encontraban tanto en el precipitado como el sobrenadante respectivamente dieron 2,448 (g/L) y 0,358 (g/L) Se cuantificó también la cantidad de proteínas en un preparado comercial llamado Biolactasa – NTL, teniendo una concentración presente de 32,97 (g/L). La suma de las proteínas luego de la purificación fue de 2,806 (g/L). El ayudante procedió a la medición de la actividad de la enzima siendo la de extracción de 5,2 (UI/mL sobrenadante) y de purificación de 6,4 (UI/ml purificado). En la segunda experiencia se halló el rango de velocidad lineal de reacción tanto para la enzima soluble como para la enzima inmovilizada de Biolactasa-NTL utilizando lactosa como sustrato. Se midió la concentración de glucosa que se formaba aplicándose el método del glucostat. Regresión lineal consistió entre los tiempos para la enzima soluble entre tiempo 0 (min) a 6 (min) y para la enzima inmovilizada los rangos lineales que se establecieron fueron los puntos de la recta desde el tiempo 0 (min) a 10 (min) de dilución 1:4 y para la dilución 1:10 se tomaron desde los tiempo 0 (min) a 12 (min). Al obtener los resultados de los rangos lineales de velocidades de reacción enzimática se cuantificó la actividad de los preparados entregados en la experiencia siendo para la Enzima Soluble (1:100)= 511060 (UI/mL enzima) y (1:200) = 575700 (UI/mL enzima) y para el caso de Enzima Inmovilizada (1:10)= 19669,75 (UI/g enzima) y (1:4)= 11675,6 (UI/g enzima). Para la última experiencia realizada se estudió hallar los parámetros cinéticos a distintas concentraciones de sustratos de Lactosa (10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L y 125 g/L) y a una determinada concentración de galactosa (10 g/L), siendo causante de una inhibición de tipo competitiva sobre la enzima. Los resultados se calcularon por medio de linealización a partir de la ecuación de Michaelis-Menten por su recíproco, dando la ecuación de lineweaver-Burck, obteniendo como principales resultados Vm = 5000, Km= 75, Vap= 5000, Kap= 347,5 y Ki= 15,29

2

INDICE

Índice

1.- Resultados y discusión……………………………………………………………4

1.1.-Ruptura celular, purificación y determinación de la proteína β-galactosidasa en Kluyveromyces marxianus…………………………….4

1.2.-Determinación de actividad enzimática de un preparado comercial proveniente de la bacteria Bacillus circulans……………………………….6

1.3.-Determinación de parámetros cinéticos para una enzima soluble procedente de la bacteria Bacillus circulans……………………………...11

2.- Conclusión……………………………………………………………………….13

3.- Bibliografía …………………………………………………………………..…14.

Anexos………………………………………………………………………………15

Anexo A…………………………………………………………………….16

Anexo B…………………………………………………………………….17

Anexo C…………………………………………………………………….21

Anexo D…………………………………………………………………….22

Anexo E…………………………………………………………………….26

Anexo F…………………………………………………………………….29

Anexo G…………………………………………………………………….32

3

1.-Resultados y Discusión

1.1.-Ruptura celular, purificación y determinación de la proteína β-galactosidasa en Kluyveromyces marxianus

Se realizó la construcción de la curva de calibrado con una proteína estándar (BSA, Ovoalbúmina) por el método de Bradford, en donde es un marco de referencia que se elabora de cantidades conocidas de esta sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de proteínas presente en una muestra incógnita. Se obtuvieron triplicados los cuales fueron medidos en el espectrofotómetro a 595 nm resultando las absorbancias enunciadas en el anexo A. Esta curva nos permitió obtener la ecuación para poder cuantificar las concentraciones de proteínas en cada una de las muestras que calculamos más adelante.

La ecuación resultante de la construcción de la curva de calibrado patrón es

Y (ABS) = 5,581x – 0,0202

R2 = 0,9923

Según las actividades a desarrollar, lo primero que se realizó fue la extracción de la proteína a través de la ruptura celular por medio de un protocolo a seguir, el cual se obtuvo el sobrenadante de la muestra o también llamado extracto crudo que nos permitió medir la concentración de la proteína que se encontraba en el pellet dado por el ayudante teniendo 0,6 g de célula en seco, diluyendo la muestra dos veces para que las absorbancias adquiridas puedan ser interceptadas en la curva de calibrado patrón. Los datos de las diluciones efectuadas por duplicado y sus absorbancias se encuentran en el Anexo B; (Tabla B.1.3.1)

La concentración del extracto crudo dio como resultado 4,5635 [g/L] de proteínas

Más adelante, se procedió a la purificación del extracto crudo (Sobrenadante) por medio de la precipitación por Etanol, en donde se disminuye la polaridad del disolvente al ser éste una sustancia menos polar y disminuyendo el grado de hidratación de los grupos superficiales de la molécula proteica provocando el precipitado. Con este procedimiento se adquirió un precipitado de proteínas la cual se re suspendió en un buffer fosfato-citrato a pH 6, aplicando el método de Bradford para calcular su concentración, la cual fue diluida anteriormente por duplicado expresándose los datos en el anexo B ; Tabla B.3 y Tabla B.3.1. Cabe recalcar que también se realizo la medición de cuantificación de proteínas para el sobrenadante aplicándose ciertas diluciones mostradas en el anexo B; Tabla B.2 y Tabla B.2.1

La concentración del re suspendido de proteína luego de la purificación en tampón fosfato-citrato dio como resultado 2,448 [g/L]

La concentración de proteínas del sobrenadante luego de la purificación dio como resultado 0,358 [g/L]

4

Cabe señalar que las proteínas que se calcularon en el extracto crudo tienen que ser cuantitativamente iguales a la suma de las proteínas que se encuentran en el sobrenadante y en la solución re suspendida luego de la purificación, por lo que según los resultados que se nos presentaron en nuestra experiencia fue menor, pero de manera objetiva es menor a la proteína del extracto crudo y esto estaría correcto, ya que extrajimos la mayor cantidad de proteínas luego de la ruptura. Como la suma de las proteínas luego de la purificación fue de 2,806 [g/L] (menor a 4,5635 [g/L]) podemos discutir el porqué de esta situación. Puede haberse dado que la ruptura haya sido muy eficiente y así la explicación de la concentración tan alta (proteína) junto a su actividad de extracción que resulto ser de 5,2 [UI/mL sobrenadante].

También tenemos que señalar que en la purificación nos faltó concentración de proteínas, que se pudo haber dado por la remoción del sobrenadante y el secado del precipitado de proteínas con aire frio, tanto por la manipulación de los instrumentos de la experiencia y la presión muy alta de aire frio que pudo sacar algún precipitado.

La actividad de purificación fue de 6,4 (UI/ml purificado) la cual señala que extrajimos casi todas las proteínas puestas en el pellet entregado por el ayudante, pero no en su totalidad. Por esta razón también puede ser que no dio perfecto el balance de concentración de proteínas.

Para este presente laboratorio se dispuso de un preparado comercial entregado por el ayudante llamado Biolactasa – NTL (Lactasa neutra calidad alimentaria), ya diluida sesenta veces, realizándose nuevamente una dilución por duplicado expresadas más adelante en el anexo B; Tabla B.4.. Se le aplicó el método de Bradford por lo que su concentración de proteína resulto ser de 32,97 (g/L).

La muestra con factor de dilución 300 presente en el anexo B; Tabla B.4.1, al calcular su absorbancia éstas dieron fuera del rango de nuestra curva de calibrado para la cuantificación de proteínas la cual no se tomo en cuenta. Por lo tanto solo se tomaron las muestras con factor de dilución 600, anexo B; Tabla B.4. por su intersección dentro de la ella (Curva de calibrado)

5

1.2.-Determinación de actividad enzimática de un preparado comercial proveniente de la bacteria Bacillus circulans

En la presente experiencia se procedió hallar el rango de velocidad lineal de reacción tanto para la enzima soluble como para la enzima inmovilizada a través de un seguimiento de la reacción entre la enzima y una solución de Lactosa ( disacárido que está compuesto por dos moléculas: galactosa y la glucosa unidas por un enlace beta-glicosídico) de concentración establecida para cada caso, ya sea soluble (100 g/L) como para inmovilizada (150 g/L), esto se debe al estado en que se encuentra la enzima en la solución, donde hay más posibilidades en que el sustrato reaccione con la enzima en un medio donde se encuentra libre, en comparación al medio donde se halla retenida y de igual manera para disminuir los efectos de las restricciones disfuncionales que se producen en este último caso. Se aplicó un llamado análisis de la curva de progreso, en donde es la forma más experimental de mediar las reacciones enzimáticas. Esta aproximación es muy útil como alternativa a las cinéticas rápidas, cuando el periodo inicial es demasiado rápido para ser medido con precisión. Cabe destacar que también se utilizo una concentración de lactosa saturante para cada enzima, debido a que se necesita que todas las enzimas estén reaccionando y convirtiendo el sustrato en producto. Cuanto mayor es la cantidad de enzima por consiguiente, mayor será la velocidad que alcanzara, debido a que necesito más cantidad de sustrato para alcanzar la saturación. Para lograr determinar los diferentes puntos del rango lineal se comenzó por la medición de unos de los productos que genera la hidrólisis de la lactosa, la glucosa, tomando muestras (las necesarias) cada cierto tiempo de reacción y procediendo a la inactivación térmica inmediata. Para poder medir la concentración de este producto se aplicó el método del glucostat, el cual se basa en un principio colorimétrico detectando el peróxido de hidrógeno que se produce por la oxidación catalizada por la glucosa oxidasa (GOD) de glucosa a ácido glucónico, siendo la intensidad del color formado proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra (bibliografía). Este método es utilizado tanto para la determinación de la actividad enzimática soluble como para la inmovilizada.

Las absorbancias resultantes medidas en el espectrofotómetro a 505 nm, ya sea para la enzima soluble e inmovilizada, se encuentran en el anexo D

Ya teniendo las absorbancias se prosiguió a determinar las concentraciones de producto, glucosa, para cada uno de las situaciones en la que se encontraba la enzima. Todo esto se pudo lograr gracias a la curva de calibrado de glucosa expresadas en el Anexo C, realizada por el ayudante, consiguiendo asimismo la ecuación de la recta que nos permitió calcular las concentraciones adecuadas. La ecuación de la recta resultó ser

Y (ABS) = 0,4476x + 0,0172

R2 = 0,9957

6

0 2 4 6 8 10 12 140.00000

0.10000

0.20000

0.30000

0.40000

0.50000

0.60000

f(x) = 0.0180803464285714 x + 0.0408878071428571R² = 0.910644611966264

f(x) = 0.0432526857142857 x + 0.0205802857142858R² = 0.870017621372252

Enzima Soluble 1:100

Tiempo (min)

[Glu

cosa

] (m

M)

Figura 1. Comportamiento cinético para enzima soluble con diferente factor de dilución

Como se puede observar en la Figura.1 se encuentran las regresiones de concentración de glucosa para dos diferentes diluciones de enzima soluble, ya sea dilución 1:100 y dilución 1:200 respectivamente, con una concentración de lactosa (100 g/L) la cual corresponde a la concentración saturada de sustrato. La grafica demuestra que a una mayor (1:200) dilución, la linealización de los datos tiende a disminuir en comparación a una menos diluida (1:100).

0 2 4 6 8 10 12 140.00000

0.20000

0.40000

0.60000

0.80000

1.00000

1.20000

1.40000

f(x) = 0.0785832857142857 x + 0.131799257142857R² = 0.684574920137612f(x) = 0.0778729285714286 x + 0.136103571428571R² = 0.800895347205132

Enzima Inmovilizada 1:10Linear (Enzima Inmovilizada 1:10)Enzima Inmovilizada 1:4Linear (Enzima Inmovilizada 1:4)

Tiempo (min)

[Glu

cosa

] (m

M)

Figura 2. Comportamiento cinético para enzima inmovilizada de 0,5 g en 15 mL de Tampón fosfato para dilución 1:10 y 0,2 g en 15 mL de Tampón fosfato para dilución 1:4

Como se observa en la figura 2 los datos se dispersan en cada uno de los tiempos de reacción enzimática, produciéndose una distorsión en la linealización de los datos,

7

que se pudo haber originado por los tiempos cortos de la reacción que afectaría a la producción de glucosa o también como la enzima estaba inmovilizada sobre una matriz de gel llamada Glioxil agarosa, la enzima se encuentra inmovilizada al interior de esta partícula, la restricciones difuncionales son considerables producto de la baja velocidad que existe en el transporte de los sustratos,(Illanes,2002)provocando una modificación en la actividad de la enzima. Se debe considerar que la concentración de lactosa que se utilizo fue 150 g/L, siendo ésta una concentración mayor que en la anterior (enzima soluble) para evitar lo descrito anteriormente.

0 2 4 6 8 10 12 140.00000

0.02000

0.04000

0.06000

0.08000

0.10000

0.12000

0.14000

0.16000

0.18000

0.20000f(x) = 0.02847366 x + 0.01588002R² = 0.950692217581066

f(x) = NaN x + NaNR² = 0

Enzima Soluble 1:100

Tiempo (min)

[Glu

cosa

] (m

M)

Figura 3. Regresión lineal para la concentración de glucosa vs tiempo, para el comportamiento de una enzima soluble con diferente factor de dilución

Con estos antecedentes recopilados se comenzó al análisis del rango de linealidad de los dos casos de determinación de actividad, el cual consistió entre los tiempos para la enzima soluble entre t (min)= 0 y t (min)= 6, siendo las ecuaciones las descritas en la figura 3. Se discriminaron ciertos datos los cuales se encuentran entre el tiempo 8 (min) y 12 (min), por la sencilla razón de que no presentaban un comportamiento lineal para el estudio de rango lineal, sino más bien una tendencia a la saturación de la enzima.

8

0 2 4 6 8 10 12 140.00000

0.20000

0.40000

0.60000

0.80000

1.00000

1.20000

1.40000f(x) = 0.115623954285714 x + 0.00833036190476177R² = 0.937328917625021

f(x) = 0.0778729285714286 x + 0.136103571428571R² = 0.800895347205132

Enzima Inmovilizada 1:10Linear (Enzima Inmovi-lizada 1:10)Linear (Enzima Inmovi-lizada 1:10)Enzima Inmovilizada 1:4Linear (Enzima Inmovi-lizada 1:4)Linear (Enzima Inmovi-lizada 1:4)

Tiempo (min)

[Glu

cosa

] (m

M)

Fiura 4g. Regresión lineal para la concentración de glucosa vs tiempo para el comportamiento de enzima inmovilizada para una dilución de 1:10 y 1:4 respectivamente

Para la enzima inmovilizada los rangos lineales que se establecieron fueron los puntos de la recta que varían entre el tiempo 0 (min) y 10 (min) para una dilución de 1:4 y para la 1:10 se tomaron los tiempo desde 0 (min) a 12 (min)

Se discriminó sólo un dato en la recta la cual corresponde a la dilución 1:4 del tiempo 12 (min), ya que este punto disminuía drásticamente en la línea por la saturación anticipada de la enzima formando el complejo ES.

Al obtener los resultados de los rangos lineales de velocidades de reacción enzimática se cuantificó la actividad de los preparados dispuestos en el laboratorio. Esto se obtuvo aplicando la regresión lineal correspondiente (ecuación de la recta dicha anteriormente) siendo la pendiente igual a la actividad enzimática en la solución, siendo para la enzima soluble Dilución 1:100 = 0,0506 [mM/min] y Dilución 1:200 = 0,0285 [mM/min] y para la enzima inmovilizada Dilución 1:4 = 0,1156 [mM/min] y Dilución 1:10 = 0,0779 [mM/min]

Luego de tener estas actividades para cada enzima, ya sea soluble como inmovilizada, se le aplicó un cambio de unidades pasando los respectivos [mM/min] de cada resultado a Unidades Internacionales [UI], siendo ésta ultima [µM/min], explicados en el anexo D , por lo tanto realizando el cambio de unidades concordados quedaría para la enzima soluble, con su respectivo factor de dilución.

Enzima Soluble (1:100) = 511.060 [UI/mL enzima]

(1:200) = 575.700[UI/mL enzima]

9

El cambio de unidades para la enzima inmovilizada, con sus respectivos valores de factor de dilución

Enzima Inmovilizada (1:10) = 19.66975 [UI/g enzima]

(1:4) = 11.6756 [UI/g enzima]

Las actividades resultantes para cada factor de dilución tanto para la enzima soluble como para la inmovilizada debieran dar muy similares, debido a que encontramos el rango lineal de la recta siendo proporcional para cada punto de la reacción, así la actividad es dependiente de la concentración de sustrato (una actividad enzimática para cada concentración de sustrato diferente)

Como se puede observar en las actividades resultantes para el caso de enzima soluble, éstas dan muy parecidas al aplicarle el respectivo factor de dilución por lo que se podría establecer como correcto la experiencia. Para el caso de enzima inmovilizada los resultados de las actividades no dan específicamente iguales por lo que se pudo haber originado producto de un poca reacción que estableció entre el sustrato y la enzima, pero objetivamente la actividad debería ser menor que para la situación soluble, ratificando la correcta metodología aplicada.

10

1.3.-Determinación de parámetros cinéticos para una enzima soluble procedente de la bacteria Bacillus circulans

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.040

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

0.0006

0.0007

0.0008

0.0009

0.001

1/S (mM/mL)-1

1/V

(UI/

mL)

-1

Figura 5. Determinacion de parametros cinéticos de inhibición competitiva , mediante el método de Lineweaver-Burk

Según la figura 5 podemos observar la linealización de los datos obtenidos de una enzima soluble con actividad láctica a distintas concentraciones de sustrato Anexo E, y en presencia de un inhibidor el cual fue la galactosa a tres concentraciones diferentes (5 (g/L) , 10 (g/L), 15 (g/L)) para la obtención de nuestros parámetros cinéticos. En nuestro caso trabajamos con una concentración de 10(g/L) dándonos como resultado lo siguiente:

Vmax = 5000 Vap= 5000

Km = 75 Kap=347,5

Según lo anterior podemos decir que estamos en presencia de una inhibición competitiva donde en nuestro caso la galactosa compite por el sitio activo de la enzima con la lactosa afectando la afinidad de la enzima hacia el sustrato (Km), ya que impide o más bien retrasa la formación del complejo enzima sustrato (ES) y como la galactosa solo afecta la afinidad, el complejo EIS se descompone también a la misma velocidad.

11

Ésta inhibición la podríamos reducir aumentando la concentración del sustrato o disminuyendo la concentración de galactosa (Inhibición), dando más ventaja al sustrato en la competencia del sitio activo de la enzima formando más producto.

En comparación de los valores obtenidos para las constantes, tanto aparente (con galactosa) como la michaeliana (sin galactosa) podemos observar que la aparente es mayor, lo cual podemos decir que el experimento se llevo a cabo correctamente.

Según los datos emanados durante el laboratorio Anexo F cabe señalar que con respectos a los datos obtenidos sin presencia de galactosa se realizo una buena práctica, logrando una regresión lineal aceptable, sin embargo cuando realizamos la práctica en presencia de galactosa se tuvo que eliminar ciertos datos, ya que no se encontraban en un rango lineal. Esto datos erróneos se pudieron haber dado por distintos factores, pero uno de lo más factible es que no consideramos el tiempo adecuado de reacción.

Una vez obtenidos todo los datos cinéticos y la concentración de galactosa con la que trabajamos (10 (g/L); 55,54 (mM)) conseguimos adquirir el Ki (constante de inhibición) el cuál fue:

Ki = 15,29 (Expresados en el Anexo G)

Sobre los cálculos de absorbancias de los blancos de reacción para la solución de lactosa sin inhibidor, están dieron prácticamente despreciables, por lo tanto se puede analizar que la muestra entregada no tenia sustrato. por eso que no hubo tanta producción de glucosa, en cambio para las muestras con inhibidor de galactosa, el blanco de reacción fue alrededor de un 0,3 de absorbancias. Esto se debe a que las muestras entregadas ya tenían el inhibidor (con concentración de 10 (g/L)), entonces al aplicar el método del glucostat y medir la concentración de glucosa, ésta se pudo haber confundido con la galactosa la cual tienen parecido peso molecular. También se tiene que destacar que tanto la glucosa como la galactosa son productos de la lactosa (que en este experimento fue nuestro sustrato)

12

2.-Conclusion

Como conclusión general podemos afirmar que se realizaron todos los experimentos entregados en la guía, obteniendo resultados adecuados a lo establecido en los objetivos de cada experiencia tanto para la determinación de proteínas, de actividad enzimática y parámetros cinéticos.

Sobre la realización de curva de calibrado para la determinación de proteínas se pudo establecer una regresión lineal aceptable, producto de la linealidad de los puntos y su respectivo coeficiente de regresión. Al interceptar nuestras absorbancias y los diferentes preparados éstos fueron aceptables para nosotros, ya que el balance realizado para el extracto crudo fue mayor al de la concentración de proteínas en la purificación. Esto es razonable ya que en el pellet entregado se encontraban presentes todas las proteínas y es en la ruptura donde se debería haber dado la mayor eficiencia para poder extraer las proteínas posibles.. Al purificar el extracto crudo, este tuvo una actividad de 6,4 (UI/mL purificado) la cual se puede concluir que se pudo cuantificar prácticamente todas las proteínas al principio de la experiencia. Pero se puede recalcar que se pudo haber originado una actividad en el sobrenadante menor y que pudo haberse dado por la acción de los contaminantes presente inhibiendo la actividad original.

Gracias al método de Bradford se pudo percibir la comparación cualitativa de las muestras y así hacer la dilución adecuada, mientras más azul era la muestra más concentrada sería, así la dilución fue aun mayor para los preparados. Gracias a esto la absorbancias de las muestras estuvieron dentro del rango de la curva de calibrado para determinar la concentración de proteínas.

Acerca del análisis del rango de linealidad de los dos casos de determinación de actividad, éstos dieron correcto, comparando las pendientes conseguidas según cada dilución realizada en el laboratorio, siendo una el doble que la otra, la cual se comprobaron calculando su respectiva actividad final siendo muy similares, independiente a la dilución se le aplicaba. Se discriminaron ciertos puntos de la gráfica para así lograr el mejor rango de linealidad, ya que no presentaban un comportamiento lineal ordenado, sino más bien una convergencia a la saturación de la enzima.

Respecto a la última experiencia realizada que fue la obtención de los parámetros cinéticos para una enzima con actividad láctica, realizamos todos los procedimiento de buena manera, considerando los determinados tiempos (3 min) obteniendo resultados coherentes y una respectiva regresión lineal, aunque en presencia de galactosa nos dieron algunos datos errados igual se pudo comprobar que existió una inhibición del tipo competitiva, ya que sólo se vio modificada las respectivas pendientes y adquiriendo los mismos interceptos, y en comparación con los datos obtenidos de nuestros compañeros pudimos comprobar que a mayor concentración de inhibición mayor será la diferencia entre las pendientes disminuyendo sus velocidades especificas.

13

3.-Biblografía

Macarulla, J. Goñi, F. (1981).”Proteínas”. Biomoléculas: Lecciones de Bioquímica Estructural. 3º Edición, vol 2, p.115. España, Editorial Reverté.

Millán, A. (2001).”Proteínas totales y solubles”. Métodos de ecología vegetal. 1° Edición, vol 1, p. 224. Chile. Editorial Universitaria.

Arias, E. (1993). “Propiedades de las proteínas”. Biomoléculas. 1° Edición, vol 1, p. 245. España. Ediciones universidad de salamanca.

Illanes, A. Acevedo, F. Gentina, J. (2002). Fundamentos de Ingeniería bioquímica. 3° Edición, p. 49, p. 61. Chile. Ediciones universitarias de Valparaíso

14

ANEXOS

15

Anexo ACurva de Calibrado patrón con una proteína estándar (BSA)

Tabla A.1.1 Datos para la determinación de la curva de calibrado por el método de Bradford.

Concentración BSA (g/l) Volumen BSA (ml) Volumen BSA (μl) Volumen de Agua (μl) Volumen total (μl)0,01 0,04 40 360 4000,02 0,08 80 320 4000,03 0,12 120 280 4000,04 0,16 160 240 4000,05 0,2 200 200 4000,06 0,24 240 160 4000,07 0,28 280 120 400

En la tabla A.1.1 se muestran los datos en brutos para el cálculo de las respectivas absorbancias

Tabla A.1.2 Datos de absorbancias para cada concentración de proteína patrón, su promedio y desviación.

Absorbancia 1 Absorbancias 2 Absorbancia 3 Promedio Absorbancias

Desviación estándar

Absorbancia0,019 0,025 0,080 0,041 0,0340,089 0,098 0,086 0,091 0,0060,128 0,135 0,128 0,130 0,0040,213 0,210 0,215 0,213 0,0030,258 0,243 0,265 0,255 0,0110,322 0,329 0,334 0,328 0,0060,347 0,362 0,378 0,362 0,016

Absorbancia medida a 595 nm, medida a traves del método de BradfordLas muestras no fueron diluidas Graficando nuestros datos de Concentracion de BSA versus el promedio de las absorbancias obtenidas por el método de Bradford por duplicado es:

concentracion de proteinasen curva :

y = 5,581x - 0,0202R² = 0,9923

Anexo B

16

Cuantificaciones de concentraciones finales de las proteínas para distintos preparados.

Tabla B.1.1 Medición de proteína (sobrenadante) luego de la ruptura Primera dilución

N° de Tubo Dilución

Volumen de la muestra extracto crudo (μl)

Volumen Tampón fosfato( μl) Volumen total (μl)

1 1:10 40 360 4002 1:05 80 320 400

De esta primera dilución se tomo muestras para realizar una segunda dilución y así medir absorbancia.

Tabla B.1.2. Datos de absorbancias del tubo nº 1 por duplicado de la segunda dilución realizada.

Dilucion total Volumen de la muestra extracto crudo (μl) Volumen Tampon fosfato( μl) Absorbancia

1:100 100 900 0,2551:100 100 900 0,265

Volumen total (μl) : 1000 F.D. Total : 100

En la segunda dilución se realizo una dilución de 1:10 teniendo así la dilución total expresada en la tabla con el factor de dilución total de la muestra. Absorbancia a 595 nm, medida a través del método de Bradford

Tabla B.1.3 Datos de absorbancia del tubo nº2 por duplicado, realizada la segunda dilución.Dilución total Volumen de la muestra extracto crudo (μl) Volumen Tampón fosfato( μl) Absorbancia

1:60 100 1100 0,3651:60 100 1100 0,359

Volumen total (μl) : 1200 F.D. Total : 60

Al diluirla por segunda vez la muestra esta se diluyo con una dilución de 1:12 teniendo en la tabla la dilución total y el factor total de la muestra.Absorbancia a 595nm

Tabla B.1.2.1: Cuantificación de concentración de proteína del preparado obtenido del sobrenadante luego de la ruptura del tubo nº1

17

Concentración Factor de Concentración de Promediode proteínas (g/l) dilución proteínas final (g/l) Concentraciones (g/l)

0,0493 100 4,93 5,020,0511 100 5,11

Desde los datos obtenidos de la tabla B.1.2

Tabla B.1.3.1: Cuantificación de concentración de proteína del preparado obtenido del sobrenadante luego de la ruptura del tubo nº2


0,0690 60 4,14 4,1070,0679 60 4,07

Desde los datos obtenidos de la tabla B.1.3.Al calcular la concentración final del extracto crudo para las distintas diluciones ya mencionadas este da como resultado una concentración de proteínas de, 4,5635 (g/l)

Tabla B.2. : Cuantificación de proteína luego de la purificación para el sobrenadante.

Dilución Volumen de muestra (μl) Volumen Tampón(μl) Absorbancia1:10 100 900 0,1791:10 100 900 0,180

El sobrenadante se obtuvo luego de acondicionarle pequeñas alícuotas de etanol y su centrifugación correspondiente.Absorbancia a 595nm, medida a través del método de Bradford.

Tabla B.2.1: Concentraciones de proteína finales luego de la purificación para el sobrenadante.

Concentración Factor de Concentración de Promedio

18

de proteínas (g/l) dilución proteínas final (g/l) Concentraciones (g/l)0,0357 10 0,357 0,3580,0359 10 0,359

Tabla B.3: Cuantificación de proteína resuspendida luego de la purificación en tampón fosfato- citrato, pH 6 a 0,1M de concentración.

Dilución Volumen de muestra (μl) Volumen Tampón(μl) Absorbancia 1:50 40 1960 0,2601:50 40 1960 0,246

La proteína resuspendida se obtuvo a través de la remoción del sobrenadante y el secado con aire frío Absorbancia a 595nm, medida a través del método de Bradford

Tabla B.3.1 Concentraciones de proteína resuspendida finales luego de la purificación


0,0502 50 2,51 2,4480,0477 50 2,39

Tabla B.4. Cuantificación de proteína del preparado comercial, Biolactasa –NTL, ya diluida 60 veces.

Volumen muestra (μl) Volumen tampón (μl) Volumen total (μl) Absorbancia F.D

total100 400 500 0,546 300100 400 500 0,533 300

50 450 500 0,303 60050 450 500 0,270 600

Muestras por duplicado.El factor de dilución total se incluye la dilución ya realizada por el ayudante (1/60)Absorbancia a 595 nm, medida a través del método de Bradford

Tabla B.4.1. Concentraciones de proteínas finales del preparado comercial


19

0,0579 600 34,74 32,970,0520 600 31,20

Sólo se cuantifico la concentración de proteínas del segundo duplicado ya que las absorbancias del primero estuvieron fuera de rango dentro de la curva de calibrado calculada en el Anexo A

Anexo CCurva de calibrado glucosa.

20

En Tabla C1 se muestran los datos para realizar la curva de calibrado para la cuantificación de proteínas.

Concentración Glucosa (mM/L) Absorbancia 1 Absorbancia 2 Promedio Absorbancia Desviación estándar

0 0 0 0 00,25 0,125 0,127 0,1258 0,00176776700,5 0,249 0,254 0,2515 0,0035355339

0,75 0,370 0,375 0,3725 0,00353553391 0,467 0,482 0,4745 0,0106066017

1,5 0,668 0,671 0,6695 0,0021213203

Ecuación de la linealizacion de la curva de calibrado de glucosa, promedio de absorbancias versus concentración de glucosa.

y = 0,4476x + 0,0172R² = 0,9957

Anexo DDeterminación de actividad enzimática para enzima soluble e inmovilizada

TablaD.1.1 Datos de absorbancia medidos para la Enzima soluble con dilución de enzima 1:100

21

Tiempo (min)

Absorbancia 1

Absorbancia 2 Concentración Glucosa (mM) 1 Concentración Glucosa (mM) 2

0 0,000 0,000 0 02 0,269 0,274 0,1376044 0,13984244 0,465 0,453 0,225334 0,21996286 0,670 0,635 0,317092 0,3014268 0,450 0,428 0,21862 0,2087728

10 0,563 0,523 0,2691988 0,251294812 0,592 0,573 0,2821792 0,2736748

Absorbancias medida a 505 nm y respectiva determinación de cada concentración de glucosa por el método del glucostat interceptando en la curva de calibrado (Anexo C)

Tabla D1.2 Obtención de concentraciones reales de glucosa

Promedio ConcentraciónFactor

Dilución Concentración Real Glucosa (mM)

Desviación Estándar de

concentración0 1 0,00000 0

0,1387234 1 0,13872 0,0015825050,2226484 1 0,22265 0,0037980120,309259 1 0,30926 0,011077535

0,2136964 1 0,21370 0,0069630220,2602468 2 0,52049 0,012660040,277927 2 0,55585 0,006013519

Calculo de promedio de concentraciones multiplicadas por su factor de dilución

[ gluc ]( mMl

)∗50 .5ml∗ 10 .5 (mlenz )

∗103 μmol1mmol

∗ 1L1000mL

∗FD(enxima )=v ( UImlEnz

)

TablaD.2.1 Datos de absorbancia medidos para la Enzima soluble con dilución 1:200

Tiempo (min)

Absorbancia 1


22

0 0,000 0,000 0 02 0,172 0,170 0,0941872 0,0932924 0,309 0,220 0,1555084 0,1156726 0,350 0,359 0,17386 0,17788848 0,362 0,376 0,1792312 0,1854976

10 0,450 0,460 0,21862 0,22309612 0,219 0,234 0,1152244 0,1219384


Tabla D2.2 Obtención de concentraciones reales de glucosa

Concentración PromedioFactor

Dilución Concentración Real Glucosa (mM) Desviación Estandar

0 1 0,00000 00,0937396 1 0,09374 0,0006330020,1355902 1 0,13559 0,0281685890,1758742 1 0,17587 0,0028485090,1823644 1 0,18236 0,0044310140,220858 1 0,22086 0,00316501

0,1185814 2 0,23716 0,004747515Calculo de promedio de concentraciones multiplicadas por su factor de dilución

TablaD.3.1 Datos de absorbancia medidos para la Enzima inmovilizada sin dilución 0,5 gr de catalizador en 15 de tampón fosfato

Tiempo (min)

Absorbancia 1


0 0,000 0,000 0 02 0,031 0,097 0,0310756 0,0606172

23

4 0,100 0,100 0,06196 0,061966 0,058 0,056 0,0431608 0,04226568 0,086 0,180 0,0556936 0,097768

10 0,091 0,155 0,0579316 0,08657812 0,270 0,202 0,138052 0,1076152


Tabla D.3.2 Obtención de concentraciones reales de glucosa

Concentración PromedioFactor Dilución Concentración Real Glucosa (mM)

Desviación Estandar

0 10 0,00000 00,0458464 10 0,45846 0,020889066

0,06196 10 0,61960 00,0427132 10 0,42713 0,0006330020,0767308 10 0,76731 0,0297510940,0722548 10 0,72255 0,0202560640,1228336 10 1,22834 0,021522068

Calculo de promedio de concentraciones multiplicadas por su factor de dilución

TablaD.4.1 Datos de absorbancia medidos para la Enzima inmovilizada sin dilución 0,2 gr de catalizador en 15 de tampón fosfato

Tiempo (min)

Absorbancia 1


0 0,000 0,000 0 02 0,282 0,246 0,1434232 0,12730964 0,390 0,290 0,191764 0,1470046 0,337 0,270 0,1680412 0,1380528 0,676 0,310 0,3197776 0,155956

10 0,775 0,424 0,36409 0,206982412 0,370 0,340 0,182812 0,169384


Tabla D.4.2 Obtención de concentraciones reales de glucosa

Concentración PromedioFactor

Dilución Concentración Real Glucosa (mM)Desviación Estandar

0 1 0,00000 00,1353664 1 0,13537 0,0113940360,169384 4 0,67754 0,0316501

0,1530466 4 0,61219 0,021205567

24

0,2378668 4 0,95147 0,1158393640,2855362 4 1,14214 0,1110918490,176098 4 0,70439 0,00949503

Calculo de promedio de concentraciones multiplicadas por su factor de diluciónDesde el tiempo 4 min se aplico una dilución 1:4

Anexo E

Determinación de los parámetros cinéticos a distintas concentración de sustrato lactosa sin presencia de galactosa

Se obtuvo cada concentración de glucosa interceptando en la curva de calibrado (Anexo C)

Se realizó la transformación de cada concentración de glucosa a su actividad mediante:

25

[ gluc ]( mMl

)∗ 13min

∗5ml∗ 1 L1000mL

∗ 10 . 5(mlenz )

∗103μ mol1mmol

∗FD (enxima )=v ( UImlEnz

)

Tabla E.1.1 Solución de lactosa a diferentes concentraciones con enzima lactosa NTL diluida 1:1000

tubo Concentración lactosa (g/L)

Concentración lactosa (mM)

Absorbancia blanco de reacción

Concentración glucosa blanco de

reacción (mM)

Concentración blanco de reacción pasando

por 0 (mM)1 10 27,78 0,019 0,0040 0,04242 20 55,56 0,011 -0,0138 0,02463 30 83,33 0,003 -0,0317 0,00674 50 138,89 0,008 -0,0205 0,01795 75 208,33 0,002 -0,0339 0,00456 100 277,78 0,011 -0,0138 0,02467 125 333,33 0,013 -0,0094 0,0290

Se expresan las concentraciones de glucosa obtenías a partir del blanco de reacciónMuestras obtenidas al tiempo 0; antes de agregar la enzima (antes de comenzar la reacción)Como se obtuvo valores negativos se procedió a interceptar en la curva con el punto 0,0 para la obtención de la concentración (g/L) de glucosaNo se aplico dilución Absorbancia medida a 505 nm


Tubo

Concentración lactosa (g/L)

Concentración lactosa

(mM)Absorbanci

a

Concentración glucosa real

(mM)

Concentración glucosa – blanco(mM)

Velocidad especifica(UI/ml

)1 10 27,78 0,21 0,4307 0,3883 1,294312 20 55,56 0,338 0,7167 0,6921 2,30712

26

3 30 83,33 0,474 1,0205 1,0138 3,379504 50 138,89 0,446 0,9579 0,9401 3,133755 75 208,33 0,448 0,9624 0,9579 3,193336 100 277,78 0,5 1,0786 1,0540 3,513557 120 333,33 0,47 1,0116 0,9826 3,27524

Concentraciones obtenidas para las primeras muestras para la determinación de las velocidades a cada concentración de glucosaMuestras obtenidas a los 3 minutos de agregada la encima (comienzo de la reacción) a distintas concentraciones de sustrato y luego se procedió a la determinación de concentración de glucosa por método de glucostatNo se aplico diluciónAbsorbancia medida a 505 nm


tubo

Concentración lactosa (g/L)

Concentración lactosa (mM) Absorbancia


(mM)

Concentración glucosa –

blanco(mM)Velocidad

especifica(UI/ml)1 10 27,78 0,207 0,424039321 0,381590706 1271,969022 20 55,56 0,292 0,613941019 0,589365505 1964,551683 30 83,33 0,339 0,718945487 0,712243074 2374,143584 50 138,89 0,365 0,777033065 0,759159964 2530,533215 75 208,33 0,509 1,098748883 1,094280608 3647,602036 100 277,78 0,603 1,308757819 1,284182306 4280,607697 120 333,33 0,484 1,042895442 1,013851653 3379,50551

Datos obtenidos del duplicado para la determinación de las velocidades a cada concentración de glucosaMuestras obtenidas por el mismo procedimiento anterior en la tabla E.1.2

Tabla E.1.3 Datos para la obtención de nuestros parámetros cinéticos

1/V(UI/mL)-1 (1)1/V(UI/mL)-1

(2)1/V(UI/mL)-1

promedioDesviación

estándar 1/V 1/S( mM/mL)-1

0,000772612 0,00078618 0,0007794 9,59577E-06 0,036

0,000433441 0,00050902 0,00047123 5,34439E-05 0,018

0,000295901 0,0004212 0,00035855 8,86028E-05 0,012

0,000319106 0,00039517 0,00035714 5,37876E-05 0,0072

27

0,000313153 0,00027415 0,00029365 2,75774E-05 0,0048

0,000284612 0,00023361 0,00025911 3,60628E-05 0,0036

0,000305321 0,0002959 0,00030061 6,66047E-06 0,003

Muestra los inversos de la velocidades, promedio y desviación estándar para la determinación de los parámetros cinéticos

A partir de la ecuación de michaelis y menten se ocupo su reciproca(ecuación Lineweaver y Burk)

y = 0,015x + 0,0002R² = 0,9753

1V max

=0,0002 ;V max=5000

KmVmax

=0,015 ; Km=75

Anexo FDeterminación de los parámetros cinéticos a distintas concentración de sustrato lactosa con

presencia de galactosa a 10(g/L)

Tabla F.1.1 Solución de lactosa a diferentes concentraciones con enzima lactosa NTL diluida 1:100 en presencia del inhibidor galactosa

tuboConcentración lactosa (g/L)

Concentración galactosa (g/L)

Absorbancia blanco de

Concentración glucosa blanco de

Concentración blanco de reacción pasando

28

1v= kmvm∗s

+ 1vm

reacción reacción (mM) por 0 (mM)1 27,78 10 0,324 0,685433423 0,723860592 55,56 10 0,35 0,743521001 0,7819481683 83,33 10 0,328 0,694369973 0,732797144 138,89 10 0,278 0,582663092 0,6210902595 208,33 10 0,289 0,607238606 0,6456657736 277,78 10 0,274 0,573726542 0,6121537097 333,33 10 0,317 0,669794459 0,708221626

Se expresan las concentraciones de glucosa obtenías a partir del blanco de reacciónMuestras obtenidas al tiempo 0; antes de agregar la enzima (antes de comenzar la reacción)Como en el proceso anterior se procedió a interceptar en la curva con el punto 0,0 para la obtención de la concentración de glucosa en este proceso también se siguió los mismo pasos para la obtención de la concentraciones de glucosaAbsorbancia medida a 505 nm


Tubo Concentración lactosa (mM)

Concentración galactosa (g/L) Absorbancia


(mM)


blanco(mM)

Velocidad especifica (UI/mL)

1 27,78 10 0,499 1,076407507 0,352546917 117,5156392 55,56 10 0,593 1,286416443 0,504468275 168,15609173 83,33 10 0,57 1,235031278 0,502234138 167,41137924 138,89 10 0,239 0,99106345 0,36997319 123,3243968

29

5 208,33 10 0,244 1,013404826 0,367739053 122,57968426 277,78 10 0,239 0,99106345 0,378909741 126,30324697 333,33 10 0,248 1,031277927 0,3230563 107,6854334

Muestra las concentraciones obtenidas para las primeras muestras para la determinación de las velocidades a cada concentración de glucosaMuestras obtenidas a los 3 minutos de agregada la encima (comienzo de la reacción) a distintas concentraciones de sustrato y en presencia del inhibidor galactosa donde luego se procedió a la determinación de concentración de glucosa por método de glucostatAbsorbancia medida a 505 nm


Tubo Concentración lactosa (mM)

Concentración galactosa (g/L) Absorbancia


(mM)


blanco(mM)

Velocidad especifica (UI/mL)

1 27,78 10 0,295 1,241286863 0,888739946 296,24664882 55,56 10 0,357 1,518319929 1,013851653 337,95055113 83,33 10 0,384 1,63896336 1,136729223 378,90974084 138,89 10 0,19 0,772117962 0,402144772 134,04825745 208,33 10 0,17 0,682752458 0,315013405 105,00446836 277,78 10 0,27 1,129579982 0,750670241 250,22341387 333,33 10 0,18 0,72743521 0,40437891 134,7929699

Datos obtenidos del duplicado para la determinación de las velocidades a cada concentración de glucosaMuestras obtenidas por el mismo procedimiento anterior en la tabla F.1.2

Tabla E.1.3 Datos para la obtención de nuestros parámetros cinéticos

1/V(UI/mL)-

1 (1)1/V(UI/mL)-

1 (2)1/V(UI/mL)-

1 promedio

Desviación estándar

1/V0,00891 0,00738 0,00814 0,001080,00063 0,00091 0,00077 0,001410,00065 0,00068 0,00067 0,001110,00049 0,00050 0,00050 0,000460,00816 0,00952 0,00884 0,000970,00035 0,00020 0,00027 0,00035

30

0,00929 0,00742 0,00835 0,00132

Datos en sombreados datos eliminados muestra los inversos de la velocidades, promedio y desviación estándar para la

determinación de los parámetros cinéticos

A partir de la ecuación de michaelis y menten se ocupo su reciproca(ecuación Lineweaver y Burk)

y = 0,0695x + 0,0002R² = 0,948

1V ap

=0,0002;V ap=5000

KapVap

=0,0695 ;Kap=347,5

Anexo GComparación con inhibidor y sin inhibidor

Vm = Vap inhibición competitiva

Por consiguiente Km ap debería ser mayor al Km en ausencia de inhibidor,con estos

datos determinamos nuestra constante de inhibición (Ki) con la siguiente fórmula:

31

1v= kmvm∗s

+ 1vm

Kmap = Km (1 + (i/Ki))

Siendo i concentración de galactosa = 55,56 mM

Reemplazando los datos de Km ap, Km y de concentración de inhibidor (i), el Ki nos da 15,29

32

INFORME BIOCATALISIS Nº2 Noviembre 2012

Documents

Transcript of INFORME BIOCATALISIS Nº2 Noviembre 2012