PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO

FACULTAD DE INGENIERÍAESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

(ICB 690): Laboratorio de BioprocesosFERMENTACIÓN PILOTO DE Kluyveromyces marxianus EN

CULTIVO POR LOTEMuy buen trabajo, aunque los resultados no se muestran claros.No estoy de acuerdo con la justificación de tan elevados rendimientos, se valora la intención de discutir los resultados. (Aunque existe confusión entre resultados y discusiones.)Es interesante el balance para obtener los rendimientos.

Alumnos:Núñez, Tomás

Soto, ErikTapia, Carlos

Wiche, PiaProfesores:

Conejeros, RaúlRomero, Oscar

2

(Abril) 2009

Resumen

El presente laboratorio tuvo como objetivo principal la producción de biomasa del

microorganismo K. marxianus utilizando como sustrato lactosa en una fermentación a nivel

piloto. Para ello se realizó la propagación del microorganismo en un fermentador de menor

escala (12 [l] de volumen útil), lo que luego se utilizó como inóculo en el reactor de tamaño

piloto (120 [l] de volumen útil).

El manejo de los fermentadores se realizó de acuerdo a las condiciones de esterilidad

necesarias y se operararon manteniendo la temperatura a 38°C y regulando el pH entre 4,8 y

4,5.

Para la fase de propagación, el medio de cultivo se diseñó para mantener la fase

exponencial de crecimiento del microorganismo desde el final del segundo día hasta inicios

del tercer día (un total de 15 [h]). Se utilizó un volumen 12 [l] de medio de cultivo, el que

contenía lactosa, sulfato de amonio, sulfato de magnesio, fosfato de potasio, extracto de

levadura, sulfato de hierro y cloruro de calcio. La concentración final de células obtenida fue

la estimada, es decir 10[g/l].

Para la fase de fermentación, el fermentador piloto contó con un medio de cultivo que

permitiera sostener la fase exponencial del microorganismo por las 7 [h] que se estimó que

debía durar el proceso. Fue durante este tiempo que se procedió a determinar la cinética de

crecimiento del microorganismo y consumo de lactosa del mismo, tomando muestras en

intervalos de 30 [min]. Se comenzó con una concentración de 1,6[g/l] y una concentración

final de 17,3 [g/l], siendo mucho mayor a la estimada en alrededor de 11 [g/l].

A partir de los datos obtenidos se determinó que el rendimiento de lactosa en célula (YX/S)

para Kluyveromyces marxianus fue de 0,76 [g.levadura /g. lactosa], la producción

volumétrica de biomasa fue de 3,88 [g/l*h] y el crecimiento especifico presentado fue

notablemente alto, de 0,61[h-1].

i

Índice General

página1 Introducción 12 Objetivos 2

2.1 Objetivo General 22.2 Objetivos específicos: 2

3 Revisión Bibliográfica 33.1 Antecedentes generales de Kluyveromyces marxianus 33.2 Cultivo por lotes 4

3.2.1 Cinética de crecimiento 53.2.2 Crecimiento de biomasa y consumo de sustrato en fermentación por lotes 63.2.3 Consumo de Oxígeno en fermentación por lote 73.2.4 Condiciones de operación a utilizar en fermentación por lote 8

4 Materiales y métodos 94.1 Materiales 9

4.1.1 Material de laboratorio 94.1.2 Reactivos 94.1.3 Equipos 11

4.2 Métodos 124.2.1 Espectrofotometría 124.2.2 Determinación de la concentración de azúcares reductores 134.2.3 Determinación de la concentración celular 154.2.4 Diseño del medio de cultivo 164.2.5 Preparación de los medios de cultivo 174.2.6 Control de pH 184.2.7 Adición de Antiespumante 184.2.8 Control de la Aireación 194.2.9 Calibración de los electrodos 194.2.10 Esterilización 204.2.11 Traslado del medio 224.2.12 Manejo de la Caldera 234.2.13 Lavado del Fermentador Piloto y del Biolaffitte 23

5 Resultados 245.1 Concentración de biomasa en el tiempo para fermentador piloto 245.2 Concentración de lactosa en el tiempo para fermentador piloto 245.3 Rendimiento global de biomasa en sustrato 255.4 Productividad volumétrica de biomasa 265.5 Velocidad específica de crecimiento 265.6 Estimación de rendimientos de oxígeno y biomasa por medio del balance de la reacción 26

6 Discusiones 287 Conclusiones 338 Referencias 34A Apéndices 36

ii

Índice de Tablas

Tabla 4.1. Resumen de la composición de los medios de cultivo utilizados. 10

Tabla 4.2 Características de los fermentadores a utilizar en la experiencia 12

Tabla 4.3. Composición de los medios de cultivo utilizados en el desarrollo de la experiencia

y la masa de reactivo que se agregó en cada caso. 18

Tabla 5.3 Concentraciones de biomasa obtenidas al inicio y final de cada fermentación 25

iii

Índice de Figuras

Figura 3.1 Curva típica de crecimiento microbiano, con las 4 primeras fases del crecimiento

4

Figura 5.1Curva de crecimiento de Kluyveromyces marxianus a 38ºC y pH 4.8 24

Figura 5.2 Consumo de lactosa en el tiempo por Kluyveromyces marxianus en un medio a

38ºC y pH de 4,8 25

Figura 5.3 Curva del crecimiento logarítmico de biomasa v/s tiempo, para la obtención de la

Velocidad Específica de Crecimiento 26

iv

1 Introducción

En la actualidad la producción de levadura ha adquirido mucha importancia para distintos

tipos de industria, como la producción de cerveza, pan, vino, entre otros fermentados, e

incluso para la producción de enzimas. Para el exitoso desarrollo de la fermentación es

necesario considerar ciertos requisitos para estimular una adecuada producción de biomasa.

El presente informe tiene como objetivo reportar los resultados obtenidos durante la

experiencia llevada a cabo en la planta piloto, además del análisis de los mismos. Se realizó

la fermentación a nivel piloto del microorganismo Kluyveromyces marxianus, con el objetivo

de generar biomasa en condiciones aerobias. Para la fermentación con el microorganismo K.

marxianus, se utilizó como sustrato limitante la fuente de carbono (lactosa).

Una adecuada estrategia de producción está basada en el conocimiento de distintos

parámetros característicos del microorganismo de interés, tales como, velocidad específica

de crecimiento, rendimiento de fuente de carbono en biomasa y productividad volumétrica.

La esterilidad dentro del fermentador es indispensable para el buen desarrollo del proceso y

la mantención de la cepa de interés. De haber proliferación de otra(s) especie(s), se puede

generar competencia por los nutrientes, lo que puede reducir el rendimiento global del

proceso o simplemente inutilizarlo. Además, el equipo debe poseer un sistema de control

que permita el manejo de las variables controladas del sistema, como el pH, temperatura,

agitación, flujo de gas de aireación, entre otros.

v

2 Objetivos

2.1 Objetivo General

El objetivo de esta experiencia fue determinar la cinética de crecimiento y de consumo de

lactosa de K. marxianus en una fermentación realizada a escala piloto, a 38ºC y un pH de 4,8

+ 0,4, para la producción de biomasa.

2.2 Objetivos específicos:

Obtener un aumento de 10 veces en la concentración de biomasa dentro del reactor.

Lograr condiciones de esterilidad en la operación.

Diseñar y preparar un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de la levadura

Kluyveromyces marxianus.

Controlar condiciones de operación de forma de obtener el máximo rendimiento

posible durante la fermentación.

Determinar rendimiento y productividad volumétrica para una fermentación por lote a

escala piloto de Kluyveromyces marxianus

vi

3 Revisión Bibliográfica

vii

3.1 Antecedentes generales de Kluyveromyces marxianus

K. marxianus es una especie de levadura muy estudiada por sus aplicaciones industriales,

siendo algunas de estas la producción de etanol y de enzima b-galactosidasa. Se ha

estudiado su uso para producción de la enzima b-galactosidasa y etanol usando medios de

cultivo definidos y complejos, principalmente extracto de levadura y suero de queso. (Banat,

1996; Hack, Marchant, 1998; Chinappi y Sánchez, 2000).

Kluyveromyces marxianus es una levadura que presenta características de Crabtree

negativa (Graciano, 2007), lo que indica que produce biomasa en presencia de altas

concentraciones de glucosa, al contrario de las Crabtree positivas, que fermentan la fuente

de carbono a alcohol cuando ésta se encuentra en cantidades excesivas.

Otra característica importante a señalar de K. marxianus es que presenta altas velocidades

de crecimiento, estando dentro de las más altas de entre todas las levaduras (Graciano,

2007). Se han reportado velocidades de crecimiento de K. marxianus en lactosa de 0,59 [h-1]

(Krzystek, Ledakowicz, 2000). Por otro lado, estas velocidades se ven justificadas en parte

por el comportamiento termotolerante que posee esta levadura (Hack, Marchant, 1998),

pudiendo soportar temperaturas de 45°C con velocidades específicas de crecimiento de 0,6

[h-1] en condiciones aeróbicas.

Dentro de los estudios revisados, también se indica los rendimientos de lactosa en biomasa.

Estos rendimientos están en el orden de 0,36 a 0,49 [g biomasa/g lactosa] (Chinappi y

Sánchez, 2000; Longhi et al, 2004).

Para la fermentación realizada con el microorganismo K. marxianus, se utilizó como sustrato

limitante la lactosa (fuente de carbono). K. marxianus es capaz de degradar la lactosa debido

a su producción de la enzima b-galactosidasa, la que posee una acción intracelular y cuya

acción es inducida por la presencia de lactosa.

3.2 Cultivo por lotes

viii

La modalidad de cultivo por lotes se caracteriza por no tener entradas ni salidas de masa

desde o hacia el sistema durante la operación, salvo el intercambio gaseoso (inyección de

aire y salida de gases). Se lleva a cabo en un fermentador, en el cual se utiliza sólo un 60 a

80% de su capacidad total, aproximadamente. Es aconsejable dejar una “cabeza de aire” en

el fermentador, para evitar el derrame de líquido por efecto de la agitación y además el evitar

salida de medio por causa de espuma.

El cultivo debe comenzar con una adecuada concentración de biomasa. El tamaño del

inóculo debe ser de un 10% del volumen total de fermentación, para evitar retrasos

excesivos en la proliferación del microorganismo (Mateos, 2000).

Al monitorear la concentración de biomasa durante un cultivo por lotes, se pueden observar

3 fases características: fase de latencia (o lag), fase de crecimiento exponencial (o fase log)

y fase estacionaria. A estas se agregan dos más, la fase de muerte y fase de crecimiento

críptico, que se observan dependiendo del tiempo del estudio (Acevedo et al, 2002). Las

primeras 4 fases pueden observarse en la Figura 3.1

Figura 3.1 Curva típica de crecimiento microbiano, con las 4 primeras fases del crecimiento

Se puede observar que en un cultivo por lotes se trabaja en régimen no estacionario, ya que

las condiciones ambientales (como la concentración de nutrientes y células) varían en el

tiempo. Otros factores, como el pH y la temperatura, deben ser regulados durante el cultivo

si se desean mantener dentro de ciertos límites.

ix

En el desarrollo de la fermentación se llevará a cabo dos etapas: la primera consiste en la

propagación de los microorganismos para generar la biomasa inicial de fermentación y la

segunda es la fermentación de K. marxianus a escala piloto. Para cada una, se aplican los

criterios presentados en los párrafos anteriores.

3.2.1 Cinética de crecimiento

Se considera que el crecimiento microbiano, o aumento de biomasa, se puede modelar a

través de una cinética de primer orden, que depende de la velocidad específica de

crecimiento, como se describe a continuación (Acevedo et al, 2002).

dNdt

=μNEcuación 1

Donde:

N: Número de microorganismos

μ: Velocidad de crecimiento específica [h

-1]

t: Tiempo [h]

La velocidad específica de crecimiento depende de las condiciones de ensayo, en particular

de la disponibilidad de la fuente de carbono (u otro nutriente limitante) y oxígeno (para

cultivos aerobios), el pH y la temperatura (Atkinson et al, 1986). Es deseable mantener estas

variables controladas (y mejor aún, constantes) para poder determinar con precisión la

velocidad específica de crecimiento en tales condiciones, y de esta forma poder diseñar

equipos y procesos. Si alguna de estas variables cambiara notablemente durante el

desarrollo de la experiencia, lo haría también la velocidad de crecimiento específica. Esta

variación inutilizaría la experiencia tanto para propósitos de diseño como de estudio, puesto

que es en base a esta velocidad que se determinan los tiempos de reacción, y de aquí los

tamaños de los reactores.

La velocidad específica de crecimiento tiene un comportamiento del tipo Monod,

dependiendo de la concentración de sustrato limitante en el medio. Es decir, la velocidad

específica aumenta si lo hace también la concentración de sustrato. A altas concentraciones

de sustrato limitante, la velocidad de crecimiento específica encuentra un valor máximo, al

que se denomina velocidad de crecimiento específica máxima, y se denota como max .

x

3.2.2 Crecimiento de biomasa y consumo de sustrato en fermentación por lotes

Las ecuaciones utilizadas en la determinación de biomasa y sustrato en la experiencia de

laboratorio se explicitan a continuación (Acevedo et al, 2002). El crecimiento de la biomasa

microbiana está representado por:

dXVdt

=μ XVEcuación 2

Dado que en un cultivo por lotes el volumen (V) se puede asumir constante, se utilizan sólo

las concentraciones inicial y final para el cálculo del tiempo. El tiempo calculado corresponde

sólo a aquel en que se desarrolla el crecimiento exponencial de la población bacteriana. Para

un cultivo por lote, la expresión es:

Ecuación 3

Donde:

μ: Velocidad específica de crecimiento, en [h-1

]. Para el periodo exponencial, μ se considera constante e igual a μmax, dado que la oferta de sustrato

supera a la demanda.

X: Concentración de biomasa a tiempo t, [g/l]

X0: Concentración inicial de biomasa, [g/l]

Se define el rendimiento celular (YX/S) como:

Y X /S=ΔX

−ΔS Ecuación 4

Donde:

∆S: Concentración de sustrato consumido por el microorganismo, [g/l]

∆X: Diferencia entre la concentración inicial y final de células, [g/l]

YX/S: Rendimiento de la célula en sustrato [g/g]

Reordenando la ecuación anterior, se obtiene:

X=Y X /S⋅S0+X0−Y X / S⋅S Ecuación 5

xi

Se puede relacionar la velocidad de aparición de biomasa y la de consumo de sustrato,

como sigue:

Ecuación 6

El rendimiento también puede ser expresado como la fracción del elemento de interés en el

compuesto partido por la fracción del elemento en la célula, multiplicado por un factor (f).

Y X /S=%EC

%EX

⋅fEcuación 7

Donde:

%EC : % del elemento en la fuente

%E X : % del elemento en la célula

f: Factor de corrección para el aprovechamiento de la fuente de carbono

f es un factor que da cuenta de la real utilización de la fuente de carbono en la célula. A

mayor f , mayor es el traspaso de carbono desde la fuente a la célula. El factor toma

diferentes valores según el metabolismo del microorganismo. Si el microorganismo utiliza la

vía aerobia, este factor tendrá un valor estimado entre 0,5 a 0,6. Esto quiere decir que los

microorganismos aerobios generan más masa celular que los anaerobios a partir de una

misma masa de fuente de carbono.

Esta forma de cálculo se utiliza principalmente para estimar el rendimiento teórico de cada

nutriente y principalmente del nutriente limitante, con fines de preparación de los medios de

cultivo.

3.2.3 Consumo de Oxígeno en fermentación por lote

xii

Las levaduras, como Kluyveromyces marxianus, son organismos anaerobios facultativos, por

lo que pueden vivir en presencia o en ausencia de oxígeno. En condiciones aerobias, oxidan

la fuente de carbono mediante los procesos de: glicólisis, ciclo de Krebs y cadena de

transporte de electrones. En condiciones anaerobias proceden a fermentar la fuente de

carbono, produciendo etanol. En metabolismo aerobio la fuente de carbono se aprovecha

más que en fermentativo, en términos de producción de biomasa (Acevedo et al, 2002).

La demanda de oxígeno depende de la naturaleza del microorganismo y de su medio

ambiente nutricional. Por ejemplo, al tener la glucosa una mayor tasa de consumo que otros

sustratos, la demanda de oxígeno que genera es mayor. El oxígeno que consumen los

microorganismos es aquel que se encuentra disuelto en el fermentador. Su solubilidad

depende de la composición del medio y debe ser constantemente renovado para que las

células puedan seguir reproduciéndose. Por ejemplo, se reporta que para la respiración de

una población de levadura con una densidad de 109 [células/ml] el contenido de oxígeno en

el medio debe renovarse unas 12 veces por minuto para suplir la demanda celular de

oxígeno (Doran, 1998). Es claro, a partir de lo anterior, que la tensión de oxígeno disuelto es

un parámetro importante para el crecimiento y velocidad de crecimiento, afectando también

la síntesis de enzimas.

Se ha reportado en el caso específico de K. marxianus, que al comparar esta con otras

levaduras como S. cerevisiae o K. lactis, K. marxianus posee una demanda de oxígeno

mucho mayor, por lo que se debe tener presente una aireación adecuada para que el

sustrato limitante sea la fuente de carbono y no el oxígeno (Pinheiro et al.2002).

3.2.4 Condiciones de operación a utilizar en fermentación por lote

Para la elección de las condiciones de operación utilizadas en la fermentación se tomaron

valores recomendados de acuerdo a varios trabajos previamente realizados con esta cepa,

como se mostrará a continuación.

En el caso de la temperatura, se ha reportado que la temperatura óptima para el crecimiento

de K. marxianus se encuentra alrededor de los 38 + 2ºC. (Longhi et al. 2004). Dentro de este

rango se observa la mayor velocidad específica de crecimiento.

xiii

En relación al pH óptimo para realizar la fermentación de K. marxianus se consideró dentro

del rango de 4,8 ± 0,4 de acuerdo a estudios similares con esta cepa (Rech et al, 2007). El

pH debió ser regulado constantemente, puesto que el consumo de sulfato de amonio, con la

correspondiente liberación de protones, produce la acidificación del medio.

xiv

4 Materiales y métodos

4.1 Materiales

4.1.1 Material de laboratorio

A continuación se da una lista de los materiales utilizados durante la experiencia:

Pipetas de 1 [ml], 5 [ml] y 10 [ml]

Propipetas

Micropipeta y puntas

Vasos precipitados 100 [ml], 500 [ml] y 1 [l]

Espátulas

Pinzas

Celdas para espectrofotómetro

Capachos de centrifugación

Gradillas

Papel aluminio

50 tubos de ensayo con tapa

Matraces de aforo de 500 [ml]

Bidón de 15 [l] para esterilizar medio de propagación

Algodón y gasa

1 matraz Erlenmeyer de 2[l] (para salida de gases desde el fermentador)

4.1.2 Reactivos

Medio de Cultivo

La composición de los dos medios de cultivo utilizados durante la experiencia, resultaron

muy similares al ser diseñados, por lo que se decidió usar la misma composición para

ambos.

En la Tabla 4.1 se resumen las cantidades de cada nutriente utilizado para los volúmenes

respectivos. Además, se agrega la cantidad de antiespumante y tampón utilizados

xv

Tabla 4.1. Resumen de la composición de los medios de cultivo utilizados.

CompuestoConcentració

n [g/l]

Masa agregada medio cultivo fermentador Biolaffitte [g]

Volumen de reactivo

agregada fermentador Biolaffitte[ml]

Masa agregada

medio cultivo fermentador

piloto [g]

Lactosa 22,46 224,6 2743,2Sulfato de amonio 3,49 34,9 426

Sulfato de magnesio 0,3 3 36Fosfato de potasio 0,86 8,6 104,4Sulfato de Hierro 0,83 8,3 102Cloruro de Calcio 0,05 0,5 7,2Ácido Clorhídrico 0,7 7

Hidróxido de Sodio 100Ácido Cítrico 10,5

Citrato Disódico 11,8Antiespumante 1 10

Extracto de levadura 10 100 1200

Salida de aire del fermentador

Sulfato de cobre pentahidratado

Reactivo DNS

Ácido Dinitrosalicílico

Hidróxido de Sodio

Tartrato de Sodio y Potasio

Tampón Citrato

Ácido Cítrico

Hidróxido de sodio 1 [N]

Ácido clorhídrico 0.1 [N]

Implementos de seguridad

Cascos

Antiparras de protección

Guantes de cuero o descarne

Guantes de látex

xvi

4.1.3 Equipos

Placa calefactora; modelo IKA RH, Alemania.

Agitador de tubos; modelo VM-300; marca Boeco.

Balanza analítica: Chyo JS 110, YMC Co. Japan.

Espectrofotómetro: Shimadzu double-beam, modelo UV-150-02, Corporación Kyoto Japón.

Balanza Granataria: Sartorius, 2240, Sartorius – Werke ag. Alemania, rango 0 a 100[g] precisión +- 0.1 [g].

Termómetro de mercurio; rango de 0-150 , Quimis, Brazil

Mangueras para presión Masterflex.

Termocirculador eléctrico y mangueras

Caldera: Marca Ingecyc, 2 [bar] de presión máxima.

Autoclave ETS. Laqueus S.A. Modelo 19961. Francia, 1970.

Bomba peristáltica Masterflex Modelo 7549-40, Cole Palmer Instruments con capacidad para una manguera de alimentación 50-490 [rpm], 230 VAC, 50/60 [Hz].

Centrifuga Tabletop, modelo PLC-05, 1000-4000 [rpm]

Estufa, modelo ULM 600, temperatura máxima 220ºC.

Reactores

En la Tabla 4.2 4.2 se indican las características de los reactores a utilizar durante la primera

experiencia de laboratorio.

xvii

Tabla 4.2 Características de los fermentadores a utilizar en la experiencia

CaracterísticasFermentador de

propagaciónFermentador Piloto

DenominaciónFermentador Biolafitte

n°123770, tipo C5, Maisons-Laffitte.

Fermentador a escala piloto

Material Acero inoxidable Acero inoxidableVolumen [l] 15 120

Capacidad (Volumen útil) [l] 10 100

Sistema de agitaciónRotor Antiriebstechnik 1410

rpm. Tres agitadores de paleta plana

Rotor Siemens, Rapp Ratio 21,9. Dos agitadores de

paleta planaN° deflectores Dos Cuatro

Sistema de intercambio de calor

Serpentín internoSerpentín interno. Circuito

de agua externo (chaqueta).

Sistema de aireaciónMediante manguera de

burbujeoMediante dispersor en la

base del reactor

Sistema de captación de gasesLos gases son inyectados en una solución de CuSO4

Los gases son inyectados en una solución de CuSO4

Sistema de control de pH Solución tampón Electrodo de pH

Sistema de control de temperatura

Control manual mediante termómetro.

Termocirculador eléctrico que proporciona calor al

agua de calefacción, ésta es recirculada mediante

una manguera conectada con el serpentín interior

Control automático.Se utiliza vapor de la caldera alimentada al

serpentín interior, se enfría con una chaqueta externa

de agua fría.

xviii

4.2 Métodos

4.2.1 Espectrofotometría

La medición de biomasa se realiza mediante el fundamento de la ley de absorción, también

llamada ley de Lambert-Beer. Esta ley indica cuantitativamente la forma en que el grado de

atenuación de la luz depende de la concentración de las moléculas absorbentes y de la

longitud del trayecto en el que ocurre la absorción. Cuando la luz atraviesa un medio que

contiene un analito absorbente, disminuye su intensidad como consecuencia de la excitación

del analito (Douglas et al, 2004). Cuanto más largo sea el medio por el que pasa la luz,

existirán más moléculas o átomos absorbentes en el trayecto, y por tanto será más la

atenuación. La ley de Lambert-Beer se expresa en la Ecuación 8.

A=k⋅l⋅c Ecuación 8

Donde:

A : Absorbancia

k: Constante de proporcionalidad de absortividad, [l/(g∙cm)]

l: Longitud del trayecto del medio de absorción, [cm]

c : Concentración de analito absorbente, [g/l]

Sabiendo que esta relación es directamente proporcional, se puede utilizar para hacer una

regresión lineal de absorbancia versus concentración. Así se puede obtener una ecuación

que relacione ambas variables y permita conocer la concentración de las muestras problema,

sólo con obtener su absorbancia. Además, para no tener problemas con las otras moléculas

que no son de interés, es necesario calibrar el espectrofotómetro para la longitud de onda

característica del analito a determinar.

Dentro de las limitaciones de esta ley se encuentran el que el comportamiento de absorción

sólo ocurre en soluciones diluidas. Otra de estas limitaciones es que si se está midiendo la

concentración de levaduras, es posible que el tamaño de las células interfiera en la medición

de la concentración, ya que si es relativamente grande se obtendrá una mayor absorbancia

por el fenómeno descrito anteriormente.

Tanto la determinación de biomasa como la de azúcares reductores fueron realizadas a

través de espectrofotometría, como se detallará a continuación.

xix

4.2.2 Determinación de la concentración de azúcares reductores

Es una técnica de óxido-reducción que se basa en la capacidad de los azúcares reductores,

como la lactosa, para reducir el ácido 3,5–dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas

condiciones. Esta reducción produce una coloración que se hace más intensa a medida que

aumenta la concentración de azúcares reductores. Se evidencia por medio de la lectura de la

absorbancia en espectrofotómetro, lo que conlleva a la aplicación de la Ley de Beer-Lambert

(Miller, 1959). La longitud de onda explicitada en el método es de 540 [nm].

El fundamento de esta técnica consiste en la oxidación de la lactosa, para lo cual es

necesario abrir la molécula, que es cíclica. Esto se consigue aplicando calor y

proporcionando condiciones alcalinas. Para lograrlo, se prepara el reactivo DNS adicionando

hidróxido de sodio (NaOH). El grupo hidroxilo del NaOH causa la oxidación de la lactosa. En

esta oxidación, el carbono del grupo aldehído se convierte en un ácido carboxílico,

obteniéndose ácido glucónico. Por otro lado, el DNS es reducido gracias a la acción de

tartrato de sodio y potasio y a la oxidación de la lactosa. El ácido se transforma en ácido 3-

amino-5-nitrosalicílico, produciendo una coloración amarilla. Esta coloración es proporcional

a la concentración de lactosa, y su relación se conoce a través de la construcción de una

curva patrón.

La curva patrón se construye efectuando el método sobre un conjunto de muestras de

concentración de azúcar reductor conocida. Los puntos se grafican como concentración en el

eje de las abscisas, versus absorbancia en el eje de las ordenadas.

El reactivo DNS se degrada en el tiempo por factores ambientales, como la incidencia de luz,

lo que puede afectar su capacidad reductora sobre la lactosa.

Preparación del reactivo DNS

En 50ml de agua destilada se disuelven 1,6 [g] de NaOH

En la solución anterior se disuelve además 30 [g] de tartrato de sodio potasio

Calentar con agitación y lentamente se agrega 1 [g] de ácido dinitrosalicílico.

Dejar enfriar

Aforar a 100 [ml]

Se mantiene a temperatura ambiente y protegido de la luz.

xx

Curva patrón del DNS

Se prepararon 500 [ml] de solución estándar de lactosa de concentración 1,5 [g/l] en agua destilada. A partir de este estándar se preparó una batería de 9 tubos con concentraciones que variaron entre los 0 y 1,5[g/l]

Se tomaron alícuotas de 1 [ml], de cada tubo y se adicionaron a diferentes tubos de ensayo

Se agregó 1 [ml] de reactivo DNS en cada tubo de ensayo y se taparon

Se pusieron los tubos de ensayo tapados en un baño en ebullición durante 15 minutos

Luego, los tubos fueron dispuestos en un vaso de precipitado con hielo, para detener la reacción

Se agregaron 10 [ml] de agua destilada y se dejaron reposar por 15 minutos

Se agitaron los tubos para homogenizar la mezcla

Finalmente, se midió la absorbancia de la solución en cada tubo, llenando una celda de espectrofotómetro. La longitud de onda fue de 540 [nm].

Los datos obtenidos se agregaron a un gráfico de absorbancia versus concentración de lactosa

El blanco fue agua destilada

Determinación de la concentración de azúcares reductores

Para determinar la concentración de lactosa en el caldo de fermentación, se llevó a cabo el

siguiente procedimiento.

Se tomaron muestras de volumen igual o mayor a 4 [ml] y se dispusieron en tubos de centrifugación.

Las alícuotas fueron centrifugadas a 10000 rpm por 15 minutos, para separar los sólidos suspendidos (células) de los disueltos (componentes del medio de cultivo y productos extracelulares).

Se extrajo el sobrenadante, y se sometió a la prueba de DNS para determinación de azúcares reductores como fue explicitado anteriormente.

La absorbancia obtenida de las muestras se interpoló en la curva de calibrado, obtenida anteriormente con la solución estándar de lactosa, y se obtuvo la concentración de lactosa en cada muestra.

4.2.3 Determinación de la concentración celular

Determinación de biomasa por Turbidimetría

xxi

La concentración celular en el medio de cultivo es determinada a través de

espectrofotometría, correlacionando la absorción de la luz con la concentración celular del

medio a una determinada longitud de onda, esta longitud de onda se ajustó a 620 [nm] para

el caso específico de K. marxianus (Longhi et al, 1996). Para la medición de la absorbancia

se utilizó un espectrofotómetro.

Protocolo para obtener curva de calibrado

Para la confección de esta curva se contó con una suspensión celular concentrada del

microorganismo a utilizar, proporcionada por los ayudantes.

Se prepararon y enumeraron 3 capachos de aluminio y se pusieron a secar en la estufa, a 105ºC, por aproximadamente 2 [h], hasta obtener un peso constante

Se pesó cada capacho.

A partir del matraz original, con biomasa, se generaron 5 diluciones diferentes en matraces de aforo de 50 [ml], por duplicado. La curva de calibrado se realizó a partir de la dilución 1/10 que otorgó un valor de absorbancia cercano a 0,500 con el objetivo de tener la mayor linealidad posible en la confección de la curva.

Determinación de la concentración de células por peso seco.

De la solución madre se extrajeron 3 muestras de 20 [ml] cada una y se les aplicó el siguiente procedimiento 3 veces.

Centrifugar las muestras a 10000[rpm] por 10 min.

Retirar el sobrenadante del centrifugado

Adicionar agua destilada y resuspender las células para lavarlas

Realizado lo anterior, se resuspendió el pellet obtenido en un volumen mínimo de agua y se vertió en cada uno de los capachos secados previamente.

Se pusieron los capachos a secar en estufa a 105ºC hasta peso constante.

Se determinó el peso de las células por diferencia con el peso del capacho vacío

Se determinó la concentración celular de cada muestra con la masa de células y el volumen sometido a centrifugación. Se promediaron las concentraciones de las muestras triplicadas y de esta forma se obtuvo la concentración del inóculo utilizado

Medición de Absorbancia

De cada dilución, se extrajo una alícuota para determinar su absorbancia a 620 [nm]

Se relacionaron los valores de concentración y absorbancia en un gráfico

Se realizó una regresión lineal con los datos y se extrajo pendiente e intercepto de la curva de calibrado

Protocolo para obtener la concentración celular.

xxii

Cada 30 [min] se tomó una muestra del fermentador piloto

Se ajustó el espectrofotómetro a 0 con un blanco de agua destilada

Se midió la absorbancia de la muestra a 620 [nm] Si el valor se encontraba fuera del rango de aplicación de la curva de calibrado, se diluía y volvía a medir. Este paso fue repetido tantas veces como fue necesario.

Se interpoló el valor de absorbancia obtenido en la curva patrón y se extrajo la concentración celular, aplicando el factor de dilución correspondiente.

4.2.4 Diseño del medio de cultivo

El medio de cultivo se determinó a partir de la composición aproximada de la levadura,

extraída en parte de Acevedo (2002) y lo restante de Aiba (1973). En los Apéndices A.1 y

A.2 se muestran los datos y el procedimiento realizados para determinarlo. En la Tabla 4.3

4.3 se indica la composición del medio de cultivo utilizado para la propagación (en el reactor

Biolaffitte) y para la fermentación (en el reactor de escala piloto).

Debe considerarse que en el caso del reactor Biolaffitte el volumen utilizado fue de 12 [l] y en

el reactor a nivel piloto fue de 120 [l].

Para el control de pH se consideró el uso de tapón citrato, en el reactor Biolaffitte, y la

adición de una solución concentrada de NaOH, 4 [N], para el reactor piloto. La adición de

base fue manual, en la medida que fuera necesario.

4.2.5 Preparación de los medios de cultivo

Para el reactor Biolaffitte, en el cual se realizó la propagación del microorganismo, los

sustratos fueron pesados en balanza granataria y mezclados con 12 [l] de agua potable

dentro de un balde plástico. Se mezcló la solución hasta obtener una solución homogénea, la

que luego fue traspasada al bidón plástico, para posteriormente ser introducida en el auto

clave para su esterilización.

Para el reactor piloto, el medio de cultivo se preparó en un mezclador con capacidad 100 [l].

Los reactivos utilizados fueron pesados en una balanza balance digital y las cantidades

menores se midieron en balanza granataria. Dado que la capacidad del mezclador era menor

a la requerida para preparar el medio de cultivo, se adicionó el agua faltante directo en el

reactor.

xxiii

Las composiciones de los medios de cultivo se indican en la Tabla 4.3

xxiv

Tabla 4.3. Composición de los medios de cultivo utilizados en el desarrollo de la experiencia y la masa de reactivo que se agregó en cada caso.

CompuestoConcentración deseada [g/l]

Masa agregada medio cultivo fermentador Biolaffitte [g]

Volumen de reactivo agregada

fermentador Biolaffitte[ml]

Masa agregada medio cultivo fermentador

piloto [g]

Lactosa 22,46 224,6 2743,2Sulfato de amonio 3,49 34,9 426

Sulfato de magnesio

0,3 3 36

Fosfato de potasio 0,86 8,6 104,4Sulfato de Hierro 0,83 8,3 102Cloruro de Calcio 0,05 0,5 7,2Ácido Clorhídrico 0,7 7

Hidróxido de Sodio 100Ácido Cítrico 10,5

Citrato Disódico 11,8Antiespumante 1 10

Extracto de levadura

10 100 1200

xxv

4.2.6 Control de pH

Tampón citrato para fermentador Biolaffitte

El tampón citrato que se preparó en la experiencia de laboratorio, se obtuvo de mezclar 7

[ml] de una solución de ácido clorhídrico al 37% v/v con citrato disódico al 0,12 M. El citrato

disódico (base) fue preparado con 4 [g] de NaOH disueltos en 100 [ml] de agua destilada y

10,5 [g] de acido cítrico.

NaOH para reactor piloto

Se preparon 2[l] de una solución 4 [N] de NaOH para regular el pH en el reactor piloto. Se

adicionó 160 [g] de NaOH a un matraz Erlenmeyer y sobre ello se vertieron 2 [l] de agua

destilada, medida en matraz de aforo.

4.2.7 Adición de Antiespumante

Las fermentaciones son propensas a la formación de espuma como consecuencia de la

presencia de metabolitos con propiedades tensoactivas, principalmente las proteínas

(Atkinson et al, 1986). Tales espumas pueden conducir a una considerable disminución del

volumen de líquido en el recipiente durante el periodo de fermentación, al humedecimiento

del filtro de salida de aire con los peligros consecuentes de infección microbiana y a un

posible decrecimiento de las velocidades de transferencia de oxígeno.

Para evitar la fuga de medio de cultivo desde el reactor por efecto de la espumación, se

decidió agregar 1 [ml] por cada 10 [l] de medio de cultivo. El antiespumante utilizado fue un

antiespumante siliconado, en base a la recomendación del fabricante Widetec (2008).

Para adicionar el antiespumante se procedió a disolverlo en un pequeño volumen de agua

destilada, dentro de un matraz Erlenmeyer. Esto se hizo así para facilitar el vaciado del

antiespumante desde el matraz, ya que presentaba una alta viscosidad. Luego, se esterilizó

en autoclave a 1 [atmg] por 15 [min] y se adicionó al fermentador bajo mechero, por la misma

entrada por la cual se agregó el medio de cultivo (en el caso del reactor Biolaffitte) o por la

entrada de inóculo (en el caso del fermentador piloto).

xxvi

4.2.8 Control de la Aireación

Para el fermentador Biolaffitte se fijó un flujo de 14 [l aire/min] con un rotámetro, y se dejó

toda la noche, sin control visual.

Para el fermentador piloto se usó aireación variable, en buena medida pues a poco andar la

fermentación se comenzó a perder mucho medio de cultivo por efecto de la turbulencia

dentro del reactor. Es por esto que en principio se operó a 1,2 [vvm], lo que luego se

disminuyó a 0,6 [vvm], hasta que se resolvió el problema de la espuma (se agregó el

antiespumante) cuando se aumentó hasta 0,8 [vvm].

4.2.9 Calibración de los electrodos

Electrodo de pH

La calibración del electrodo de pH se realizó 4 horas antes de la esterilización, para de este

modo tener instalado el electrodo de pH dentro del fermentador antes de comenzar con la

esterilización. Para la calibración se procedió a preparar una solución a pH 7 y otra de pH 4

con tabletas buffer en matraces de 200 [ml]. Una vez preparados ambos buffer se procedió a

introducir el electrodo en cada solución buffer y manualmente se ajustaron ambos pH en el

medidor de pH.

Electrodo de oxígeno

Para calibrar el electrodo de oxígeno, se debió encender el equipo 6 [h] antes de esterilizar.

Sin embargo, esta medición no se realizó, debido al mal funcionamiento del equipo.

4.2.10 Esterilización

La esterilización de un medio o un ambiente es una operación destinada a eliminar todas las

formas vivas, ya sea destruyéndolas o removiéndolas (Vitalis Moritz, 2002). La esterilización

busca evitar los efectos adversos de la presencia de microorganismos extraños al proceso

biotecnológico (contaminantes), que podrían: consumir nutrientes, rebajando el rendimiento,

producir sustancias inhibitorias al proceso o perjudiciales a la separación del producto o bien

formar compuestos que descomponen el producto, dentro de otras consecuencias negativas.

xxvii

Protocolo para esterilización en el autoclave

Abrir el autoclave cuidadosamente con el gancho.

Verificar que el nivel de agua desionizada del autoclave se encuentre sobre la marca roja del medidor. De no ser así, rellenar el autoclave con agua desionizada.

Disponer el material a esterilizar dentro del autoclave. Se esterilizaron mangueras, el filtro de aire de algodón, el medio de cultivo y solución antiespumante

Cerrar el autoclave, apretando las mariposas de la tapa de forma cruzada.

Dejar la válvula de ventilación abierta totalmente.

Encender el autoclave.

Cuando comienza a salir vapor se debe dejar la válvula cerrada de forma de no interrumpir la salida de vapor.

Contar 25 minutos desde cuando el manómetro indica 1 [bar] de presión dentro del equipo (Roselfeld et al, 2003)

Apagar el autoclave

Esperar que disminuya tanto la presión como la temperatura.

Soltar las mariposas de forma cruzada, y abrir la tapa del autoclave con el gancho y guantes.

Esterilización de medio de cultivo para fermentador Biolaffitte

El medio de cultivo fue esterilizado dentro del autoclave en un bidón al cual se le diseñó una

tapa de gasa con algodón y se le introdujo una manguera. Por esta misma manguera se hizo

el traspaso del medio de cultivo al fermentador Biolaffitte, una vez que el medio y el

fermentador estuvieran esterilizados. El procedimiento de esterilización fue el de

“esterilización en autoclave”

Esterilización de medio de cultivo para fermentador reactor piloto

El medio de cultivo fue esterilizado dentro del reactor, para lo cual se utilizó el calor suministrado por el vapor que circuló por el serpentín.

Luego de cerrar todas las válvulas, se conectó la línea de vapor al serpentín

Se cuidó de que la presión no sobrepasara los 0,5 [bar]. En tal caso, se abrieron las válvulas necesarias para lograr la disminución de la presión.

Una vez que la temperatura llegó a 100°C, se contaron 20 [min] para la esterilización.

Luego de los 20 [min], se cerró el paso de vapor

Para enfriar, se conectó la línea de agua al serpentín

Con el agua se enfrió el reactor y medio de cultivo hasta la temperatura de operación, 38°C.

xxviii

Esterilización de línea de aire

El aire que se inyecta al reactor a fin de obtener el suministro de oxígeno debe ser

esterilizado para evitar la contaminación por otros microorganismos. Para ello se debe pasar

el aire a través de un filtro de a lo más 0, 45 micrones (Estola et al, 2005).

A fines de airear el cultivo, se utilizará la línea de aire disponible.

Para el reactor Biolaffitte, se utilizó un filtro de algodón para retener el paso de posibles

microorganismos. En el caso del reactor de fermentación, se utilizo una corriente de aire que

fue esterilizada con el vapor que se produjo en la caldera.

Protocolo para esterilización del fermentador Biolaffitte

Abrir todas las válvulas

Conectar la entrada de vapor a la parte inferior del reactor

Permitir el paso de vapor por 30 [min]

Protocolo para esterilización del fermentador piloto

Se conectó el electrodo de pH al reactor, el que estaba previamente calibrado. El electrodo de oxígeno también se conectó, aunque no funcionaba.

Se cerraron todas las válvulas

Se conectó la línea de vapor a la entrada de aire del sistema

Se abrieron las válvulas que permiten el paso del aire hacia el fermentador y se cerró la válvula que conecta la línea de aire con el rotámetro, para evitar daños al mismo

La válvula de descarga del fermentador (al fondo del equipo), se dejó abierta, para permitir evacuación del agua. Luego se dejó semi-abierta la válvula para el retiro del vapor y para permitir el flujo de este durante 15 [min].

Se cerraron las válvulas y la línea de vapor

Se llenó con agua destilada los tubos donde se ubicaban la termocupla y el termómetro

Se conectó la línea de vapor a la salida del toma muestras

Se cerró la válvula que conecta el toma muestra con la vasija de fermentación y se abrieron las dos válvulas pequeñas

Se conectó la línea de vapor al reactor. Cuando comenzó a salir vapor por la salida de aire, se cerró la válvula y se permitió el paso de vapor por 20 [min]. Las válvulas superiores se mantuvieron cerradas, pero si la presión subía a más de 0,5 [bar] se abrieron, para disminuirla.

Se desconectaron las líneas de vapor y se conectó el agua al serpentín

xxix

La esterilización del medio de cultivo se realizó dentro del mismo reactor. Cuando la aguja del manómetro marcaba 1 [barg] se contaron 20 [min] con el fin de asegurar la correcta esterilización del medio.

Para enfriar, se conectó la línea de agua al serpentín

4.2.11 Traslado del medio

El medio para propagación fue esterilizado fuera del reactor, por lo que debió ser incorporado al mismo de forma aséptica.

Bajo mechero, los manipuladores con guantes y mascarillas, se introdujo una manguera previamente esterilizada en el contenedor del medio, se pasó por una bomba peristáltica, y el extremo opuesto se introdujo al reactor por la entrada de medio.

Se encendió la bomba peristáltica y se esperó que se efectuara el traslado, cuidando que la manguera siempre estuviera sumergida en el medio.

Una vez finalizado el proceso, se extrajo la manguera, también cuidando la asepsia del proceso y finalmente se cerró el reactor.

xxx

4.2.12 Manejo de la Caldera

Se conecto la salida de agua desionizada a la manguera amarilla, para proveer a la caldera con agua. Cuando el nivel del agua en el bidón que se encuentra junto a la caldera sea inferior al límite, debe permitirse el paso de agua desionizada para recargarlo.

Posteriormente se revisó el nivel de agua de la caldera. Si es inferior a la marca roja, debe rellenarse con agua desionizada.

Asegurarse de que las 2 válvulas que conectan el estanque con agua desionizada y la caldera estén abiertas.

Encender la bomba que lleva el agua desionizada hacia la caldera.

Verificar constantemente que haya agua en el bidón para alimentar la caldera.

Cuando la cantidad de agua en la caldera sea la apropiada, encender la caldera.

Cuando el vapor acumulado en la línea logre que el barómetro del intercambiador de calor llegue a poco menos de 2 [bar], se puede iniciar la esterilización.

La caldera se debe encender al menos 1 [h] antes de que sea necesaria su utilización.

4.2.13 Lavado del Fermentador Piloto y del Biolaffitte

Para la limpieza del fermentador se procedió a levantar la tapa, habiendo soltado los seguros

previamente y con el equipo de protección adecuado.

Se lavó el interior del estanque con agua y detergente utilizando un cepillo de cerdas largas,

teniendo el cuidado de remover toda la suciedad existente entre el serpentín y la pared del

fermentador. También se procedió a retirar y lavar las válvulas de toma de muestra, de

alimentación y de adición de soda, verificando que la goma que sella herméticamente la

unión al fermentador se encontrara en buenas condiciones y estuviera ubicada

correctamente dentro del canal del borde superior del fermentador piloto.

Para limpiar el difusor de aire, se hizo circular agua a través de válvulas.

El lavado sirvió además para determinar la cantidad de líquido perdida durante la

fermentación piloto, la que correspondió aproximadamente a 20[l].

xxxi

5 Resultados

5.1 Concentración de biomasa en el tiempo para fermentador piloto

De acuerdo a la curva de calibrado descrita en el apéndice A.4 se logró seguir la cinética de

crecimiento de K. marxianus de acuerdo a los valores de concentración de biomasa a través

del tiempo total de fermentación, mostrados en la Tabla A.5. Estos valores se representan

mediante la Figura 5. 5.1

Figura 5.2 Curva de crecimiento de K. marxianus a 38ºC y pH 4.8

De acuerdo a esta figura, se determinó que la fase de latencia en el medio de cultivo a las

condiciones mencionadas duró alrededor de 150 [min]. El inicio de la fase exponencial de

crecimiento de K. marxianus se aprecia con mayor claridad en la Tabla A..

5.2 Concentración de lactosa en el tiempo para fermentador piloto

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 100 200 300 400tiempo [min]

Conc

entr

ació

n Bi

omas

a [g

/l]

xxxii

La curva de calibrado utilizada para medir la concentración de lactosa se encuentra detallada

en el apéndice A.6. De acuerdo a esta se pudo obtener las concentraciones de lactosa en las

muestras del fermentador piloto, las cuales se encuentran detalladas en la Tabla A.7

representados en la Figura 5.3 5.2.

Figura 5.3 Consumo de lactosa en el tiempo por Kluyveromyces marxianus en un medio a 38ºC

y pH de 4,8

5.3 Rendimiento global de biomasa en sustrato

La Tabla 5.3 resume los principales valores de concentración de biomasa obtenidos al inicio

y final de cada fermentación.

Tabla 5.3 Concentraciones de biomasa obtenidas al inicio y final de cada fermentación

Concentración BiomasaInóculo (500 ml)

Inóculo (1,1l)

Fermentador Biolaffite

Fermentador Piloto

Concentración Inicial Estimada [g/l] - - 0,15 1Concentración Inicial Obtenida [g/l] 2,6 - 0,26 1,6(*)

Concentración Final Estimada[g/l] - - 10 11Concentración Final Obtenida [g/l] - 1,4 10 17,3

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 100 200 300 400tiempo [min]

Conc

entr

ació

n La

ctos

a [g

/l]

xxxiii

(*) Este valor difiere del estimado debido a un error durante la medición

De acuerdo a estos datos, y considerando una pérdida de volumen de 20[l], de acuerdo a la

Ecuación 14 se obtuvo un rendimiento de 0,76[g biomasa/g lactosa]. De esto se desprende

que se obtuvo una producción de biomasa de 1570[g] por cada 2027[g] de lactosa durante

los 390 [min] de cultivo en el fermentador piloto. Se alcanzó una concentración de 17,31[g/l]

a partir de tan solo 1,60 [g/l].

xxxiv

5.4 Productividad volumétrica de biomasa

La productividad volumétrica se calculó de acuerdo a la Ecuación 11 11 del Apéndice A.8,

obteniéndose un valor de 3,88[g/l h] en biomasa.

5.5 Velocidad específica de crecimiento

Los puntos utilizados para la determinación de la velocidad específica de crecimiento se

representan en la 5.3 mediante la siguiente gráfica construida por los datos mostrados en la

Tabla A del apéndice A.9

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0 100 200 300 400tiempo [min]

Ln(X

)

Figura 5.4 Curva del crecimiento logarítmico de biomasa v/s tiempo, para la obtención de la

Velocidad Específica de Crecimiento

De esta recta se puede obtener la velocidad de crecimiento específica a través de la

pendiente, que es de 0,0102[min-1] la cual equivale a 0,61[h-1].

5.6 Estimación de rendimientos de oxígeno y biomasa por medio del

balance de la reacción

xxxv

Los rendimientos de oxígeno en biomasa y de biomasa en sustrato se estimaron de acuerdo

a la Ecuación 122 del apéndice A.10. Los valores calculados fueron 0,3 [g célula/ gO2] y de

0,63 [g célula/ g lactosa] respectivamente.

xxxvi

6 Discusiones

Durante la realización de la fermentación se perdió una considerable cantidad de

volumen. En total, aproximadamente 20 [l]. Para determinar el volumen perdido, se marcó

con un plumón el nivel de líquido que se obtuvo al final de la fermentación y, una vez vaciada

la vasija de fermentación, se procedió a llenarla otra vez, pero con agua, hasta el nivel

marcado. De esta forma se determinó que el nivel final dentro del fermentador fue de 100 [l].

Luego, por diferencia, se definió que el volumen de medio de cultivo perdido por efecto de la

excesiva espumación fue de 20 [l]. Debido a esto, el cálculo del rendimiento de lactosa en

células se hizo con los valores iniciales y finales de volumen utilizados durante la

fermentación cálculados mediante la Ecuación 10 10 detallada en el apéndice A.8

La pérdida de volumen se debió a la producción de espuma. Se trabajó con una

aireación de entre 0,6 y 1,2 vvm. La mayoría del tiempo se trabajó con una aireación de 0,8

vvm. Se agregó 12 [ml] de antiespumante siliconado para los 120 [l] de medio de cultivo y 1

[ml] para el fermentador biolaffitte, donde se realizó la propagación de la levadura, previo a la

fermentación.

La cantidad de antiespumante adicionado fue insuficiente para el alto volumen de medio

de cultivo utilizado, en la práctica se utilizó la recomendación de 1 [ml] por cada 10[l]. Sin

embargo, otras fermentaciones similares llegan a usar hasta 3,3[ml] por cada 10[l] (Cori de

Mendoza et al, 2006) cantidad que parece mucho más adecuada a la luz de los resultados

obtenidos en la fermentación piloto, donde debido a la alta agitación (300 [rpm]) y a la alta

aireación (1,19 vvm), se llegó a perder aproximadamente 20[l] de medio de cultivo por el sólo

efecto de espumación.

La gran cantidad de espuma generada pudo haberse debido a la alta concentración de

extracto de levadura agregado al medio de cultivo, puesto que este componente contiene

una gran fracción de proteínas. Las proteínas, por su diversidad de grupos funcionales,

presentan características tensoactivas, situándose en las interfases y dando lugar a

espumas.

xxxvii

La buena cinética de crecimiento del microorganismo hace pensar que la aireación

calculada de forma teórica fue sobreestimada. Esto se apoya sobre el hecho de que el flujo

de aire suministrado al reactor piloto fue disminuido en un 33% desde el teórico calculado

(desde 1,2 vvm a 0,8 vvm) lo que no se vio reflejado en una limitación en el crecimiento de la

levadura. La disminución en el flujo de aire fue motivada por la gran pérdida de medio de

cultivo que estaba provocando la espuma.

El haber trabajado con 120[l] de cultivo en el fermentador piloto dificultó la operación del

mismo debido a la alta aireación a utilizar, lo que llevó a una pérdida de cultivo importante.

Esto puede ser muy perjudicial para una fermentación real por lo que se debe trabajar con un

menor volumen útil dentro del fermentador. En este caso se prefirió el dar una mayor

aireación en desmedró de la pérdida de medio de cultivo para favorecer el crecimiento, lo

que resulto en una buena decisión.

El medio de cultivo fue diseñado inicialmente para una velocidad específica de

crecimiento máxima de 0,3[h-1]. Sin embargo esta velocidad durante la experiencia resulto

ser el doble (0,61 [h-1]) Para definir la biomasa a obtener, se fijó la variable tiempo y la

concentración inicial de la fase de propagación y se calculó que, para esta fase, en 15[h] de

cultivo, se obtendría una concentración celular en el reactor Biolaffitte, de 10,0 [g/l]. Este

valor coincidió con el valor obtenido al final de la fermentación en este reactor. Sin embargo

se esperaba obtener 11,0 [g/l] de concentración celular al final de la fermentación piloto para

un tiempo de fermentación de 480[min], y el resultado final fue de 17,3[g/l] para 390 [min] de

fermentación.

xxxviii

La levadura presentó una alta velocidad específica de crecimiento. A pesar de ser un

evento poco frecuente, se puede encontrar referencias en que se han presentado resultados

similares (velocidad específica de crecimiento de 0,62 [h-1]) utilizando condiciones de

operación más restringidas para el crecimiento. La experiencia a la cual se alude es aquella

realizada por Chinappi y Sánchez (2000). Se cultivó K. marxianus en suero de leche para un

volumen de reacción de 100[l], a pH 4,5, 30°C, 200 rpm y entre 0,25 a 0,5 vvm. (Chinappi y

Sánchez, 2000). La mayor disponibilidad de oxígeno y mejor temperatura para el

crecimiento, apoya la idea de que el resultado obtenido durante la experiencia piloto se

ajusta a los márgenes de la realidad. Esto se justifica en parte al diseño minimalista del

medio de cultivo, el cual fue pensado utilizando condiciones infavorables de crecimiento y

sobredimensionando las cantidades a agregar de cada compuesto en el medio.

Respecto del extracto de levadura, existe evidencia que indica que para el caso de un

fermentador de 100 [l], la adición de extracto de levadura al medio de cultivo aumenta la

producción de biomasa cerca del 50% del valor obtenido en ausencia de este (Chinappi y

Sánchez, 2000). Esto explicaría en parte el rendimiento observado de 0,76 [g biomasa/g

lactosa], dado que el rendimiento esperado era de 0,5 [g biomasa/g lactosa] o mayor. Otras

referencias indican que el rendimiento de lactosa en levaduras puede ser encontrado entre

50 a 57% y que puede ser mejorado agregando al medio de cultivo suplemento con extracto

de levadura de 0,2 al 5% en peso del medio de cultivo (El-Hawary & Mehanna, 1991).

En la determinación de la curva de consumo de sustrato, se tuvieron varios fallos en la

medición de la concentración de lactosa en la muestra. Esto puede deberse a un error en el

protocolo de obtención de la muestra libre de biomasa, ya que se observó en las muestras

más concentradas (más cercanas al final de la fermentación) que una sola centrifugación no

era suficiente para remover toda la biomasa en el sobrenadante de la muestra, requiriéndose

hacer la separación de fases al menos dos veces.

xxxix

Respecto a la curva de calibrado de biomasa, se tiene que la pendiente de ésta posee

variaciones significativas frente a otras curvas de calibrado para el mismo microorganismo.

Sin embargo las experiencias se realizaron a distintas longitudes de onda (650 [nm] versus

620[nm]) y se le realizó un duplicado a la curva de calibrado de biomasa, por lo que no hubo

un error en la metodología significativo (datos en apéndice A.4). Sin embargo al utilizar la

curva a 650[nm] se obtiene al final de la fermentación piloto una concentración celular

cercana a 11[g/l], que fue la que inicialmente se estimó. Esto hace pensar que la longitud de

onda elegida y utilizada durante esta experiencia no fue la óptima para la detección de

biomasa. Tal vez habría sido conveniente realizar un paneo en un rango de longitudes de

onda para determinar la que mejor se ajustaba a la experiencia.

Con los datos de biomasa y lactosa obtenidos en el laboratorio, se procedió a realizar un

balance de masa estequiométrico de la fermentación mostrado en detalle en el apéndice

A.10, utilizando la fórmula empírica de K. marxianus propuesta por Krzystek y Ledakowicz

(2000). El resultado obtenido de rendimiento de lactosa en célula es similar al calculado por

el balance de masa (0,76[g/g] versus 0,63[g/g] respectivamente).

Respecto del estudio del rendimiento de oxígeno en célula, se puede decir que este

sirve para poder calcular la cantidad de litros de aire por minuto que hay que alimentar al

fermentador. Sin embargo el valor de oxígeno disuelto no fue obtenido por falta de un equipo

de medición en buen estado. A pesar de lo anterior, este valor fue estimado a partir de los

datos obtenidos durante el laboratorio y calculado a través del balance de la reacción de

formación de biomasa del apéndice A.10. El resultado fue un rendimiento de oxígeno (YO2)

de 0,3 [g.célula/ gO2], el cual es menor al valor pronosticado y propuesto en el preinforme

cuyo valor fue obtenido por la ecuación de Mateles (el cual era de 0,81 [g célula/ gO 2]). A

pesar de que este valor es menor y por tanto el flujo de aire debería ser mayor, no hubo una

limitación por oxígeno. Hay que considerar que Mateles propone una ecuación para

bacterias y levaduras muy generalizadas para distintos tipos de sustratos, por lo que es

solamente una aproximación al valor real y no se ajusta de forma exacta a especies y

variedades particulares.

xl

La diferencia de concentración observada entre el inóculo y el inicio de la fermentación,

se debió a un error experimental. La concentración final del reactor biolaffitte, se midió a 650

[nm] y no a 620 [nm]. Longitud de onda a la cual se construyó la curva de calibrado. Como el

inóculo tenía un volumen del 10% del volumen de fermentación, y éste presentó una

concentración de 1,6 [g/l] al inicio, se puede estimar la concentración final del inóculo en 16

[g/l]. Otra razón puede ser el que la muestra obtenida al final de la fermentación dentro del

fermentador biolaffitte no estuviera lo suficientemente homogénea, debido a la detención de

la agitación antes del muestreo, explicando así el aumento de concentración inicial en el

fermentador piloto. El valor de 1,6[g/l] además concuerda con las siguientes tres muestras

obtenidas durante la fase de latencia de la cinética de crecimiento mostrada en la tabla A.5

del apéndice A.5.

Respecto a la curva de calibrado de biomasa, se tiene que la pendiente de esta posee

variaciones significativas frente a otras curvas de calibrado para el mismo microorganismo

(datos no mostrados). Sin embargo las experiencias se realizaron a distintas longitudes de

onda (650 [nm] versus 620[nm]) y se le realizó un duplicado a la curva de calibrado de

biomasa, por lo que no hubo un error en la metodología significativo (datos en apéndice A.5).

Al comparar los valores obtenidos al utilizar la curva a 650[nm] se obtiene al final de la

fermentación piloto una concentración celular cercana a 11[g/l], la cual es mucho más

cercana a la que inicialmente se estimo. Esto hace pensar que la longitud de onda elegida y

utilizada durante esta experiencia no fue la óptima para la detección de biomasa.

xli

7 Conclusiones

El ensayo con las condiciones de 38ºC a un pH de 4,8 resultó ser adecuado para el cultivo y

producción de biomasa de Kluyveromyces marxianus, confirmándose esto por los excelentes

parámetros cinéticos observados (velocidad de crecimiento especifico de 0,61[h -1] y un

rendimiento de sustrato en célula de 0,76[g biomasa/g lactosa]).

Se requiere de un nuevo estudio de la cinética de crecimiento de K. marxianus a la longitud

de onda de 650[nm] con el fin de corroborar los datos obtenidos en el presente laboratorio.

42

8 Referencias

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44

A Apéndices

A.1 Diseño del medio de cultivo

La Tabla A 1 1 muestra los datos requeridos para la determinación de los rendimientos

teóricos de sustrato en célula, que luego fueron utilizados para el diseño del medio de

cultivo.

Tabla A 1 Información utilizada para estimar los rendimientos teóricos de los diversos nutrientes en célula

ElementoCompuesto

fuente

% del elemento en célula [g/g]

% del elemento en el

compuesto fuente [g/g]

PM Fuente [g/gmol]

Rendimiento de compuesto en célula teórico

[g/g]

Carbono Lactosa 48 42,1 342 0,53

NitrógenoSulfato de

amonio7,5 21,2 132 2,8

MagnesioSulfato de Magnesio

0,3 9,8 246 32,7

PotasioFosfato de

Potasio diácido

2,5 28,7 136 11,5

HierroSulfato de

Hierro1,7 20,1 277,9 11,8

CalcioCloruro de

Calcio0,2 36,1 111 180,6

Vitaminas

Extracto de Levadura

- - - 0,985

45

Para calcular el porcentaje de elemento en el compuesto fuente, presentado en la columna 4

de la Tabla A 1 se realiza el siguiente cálculo.

% elemento encompuesto=NAC∗PM

PMC

Ecuación 9Donde:

NAC : Número de átomos del elemento en el compuesto

PMC : PM del compuesto fuente del elemento, [g/mol]

PM: Peso molecular del elemento de interés, [g/mol]

Los cálculos se desarrollaran de la siguiente manera:

%C=12∗12342

=0,42

El rendimiento teórico para cada nutriente en célula fue determinado utilizando la expresión

indicada en la Ecuación 7 de revisión bibliográfica y los resultados se presentan en la

columna 6 de la Tabla A 1.

El rendimiento de la fuente de carbono se calcula como sigue:

Y XS

=42,1%48 %

∗0,6=0,53[ gg ]Se utilizó el factor de 0,6 extraído de Acevedo (2002) debido al carácter aerobio de la

fermentación.

Para el caso de los demás rendimientos se omite el factor f, quedando en el caso del sulfato

de amonio:

Y XS

=21,2 %7,5 %

=2,83[ gg ]

46

A.2Adición de extracto de levadura

A partir de información recopilada (El-Hawary y Mehanna, 1991; Kallel-Mhiri et al., 1994) el

utilizar una cantidad de extracto de levadura entre 0,1% a 5% permite un incremento del

rendimiento de lactosa en biomasa, el cual es del orden del 50% a 57% (Moresi et al., 1980).

Para no utilizar sugerencias empíricas, se procedió a determinar el requerimiento de extracto

de levadura a partir de las necesidades de vitaminas que presenta K. marxianus y el

contenido de esas mismas vitaminas en el extracto de levadura.

Simplemente, se procedió a comparar el requerimiento y la disponibilidad y a calcular una

concentración de extracto que las supliera. En la Tabla A 2 se indica la comparación en base

a las vitaminas requeridas para el crecimiento de la levadura (Zabriskie. D., 1980).

Tabla A 2 Determinación del requerimiento de extracto de levadura para satisfacer la demanda de algunas vitaminas

Vitaminas (µg/g):

Contenido de nutrientes en el extracto [ug/g]

(a)

Requerimiento mínimo de

nutrientes [ug/g](b)

Requerimiento máximo de

nutrientes [ug/g]

Requerimiento mínimo de

extracto por g de levadura [g

ext/g lev]

Requerimiento máximo de extracto por g de levadura [g

ext/g lev]

Tiamina 9 29 90 3,2 10,0Niacina 200 190 585 1,0 2,9

Ac. Pantoténic

o180 118 198 0,7 1,1

Ac. Fólico 15 19 35 1,3 2,3Biotina 0,5 0,5 1,8 1,0 3,6Inositol 4000 4320 1,1 -

47

(a) Cook, A. 1958. The Chemistry and Biology of Yeasts. In: Aspects of the Chemical Composition of Yeast. First Edition p.163. New York. Academic Press Inc.

(b) Zabriskie, D. 1980. Trader’s Guide To Fermentation Media Formulation. In: The Vitamin Content of Some Industrial Culture Medium Constituents p.23. Texas, USA. Trader’s Protein Division.

En la tercera y cuarta columnas se indican valores mínimos y máximos de concentración de

cada vitamina recomendados para obtener un buen crecimiento celular (Cook. A., 1958). En

base a éstos, las columnas 5 y 6 presentan la cantidad de extracto de levadura por g de

levadura producida mínima y máxima que se requeriría agregar para satisfacer el rango.

Para mayor claridad, se expone el siguiente ejemplo de cálculo para el Ácido Pantoténico.

Contenido de ácido pantoténico en 1[g] de extracto de levadura: 180[µg]

Requerimiento mínimo recomendado para obtener un buen crecimiento de la levadura: 118

[µg/g]

Requerimiento máximo recomendado para obtener un buen crecimiento de la levadura: 198

[µg/g]

Crecimiento esperado de la levadura: 11 [g/l]

Entonces, el requerimiento de ácido pantoténico que presentará el cultivo es:

P=11 [g /l ]⋅0 ,118 [mg / l ]

1 [ g/ l ]=1 . 298 [mg / l ]

Conociendo el contenido del ácido pantoténico en el extracto de levadura, para poder suplir

esto se requiere,

E=1 [g / l ]⋅1. 298 [mg / l ]

0 ,180 [mg / l ]=7 ,21 [g /l ]

Donde E es la concentración de extracto de levadura requerida.

48

Para determinar el requerimiento de extracto de levadura por g de levadura producida, se

realizó el cuociente entre la concentración de extracto requerida y la concentración de

levadura que se estimaba obtener. Así, se estima el rendimiento de extracto de levadura en

biomasa.

R=7 ,21 [g /l ]11 [g /l ]

=0,7 [ g extractog levadura ]

Realizando este cálculo para todos los nutrientes explicitados en la tabla, se obtienen los

valores de las columnas 5 y 6. Para determinar la concentración de extracto de levadura a

agregar al medio de cultivo, se tomó en consideración los valores de la columna 5. Se

promediaron los requerimientos mínimos (a excepción del referido a la tiamina) y se obtuvo

un valor cercano a 1 [g de extracto/g levadura], razón por la cual se utilizó este valor para

estimar la concentración de extracto.

Para mayor claridad, se explicita la operación realizada:

Promedio=1 [ g/ g ]+0 .7 [g /g ]+1 . 3 [g /g ]+1 [g /g ]+1,1 [ g/ g ]

5=0 ,99[ g extracto

g levadura ]

49

A.3Preparación del tampón citrato

Debido a la acidificación del medio dada por la liberación de protones en el consumo de la

fuente de nitrógeno, es necesaria la regulación del pH del sistema a través de toda la

fermentación. La reacción se explicita a continuación:

NH 4+¿❑

→

NH3+H +¿ ¿¿

Para la fase de propagación, se requirió mantener el pH del medio en torno a 4,8 + 0,4, para

lo cual se utilizó tampón citrato, que se compone de:

Solución A: Ácido clorhídrico (HCl) 0,1 [N].

Solución B: Citrato disódico 0,1 [M] (correspondientes a 21 gramos de acido cítrico

monohidratado disuelto en 200 [ml] de NaOH 1 N aforado a 1 [l])

De la tabla buffer solutions (Diem E., 1962) se obtiene que el volumen a agregar de solución

A y B serán respectivamente de 11.8 [ml] y de 88.2 [ml].

Para considerar la fuerza iónica se procederá de la siguiente manera:

Solució nBSolució n A

=88.2[ml]11.8[ml ]

=7.48

Despejando en función de solución A, tenemos:

[Solución B]=7.48 [Solució n A ]

Considerando que la base neutralizará la cantidad de protones liberados, se tiene que:

[Solución B]= 0.05 M

Luego, por simple regla de 3 se obtiene que:

X=[Solució n A ]∗0.057.48∗[Solución A ]

=0.007[moll ]

50

Siendo X=[Solució n A ] en [mol/l]

Ahora para el cálculo de la preparación del citrato disódico se procedió a calcular la

concentración necesaria en [g/l] multiplicando por el peso molecular de acuerdo a:

[C6H 6 Na2O7 ]=0.05[moll ]∗236 [ gmol ]=11.8 [ gl ]

La Tabla A.3 muestra las cantidades a agregar de los reactivos para la preparación del

citrato disodico.

Tabla A.3 Preparación de la solución B

Concentración Estándar (aforado a 1 [l]) Concentración a utilizar (aforado a 1 [l])0.1 M 0.05 M

21 [g] acido cítrico 10.5[g] acido cítrico200 [ml] 1 [N] de NaOH 100 [ml] 1 [N] de NaOH

51

Para el caso del NaOH se preparo la solución de 1[N] de la siguiente manera:

NaOH [gmol ]=100 [ml ]∗1

[gmol ][l ]

∗[l ]

1000 [ml ]=0.1 [gmol ]

Para obtener la masa en gramos que necesitamos de NaOH, se procedió a multiplicar los

moles ya obtenidos por el peso molecular del NaOH que es 40 [g/gmol], por lo cual tenemos:

NaOH [g ]=100 [ml ]∗1

[ gmol ][l ]

∗[ l ]

1000 [ml ]∗40

[g ][gmol ]

=4 [ g ]

Para el caso del ácido clorhídrico se tiene:

[H Cl ]=0.007[moll ]∗36.45[ gmol ]=0.26 [ gl ]

Ahora bien, el ácido clorhídrico que se utilizó poseía una concentración de 37% p/p

[ HCl ]ensolucion=0.26 [ gHCl

l ]0.37 [ gHCl

gsoluc ]=0.7[ gsoluc

l ]

52

Como el medio de propagación fueron 12 litros, se tiene:

masa HCl=0.7 [ gl ]∗12 [l ]=8.5 [g]

La densidad de la solución del ácido clorhídrico al 37%p/p es de 1190[ gl ], con lo cual se

obtiene el volumen de ácido clorhídrico a utilizar:

volumenHCl=8.5[ g]

1190[ gl ]=0.29 [l ]=0.007 [ml ]=7 [ml ]

53

A.4 Construcción de la curva de calibrado de biomasa

Para la cuantificación de la biomasa en el reactor, primero se procedió a realizar la

construcción de la curva de calibrado para la biomasa, cuya absorbancia fue medida a 620

[nm]. Esta curva de calibrado se puede observar en la 1, la cual se obtuvo a través de los

datos de la Tabla A 4.

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300Concentración Biomasa [g/l]

Abs

orba

ncia

Figura A. 1 Curva patrón de calibrado de biomasa

La Tabla A4 detalla los valores obtenidos para la construcción de la curva de calibrado para

biomasa, indicándose el factor de dilución utilizado y la correspondiente absorbancia medida.

Tabla A.4 Datos para la curva de calibrado de la biomasa

FDConcentració

n [g/l]Absorbancia

Absorbancia Duplicado

Absorbancia

Promedio10 0,260 0,539 0,531 0,53515 0,173 0,383 0,370 0,37720 0,130 0,283 0,271 0,27730 0,087 0,162 0,179 0,17140 0,065 0,146 0,135 0,141- 0,000 0,000 0,000 0,000

54

Cabe señalar que para la construcción de la curva de calibrado se utilizó el valor promedio

de las absorbancias. La concentración de la muestra inicial, determinada por peso seco, fue

de 2,6[g/l], lo que se muestra en la Tabla A.

De este análisis tras la regresión lineal se obtuvo la siguiente recta, poseyendo un valor de

correlación r² = 0,9976:

A=2,0722∗c+0,0054

En donde:

A : Absorbancia

c : Concentración de células, [g/l]

55

A.5 Aumento de biomasa durante la fermentación piloto

En la Tabla A.5 se detallan los resultados del muestreo realizado cada 30 [min] en el

fermentador piloto para la determinación de la concentración celular [g/l].

Tabla A.5 Datos para la obtención de la curva de crecimiento de la biomasa a 38ºC, pH 4.8 limitado por lactosa como fuente de carbono

Tiempo [min] Absorbancia FD Concentración [g/l]0 0,334 10 1,59

30 0,334 10 1,5960 0,336 10 1,690 0,396 10 1,88

120 0,424 10 2,02150 0,283 20 2,68180 0,395 20 3,76210 0,493 20 4,71240 0,534 25 6,38270 0,345 60 9,83300 0,264 100 12,48330 0,303 100 14,36360 0,329 100 15,62390 0,364 100 17,31

56

A.6 Datos utilizados para la construcción de la curva de calibrado de

consumo de sustrato

En la Tabla A..6 se detallan los valores obtenidos en la construcción de la curva de calibrado

para la determinación de lactosa, indicándose el factor de dilución utilizado y la

correspondiente absorbancia medida.

Tabla A.6 Datos para la curva de Calibrado DNSFD Concentración Absorbancia

1,000 1,500 0,6152,000 0,750 0,2823,000 0,500 0,1954,000 0,375 0,1585,000 0,300 0,1086,000 0,250 0,0997,000 0,214 0,0708,000 0,188 0,065

- 0,000 0,000

57

Respecto a la concentración de sustrato, se procedió a la realización de una curva de

calibrado como patrón para la obtención de la concentración de lactosa en las muestras. La

Figura A. 2 2 muestra la curva patrón obtenida.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Concentración lactosa [g/l]

Abs

orba

ncia

Figura A. 2 Curva patrón de Calibrado de DNS

Luego de este análisis tras la regresión lineal se obtuvo la siguiente recta, poseyendo un

valor de correlación r² = 0,9972:

A=0,4113∗c−0,0094

Donde

A : Absorbancia

c : Concentración de lactosa, [g/l]

58

A.7 Medición de sustrato realizada durante la fermentación piloto

Se muestran en la Tabla A la totalidad de los resultados obtenidos por medio del método del

DNS para la medición de azúcares reductores, en este caso lactosa.

Tabla A.7 Datos para la obtención de la curva de consumo de azúcar obtenida por el método DNS

Tiempo [min]

Absorbancia FDConcentració

n [g/l]0 0,312 22 17,19

30 0,272 22 15,0560 0,284 22 15,6990 0,145 20 7,51

120 0,139 20 7,22150 0,102 20 5,42180 0,23 10 5,82210 0,433 5 5,38240 0,37 5 4,61270 0,454 3 3,38300 0,254 3 1,92330 0,063 3 0,53360 0,055 2 0,31390 0,139 1 0,36

59

A.8 Cálculo de rendimiento de sustrato en biomasa y productividad

volumétrica

Para el cálculo de rendimiento global de biomasa en sustrato, y en el caso específico en que

el sistema posea un cambio de volumen significativo, se utiliza la Ecuación 10 10

Ecuación 10

En donde, YX/S es el rendimiento, X es la concentración de células, S es la concentración de

sustrato y los subíndices i y f se refieren a las condiciones iniciales y finales

respectivamente.

De esta forma se procedió a calcular el rendimiento de biomasa en lactosa, considerando la

pérdida de volumen de 20 [l], obteniendo:

Y XS

= 17,3∗100−1,61∗12017,19∗120−0,36∗100

=0,76 [ gg ]La productividad volumétrica se cálculo de acuerdo a la Ecuación 11 para cultivo por lotes

QX=X−X0

1μ∗ln( X

X0¿¿)

Ecuación 11

Como esta fórmula no considera que el volumen varía a lo largo de la fermentación, se

calcularon las masas finales e iniciales de biomasa producidas y se tomo como volumen

promedio 110[l], así se obtiene:

60

M fX=17,3∗100=1730 [g ];X '=1730110

=15,7 [ gl ] M iX=1,6∗120=192 [g ];X ' 0=

192110

=1,75 [ gl ]Con estos valores promedio y reemplazando en la Ecuación 11 se obtiene:

QX=15,7−1,751

0,61∗ln( 15,7

1,75 )=3,88 [ g

l∗h ]

61

A.9Datos utilizados para el cálculo de la velocidad específica de

crecimiento

La Tabla A.9 muestra los datos utilizados para el cálculo de la velocidad específica de

crecimiento de K. marxianus correspondientes a la zona de crecimiento exponencial. La zona

de crecimiento exponencial se definió como aquella en la cual la relación entre el logaritmo

natural de la concentración de células (Ln(X)) y el tiempo diera la mejor línea recta. Es decir,

con un factor de correlación r2 mayor.

Tabla A.9 Datos utilizados para la determinación de la velocidad especifica de crecimiento

Tiempo [min] Concentración [g/l] Ln (X)120 2,02 0,703150 2,68 0,986180 3,76 1,324210 4,71 1,549240 6,38 1,853270 9,83 2,286300 12,48 2,524

A partir de estos datos, aplicando una regresión lineal se obtuvo la siguiente recta,

poseyendo un valor de correlación r² = 0,9954. La recta resultó ser:

ln (X )=0,0102∗t−0,5444

En donde:

X: Concentración de biomasa [g/l]

t: Tiempo [min]

62

A.10Balances de la reacción de formación de biomasa para obtener el

rendimiento de oxígeno

De acuerdo a la Ecuación 12, extraída de Acevedo (2002), se puede modelar el mecanismo

de consumo de sustrato y oxígeno para K. marxianus:

A (C12H22O11)+B (NH 3 )+C (O2 )→D (CH 1,63O0 ,54 N0 ,16)+E (CO 2 )+F (H 2O )

Ecuación 12

Realizando el balance de materia para cada elemento, se obtienen las siguientes 4

ecuaciones:

C : 12 A=D+EH : 22 A+3B=1 ,63 D+2 FO : 11A+2C=0 ,54 D+2E+FN : B=0 ,16 D

Calculando hasta el tiempo 330 [min], debido al agotamiento de la solución de hidróxido de

sodio en el cultivo del fermentador piloto, tenemos que, dado a la reacción:

NaOH Na+¿+OH−¿¿¿

Se tiene que se consumen 2 [l] de NaOH a 4[N] (o 4[M]), obteniéndose:

NaOH [gmol ]=2 [l ]∗4[gmol]

[l ]=8[gmol ]

Por lo cual la cantidad de OH liberados al medio de cultivo corresponde a 8 [gmol].

Considerando:

NH 4+¿NH3+H

+¿¿¿

Como un mol de OH- neutraliza un mol de H+, se tiene que los moles producidos de H+

corresponden a 8 moles. Por la estequiometría de la reacción anterior, se observa que los

moles de NH3 en el medio son 8 moles (B=8).

63

Para calcular la concentración de células que se tiene a los 330 [min] de iniciado el cultivo,

se utilizan los datos presentados en la Tabla A. y se operan mediante laError: Reference

source not found 13.

Biomasa=(X ∙V−X0 ∙V 0)

PM C

Ecuación 13

Donde:

X : Concentración de células al tiempo 300 minutos [g/l]

V : Volumen al tiempo 330 minutos

X 0: Concentración de células al tiempo 0 (tiempo de inoculación) [g/l]

V 0: Volumen al tiempo 0 [l]

PM 0: Peso molecular de la célula [g/gmol]

El peso molecular de la célula (PM) se obtiene a partir de (Krzystek and Ledakowicz, 2000) y

es 24,53 [g/mol]

Reemplazando en ecuación 2, tenemos:

Biomasa=(14.36 ∙100−1.56 ∙120)

24.5=51[g .mol ]

Por lo tanto D es igual a 51 moles. Por otro lado, se puede obtener D despejando de la

relación del balance de elementos para el N (NH3).

B=0 ,16D

Reemplazando, tenemos:

D= 80 ,16

=50 [ gmol ]

Con lo anterior, se confirma que la biomasa obtenida a través de la medición es

prácticamente la misma que se obtiene con la relación de consumo de NaOH.

64

Para calcular la concentración de lactosa que tenemos en los 330 [min] del tiempo de cultivo,

mediante la Ecuación 14 y recurriendo a los datos entregados por las mediciones, estimando

la pérdida de volumen debido a espumación en 20[l] para tal tiempo:

Lactosa=(S0 ∙V 0−S ∙V )

PM S

Ecuación 14

Donde:

S: Concentración de lactosa al tiempo 300 minutos [g/l]

V : Volumen al tiempo 330 minutos [l]

S0: Concentración de lactosa al tiempo 0 (tiempo de inoculación) [g/l]

V 0: Volumen al tiempo 0 [l]

PM S: Peso molecular de la lactosa (132 g/gmol)

Reemplazando en la ecuación 14, tenemos:

Lactosa=(17.19 ∙120−0.53 ∙100)

132=15[gmol ]

Por lo tanto A=15 moles.

Ahora bien, reemplazando en los balances a los elementos que se desprenden de la

ecuación 1, tenemos:

C :12∗15=51+E E=129[ gmol] . H :22∗15+3∗8=1.63∗51+2 F F=135,5[ gmol] .0 :11∗15+2C=0.54∗51+2E+F C=128[ gmol] .

Reemplazando en la Ecuación 12 12, tenemos:

15 (C12H22O11)+8 (NH 3 )+128 (O2 )→51 (CH 1,63O0 ,54 N0 ,16)+129 (CO2 )+135 .5 (H2O )

Ahora se puede calcular el rendimiento de oxigeno según:

65

Y 02=( 128 [gmol ]∗32

[ g ][ gmol ]

51 [ gmol ]∗24.5[ g ]

[ gmol ])−1

=0,3[ gcélula]

[gO2]

Calculando el rendimiento de lactosa en célula, se obtiene:

Y xs

=51 [gmol ]∗24.5

[g ][gmol ]

15 [ gmol ]∗132[g ]

[gmol ]

=0.63[ gcé lula ][glactosa ]

Valor que es muy similar al obtenido con los cálculos gráficos, lo que valida los cálculos

obtenidos experimentalmente.