PONTIFICA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOPROCESOS

Laboratorio 2 - Informe

Curso: IIQ3682 Sección 1 “Biotecnología Microbiana”

Profesor: Eduardo Agosín

Ayudantes: Benjamín Sánchez, Daniela Soto

Phammela Abarzúa I.

Guillermo Gutierrez H.

Pradyumna Sepulveda D.

Miércoles 20 de Junio, 2012

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Indice Resumen .............................................................................................................................................. 5

Introducción ........................................................................................................................................ 6

Objetivos ............................................................................................................................................. 6

Fundamentos Teóricos ........................................................................................................................ 7

Cultivo batch ................................................................................................................................... 8

Cultivo Continuo .............................................................................................................................. 9

Cultivo Fedbatch ............................................................................................................................. 9

Metodología ...................................................................................................................................... 11

Seguridad....................................................................................................................................... 11

Obtener volumen se desecho y volumen de muestra .................................................................. 11

Medición de peso seco .................................................................................................................. 11

Centrifugación ............................................................................................................................... 12

HPLC .............................................................................................................................................. 12

Espectrofotometría ....................................................................................................................... 12

Resultados ......................................................................................................................................... 13

Cultivo Batch ................................................................................................................................. 14

Cultivo Continuo (Quimiostato) .................................................................................................... 17

Cultivo Fed-batch .......................................................................................................................... 21

Discusión ........................................................................................................................................... 26

Cultivo continuo ............................................................................................................................ 26

Cultivo fed-batch ........................................................................................................................... 28

Cultivo Batch ................................................................................................................................. 29

Conclusiones y Recomendaciones .................................................................................................... 31

Nomenclatura.................................................................................................................................... 32

Bibliografía ........................................................................................................................................ 33

Anexos ............................................................................................................................................... 34

3

Indice de Tablas Tabla 1 ............................................................................................................................................... 12

Tabla 2 ............................................................................................................................................... 13

Tabla 3 ................................................................................................ 1¡Error! Marcador no definido.

Tabla 4 ................................................................................................ 1¡Error! Marcador no definido.

Tabla 5 ............................................................................................................................................... 17

Tabla 6 ................................................................................................ 1¡Error! Marcador no definido.

Tabla 7 ............................................................................................................................................... 19

Tabla 8 ............................................................................................................................................... 20

Tabla 9 ............................................................................................................................................... 22

Tabla 10 ............................................................................................................................................. 23

4

Indice de Figuras Figura 1 ................................................................................................................................................ 7

Figura 2 ................................................................................................................................................ 7

Figura 3 .............................................................................................................................................. 13

Figura 4 .............................................................................................................................................. 14

Figura 5 .............................................................................................................................................. 15

Figura 6 .............................................................................................................................................. 16

Figura 7 .............................................................................................................................................. 16

Figura 8 .............................................................................................................................................. 17

Figura 9 .............................................................................................................................................. 18

Figura 10 ............................................................................................................................................ 18

Figura 11 ............................................................................................................................................ 19

Figura 12 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 13 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 14 ............................................................................................................................................ 21

Figura 15 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 16 ............................................................................................................................................ 23

Figura 17 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 18 ............................................................................................................................................ 26

Figura 19 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

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Resumen Este laboratorio consistió en realizar análisis sobre las muestras tomadas a los tres tipos de cultivos disponibles (quimiostato, batch y fed batch), los análisis se realizaron en base a las herramientas de cálculo y balances entregadas en el curso biotecnología microbiana. Así, de los diferentes cultivos se tomaban cada treinta minutos muestras de aproximadamente 5mL para los cultivos batch y fed batch y 7mL para el cutivo continuo de las cuales se medía absorbancia a 600nm (valor que mediante un ajuste lineal nos entregaría la biomasa), y se guardaba el sobrenadante de su centrifugado (3600 rpm por 5 minutos) para posteriormente sería sometido a un HPLC entregándonos las concentraciones de glucosa y acetato. Para llevar a cabo el análisis de los datos entregados por el muestreo nos servimos principalmente de balances de masa y la ecuación de Monod. Ecuaciones mediante las cuales fue posible calcular datos como coeficiente de mantención, μ máximo y Ysx° entre otros. En el cultivo continuo se observo una lavado completo del sistema para una dilución de 0.6 1/hr. Para el cultivo fed-batch tenemos que se realiza una etapa previa de crecimiento de un cultivo batch normal. Por lo tanto, para todos los cálculos de parámetros y coeficientes se tomó como tiempo cero T= 7,7 horas. La diferencia entre batch y fed-batch es que el segundo tiene una entrada de alimentación con sustrato limitante, glucosa. En este caso el flujo que ingresa se calcula según ecuaciones que dependen de (XV)0 al inicio del fed-batch y parámetros de rendimiento, tasa de crecimiento y sustrato en alimentación fijas. De hecho, el cultivo por lotes alimentados permite mantener un crecimiento a una tasa seteada ( =0, 3 para este caso). El flujo Fin presenta un aumento en su magnitud con el tiempo, pues debe alimentar con suficiente sustrato limitante a un volumen creciente de biomasa. Se calculó el experimental al realizar un gráfico Ln (XV)t vs. Tiempo (hr.), ya que la pendiente de la recta que ajusta para el grupo de datos corresponde a este valor. Se encontró que , menor que lo previsto. Posibles causas de este crecimiento “restringido” se discuten en la sección correspondiente.

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Introducción Un cultivo es un método para la multiplicación de microorganismos. En biotecnología se han desarrollado distintos tipos de cultivo para maximizar distintos componentes tales como biomasa o un cierto producto. Los 3 tipos de cultivos más utilizados para optimizar el crecimiento de microorganismos son batch, fed-batch y continuo.

En un cultivo batch, no hay flujos de entrada ni salida. Todos los componentes del sistema se ingresan el sistema el principio del proceso. El sistema se deja funcionando solo hasta que los el sustrato limitante y/u otros nutrientes se van limitando u se producen productos inhibitorios tal como acetato. En un cultivo fed-batch hay flujo de entrada pero no hay flujo de salida. Por esta razón el volumen va aumentando continuamente en el tiempo. En un cultivo continuo hay un flujo de entrada y un flujo de salida. Al ser ambos flujos iguales, el volumen se mantiene constante. Además, el cultivo opera en fase estacionaria, es decir, no hay acumulación de producto, biomasa ni sustrato. Por ende, las variables del proceso son constantes. En este laboratorio se analizaron los 3 tipos de cultivo para poder compararlos y entender cómo se diferencian. También, con las mediciones tomadas y utilizando las ecuaciones de balance de masa se podrá construir modelos para poder explicar y predecir el comportamiento de los componentes en los cultivos.

Objetivos

1. Tomar sistemáticamente mediciones a cultivos batch, fed batch y continuo (quimiostato) de Escherichia coli para posteriormente analizarlas y asì familiarizarse y comprender a cabalidad el funcionamiento de estos tres tipos de cultivo.

2. Poder construir un modelo que describa el comportamiento de los cultivos y comparar los valores teóricos del modelo con los datos experimentales.

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Fundamentos Teóricos

Para los distintos cálculos de concentración y los parámetros de cultivos, utilizamos las ecuaciones de balance de materia para cada tipo de cultivo. La ecuación general de balance es:

La ecuación general para el sustrato es:

Con: S (t): concentración de sustrato dado en un tiempo t: tiempo (hr) Ff = flujo de alimentación (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) Sf = concentración de sustrato en el flujo de alimentación (g/L) V= volumen (L) qS=tasa volumétrica de generación de sustrato La ecuación general para la biomasa es:

Con: X (t): concentración de sustrato dado en un tiempo t: tiempo (hr) Ff = flujo de alimentación (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) Xf = concentración de sustrato en el flujo de alimentación (g/L) V= volumen (L) qX=tasa volumétrica de generación de biomasa Para describir la tasa de crecimiento de la biomasa utilizamos la ecuación de Monod. Esta es un modelo de cinética simple. Su ecuación esta dado por:

Con, μ: tasa de crecimiento celular (1/hr) μ max: tasa de crecimiento celular máxima (1/hr) Ks : medida inversa de la afinidad entre el microorganismo y el sustrato limitante (También se

describe como el valor de S(t) cuando

)

Si se reordena la ecuación de Monod se llega a la siguiente expresión:

8

Esta expresión corresponde a la ecuación de una recta como se observa en la Figura 1.

Figura 1 – Grafico de la ecuación de Monod

Cultivo batch En un cultivo batch, no hay flujo de entrada ni salida. Solo hay términos de acumulación y generación y/o consumo. Luego desde el balance de biomasa se tiene:

Para obtener μ, se integra ambos lados de la ecuación anterior obteniendo:

Con X0 = concentración inicial de biomasa (g/L). Para obtener μmax (la tasa de crecimiento celular máxima) se usa la zona fase de crecimiento exponencial donde la pendiente de la curva es mayor (Fig. b) La pendiente de esta zona es μmax.

Figura 2 – Fases de un cultivo batch.

Cuando interesa maximizar el crecimiento de un microorganismo, se asume que el sustrato no se utiliza para formar producto, sino que solamente se usa para el crecimiento y el mantenimiento de la célula. Luego la ecuación de balance para el sustrato queda:

9

Con, m = coeficiente de mantenimiento celular

YSX = rendimiento de sustrato para producir biomasa (g/g) =

Igual que la ecuación de Monod, la ecuación de sustrato se puede reordenar para que represente una recta

Cultivo Continuo En un cultivo continuo hay flujos de entrada y salida. También se opera en fase estacionaria. Por lo tanto, las ecuaciones de balance no van a tener un término de acumulación y el volumen del reactor va a ser constante. Además, la alimentación es estéril, es decir no tiene biomasa. Entonces, la ecuación de balance para la biomasa queda:

Como F/V es lo mismo de la tasa de dilución D, entonces la ecuación queda:

Con D: tasa de dilución (1/hr) La ecuación para el sustrato queda:

Con la ecuación anterior y reemplazando la condición D=μ se puede obtener una expresión para X(t):

Específicamente en este laboratorio vamos a trabajar con un quimiostato, lo cual es un cultivo continuo donde todos los parámetros se mantienen constante, menos la alimentación de sustrato para así maximizar la producción de biomasa.

Cultivo Fedbatch El cultivo fedbatch tiene 2 etapas. La primera etapa se parece a un cultivo batch y la segunda es un cultivo fedbatch. En un cultivo fedbatch hay un flujo de entrada pero no de salida. Luego la ecuación de balance tiene términos de acumulación, entrada y consumo y/o generación. Ademas se asume que el flujo de alimentación no tiene biomasa. Luego, el balance de biomasa queda:

Integrando la ecuación, se tiene:

10

La ecuación para el sustrato es:

Integrando lo anterior, despejando Ff y reemplazando la ecuación de biomasa se tiene:

Ley de Lambert-Beer Esta ley relaciona la absorción de luz con las propiedades de un material. Se ve expresado como:

Siendo: A: absorbancia I: intensidad de luz transmitida I0: intensidad de luz incidente ε: coeficiente de absorción molar (M/cm) L: la distancia que viaja la luz (cm) c: concentración del material (g/cm3) Esta ley describe una función lineal entre absorbancia y concentración, pero solo dentro de un cierto rango de absorbancia. Lambert-Beer solo es aplicable a soluciones diluidas. Esto se debe a varios factores. Por ejemplo, a altas concentraciones, las moléculas del material están mas cercas entre si y se producen interacciones entre ellas lo que produce una alteración en la capacidad de absorción.

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Metodología

Seguridad

1. Para establecer condiciones mínimas de seguridad e higiene en laboratorio se ocupó un delantal de laboratorio.

2. Las manos previamente lavadas se cubren con guantes de látex. 3. Para proteger los ojos se ocuparon antiparras

Obtener volumen se desecho y volumen de muestra Cultivo batch y fedbatch:

1. Se rocía la manguera donde se sacan muestras con etanol 70% 2. Se abre el sello de la manguera donde se va a extraer la muestra. Luego se conecta la

jeringa a la manguera. 3. Se abre la válvula del reactor y se extrae aproximadamente 3mL de desecho para

ambientar el tubo falcon y sacar el cultivo que está dentro de lo largo del tubo donde se sacan muestras. Se anota el volumen de desecho y luego se descarta.

4. Repetir paso anterior pero con 5mL y sin descartarlo. Esta será la muestra para hacer las mediciones. El tubo se mete en un envase con hielo. Esto es para que las células no sigan creciendo.

5. Cerrar la válvula y sellar manguera Cultivo continuo:

1. Se rocía la manguera de salida con etanol 70%. 2. Se obtiene 5mL de volumen de desecho de la manguera de salida donde continuamente

sale cultivo. Esto se hace para eliminar el cultivo dentro de la manguera y para ambientar el tubo falcon. El volumen se anota y luego se descarta.

3. Se obtiene 7mL de muestra en el tubo falcon. El tubo se pone en hielo.

Medición de peso seco

1. Cuidar que la implementación sea apropiada, usando implementos de seguridad personales como lentes o guantes.

2. Se pesa el filtro en la balanza infrarroja 3. Se coloca el filtro (seco) sobre el embudo, el cual esta acoplado a un matraz y a la bomba. 4. Se pipetean 20 mL (10mL + 10mL) desde el falcon con la muestra de S.cerevisiae al filtro. 5. Se lava la muestra usando agua. 6. Se inicia el proceso de filtrado, con la bomba que permite alcanzar los 10 mbar, hasta que

no se aprecie más escurrimiento de fluido. 7. Una vez terminado se quita cuidadosamente el filtro del embudo (tomándolo desde el

costado) para evitar su ruptura. 8. Se lleva el filtro con la muestra a la balanza infrarroja (no superar 65 °C) dejándolo hasta

que la variación de peso en el tiempo sea despreciable.

12

9. Se le quita al peso encontrado el del filtro, obteniéndose el peso seco de la muestra.

Centrifugación

1. Se mide 2 muestras de 1.5mL cada uno en tubos eppendorf. 2. Se programa la centrifuga a 6°C, 14000 RPM y 5 minutos. 3. Se colocan las muestras idénticas en lados opuestos de la centrifuga para balancearla. 4. Se inicia el proceso de centrifugado, después de verificar que este bien cerrado.

Corroborar que no hayan ruidos extraños que indiquen algún malfuncionamiento de la centrífuga.

5. Una vez terminado el proceso se abre la centrífuga y se sacan ambas muestras. 6. Se extrae el sobrenadante en otro tubo eppendorf rotulado y se guarda en el refrigerador

a -80°C . Este se va a usar para el análisis de glucosa y acetato con HPLC. El pellet se descarta.

HPLC

1. Seleccionar la fase estacionaria y móvil adecuada para la realizar la separación. 2. Para calibrar el HPLC se realiza el proceso de cromatografía con una sustancia de

concentración conocida, luego el área bajo la curva en el cromatograma correspondiente se calibra hasta la concentración de la sustancia introducida. Además, mediante software es posible regular los tiempos de retención para cada compuesto y el área bajo la curva para la concentración del compuesto, todo esto para mejorar la identificación y cuantificación de las sustancias en la muestra.

3. Para realizar la medición, se carga la muestra a analizar en la matriz de tubo. 4. Se selecciona la posición en que se colocó la muestra y se inicia el proceso de

cromatografía. La duración del muestreo es cercana a los 30 minutos. 5. En el cromatograma se identifican y cuantifican los componentes de la muestra según su

tiempo de residencia e índices de refracción. Dada una base de datos previa donde se identifican estos datos para los compuestos probables, el programa identificará los peaks y determinará el (los) compuesto (s) correspondiente.

Espectrofotometría

1. Se lavan y limpian las cubetas evitando el daño a la superficie de esta, lo cual podría impedir la correcta medición de absorbancia.

2. Se calibra el espectrofotómetro con una muestra blanco de 1mL de, en este caso, NaCl 0.9%.

3. Se pipetea la muestra en la cubeta. La dilución dependerá del valor de la absorbancia. La dilución se hace con NaCl 0.9% (medio isotónico) para evitar la lisis de las células.

4. Se mide la absorbancia de la muestra con materia orgánica: de estar entre 0 a 0.6 se puede considerar la medición ya que estamos en el rango lineal en la relación concentración vs. Absorbancia, es decir, se puede usar la ley de Lambert-Beer. Si es que se supera este valor, es necesario diluir la muestra hasta cumplir ese rango y extrapolar luego a la concentración inicial.

13

Resultados

Se hicieron mediciones para 3 tipos de cultivos: batch, continuo y fed-batch. Obtuvimos datos para la densidad óptica, y concentraciones de glucosa y acetato. Con estos datos luego se procedió a calcular los parámetros cinéticos de cultivos tales como YSX, μ y ks. Primero se calculo la ecuación para la curva de calibración. Utilizando los datos dados de 3 experimentos para cada uno de las 5 muestras se obtuvo la masa de cada experimento, la masa promedio de cada muestra y un valor promedio de la densidad óptica (OD600). Los valores se muestran en la Tabla 1. Tabla 1 – Mediciones para la curva de calibración.

Muestra (g) Promedio OD600 Promedio Muestra (g) Biomasa (g/L)

0.008427 4.2 0.00838442 4.19221033

0.00834726

0.008379

0.009959 5.92 0.0098344 4.9172

0.0098028

0.0097414

0.01319954 9.64 0.01269738 6.34869

0.0129926

0.0119

0.029289 27.8 0.02909233 14.5461667

0.027994

0.029994

0.03242 31.3 0.03303333 16.5166667

0.03286

0.03382

Con los valores de OD600 promedio y concentración de biomasa se hizo un grafico de absorbancia de OD vs biomasa (Fig. 3). Luego se ajusto una recta a esos puntos. La ecuación de la recta obtenida (ec. 17) es la ecuación de la curva de calibración. Este se va a usar para calcular la concentración de biomasa en función de OD.

Luego se procedió hacer los cálculos respectivos para cada tipo de cultivo.

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Figura 3 - Curva de calibración con densidad óptica vs concentración de biomasa

Cultivo Batch La tabla A1 en anexos muestra los datos de las condiciones del cultivo. Las mediciones que se obtuvieron se encuentran en la tabla 2. Tabla 2 – Mediciones de cultivo batch

Hora Volumen Desecho

(mL)

Volumen Muestra

(mL) OD600

Factor de Dilución

Glucosa (g/L)

Acetato (g/L)

14:00 3 5 0.275 1 9.028 0.040

15:48 4 5 0.114 10 8.189 0.030

17:13 3.75 4 0.261 10 7.010 0.035

17:33 4.25 5.75 0.342 10 6.570 0.028

17:56 1 4 0.425 10 5.784 0.032

18:37 2.3 4 0.55 10 4.351 0.024

19:19 3 4 0.405 20 2.205 0.079

19:43 2 4.5 0.497 20 0.546 0.133

20:00 2.5 10 0.545 20 0.011 0.123

20:49 4 6.5 0.537 20 0.009 0.041

21:17 3 7 0.554 20 0.005 0.004

De los datos de la Tabla 2, calculamos el tiempo en horas, con 14:00hr como t=0, y la biomasa en g/L con la ec. 1. De esta manera se obtuvieron los siguientes valores (Tabla 3).

y = 2,212x - 4,8087 R² = 0,999

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

OD

60

0

Biomasa (g/L)

Curva Calibrado de Absorbancia

15

Tabla 3 – Cantidad de concentración de biomasa (X) en el tiempo

Tiempo (hr) X (g/L)

0 2.3049175

1.8 2.695638

3.21666667 3.359637

3.55 3.725514

3.93333333 4.100425

4.61666667 4.66505

5.31666667 5.83947

5.71666667 6.670598

6 7.10423

6.81666667 7.031958

7.28333333 7.185536

Utilizando los valores de las concentraciones de glucosa, acetato y biomasa (Tablas 2 y 3), se hizo un grafico de concentración vs tiempo (Fig. 4) para ver el comportamiento de cada componente en el tiempo.

Figura 4 – Concentraciones de biomasa, glucosa y acetato vs tiempo en cultivo batch. Se grafico el acetato por separado para ver con más detalle su comportamiento en el tiempo (Fig. 5).

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8

Co

nce

ntr

acio

n (

g/L)

Tiempo (hr)

Biomasa, glucosa y acetato vs tiempo

Biomasa

Glucosa

Acetato

16

Figura 5 – Producción de acetato en el tiempo en cultivo batch Para el cálculo de los parámetros de rendimiento YSX, se utilizo los valores de la biomasa de la

Tabla 3 y sabiendo que YSX =

se obtienen los valores de la Tabla 4.

Tabla 4 – Valores calculadas de parámetros de crecimiento

X (g/L) ln(X) Ysx

Rendimiento OD600*FD

2.3049175 0.83504488 0.46539521 0.275

2.695638 0.99163491 0.56301558 1.14

3.359637 1.21183293 0.8319887 2.61

3.725514 1.31520483 0.47683973 3.42

4.100425 1.41109063 0.39413763 4.25

4.66505 1.54009855 0.54738617 5.5

5.83947 1.76464004 0.50095051 8.1

6.670598 1.89770951 0.8094528 9.94

7.10423 1.96069038 -54.2333377 10.9

7.031958 1.95046519 34.9591162 10.74

7.185536 1.97207012 11.08

Dejando fuera los últimos 2 valores de YSX, se hizo un promedio de YSX con los valores de la Tabla 4, llegando a un valor de YSX_promedio = 0.57364579 g/g Además se construyó un grafico de ln(x) en el tiempo para obtener el valor de la pendiente de la curva, o sea, μ. Específicamente se deseaba encontrar μmax, o sea, μ en la fase de crecimiento exponencial. Desde la figura 6 se puede observar que el valor de μmax es 0.3246 (1/hr)

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,120

0,140

0,160

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Co

ne

ntr

acio

n (

g/L)

Tiempo (hr)

Concentracion de acetato en el tiempo

17

Figura 6 – ln(X) en el tiempo para la fase exponencial de crecimiento en cultivo batch. Para el cálculo de Ks se hizo algo similar a lo anterior pero tratamos que encontrar el valor de μ tale que μ = μmax/2. El valor de la concentración de glucosa en ese punto es el valor de Ks. La pendiente de los puntos 2, 3 para tiempos y ln(X), daba una pendiente de μ =0.1554, lo cual es muy cercano a μmax /2 = 0.1623 (Fig. 7). Se tomo un promedio de los tiempos y concentración de glucosa en los puntos 2 y 3 y se obtuvo que aproximadamente en el tiempo t=2.5 hr, la concentración de glucosa es 7.6 g/L, lo que es el valor de Ks buscado.

Figura 7 - ln(X) en el tiempo para la fase lag de crecimiento en cultivo batch

Cultivo Continuo (Quimiostato) Las condiciones del cultivo se pueden ver en la Tabla A2 en Anexos. Se midió las cantidades de glucosa, acetato, oxigeno y CO2 disuelto en el medio para diluciones distintas hasta que se observa un lavado del sistema (Tabla 5).

y = 0,3246x + 0,0408 R² = 0,9999

0

0,5

1

1,5

2

0 2 4 6 8

ln(X

)

Tiempo (hr)

Ln(X) v/s t , en la fase exponencial

Ln(X)

Lineal (Ln(X))

y = 0,1554x + 0,7119 R² = 1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

ln(X

)

Tiempo (hr)

ln(X) vs tiempo

18

Tabla 5 – Mediciones del cultivo continuo

D (1/h)

(OD600)*FD

Glucosa (g/L)

Acetato (g/L)

%O2 (v/v)

%CO2 (v/v)

Oxigeno Disuelto (ppm)

0.2 10.99 0.047 0.004 0.209 0.086 5.273

0.3 10.34 0.073 0.003 0.209 0.097 5.109

0.3 11.34 0.115 0.003 0.209 0.108 4.765

0.4 10.54 0.171 0.003 0.208 0.120 4.643

0.4 11.46 0.266 0.003 0.208 0.131 4.265

0.5 11.22 0.476 0.016 0.209 0.143 4.070

0.6 0 10 0 0.21 0.04 6.2

Con la ecuación 1, se calcula la concentración de biomasa en el reactor para cada dilución, obteniéndose los valores de la Tabla 6. Con estos datos se construyo un grafico de concentración de biomasa vs dilución (Fig. Tabla 6 – Concentración de biomasa para distintas diluciones

D (1/h) Biomasa

(g/L)

0.2 7.14306258

0.3 6.85110054

0.3 7.30090347

0.4 6.94290078

0.4 7.35850603

0.5 7.24889268

0.6 2.1807

Luego se grafico la producción de acetato y biomasa y el consumo de glucosa para las distintas diluciones. (Fig. 8)

Figura 8 – Concentración de biomasa, glucosa y acetato para distintas diluciones en cultivo continúo

-2,000

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Co

nce

ntr

acio

n (

g/L)

Dilucion (1/hr)

Biomasa, glucosa y acetato vs dilucion

Glucosa (g/L)

Acetato (g/L)

Biomasa

19

Para observar mejor el comportamiento de acetato (Fig. 9), y glucosa (Fig. 10), se construyeron gráficos separados. Para el grafico de glucosa, solo se grafico hasta la dilución 0.5 1/hr dado que a 0.6 1/hr la concentración de glucosa se dispara y aumenta en 2 órdenes de magnitud (desde 0.476 g/L hasta 10 g/L). Luego para ver cómo se comporta la glucosa antes del lavado (dilución 0.6 1/hr) se grafica hasta la dilución 0.5 1/hr.

Figura 9 – Concentración de acetato para distintas diluciones en cultivo continúo

Figura 10 – Concentración de glucosa hasta antes del lavado del sistema en cultivo continúo. También se grafico la cantidad de O2 y CO2 en %v/v en el reactor para cada dilución. (Fig. 11)

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Co

nce

ntr

acio

n (

g/L)

Dilucion (1/hr)

Acetato

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Co

nce

ntr

acio

n (

g/L)

Dilucion (1/hr)

Glucosa

20

Figura 11 – Cantidad de oxigeno y CO2 disuelto en el reactor (0.4L) para cultivo continuo Luego se procedió a calcular los valores de la Tabla 7.

Ysx 1/Ysx 1/Mu 1/Glucosa Mu

0.71768092 1.39337688 5 21.266755 1.39337688

0.69014069 1.44897992 4 13.71876 1.44897992

0.73861114 1.35389239 3.33333333 8.66833666 1.35389239

0.70638726 1.41565407 2.85714286 5.83927175 1.41565407

0.7559785 1.32278894 2.5 3.75587376 1.32278894

0.76111411 1.31386344 2.22222222 2.10108329 1.31386344

- 1.66666667 0.1

Tabla 7 – Valores de Rendimiento y tasa de crecimiento para distintas diluciones Con los valores de la tabla 7 se construyeron las figuras 12 y 13

Figura 12 – Relación entre rendimiento y tasa de crecimiento celular

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

% (

v/v)

Dilucion (1/hr)

O2 y CO2 vs dilucion

%O2 (v/v)

%CO2 (v/v)

y = 0,032x + 1,2686 R² = 0,3829

0

0,5

1

1,5

2

0 2 4 6

1/Ysx v/s 1/Mu 1/Ysx v/s 1/Mu

21

Figura 13 – Relación entre tasa de crecimiento celular y tiempo

Cultivo Fed-batch Las condiciones del cultivo fed-batch se pueden observar en la Tabla A3 en los Anexos. Utilizando los datos de medición (Tabla A4 en Anexos) y la ecuación 1, calculamos la concentración de biomasa en el reactor en el tiempo (Tabla 8). Tabla 8 – Valores calculados para biomasa (X)

Tiempo (hr)

X (g/L) ln (X)

0 2.338795 0

2 2.347829 0.85349107

3.06666667 2.528509 0.9276298

3.93333333 2.731774 1.00495122

4.83333333 3.070549 1.12185637

5.61666667 3.49063 1.25008224

6.31666667 4.104942 1.41219161

7.1 4.827662 1.57436229

8.48333333 7.23974 1.97958529

8.96666667 8.5045 2.14059544

10.05 10.67266 2.36768533

10.7 12.97633 2.56312693

11.35 15.46068 2.73830003

12.4333333 19.3453 2.9624495

12.9666667 20.83591 3.03667794

13.4666667 22.484615 3.1128313

14.0166667 23.5762233 3.16023872

14.7166667 24.314 3.19105232

y = 0,1522x + 1,8772 R² = 0,9876

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30

1/Mu v/s 1/s

1/Mu v/s 1/s

El intercepto es Mu max La pendiente Ks/Mu max

Mu max=0,532

Ks=0,0810

22

15.2333333 25.39808 3.23467358

15.7333333 25.62393 3.24352668

16.2666667 25.39808 3.23467358

16.8833333 25.03672 3.22034355

Considerando que el proceso fed-batch no comienza al mismo tiempo que el muestreo, se debe considerar el punto en el que comienza la alimentación. Esto es aproximadamente a los 7.7 hr desde el comienzo del muestreo. El perfil del desarrollo de este proceso se ve en las figuras siguientes.

Figura 14 – Perfil de biomasa durante todo el tiempo de muestreo del cultivo fed-batch

Figura 15- Perfil para la fermentación fed-batch (ya que se dice que la alimentación se conecta cerca de 7.7 horas después de iniciado el muestreo). Para el cálculo del flujo que ingresa se usa la fórmula:

(ecuación 18)

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20

Bio

mas

a (g

/L)

Tiempo (hr)

Biomasa vs tiempo

Biomasa (g/L)

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20

Bio

mas

a (g

/L)

Tiempo (hr)

Biomasa vs tiempo

Biomasa (g/L)

23

En el que los valores vienen dados y son:

Siendo M el volumen correspondiente a las muestras tomadas antes de la conexión del flujo de entrada. Con esto nos queda que Fin es:

Para tener el volumen a cada instante es necesario saber cuál es el volumen que ha ingresado por Fin hasta cierto instante, esto lo podemos obtener al integrar la ecuación de en el tiempo (se resta 7,7 pues es tiempo en el que comienza el fed-batch):

En esta situación el volumen estará dado en cada instante por:

Con M(t) el volumen para realizar el muestreo (aunque es un valor marginal al considerar el tamaño total, a la postre puede influir en el resultado). Así, tenemos que el y el volumen del reactor en función del tiempo es de: Tabla 10 - Flujo de alimentación y volumen en el cultivo fed-batch.

Tiempo (hr) (L/hr) Volumen (L)

8,48333333 0,02019841 0,00288319 0,32718319

8,96666667 0,02134921 0,00504209 0,32234859

10,05 0,02392857 0,01118445 0,33419795

10,7 0,02547619 0,01595076 0,34145854

11,35 0,02702381 0,0217433 0,34764859

12,4333333 0,02960317 0,03429944 0,35790434

12,9666667 0,03087302 0,04215113 0,36715832

13,4666667 0,03206349 0,05074509 0,37415088

14,0166667 0,03337302 0,06181319 0,38622059

14,7166667 0,03503968 0,07881691 0,4032233

24

y = 0,1977x - 0,6592 R² = 0,9592

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 5 10 15 20

Ln (XV) vs tiempo (hr)

Ln (XV) vs tiempo (hr)

Lineal (Ln (XV) vs tiempo (hr))

15,2333333 0,03626984 0,09386745 0,41687384

15,7333333 0,03746032 0,11083089 0,43383868

16,2666667 0,03873016 0,13196161 0,4542694

16,8833333 0,04019841 0,16100436 0,48281286

Para el cálculo de la tasa de crecimiento es necesario dibujar un gráfico ln(XV) vs tiempo en el cual es posible estimar μ según la correspondencia entre el ajuste lineal y el logaritmo de la ecuación de biomasa en función del tiempo (ecuación 3)

(ecuación 19) ln(XV)t = ln(XV)0 + µ*t y = b + m*x En este caso el ajuste a los datos queda como en la figura 16. Figura 16 – Grafico de ln(XV) en el tiempo para el cultivo batch Tabla 11 – valores de ln(XV) calculado en cultivo fed-batch

Tiempo (hr) Ln (XV)t

8,48333333 0,86235025

8,96666667 1,00847369

10,05 1,27166353

10,7 1,48859793

11,35 1,68173692

12,4333333 1,93495995

12,9666667 2,03471581

13,4666667 2,12973517

14,0166667 2,20889212

14,7166667 2,28278755

15,2333333 2,35970194

15,7333333 2,40844416

25

Luego, de la figura 16 se obtuvo que el valor de μ (la pendiente) es 0.1977 (1/hr). Finalmente se grafica XV por el tiempo para el proceso batch completo (Fig. 15)

Figura 17 - Gráfico VX vs tiempo para el cultivo fed-batch. Cuadrados rojos: gr. de biomasa del

cultivo batch previo, rombos celestes: gr. de biomasa del fed-batch.

y = 1,2355x - 8,4457 R² = 0,995

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20

XV vs tiempo

XV batch previo

Lineal (XV vs tiempo)

16,2666667 2,44560871

16,8833333 2,49221739

26

Discusión Según la ley de Lambert-Beer, las mediciones de biomasa solo sirven dentro un cierto rango de OD. En este caso, el rango en que la curva de calibrado es válido es entre 4.2 y 31.3 OD600. Cuando se produce el lavado, el OD es 0 lo cual queda debajo del rango mencionado. Por esta razón, la curva de calibración no se puede utilizar para calcular biomasa cuando ocurre el lavado. Esto explica la cantidad positiva de biomasa para OD600 = 0 en el quimiostato, cuando debería ser 0 g/L.

Cultivo continuo De los datos de cultivo continuo se obtuvo un coeficiente de mantención 0.032 y un rendimiento real en glucosa variable a través del tiempo que promediaba 0.728. El coeficiente de mantención es despreciable ya que la tasa a la que se reproduce el microorganismo es elevada implicando un consumo de sustrato mucho mayor. El coeficiente demantencion pasa a ser relevante cuando la velocidad de crecimiento es pequeña Los valores de μmax y Ks resultaron 0,532 y 0,0810 respectivamente. Ks o constante de saturación corresponde a la concentración de sustrato para la cual se crece a μmax/2. La constante de saturación es inversa a la afinidad del organismo por el sustrato, es decir que a mayor Ks el organismo es menos afín al sustrato por lo que se debe poner en contacto con el organismo una mayor cantidad de sustrato para que este “la perciba”. Podemos dar mayor razón a este hecho mediante a la ecuación de Monod; Para una determinada concentración de sustrato, a Ks bajo nos aproximamos cada vez más a μmax, mientras que si aumentamos Ks, Mu disminuye, en fin, mientras Ks<<S tenemos que Mu será igual a μmax. Los valores típicos Ks de Escherichia coli para glucosa varían entre 0.07 y 2 mg/L ( nuestro Ks calculado estaría dentro de esyos rangos) por lo que bastarían concentraciones relativamente bajas de sustrato para hacer crecer nuestra coli a μmax. Respecto a μmax los valores típicos para Escherichia coli varían según cepa y medio de cultivo, pero estos oscilan entre 0.14 y 0.82 [1/h] por lo que estaríamos dentro de los rangos aceptados. Tenemos que para cultivo quimiostato/batch; μmax= 0,532 /0.324 , Yxs=0.728/0.573 En definitiva los valores no son iguales, y confiaremos más en los parámetros obtenidos en el quimiostato ya que en este sistema, al trabajar en estado estacionario los valores a obtener para el cálculo de μmax son independientes del tiempo en que uno los tome. Mientras que en el batch, los valores medidos dependen todos del tiempo. Más aún debido a esta diferencia somos capaces de tomar muchas mediciones en el quimiostato y luego sacar un promedio mientras que en el batch tendremos una sola posibilidad. Cuando D=0.4 se comienza a producir acetato, tenemos que a esta tasa de dilución estamos muy cerca de la tasa a la que comienza a lavarse el reactor. Cabe decir que el reactor termina por lavarse a D=0.6 donde obviamente tenemos biomasa nula y máximos niveles de glucosa. Como se puede observar de la figura 8, en la dilución 0.5 1/hr comienza a disminuir la cantidad de biomasa en el reactor porque el sistema está comenzando el lavado. Como hay menos microorganismos, hay menos consumo de glucosa y menos producción de acetato. Esto explica los cambios de las pendientes para acetato y glucosa en las figuras 9 y 10 respectivamente. Además en esta misma dilución ocurre un aumento en la cantidad de oxigeno disuelto en el medio y una disminución en la cantidad de CO2 disuelto (Fig. 11). Esto es porque hay menos E. coli que puede consumir oxigeno y producir CO2.

27

En D=0.6 1/hr se produce el lavado completo del sistema. Es decir que no quedan microorganismos en el reactor. Esto explica que la concentración del acetato sea 0 g/L (no hay E. coli para producirlo) y que la concentración de salida de glucosa sea la misma que la entrada (no hay E. coli para consumirla). Una inconsistencia es que la densidad óptica sea 0 cuando D=0.6 1/hr. Dado que el espectrofotómetro se calibro con NaCl 0.9%, lo cual es menos turbio que el medio de cultivo que se utilizo para E. coli, el OD para el sistema lavado (solo medio de cultivo) debería ser un numero positivo. Esto se puede explicar con Lambert-Beer. Como esta ley solo es válida dentro de cierto rango (para concentraciones de biomasa entre 4.19 g/L – 16.51 g/L, el rango en el cual se construyó la curva de calibración) Otra inconsistencia es la cantidad positiva de CO2 en el lavado. Como no hay E. coli para producirlo, el valor debería ser 0 g/L. Una explicación es que quizás una pequeña cantidad de CO2 se haya disuelto bien en el medio y por ende se va a demorar más en eliminarlo del sistema. Otra explicación es que el flujo de alimentación de aire contiene pequeñas cantidades de CO2. Para estimar las tasas específicas de producción de Co2 y consumo de O2 podemos realizar balances de masa. Balance fase gaseosa oxígeno: 0 = C02*Ff - C02*F – Kla(O2*-O2) Balance fase gaseosa oxígeno: 0 = CC02*Ff - CC02*F – Kla(CO2*-CO2) Balance fase líquida oxígeno: 0= Kla(O2*-O2)*V-ro2*X*V

=>

= ro2 //Asumiendo um X promedio de 0,14 y O2° =0,023 y Kla=140

ro2=0.4508 Balance fase líquida dióxido de carbono: 0= Kla(CO2*-CO2)*V-rco2*X*V

=>

= rCo2

Respecto a la produccion de acetato se tienen variadas teorías, que El flujo de carbono se va hacia acetato porque el ciclo de Krebs ya está funcionando a su máxima capacidad o que se produce debido a la falta de oxigeno por mencionar solo dos. Si tomamos la producción de acetato desde el último punto de vista podremos modelar la produccion de acetato em función de la incorporacion de oxigeno al microorganismo. Y diremos que se produce acetato cuando la tasa específica esperada de consumo de oxigeno del organismo es menor a la incorporación posible debido a limitaciones de solubilidad.

28

Cultivo fed-batch Debemos considerar que para el caso batch anterior se calculó la máxima tasa, siendo el promedio seguramente de menor magnitud, ya que luego del periodo lag y antes de la fase estacionaria hay un descenso de la tasa de crecimiento con respecto al máximo. Si observamos la cantidad de biomasa al alcanzarse el estado estacionario del proceso batch (6 horas aproximadamente) tenemos que la concentración es de 7.1 g/L. En este caso se observa una etapa de crecimiento exponencial, que seguramente debe ajustar a una cinética como la que describe Monod (ecuación 3). Si vemos los gráficos de μ para el cultivo por lotes alimentados vemos que ajusta bastante bien a una curva lineal (R > 90), en la que la tasa de crecimiento (μ) se mantendría constante durante el proceso. Por lo tanto, en este caso el crecimiento no depende de la concentración de sustrato como en batch sino que es constante durante el proceso. La variable del proceso que diferencia el caso batch del fed-batch es la presencia de alimentación, por lo tanto es esperable que ahí este la causa de las diferencias que se puedan esperar entre los cultivos. Gracias a esta alimentación podemos fijar μ a un valor específico, el cual se calculó y se presenta en los resultados. Cabe destacar, que a pesar de que la aproximación lineal es buena para este caso, la tasa presenta un ligero pero sostenido descenso a medida que va pasando el tiempo. Sin embargo, la tasa de crecimiento que se fijó no corresponde a la que se observa experimentalmente. En el cultivo el microorganismo crece más lentamente de lo presupuestado, = 0.3 [1/h] y [1/h] es el experimental. Una de las posibles causas es la aparición de un crecimiento restringido desde el punto de vista limitante, como se presentó en la clase 7 del profesor Agosin. El siguiente gráfico representa esta situación:

Figura 18 - Crecimiento del microorganismo en cultivo por lotes alimentados (CLA) en condiciones de crecimiento no restringido (exponencial) y de crecimiento restringido (limitado) desde el punto de vista del nutriente limitante. Notamos que hacia el final el crecimiento de la biomasa (VX) deja su comportamiento exponencial (y constante) para llegar a un crecimiento lineal (y decreciente). La primera condición se da cuando S >> Ks, es decir estamos alimentado al microorganismo con sustrato mayor a la tasa de saturación (Ks), así no verá su crecimiento afectado por la falta de glucosa. En el caso restringido tenemos que S es despreciable frente a X/Y X/S, lo cual corresponde al S consumido por L de reactor. Es decir, está consumiendo más rápido de lo que alimentamos, lo que lleva a que se limite el crecimiento de la bacteria. En nuestro caso si graficamos VX (Fig. 15).

29

Vemos que ajusta todo muy bien a una función lineal lo cual correspondería a un cultivo de crecimiento restringido. Lo mismo se obtiene de la tasa calculada en resultados. Se observa un decrecimiento con el tiempo en vez de ser lineal. Una explicación para esto es que E. coli aumenta tanto su biomasa que empieza a estresarse a concentraciones muy altas. Debido a este estrés E. coli disminuye su tasa de crecimiento. También empieza a producir acetato bajo condiciones de estrés, lo cual es un inhibidor de crecimiento. Con respecto al muestreo, en este caso, el volumen de muestra que se saca del reactor para realizar el estudio de absorbancia y el de desecho puede ser un factor que incida en el crecimiento, quizás no en una magnitud importante, pero aún así considerable. Por ejemplo, en la primera parte del cultivo batch, se comienza con 0.4 L y producto del muestreo se queda (al momento en el que se conecta la alimentación) con 0.33 L. En total, se retiran 0.17 L de muestra lo cual es casi la mitad del volumen total con el que comenzamos en el reactor. Si se desprecian, el cambio que generan en las otras variables es considerable, más no crítico. Por ejemplo, la tasa de crecimiento aumentaría a 0.19 [1/h] pero no hay valores q cambien de signo, o que cambie la condición de crecimiento (sigue observándose como restringido). Por lo tanto, la limitación en el muestreo tiene como fundamento no interferir en el crecimiento normal del cultivo fed-batch. Entre las posibles causas de la limitación de la biomasa hasta 50 OD, podemos encontrar la ya nombrada restricción ligada al crecimiento del nutriente limitante, en la que al hacia el final (cuando se queda estancado el valor de OD) se hace cada vez más insuficiente el sustrato alimentado para la biomasa presente. Oxigeno: puede ser que se estén quedando sin lo necesario al aumentar en tal proporción la biomasa, mejorar alimentación. La otra medición posible de realizar es la del acetato. Según Yee et al. (8) el acetato inhibe el crecimiento celular y reduce la producción de proteínas recombinantes, en este caso solo la primera consecuencia es la que observamos. El volumen del sistema va aumentando con el tiempo (Tabla A2 en Anexos) lo cual es consistente con un cultivo fed batch. Dado que hay flujo de entrada y no de salida y que el volumen de muestras y desecho (8mL aproximadamente) no es tan grande en comparación con el volumen del medio (400mL), el flujo de entrada es mayor que el volumen retirado y por esta razón aumenta el volumen en el tiempo. Para alcanzar valores de biomasa mayores se puede regular el de modo tal que no se produzca tanto acetato, podemos mejorar las condiciones de aireación y agitación para obtener una transferencia de oxigeno más eficiente y aumentar la alimentación de glucosa a valores mayores para que no se vea afectado el crecimiento por su carencia.

Cultivo Batch El lag-time corresponde a la fase en la que la biomasa no presenta un aumento observable en su concentración. Esto se puede deber a que las células están preparándose para la división, recolectando nutrientes o aumentando su tamaño, crecimiento celular (como se observa en Wade (2)). En el gráfico y en la tabla de los resultados no se observa ningún intervalo en el que la cantidad de biomasa se mantenga constante. Entre 0 y 1.8 hrs. se produce un aumento de biomasa (2.3 g/L a 2.69 g/L). En consecuencia, lo que podemos decir de la duración del lag es que es menor a 1.8 hrs, pero no se distingue debido a que no se realizó muestreo más exhaustivo. Sin embargo, debido a la baja tasa de crecimiento que se observa en este primer intervalo, podríamos decir que puede ser un valor cercano a esas 1,8 horas. La duración del lag time está determinada por factores como el tamaño del inóculo, tiempo necesario para recuperarse de daño físico o

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shock en la transferencia, tiempo requerido para la síntesis de enzimas (que pueden ser inducidas por el medio en el que se encuentra) o cofactores esenciales para metabolizar los nutrientes específicos presentes en el medio (7). En consecuencia, un modo de acortar el periodo lag puede ser manteniendo las células, previo a la inoculación, en un cultivo de características similares a las que se encontrarán en el medio batch definitivo y de este modo evitar el shock de las células y la necesidad de sintetizar nuevas enzimas para el metabolizar los nutrientes del nuevo cultivo. Acetato es una producto lateral que produce Escherichia coli cuando está realizando fermentación aeróbica. La tasa en la que se produce acetato es directamente dependiente de la tasa en la que célula crece, consumiendo su sustrato glucosa. La producción se produce específicamente cuando hay overflow metabolism en E. coli. Esto es, se llega a un punto en la saturación de la tasa de captura de oxigeno por parte de la célula, pasando a fermentación como su metabolismo (5).

Fig 19 - Tasas de captura de oxigeno (azul) y de formación de acetato (rojo) cuando E. coli pasa a overflow metabolism En el caso de la presente experiencia, se mantiene en niveles muy reducidos a lo largo de todo el cultivo, pero cuando la biomasa de la célula está comenzando a detener su crecimiento (estado estacionario) el acetato presenta un súbito peak para luego decaer nuevamente. El bajo nivel remanente en el primer tramo puede indicar que algunas bacterias a) tienen menos oxigeno del requerido y están realizando fermentación anaerobia, o b) tienen más oxigeno del que soportan y hacen fermentación en condiciones aeróbicas. Esta diferencia en las concentraciones de oxigeno es debido a que el medio no es homogéneo y no todas las zonas reciben la misma transferencia de oxígeno. Para remediar esto medidas como aumentar la velocidad de la agitación pueden ayudar. Al estar cercano a las 6 horas la tasa de captura de oxigeno se eleva por sobre los niveles de soportables por la célula a nivel más generalizado lo cual provoca un aumento en los niveles de acetato (la tasa de crecimiento comienza a disminuir por lo tanto la cantidad de oxigeno disponible para cada bacteria aumenta repentinamente), sin embargo, al pasar este estado de transición (de crecimiento exponencial a estado estacionario) ya se readecuan los sistemas a los nuevos niveles, evitando la producción de acetato. Parámetros a considerar para la cinética de crecimiento? Puede ser el consumo de oxigeno, pues nos indica que tan rápido crece en función de lo rápido q baja el oxigeno (o generación de CO2 cuando hay mas biomasa). También la tasa de consumo de glucosa nos permite ver cómo va variando el crecimiento celular (el consumo es como una exponencial invertida al crecimiento de la biomasa). Supuestos? Que solo tenemos una bacteria

31

por lo tanto lo que se consuma será lo que E. coli consume. Además no hay ni entrada ni salida, así que es más fácil de determinar, no hay alteraciones externas.

Conclusiones y Recomendaciones En conclusión se observo que los 3 cultivos se comportaron de manera esperada. Los datos obtenidos eran similares a los valores obtenidos a partir de los balances de masa y la ecuación de Monod (modelo). Para mejorar los cálculos en el cultivo batch se necesitaría tener más datos para la fase lag para así poder calcular Ks de manera más precisa. Para el cultivo continuo, se podría hacer diluciones más pequeñas para poder ver y analizar mejor el efecto del coeficiente de mantención. Para el cultivo batch se podría haber tomado muestras más seguidas (tiempo de intervalo menor) para tener más puntos en los gráficos y de esa manera calcular una tasa de crecimiento más preciso.

32

Nomenclatura A: absorbancia c: concentración del material (g/cm3) C02: concentracion de O2 (g/L) Cc02: concentracion de CO2 (g/L) D: tasa de dilución (1/hr) F = flujo de salida (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) FD: factor de dilucion Ff = flujo de alimentación (L/hr) Ff = flujo de alimentación (L/hr) I: intensidad de luz transmitida I0: intensidad de luz incidente KLa: coeficiente de transferencia de oxigeno (1/hr) Ks : medida inversa de la afinidad entre el microorganismo y el sustrato limitante (También se

describe como el valor de S(t) cuando

)

l: la distancia que viaja la luz (cm) m: coeficiente de mantenimiento celular OD600 = densidad óptica a longitud de onda 600nm qS=tasa volumétrica de generación de sustrato qX=tasa volumétrica de generación de biomasa S (t): concentración de sustrato dado en un tiempo Sf = concentración de sustrato en el flujo de alimentación (g/L) t: tiempo (hr) V= volumen (L) X (t) o X: concentración de sustrato dado en un tiempo X0 concentración inicial de biomasa (g/L). Xf = concentración de sustrato en el flujo de alimentación (g/L) YSX rendimiento de sustrato para producir biomasa (g/g) ε: coeficiente de absorción molar (M/cm) μ: tasa de crecimiento celular (1/hr) μmax: tasa de crecimiento celular máxima (1/hr) μset: tasa de crecimiento celular fija para el sistema (1/hr)

33

Bibliografía

1. Agosin, E. “Clase 4- Cultivo batch”. 2012. 2. Agosin, E. “Clase 5- Cultivo continuo”. 2012. 3. Agosin, E. “Clase 7- Cultivo por lote alimentado”. 2012. 4. Beer-Lambert Law. “Stage 2 Chemistry Social Relevance Projects”. The University of

Adelaide. http://www.chemistry.adelaide.edu.au/external/soc-rel/content/beerslaw.htm

5. Eiteman , Mark A. , Altman,Elliot. “Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations”. TRENDS in Biotechnology 2006 Vol.24 No.11

6. http://mic.sgmjournals.org/content/7/1-2/18.full.pdf Wade H.E, Observations on the Growth Phases of Escherichia coli, American Type ' B '. J . gen. Microbiol. 7. 1952 , 18-23

7. http://textbookofbacteriology.net/growth_3.html 8. Yee, L. “Blanch HW. Recombinant protein expression in high cell density fed-batch

cultures of Escherichia coli”. 1992, Dec;10(12):1550-6.

34

Anexos

Tabla A1 – Condiciones de cultivo batch

Volumen Reactor 600 mL

Agitación 800 rpm

Flujo Aire 2 VVM

Kla 202 1/h

Temperatura 37 C

pH 6.7 -

Tabla A2 – Condiciones del quimiostato

Volumen Reactor 400 mL

Agitación 500 rpm

Flujo Aire 1.5 VVM

Kla 140 1/h

Temperatura 37 C

pH 6.7 -

Glucosa feed 10 g/L

Tabla A3 – Condiciones de cultivo fed-batch

Volumen Batch 400 mL

Agitacion Max 800 rpm

Flujo Aire Max 2 VVM

Flujo Oxigeno Max 0.5 VVM

Kla max 202 1/h

Temperatura 30 C

pH 6.7 -

Glucosa Batch 10 g/L

Glucosa feed 300 g/L

mu_set 0.3 hr-1

Ysx 0.42 gDCW/gGlucosa

35

Tabla A4 – Datos de muestras de cultivo fed-batch

Hora OD600 Volumen Desecho Volumen Muestra

2:00 0.35 - 3

4:00 0.37 3.5 6.5

5:04 0.77 3 8.5

5:56 1.22 5.5 5

6:50 1.97 3 7.5

7:37 2.9 4 4.5

8:19 4.26 4 3.5

9:06 5.86 4 3.7

10:29 11.2 2.7 3.8

10:58 14 7 6.5

12:03 18.8 2 5.8

12:42 23.9 1.8 3.5

13:21 29.4 1.5 3.4

14:26 38 2.4 4.8

14:58 41.3 1 4.8

15:28 44.95 1.9 5.5

16:01 47.37 2.6 3.8

16:43 49 2.5 3.9

17:14 51.4 2.8 5

17:44 51.9 2.5 5.3

18:16 51.4 2 6.5

18:53 50.6 3 6

Tabla A5 – Cálculos para Cultivo fed-batch

XV tiempo

ln (XV)

gramos biomasa Fin

F in acumulado (L)

Volumen

concentracion teorica M (t)

0.9285016

2 0

-0.074

18316

0.397

0.9086098

2 2

-0.095

83951

0.387

0.9494551

3

3.0666666

7

-0.051

86701

0.3755

0.9970975

1

3.9333333

3

-0.002

90671

0.365

1.0885096

2

4.8333333

3 0.084

80944

0.3545

36

1.2077579

8

5.6166666

7 0.188

76573

0.346

Suma volumen muestras antes de q comience batch

1.3895228

7

6.3166666

7 0.328

96043

0.3385

0.0692

1.5969905

9 7.1 0.468

12098

0.3308

2.3687212

4

8.4833333

3 0.862

35025 1.75741

365

0.0041843

2 0.002883

19

0.3271831

9 5.3713445

4 -0.0065 2.7414135

7

8.9666666

7 1.008

47369 2.03163

972

0.0048372

4 0.005042

09

0.3223485

9 6.3026170

8 -0.0134935 3.5667810

7 10.05 1.271

66353 2.81185

163

0.0066948

8 0.011184

45

0.3341979

5 8.413731 -0.00778651 4.4308787

5 10.7 1.488

59793 3.41727

418

0.0081363

7 0.015950

76

0.3414585

4 10.007874

3 -0.00529221 5.3748836

2 11.35 1.681

73692 4.15305

085

0.0098882

2 0.021743

3

0.3476485

9 11.946117

3 -0.00489471 6.9237667

7

12.433333

3 1.934

95995 5.74794

965

0.0136855

9 0.034299

44

0.3579043

4 16.060016

8 -0.00719511 7.6500777

3

12.966666

7 2.034

71581 6.74528

141

0.0160601

9 0.042151

13

0.3671583

2 18.371588 -0.0057928 8.4126385

9

13.466666

7 2.129

73517 7.83689

891

0.0186592

8 0.050745

09

0.3741508

8 20.945824

9 -0.00739421 9.1056228

3

14.016666

7 2.208

89212 9.24278

465

0.0220066

3 0.061813

19

0.3862205

9 23.931361

9 -0.00639261 9.8039714

2

14.716666

7 2.282

78755 11.4026

206 0.0271491

0.07881691

0.4032233

28.2786747 -0.00639361

10.587795

2

15.233333

3 2.359

70194 13.3143

608

0.0317008

6 0.093867

45

0.4168738

4 31.938585

3 -0.00779361

11.116652

15.733333

3 2.408

44416 15.4690

803

0.0368311

4 0.110830

89

0.4338386

8 35.656295

7 -0.00779221 11.537570

5

16.266666

7 2.445

60871 18.1531

338

0.0432217

5 0.131961

61 0.4542694

39.9611638 -0.00849221

37

12.088050

3

16.883333

3 2.492

21739 21.8421

854 0.0520052

0.16100436

0.4828128

6 45.239444

4 -0.00899151

Gramos biomasa al inicio del fedbatch

1.38936