Informe Técnico: La Fermentación Maloláctica

8/2/2019 Informe Tcnico: La Fermentacin Malolctica

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INFORME TCNICOFermentacin malolctica (FML)Edita FUNDACIN PARA LA CULTURA DEL VINO

Plaza del Per, 1.- Esc. Izda. 1ATel.: 91 343 07 08 - Fax: 91 343 07 [email protected]

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Traduccin: Teresa Sans MoralesDiseo: Unaluna Publicidad

Madrid 2006

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Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin

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Bodegas Julin Chivite

Bodegas La Rioja Alta, S.A.

Bodegas Vega Sicilia

Vinos de los Herederos del Marqus de Riscal


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FermentacinMalolctica


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ndiceI. Introduccin a la fermentacin malolctica

(FML): las bacteria lcticas y su mecanismo.

1. Historia de la bacteria malolctica en el vino

2. La prctica de la fermentacin malolctica

3. Bacterias lcticas y fermentacin malolctica

II. Requerimientos y factores de la fermentacinmalolctica

1. Necesidades nutricionales

2. Factoresmedioambientales

3. Gua para resolver problemas-aplicacin prctica-

III. Incidencias organolpticas, color y efectos alrealizar la fermentacin malolctica

1. Estudios sobre la prdida de color

2. Percepcin del consumidor de defectos

organolpticos del vino por una fermentacinmalolctica sin control

3. Efectos de los contaminantes microbiolgicosinducidos por la fermentacin malolcticadescontrolada en el vino

4. Incidencia cualitativa de la siembra debacteria en los vinos tintos

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentacinmalolctica

1. Los tipos de vino y el momento ptimo para lainoculacin. Cmo controlar el proceso.

2. Fermentacin malolctica en barrica.

3. Fermentacin malolctica: cundo y cmo

V. La Microoxigenacin

1. Microoxigenacin y fermentacin malolctica

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Indice

I. Introduccin a

la fermentacinmalolctica

(FML): las

bacterias lcticasy su mecanismo.

I.1. Historia de la bacteria malolctica en el vino

Sybille KriegerLallemand

I.2. La prctica de la fermentacin malolcticaDidier TheodoreLallemand

I.3. Bacterias lcticas y fermentacin malolcticaAline Lonvaud-FunelFaculte denologie. Universite Victor Segalen

Bordeaux 2

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23

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19

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HI.1. Historia de

la bacteria

malolctica en

el vino

Dra. Sibylle KRIEGERLallemand

1.1 Taxonoma de las bacterias lcticasdel vino

1.2 Ecologa y desarrollo de lasbacterias lcticas

1.3 Factores que influyen en lasupervivencia y desarrollo de lasbacterias lcticas en el vino

1.4 Influencia de la fermentacinmalolctica en la composicin delvino

1.5 Alteracin del vino por las bacterias

lcticas1.6 Control de la fermentacin

malolctica


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En 1837, en su libro titulado AShort Education on Suitable

Treatments of VinificatedJuices, 1 Freiherr von Babo des-

cribi el fenmeno de una segundafermentacin en los vinos jvenes,que comenzaba con un incrementode las temperaturas al final de la pri-mavera (normalmente cuando florec-an las vias). Esta segunda fermenta-cin liberaba CO2 y originaba una tur-bidez renovada en los vinos nuevos.Von Babo relacion esta actividad conla fusin de la grasa de la fermenta-cin alcohlica. Recomend un trasie-

go inmediato a una barrica nueva, con adicin deSO2, clarificacin y reduccin de la temperatura,seguido de un segundo trasiego y estabilizacin con

otra adicin de SO2.

Durante los estudios sobre las alteraciones del vinoque llev a cabo en 1866, Louis Pasteur aisl las pri-meras bacterias del vino e inici sus tudes sur levin2. Tambin se le puede atribuir la autora de la opi-nin general de que todas las bacterias presentes enel vino son organismos perjudiciales. La reduccin decidos observada en el vino se segua relacionandocon la precipitacin del cido trtrico, aunque en1891, Hermann Mller-Thurgau3 ya haba postuladoque la reduccin de cidos poda ser resultante de la

actividad bacteriana. Koch

4

y Seiffert

5

confirmaron suteora en 1898 y 1901 respectivamente. En 1913, consu histrica investigacin sobre la bacteria del cidolctico (bacterias lcticas) en el vino6, Mller-Thurgauy Osterwalder, explicaron la degradacin bacterianadel cido mlico en cido lctico y CO2 mediante lafrmula:

C4H6O5 = C3H6O3 + CO2

Bautizaron el fenmeno con el nombre de desacidifi-

cacin biolgica o fermentacin malolctica, y atri-buyeron la responsabilidad del mismo a la Bacteriumgracile. En la dcada de 1950, la aplicacin de nuevosmtodos enzimticos ayud a explicar las reaccionesenzimticas que se producen durante la degradacindel cido mlico7. La aplicacin de mtodos analticosms perfeccionados por Radler8, Peynaud9, Beelman10

y Kunkee11 permiti comprender mejor las complejasdemandas de nutrientes de las bacterias lcticas delvino, pues la degradacin de cido mlico por s solaslo proporciona una ventaja energtica menor a lascepas bacterianas12.

Informe TcnicoFermentacin MalolcticaFundacin para la Cultura del Vino

I.1. Historia de la bacteria malolcticaen el vino


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1.1 Taxonoma de las bacterias lcticas del vino

Desde estos primeros hallazgos, la investigacinsobre las bacterias lcticas ha mejorado. Se ha revisa-do el nombre de Bacterium gracile, que hace tiempose utilizaba a menudo como nombre del organismoque causaba la fermentacin malolctica. Los resulta-dos alcanzados por Vaughn13 y Radler8 han demostra-do que las bacterias lcticas presentes en el mosto deuva y en el vino pertenecen al gnero deLactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y, msrecientemente, Oenococcus14. Muchas bacterias lcti-cas distintas pasaban al mosto y al vino desde lasuperficie de las bayas, los vstagos, las hojas, el sueloy el material de bodega. No obstante, debido almedio sumamente selectivo que constituyen losdiversos mostos y vinos, slo unos pocos tipos debacterias lcticas son capaces de desarrollarse en elvino15, 16, 17. La descripcin general siguiente es vlida

para todas las bacterias lcticas del vino:

Gram-positiva; No mvil y no esporulada; Anaerobios facultativos; Metabolismo quimioorganotrfico - Necesitan

un medio rico y azcares fermentables; Temperatura ptima para su desarrollo com-

prendida entre 20 y 30C.

Adems de sus formas coccideas (redondas) o ciln-dricas, el metabolismo homo o heterofermentativodel azcar constituye un criterio decisivo para su cla-sificacin. Las bacterias homofermentativas producencido lctico a partir de la glucosa y/o fructosa. Lasbacterias lcticas heterofermentativas producen di-xido de carbono, etanol y cido actico, as comocido lctico, a partir de los mismos hidratos de car-bono. Los lactobacilos pueden poseer ambos tiposde metabolismo de los hidratos de carbono, y se divi-den en tres grupos:

Grupo 1: Homofermentativos estrictos Estegrupo nunca se ha detectado en el vino.

Grupo 2: Heterofermentativos facultativos Unamolcula de glucosa se convierte en dos mol-culas de cido lctico. Las pentosas fermentanen cido lctico y cido actico.

Grupo 3: Heterofermentativos estrictos Fer-mentan la glucosa en cido lctico, cido acti-co, etanol y CO2. Las pentosas fermentan encido actico y cido lctico.

En la tabla siguiente se resume el metabolismo de loshidratos de carbono de las bacterias lcticas corrien-tes en el mosto y el vino.

I. Introduccin a la fermentacin malolctica: las bacterias lcticas y su mecanismo.

Tabla 1.Metabolismo de hidratos de carbono de las bacterias lcticas

Grupo Fermentacin Azucar Especies

Lactobacilli

(clulas forma ovalada)

Heterofermentativa facultativa

Grupo 2

Lactobacillus casei

Lactobacillus plantarum

Heterofermentativa estricta

Grupo 3

Lactobacillus brevis

Lactobacillus hilgardii

Cocci(clulas redondas)

HomofermentativaPediococcus damnosus

Pediococcus pentosaceus

HeterofermentativaLeuconostoc oenos

Oenococcus oeni)

Esta clasificacin est sujeta a modificaciones debidoa los progresos de la identificacin de nuevos aisla-mientos bacterianos a partir del vino, as como a losavances de las tcnicas de biologa molecular utiliza-das para identificar los aislamientos. Por ejemplo, en1995 Dicks et al.14 han demostrado que laLeuconostoc oenos se diferenciaba de otra especie

de Leuconostoc no slo por su crecimiento enmedios cidos, su necesidad de un factor de creci-miento de zumo de tomate y su esquema de fermen-tacin de los hidratos de carbono, sino tambin por la

hibridacin ADN/ADN y por los anlisis digitales delos esquemas protenicos celulares solubles. Los estu-dios filogenticos, en especial los que incluyensecuencias 16S y 23S ARNr, han permitido identificarun sublinaje diferenciado, Leuconostoc oenos, que esindependiente y distinto de otras especies deLeuconostocas como de otras bacterias lcticas en

general. Este sublinaje es genotpicamente homog-neo y constituye un grupo diferenciado deLeuconostoc oenos. Por consiguiente, se le ha asigna-do un nuevo gnero llamado Oenococcus oeni.


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1.2 Ecologa y desarrollo de las bacterias lcticas

Como se ha mencionado ms arriba, en las uvas18 seencuentran recuentos reducidos (inferiores a 100clulas/g) de bacterias lcticas; en cambio, los recuen-tos de bacterias acticas y de levaduras son muchoms altos. Las bacterias lcticas aparecen en las hojasy en los tallos de los racimos de la vid, y tambin sepueden encontrar en el material de bodega. Estudiosrealizados en varios pases indican que la Oenococcusoenies la especie predominante en la realizacin dela fermentacin malolctica en el vino, aunque lacomposicin de las bacterias lcticas presentes en elmosto de uva al principio de la fermentacin alcoh-lica est dominada por cepas de Lactobacillus. LaPediococcus se encuentra principalmente despusde la fermentacin malolctica (FML) as como en losvinos con un pH ms alto. Normalmente, los vinos

con un pH inferior a 3.5 slo contienen cepas deOenococcus oeni, mientras que los vinos con un pHsuperior a 3.5 pueden contener diversas especies dePediococcusas como cepas heterofermentativas deLactobacillus. El estudio de Wibowo et al.17 identificdiversas fases de la de vinificacin (Fig. 1) en las quepueden aparecer y desarrollarse distintas especies debacterias lcticas. Textualmente, dice as, Despus dela trituracin, por lo general los mostos contienenpoblaciones de bacterias lcticas de 103 a 104CFU/mL; entre las principales especies presentes en

esta fase figuran Lactobacillus plantarum yLactobacillus casei, y, en menor medida, Leuconostocoenos [Oenococus oeni] y Pediococcus cerevisiae.Por lo general, estas especies no se multiplican, y des-aparecen durante la fermentacin alcohlica, aunqueen contadas ocasiones (alto pH los vinos) se puedeproducir una ligera proliferacin de algunas especiesindeseables en su mayora. La sensibilidad al etanolpuede explicar este declive de la viabilidad celular.Despus de un intervalo de estancamiento, cuyaduracin depende en buena medida de las propieda-des del vino, las clulas supervivientes empiezan amultiplicarse y, una vez que han alcanzado la bioma-sa crtica, se inicia la degradacin del cido mlico. Lasupervivencia de las bacterias malolcticas despusde terminar la FML depende en buena medida de lascondiciones del vino y del tratamiento aplicado almismo. El aporte de dixido de azufre induce unaprdida progresiva de viabilidad de estas bacterias,

aunque tambin es muy importante el pH del vino.Con un pH bajo, las bacterias lcticas del vino muerenprogresivamente, mientras que con un pH superior a3.5, la poblacin de bacterias lcticas puede seguiraumentando. No slo la Oenococcus oeni, sino tam-bin bacterias perjudiciales para el vino, comoPediococcus y Lactobacillus se pueden multiplicarhasta alcanzar concentraciones de nada menos quede 106 a 108 CFU/mL, y por ende, deteriorar el vino. Aspues, en condiciones de pH elevado, se recomiendauna estabilizacin temprana del vino.


Figura 1.Ciclo de desarrollo de las bacterias lcticas en el vino durante la vinificacin y crianza


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1.3 Factores que influyen en la supervivencia ydesarrollo de las bacterias lcticas en el vino

Los factores que influyen en la supervivencia y multi-plicacin de las bacterias lcticas en el vino se pue-den dividir en las tres categoras siguientes:

La composicin fsica y qumica del vino; Los factores asociados a la vinificacin; Las interacciones microbianas entre las bacte-

rias lcticas y otros microorganismos presentesen el vino.

Comentaremos detalladamente los factores especfi-cos, pero por lo que se refiere a la composicin delvino, el pH es uno de los parmetros ms importantesen la determinacin del comportamiento de las bac-terias lcticas en el vino, y tambin ejerce una accinselectiva sobre las cepas de bacterias lcticas que

estarn presentes en el mismo. El pH del vino contri-buye a determinar qu especie bacteriana proliferar,su viabilidad y la tasa de crecimiento de las bacteriaslcticas, la velocidad de degradacin del cido mlico,y el comportamiento metablico de las especies bac-terianas. El pH crtico en el vino es 3.5, pues por deba-

jo de ese umbral resulta ms fcil controlar la micro-biologa del vino. Aunque es ms difcil inducir la FMLcon un pH ms bajo, slo las especies de bacteriaslcticas menos perjudiciales son capaces de desarro-llarse y de llevar a cabo la FML a esos niveles de pH. Eldixido de azufre (SO2) inhibe fuertemente el desarro-

llo de las bacterias lcticas, si bien la sensibilidad delas bacterias lcticas al SO2 vara. El dixido de azufrees ms inhibitorio con un pH bajo. El crecimiento y larealizacin de la FML por bacterias lcticas se inhibenprogresivamente a concentraciones de alcohol supe-riores al 6%, siendo el 14% (v/v) el lmite superior tole-rado por la mayor parte de las cepas. Las bacterias lc-ticas del vino son mesoflicas, y la temperatura ptimapara su crecimiento est comprendida entre 15 y30C. Las temperaturas bajas inhiben fuertementetanto la tasa de crecimiento bacteriano como la velo-cidad de la FML.

Por lo que se refiere a las prcticas de vinificacin, laclarificacin del mosto y del vino puede eliminar granparte de las bacterias lcticas y reducir asimismo laincidencia del desarrollo bacteriano y su efecto sobrela calidad del vino19. Durante la clarificacin, se supri-men algunos nutrientes y partculas en suspensinque estimulan el desarrollo bacteriano. Se ha comuni-cado que los vinos elaborados por termovinificacinson menos aptos a la fermentacin malolctica. Elmomento de la inoculacin de las bacterias malolc-ticas (bacterias lcticas) tambin influye en la cinticade la FML. Por lo que se refiere a las interacciones con

otros organismos del vino, los cultivos mixtos demicroorganismos introducen la posibilidad de rela-ciones antagnicas y sinrgicas, aunque en algunoscasos menores pueden carecer de efecto. En la vinifi-

cacin, existe la posibilidad de una interaccin de lasbacterias lcticas con levaduras, hongos, bacteriasacticas y bacterifagos, as como interacciones entreespecies y cepas de BAL20. El efecto antagnico de lalevadura se ha explicado por la competencia por losnutrientes y la produccin de sustancias que inhibenel desarrollo bacteriano, como SO

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o cidos grasos decadena media. Por otra parte, la levadura puede ayu-dar al desarrollo de las bacterias lcticas en el vino yestimular la FML. Durante el contacto prolongado delas las con el vino, el proceso de autolisis de la leva-dura libera vitaminas y aminocidos en el vino. Estoinduce un enriquecimiento en nutrientes, con la sub-siguiente estimulacin de la fermentacin malolcti-ca. No obstante, Costello21 ha comunicado que el des-arrollo de Pediococcus sspse ve facilitado por la rpi-da muerte celular de Oenococcus oeni, y en condicio-nes de pH alto, el desarrollo temprano delLactobacillus brevis inhibe completamente el des-

arrollo de Oenococcus oeni. Recientemente,Gerbaux31 ha demostrado que las condiciones delvino que estimulan la FML pueden ser capaces deinhibir el desarrollo de la levadura Brettanomycestanperjudicial para el vino.


Aaron Kohr - FOTOLIA


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1.4 Influencia de la fermentacin malolctica en lacomposicin del vino

La FML no consiste en una mera descarboxilacindel cido mlico en cido lctico y CO2. Utilizando elvino como sustrato de crecimiento, las bacteriasmalolcticas eliminan algunos componentes delvino y producen otras a resultas de su metabolismo.La actividad metablica de las bacterias lcticas noslo influye en los componentes aromticos delvino derivados del fruto y de la fermentacin alco-hlica22, sino que adems confiere estabilidad biol-gica al producto final. Por norma general, se fomen-ta el desarrollo de bacterias lcticas cuando senecesita la FML para reducir la acidez del vino. Lareduccin de la acidez es beneficiosa para la calidaddel vino elaborado en regiones vitcolas fras, por-que las bayas presentan naturalmente altas concen-traciones de cidos orgnicos. Las preferencias

actuales de los consumidores de todo el mundo seinclinan por los vinos afrutados de acidez modera-da, lo cual conlleva que la reduccin de los cidosse ha convertido en un aspecto importante para laproduccin de vinos en los climas ms fros. Este

hecho, combinado con los cambios de sabor positi-vos asociados al desarrollo de bacterias lcticas enel vino, hace de la FML un proceso deseable paracasi todos los vinos tintos y para ciertos tipos deblancos. Ahora bien, el desarrollo de bacterias lcti-cas en el vino debe estar rigurosamente controladopara garantizar que se desarrollen bacterias lcticasdeseables que no produzcan sabores desagrada-bles ni compuestos que encierren peligro para lasalud humana. En la mayor parte de los casos, esimportante lograr que la FML concluya rpidamen-te, para ahorrar tiempo de proceso y conseguir unaestabilidad temprana del vino. En ningn caso sedebera confiar en las cepas indgenas de bacteriaslcticas para realizar la FML.

Aparte de producir cido lctico como principal pro-ducto final del catabolismo del azcar23, se sabe quelas bacterias lcticas producen otros compuestos con

incidencia aromtica, entre ellos el acetaldehdo, elcido actico, el diacetilo, la acetona, y el 2,3-butano-diol. El diacetilo, la acetona y el 2,3-butanodiol sonproducto del consumo bacteriano de cido ctrico, ytienen una incidencia considerable en el perfil arom-tico del vino. A bajas concentraciones, estos com-puestos parecen aportar complejidad al aroma delvino. A concentraciones superiores a 5 mg/L, el diace-tilo puede resultar dominante, y conferir al vino unclaro sabor a mantequilla/avellana. Dependiendo delpH y de la oxidacin-reduccin potencial del vino, elcido actico puede ser otro metabolito producido a

partir de la degradacin de cido ctrico por bacteriaslcticas. Tambin se han comunicado mayores con-centraciones de esteres voltiles, de etilactato, y gra-duaciones alcohlicas ms altas en los vinos someti-dos a la FML24. Henick-Kling25 ha descrito las contribu-ciones aromticas de las cepas individuales de bacte-rias malolcticas.

1.5 Alteracin del vino por las bacterias lcticas

La FML no siempre es beneficiosa, y puede causaralteraciones indeseables en las propiedades organo-lpticas del vino. Como se ha mencionado ms arriba,

son varias las especies de bacterias lcticas que pue-den realizar la FML. Cuando la FML se produce con unnivel de pH inferior 3.5, la suele inducir la bacteriaOenococcus oeni y es menos probable que genereolores indeseables, aunque algunas cepas indgenastienen la capacidad de hacerlo. Los olores indeseablesa mantequilla, leche, queso, metal y tierra, as comocantidades excesivas de cido actico suelen ir aso-ciados a fermentaciones malolcticas desarrolladasen vinos con un pH superior a 3.5 y realizadas porpediococci o lactobacilos. Las bacterias lcticas pro-ducen aminas bigenas mediante la descarboxilacin

de aminocidos. Se cree que la histamina, derivada dela descarboxilacin de la histidina, provoca una reac-cin en individuos sensibles si el vino tiene una con-centracin superior a 0.1 mg/L. Se considera que, de



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las diversas bacterias lcticas, Pediococcus sp. yLactobacillus brevisson las que ms histamina produ-cen26. Estos dos gneros se suelen hallar en vinos conun pH superior a 3.5. Por consiguiente, la sntesis deaminas bigenas parece ser importante nicamenteen los vinos con un pH elevado. Si sabe que hay pre-sentes cepas bacterianas capaces de producir aminasbigenas, el productor de vino debe inocular un cul-tivo malolctico iniciador seleccionado por su capaci-dad de sustituir a las bacterias lcticas indgenas. Lasbacterias tienen una ligera capacidad de formar hista-minas, y slo durante su fase de crecimiento activo.No obstante, se ha demostrado26 que incluso una florabacteriana no proliferante puede desarrollar cantida-des considerables de histamina. Por lo tanto, se debeeliminar la poblacin bacteriana de un vino mediantela adicin de SO2 seguida de una clarificacin nadams terminar la FML; esto es especialmente impor-tante en los vinos con un pH alto. Tambin se pueden

producir alteraciones organolpticas indeseables araz del metabolismo de bacterias lcticas indgenas,como por ejemplo coloraciones parduscas, cambiosde color y viscosidad.

1.6 Control de la fermentacin malolctica

Impedir la FML:

Si no se desea la FML, hay que impedir el desarrollo debacterias lcticas en el mosto y en el vino mediante laeliminacin o desactivacin de las bacterias presen-

tes en dichos medios. Aunque en ocasiones puederesultar difcil inducir la FML, impedir el desarrollo debacterias lcticas es igualmente difcil. Dependiendodel pH, la adicin de 50-100 mg/L de SO2 debera des-truir ms del 90% de las bacterias viables presentes. Elefecto del SO2 depende de la acidez del vino: el SO2es ms eficaz con los niveles de pH ms bajos. Porconsiguiente, en vinos con un alto pH, hay que consi-derar la utilizacin de una combinacin de SO2 conlisozimas o la utilizacin de lisozimas solas. Para lainhibicin de la FML se puede utilizar todos los facto-res contrarios a los empleados para favorecer su des-arrollo. Por lo tanto, los parmetros que permiten inhi-

bir la FML son los siguientes:

Maceracin mnima; pH bajo; Bajas temperaturas; Trasiego y clarificacin precoz.

Induccin de la FML:

Los anlisis qumicos y sensoriales han demostradoque las bacterias lcticas influyen en la calidad delvino no slo a travs de la propia FML, sino tambin a

travs de otras actividades metablicas. Si se desea laFML y la produccin bacteriana de compuestos aro-mticos, el productor de vino puede propiciar el cre-cimiento de bacterias lcticas manteniendo condicio-

nes favorables al desarrollo y la supervivencia de lasbacterias, como temperaturas ms clidas, adicinmnima o nula de SO2, y retraso del trasiego. Tambinse puede llevar a cabo una inoculacin cruzada convinos que ya estn experimentando la FML. No obs-tante, los mtodos ms eficaces y recomendables son

o bien la inoculacin en el vino de cepas de bacteriasmalolcticas preparadas en laboratorio o adquiridasen el comercio, o el paso del vino sobre bacteriasmalolcticas activas inmovilizadas. Las bacterias lcti-cas ms recomendables para realizar la FML son lascepas de Oenococcus oeni, porque pueden crecer envinos con pH bajo y pueden degradar el cido mlicosin producir sabores y olores indeseables ni metaboli-tos peligrosos. Adems, no degradan los componen-tes del vino necesarios para la calidad y estabilidaddel mismo, como son el cido tartrico, el etanol o elglicerol19. El crecimiento de la Oenococcus oeniser

lento en los vinos con un pH inferior a 3.1 y, depen-diendo de otros factores inhibidoress del desarrolloas como de la densidad celular inicial, el inicio y laculminacin de la FML se puede retrasar considera-blemente. En las condiciones de crecimiento ms ele-vadas, es decir con un alto pH, las especiesLactobacillusy Pediococcuspueden realizar la FML.La opinin de que dichas especies producen vinosmenos aceptables que aquellos en los que se ha des-arrollado la Oenococcus oeni est generalmenteaceptada27. En algunos vinos, se puede provocar elfracaso de la FML por la inoculacin de un vino que yaest experimentando la FML. Las principales desven-

tajas de este planteamiento son que hay que dispo-ner de un vino adecuado, y que las bacterias conteni-das en el vino inculo pueden no ser adecuadas parasu desarrollo en el vino en donde se inoculan. Y lo quees ms importante, no se conocen bien las caracters-ticas de dichas bacterias. El reconocimiento crecientede la influencia de la FML en la calidad del vino ha lle-vado a los productores de vino a buscar un mayorcontrol sobre la intervencin y el resultado de la FML.La inoculacin de cultivos iniciadores definidos, cui-dadosamente seleccionados en la naturaleza, reduceel potencial de alteracin por otras bacterias lcticas

y/o bacterifagos, garantizando con ello el rpido ini-cio de la FML, un mayor control de la produccin decompuestos aromticos, sabores y olores en el vino28.Se han desarrollado cultivos iniciadores a base de



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diversas bacterias lcticas, y en su mayor parte secomercializan en forma liofilizada o congelada, aun-que tambin se venden algunos cultivos lquidos.Estas cepas se han seleccionado a partir de la FMLespontnea por su buena cintica fermentativa, susresultados en condiciones restrictivas en el vino, y suspropiedades organolpticas deseables. Estas cepastoleran las difciles condiciones de crecimiento ysupervivencia imperantes en el vino y no producenmetabolitos peligrosos. No producen compuestosaromticos que puedan incidir negativamente en lacalidad del vino, sino que, por el contrario, aportancontribuciones organolpticas positivas al sabor delvino. Hasta hace poco, la mayor parte de estos culti-vos iniciadores requeran una fase de aclimatacin oreactivacin en condiciones controladas29.Normalmente, su reactivacin se llevaba a cabo enmosto de uva sin SO2, que se dilua en una proporcinde 1:1 con agua y/o vino. Se ajustaba el pH del mosto

diluido a un nivel de 3.6 o superior, y se aadannutrientes bacterianos a una concentracin de 0.05%w/v. Por lo general, la reactivacin llevaba al menos24 horas, y se evitaba el choque trmico mediante eldesarrollo de las clulas a una temperatura que nodifiriera en ms de 10C de la temperatura del vino alque se iba a aadir el iniciador.

Desde hace poco se comercializan asimismo cultivosiniciadores para la inoculacin directa de las bacteriasen el vino. Estos cultivos iniciadores se han preaclima-tado durante su proceso de produccin para que

sobrevivan a su incorporacin a un medio hostil en elvino sin que disminuya el recuento de clulas viablesni se produzca la subsiguiente prdida de actividadmalolctica. Estas preparaciones de bacterias malo-lcticas se pueden aadir directamente al vino, o sepueden rehidratar en agua durante un breve periodode tiempo antes de su adicin al vino. El objeto de la

fase de rehidratacin consiste en conseguir unamejor distribucin de las bacterias al aadirlas al vino.

Las bacterias malolcticas se pueden inocular en lasfases siguientes de la fermentacin alcohlica:

Simultneamente a la inoculacin de levadura; Durante la fermentacin alcohlica; Hacia el final de la fermentacin alcohlica; Despus de la fermentacin alcohlica.

El mejor momento para la inoculacin de bacteriaslcticas sigue siendo objeto de discusin. En Burdeos(Francia) la opinin consiste en recomendar la inocu-lacin de bacterias lcticas nada ms terminar la fer-mentacin alcohlica, para evitar el riesgo de produ-cir cido actico y D-cido lctico, la llamada piqrelactique(picado lctico)30. En ocasiones, la FML que seproduce durante la fermentacin alcohlica puede

provocar una interrupcin de la fermentacin alcoh-lica. La investigacin no ha confirmado unnimemen-te los resultados franceses referentes al desarrollo deuna alta concentracin de cido actico, al antagonis-mo con la levadura o a la interrupcin de la fermenta-cin alcohlica que se han asociado al desarrollo pre-coz de bacterias lcticas. Se ha abogado por la inocu-lacin de la levadura junto con bacterias lcticas por-que se crea que las bacterias tenan ms posibilida-des de crecer y aclimatarse en ausencia de etanol.

Para controlar con xito el proceso de vinificacin, es

importante comprender los mecanismos reguladoresque rigen el desarrollo y el metabolismo de las bacte-rias malolcticas en el vino. Es importante seleccionarla cepa ms adecuada, elegir el momento ms favora-ble para la inoculacin, garantizar que la cepa de bac-terias lcticas correcta domine la FML y que la FMLculmine en un plazo de tiempo predecible (Fig. 2).


Figura 2.FML controlada


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Referencias

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31. Gerbaux, V. Comunicacin personal.



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LI.2. La prctica

de la

fermentacin

malolctica

Didier THEODORELallemand

2.1 Gestin de la fermentacinmalolctica en bodega

2.2 Determinacin del momento de lainoculacin

2.3 Problemas potenciales2.4 Procedimientos analticos


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Oenococcus oeni, es la bacte-ria lctica identificada comola especie responsable dellevar a cabo la fermentacin

malolctica (FML) en el vino y de hacerimportantes aportaciones a la mejorade la calidad de ste. Incluso en condi-ciones ideales, la FML presenta fasti-diosas exigencias nutricionales, y sedesarrolla muy lentamente. Por ello noresulta sorprendente que las condicio-nes desfavorables para su desarrolloque presenta el vino puedan hacersumamente difcil que se inicie y com-plete la FML. Para que se inicie la FML,

las poblaciones bacterianas deben alcanzar una con-centracin mnima de 106 CFU/mL, y las condicionesfsicas del vino hacen difcil que se cumpla este requi-

sito.

2.1 Gestin de la fermentacin malolctica enbodega

Los factores ms importantes que influyen en el des-arrollo bacteriano en el vino son el alcohol, el SO2, latemperatura y el pH. Las bacterias empiezan a presen-tar signos de inhibicin del desarrollo con una con-centracin de alcohol del 10% aproximadamente. Laconcentracin de SO2 libre se debe mantener lo msbaja posible, para evitar que inhiba an ms el des-

arrollo y la supervivencia de las bacterias lcticas. Lasbacterias lcticas se multiplican a temperaturas com-prendidas entre 18 y 20C, pero su crecimiento se vefuertemente restringido a temperaturas inferiores. Lasbacterias se desarrollan en una horquilla de pH de 3 a4, observndose un crecimiento ms abundante conun pH de 4 que con un pH de 3. La FML se producems fcilmente con un pH ms alto que con un pHms bajo, si bien la presencia de un pH ms altopuede favorecer el desarrollo de cepas de bacteriaslcticas que pueden tener un fuerte impacto negati-vo en la calidad del vino. Es necesario relacionar elefecto de cada uno de estos parmetros en la FML

con el de los parmetros restantes, pues no ejercen suinfluencia individualmente, sino que sta depende dela suma de todos los factores. Por consiguiente, sepuede estimar que el vino no es un medio conducen-te sin esfuerzo al desarrollo de microorganismos. Parasuperar las tensiones naturales del medio que es elvino, con objeto de garantizar el desarrollo de las bac-terias lcticas y una FML completa en ste, se reco-mienda aadir un cultivo bacteriano iniciador. La bac-teria Oenococcus oenies el organismo de eleccin, yes preferible aadir una cantidad concentrada dedicho organismo. Cuando se aade dicho organismo

en cantidades suficientemente importantes, ste seve obligado a crecer y multiplicarse en las condicio-nes del vino, lo cual significa que la FML comenzarsin tener que esperar a que se desarrolle un nmero


I.2. La prctica de la fermentacinmalolctica


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de clulas suficientemente importante. Existen culti-vos comerciales de bacterias lcticas aptos para suinoculacin en el vino. Estos cultivos estn disponi-bles en estado lquido, congelado, o deshidratado porcongelacin. Algunos de los cultivos deshidratadospor congelacin han sido adaptados biofsicamentepara resistir los rigores del medio del vino, y se pue-den aadir directamente al vino sin necesidad depasar por una fase de activacin. Los dems tipos decultivo iniciador requieren fases de activacin y multi-plicacin previas a su introduccin en el vino. Esteproceso exige pasar por varias etapas planificadas, yconlleva mucho trabajo. Si se realiza correctamente,normalmente garantiza una FML completa, inclusoen los vinos ms difciles, pues los cultivos lcticos ini-ciadores han sido seleccionados por su resistencia alas condiciones adversas del vino. Cuando se utilizancultivos que se pueden inocular directamente en elvino, o que slo requieren una fase de desarrollo, la

intencin es inocular una poblacin bacteriana mni-ma de 106 CFU/mL sin depender del desarrollo de lasbacterias lcticas del propio vino para alcanzar dichaconcentracin.

La investigacin ha permitido conocer mejor la nutri-cin bacteriana y la influencia del vino en el desarrollode bacterias lcticas y la nutricin de las levadurasdurante la fermentacin alcohlica. Se ha demostradoque las levaduras con grandes necesidades nutricio-nales durante la fermentacin alcohlica agotan rpi-damente los factores de crecimiento del mosto nece-

sarios para el desarrollo de la bacteria lctica justocuando se desea la FML. El fenmeno se puede produ-cir en todos los mostos de uva, pero resulta especial-mente problemtico en las uvas de varietales con uncontenido de nutrientes naturalmente bajo. Estainvestigacin ha desembocado en la recomendacinde aadir nutrientes bacterianos despus de la fer-mentacin alcohlica con objeto de ayudar a la inicia-cin y culminacin de la FML. Es imprescindible garan-tizar una nutricin adecuada y suficiente de los hon-gos de fermentacin as como de las bacterias lcticas.

2.2 Determinacin del momento de la inoculacin

Es imperativo inocular el vino con un cultivo malolc-tico iniciador que presente una concentracin depoblacin de 106 CFU/mL para garantizar una presen-cia de clulas bacterianas suficiente para degradar elcido mlico. Si la fermentacin alcohlica se inicia yconcluye rpidamente, la degradacin del cido mli-co por la bacterias lcticas no suele provocar una aci-dez voltil (AV) extrema. Cuando se observan cantida-des excesivas de AV, stas suelen ser consecuencia dela presencia y crecimiento de bacterias indgenas, contoda probabilidad introducidas en el vino debido a

una combinacin de condiciones sanitarias deficien-tes y elevado pH del vino. Estas bacterias indgenas sedesarrollan en el vino utilizando el azcar como fuen-te de energa, y produciendo cido actico.

La investigacin ha demostrado que cuando se com-prenden las interacciones entre la levadura de fer-mentacin y la bacterias lcticas, la inoculacin de uncultivo malolctico iniciador en diversos momentosde la fermentacin alcohlica puede dar buenosresultados. Ahora bien, dependiendo de los procesosde vinificacin utilizados microoxigenacin, termo-vinificacin o maceracin prolongada la FML sepuede retrasar hasta el final de la fermentacin alco-hlica. En esos casos, los responsables pueden ser laadicin de SO2, la clarificacin del vino y los regme-nes de refrigeracin.

En presencia de vinos con un elevado pH, puederesultar beneficioso una adicin precoz de lisozima,una enzima especficamente dirigida a las bacteriasGram+. Si se controla estrictamente el momento delaporte, la adicin ulterior del cultivo malolctico ini-ciador deseado se puede llevar a cabo ms tarde. La

introduccin de iniciadores de cultivo malolcticocomerciales ha permitido a los vinificadores integrarmejor sus procesos de vinificacin gracias a la gestinde la FML.




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2.3 Problemas potenciales

A veces, en lugar de mejorar el vino, las bacterias lc-ticas pueden provocar cambios indeseables. Durantela FML ocurrida naturalmente y sin control, realizadapor cepas indgenas de Lactobacillusy Pediococcus,se puede producir una alteracin de las propiedadesorganolpticas del producto. Concretamente, sepuede formar un exceso de AV o de diacetilo. Ademsde velar los sabores afrutados primarios del vino,estos compuestos tambin pueden aportar caracte-res indeseables a su aroma. Por ejemplo, los AV sonirritantes para la nariz y provocan un sabor agrio. Eldiacetilo puede aportar un sabor almendrado ocaractersticas que pueden evocar el caramelo, lalevadura e incluso el pelo de animal mojado. Los aro-mas y sabores indeseados generados por el desarro-llo de organismos de putrefaccin pueden producircaractersticas similares al yogur cido, la mantequilla

rancia y el sudor. En los vinos tintos, los fenoles volti-les pueden producir olores a establo, y en los blancos,los mismos componentes pueden provocar la apari-cin de olores a antisptico. Esos olores pueden iracompaados de amargor y de taninos metlicos enel paladar. La proliferacin incontrolada de microor-

ganismos indeseados puede generar compuestossecundarios, entre ellos, alergenos tales como aminasbigenas (histamina, putrescina y cadaverina), y com-puestos potencialmente cancergenos como el car-bamato de etilo y la ocratoxina A.

2.4 Procedimientos analticos

La accin ms obvia de la FML es la descaboxilacindel cido mlico del vino, y siempre provoca una dis-minucin de la acidez total y un incremento del pH.La forma ms fcil de seguir el avance de la FML con-siste en realizar anlisis qumicos para detectar la des-aparicin del cido mlico. A continuacin se descri-ben algunos de los mtodos ms utilizados.

Cromatografa en papel

Es una tcnica cromatogrfica cuantitativa utilizada

para realizar un seguimiento visual de la desaparicindel cido mlico. No es precisa, pero s fcil de utilizaren bodega.

Tcnicas enzimticas

Esta tcnica es ms compleja y costosa, pero resultamuy precisa. Utiliza el anlisis qumico para determi-nar la concentracin absoluta de cualquier cidoorgnico en el mosto. Durante la FML, el L-cido mli-co se convierte especficamente en L-cido lctico, demodo que se puede utilizar la medicin de la concen-

tracin de L-cido lctico como indicador del iniciode la FML. Por lo general, cuando la concentracin deL-cido lctico alcanza 200-300 mg/L, se puede supo-ner con seguridad que se ha iniciado la FML.Normalmente, se considera que la FML ha concluidocuando la concentracin de cido mlico baja a valo-res de entre 100 y 200 mg/L.

Recuentos microbiolgicos

Esta tcnica asla y cuenta el nmero de bacterias lc-ticas presentes en el vino. Su tasa de crecimiento esmuy lenta, de modo que puede llevar hasta siete das

determinar el nmero de Oenococcus oeniviables. Latasa de crecimiento de bacterias indeseables, comoLactobacillus y Pediococcus, es ms alta, de modoque el recuento de estos organismos se puede obte-ner en un plazo de dos das.

Observacin microscpica

Este mtodo se basa en la observacin directa de unvino mediante un microscopio de buena calidad. Noes cuantitativo, pero si lo aplica un tcnico con expe-riencia, proporciona una evaluacin rpida y valiosa

de la microflora presente en el vino.



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BI.3. Bacterias

lcticas y

fermentacin

malolctica

Aline LONVAUD-FUNELFacult denologie. Universit victorsegalen bordeaux 2

3.1 Las bacterias lcticas: generalidades3.2 Principales metabolismos en el vino3.3 Vas de utilizacin de ciertos

aminocidos3.4 Metabolismos de alteracin3.5 Lugar de las bacterias lcticas en el

ecosistema microbiano de la uva-vino

3.6 Conclusin


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3.1 las bacterias lcticas:generalidades

L

as bacterias lcticas (BL) sonmicroorganismos comunes ennumerosos entornos. Estn pre-sentes en gran nmero de

vegetales y en la leche, y participan enla elaboracin de todo tipo de produc-tos fermentados, bebidas y alimentos.Las BL del vino son muy parecidas a lasde la sidra, con las que presentan gran-des similitudes en cuanto a materiaprima y proceso de elaboracin. Por lotanto, la especie Oenococcus oeni

desempea el mismo papel en sendos medios. Enotras bebidas o verduras fermentadas, hay mayor pre-sencia de lactobacilos, lactococos y estreptococos,

que son los encargados de realizar las transformacio-nes.

- Definicin

Las BL son bacterias de coloracin Gram positiva. Estasencilla prueba de color permite distinguirlas rpida-mente de las bacterias acticas, Gram negativas, quetambin estn siempre presentes en el mosto y en elvino. Todas las BL producen cido lctico a partir delos azcares. Cultivadas en un medio que contengaglucosa y todos los dems nutrientes imprescindibles

para su desarrollo, se multiplican en el mismo acidifi-cndolo intensamente.

- Clasificacin

La forma de las clulas es bien visible tras una pruebade coloracin Gram. Es redondeada en el caso de loscocos y alargada en el de los bacilos. En el entornoenolgico, existen cocos y bacilos. La va metablicade fermentacin del azcar es el criterio que permiteclasificar a las BL como bacterias homofermentativasy heterofermentativas. Las primeras producen exclusi-vamente cido lctico a partir de la glucosa, y las otras

forman asimismo cido actico, etanol y CO2 comoprincipales metabolitos.

Algunas BL se comportan como homofermentativasen condiciones de cultivo ptimas, pero como hete-rofermentativas en otras condiciones. Esas bacterias, adiferencia de las homofermentativas estrictas, fer-mentan las pentosas por la misma va que las hetero-fermentativas. Son heterofermentativas "facultativas".Hasta ahora, no se ha descrito en el vino ningn lac-tobacilo homofermentativo estricto. Las especiesidentificadas se clasifican entre los cocos y bacilos

heterofermentativos, y los cocos homofermentativos.


I.3. Bacterias lcticas y fermentacinmalolctica


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- Identificacin

Los mtodos clsicos de identificacin se basan en laobservacin de varios caracteres (denominadoscaracteres fenotpicos). La clasificacin de una cepa sedetermina en funcin del parecido de esos caracteres

con los de las cepas tipo. Las pruebas de identifica-cin se realizan sobre aislamientos puros, es decirsobre bacterias aisladas tras su cultivo en medio nutri-tivo gelificado.

Las colonias aisladas se vuelven a poner en cultivocon glucosa como nico azcar para determinar eltipo fermentativo (heterofermentacin/homofer-mentacin). Despus, en las mismas condiciones, sesustituye la glucosa por otros azcares diversos, hexo-sas, pentosas y osas varias, que permiten obtener elperfil bioqumico. En funcin de su capacidad demetabolizar tales o cuales azcares, las bacterias se

clasificarn dentro de una u otra especie. El mtodoms cmodo de clasificacin consiste en utilizar lasgaleras "API 50CH" en las cuales se miniaturiza unacuarentena de pruebas en una misma placa. La iden-tificacin se lleva a cabo cotejando el resultado detodas las pruebas con las claves facilitadas en elmanual de clasificacin de Bergeys. Aunque el mto-do sea sencillo, lleva mucho tiempo, pero lo peor esque a veces los resultados son ambiguos.

En lo sucesivo la identificacin se basa en el anlisisdel ADN, es decir en el verdadero patrimonio genti-

co de la clula, y no en su reflejo a travs de caracte-res fenotpicos ms o menos fciles de poner en evi-dencia. Existen varios mtodos disponibles, el msseguro consiste en secuenciar una parte del genoma

muy caracterstico de la especie, correspondiente alos genes que codifican el ribosoma esencial de laclula, es decir el ARN 16S. Esta regin contiene par-tes muy conservadas en todas las bacterias de unamisma especie, as como otras variables en funcinde las cepas. Basndose en este principio, el mtodo

de PCR permite identificar un aislamiento consideran-do la regin conservada en la especie. Consiste enestudiar esa regin por amplificacin gentica, eli-giendo "inicios" cuya la secuencia es especfica de laespecie. La identificacin tambin se puede llevar acabo mediante hibridacin del ADN con una sondaespecfica. Por ltimo, a nivel de la cepa, el mtodoms seguro consiste en analizar el perfil genticogenerado por la hidrlisis del cromosoma bacteriano.

Todos estos mtodos se utilizan para identificar cepasaisladas por cultivo en un medio nutritivo, aunquetambin se puede hacer inventario de las bacteriaspresentes en una mezcla como el vino o el mosto de

uva, sin cultivo previo. El mtodo (PCR-DGGE) se basaen la diferencia de migracin de ADN 16S en funcinde las especies.

Figura 2.Hibridacin de

colonias con lasonda de ADN

genmico

Oenococcus oeni


Oenococcus oeni Pediococcus damnosus Lactobacillus brevis

Figura 1.Fotografias de bacterias aisladas del vino, tomadas al microscopio electrnico

Especies ms comunes de bacterias lcticas del vino

Lactobacilos Heterofermentativo facultativo Lactobacillus plantarum -L. casei

Lactobacilos Heterofermentativo L. brevis, L hilgardii

Cocos Homofermentativo Pediococcus parvulus, P. damnosus

Cocos Heterofermentativo L. mesenteroides, O. oeni


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3.2 Principales metabolismos en el vino

- Fermentacin de los azcares

Los azcares son las principales fuentes de energapara el crecimiento de las bacterias. Dependiendo delas especies de lactobacilos y de cocos, se fermentanbien por va de la glicolisis (homofermentacin) bienpor la va de las pentosas (heterofermentacin); sinembargo, slo esta ltima genera el cido actico queincrementa la acidez voltil del vino. No obstante, enuna vinificacin normal, sin incidentes, cuando semultiplican las BL, en el medio slo persisten los az-

cares sin fermentar por las levaduras. Por lo general, setrata de algunas centenas de mg/l de glucosa y defructosa, y de las pentosas del zumo de uva (arabino-sa, xilosa).

Figura 4.Distintas vas de fermentacin de los azcares por las BL

Los azcares residuales son suficientes para suminis-trar la energa necesaria para el crecimiento de las BL

y permitir la formacin de la biomasa que posterior-mente lleva a cabo la fermentacin malolctica (FML).La produccin de acidez voltil es siempre muy limi-tada, y slo llega a cobrar importancia en caso de inci-

dentes en la fermentacin alcohlica, si la competen-cia entre levaduras y bacterias se inclina a favor deestas ltimas, o si la fermentacin se desacelera o seinterrumpe por otros motivos. En esa situacin, se fer-mentan varios gramos de hexosas por litro, y la acidezvoltil aumenta sensiblemente. Es el llamado picadolctico. Este incidente es especialmente de temercuando tanto el pH de la vendimia como la concen-tracin de los azcares son muy altos.

- Transformacin del cido mlico

Es la reaccin principal de la FML. Qumicamente,consiste en la mera descarboxilacin del cido L-mli-co del vino en cido L-lctico. Bioqumicamente, es elresultado de la actividad de la enzima malolctica,caracterstica de las BL. Esta transformacin tiene undoble efecto. Por una parte, desacidifica el vino, esdecir eleva el pH, tanto ms cuanta ms alta fuera la

cantidad inicial de cido mlico. Por otra parte, tam-bin suaviza el vino, al hacer desaparecer el saborcido y duro del cido mlico y sustituirlo por el saborms suave del cido lctico.

Esta es la reaccin principal que hace que la FMLmodifique muy sensiblemente los caracteres organo-lpticos del vino, y el motivo por el cual la segundafermentacin resulta especialmente recomendablepara la mayor parte de los vinos tintos y muchos blan-cos. La duracin de la transformacin del cido mli-co depende de la cantidad inicial de cido ste y del

nivel de poblacin total de la bacteria que haya con-seguido multiplicarse en el vino. Sin embargo, parauna misma biomasa formada, se puede desacelerarcomo consecuencia de ciertos inhibidores del vino,que de momento todava no estn bien identificados.El pH, el grado alcohlico, la temperatura y la concen-tracin de dixido de azufre son los principales par-metros que controlan el crecimiento y el nivel de lapoblacin total.

- Degradacin del cido ctrico

Mientras que, antes de la FML, el vino contiene varios

g/l de cido L-mlico, por lo general slo contieneentre 200 y 300 mg/l de cido ctrico. Ahora bien, aun-que su concentracin sea baja, el cido ctrico tieneuna gran importancia, pues su va metablica condu-ce por una parte a cido actico, es decir a un aumen-to de la acidez voltil, y por otra parte a las molculasacetonicas, la ms importante de las cuales es el dia-cetilo. Este compuesto aromtico, que tiene un olor amantequilla, se detecta fcilmente en la cata desdeconcentraciones relativamente bajas, del orden de 5-6 mg/l en los vinos blancos y 8-9 mg/l en los vinos tin-tos. Por debajo de ese umbral, el diacetilo contribuye

al bouquet del vino y a su complejidad. Por encima,puede llegar a resultar francamente desagradable. Noobstante, para algunos vinos s que se busca esa notamantecosa.


Figura 3.Perfil genmico de cepas de O. oeniaisladas en una cuba durante la FML


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Figura 5.Va de degradacin del cido ctrico por las bacterias lcticas

El diacetilo se puede reducir a acetona debido a lasactividades enzimticas de las bacterias, y tambin delas levaduras, de manera que si se prolonga el contac-to del vino con las las, disminuye su concentracin.Esa puede ser una buena manera de suprimir un

exceso. Por el contrario, el trasiego precoz permiteconservarlo.

La degradacin del cido ctrico es un carcter muycomn de las bacterias del vino, si bien es ms lentaque la del cido mlico. Por ello, a veces al final de laFML el vino todava contiene la mayor parte del cidoctrico inicial. No obstante, la observacin general esque incluso despus de la adicin de azufre, la activi-dad bacteriana contina y la concentracin final delvino acaba por ser nula. El aumento del cido acticoobservado durante y en ocasiones despus de la FML

se debe a esta degradacin.

3.3 Vas de utilizacin de ciertos aminocidos

- Degradacin de la arginina

La mayor parte de los lactobacilos del vino y numero-sas cepas de O. oenicatabolizan la arginina del vino.Es uno de los aminocidos ms importantes, y en elvino, despus de la FA, procede sobre todo del meta-bolismo de las levaduras y de su autolisis.

La va de degradacin es la de la arginina deiminasa.

Consta de tres etapas, catalizadas por tres enzimascuyos genes se han caracterizado en la O. oeni. El an-lisis de un gran nmero de cepas de esta especie per-mite concluir que estos genes estn situados en unaregin del cromosoma presente o ausente en su tota-lidad, dependiendo de las cepas. Incluye asimismo losgenes que codifican las protenas de transporte de laarginina. Como esta va metablica suministra energaa las bacterias, las cepas que poseen todos los genestienen una ventaja sobre las dems, algo que puederesultar importante para su supervivencia o su creci-miento.

A nivel enolgico, la consecuencia es la formacin decitrulina, precursor del carbamato de etilo. Sin embar-go, las concentraciones formadas son dbiles, y la

fuente principal de carbamato de etilo sigue siendo laurea producida por la levadura durante la fermenta-cin alcohlica.

- Descarboxilacin de ciertos aminocidos

Las BL pueden producir aminas bigenas por la merareaccin de descarboxilacin de los aminocidoscorrespondientes. La histamina y la tiramina son lasprincipales aminas cuya concentracin aumentadurante y despus de la FML. Se forman a partir de lahistidina y de la tirosina respectivamente. Las enzimasdescarboxilasas necesarias para esas transformacio-nes se han purificado y estudiado en bacterias lcticasdel vino. Son muy frecuentes en los lactobacilos hete-rofermentativos (L. brevisy L. hilgardii), si bien tam-bin se han aislado cepas de O. oeniproductoras dehistamina.

Los genes que codifican la histidina y la tirosina des-carboxilasas han sido secuenciados y bien localizadosdentro de un conjunto de genes que tambin inclu-yen los que codifican las protenas de transporte queintercambian el aminocido y la amina al nivel de lamembrana celular. La capacidad de producir aminasbigenas es totalmente dependiente de la presenciade dichos genes. Por lo tanto, si se detectan esosgenes en la poblacin, eso significa que el riesgo deproduccin de amina bigena es alto, en caso de quese multipliquen esas bacterias en concreto.

Figura 6.Esquemas de los sistemas de produccin de histamina y tiramina

por las BL del vino.



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A partir de esta observacin, se ha desarrollado unaprueba basada en la amplificacin de estos genes porPCR. Si la prueba da positivo antes de la FML, consti-tuye una buena indicacin para la utilizacin de leva-duras malolcticas. En efecto, aunque no se pueda eli-minar las bacterias indeseables, se puede frenar sucrecimiento mediante una siembra masiva de O. oeniseleccionadas. Luego, desde el momento en que sehaya degradado el cido mlico, se puede realizar unsulfitado adecuado que permitir reducir an ms supoblacin, y por ende su actividad. Si la prueba dedeteccin de las bacterias productoras de aminasbigenas da positivo despus de la FML, indica lanecesidad de sulfitar rpidamente y lo ms eficaz-mente posible, pero tambin de evitar el contactoprolongado con las las. Durante la crianza de estosvinos, ser necesario vigilar la microflora lctica.

- Metabolismo de los aminocidos azufrados

La cistena y la metionina son metabolizadas por lasbacterias que forman compuestos azufrados diversos,entre ellos el hidrgeno sulfurado y el metano-tiol,poco apreciados.

El metabolismo de la metionina est mejor estudiado,y conduce, adems del metanotiol y del sulfuro dedimetilo, a molculas ms complejas de probada inci-dencia organolptica. Las bacterias lcticas del vinoproducen estos compuestos, metionol y cido metil-3-sulfanilo propinico pero la O. oeni es la que los

produce en mayores cantidades. Su concentracinaumenta durante la FML, y podran figurar entre lasnumerosas molculas aromticas que participan en elcambio complejo del aroma de los vinos por influen-cia de las BL.

3.4 Metabolismos de alteracin

- Degradacin del glicerol

El glicerol es un componente fundamental del vino,formado por las levaduras. La mayora de las veces no

queda metabolizado despus de la fermentacinalcohlica. Sin embargo, algunas cepas de lactobaci-los disponen de una va especial que conduce al 1,3propanodiol. La primera etapa la cataliza la glicerol-deshidratasa, y produce 3 hidroxi propionaldehdo,que se reduce inmediatamente a 1,3 propanodiol. Sinembargo, una cantidad muy reducida del aldehdoescapa a la reduccin, y forma acrolena, con unadoble incidencia en la calidad del vino: por una partedesaparece el glicerol, a veces completamente, y porotra parte, la acrolena, incluso en reducidas cantida-des, se combina con los polifenoles del vino y forma

molculas de sabor amargo. Es la enfermedad delamargor.

Figura 7.Deteccin por PCR de las bacterias productoras de amargor en el

vino

-Produccin de glucano

Durante la FML, las BL forman exopolisacridos en elvino. De momento, todava no se conocen bien, yprobablemente participan en reacciones con losdems compuestos del vino. Sin embargo, algunassintetizan un glucano muy particular, que tiene la pro-

piedad de incrementar considerablemente la viscosi-dad del vino, incluso a una concentracin relativa-mente dbil. Es la enfermedad de la grasa o de losvinos ahiladosque en ocasiones sobreviene en cubao en barrica, pero tambin con gran frecuencia enbotella. Hasta ahora, las bacterias aisladas ms amenudo en estos vinos alterados se han identificadocomo Pediococcus parvuluso P. damnosus, pero slose trata de cepas concretas de estas especies, bienadaptadas para crecer en el vino. Esas cepas poseenun gen particular que codifica una enzima implicadaen la sntesis del glucano. Se pueden detectar con la

prueba PCR apropiada.

Figura 8.Deteccin por hibridacin ADN/ADN de bacterias de la

enfermedad de la grasa. (Izda. Todas las colonias cultivadas a

partir de una muestra de vino. Drcha. Slo se revelan las

colonias de la enfermedad de la grasa)

Los vinos afectados por la enfermedad de la grasa notienen por qu presentar ms defecto que su viscosi-dad. En ese caso, se pueden tratar para recuperarlos.Una accin mecnica por batido o fragmentacin delvino que permite recobrar una viscosidad adecuada.Despus, la estabilizacin debe recurrir a procedi-mientos muy eficaces, como el tratamiento trmico yla filtracin esterilizante, con un sulfitado adecuado

para suprimir cualquier riesgo de desarrollo ulteriorde las bacterias perjudiciales.



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3.5 Lugar de las bacterias lcticas en el ecosistemamicrobiano de la uva-vino

En el mosto de uva, las BL forman parte del complejosistema de mltiples especies de levaduras y bacte-rias. Inicialmente, estn presentes en la superficie dela baya, aunque muchas veces son difciles de aislaren la via. En la vendimia recin recogida, prensada yencubada, la poblacin de BL es del orden de 102 a104 UFC/mL. Vara en funcin de las condicionesmeteorolgicas durante los ltimos das de la madu-racin. En realidad, depende de las innumerablesinteracciones entre las decenas de especies de otrosmicroorganismos que colonizan el medio, en lasuperficie de la uva, y despus en la uva reventadapor el prensado.

En las condiciones habituales de vinificacin, que lamayor parte de las veces suponen un sulfitado de la

vendimia, la poblacin de BL deja muy rpidamentepaso a las levaduras que desencadenan la fermenta-cin alcohlica (FA). En un medio cuya composicinqumica cambia constantemente y donde todos losmicroorganismos luchan por desarrollarse, general-mente las BL consiguen multiplicarse de forma muytransitoria, tras lo cual entran en regresin hasta elfinal de la FA. En ese momento, su poblacin esmucho ms reducida que las de las levaduras, y sunivel depende en buena medida del pH y del gradoalcohlico del vino. En condiciones difciles, de pHrelativamente cido (pH 13 %) muchas veces la poblacin esinferior a 102 UFC/mL. Por el contrario, puede rebasar104 UFC/mL en las condiciones opuestas, sobre todosi el pH es > 3,5. Esta es la poblacin que deber mul-tiplicarse para iniciar la FML.

Un fenmeno muy importante que se desarrolladurante la FA, es la seleccin de las bacterias de laespecie O. oeni. En la gran mayora de los casos, lasbacterias de esta especie son las nicas que invadenel medio despus de la FA para realizar la FML. Laseleccin natural operada entre una mezcla muyvariada de especies de BL presentes en el mosto se

lleva a cabo por efecto del cambio de composicindel medio. Inicialmente se identifican lactobacilos ycocos pertenecientes a una decena de especies dis-tintas. Luego, muchos de ellos desaparecen progresi-vamente, o al menos se vuelven muy minoritarios,dejando que la O. oenicolonice el medio.

No se conocen con precisin los mecanismos de estaseleccin. Sean cuales fueren, el hecho es que la O.oenise adapta mejor que las dems especies al cam-bio del entorno. Adems de la acidez del medio, estasbacterias soportan mejor que las dems las posiblescarencias nutritivas y la toxicidad creciente resultantedel metabolismo de las levaduras.

Cuando ha cesado por completo la actividad de laslevaduras o a veces incluso antes, la poblacin de BL,compuesta principalmente de O. oeni prosigue suadaptacin al medio, y, dependiendo de los factores

limitativos con que se enfrente, desencadena un ver-dadero crecimiento, que puede ser muy rpido, cues-tin de das o semanas. Finalmente, esta biomasacobra entidad suficiente para que se observe ladegradacin del cido mlico. Ese es el verdaderocomienzo de la FML. Mientras quede cido mlico pordegradar, contina la actividad, y la biomasa se man-tiene elevada. Cuando todo se ha transformado, labiomasa se elimina por el sulfitado, que pone puntofinal al proceso de vinificacin. Entonces hay queestabilizar el vino de cara a cualquier desarrollo micro-biano, pues va a empezar la crianza, que en principio

no representa ms que transformaciones de tipo fisi-coqumico.

La mayora de las veces, el sulfitado elimina masivamen-te la poblacin de O. oenique ha llevado a cabo la FMLpero no consigue librar totalmente al vino de todas lasbacterias. En ese momento, la microflora puede ser denuevo totalmente mixta, y compuesta de diversas espe-cies de lactobacilos y de pediococos adems de O. oeni.El sulfitado reduce la poblacin total, pero algunascepas especialmente resistentes a las condiciones cadavez ms hostiles se seleccionan espontneamente,pudiendo originar alteraciones bacterianas.


Recuento de bacterias lcticas durante la vinificacin de Cabernet Sauvignon (UFC ml-1)

EspeciesDas

0 3 6 10 18

nococcus ni Nd Nd Nd 4.3x103 3.4x106

Leuconostoc mesenteroides 2.9x102 1.7x104 9.6x104 3.2x103 Nd

Pedicoccus damnosus 6.0x102 3.8x104 3.7x104 4.9x103 Nd

Lactobacillus hilgardi 1.1x103 8.0x104 4.0x104 4.4x103 Nd

Lactobacillus brevis Nd 2.0x104 4.5x104 Nd Nd

Lactobacillus plantarum 7.5x101 2.0x104 Nd Nd Nd

Lactobacillus casei 7.7x10

1

2.0x10

4

Nd Nd NdTotal 2.5x103 1.7x105 1.5x105 1.8x104 3.4x106

Nd: non dtcte

Tabla 1. Recuento de BL durante la vinificacin de Cabernet Sauvignon


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3.6 Conclusin

La vinificacin es el resultado de fenmenos espont-neos ligados al crecimiento de las levaduras y bacte-rias en el vino. Sin embargo, el productor de vinodesea controlar cada vez ms completamente losprocesos fermentativos. Elige no slo el momento deinicio de las fermentaciones alcohlica y malolcticas,sino tambin el tipo de microorganismos encargadosde llevarlas a cabo. Por ello se practica cada vez msla siembra de levaduras, con un objetivo no slo derapidez y exhaustividad de fermentacin de los az-cares, sino tambin de aporte o de refuerzo de notasaromticas concretas en ciertos vinos. Para la FML, lademanda es idntica, si bien persisten dificultades decontrol del fenmeno. El primer problema es la dbiltasa de supervivencia de las BL en el vino, o incluso enel mosto en caso de inoculaciones precoces ("inocu-lacin conjunta" con las levaduras). La eficacia de las

levaduras propuestas ha mejorado mucho durantelos ltimos aos, aunque siguen producindose algu-nos fracasos. El segundo problema, si bien de menorimportancia, es la falta de control sobre el impactoorganolptico de las cepas implantadas. Si bien escierto que las cepas de O. oenipueden tener una inci-dencia significativa en los caracteres sensoriales delvino, muchas veces tambin resulta imprevisible, yparece depender mucho del propio vino.

El inters de los productores de vino, de los enlogos,de los industriales de la fermentacin y de los cientfi-cos por las BL no deja de acrecentarse. Los progresosalcanzados tanto en materia de vinificacin espont-nea como de vinificacin controlada por levadurasmalolcticas son buena prueba de ello. Los conoci-mientos y herramientas de investigacin se afinan, yse aplican a una mejor utilizacin de la diversidadnatural de la especie O. oeni.



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Rndice

II.

Requerimientosy factores de lafermentacin

malolcticaII.1. Necesidades nutricionalesDr. Sibylle KriegerLallemand

II.2. Fermentacin malolctica en barrica.Piet LoubserLallemand

II.3. Gua para resolver problemas-aplicacin prctica-Annamarie kyne

LallemandSigrid Gertsen-BriandScott Laboratories

3341

47

33

41

47


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NII.1.Necesidadesnutricionalesde la bacteriamalolctica

Dr. Sibylle KRIEGERLallemand

1.1 Hidratos de carbono1.2 Compuestos nitrogenados1.3 Vitaminas, minerales y otros

factores de crecimiento1.4 cidos orgnicos1.5 Disponibilidad de nutrientes

determinada por las prcticas devinificacin

1.6 Formulacin de nutrientes

malolcticos


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33

Durante mucho tiempo secrey que la degradacin delcido mlico en cido lcticoera la fuente de energa que

permita el desarrollo de la bacteriamalolctica (BML) en el vino1. Radler2

refut esa teora, al demostrar que enun medio sinttico, la proliferacin delas bacterias lcticas (BL) depende dela presencia de hidratos de carbonofermentables. Por lo general, las BL delvino son conocidas como microorga-nismos especialmente fastidiosos porsus complejas necesidades nutriciona-les. El apartado siguiente presenta las

diversas necesidades nutricionales de las BL del vinoen general, y de la Oenococcus oenien particular.

1.1 Hidratos de carbono

Las condiciones de desarrollo durante la fermenta-cin malolctica (FML) del vino son muy difciles paralas BL. Durante la FML, se degradan de 0,4 a 0,8 g/L deazcares, consistentes en su mayor parte en glucosa yfructosa, que son las principales fuentes de energapara el desarrollo bacteriano3. Radler4 ha calculadoque para la degradacin de 1 g/L de cido mlico sonnecesarios aproximadamente 0,01 gramos de bacte-rias, y que 0,1 g de glucosa suministra energa sufi-ciente para producir esta cantidad de biomasa.

Prcticamente todos los vinos contienen estos azca-res en cantidad suficiente para alimentar un desarro-llo bacteriano que alcance para garantizar una FMLcompleta, pero se ha demostrado que la FML sepuede inhibir en los vinos cuyas concentraciones deglucosa y fructosa suman un nivel inferior a 0,2 g/L 5.La Oenococcus oenies heterofermentativa y convier-te la glucosa en idnticas cantidades de D-cido lcti-co, CO2 y cido actico (o etanol). Casi todas las cepasde BML fermentan la glucosa y fructosa, y la mayorparte de ellas prefiere la fructosa a la glucosa, es decirque son fructoflicas. Cuando se desarrollan a partir dela fructosa como nica fuente de carbono, parte de

este azcar se convierte en manitol, que produce unmol adicional de ATP, y dbiles concentraciones decido actico. No obstante, si hay un exceso de mani-tol presente en el vino, se puede producir un proble-ma denominado alteracin por manitol. Se caracteri-za por un incremento de la produccin de cido ac-tico y la aparicin de un sabor agridulce. Este fenme-no se aborda ms detalladamente en el captulo titu-lado Defectos organolpticos causados por una FMLdescontrolada.


II.1. Necesidades nutricionales de labacteria malolctica


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34

La mayor parte de las BL del vino son capaces dedegradar las pentosas arabinosa y xilosa durantesu crecimiento6. Los compuestos glicsidos presentesen el vino pueden ser todos ellos substratos para eldesarrollo de BL, y Rosi et al.8 han demostrado el efec-to positivo de los polisacridos producidos por leva-duras (manoprotenas) en el inicio y la aceleracin dela FML. La mayor parte de las cepas de la FML desea-da, Oenococcus oeni, son capaces de producir -glico-sidasas7 y se pueden distinguir de otras cepas de BLpor su incapacidad de fermentar la sacarosa, la lacto-sa y maltosa.

1.2 Compuestos nitrogenados

Las BL requieren un suplemento extensivo de amino-cidos, purinas, pirimidinas, vitaminas y minerales9, locual significa que el contenido de nitrgeno del vinopuede variar significativamente durante la FML10. Las

necesidades de aminocidos especficos difieren deuna cepa de BL a otra. La Oenococcus oeni y laPediococcus pentosaceusaisladas en el vino puedennecesitar hasta 16 aminocidos distintos11, pero nopueden utilizar fuentes de nitrgeno inorgnicas,como el fosfato diamonio. La Oenococcus oeni, comodemostraron Fourcassie et al.13, presenta una necesi-dad absoluta de los aminocidos arginina, cido glu-tmico, triptfano e isoleucina, y necesita otros seisaminocidos para su desarrollo ptimo. Lallemand haestudiado las necesidades de nitrgeno de cuatrocepas comerciales de BL y de una cepa de laboratorio

de las BL Oenococcus oeni en colaboracin con elgrupo de Jean Guzzo, y compar los resultados conotros dos estudios descritos en la literatura13. De untotal de 13 aminocidos, siete eran imprescindiblespara el desarrollo. El cido glutmico era imprescindi-ble para todas las cepas de los tres estudios, y lametionina, serina, fenilamina y tirosina resultaron vita-les para la mayor parte de las cepas. La alanina, glici-na y prolina ejercen un efecto menor en el crecimien-to de la Oenococcus oeni, mientras que la valina, leu-cina, triptfano, isoleucina, histidina y arginina se pue-den describir como en cierta medida imprescindibles,pues resultan necesarios para la mayor parte de las

cepas de Oenococcus oeniy son necesarios, pero noimprescindibles, para las dems14. Se han confirmadolas necesidades cuantitativas de cada aminocido, yes suficiente una concentracin inferior a 2 mg N/Lpara garantizar el desarrollo de las BL. Durante la pro-liferacin de la bacteria en el vino, puede disminuirfuertemente la concentracin de varios aminocidos,mientras que puede aumentar la de otros5. No se hacomprobado que la disponibilidad de aminocidospueda ser limitadora del desarrollo2, pues las prote-nas y pptidos presentes en el vino tambin se pue-den utilizar como fuente de aminocidos15. Se ha

demostrado que el desarrollo bacteriano y la FML seven estimulados por la presencia de compuestosnitrogenados derivados de levaduras, como los pp-tidos y manoprotenas de la pared celular. Todos los

medios no sintticos de cultivo de la BML debensuministrar extractos de levadura o autolisado delevadura a los organismos16. Para utilizar estos tiposcomplejos de fuente de nitrgeno para su crecimien-to, las bacterias tienen que ser capaces de hidrolizar-los a sus subunidades, y de transportarlos a la clula.

Los estudios de secuenciacin del genoma de laOenococcus oenirealizados por el grupo de Guzzosy la Genome Express Company han revelado la pre-sencia de genes con una capacidad potencial decodificacin de proteasas y peptidasas, as como detransportadores de aminocidos y pptidos.Recientemente, Remize et al.17 han demostrado quedos fuentes distintas de nitrgeno derivado de lalevadura tienen un impacto distinto, aunque depen-diente de la cepa, en el crecimiento de laOenococcus oeni.

1.3 Vitaminas, minerales y otros factores decrecimiento

Adems del amino nitrgeno, las BL del vino necesitaun suministro de purinas y pirimidinas o sus deriva-dos. La adenina, xantina, guanina y uracilo tienen unefecto estimulante sobre el desarrollo de las BL. Variasvitaminas del grupo B son imprescindibles para el cre-cimiento, y aparentemente todas las cepas necesitancido flico y cido nicotnico2. La necesidad de bioti-na, riboflavina, cido pantotnico y piridoxina depen-de de la cepa. Durante la produccin comercial de

cepas de Oenococcus oeni, se puede incrementar elrendimiento de biomasa aadiendo pantotenato decalcio, tiamina y piridoxina, a razn de 1 mg/L de cadasustancia. 18. El descubrimiento de la contaminacinbacteriana de la salsa de tomate indujo la utilizacindel zumo e tomate como nutriente en la formulacinde medios de cultivo de la BL19. Amachi20 ha descritoun factor zumo de tomate como un derivado delcido pantotnico, y ha demostrado que es estimula-dor del crecimiento de la Leuconostoc oenos[Oenococcus oeni]. Zickler21 ha demostrado que eldesarrollo de la BML denominada Bacterium gracile

II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica



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requiere potasio, sodio, magnesio y concentracionesrelativamente altas de iones de manganeso. El man-ganeso tambin desempea un papel vital en calidadde coadyuvante en la enzimologa de la FML realizadapor BL. Por lo general, las concentraciones de todosestos iones son suficientes para permitir el crecimien-to y metabolismo de las BL.

1.4 cidos orgnicos

Aunque el cido mlico es el cido ms importantemetabolizado por las BL en el vino, sta tambinmetaboliza otros cidos orgnicos, comentados acontinuacin.

cido tartrico

A veces se observan pequeas reducciones de la con-centracin de cido tartrico durante la FML. Lo ms

probable es que estas variaciones se deban a modifi-caciones de la solubilidad del cido tartrico ms quea una degradacin microbiana real16. Slo se ha com-probado que degraden el cido tartrico algunascepas de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bre-vis y Lactobacillus arabinosus22. La degradacin delcido tartrico siempre va asociada al picado del vino.

cido mlico

Los cidos tartrico y mlico son los dos principalescidos orgnicos del vino, en especial de los vinos de

climas fros. El cido mlico est naturalmente presen-te en su forma L. El D-cido mlico no est natural-mente presente en el mosto de uva, y no lo metabo-liza las BL del vino. Varios estudios han demostradoque el L-cido mlico estimula el crecimiento y la pro-duccin de biomasa de Oenococcus oeni23, 24. Duranteel crecimiento con pH bajo, la bacteria degrada cidomlico a gran velocidad, mientras que los hidratos decarbono se degradan a poca velocidad. Este fenme-no induce un aumento global del pH, que por smismo permite un incremento de la utilizacin de loshidratos de carbono, lo cual explica la observacin de

crecimiento inducido por el cido mlico. Aunquehasta hace poco se consideraba que la conversin deL-cido mlico en L-cido lctico y CO2 no produceenerga26, la investigacin reciente indica que las clu-las intactas de Oenococcus oeni generan ms ATPcuando se han desarrollado en presencia de L-cidomlico27.

cido ctrico

El cido ctrico es un componente fundamental delmosto de uva y del vino, y se puede encontrar enconcentraciones comprendidas entre 0,1 y 0,7 g/L. Elmetabolismo del cido ctrico por Oenococcus oenise ha correlacionado con la sntesis del cido actico,el diacetilo y la acetona28. La Oenococcus oenino escapaz de desarrollarse a partir del cido ctrico comonica fuente de carbono y energa. Pero en presenciade una fuente de energa como la glucosa, mejoran

tanto la tasa de crecimiento especfica como la pro-duccin de biomasa de la Oenococcus oeni29. Lamejora del crecimiento en presencia de cido ctricose debe, en parte, a un incremento de la produccinde ATP derivada de la fosforilacin durante el co-metabolismo de la glucosa con el cido ctrico 30. Elcido ctrico queda completamente metabolizadoen algunos vinos, y en menor medida en otros.Mayores concentraciones de cido ctrico31 estimulanla produccin de diacetilo y acetona por laOenococcus oeni, y la mxima concentracin de dia-cetilo se observa al terminar la degradacin del cido

mlico

32.

Durante la FML, la degradacin del cidoctrico se retrasa con respecto a la degradacin decido mlico.

1.5 Disponibilidad de nutrientes determinada porlas prcticas de vinificacin

La clarificacin de mostos y vinos no slo puede eli-minar fsicamente una amplia porcin de las BL, sinoque adems puede reducir el desarrollo bacterianopotencial, lo cual incide en la calidad del vino19.Adems, la clarificacin elimina nutrientes y partculasen suspensin que estimulan el desarrollo bacteriano,

con lo cual inciden an ms en la FML. De forma simi-lar, se ha comunicado que los vinos elaborados utili-zando el proceso de termovinificacin tienen menorcapacidad de permitir la FML. La determinacin delmomento de la inoculacin de la BL (tratada en otrocaptulo) tambin influir en la cintica de la FML.

La disponibilidad resulta afectada por las interaccio-nes entre los microorganismos del vino. Es corrienteesperar que la mezcla de cultivos de microorganis-mos introduzca la posibilidad de relaciones antagni-cas y sinrgicas, si bien, en algunos casos menores, los

distintos microorganismos ejercen poca o ningunainfluencia mutua. En la vinificacin, siempre existe laposibilidad de que se produzcan interacciones entrelas BL y las levaduras, hongos, bacterias acticas e



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incluso bacterifagos. Es ms, tambin se puedenproducir interacciones entre diversas especies y cepasde BL20. El efecto antagnico de la levadura sobre lasBL se ha explicado por la competencia por losnutrientes as como la produccin de sustancias queinhiben el desarrollo bacteriano, como el SO2 o loscidos grasos de cadena media. A la inversa, la leva-dura puede sostener el desarrollo de las BL en el vinoy estimular el avance de la FML. Durante el proceso deautolisis de la levadura, se liberan vitaminas y amino-cidos en el vino, y el mayor contacto con las las aso-ciado al proceso enriquece el vino con micronutrien-tes que estimulan la FML. Costello21 ha comunicadoque una rpida mortandad de clulas de Oenococcusoeni sostiene el crecimiento de Pediococcus ssp. Encondiciones de alto pH, el desarrollo precoz de laLactobacillus brevis inhibe totalmente el desarrollode Oenococcus oeni. Recientemente, Gerbaux(comunicacin personal) ha demostrado que las con-

diciones del vino que estimulan la FML pueden inhi-bir el desarrollo de la levadura Brettanomyces nocivapara el vino.

1.6 Formulacin de nutrientes malolcticos

La investigacin extensiva ha contribuido a un mejorconocimiento de las necesidades nutricionales de loscultivos iniciadores malolcticos, las interacciones delas levaduras con dichos cultivos, y el impacto delmedio del vino en el desarrollo bacteriano y la nutri-

cin de las levaduras durante la fermentacin alcoh-lica. Por ejemplo, se sabe que si una levadura con ele-vadas necesidades de nutrientes realiza la fermenta-cin alcohlica, en el mosto se agotan rpidamentelos factores necesarios para permitir el desarrollo de

BL. En esas condiciones, es necesario aadir unnutriente bacteriano33. De forma similar, el aporte deun nutriente bacteriano es vital en los mostos cuyasconcentraciones de nutrientes son naturalmentebajas, pues un poco de levadura puede producir nive-les excesivos de SO2, que inhiben fuertemente eldesarrollo de BL. Baste decir que siempre es funda-mental una nutricin adecuada tanto de la levaduracomo de las BL.

En las difciles condiciones de pH, SO2, alcohol y nitr-geno que se dan en el vino, la utilizacin de suple-mentos nutritivos permitir que la Oenococcus oenisobreviva y se multiplique. Una cuidadosa prepara-cin de cultivos de inicio malolcticos y un uso ade-cuado de las preparaciones de nutrientes diseadaspara esos cultivos garantizar el rpido inicio de laFML. Esto se ilustra en la Figura 1, que presenta losresultados obtenidos a partir de la inoculacin de un

cultivo iniciador ML en un vino Chardonnay en pre-sencia o ausencia de una preparacin de nutrientesML. La cintica de la degradacin del cido mlicocorrespondiente a cada uno de los tres cultivos inicia-dores es mucho ms rpida cuando se utiliza elnutriente, mientras que slo se degrad un mximode 1 g/L de cido mlico cuando se aadieron bacte-rias en ausencia de suplemento nutricional.

Se recomienda un buen suplemento nutricional delos cultivos iniciadores ML, y existe un recomendacinsimilar en relacin con la levadura. La nutricin de las

BL es distinta de la de la levadura, y exige un rigurosocontrol. En casos de escasez de nutrientes en el vino,la alimentacin adecuada del cultivo iniciador MLpuede ser determinante para el xito de la FML. Enpalabras del inmortal Shakespeare, Ser, o no ser

II. Requerimientos y factores de la fermentacin malolctica

Tiempo (das)Alcohol 14,1% v/v, SO2 total 14 ppm, pH 3,38

Inoculacin directa con cultivos iniciadores de ML con (+) y sin (-) adicin de nutrientes

Figura 1.


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Referencias

1. Kvasnikov, E. I., y G. F. Kondo. 1960. Fermentation byheterofermentative lactic acid bacteria which causewine spoilage. Cit.: Chem. Abstr. 54:14575.

2. Radler, F. 1966. Die mikrobiologischen Grundlagendes Sureabbaus in Wein. Zentralbl. Bakteriol.Parasiten Abt. II. 120:237-287.

3. Melamed, N. 1962. Dtermination des sucres rsi-duels du vin, leur relation avec la fermentation malo-lactique. Ann. Techn. Agric. 11:5-11, 107-119.

4. Radler, F. 1958. Untersuchung des Sureabbaus imWein. III. Die Energiequelle der pfelsure-abbauen-den Bakterien. Arch. Mikrobiol. 31:224-230.

5. Henick-Kling, T. 1986. Growth and metabolism of

Leuconostoc oenos and Lactobacillius plantarum inwine. Tesis doctoral. Univers

Informe Técnico: La Fermentación Maloláctica

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