INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL MAESTRÍA EN CIENCIAS …
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR “DETECCIÓN DE LA PROTEÍNA VPg EN CÉLULAS INFECTADAS CON ASTROVIRUS 8 (HAstV-8) Y SU UNIÓN A LA RNT 5'” TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR PRESENTA: CID CASTRO CAROLINA DIRECTOR DE TESIS: DRA. MONICA ASCENCIÓN DE NOVA OCAMPO MEXICO D.F. A 10 DE DICIEMBRE DE 2012
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
“DETECCIÓN DE LA PROTEÍNA VPg EN CÉLULAS INFECTADAS CON
ASTROVIRUS 8 (HAstV-8) Y SU UNIÓN A LA RNT 5'”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN
CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
PRESENTA:
CID CASTRO CAROLINA
DIRECTOR DE TESIS:
DRA. MONICA ASCENCIÓN DE NOVA OCAMPO
MEXICO D.F. A 10 DE DICIEMBRE DE 2012
COMITÉ TUTORIAL:
Dra. María Esther Ramírez Moreno (PIBIOM)
Dra. Laurence Annie Marchat Marchau (PIBIOM)
Dr. Juan Santiago Salas Benito (PIBIOM)
Dr. Nicolás Villegas Sepúlveda (Depto. de Biomedicina Molecular, Cinvestav)
El trabajo experimental de esta tesis fue realizado en el laboratorio III de Virología
bajo la de la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación del Programa
Institucional de Biomedicina Molecular de la Escuela Nacional de Medicina y
Homeopatía (ENMyH) del Instituto Politécnico Nacional (IPN).
Esta tesis se realizó con al apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACyT), con número de proyecto CB-2008-99682.
Proyectos SIP: 20110182, 20120790
Se contó con beca de Maestría del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
CONACYT 377538, así como beca del Programa Institucional de Formación de
Investigadores (PIFI) del Instituto Politécnico Nacional (SIP-IPN 20120790.
Periodo 2011-2012) y con beca Tesis del Instituto Politécnico Nacional (IPN).
Agradecimientos
A mi directora de tesis:
Dra. Mónica Ascención de Nova Ocampo
Por la oportunidad que me brindó de colaborar en su equipo de
trabajo, el tiempo y apoyo brindado durante la realización de esta tesis
de maestría.
A mi comité tutorial:
Dra. Laurence Annie Marchat Marchau
Dra. María Esther Ramírez Moreno
Dr. Juan Santiago Salas Benito
Dr. Nicolás Villegas Sepúlveda
Por los consejos, observaciones y el apoyo brindado para la
realización de esta tesis.
Agradezco especialmente a:
Bióloga. Mariana Sala Benito, Profesor asociado A, ENMyH-IPN
Biólogo. Raúl Bonilla Moreno, Auxiliar de investigación, CINVESTAV
Dr. Héctor Romero Ramírez, Auxiliar de investigación, CINVESTAV
Dr. Renato León Rodríguez, Técnico Académico, IIB-UNAM
Dra. Cleotilde Cancio Lonches, Auxiliar de investigación,
CINVESTAV
M en C. Lorena García Morales, Profesor, ENMyH-IPN
Q.F.B. Matilde García Espitia, Profesor asociado A, ENMyH-IPN
Por haberme compartido sus conocimientos y experiencia, por su
valioso tiempo, orientación y ayuda en la elaboración y diseño de los
experimentos realizados en esta tesis.
Índice
Lista de abreviaturas …………………………………………………... 1
Lista de figuras ...………………………………………………... . 2
Lista de tablas ……………………………………………………. 3
Resumen …………………………………………………….. 4
Abstract ……………………………………………………. 5
Introducción ……………………………………………………. 6
Antecedentes …………………………………………………….11
Justificación …………………………………………………. ..15
Objetivos ….……………………………………………...…16
Estrategia experimental …………………………………….……………17
Materiales y métodos …………………………………………..…….. 18
Resultados ……..…………………..……………………….. 27
Discusión …………………………………………………… 45
Conclusiones ..………………………………………………… 50
Perspectivas ……………………………………………………. 50
Referencias …………………………………….……………. 51
1
LISTA DE ABREVIATURAS
BMV: Virus del mosaico de bromo
CaCo-2: Carcinoma colorectal humano
EF-1α: Factor de elongación de la traducción EF- 1alfa
eIF4: Factor de inicio de la traducción eIF4
FCV: Calicivirus felino
HAstV: Astrovirus humano
HCV: Virus de la hepatitis C
IRES: Sitio de entrada interno del ribosoma
Kb: Kilobase
NLS: Señal de localización nuclear
ORFs: Marcos de lectura abiertos
PABP: Proteína de unión a la cola de poli-A
PCBP: Proteína de unión al tracto de poli-C
PTB: Proteína de unión a tractos de polipirimidinas
PV: Virus de la polio
RdRp: RNA polimerasa dependiente de RNA
RE: Retículo endoplásmico
RNAcs(+): RNA de cadena sencilla y polaridad positiva
RNAg: RNA genómico
RNAsg: RNA subgenómico
RNT 3’: Región no traducida 3’
RNT 5’: Región no traducida 5’
VPg: Viral protein genome-linked
Hpi: Horas post infección
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Organización genómica de HAstV ……………………… 8
Figura 2. Esquema del ciclo replicativo de astrovirus ……………………… 10
Figura 3. Representación esquemática del ORF1a de HAstV-4 ……………. 14
Figura 4. Perfil antigénico de VPg ..……………………… 28
Figura 5. Modelado de los péptidos VPg1 y VPg2 ………………………...30
Figura 6. Evaluación de los sueros anti-VPg …………………………33
Figura 7. Predicción de sitios de fosforilacion de VPg ………………………..34
Figura 8. Western blot de extractos totales obtenidos con NP40 …………….37
Figura 9. Inmunolocalización de VPg ……………………...... 39
Figura 10. Co-localización de VPg y Retículo endoplásmico ………………...42
Figura 11. Co-precipitación de VPg ………………………… 43
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Proteínas celulares involucradas en
la replicación o traducción del virus ……………………………………… 11
Tabla 2. Proteínas virales involucradas en
la replicación o traducción de virus de RNAcs+ ………………………………….... 12
Tabla 3. Presencia de VPg en distintos tipos virales …………………………….... 13
Tabla 4. Péptidos utilizados para la obtención de sueros anti-VPg ……………….20
Tabla 5. Esquema de inmunización para la obtención de sueros Anti-VPg ……..21
Tabla 6. Anticuerpos secundarios utilizados en
los ensayos de Western Blot …………………………………………. 23
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RESUMEN
Los Astrovirus humanos (HAstVs) son virus de RNA de cadena sencilla y polaridad
positiva (RNAcs+), poseen dos regiones no traducidas pequeñas (RNTs)
flanqueando sus extremos, las cuales al parecer interaccionan con diversas
proteínas celulares y virales, modulando distintos procesos virales. Poco se
conoce sobre cuáles proteínas median las interacciones RNA-proteína en estos
virus, sin embargo dada la similitud de estos con otros virus de RNAcs+, una de las
proteínas cuya presencia se ha dilucidado por análisis in silico es la proteína "VPg"
ya que astrovirus carece de “cap” en su extremo 5’, y cuya función es muy
importante en el ciclo infectivo. Por ello, buscamos a esta proteína en células
infectadas con astrovirus serotipo 8 (HAstV-8) y su asociación con el genoma viral.
A partir del diseño de dos péptidos sintéticos se obtuvieron dos sueros
hiperinmunes VPg1 y VPg2 cuya inmunoreactividad se evaluó por western-blot,
inmunofluorescencia y co-inmunoprecipitación, para demostrar su asociación al
genoma viral. Para buscar la presencia de VPg, se realizó una cinética de
infección en células CaCo2, se obtuvieron extractos totales de proteínas y se
analizaron por western- blot. Solo el suero hiperinmune VPg2 reconoció una
proteína de aproximadamente 16 kDa únicamente en los extractos de células
infectadas a 8 y 10 horas post-infección y ninguna banda en los extractos de
células no infectadas. Mediante inmunofluorescencia, se observó una señal
focalizada del suero VPg2 cerca del retículo endoplásmico de células infectadas
co-localizando con la proteína PDI , sitio en el cual se ha reportado se lleva a
cabo la replicación de astrovirus. Los resultados de co-inmuprecipitación por un
lado revelaron la presencia de VPg en extractos de células infectadas a las 12
hpi, mientras que los ensayos de RT-PCR realizados con el RNA total extraído del
complejo co-precipitado con el suero VPg2 no permitieron amplificar la región
seleccionada para demostrar la asociación de VPg al genoma vira; sin embargo,
los resultados encontrados permiten sugerir la posible participación de VPg en el
sitio replicativo de astrovirus
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ABSTRACT
Human Astroviruses (HAstVs) are single-stranded positive RNA virus (RNAcs +),
which includes 5’ and 3’ nontranslated region (RNTs). Very little is known about the
participation of these RNA regions in astrovirus functions, the similarity with other
RNA viruses, the presence of VPg protein linked on astrovirus genome it has been
elucidated by in silico analysis and suggested a role in the infectious cycle. The
identification of VPg protein of HAstV-8 virus will help to understand the viral
requirements for VPg viral functions. To approach this problem, we designed two
peptides to obtain rabbit hyperimmune sera called VPg1 and VPg2.
Immunoreactivity was examined by western blot, immunofluorescence and co-
immunoprecipitation assay. To analyze the presence of the VPg protein, a kinetic
infection CaCo2 cells HAstV-8 was carried out. Total protein extracts from infected
cells were obtained and evaluated with a hyperimmune sera. The Anti-VPg2 serum
recognized a 16kDa protein, after 8 and 10 hours post-infection, no bands were
detected in the extracts from uninfected cells. The immunofluorescence assay,
showed a positive cells with this anti-serum near the endoplasmic reticulum in
infected cells co-localization experiments using PDI antibodies suggested the
presences of both VPg at 12hpi in the extract of in infected cells with HAstV-8.
Furthermore, the coinmmuprecipitation analysis revealed the presence of VPg at
12 hpi in the extract of infected cells, while the RT-PCR assays performed using
the total RNA extracted from these cells, did not allowed the amplification of the
Hast-V genomic sequence, from co-precipitated VPg2 complex. These results
suggest the possible involvement of VPg to localize the viral replicative complexes
in human astrovirus.
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INTRODUCCIÓN
Los Astrovirus humanos (HAstVs) son la causa más común de gastroenteritis
aguda en niños alrededor del mundo (Chen, et al, 2007) la población más afectada
son los niños menores de dos años, personas de la tercera edad y pacientes
inmunocomprometidos (Dennehy et al, 2001). Estos virus son transmitidos por vía
fecal-oral e infectan mamíferos y algunas especies de aves (Jonassen, et al,
2001). Los HAstV fueron observados en muestras fecales de niños con diarrea por
primera vez en 1975 por Madeley y Crosgrove mediante microscopia electrónica,
dándoles el nombre de astrovirus (del griego astron, estrella) por su estructura
similar a una estrella. La importancia médica de los astrovirus se estableció en
Tailandia, donde se encontró que eran la segunda causa más común (después de
rotavirus) de diarrea viral en niños pequeños (Herrmann, et al, 1991). Los ocho
serotipos identificados en humanos (HAstV1- HAstV8) han sido asociados con
gastroenteritis (Jin, et al, 2009), el serotipo 1 es el más prevalente alrededor del
mundo; en los últimos años se han aislado dos nuevos miembros denominados
AstV-MLB1 y AstV-VA1 (Finkbeiner, et al, 2008, 2009). Los síntomas causados
por la infección se presentan usualmente entre los 2 a los 4 días postinfección y
consisten en diarrea acuosa, vómito poco frecuente, dolor de cabeza, fiebre y
dolor abdominal (Méndez, 2007).
ORGANIZACIÓN GENÓMICA Y PROTEÍNAS NO ESTRUCTURALES
La familia Astroviridae a la que pertenecen los HAstVs, consta de dos géneros:
Avastrovirus y Mamastrovirus, que infectan aves y mamíferos, respectivamente,
está constituida por virus pequeños con tamaños de 28-30nm, icosaédricos, no
envueltos, de genoma de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva (RNAcs+)
con tamaños de 6.4 a 7.3Kb (RNAg), además contienen un RNA subgenómico
(RNAsg) de 2.8 Kb (Kapoor, et al, 2009). El genoma del virus contiene dos
regiones no traducidas (RNTs) en sus extremos las cuales son muy conservadas y
aunque varían en tamaño en los serotipos, se propone que están implicadas en
7
procesos tales como la replicación y la producción de nuevas partículas virales
(Méndez, 2007). Flanqueando la RNT5´, se encuentra una proteína llamada VPg
(Genome-linked viral protein) en su extremo 5', inicialmente su presencia fue
descrita inicialmente por estudios in silico (Al Mutairy, et al, 2005), recientemente
se demostró su presencia e importancia para la infectividad del virus en las células
BHK-21 (riñón de hamster chino), al transfectarlas con versiones mutadas de VPg
(Fuentes, et al, 2012). En el otro extremo, después de la RNT 3' se localiza una
cola de poli-A, cuya longitud varía entre los distintos serotipos de astrovirus
aislados a la fecha.
El genoma de HAstV consta de tres marcos de lectura abiertos (ORFs)
sobrelapados (Fig. 1A), designados como ORF1a, ORF1b y ORF2. El ORF1a y el
ORF1b están traslapados. El ORF1a codifica para la proteína no estructural 1a
(nsP1a) cuyo peso molecular es de 101 KDa, consta de 920-935 aminoácidos, y
tiene cinco dominios transmembranales seguidos de un dominio de serina-
proteasa (Jonassen et al, 2001). La poliproteína nsP1ab, es producto de la
traducción de los marcos ORF1a y ORF1b y es generada a través de un
mecanismo de frameshift debido a la presencia de una secuencia heptamérica
(AAAAAAC) localizada entre el ORF1 y el ORF2, que junto con una estructura de
tallo y burbuja de la misma región son las responsables del frameshift ribosomal
que se lleva a cabo durante la traducción del genoma viral (Lewis et al, 1996,
1997).
El ORF1b genera la proteína nsP1b la cual está compuesta de 515 a 528
aminoácidos, dependiendo del serotipo (Jiang et al, 1993). Esta proteína es una
RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp), contiene un motivo de RNA
polimerasa dependiente de RNA que corresponde al supergrupo I, según la
clasificación de Koonin (Koonin, 1991). Se ha propuesto que el lugar activo de
esta RNA polimerasa continen a la secuencia aminoacídica Y374G375D376D377
altamente conservada entre los astrovirus que infectan humanos y animales
(Carter et al, 1996).
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PROTEINAS ESTRUCTURALES
Las proteínas estructurales de astrovirus son traducidas a partir del ORF2 el cual
se encuentra tanto en el RNAg como en el RNAsg, este último se traduce
mayoritariamente y genera las proteínas de la cápside. El producto primario de la
traducción del ORF2 (llamado VP90) varía en tamaño dependiendo del serotipo
(782 a 796 aminoácidos); es procesada intracelularmente por proteasas celulares
(caspasas) y extracelularmente por tripsina; genera a VP70 como producto
primario, la cual a su vez genera VP28 (extremo carboxilo) y VP21 (extremo
amino) (Fig. 1B).
Figura 1.- Organización genómica de HAstV-8. A) Tres marcos de lectura
(ORFs) sobrelapados que codifican para las proteínas no estructurales nsP1ab,
nsP1a, nsP1b y una VPg unida al extremo 5´, dos RNT´s en sus extremos una
en el 5’ y una cola de poli-A en el extremo 3´. B) VP90 es procesada por
caspasas para generar a VP70, esta es procesada por tripsina y genera VP34,
VP27 y VP25 presentes en el virion maduro (Méndez et al, 2002) (Tomado de
Méndez, 2007).
9
CICLO REPLICATIVO
Hasta el momento el ciclo replicativo de astrovirus no está completamente
elucidado, pero se sabe que la entrada del virus a la célula huésped es mediada
por un proceso de endocitosis (Donnelly et al., 1992). A la fecha no se ha descrito
un posible receptor en células susceptibles a la infección por estos virus (Giux et
al, 2004; 2007, Méndez 2007). Recientemente se resolvió por cristalografía de
rayos X la estructura de la cápside de HAstV-8 (Dong, 2011), Es la aproximación
más cercana de las proteínas estructurales que podrían estar participando en el
reconocimiento inicial para la entrada de astrovirus a las células permisivas a la
infección.
Posterior a la entrada, el RNA genómico es liberado en el citoplasma para
comenzar la traducción de las proteínas no estructurales entre ellas, la RNA
polimerasa viral, que en conjunto con proteínas celulares, generan las cadenas de
RNA de polaridad negativa a partir del RNA genómico. Las cadenas negativas
funcionan como intermediarios replicativos para dar origen a nuevas cadenas de
polaridad positiva, las cuales son posteriormente encapsidadas. Estudios recientes
sugieren, que la infección por HAstV-8 promueve la síntesis de membranas
intracelulares, dentro de las cuales se localizan los complejos replicativos; se
propone que en estos sitios se lleva a cabo la replicación del genoma viral
(Méndez, et al., 2011, comunicación personal).
Por otro lado, la presencia del RNA subgenómico se hace evidente a las 12 horas
post-infección, subsecuentemente es traducido y genera las proteínas de la
cápside que empaquetaran el RNA genómico sintetizado de novo. Una vez
ensamblada las cápside y el genoma viral, la partícula es liberada de la célula, al
parecer por un proceso mediado por caspasas (Méndez, et al., 2007) (Fig. 2).
10
Hasta la fecha se conocen sólo algunas de las funciones de las proteínas virales
generadas durante la infección, sin embargo, sabemos que las interacciones de
las proteínas virales y celulares con las RNTs del genoma del virus son una parte
importante del ciclo replicativo, tal y como ocurre con otros virus de RNAcs+ donde
estas interacciones juegan un papel importante en la regulación de la replicación y
traducción.
Figura 2.- Esquema del ciclo replicativo de astrovirus. Tras la interacción
del virus con su receptor en la superficie de la célula blanco, él RNA viral es
liberado en el citoplasma, se traduce para dar origen a las proteínas virales
responsables de la replicación del genoma. El RNA viral sintetizado de novo es
encapsidado para generar nuevas partículas virales e infectar a células vecinas
(Guix et al., 2004; 2007, Méndez y Arias, 2007).
11
ANTECEDENTES
La generación de partículas virales nuevas, es un proceso complejo y organizado
en el que participan diversos factores, como son, lípidos y proteínas de las
membranas del retículo endoplásmico y del aparato de Golgi e incluso
mitocondriales, así como proteínas del virus. Varios reportes describen la
interacción de estos componentes con el genoma viral, principalmente, con las
regiones no traducidas (RNT´s). Dichas interacciones regulan la replicación,
traducción o estabilización de los genomas virales. En la tabla 1 se muestran
algunos ejemplos de proteínas celulares que intervienen en la replicación y/ o
traducción; así como algunas de las proteínas virales que también participan en
dichos procesos (Tabla 2).
Virus Proteína Proceso en el
que participa
Referencia
Polio La, PCBP-2, EF1α,
PABP
Traducción Harris et al, 1994
Gamarnik et al, 1997
Herold y Andino, 2001
Dengue PTB, La, Calreticulina,
EF1α
Replicación De Nova et al, 2002
Yocupicio et al, 2003
Agis Juárez et al, 2009
Virus
Norwalk
La, hnRNP-L, PTB,
PCBP-2
Traducción Gutiérrez et al, 2003
Hepatitis C PTB Traducción Ito y Lai, 1999
Tabla 1.- Proteínas celulares involucradas en la replicación o traducción de virus
de RNAcs+. Ejemplos de proteínas celulares intervienen en procesos de replicación y
traducción del genoma de distintos virus.
12
Virus Proteína Función Referencia
Polio VPg
3D
Primer de replicación
RNA-polimerasa viral
Gamarnik, 2000
Dengue NS5 RNA polimerasa viral Villordo, 2009
Calicivirus Felino VPg Primer de replicación Herbert, 1997
Norwalk VPg Primer de replicación
Inicio de la traducción
Dunham, 1998
Daughenbaugh, 2003
Presencia de VPg en virus de RNAcs+
Picornaviridae, Caliciviridae y Potyviridae son de las familias virales que poseen la
proteína viral llamada VPg en el extremo 5' de su RNA, la interacción entre ambos
ocurre a través de la unión covalente con un residuo de tirosina de la proteína; la
posición de este residuo y los pesos moleculares de estas proteínas sin diferentes
entre los distintos virus (Tabla 3). En los virus de RNAcs+ que carecen de "cap" la
presencia de esta proteína cobra relevancia, dado que tiene como principal
función ser un “primer” para el inicio de la replicación del genoma viral. La proteína
se uridila en el caso de picornavirus, mientras que en calicivirus esto ocurre por
una reacción de guanilación (Goodfellow et al, 2011). Por otro lado, se han
descrito otras posibles funciones para VPg: participación en la encapsidación del
genoma viral, proceso observado en calicivirus (Liu et al, 2010). Y la VPg,
interacción con factores de inició de la traducción como eIF3, lo que sugiere su
participación en la síntesis de proteínas virales (Daughenbaugh et al, 2006). Se
Tabla 2.- Proteínas virales involucradas en la replicación o traducción de virus de
RNAcs+. Ejemplos de diversas proteínas virales intervienen en procesos de replicación
y traducción del genoma de distintos virus.
13
ha observado que la interacción de la VPg de calicivirus felino con el factor de
inicio de la traducción eIF4E en células infectadas por este virus es requerida para
la traducción del RNA viral (Goodfellow et al, 2005) al igual que su interacción con
la proteasa/polimerasa del virus (Kaiser et al, 2003). En Potyvirus también se ha
encontrado una interacción con eIF4E la cual es trascendental para la infectividad
(Léonard et al, 2000, Tavert-Roudet et al, 2012).
Virus
Tamaño de VPg
(KDa)
Referencia
Poliovirus 4.2 Ambros et al, 1978
Calicivirus felino 15 Herbert et al, 1997
Astrovirus 15-16 Al – Mutairy et al, 2005
Potyvirus 24-26 Hong et al, 1995
Además en el caso de HAstV, la traducción del ORF1a da como resultado una
poliproteína llamada nsP1a, cuyo procesamiento genera cuatro productos
proteicos conocidos como: nsP1a/1, nsP1a/2, nsP1a/3 (posible proteasa viral) y
nsP1a/4, esta última se ha propuesto participa en el ciclo replicativo del virus ya
que colocaliza con RNA viral y las membranas del retículo endoplásmico (RE)
rugoso en células infectadas (Guix et al, 2004) e interacciona con la RNA
polimerasa viral (nsP1b) gracias una región hipervariable cuya fosforilación puede
mediar esta interacción (Fuentes et al, 2011). Recientemente Fuentes y cols.,
(2012) demostraron la presencia de VPg en el genoma de astrovirus tipo 4 y
Tabla 3.- Presencia de VPg en distintos tipos virales. La presencia de VPg se ha
descrito en varios virus de RNAcs+ donde existen una gran heterogeneidad entre el
tamaño de estas proteínas
14
establecieron su importancia en la infectividad del virus; Los residuos de VPg se
hallan dentro de la proteína nsP1a/4 (Fig. 3).
Aún cuando se cuenta con evidencias experimentales que sugieren la presencia
de VPg en el RE, no se ha descrito con exactitud la localización celular de la
proteína en células infectadas con HAstVs, por lo que nos dimos a la tarea de
buscar a esta proteína y tratar de demostrar su asociación con el genoma viral en
el contexto de células infectadas.
Figura 3.- Representación esquemática del ORF1a de HAstV-4. La
traducción del ORF1a genera la poliproteína nsP1a, la cual posee varios
dominios transmembranales (TM), un dominio proteasa (PRO) y una región
hipervariable (HVR). El procesamiento de nsP1a da origen a cuatro productos
proteicos. El producto nsP1a/4 localizado en la porción COOH-terminal
contiene la secuencia correspondiente a VPg ubicada entre los residuos 665 a
755 (Tomada de Fuentes et al., 2012).
15
JUSTIFICACIÓN
La diarrea es la segunda causa de mortalidad en niños alrededor del mundo,
entre sus principales agentes causales se encuentran las infecciones por
astrovirus después de las infecciones por rotavirus. La replicación y traducción del
genoma viral son sumamente importantes en el momento de la infección, ya que,
de la eficiencia de estos procesos dependerá la replicación viral. Una parte
importante en la regulación de estos procesos es la interacción de las RNTs con
proteínas virales y celulares; procesos que en el caso de astrovirus no se conocen
del todo. Asimismo se desconoce qué proteínas interaccionan con el genoma o
cuál es su participación en la regulación de la replicación y/o traducción.
Recientemente se describió la presencia de VPg en células infectadas con
astrovirus, siendo esta muy importante en la infectividad del virus, sin embargo no
se conoce con exactitud la forma en que esta proteína interacciona con la RNT 5’,
probablemente es parte del complejo replicativo, ya sea durante el inicio de la
traducción viral, a través del reclutamiento de los ribosomas o bien facilitando la
circularización del genoma como sucede en otros virus de RNAcs +, y de esta
manera dar inicio a los dos eventos que corresponden propiamente al ciclo
replicativo del virus, es decir la traducción seguida de la replicación.
Para comenzar a dilucidar como se llevan a cabo dichos eventos, es necesario
buscar la presencia de esta proteína en los complejos activos en replicación con la
finalidad de tener un conocimiento más amplio de la biología del virus, y
probablemente aportar información para el diseño de nuevas estrategias en el
tratamiento antiviral.
16
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar la presencia de la proteína VPg en células infectadas con astrovirus
serotipo 8 (HAstV-8) y caracterizar su unión con el RNA viral.
OBJETIVOS PARTICULARES
Diseñar dos péptidos sintéticos a partir de la secuencia reportada para la
VPg de HAstV-8.
Obtener sueros hiperinmunes a partir de los péptidos seleccionados
capaces de reconocer a VPg .
Evaluar, mediante western-blot e Inmunofluorescencia, la presencia de
VPg en células infectadas con HAstV-8.
Evaluar la unión de VPg con el genoma viral mediante ensayos de co-
precipitación.
17
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Para alcanzar los objetivos previamente descritos, se diseñó la siguiente
estrategia experimental
18
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo de células CaCo-2
La línea celular de adenocarcinoma colo-rectal humano (ATCC HBT-37) llamada
CaCo-2 se cultivó a 37ºC, 5% de CO2 en medio de cultivo Advanced-DMEM
(Invitrogen) suplementado con L-Glutamina 2 mM (Invitrogen), 5% de suero fetal
bovino (PAA, Canadá) y antibióticos. La línea celular se empleó para la
propagación de la cepa viral Yuc 8 (HAstV-8) y para la obtención de los extractos
totales (RSB-NP40) de células no infectadas e infectadas.
Infección de células con HAstV- 8
Las células CaCo-2 se infectaron con la cepa viral Yuc 8 (donada por el Dr.
Ernesto Méndez Salinas, IBT-UNAM). La infección de las células se llevó a cabo a
una confluencia de 80%. El virus se activó con tripsina (Gibco, BRL, USA) a una
concentración final de 200 µg/ml durante 1 h a 37°C; transcurrido ese tiempo se
adicionó inhibidor de tripsina de soya (Sigma, USA) a la misma concentración (200
µg/ml) para evitar el desprendimiento de la monocapa celular durante la adsorción
viral. Una vez activado el virus, se retiró el medio y la monocapa celular se lavó
dos veces con PBS estéril 1X pH 7.3, subsecuentemente se agregó el virus
activado y medio de cultivo para cubrir la monocapa (MEM-HEPES 1M-
bicarbonato 0.034%-antibióticos, sin suero pH 7.1), para permitir la adsorción
durante 1 hora a 37°C. Posteriormente, se retiró el inóculo viral y se lavó 2 veces,
se agregó medio fresco y se incubó por 12 horas para la obtención de extractos
totales por RSB-NP40.
Extractos proteicos totales por RSB-NP40
A las cajas de células CaCo2 confluentes, se les retiró el medio de cultivo (no
infectadas e infectadas), se lavaron 3 veces con PBS frío, se adicionó
amortiguador de despegado (Tris-HCl pH 7.5, EDTA 1mM, NaCl 150mM) y se
incubaron durante cinco minutos en hielo y se removieron mecánicamente con un
scrapper, se recolectaron en un tubo eppendorf de 1.5ml y se centrifugaron a 5000
19
rpm a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente se retiró el sobrenadante, la pastilla
se resuspendió en PBS y se lavó dos veces. Al sobrenadante obtenido se le
agregaron 100µl de RSB-NP40 (10mM Tris-HCl, pH 7.5; 10mM NaCl, 1% NP40),
se resuspendió la pastilla y se centrifugó por otros 15 minutos a 12000 rpm a 4°C.
El sobrenadante se alicuotó y almacenó a -70°C. La concentración de proteínas se
cuantificó por el método de Bradford (Bio-Rad) y la integridad se verificó en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE) teñidos con azul de
coomassie.
Diseño de péptidos inmunogénicos a partir de la secuencia para VPg de
HAstV-8
A partir de la secuencia de HAstV-8 reportada en el GenBank (no. de acceso
AF260508) y tomando como referencia lo reportado por Al-Mutairy y cols., (2005),
se realizó el diseño de dos péptidos sintéticos de la VPg, mediante un análisis In
silico con el software Predicting Antigenic Peptides (Universidad compútense de
Madrid), el cual predice la secuencias que son mas antigénicas dentro de una
proteína y que puedan generar una respuesta inmune evaluada a través de la
producción de anticuerpos. Este diseño y análisis se realizó bajo la asesoría de la
M. en C. Lorena García Morales (Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía).
Por otro lado se empleó la herramienta IEDB Analysis resource para determinar la
probabilidad de generación de anticuerpos de cada secuencia peptídica que
presentó un alto índice de propensión antigénica y posteriormente se realizó el
modelado de la secuencias peptídicas con la finalidad de determinar cuál de los
péptidos generados tenía una mayor superficie expuesta al solvente y que se
encontraran más próximos al amino terminal.
En la tabla 4 se muestran los dos péptidos seleccionados (VPg1 y VPg2) de seis
obtenidos y que poseen las mejores características antes mencionadas para ser
usados en la inmunización de conejos. Los péptidos fueron sintetizados por
Invitrogen.
20
Péptido Secuencia Aminoácidos Tipo de
anticuerpo
VPg 1 KPKPCPEP 103-110 Policlonal
VPg 2 HEQQVAK 129-135 Policlonal
Inmunización de conejos con péptidos sintéticos
Los péptidos VPg 1 y VPg 2, se resuspendieron en agua inyectable (1mg/ml), con
ellos se inmunizaron dos conejos hembra de la raza Nueva Zelanda, de
aproximadamente 2.5 Kg cada uno. El manejo e inoculación de los animales se
llevó a cabo bajo la supervisión y asesoría de Héctor Romero Ramírez (Lab del Dr.
Leopoldo Santos Argumedo, Depto. de Biomedicina Molecular, Cinvestav).
Previo a la inmunización con los péptidos, se obtuvo el suero preinmune de cada
conejo, el cual se almacenó a 4°C. Para las primeras cuatro inmunizaciones, se
utilizaron 200 µg del péptido correspondiente y 100µl de TiterMax Gold (Sigma,
USA) como adyuvante, administrados por vía intramuscular e intradérmica, las
últimas tres inmunizaciones se realizaron con 400 µg del péptido, disuelto en
solución salina. Al inicio se realizaron 4 inmunizaciones con intervalos de 7 días,
tres con el péptido y adyuvante y la última inoculación únicamente con el péptido
disuelto en solución salina; después de evaluar la reactividad por medio de
ensayos tipo western blot se decidió realizar otras 3 inmunizaciones cada 10 días
con 400 µg del péptido disueltos en solución salina (Tabla 5), cinco días después
de la última inmunización los conejos se sangraron a blanco para obtener el suero
inmune, para ello los conejos fueron inyectados con 3ml de pentobarbital sódico y
la sangre se obtuvo por punción cardiaca, la cual se colectó en tubos cónicos de
50 ml, que fueron almacenados a 4°C durante 4 horas, posteriormente se
Tabla 4.- Péptidos utilizados para la obtención de sueros anti-VPg
21
centrifugaron durante 30 minutos a 4000 rpm a 4°C, obteniendo el suero
hiperinmune el cual fue alicuotado y guardado a 4°C.
La inmunoreactividad de los sueros obtenidos se evaluó mediante ensayos tipo
western-blot, y por ensayos de inmunofluorescencia sobre células CaCo2 no
infectadas e infectadas con HAstV-8.
Inoculación Péptido
(µg)
Solución
salina
(µl)
Adyuvante
(µl)
1 200 1000 100
2 200 1000 100
3 200 1000 100
4 200 1000 -
5 400 1000 -
6 400 1000 -
7 400 1000 -
Tabla 5.- Esquema de inmunización para la obtención de sueros anti-VPg.
22
Ensayos tipo Western Blot
Para descartar posible contaminación con proteínas nucleares en los extractos
totales obtenidos con NP40 se realizaron ensayos tipo WB. El análisis de los
extractos se realizó con los anticuerpos anti-actina (Millipore) a la dilución 1:1000,
anti-lamina A (Santa Cruz Biotechnology Inc) para componentes nucleares
(1:1000) y el anticuerpo anti-PDI (Cell signaling) para validar la presencia de
fracción membranal de retículo endoplásmico (1:100). Los extractos de células
infectadas con HAstV-8 se evaluaron con el suero hiperinmune anti-nsP1b-2
(1:1000) que reconoce a la RNA polimerasa viral (nsP1b) asociada a complejos
activos en replicación en células infectadas como se describió previamente
(Méndez et al, 2003).
Por otro lado, una vez completado el esquema de inmunización de los conejos con
los dos péptidos sintéticos, se evaluó la inmunoreactividad tanto de los sueros pre-
inmunes, cómo de los sueros hiperinmunes utilizando una dilución 1:500 para
ambos casos.
Se partió de 60 μg de proteínas las cuales se separaron en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida al 10%, excepto para VPg, para la cual se
usaron geles al 15%, cuyo peso molecular se estimó en aproximadamente 16 kDa.
Se utilizó el marcador de peso molecular Precision Plus Protein Dual Color (Bio-
Rad). Todos los geles se corrieron a 120 volts en amortiguador de corrida para
proteínas (192mM de Glicina, 0.1% de SDS, 25mM Tris-base). Al termino de la
electroforesis, los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond- c
extra, Amersham), tanto el gel como la membrana se equilibraron durante 20
minutos en amortiguador de transferencia (25 mM Tris-Base, 192 mM de Glicina,
20% metanol) la cual se realizó en un sistema de transferencia semi-seco (Bio-
Rad) durante 45 minutos a 25 volts. La eficiencia de transferencia se verificó con
rojo de Ponceau (rojo de Ponceau 1%, ácido tricloro acético1%).
23
Todas las membranas se bloquearon con leche Casec (Nestle Nutrition) al 5% en
PBS1X-0.5%Tween-20 durante 2h a temperatura ambiente y se lavaron 6 veces
con PBS 1X-0.5% Tween-20, posteriormente las membranas se incubaron con los
respectivos anticuerpos primarios en PBS 1X- 0.5%Tween-20 a las diluciones ya
indicadas y se dejaron toda la noche a 4°C, al día siguiente se lavaron las
membranas 6 veces con PBS 1X- 0.5% Tween-20, posteriormente se incubaron
con el anticuerpo secundario correspondiente (Tabla 6). Por último se lavaron las
membranas 6 veces con PBS 1X-Tween20 0.5% y se revelaron por
quimioluminiscencia (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate,
Pierce).
Anticuerpo Dilución Proteína Marca
Cabra anti-
conejo IgG (H+L)
acoplado a
peroxidasa de
rábano
1:5000 Actina
Lamina A
VPg
ZYMED
Cabra anti-ratón
IgG+A+M (H+L)
acoplado a
peroxidasa de
rábano
1:10 000 PDI ZYMED
Tabla 6.- Anticuerpos secundarios utilizados en los ensayos de WB.
24
Inmunofluorescencia
Para los ensayos de inmunofluorescencia se sembraron 0.4 x105 células CaCo2
por pozo en una placa de 8 pozos Chamber Slide System (Nunc), éstas se
incubaron a 37ºC, 5% CO2 y 72 horas después se hizo la infección con HAstV- 8;
24 horas post-infección se eliminó el medio y se lavaron las células con PBS 1X,
50mM NH4Cl. Posteriormente las células se fijaron con paraformaldehído al 2.5%
durante 15 minutos a temperatura ambiente; transcurrido este tiempo las células
se lavaron 4 veces con PBS 1X, 50mM NH4Cl. Enseguida, las células se
permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.5% en PBS 1X, 1% BSA, 50mM NH4Cl
durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron nuevamente con PBS
1X, 50mM NH4Cl. Las células permeabilizadas se bloquearon con PBS 1X, 1%
BSA, 50mM NH4Cl durante una hora a temperatura ambiente y una vez
transcurrido el tiempo las células se incubaron con el anticuerpo primario TYVD
(donado por el Dr. Ernesto Méndez, IBT, UNAM) que reconoce a las proteínas
VP70 y VP90 de la cápside de HAstV-8 a una dilución 1:200 en PBS 1X, 1% BSA,
50mM NH4Cl, durante 1 hora a temperatura ambiente, este se usó como control
positivo de células infectadas. Para evaluar la inmunoreactividad de los sueros se
probaron distintas diluciones (1:20. 1:50 y 1:100) tanto de los sueros pre-inmunes
como inmunes y también de los dos conejos inmunizados con los dos péptidos.
Para el ensayo que se analizó por microscopía confocal se utilizó el anticuerpo
comercial MCA2716 (ratón anti-Astrovirus IgG, Serotec) como control positivo de
células infectadas y un anticuerpo Anti-PDI 1:100 (ratón anti-PDI, Santa Cruz)
como marcador de retículo endoplásmico (RE).
Al termino de la incubación con el anticuerpo primario correspondiente, las células
se lavaron 7 veces con PBS 1X- NH4Cl y se incubaron con el respectivo
anticuerpo secundario; para el caso de la células incubadas con el anticuerpo
TYVD se utilizó un anticuerpo secundario cabra anti-conejo IgG (H+L) 2mg/ml
acoplado a Alexa- Fluor 594 (Invitrogen) en dilución 1:500; para el anticuerpo
MCA2716 y anti-PDI se utilizó un anticuerpo secundario cabra anti-mouse IgG
acoplado a FITC (Invitrogen) a una dilución 1:1000, estos se diluyeron en PBS 1X,
25
1%BSA, 50mM NH4Cl y se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente, se
lavaron nuevamente siete veces con PBS 1X, 50mM NH4C. Una vez concluida la
incubación con ambos anticuerpos, se retiró el soporte plástico de las chamber
slide y la monocapa se cubrió con un cubreobjetos utilizando medio de montaje
para fluorescencia VectaShield con DAPI (Vector Laboratories, Inc.), estos se
sellaron con barniz. Las imágenes se obtuvieron en un microscopio de
inmunofluorescencia OLYMPUS IX70, bajo la supervisión del Dr. Renato León
Rodríguez (Depto.de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de
Investigaciones Biomédicas, UNAM). Las imágenes de microscopia confocal
(equipo Zeizz LSM700) se analizaron bajo la supervisión de la Dra. Cleotilde
Cancio Lonches (Departamento de Infectómica y Patogénesis Molecular,
Cinvestav).
Co-Inmunoprecipitación de VPg
Para encontrar a la proteína VPg en células infectadas con HAstV-8 unida al RNA
viral, se realizó un ensayo de co-inmunoprecipitación. Se partió de 10 cajas de
75cm2 de células CaCo2 no infectadas y 10 cajas de 75cm2 de células infectadas,
12 horas post infección (hpi) las cajas se lavaron con 2ml de PBS, las monocapas
de células se rasparon con un scrapper, se colocaron en tubos eppendorf y se
centrifugaron a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C, el sobrenadante se eliminó y la
pastilla resultante se resuspendió en 1 volumen de amortiguador “Polysomal Lysis”
(PBL) (10mM HEPES pH 7.0, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 0.5% NP-40, 1mM de
DTT, Inhibidor de proteasas COC e inhibidor de RNAsas), el extracto obtenido se
incubó con 10µl de proteína G (previamente lavada con PBL) por 2 horas a 4°C en
agitación constante; posteriormente se centrifugó a 13000 rpm por 5 minutos a
4°C y el sobrenadante se incubó con el suero anti-VPg2 (1:100) durante toda la
noche a 4°C con agitación. Al día siguiente el inmunocomplejo se inmovilizó en
10µl de proteína G (previamente lavada con PBL) saturada con 2% de BSA por 2
horas a 4°C, transcurrido este tiempo el inmunocomplejo se centrifugó a 13000
rpm por 5 minutos a 4°C y la pastilla resultante se lavó cinco veces con
26
amortiguador NETS (50mM Tris-HCl pH 7.4, 5mM EDTA, 1mM DTT, 100mM NaCl,
0.05% NP-40).
Una porción de esta pastilla se analizó por western-blot para detectar VPg y la otra
porción se trató con Trizol (Invitrogen) para extraer RNA total, a partir del cual se
realizó una RT-PCR con el Kit OneStep RT-PCR (Qiagen) utilizando los
oligonucleótidos Mon269 (forward) y Mon270 (reverse) para amplificar un producto
de 449pb que corresponde a una región conservada del ORF2 de HAstVs. Las
condiciones de RT-PCR que se siguieron fueron descritas previamente (Acosta-
Mejía, 2011).
27
RESULTADOS
Diseño de péptidos para la VPg de HAstV-8.
Una proteína viral fundamental en la biología molecular de astrovirus es “VPg”, la
cual debe estar unida al extremo 5’ del genoma viral por dos razones
fundamentales: La primera es que el genoma de este virus no posee un “cap” en
su extremo 5' que lo proteja del ataque de nucleasas, la segunda porque el
genoma viral requiere de una molécula que pudiera ser la responsable de mediar
procesos como, replicación y/o traducción, como ya se ha descrito en otros virus
de RNAcs+ que contienen una VPg. Dado que en la literatura sólo se disponía de
un análisis in silico que revelaba una secuencia putativa para una VPg en el
genoma de los astrovirus, cuya secuencia estaba disponible en el GenBank en
ese momento (Al Mutairy et al, 2005) pero su presencia y función en células
infectadas no había sido dilucidada del todo nos dimos a la tarea de buscarla.
Dado que no existen anticuerpos comerciales dirigidos contra la VPg que pudieran
ser usados para localizar a esta proteína y así comenzar el estudio de su función
en el ciclo viral de astrovirus, la estrategia que se siguió fue el diseño de dos
péptidos sintéticos a partir de la secuencia reportada en el GenBank para HAstV-
8, con la finalidad de generar sueros inmunes capaces de reconocer a esta
proteína en células infectadas.
A partir de los residuos 665 al 804, se realizaron análisis bioinformáticos que
permitieron determinar el perfil antigénico de esta secuencia peptídica y así
analizar las posibles regiones expuestas de VPg, para posteriormente seleccionar
regiones hidrofílicas de este polipéptido, para el diseño de los péptidos que se
usarían para la producción de anticuerpos especificos.
El criterio que se siguió para la selección de regiones potencialmente expuestas
en la proteína fue considerar todas aquellas secuencias, cuya media del valor de
perfil antigénico fuera mayor a 1 en la escala de hidrofobicidad, es decir, regiones
que se ubicaran dentro de este valor o por arriba de él. El perfil obtenido para los
28
139 residuos de la posible VPg (665-804) reveló 6 regiones potencialmente
hidrofílicas, indicándose la posición inicial y final de cada región; los índices de
propensión antigénica de estas seis regiones mostraron valores por arriba de 1
(Fig. 4).
A partir del resultado del perfil antigénico, se decidió analizar la secuencia de las 6
regiones obtenidas con el software IEDB Analysis Resources que permite conocer
datos relacionados con potenciales epítopos de células T y anticuerpos para
diferentes especies, con la intención de determinar la probabilidad de generación
de anticuerpos para cada secuencia peptídica obtenida. El resultado generado
Figura 4.- Perfil antigénico de VPg. A) Histograma resultante del análisis de
los residuos 665 a 804 de HAstV-8. Las seis regiones hidrofílicas se indican con
líneas horizontales sobre cada pico. B) Valores del índice antigénico de las
regiones resultantes del análisis in sílico con el software de la Universidad
Complutense de Madrid
29
mostró que sólo 2 de las 6 regiones resultaron con más del 80% de probabilidad
de generación de anticuerpos. Estas regiones corresponden a las posiciones 4 y 6
de la tabla y se denominaron péptidos VPg1 y VPg2 respectivamente (Fig. 5A).
Posteriormente se modeló cada región con el software Swiss Model utilizando el
templado más adecuado en el programa para posteriormente validarlas mediante
el programa Ramachandranplot. El modelo generado se visualizó con el visor y
editor de archivos PDB Pymol PBD viewer. El área expuesta del péptido VPg1 se
muestra en naranja y la del péptido VPg2, en blanco (Fig. 5B).
Los resultados obtenidos en el análisis in silico de la secuencia reportada para la
VPg de HAstV-8 revelaron que las secuencias de los péptidos que se muestran en
la figura 5, son los más indicados para generar una mayor respuesta antigénica,
ya que poseen una gran superficie expuesta al solvente, alto índice de
inmunogenicidad, secuencias con seis o más aminoácidos, además de que se
encuentran próximas al extremo amino y carboxilo de la proteína, características
recomendadas para este tipo de péptidos. Con éstas secuencias peptídicas
seleccionadas, se sintetizaron los péptidos y se inmunizaron conejos de la raza
Nueva Zelanda siguiendo el esquema de inmunización que se describió
anteriormente.
30
Figura 5.- Modelado de los péptidos VPg1 y VPg2. A) Determinación de
regiones potencialmente productoras de anticuerpos B) Modelado del péptido
VPg1 (residuos del 103-110) y péptido VPg2 (residuo 129-135) con el editor de
archivos PDB Pymol, PDB Viewer marcados en color naranja y blanco
respectivamente.
31
Evaluación de los sueros anti-VPg1 y anti-VPg2
Para comenzar a evaluar la inmunoreactividad de los sueros generados para cada
péptido, se realizaron ensayos tipo WB usando extractos citoplásmicos de
proteínas de células no infectadas y extractos provenientes de una cinética de
infección (2 a 10 hpi) de células CaCo2, con la finalidad de encontrar el tiempo en
el cual comienza a aparecer VPg y tratar de dilucidar su posible función durante el
ciclo replicativo de astrovirus; como control se utilizó el suero pre-inmune de cada
conejo. Dado que en los ensayos preliminares de WB usando cada uno de los
sueros se observó inespecificidad; estos (sueros preinmunes e hiperinmunes) se
inmnoabsorbieron sobre membranas de nitrocelulosa con proteínas de células
CaCo2 no infectadas y se volvieron a usar sobre extractos citoplásmicos en las
dos condiciones experimentales ya mencionadas.
Por otro lado, para determinar el posible peso molecular de VPg de HAstV-8 se
realizó un análisis in silico con la secuencia reportada que arrojó un valor
aproximado de 16.33 kDa, rango en el cual se han descrito los pesos moleculares
de las VPgs de otros virus de RNAcs+, que van desde 6 kDa (Poliovirus) hasta 20
kDa aproximadamente (Norwalk) (Gamarnik, 2000M; Daughenbaugh, 2003).
Una vez inmunoabsorbidos los sueros se analizaron nuevamente y los resultados
con el suero preinmune VPg1 mostraron una vez más la detección de muchas
bandas inespecíficas en ambos tipos de extractos (Fig. 6A, panel izquierdo),
mientras que el suero hiperinmune no fue capaz de reconocer ninguna banda del
peso molecular esperado. Este ensayo se repitió al menos 3 veces obteniéndose
el mismo resultado por lo que se decidió evaluar la inmunoreactividad de este
suero por ensayos de inmunofluorescencia antes de descartarlo.
En cuanto a los resultados obtenidos con el suero preinmune del conejo que fue
inoculado con el péptido VPg2, no se detectó ninguna banda (Fig. 6B, panel
izquierdo) interesantemente cuando el ensayo se realizó con el suero hiperimune,
este detectó una banda del tamaño esperado (16 kDa aproximadamente) a las 8
hpi (Fig. 6B, panel derecho) y ninguna banda en los extractos de células no
32
infectadas (carril Ni). Además de la banda de16 kDa se detectaron bandas
adicionales que pudieran ser productos del procesamiento de nsP1a/4, la cual
contiene a VPg o bien, corresponde a formas fosforiladas de esta proteína de
acuerdo con los antecedentes descritos en la literatura (Fuentes et al. 2011). Esta
probabilidad fue demostrada por medio de un análisis con NetPhos 2.0, software
que predice que aminoácidos de una secuencia peptídica son susceptibles a ser
fosforilados, encontramos que las tirosinas y las treoninas son los aminoácidos
con mayor potencial de fosforilación. En la figura 7 se muestra el resultado de éste
análisis, en el panel A, se observa la gráfica donde se indica, en el eje de las X, la
posición de cada aminoácido en la secuencia peptídica y en el eje de las Y, el
potencial de fosforilación. Los datos obtenidos muestran qué los aminoácidos con
un mayor potencial de fosforilación son las tirosinas, en segundo lugar las
treoninas y por último las serinas. En la tabla del panel B se enlistan los puntajes
de potencial de fosforilación y sus posiciones dentro de la secuencia. Se debe
mencionar que los aminoácidos con puntajes más cercanos a 1 son los que se
consideran con mayor probabilidad de ser fosforilados.
33
Figura 6.- Evaluación de los sueros anti-VPg. 60µg de extractos citoplásmicos de
células CaCo2 no infectadas (Ni) e infectadas con HAstV-8 (2-10 hpi) fueron separados
en geles de poliacrilamida desnaturalizante al 15% y transferidos a membranas de
nitrocelulosa, las cuales se incubaron con los sueros preinmunes (izquierda) y sueros
hiperinmunes (derecha) obtenidos con los péptidos VPg1 (A) y péptido VPg2 (B)
respectivamente. Los pesos moleculares se muestran en kilodaltones (KDa) (Dual
Color, Bio-Rad) y VPg se indica con una flecha a la derecha.
34
Figura 7.- Predicción de los sitios de fosforilación de VPg de HAstV-8. Por medio
de un análisis con NetPhos 2.0 se determinaron los sitios más susceptibles a
fosforilación dentro de la secuencia de VPg previamente reportada en el GenBank. A)
Gráfica del potencial de fosforilación de cada aminoácido B) Posición y puntaje de cada
aminoácido susceptible de ser fosforilado. Los valores más cercanos a 1 tienen una
mayor probabilidad de ser fosforilados
35
Con la finalidad de demostrar esta posibilidad, los extractos totales de células
CaCo2 infectadas se trataron con fosfatasa alcalina y proteinasa K siguiendo el
protocolo descrito por fuentes y cols. (2011) y se analizaron por WB con el suero
anti-VPg2, sin embargo los resultados no fueron concluyentes por lo que se
decidió continuar con los ensayos de inmunofluorescencia.
Obtención de extractos RSB-NP40 de células CaCo2 no infectadas e
infectadas con HAstV-8
Se obtuvieron extractos totales de proteínas de células CaCo2 (no infectadas e
infectadas) con NP40, al utilizar este método, el detergente NP40 permitirá
secuestrar, además de proteínas citoplásmicas, proteínas que se encuentran en
las membranas de los distintos organélos celulares, esto nos interesa
principalmente porque recientemente se describió que la infección por astrovirus
induce la síntesis de membranas intracelulares en el citoplasma de la célula
(Méndez, 2011, comunicación personal) aparentemente cerca de la región
perinuclear asociado a membranas del retículo endoplásmico rugoso (Guix, 2005;
2007); además de que evidencias experimentales han mostrado que complejos
activos en replicación asociados a membranas obtenidos de células CFRK
infectadas con calicivirus felino se enriquecen de proteínas tanto celulares como
virales (Cancio-Lonches, 2011).
La presencia de proteínas citoplásmicas en el extracto total de NP40, se verificó
usando un anticuerpo anti-actina, revelándose la presencia de una banda de
42kDa, correspondiente al tamaño de la actina citosólica, tanto en el control de
células no infectadas, como a lo largo de la cinética de infección (Fig. 8A). Para
descartar que el procedimiento de la extracción con NP40 no removiera proteínas
de origen nuclear, se analizaron éstos mismos extractos con el anticuerpo anti-
lamina A; el resultado que se esperaba era la ausencia de bandas tanto en el
control negativo como a lo largo de la cinética de infección, sin embargo en todos
los tiempos analizados y en el control, aparecieron dos bandas, una de 62 kDa y
otra de 65 KDa que corresponden a los pesos moleculares reportados para
36
Lamina A (Fig. 8B). Esto se puede explicar por el hecho de que existen reportes
en los que muestran que concentraciones desde el 0.1% de NP40 pueden llegar a
secuestrar a Lamina A, sin que esto signifique que el núcleo pierda su estructura
(Kolb, 2011) y esto pudo ser el caso durante la obtención de los extractos totales
en la condición de células infectadas.
Como proteína marcadora de la fracción de membranas internas se usó el
anticuerpo anti-PDI (proteína disulfuro isomerasa), la cual se encuentra en el
lumen del retículo endoplásmico rugoso, y en membranas celulares. PDI se
detectó como una banda de 57 kDa tanto en el control negativo como a lo largo de
cinética de infección como se esperaba (Figura 8C).
Dado que era necesario demostrar que los extractos totales de células infectadas
estaban enriquecidos con complejos activos en replicación para usarlos
posteriormente en los ensayos de co-inmunoprecipitación y evidenciar la
presencia de VPg, no sólo en los extractos sino probablemente unida al RNA viral,
se buscó la presencia de la RNA polimerasa viral (nsP1b) proteína esencial en la
replicación y dado que en el laboratorio contamos con un suero hiperinmune que
reconoce la porción carboxilo esta proteína, evaluamos los extractos totales con
este suero hiperinmune. El resultado mostró la presencia de la RNA polimerasa
viral (57- 60 KDa) a partir de las 8 horas post-infección (Fig. 8D) y su presencia al
parecer disminuye conforme transcurre el tiempo de la infección, es decir, entre
las 10 y 12 horas post-infección, tiempo en el cual prácticamente se completa el
ciclo de replicación y no se observó ninguna banda en el carril de extractos totales
de células no infectadas. Este resultado sugiere que VPg y la RNA polimerasa
viral se hallan presentes en el mismo extracto durante la replicación viral, aunque
cabe aclarar que VPg no se buscó en los extractos obtenidos con NP40 durante la
evaluación de los sueros hiperimunes, sino hasta la realización de los ensayos de
co-inmunoprecipitación como se mencionó anteriormente.
37
Localización de VPg por inmunofluorescencia.
A partir de los resultados de la inmunoreactividad de los dos sueros hiperinmunes
obtenidos, donde uno de ellos no mostró ninguna reactividad sobre extractos de
células infectadas (VPg1) y el otro (VPg2), reconoció una banda de
aproximadamente 16 kDa en extractos NP40, se decidió determinar la localización
celular de VPg en células CaCo2 infectadas con HAstV- 8 con el suero
hiperinmune para VPg2 por inmunofluorescencia (Fig. 9).
Los ensayos realizados con el suero VPg1 no mostraron ninguna señal focalizada
con ninguna de las diluciones probadas, corroborándose los resultados obtenidos
por WB, por lo que este suero hiperimune se descartó para los posteriores
análisis. Una posible explicación del porque este péptido VPg1 no fue capaz de
despertar una respuesta inmune, probablemente se deba a que la concentración
Figura 8.- WB de extractos totales obtenidos con NP40. 60µg de extractos
totales de células no infectadas (Ni) e infectadas a distintos tiempos (2 a 12
horas) se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% y se
transferieron a una membrana de nitrocelulosa para ser evaluados por WB. A)
Anti-actina; B) Anti-lamina A; C) Anti-PDI; D)Suero hiperinmune anti-nsP1b-2.
Las bandas fueron reveladas por quimioluminiscencia con el kit Super-Signal
(Pierce) e indicadas con flechas a la derecha de cada panel. El marcador de
peso molecular utilizado fue Dual-color, Bio Rad.
38
de péptido que se eligió para la inoculación de los conejos no haya sido la
adecuada para este péptido en particular, a pesar de cubrir los requisitos de
exposición al solvente y demás características ya mencionadas o bien, se requiera
de un esquema de inoculación distinto al seguido en este proyecto.
Los resultados con el suero hiperinmune VPg2 mostraron la presencia de marca
fluorescente en células infectadas con HAstV-8 (Fig. 9E) al parecer en la zona
perinuclear y ninguna señal cuando se incubaron células no infectadas con el
mismo suero (Fig. 9D), corroborándose así los resultados de western-blot. Este
mismo diseño se siguió para evaluar el comportamiento del suero preinmune y el
resultado mostró que cuando se incubaron las células no infectadas (Fig. 9B) e
infectadas (Fig. 9C) con este suero, en ninguna de las dos condiciones
experimentales se observó señal fluorescente como se esperaba, por lo que éstos
fueron considerados los controles internos del ensayo.
Como control adicional de células infectadas, se usó el anticuerpo TYVD
observándose el puntilleo perinuclear descrito previamente cómo producto de la
infección con astrovirus (Fig. 9A).
39
Figura 9.- Inmunolocalización de VPg . Se infectaron células CaCo2 con HAstV-
8 y 20 horas post-infección se analizaron por inmunofluorescencia. A) Células
infectadas incubadas con el anticuerpo TYVD que reconoce proteínas de la
cápside (1:200) como control positivo. Células no infectadas (B) e infectadas (C)
incubadas con el suero preinmune de VPg 2 (1:20). Células no infectadas (D) e
infectadas (E) incubadas con el suero hiperinmune de VPg2 (1:20). Los núcleos
fueron teñidos con DAPI.
40
Co-localización de VPg y RE en células infectadas con HAstV-8
Como se mencionó previamente, se han reportado varias evidencias
experimentales en las que se demuestra que la infección por astrovirus se lleva a
cabo en el citoplasma asociado a la región perinuclear, co-localizando con
membranas del retículo endoplásmico rugoso, la RNA polimerasa viral (nspP1b) y
la proteína nsP1a/4, que contiene los residuos correspondientes a VPg (Guix,
2005, 2007; Fuentes 2011); Estos ensayos de inmunolocalización fueron
realizados con varios anticuerpos, uno de los cuales está dirigido contra la
proteína nsP1a/4 y otro llamado anti-NAR, que reconoce una región que va desde
el motivo proteasa (nsp1a/3 y la parte final de nsP1a), por último uno con un
anticuerpo dirigido específicamente para los residuos que corresponden a VPg, sin
embargo los resultados de co-localización no permiten observar claramente la
ubicación exacta de los complejos activos en replicación, formados probablemente
por VPg, nsP1a/4, nsp1b y proteínas de la célula que pudieran estar involucradas
en la replicación viral.
Con esto en mente, decidimos realizar un ensayo de inmunoflurescencia para
verificar la posible co-localización de VPg en la zona perinuclear y su asociación
con el RE en el contexto de células infectadas. Para este ensayo se utilizó a la
proteína PDI como marcador del RE y el resultado se analizó por microscopía
confocal; para demostrar la positividad de las células CaCo2 a la infección con
HAstV-8 se usó un anticuerpo comercial anti-astrovirus denominado MCA, del cual
no se ha reportado su uso en ensayos de inmunofluorescencia.
Los resultados mostraron que el anticuerpo comercial MCA nos permitió observar
una señal completamente perinuclear, el mismo patrón producto de la infección
por astrovirus (Fig. 10A) como se describió previamente con el suero TYVD
(Mendez, 2003); lo que nos indicó que las células estaban infectadas con HAstV-
8. Cuando se analizó el resultado obtenido con el anticuerpo anti-PDI tanto en
células no infectadas (Fig. 10B) como infectadas (Fig. 10D), éste no presentó la
señal focalizada en el RE como se esperaba, sino más bien se observó
41
mayoritariamente la señal en el citoplasma de la célula. Mientras que los
resultados obtenidos con las células infectadas incubadas con el suero anti-VPg2,
mostraron la señal fluorescente en el citoplasma y algunas señales focalizadas en
la región perinuclear como se había observado previamente. Se realizó el ensayo
de co-localización entre VPg y PDI (Fig.10D), el resultado del empalme mostró
una co-localización parcial en algunas células, sugiriendo que VPg se encuentra
asociada a las membranas del RE en células infectadas.
42
Figura 10.- Co-localización de VPg y RE. Se infectaron células CaCo2 con
HAstV-8 y 20 horas post- infección fueron procesadas para inmunofluorescencia.
A) Células infectadas incubadas con el anticuerpo MCA (1:50). (B) Células no
infectadas incubadas con el anticuerpo anti-PDI (1: 100) (C) Células infectadas
incubadas con el suero anti-VPg2 (1:100) (D) Células infectadas incubadas con
anticuerpo anti-PDI (1:100) y suero anti-VPg 2 (1:100). Los núcleos fueron teñidos
con DAPI. Las zonas de co-localización se muestran con flechas
43
Co-precipitación de VPg y RNA viral
Una vez que los ensayos de co-localización entre VPg y membranas del retículo
endoplásmico de células infectadas, sugirieron la posible ubicación celular de los
complejos activos en replicación, nos interesó buscar la unión de la proteína VPg
con el genoma viral. Para ello se realizó un ensayo de co-precipitación con
extractos totales de proteínas de células infectadas, los cuales se incubaron con el
suero anti-VPg2 y proteína G-agarosa para recuperar el complejo inmune
formado, a partir del cual se extrajo RNA total para amplificar por RT-PCR una
región conservada del ORF2 y evidenciar la presencia de VPg en el complejo
mediante western-blot.
En la figura 11 se muestran los resultados obtenidos del WB después de recuperar
el complejo inmune (extractos totales-anti-VPg-proteína G) en el cual se observó
una banda de 16 KDa aproximadamente únicamente en los extractos de células
infectadas (carril I) y ninguna banda del mismo tamaño en el complejo inmune
obtenido con los extractos de células no infectadas (carril NI).
Figura 11.- Co-precipitación de VPg. Extractos totales de células CaCo2 no
infectadas (NI) e infectadas (I) con HAstV-8 se preadsorvieron con proteína G-
agarosa y el sobrenadante recuperado se incubó con el suero anti-VPg2 (1:100)
toda la noche a 4°C. El complejo resultante se inmovilizó nuevamente con
proteína G y el sobrenadante recuperado se separó en un gel desnaturalizante de
poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE), el cual se transfirió a una membrana de
nitrocelulosa y se evaluó por WB con el suero anti-VPg2. La presencia de VPg se
indica con una flecha. Cómo marcador de peso molecular se utilizó Dual-Color
(Bio Rad).
44
En cuanto a los resultados de RT-PCR, se realizaron varios ensayos y no se logró
obtener la amplificación del ORF2 de HAstV-8. Se intentó amplificar otra región del
genoma de astrovirus la cual contiene a la RNT 5’ y parte del ORF1a (nucleótido 1
al 101) y tampoco fue posible observar ninguna banda en el RNA obtenido del
complejo inmune formado con los extractos de células infectadas.
Existen varias posibilidades que expliquen este resultado, una de ellas es que la
cantidad de RNA extraído no fue suficiente para llevar a cabo la reacción de RT-
PCR, otra posibilidad es que el tratamiento del complejo inmune con proteinasa K
para liberar al RNA de las proteínas asociadas no fue suficiente y por lo tanto los
oligonucleótidos no reconocieron sus respectivas secuencias dentro del genoma
viral y otra posibilidad es que una vez llevado a cabo el tratamiento con proteinasa
K, esta no se inactivó correctamente y probablemente se degradaron ambas
enzimas por lo que no fue posible sintetizar el cDNA y amplificarlo.
Estos resultados, obligan a realizar cambios en las condiciones experimentales
probadas en este trabajo con la finalidad de demostrar la asociación de VPg con el
genoma viral en trabajos futuros.
45
DISCUSIÓN
El ciclo replicativo de los virus de RNAcs+ es un proceso altamente organizado y
coordinado, que está regulado por diversas interacciones entre componentes de
la célula blanco y elementos virales principalmente entre las RNTs presentes en
el RNA viral y proteínas. Se han reportado infinidad de proteínas celulares que
interaccionan con las RNTs, entre las más conocidas están el factor EF-1alfa,
PCBP, PABP, hnRNPs y PTB por mencionar solo algunas (Li y Nagy, 2011);
además de estas, también se ha descrito la interacción de proteínas virales con
las RNTs como las RNA polimerasas dependientes de RNA, proteasas, helicasas
y en algunos casos, una proteína llamada VPg, todas ellas implicadas en el ciclo
replicativo.
Ahora bien, estas interacciones RNA-proteínas no es sólo la consecuencia de que
el ciclo replicativo pueda llevarse a cabo, sino que es el paso previo para hacer
más eficiente el “switch” entre traducción y replicación, mediado esto, en gran
parte por la capacidad de los genomas virales de circularizarse, ya sea a través
de estas interacciones o de interacciones RNA-RNA previo al reclutamiento de los
complejos activos en replicación, estructuras donde se reúne toda la maquinaria
necesaria para la formación de nuevos virus los cuales se forman dentro de la
célula para aumentar la eficiencia de replicación (Nagy y Pogany, 2012), proteger
a los virus de los mecanismos de defensa de la célula, tales como nucleasas y
proteasas, además de evadir el sistema inmune (Den Boon, et al, 2012. Wang y Li,
2011).
En el caso de astrovirus, no se conoce que interacciones RNA-proteína regulan la
replicación y traducción; en nuestro laboratorio se están explorando las
interacciones entre las RNTs 5' y 3' de HAstV-8 y proteínas provenientes tanto de
la célula como proteínas virales que permitan conocer como está conformado el
complejo replicativo de astrovirus. Evidentemente una de las proteínas a buscar
dentro de este complejo es VPg, ya que su presencia en el extremo 5’ la hace un
46
blanco idóneo para comenzar a describir los mecanismos antes mencionados por
lo que nos dimos a la tarea de buscar a esta proteína en el citoplasma de células
CaCo2 infectadas con HAstV-8.
La estrategia que se siguió consistió en el diseño de dos péptidos sintéticos con
los cuales se inocularon conejos y se obtuvieron sueros hiperimunes; estos se
evaluaron por diferentes métodos, WB, e inmunofluorescencia y dado que VPg
debe estar unida al extremo 5' del genoma viral estudiamos su posible interacción
mediante ensayos de co-inmunoprecipitación.
La evaluación de la inmunoreactividad de los sueros generados, nos permitió
determinar que únicamente el suero hiperinmune denominado VPg2 reconoció a
VPg en las células CaCo2 infectadas con HAstV-8; mientras que el suero VPg1 no
bajo ninguna de las dos vías seleccionadas, western-blot e inmunofluorescencia a
pesar de cumplir con los criterios descritos en los resultados; probablemente éste
péptido requiera ser inoculado a una dosis mayor, o bien aumentar el número de
inmunizaciones, otra posibilidad es que la secuencia se encuentre modificada in
vivo, es decir, que se formaran puentes disulfuro o formas fosforalidas del péptido
que provocaran que la secuencia no fuera reconocida por el sistema inmune de
manera eficiente, además de que el suero generado pudo no ser capaz de
reconocer VPg. Ahora bien, aún cuando en el ensayo de WB realizado con el
suero anti-VPg2 se observó la banda de 16KDa a las 8 hpi y que corresponde al
peso calculado a partir de los residuos 665 a 804 para la VPg de HAstV-8, se
observaron otras bandas de mayor peso molecular que podrían corresponder a
precursores de la proteína, es decir, productos generados a partir del corte por
proteasas celulares o virales de la proteína nsP1a/4 que contiene a VPg (Fig. 3) o
bien corresponder a formas fosforiladas de la proteína, cuya relevancia radica en
que nsP1a/4 establece interacciones proteína-proteína con nsP1b (polimerasa
viral) y bajo este estado fosforilado la replicación de astrovirus es más activa
(Fuentes et. a, l2011). Para explorar esta última posibilidad, se buscaron sitios
que fueran susceptibles a fosforilación mediante un análisis con el software
47
NetPhos 2.0, y se encontraron 7 sitios potenciales de fosforilación para la VPg de
HAstV-8, principalmente en residuos de tirosina en las posiciones 30, 57, 60, 65,
66 y 84, explicando así la aparición de bandas adicionales. Se evaluó
experimentalmente la posibilidad de que VPg estuviera fosforilada, pero los
resultados no fueron concluyentes por lo que deberán repetirse para contestar
esta interrogante. Que VPg se fosforíle, además de ser importante para la
replicación, probablemente también lo sea para la traducción como se ha
reportado para otros virus de RNAcs+ por lo que esta posibilidad habrá que
determinarla en astrovirus (Daughenbaugh et al, 2006; Goodfellow et al, 2005;
Kaiser et al, 2003; Léonard et al, 2000; Tavert-Roudet et al, 2012). La fosforilación
de VPg no se ha estudiado exhaustivamente, pero se cree que en potivirus la
fosforilación implica una posible activación de la proteína para comenzar la
replicación del genoma viral (Puustinen et al, 2002), sin embargo, no se ha
establecido cual es el papel que desempeña esta modificación dentro del ciclo
replicativo.
Una de las incógnitas de la replicación de astrovirus es la localización celular del
complejo replicativo responsable de la síntesis del RNA viral de novo, los cuales
se cree están asociados al RE dada la similitud con otros virus como Bromovirus,
Picornavirus y el virus de la Hepatitis C, los cuales se replican en este
compartimiento celular (Salonen et al, 2004). Para comenzar a dilucidar en que
compartimento celular se concentran los componentes del complejo replicativo de
HAstV-8, se consideró pertinente evaluar si en extractos totales obtenidos con
NP40 de células infectadas se encontraba la polimerasa viral (nsP1b) para
después demostrar la unión de VPg al RNA viral, ya fuese por inmunofluoresencia
o por co-inmunoprecipitación. Los resultados de western-blot revelaron que la
RNA polimerasa se encuentra enriquecida en los extractos totales de células
infectadas e interesantemente esta aparece a las 8hpi al igual que VPg, esto
sugiere que la presencia de ambas proteínas en el mismo compartimento (fracción
citoplásmica enriquecida con membranas) muy probablemente están participando
en el proceso replicativo de astrovirus.
48
Con esto en mente, buscamos la localización celular de VPg en células infectadas
y tratamos de determinar si esta co-localizaba tanto con la RNA polimersa viral
así como con membranas del RE. Resultados preliminares del laboratorio en los
cuales se probó la inmunoreactividad de un suero hiperinmune por
inmunofluorescencia el cual reconoce la porción carboxilo terminal de la RNA
polimerasa viral, no mostraron una señal convincente y dado que se tenía poco
suero, se buscó únicamente la co-localización de VPg y membranas del RE en el
contexto de células infectadas. Los datos de inmunofluorescencia y de
microscopia confocal con el suero anti-VPg2 revelaron la localización de VPg en
la zona perinuclear cercana al RE de células infectadas, hecho que sustenta lo
descrito (Guix, 2004, 2005, 2007; Fuentes et al, 2011; Méndez, 2011). Por otro
lado, mientras se llevaba a cabo este proyecto, Fuentes y cols, (2012) describieron
la presencia de VPg en HAstV-4 estableciéndose que ésta es esencial en la
infectividad del virus, ya que versiones mutadas de VPg y que fueron
transfectadas en células BHK21, mostraron ser letales para la replicación de
HAstV, principalmente la mutación en la tirosina 693, residuo que se considera es
el responsable de la unión de VPg al RNA viral (Fuentes, et.al., 2012).
Los datos publicados recientemente dan una idea clara de la participación de VPg
en la infección, es importante señalar que el suero empleado por Fuentes y cols,
no muestra una localización clara de VPg y sus respectivas formas mutadas por lo
que no se sabe si co-localizan o no con el RE; mientras que el suero hiperinmune
generado por nuestro grupo de trabajo, muestra claramente la ubicación celular de
VPg en la región perinuclear y una cierta co-localización con RE en el contexto de
células infectadas con HAstV-8 aunque será necesario repetir este ensayo, ya sea
cambiando de proteína marcadora de RE o bien de anticuerpo que permita evaluar
de forma concluyente dicha asociación. Por otro lado, aún cuando se trato de
determinar la unión de VPg al extremo 5' del genoma viral co-precipitando dicha
unión con el anti-VPg2 para amplificar el genoma viral por RT-PCR y pudimos
obtener un resultado positivo, consideramos que esto se debió a un problema
49
técnico y no al hecho de que VPg no esté unida al extremo 5' del genoma de
HAstV-8. Para lograr el resultado esperado, probablemente sea necesario
aumentar la cantidad de células utilizadas para extraer RNA del virus, para de esta
manera aumentar la posibilidad de amplificar el fragmento de interés por RT-PCR,
y así demostrar la unión de VPg el genoma viral.
50
CONCLUSIONES
A partir de los resultados encontrados en este proyecto de investigación, se
obtuvieron los siguientes logros:
Se diseñaron dos péptidos, VPg1 y VPg2 para la proteína VPg, a partir de
la secuencia reportada para astrovirus serotipo 8, cuyas características de
superficie expuesta al solvente, alto índice de inmunogenicidad y
secuencias con seis o más aminoácidos, resultaron ser los más indicados
para generar una mayor respuesta antigénica.
De los dos sueros hiperimunes obtenidos, sólo el denominado VPg2
reconoció la presencia de VPg en células infectadas CaCo2 infectadas con
HAstV-8.
Al parecer VPg co-localiza con membranas del retículo endoplásmico en
células infectadas con HAstV-8, sugiriendo la posible ubicación celular de
los complejos activos en replicación.
PERSPECTIVAS
Determinar la función de VPg en el ciclo replicativo de astrovirus, partiendo del
hecho de que su posible estado fosforilado sea una determinante importante tanto
para la replicación como para la traducción.
Establecer que proteínas están interaccionando con VPg coadyuvando en su
función en el ciclo replicativo del virus.
Definir que proteínas celulares y/o virales interacción con la RNT 5' con la finalidad
de conocer la composición del complejo activo en replicación y definir si este
requiere de interacciones RNA-proteínas para su reclutamiento y se inicia vía una
interacción RNA-RNA.
51
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Immune epitope data base and analysis resource http://www.immuneepitope.org/
GETAREA http://curie.utmb.edu/getarea.html
Ramachandran Plot http://swift.cmbi.ru.nl/servers/html/ramaplot.html
NetPhos2.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/
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