INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL - BIBLIOTECA UPIBI Didactico/manual... · 1.5 Determinación de...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

PRÁCTICA 1

Determinación de actividad enzimática y efecto de la concentración de enzima, pH, temperatura y fuerza

Iónica en la actividad enzimática (alfa-amilasa). La Práctica 1 incluye 6 módulos de iniciación de técnicas analíticas y manejo de equipo (1.1 a 1.6) necesarias para el curso y las tres últimas están enfocadas tema central relativa actividad enzimática, parte fundamental del desarrollo del curso.

Contenido 1.1 Capacitación para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio. ...... 2 1.2. Capacitación para el uso de espectrofotómetros y centrífugas. ............ 7 1.3. Preparación de reactivos requeridos en el laboratorio de

bioconversiones. ................................................................................................. 13 1.4 Determinación de crecimiento celular por turbidimetría (D.O.), peso

seco, proteína y cuenta directa en cámara de Neubauer. ........................ 14 1.5 Determinación de azúcares reductores y azúcares totales. ................... 17 1.6 Determinación de la concentración de proteína de las enzimas

elegidas. ................................................................................................................. 20 1.7 Medición de la actividad catalítica de enzimas y/o de extractos crudos

enzimáticos: Amilasas. ...................................................................................... 23 1.8 Efecto de la concentración de enzima y fuerza iónica en la actividad de

la enzima elegida. ................................................................................................ 25 1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática. ...................... 27 Cada módulo se llevará a cabo en una o más sesiones, las cuales serán determinadas por el profesor, requiriéndose para toda la práctica un máximo de 9 sesiones (cinco semanas)

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1.1 Capacitación para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio.

USO DE MICROPIPETAS AUTOMÁTICAS En las prácticas de Bioquímica los volúmenes de las soluciones que se necesitan medir son del orden de microlitros (μL). Para tomar estas cantidades con exactitud y reproducibilidad se emplean micropipetas, ya sean de volumen fijo o variable. Los errores de medida que se pueden cometer dependen principalmente del usuario y no de la micropipeta en sí, a menos que esta no esté bien calibrada. Para que las medidas sean correctas se debe de tener en cuenta las siguientes consideraciones: La pipeta debe de mantenerse siempre en posición vertical durante todo el proceso de pipeteo, nunca inclinada. También, cuando la pipeta no se utilice se debe dejar siempre en posición vertical en el soporte de pipetas. Nunca la deje horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga líquido succionado. Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden solamente un volumen determinado. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un intervalo de valores determinado. En éstas, no se deben ajustar volúmenes superiores o inferiores a los que se recomiendan para cada pipeta. Los modelos que toman volúmenes inferiores a 200 μL usan puntas amarillas (o blancas), y las micropipetas que toman volúmenes superiores a 200 μL hasta 1 mL usan puntas azules (en algunos casos son blancas). Las pipetas que manejan volúmenes mayores de 1 o de 0.5 y 10 μL, pueden usar otro tipo de puntas específicas. La pipeta se agarra como si se tomara una empuñadura. La parte superior debe de reposar sobre su dedo índice (Fig. 1). Todas las pipetas tienen dos topes:

1) Primer tope para tomar el volumen calibrado.

2) Segundo tope para expulsar de forma más eficiente el volumen tomado y se usa solo cuando se está expulsando el contenido. .

Si antes de tomar la muestra, se lleva hasta el segundo tope, se tomará un volumen mayor al deseado, un volumen ERRONEO- El segundo tope es para sacar de forma más eficiente el volumen establecido

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Primer Tope

Segundo Tope

1 2 3 4 Posición Inicial

Fig. 1 Manera de asir una pipeta automática y tomar una muestra (presión

del émbolo).

Tanto la presión como la liberación del émbolo de la pipeta se debe de realizar lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas dentro de la punta de la pipeta, que alterarían los volúmenes; así mismo se podría ensuciar la parte interna de la pipeta. También se pueden formar burbujas o tomar un menor volumen si la punta no está bien ajustada a la pipeta. Procedimientos para medir correctamente un volumen con una micropipeta

1. Seleccionar la pipeta adecuada para medir el volumen deseado (que esté dentro del intervalo establecido para la pipeta).

2. El volumen requerido se fija girando el émbolo (Fig. 2). Se debe girar suavemente (evitar estar cambiando constantemente los volúmenes, para evitar descalibrar las pipetas).

Fig. 2 Manera de fijar el volumen deseado. 3. Colocar una punta desechable en el vástago de la pipeta (Fig. 3);

asegurando que esté bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de torsión y presionando. Tener cuidado de no presionar mucho porque esto hace que la punta quede atorada fuertemente dificultando retirarla.

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Figura 3 Figura 4

4. Tomar la muestra presionando suavemente el émbolo con el pulgar hasta el primer tope.

5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no más de 3 mm de la

superficie de líquido, manteniendo la pipeta en posición vertical (Fig. 4).

6. Succionar el líquido, relajando suavemente y controlando la presión con el dedo pulgar, sin permitir que el émbolo suba por sí solo. Se espera un par de segundos con la punta introducida en el líquido.

7. Retirar la punta de la muestra.

8. Introducir la punta de la pipeta en el tubo o frasco donde se va a verter,

colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solución.

9. Presionar el émbolo lentamente, llevándolo hasta el primer tope.,

continuando inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la totalidad del líquido que está en la punta.

10. Con el émbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la

pipeta, deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo.

11. Llevar el émbolo a la posición inicial, controlando con el dedo (sin permitir que el émbolo suba por sí solo).

12. Sacar la punta de la pipeta, presionandoel expulsor de puntas o tirando

de ella, (Fig. 5).

En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la mezcla, una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope. El procedimiento completo se esquematiza en la Figura 6.

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Figura 5 Figura 6

http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropipetas.htm

TRABAJO PRÁCTICO

Cada equipo realizará lo siguiente: 1. Elegir la micropipeta adecuada para 20, 200 o 1000 μL. Seleccionar el

volumen indicado en la tabla 1 y colocar la punta adecuada.

2. Tomarla muestra indicada como se indicó anteriormente.

3. Transferir el líquido a un tubo Eppendorf, colocando la punta de la micropipeta en la pared interna del tubo Eppendorf al cual se va a transferir la muestra, depositar la muestra según el procedimiento ya indicado.

4. Eliminar la punta en un recipiente determinado para este fin, colocando

encima del recipiente la punta y presionando el pistón ubicado en la parte inferior, atrás del pistón de succión. Cada vez que se agregue un volumen seleccionado, se registrará su peso en la balanza (dependiendo de la sensibilidad de la balanza), cada volumen se hará por duplicado.

IMPORTANTE Cuando se vaya a pipetear solvente volátiles, como diclorometano, acetona, cloroetileno, cloroformo, etc. Antes de tomar la muestra, se debe saturar la pipeta con el solvente. Esto se logra introduciendo la punta en el solvente y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope. Finalmente teniendo al punta en el solvente bajar el embolo hasta el primer tope y tomar toda la muestra llevando hasta la posición inicial. Cuando no se satura, al sacar la punta el solvente se sale de punta, debido a que se volatiliza dentro de la misma. Cuando se tomas muestras viscosas o densas como el glicerol, debe esperar a que suba muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrará aire. Esto indica que aún no se había tomado todo el volumen y se debe repetir todo el procedimiento.

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Ensayar varias veces este procedimiento con las diferentes micropipetas así como cambiar los volúmenes de acuerdo a las tablas 1 y 2:

Tabla 1. Volúmenes de agua a seleccionar para el uso de micropipetas.

1000 μL 200 μL 20 μL 600 150 16 200 100 12 100 50 8

4 1

Tabla 2. Volúmenes de glicerol a seleccionar para el uso de micropipetas.

1000 μL 200 μL 20 μL

600 150 20 200 100 10

Practicar con el profesor la toma de muestras volátiles

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1.2. Capacitación para el uso de espectrofotómetros y centrífugas. Fotometría La fotometría o "medida de la luz" es un método óptico de análisis dentro del cual se encuentran la colorimetría y la espectrofotometría, que miden la cantidad de luz absorbida por sustancias colorido o colorido e incoloras respectivamente. La luz es una forma de energía electromagnética, igual que los ultravioletas, infrarrojos etc. Que es irradiada a partir de una fuente energética en líneas o rayos virtualmente rectos. Se propaga en el vacío sin necesitar sustancia transportadora. Dentro de su trayectoria rectilínea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran perpendicularmente a su dirección de desplazamiento y cuya longitud de onda se sitúa entre 380 y 780 nanómetros. Longitud de onda: Es la distancia entre dos picos sucesivos de una onda. La luz que percibe el ojo humano es la luz visible y comprende desde 400 a 700 nm. Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama infrarroja; entre 100 y 400 nm es radiación ultravioleta (UV). Las medidas de absorción de luz se basan en dos leyes, la ley de Lambert y la ley de Beer. Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta. I0 I = I0 ⋅ 10 -K.L log = K ⋅ L I donde:

I = intensidad de luz transmitida I0 = intensidad de luz incidente K = coeficiente de extinción L = espesor de capa K es el coeficiente de extinción definen cuan fuertemente una substancia absorbe la luz a una dada longitud de onda, por unidad de masa o por concentración molar. Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente (Fig 1), su intensidad disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentración de la sustancia absorbente en el medio. I0 I = I0 ⋅ 10 –K’.C log = K’ ⋅ C I donde C = concentración de la sustancia absorbente

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Sol.Absorbente concentración C

Rayo incidente Rayo emergenteLuzmonocromática

Intensidad I0 Intensidad IL

Espesor de la solución Figura 1. Diagrama del paso de luz monocromática a través de una solución Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer: I0 I = I0 ⋅ 10-ε⋅C⋅L log = ε ⋅ c ⋅ L I donde ε = coeficiente de extinción molar ε es el coeficiente de extinción cuando la solución contiene un mol por litro. El cociente de las intensidades se conoce como transmitancia (T) y se suele expresar como un porcentaje I - ε⋅c⋅L I T = =10 %T = x 100 I0 I0 I0 La expresión log se conoce como absorbancia (A) o densidad óptica (DO) I0 A = D.O. = log = ε ⋅ c ⋅ L ; para L=1, A = ε⋅c I T y A quedan relacionados de la forma A = - log T = 2 - log %T ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROFÓTOMETRO Espectrofotómetros: Los métodos fotométricos de análisis utilizan los efectos de la interacción de las radiaciones electromagnéticas con las moléculas. Los aparatos de medición de la absorción de la radiación electromagnética se denominan "espectrofotómetros" y están constituidos de forma general de (Fig 2): Una fuente de luz, un monocromador, que desdobla la luz en haces monocromáticos, de un colimador que tiene una rendija de ajuste variable, pasando a través del mismo sólo luz de una determinada longitud de onda. La utilización de la luz monocromática o de un intervalo pequeño de longitudes de onda es importante, ya que la ley de Lambert-Beer solo se cumple en estas condiciones.

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La luz que sale del colimador se hace pasar por la solución y luego incide sobre el fototubo donde es detectada. La señal se envía a un registrador que convierte la señal a un registro análogo, digital o gráfico. En algunos colorímetros este registro consta de dos escalas, una mide absorbancias (A) y la otra transmitancias (T). La escala de A va desde 0 a ∞ , la de T va desde 0 a 100, en sentido contrario.

FototuboColimador

Celda con muestra

Registro

Fuente de luz

Monocromador

%T 0 100A ∞ 0

Figura 2. Esquema de las partes básicas de un espectrofotómetro Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se introduce una CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de transmitancia y a cero de absorbancia. Posteriormente, se introduce una celda con la muestra y se lee sea la transmitancia o la absorbancia a la longitud de onda determinada. Colorímetros: Los métodos colorimétricos son una aplicación de la espectroscopía y se basan en la medida de la absorbancia de una solución coloreada en la región visible del espectro (400-700 nm). La fuente de luz suele ser una lámpara de wolframio. Los compuestos no coloreados se transforman en otros con color, susceptibles de ser medidos colorimétricamente, mediante reacción con compuestos adecuados, y de esta forma se puede analizar en la región visible del espectro compuestos coloreados y sin color y ampliar sus posibilidades de utilización.

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CAPACITACIÓN PARA EWL MANEJO DE ESPECTOFOTÓMETROS

Actividad en laboratorio: Los maestros de laboratorio indicarán cómo operar y programar los equipos. El alumno deberá anotar en su bitácora cada paso y realizar un diagrama de flujo de los pasos, así como las consideraciones que hay que tener en el manejo, mantenimiento y limpieza del equipo. Existen diferentes modelos de espectrofotómetros en los laboratorios de docencia, de investigación y una gran gama en el mercado. Para el laboratorio se utilizarán dos o tres modelos, se debe aprender el manejo de cada uno. Para la lectura de muestras se utiliza celdas o cubetas de cuarzo o desechables de plástico, existen de diferentes volúmenes de operación 4, 2 y 1 mL. Antes de usar, siempre regístrese en la libreta de control del equipo.

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CENTRÍFUGA BECKMAN J2-MC

Antes de usar, siempre regístrese en la libreta de control del equipo.

Rotores: JA-20 para 8 tubos de 45 mL JA-14 para 6 tubos de 250 mL. Asegúrese de equilibrar los tubos de centrífuga con la muestra en una balanza. Se puede hacer con la misma sustancia o puede usar un contrapeso de agua. Para abrir: • Mueva el interruptor a la posición ON. • Accione la palanca de apertura (al lado derecho de la puerta)

Para programar: • Oprima ROTOR e introduzca el número 14 ó 20, dependiendo del tipo de

rotor a usar. • Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm). (verificar las velocidades

máximas para cada rotor, para esto existe una tabla) • Oprima TIME y teclee el tiempo (h : min). • Oprima TEMP y teclee la temperatura (° C) • Al terminar la selección, oprima ENTER.

Para operar: • Coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias

(encontradas).Los contrarios deben tener el mismo peso • Coloque la tapa del rotor. • Cierre la centrífuga. • Permita que el equipo enfríe a la temperatura indicada antes de comenzar

el programa. • Oprima el botón START para iniciar el programa. • Se puede abortar oprimiendo el botón STOP. NOTAS: • La palanca de apertura solo funciona con el equipo encendido. • Apague el equipo manteniendo la puerta abierta para permitir que la cámara

de la centrífuga se deshiele. Asegúrese de secar la cámara. Proceda a cerrar el equipo.

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CENTRÍFUGA HERMLE Z300

Antes de usar, siempre regístrese en la libreta u hoja de control del equipo. Cuenta con tres Rotores para: 24 tubos Eppendorf de 1.5 mL

12 tubos Falcon de 15 mL 6 Tubos Falcon de 50 mL

Para cambiar rotor: • Utilice la llave del equipo. La rosca es izquierda. Girar a la derecha para aflojar,

Girar a la izquierda para apretar. Para abrir: Oprima el botón de apertura. El equipo solo se abre cuando el LED (foco o luz verde) está encendido, señal que el rotor se ha detenido y que es posible abrir. Precaución al abrir, la tapa no tiene un tope, por lo que se requiere apoyarla lentamente. Para programar: • Mantener oprimido el botón preset • Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla • Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla Para operar: • Coloque cada par de tubos equilibrados en peso (con el mismo peso) en

posiciones encontrada (contrarias). Los tubos deben estar equilibrados por par (no todos los del rotor), pero es imprescindible que los tubos encontrados tengas el mismo peso.

• Coloque la tapa del rotor (si éste posee una). • Cierre la centrífuga. • Oprima el botón start para iniciar el programa. • Se puede parar oprimiendo el botón stop. En caso de que, por alguna falla en el suministro eléctrico, la pantalla se muestre intermitente, desconecte el equipo, espere unos segundos y conéctelo nuevamente. Proceda con la programación.

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1.3. Preparación de reactivos requeridos en el laboratorio de bioconversiones. Reactivo de Bradford Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol al 95%. A esta solución se le añaden 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v). La solución resultante se diluye a un volumen final de 1L. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G-250, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de ácido fosfórico. Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser café. Si tiene un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario. Reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) 1. Disolver 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada hasta obtener un volumen final de máximo 50 mL. 2. Agregar 1.6 g de NAOH previamente disueltos en 10 mL de agua destilada. 3. Agregar 1.0 g de DNS previamente disuelto en 20 mL de agua destilada. 4. Aforar a 100 mL con agua destilada. 5. Guardar en obscuridad y en frasco ámbar. Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener cuidado con los volúmenes que se manejan, por que el volumen final no debe ser mayor a 100 mL. Para esto, se aconseja ir disolviendo el tartrato de sodio agregando agua hasta lograr el volumen final de 50 mL (no agregar 50 mL de agua a la sal por que dará un volumen mayor) . Solución de Almidón 1% (p/v) Suspender 1g de almidón en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, el cual deberá estar tibio o caliente. Posteriormente desnaturalizar calentando en baño de agua a 60 °C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidón. Solución de alfa-amilasa La concentración de enzima será indicada por el profesor y será en mg de proteína o enzima por mL de regulador de fosfatos, 0.1 M, pH 7.0. Solución de antrona Disolver 0.2 g de antrona en 5 ml de etanol y aforar a 100 ml con H2SO4 al 75%. Para preparar el ácido al 75%, se debe realizar en la campana de extracción, en un baño de hielo, colocar el matraz o pobreta que contienen el agua en el baño e ir agregando lentamente por las paredes el ácido. Usar material de seguridad, lentes y guantes.

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1.4 Determinación de biomasa microbiana por turbidimetría o Densidad Óptica (D.O.), peso seco y cuenta directa en cámara de Neubauer. La determinación biomasa microbiana puede realizarse por varios métodos tanto directos como indirectos, tres de estos son: 1. Densidad óptica (D.O.) o turbidimetría 2. Peso seco 4. Cuenta en cámara de Neubauer PARTE EXPERIMENTAL 1) Densidad óptica A partir de muestras obtenidas de una cinética de crecimiento, es decir del medio de cultivo a través del tiempo, (o a partir de diluciones de un cultivo concentrado), obtener la densidad óptica de las muestras leyendo a 600 nm. Las lecturas no deben ser mayores a 1 de absorbancia, es ese caso es necesario realizar diluciones, para obtener el intervalo de lectura menor a 1. El blanco es el medio de cultivo fresco utilizado; así mismo, éste se debe usar para las diluciones en muestras que den lecturas mayores a 1. Se entregará un cultivo microbiano, el cual se leerá la DO a 600 nm y a partir de la lectura se establecerán 5 diluciones para leer. Con las lecturas graficar la densidad óptica vs. dilución. La DO se puede graficar vs concentración de proteína extracelular, peso seco, numero de células, proteína celular, etc. Haciendo posible correlacionarlas 2) Peso seco a) Etiquetar charolas de aluminio y ponerlas a peso constante a 60ºC por 24

horas en una estufa, enfriar en desecador y pesar. b) Tomar una alícuota de 10 a 15 mL de la suspensión celular (de cada dilución

hecha para DO) y colocarlo en un tubo de centrífuga. c) Centrifugar las muestras a una velocidad de 6000 rpm durante 5 min.

Recuerde equilibrar los tubos antes de centrifugar. d) Eliminar el sobrenadante y resupender la pastilla celular en un poco de agua

destilada y pasarla a una charola a peso constante y previamente pesada. e) Dejar las charolas en una estufa a 60ºC por 24 h o hasta que la pastilla este

completamente seca, enfriar en desecador y pesar cada charola. f) El peso seco se obtiene de la diferencia entre el peso final y el inicial de cada

charola. g) Graficar peso seco vs DO y vs no de de células/mL.

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3) Cuenta directa en Cámara de Neubauer La cámara de Neubauer es una cámara adaptada para ser utilizada en un microscopio de campo claro o de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, con el fondo marcado con una una cuadrícula (Fig 1). Es un cuadrado de 3 x 3 mm, subdividido en 9 áreas de 1mm2 cada una. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie de cada área y el cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1 microlitros). Las diferencia entre las áreas 1,3,7 y 9; 4,2,6,8 y la 5 son las subdivisiones, lo que permite en ese orden contar células de mayor a menor tamaño, contando bacterias y levaduras en el área 5, que cuenta con 25 subdivisiones y se observa en 40 o 100X

Se deben contar el número de células de cuatro o cinco cuadros de un área, la concentración en la suspensión celular será:

Cél/mL = N X 104 X F (ecuación 1) Donde: N: La media de las células contadas (suma de células contadas por subdivisión/Número de subdivisiones contadas) 25: es el número de cuadrados en cada grilla. 104: factor para pasar el número de células en el cuadrado central (volumen = 0.1mm3 = 0,1μL) a número de células por mL (1000mm3 = 1000μL=1 mL) F: factor de dilución

Figura 1. Grilla de conteo de la cámara de Neubauer (Fugelsang and Edwards,

2007).

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El conteo con la cámara se lleva a cabo de la siguiente forma:

a) Limpiar cuidadosamente con papel de arroz la cámara de Neubauer. b) Colocar el cubreobjetos sobre los canales, tal como se indica en la figura

1. c) Agitar la suspensión celular para tener una muestra homogénea. d) Con ayuda de una pipeta serológica de 1 mL o con una pipeta

automática de 100 µL, tomar 0.1 mL de la suspensión y colocar la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos; dejar que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Si se forman burbujas se debe repetir la operación, lavando y secando la cámara previamente.

e) Colocar la cámara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo 10x.

f) Localizar el cuadro central de la rejilla (ubicando la cuadrícula de 25 cuadros de 0.04 mm2), hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y contar el número de células de 4 o más subdivisiones. Evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna.

g) En caso de que el número de células sea muy elevado y se dificulte su conteo, será necesario diluir la suspensión en una proporción conocida, la que deberá ser tenida en cuenta en la estimación final.

h) Calcular el número de células con la ecuación 1 Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications and procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).

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1.5 Determinación de azúcares reductores y azúcares totales.

1) Azúcares reductores

• Colocar 0.1mL mL de reactivo de DNS en un tubo Eppendorf, posteriormente adicionar 0.1, de la solución problema. Se puede homogeneizar con la punta.

• Se puede sellar la tapa del tubo con Egapack, para evitar que se abran durante la ebullición.

• Poner a baño maría (ebullición) por 5 min. • Llevarlo después a hielo por 10 min. • Añadir a 1mL de agua destilada. • Agitar en el vortex y dejar hasta que esté a temperatura ambiente,

posteriormente: • Leer la absorbencia a 540nm.

1.1 Curva tipo de maltosa. La curva patrón se realiza con maltosa en un rango de concentración de 0 a 2.0 g/L Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1 y tratarla de acuerdo a la técnica de azúcares reductores.

Tabla 1. Diluciones para la curva patrón de maltosa.

Tubo

Concentración de maltosa en la

muestra (g/L)

Volumen de la solución de

maltosa de 2 g/L (mL)

Volumen de agua destilada

(mL)

1. (Blanco) 0.0 0.00 1.00 2 0.2 0.1 0.9 3 0.4 0.2 0.8 4 0.6 0.3 0.7 5 0.8 0.4 0.6 6 1.0 0.5 0.5 7 1.2 0.6 0.4 8 1.4 0.7 0.3 9 1.6 0.8 0.2 10 1.8 0.9 0.1 11 2.0 1.0 0.0

Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotómetro.

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Elaborar la curva patrón en donde se grafique en el eje de las ordenas (eje“y”) promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y el en el eje de las abscisas (eje”x”) el promedio de la concentración de maltosa determinada en g/L.

Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros:

y = mx + b

En donde “y” representa la absorbancia determinada a 540 nm. “x” representa la concentración de maltosa determinada en g/L.

La curva patrón será correcta cuando se obtenga una r mayor o igual a 0.98, con lecturas de absorbancia entre 0 y 1.

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2) Azúcares Totales por el método de Antrona

Solución de antrona: 0.2 g de antrona disuelta en 5 ml de etanol, y aforar a 100 Ml con H2SO4 al 75%. (ver práctica 1.3)

• Adicionar 0.2 mL de muestra en un tubo Eppendorf, posteriormente

adicionar lentamente 1 mL de solución de antrona, agregar la antrona lentamente, es una reacción exotérmica. Cuando este método se realiza con volúmenes mayores ej 1 mL de muestra y 5 de antrona debe realizarse en frio (en baño de hielo porque es muy exotérmica)

• Agitar en Vortex y luego llevar a ebullición en baño Maria durante 10 min (cuidado de que no se abras los tubos, es muy ácido, se recomienda sellar las tapas con una tira de “Egapack”).

• Enfriar en hielo (para detener la reacción). Posteriormente sacar del hielo y dejar a temperatura ambiente

• Leer a 650 nm (cuando la muestra ya esté a temperatura ambiente). 2.2 Curva tipo de sacarosa.

La curva patrón se realiza con sacarosa en un rango de concentración de 0 a 100 mg/L Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 2 y tratarla de acuerdo a la técnica de antrona.

Tabla 2. Diluciones para la curva patrón de sacarosa.

Tubo

Concentración de sacarosa en la

muestra (mg/L)

Volumen de la solución de sacarosa

100 m g/L (mL)

Volumen de agua destilada

(mL)

1. (Blanco) 0.0 0.0 1.0 2 10 0.1 0.9 3 20 0.2 0.8 4 30 0.3 0.7 5 40 0.4 0.6 6 50 0.5 0.5 7 60 0.6 0.4 8 70 0.7 0.3 9 80 0.8 0.2 10 90 0.9 0.1 11 100 1.0 0.0

Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotómetro.

Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros:

y = mx + b

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1.6 Determinación de proteína. Objetivo Determinar la concentración de proteína de una solución enzimática con el método de Bradford. Introducción La determinación de la concentración de proteínas puede realizarse por varios métodos, entre ellos: 1. Leyendo la absorbancia a 280 nm, si se conoce el valor de su ∈280 [g-1L

cm-1], por ejemplo para la albúmina de suero bovino (BSA) su ∈280 [g-1L cm-1] es de 0.667. *∈280: coeficiente de extinción a 280 nm (en la región Ultravioleta del espectro de luz)

Si no se conoce el coeficiente, se puede hace una curva tipo con la albúmina de suero bovino (BSA), como se indica en la tabla 3: Tabla 3. Curva patrón de BSA para lectura en 280 nm.

Sol. de BSA 1000 μg/mL

(mL) 0.0 0.10 0.2 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.0

Agua destilada (mL) 1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.0

Concentración de BSA ( μg/mL)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se lee la absorbancia a 280 nm ajustando el equipo con un “blanco de reactivos” (el que no contiene proteína). Con los datos graficar, realizar una regresión lineal y obtener la ecuación de la recta, con la que se calculará la concentración de la proteína “problema”.

20



2. Método de Bradford: El método de Bradford involucra la unión del azul brillante de Coomassie G-250 a la proteína. Esta unión provoca un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595 nm y este incremento a 595 nm es lo que permite la cuantificación. Dicha unión es independiente de la composición de aminoácidos de las proteínas. La concentración de proteína se determina por medio de una curva tipo con Seroalbúmina Bovina (BSA) y el reactivo de Bradford. Desarrollo experimental Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de BSA de 0 a 200 µg/mL, a partir de una solución de 200 µg/mL, (Tabla 4). Agregando en un tibo eppendorf limpio las cantidad de solucions de BSA y agua como se indica en la tabla 4 para obtener un volumen final de .02 mL de muetra Tabla 4. Curva Tipo de albúmina de suero bovino (BSA), para determinación de proteína por Bradford

(BSA) 200 μg/mL (mL) 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25

Agua destilada (mL) 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0

Concentración de BSA (μg/mL)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar EXACTAMENTE 5 min y lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con el “blanco de reactivos” o agua (el que no contiene proteína) La cantidad de proteína contenida en la muestra se determina interpolando en la ecuación obtenida con la curva tipo de seroalbúmina bovina a diferentes concentraciones. PROBLEMA: Determinar la concentración de una solución de tripsina por espectrofotometría a 280 nm. .

A partir de una solución que contenga X mg/mL de tripsina (en agua destilada) hacer por triplicado 7 diluciones adicionando 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5 mL de la solución de tripsina y agregar a cada uno agua destilada para llevar a un volumen final de 1.0 mL (0.99, 0.98, .095, 0.9, 0.8, 0.75 y .05 mL), de agua respectivamente) y leerlas a 280 nm.

Posteriormente de estas diluciones que tengan lecturas dentro de la curva, tomar tres de ellas para hacer la determinación de la concentración por el método de Bradford, considerando la sensibilidad de este método.

21



Informe 1. Establecer la curva patrón de proteína con Bradford y otra por espectrofotometría a 280 nm. 2. Calcular la concentración de proteína de la solución de tripsina usando los dos métodos de determinación de proteína. 2. Discutir los resultados obtenidos. Cuestionario 1. ¿En qué se basa el método de Bradford? 2. ¿En qué tiempo hay que leer la muestra en el método Bradford y por qué? 3. ¿Cuál es la ventaja del método de Bradford? 4. ¿Qué otros métodos de determinación de proteína existen, en que se basan

y su intervalo de sensibilidad?

Referencia.

Bradford, M. M., 1976. “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem. 72, 248-254.

22



INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 1.7 Medición de la actividad catalítica de enzimas y/o de extractos crudos enzimáticos: Amilasas. OBJETIVO Determinar la actividad enzimática de la α-amilasa y calcular las unidades de actividad enzimática. DESARROLLO EXPERIMENTAL 1.Preparar una solución de almidón: 1% (p/v): Se suspende 1g de almidón en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, Posteriormente se desnaturaliza por calor en un baño de agua a 60 °C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidón. Reactivos:

Almidón 1.0 % (p/v) Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS α-amilasa Reactivo de Bradford 2. Realizar curva tipo de maltosa por el método de azúcares reductores DNS.

Realizar la curva de maltosa de 0.0 a 2.0 g/L. y determinar por método de DNS

(práctica 1.5) 3. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6)

a la solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la práctica 1.6.

4. Cinética de hidrólisis del almidón: Tener antes de iniciar un el baño de agua en ebullición y otro de hielo. 1) Para cada muestra a la que se determinará actividad, tener listo un tubo

eppeddorf de 1.5 mL con 0.1/mL del reactivo DNS (10 tubos). 2) Por separado poner en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 0.95 mL de la solución

de almidón 1% a 20°C.. 3) Aadicionar a cada tubo 0.05 mL de la solución de amilasa (excepto al

testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reacción en el tiempo exacto. Para el tiempo cero tomar inmediatamente

23



0.1 mL de la mezcla de reacción (otra persona), transferirlo rápidamente a un tubo conteniendo 0.1 mL de reactivo DNS (éste será el testigo). Realizar: un el Blanco sin agregar la enzima, es decir a los 0.1 mL de DNS, adiciones 0.1 mL de solución de almidón.

4) Dejar que la reacción se desarrolle a tres tiempos y por triplicado (9 tubos) 0.0 (testigo), 3.0 y 6.0 minutos exactamente. Transcurrido el tiempo EXACTO transferir 0.1 mL de la mezcla de reacción a uno de los tubo que ya contiene 0.1 mL del reactivo DNS.

5) Tratar todos los tubos al mismo tiempo según la técnica de DNS: Poner en baño de agua a ebullición durante 5 min, exactamente. Cuidar de que no entre agua a los tubos.

6) Transcurrido el tiempo sacra y poner en hielo o un baño de agua fría durante 10 min.

7) Posteriormente añadir 1.0 mL de agua destilada a dicha solución. 8) Se homogeniza la solución invirtiendo con la mano los tubos. 9) Se determina la absorbancia a 540 nm, ajustando a cero con el blanco,

determinando la absorbancia para cada tubo testigo y problema (tiempo 3 y 6 min). La absorbancia del tubo testigo se resta al tubo problema con la finalidad de eliminar la absorbancia que no sea atribuible a la reacción enzimática. .

10) Se utiliza la curva patrón de DNS realizada con maltosa para determinar la concentración de azucares reductores expresados como mg maltosa/ mL de la muestra.

11) Expresar la actividad enzimática en unidades de actividad de alfa amilasa/mL. Considerar la siguiente definición de una unidad de actividad alfa amilasa: cantidad de enzima que libera 1 mg de maltosa a partir de almidón después de 1 min de reacción con la enzima a 20°C y pH 6.9

III. INFORME:

1. Elaborar la curva tipo Abs540nm vs concentración de maltosa y determinar la ecuación de la regresión lineal.

2. Calcular la actividad enzimática en unidades de actividad enzimática (U) y actividad específica (Uesp).

[ ] [ ]t

productoproductoU tt 01 −= [ ] [ ]( )[ ]proteínat

productoproductoU ttesp

01 −=

3. Hacer la gráfica de unidades de actividad de amilasa vs tiempo de

reacción. 4. ¿Cuáles son los productos de esta reacción? 5. Recopilar y comparar los resultados de todos los equipos, discutir si hay

diferencias.

24




UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 1.8 Efecto de la concentración de enzima en la actividad enzimática de una amilasa. OBJETIVO Determinar el efecto de la concentración de enzima en la actividad denzimática. DESARROLLO EXPERIMENTAL Preparación del sustrato: Almidón al 1.0 % en regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M preparado como se indicó anteriormente. Reactivos:

Almidón 1.0 % (p/v) Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS α-amilasa Reactivo de Bradford

1. Determinación de la concentración de proteína en la solución

enzimática. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a la solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la práctica 1.6.

2. Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de la reacción

enzimática. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 6,

adicionando, por triplicado, 0.95 mL de sustrato a diferentes concentraciones.

b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solución de amilasa (excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reacción en el tiempo exacto a la reacción

c) Incubar los tubos por 5 min (tiempo de reacción) en un baño o termomixer a 25°C.

d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reacción y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.

25



e) Continuar la determinación de DNS de acuerdo a lo indicado en la práctica 1.5 y 1.7.

La reacción se llevara cabo a pH (7.0), tiempo de reacción y tempertaura constante, siendo la única variable la concentración de enzima .

Tabla 6. Soluciones para determinar el efecto de concentración de la

enzima en la actividad enzimática .

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

Soluciones de Amilasa (mg/mL)

*

0.25

0.5

1.0

2.0

3.0

Volumen de Sol. Sustrato

(mL) 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95

Vol. de sol. de enzima en PO4 pH 7.0, 0.1M

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

* 3P, significa 3 tubos Problema *Para cada concentración de enzima se hace un testigo, para lo cual

inmediatamente después de adicionar los 0.05 mL de enzima, de pasa al tubo con DNS.

Realizar el blanco con sol de almidón Procedimiento: A INFORME: 1. Hacer la gráfica de unidades de actividad de amilasa vs concentración de

enzima. 2. Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos

los equipos del grupo.

26




UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática. OBJETIVO Estudiar el efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática de una enzima: α-amilasa.

1. Determinación de la concentración de proteína en la solución

enzimática. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a la solución de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la práctica 1.6. 2. Efecto de la temperatura en la actividad catalítica de las enzimas.

a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 7, adicionando, por triplicado para cada temperatura a ensayar, 0.95 mL de sustrato (almidón al 1%) y llevarlos a la temperatura deseada poniéndolos en un baño maría.

Tabla 7. Soluciones y temperaturas para la prueba de efecto de la

temperatura en la actividad enzimática .

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

Temperatura de reacción

(°C)

Uno por cada temperatura

25

35

45

55

65

Sol. de Almidón 1.0 %

(mL) 0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

*Sol. de Enzima en regulador PO4 pH 7.0

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

*α-Amilasa: 1.0 mg/mL 3P, significa 3 tubos Problema

27




c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5 min (tiempo de reacción) en un baño a cada temperatura.



La reacción se llevara cabo a tiempo constante de reacción y concentración de enzima constante, siendo la única variable la temperatura de reacción. 3. Determinación de la concentración de proteína en la solución

enzimática. Determinar, por triplicado, proteína por el método se Bradford (práctica 1.6) a cada solución de enzima proporcionada (cada pH). Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentración con la curva obtenida en la práctica 1.6. 4 Efecto del pH en la actividad catalítica de las Enzimas Reactivos: Almidón 1.0 % (p/v) en Reguladores a diferentes pH Regulador de Acetatos pH 5.0 Regulador de Fosfatos pH 6.0, 7.0 y 7.5 0.1 M Regulador de Boratos pH 8.0, 9.0 y 10.0 Preparar las soluciones de enzima con el regulador de pH indicado por el

profesor. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 8,

adicionando, por triplicado para cada pH a ensayar, 0.95 mL de sustrato (almidón al 1%).


c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5 min (tiempo de reacción).



28



29

Tabla 8. Soluciones de enzima a diferentes pH para determinar el efecto del pH en la actividad enzimática.

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

3P6

3P7

pH

5.0

6.0

7.0

7.5

8.0

9.0

10.0

Sol. de almidón al 1.0

% (mL)

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

Enzima + regulador al pH indicado

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

3P, significa 3 tubos Problema. * Para cada pH se hace un testigo. Seguir el mismo procedimiento indicado en el experimento del efecto de la concentración de enzima. INFORME:

1. Hacer la gráfica de Unidades de actividad de amilasa vs temperatura de reacción.

2. Hacer la gráfica de Unidades de actividad de amilasa vs pH de la reacción.

3. Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos los equipos del grupo.

1

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

Academia de Biotecnología. Asignaturas:

Profesores: Luis C. Fernández Linares, María del Carmen Oliver Salvador,

Determinación de constantes cinéticas, Km y Vmax y medición de la actividadenzimática de la invertasa

El objetivo de la práctica es determinar el efecto de la concentración del sustrato en lavelocidad las reacciones enzimáticas, determinando las constantes cinéticas, Km y Vmax, dela invertasa.

Las invertasa hidroliza la unión glicosídica de la sacarosa. La sacarosa es un disacáridocompuesto de una molécula de α-D-glucosa y una molécula de β-D-fructosa, ligadas por unenlace α-1,4-glicosídico. Cuando este enlace es roto en una reacción de hidrólisis, segenera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa.

Sacarosa + H2O ---> glucosa + fructosa

El nombre oficial de la invertasa es beta-fructofuranosidasa (EC3.2.1.26), lo que implica quela reacción catalizada por esta enzima es la hidrólisis del grupo terminal no reductor de lasacarosa. La invertasa es utilizada principalmente en confitería, donde la industria dealimentos prefiere más a la fructosa que a la sacarosa, debido a que es mucho más dulce yno cristaliza tan fácilmente.

La invertasa es producida por una amplia gama de microorganismos que pueden utilizar lasacarosa como nutriente. Comercialmente, la invertasa es biosintetizada principalmente porcepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis. Inclusodentro del mismo cultivo de levadura, la invertasa existe en más de una forma. Por ejemplo,la invertasa intracelular tiene un peso molecular de 135,000 Da, mientras que la variedadextracelular tiene un peso molecular de 270,000 Da.

A diferencia de la mayoría de otras enzimas, la invertasa exhibe una actividad relativamentealta en un amplio intervalo de pH (3.5-5.5), con el óptimo cercano a pH 5.0; por otro lado latemperatura óptima es de aproximadamente 55 ºC.

Parte experimental:Preparación de reactivos:

Sustrato: preparar sacarosa (30.0 g/L), disolver el sustrato en agua, la mitad del volumenque se vaya a preparar y se afora con regulador de acetatos 0.05M pH 5.0. Preparar 50 mLde sustrato.Enzima: invertasa 0.4 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0.

Diluciones de sutrato:Obtención de concentraciones de sacarosa: Realizar diluciones con regulador de acetatos

0.025 M de 0 a 30 g/L

2

Tabla 1. Preparación de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones

Sacarosa (30 g/L)(mL)

Acetatos 0.025M(pH 5.0)(mL)

Concentración finalde sacarosa (g/L)

0 10 0.01 9 3.03 7 9.04 6 12.05 5 15.08 2 24.010 0 30.0

Preparar 10 ml de cada concentración por grupo, dividir las soluciones por equipos.

Procedimiento:

La prueba se realizará por triplicado con un blanco para toda la prueba y un testigo paracada concentración.

1. Colocar 0.95 mL de sustrato, para cada concentración y de acuerdo a la tabla 2, en untubo eppendorfd, se deja equilibrar a temperatura ambiente por 5 min.

2. Agregar 0.05 mL de la enzima y agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder lareacción durante 5 min.

Condiciones de la reacción: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en °C(temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar elexperimento).3. Inmediatamente después de terminada la reacción (5 min), tomar un alícuota de 0.1 mL ytransferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrólisis enzimática).*testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reacción e inmediatamente el reactivode DNS4. Los tubos se calientan a ebullición en baño María durante 5 min. Se enfrían en baño dehielo, adiciona 1.0 mL de agua y se leen a 540 nm en un espectrofotómetro, contra unblanco de reactivos (0.1 mL de regulador de acetatos 0.25 M pH 5.0 + 0.1 de DNS + 1 mLde agua).5. Tomar la lecturas de Abs (tabla 2) del método de azucares reductores y determinar laconcentración de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se hará en laboratorio o seproporcionará en función del tiempo).

6. Determinar la concentración de proteína de la solución de invertasa por el Método deBradford

Tabla 2. Efecto de la concentración de la sacarosa en la velocidad de reacción de lainvertasa.Sacarosa

(g/L)Sacarosa

(g/L)(mL)

Invertasa(0.6 mg/mL)

(mL)

Acetatos0.025M, pH

5.0(mL)

Absorbancia(540 nm)

0.0 (blanco) 0.0 0 1.03.0 0.95 0.05 --9.0 0.95 0.05 --

12.0 0.95 0.05 --15.0 0.95 0.05 --24.0 0.95 0.05 --30.0 0.95 0.05 --

3

Los valores de A540nm netos son: (A540nm Problema)- (A540nm Testigo) = A540nm Neto

La velocidad se determinará para cada concentración de sustrato, serán reportadasen mmoles o moles de producto formado / min; así mismo determinar la actividadespecífica de la enzima para concentración de sustrato.

Determinación de las constantes cinéticas de una enzima.

La magnitud de Km y Vmax varía según el tipo de enzima y la naturaleza del sustrato. Estambién una función de la temperatura y del pH. Se determinarán las constantes cinéticasKm y kcat de la invertasa utilizando como sustrato sacarosa con las velocidades iniciales delas reacciones a cada concentración de sustrato, determinadas con los datos de susexperimentos antes descritos. El cálculo de las constantes se hará en forma comparativausando tres métodos gráficos que están basados en las formas lineales de la ecuaciónMichaelis-Menten. Estos son:

Lineaweaver-Burk: 1/vo versus 1/[S] o

Agustinsson: [S]/vo versus [S] o

Eadie Hofstee: vo versus v/ [S] o

Nota: Considerar la concentración real o final de la sacarosa que se utiliza en la reacción.

INFORME:

1. Hacer la gráfica de velocidad vs concentración de sustrato.

2. Hacer las gráficas de 1/vo vs 1/[So], [So]/vo vs [So] y vo vs vo/ [S] o y Calcule Km yVmax,

3. Determinar la constantes catalíticas de la invertasa para estas condiciones dereacción

4. Discutir los resultados obtenidos por todos los equipos del grupo.

Referencia.

maxmax

1

V

KmS

VV

S

maxVS

VKmV

maxmax

1

][

11

VSV

Km

V


LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

1

PRÁCTICA 3 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS.

OBJETIVOS 1. Inmovilizar una enzima por atrapamiento en alginato. 2. Determinar la actividad enzimática y cinéticas enzimáticas de la invertasa libre e inmovilizada. 3. Determinar el rendimiento o porciento de inmovilización INTRODUCCIÓN. Técnicas de inmovilización. La inmovilización se define como el proceso por el cual el movimiento en el espacio de las células, enzimas, orgánulos, etc. se ve restringido total o parcialmente por medio de un soporte o una matriz. En la industria se usan frecuentemente enzimas o células inmovilizadas debido a que éstas se pueden rehusar o usar en procesos continuos. Algunas ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas son: 1. El aumento de la estabilidad de la enzima; 2. La reutilización de la enzima, por lo que disminuyen los costos del proceso. 3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son: 1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo. 2. No hay heterogeneidad en la distribución de la enzima en el soporte. 3. Pérdida de actividad de la enzima inmovilizada. 4. Mayor costo en relación a la enzima libre. En general, los métodos de inmovilización se suelen clasificar en dos grandes categorías: Retención física y Unión química. Métodos de inmovilización de enzimas por retención física Atrapamiento Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros entrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen




2

ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína. Inclusión en membranas: Dividida en dos tipos: Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos Reactores de membrana: Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN QUÍMICA Unión a soportes Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos: 1. Soportes inorgánicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)




3

2. Soportes orgánicos. Se pueden clasificar en: Polímeros naturales: a su vez divididos en: polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc) proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc). Polímeros sintéticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc). Adsorción En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno. Unión covalente La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico. Reticulado También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas (7). El método del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en: 1. Aplicaciones analíticas: biosensores 2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaria y de tratamiento de residuos.




4

MATERIAL Y EQUIPO. Materiales: Agitadores magnéticos Coladores de acero inoxidable Cristalizador Espátula Matraces Erlenmeyer Vasos de precipitados Agitador magnético Jeringa desechable de 20 mL

Equipos: Balanza Espectrofotómetro Potenciómetro Vórtex Soporte universal Parrilla

Sección experimental. Inmovilización de enzimas por atrapamiento con alginato de sodio. Soluciones (Preparar soluciones por grupo): 1) 5 mL de solución de invertasa de levadura (X mg/mL) en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0 2) 15 mL de alginato de sodio al 2% (p/v) en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0 3) 100 mL Cloruro de calcio 1.0% 4) 20 mL Citrato de sodio 0.5 M o fosfato de sodio sodio monobásico 0.5 M 5) Sacarosa al 3% en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0 Parte experimental Se debe trabajar en condiciones limpias (no es necesario trabajar en condiciones de esterilidad). 1. En un vaso de precipitado de 50 ml mezclar 5 mL de enzima concentrada con 15 mL de sol. de alginato 2% que se encuentre a 40 ºC. Agita la mezcla alginato-enzima para homogenizar y lograr una temperatura homogénea, de unos 40ºC. 2. Montar un sistema de inmovilización (Fig.1), que tenga con una jeringa con aguja con punta roma (sujeta al soporte universal para mantener la altura, entre la aguja y la sol de CaCl2, constante) y un vaso con solución de CaCl2, 1%; a temperatura ambiente; con agitación constante y suave, por medio de una barra magnética. 3. Llenar la jeringa (quitar la aguja y succionar la solución alginato-enzima tirando del émbolo y poner de nuevo la aguja), fijarla al sistema, a un centímetro de distancia del CaCl2, e ir descendiendo, de forma constante, el embolo para obtener gotas homogéneas, las cuales se irán depositando en la solución e CaCl2. Contar el número de perlas de alginato formadas por cada mL y sacar un promedio final.




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El goteo debe realizarse a la altura precisa (alrededor de 1cm), de lo contrario se formará “lentejas” al golpear con la superficie líquida (con un goteo desde una distancia mayor) o se formarán esferas con una protuberancia (con un goteo desde una distancia muy corta que no permita que se logre la esfericidad)

5. Dejar estabilizar el gel durante 20 min, sin agitación y a temperatura ambiente. 6. Pasar las perlas y un poco de CaCl2 a un tubo falcon, etiquetar y conservar en refrigeración.

Figura 1. Sistema para inmovilización de enzimas por atrapamiento.

NOTA IMPORTANTE. Se debe contar con la suficiente enzima libre e inmovilizada para realizar esta práctica y la práctica 4: Determinación de Vmax y Km de una enzima libre e inmovilizada. Liberación de la enzima del soporte de inmovilización, para determinar concentración de la misma. Tomando en consideración la cantidad de esferas que se obtuvieron por mL, se toma ese número de esferas, entre 50 y 60 esferas que correspondan al mililitro. Se homogenizan las esferas en 4 mL de una solución de citrato de sodio 0.5 M, durante 1 min con ayuda de un agitador vórtex (Durán, 1997). A la solución resultante se le determinará proteína por Bradfor, realizar el blanco con la solución que se utilizó para disolver las esferas de alginato. (Si en la




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determinación de Bradford se solidifica el alginato se puede retirar cuidadosamente

con una aguja). NOTA: Se requiere conocer la actividad (y la concentración de proteína) de la solución enzimática, por lo que se necesita preparar una cantidad extra. Se debe de la concentración de proteína de la solución de cloruro de calcio, para poder saber la cantidad de enzima que no quedó inmovilizada por diferencia. Posteriormente, se debe determinar la Actividad enzimática y Actividad enzimática específica y constantes cinéticas, de la enzima libre e inmovilizada (práctica 2) y comparar los resultados de enzima libre y enzima inmovilizada. Consideración: Esta segunda parte, que es inicio de la Práctica 4, puede dejarse pendiente, si no es posible realizarlo en las 3 horas que dura la sesión. Determinación de Actividad enzimática y constantes cinéticas (tiempo cero de estabilidad, parte inicial de la práctica 4): Actividad enzimática de la invertasa libre con sacarosa al 3.0 %, a temperatura Ambiente, tiempo 5 min, por triplicado y testigos. (0.05 mL de enzima + 0.95 mL de solución de sacarosa) Actividad enzimática de la invertasa inmovilizada sacarosa al 3.0 %, a temperatura ambiente, tiempo 5 min, Para la enzima inmovilizada seguir el mismo protocolo de la libre y sustituir los 0.05 mL de enzima por lo equivalente en número de perlas (de acuerdo a los resultados de número de perlas formadas por mL). Determinar la concentración de proteína, por el método de Bradford y por triplicado. de: a) invertasa libre, b) enzima inmovilizada (la enzima liberada) y c) de la solución de cloruro de calcio residual, Usar como blanco buffer, sol de citratos y sol. de cloruro de calcio, respectivamente Guardar la enzima libre e inmovilizada en refrigeración, con éstas se determinará nuevamente la actividad a diferentes tiempos, y se compararán los tiempos el inicial (primera sesión) y los otros tiempos, para determinar el efecto de la inmovilización en la estabilidad de la enzima (Práctica 4). Procedimiento para determinar la actividad enzimática y constantes cinéticas: Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las diferentes concentraciones de sustrato.




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Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e inmovilizada (número de perlas necesarias para igualar la concentración de invertasa libre) Diluciones de sustrato: Tabla 1. Preparación de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones

Sacarosa (30 g/L)

(mL)

Acetatos 0.025 M,

pH 5.0 (mL)

Concentración de sacarosa

(g/L)

0 10 0.0

1 9 3.0

3 7 9.0

4 6 12.0

5 5 15.0

8 2 24.0

10 0 30.0

La prueba se realizará por triplicado con un blanco y un testigo para cada concentración de sustrato. 1. Colocar en 4 tubos eppendorf el número de perlas correspondiente a 0.05mL de enzima libre y en otros 4 tubos eppendorf, 0.05 mL de enzima libre, y un blanco por concentración de sustrato (Tabla 1). 2. Agregar 0.95 mL de sustrato, para cada concentración (tabla 1), agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder la reacción durante 5 min. Excepto el testigo que es tiempo cero. Condiciones de la reacción: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en °C (temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar el experimento). 3. Inmediatamente después de terminada la reacción (0 o 5 min), tomar un alícuota de 0.1 mL y transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrólisis enzimática). *testigo se adiciona la enzima e inmediatamente se transfiere 0.1 mL al reactivo de

DNS

4. Los tubos sellados con película plástica, se calientan a ebullición en baño María durante 5 min. Se enfrían en baño de hielo, y posteriormente de adiciona 1.0 mL de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se leen a 540 nm en un espectrofotómetro, contra cada blanco (solución de sacarosa en buffer de acetatos)




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5. Tomar las lecturas de Abs del método de azúcares reductores y determinar la concentración de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se hará en laboratorio o se proporcionará en función del tiempo). Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes tiempos con gráficos y cuadros adecuados. Informe:

1) Calcular la actividad enzimática de la enzima libre y de la enzima inmovilizada en el día 1.

2) Determinar el % de inmovilización de la enzima (la enzima que no se inmoviliza se queda en la solución de cloruro de potasio).

3) Determinar la estabilidad de la enzima libre e inmovilizada a los dos tiempos en días.

4) Calcular las constantes cinéticas de la enzima libre e inmovilizada. 5) Incluir en el informe una Introducción, el fundamento y el objetivo de esta

práctica. 6) Comparar los parámetros cinéticos de la enzima inmovilizada contra la

libre.



PRÁCTICA 4

Estabilidad de una enzima inmovilizada y libre, determinación de

Vmax y Km. OBJETIVOS

1. Establecer el efecto de la inmovilización en la estabilidad de una enzima. 2. Determinar el efecto de la inmovilización en la constante de Michaelis-

Menten (Km) y la velocidad máxima (Vmax.) y su relación con la estabilidad.

INTRODUCCIÓN La inmovilización puede altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del microentorno. Efectos en la estabilidad Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes razones: 1. Una estabilización conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere mayor rigidez y se hace más resistente a la desactivación térmica o química. Este tipo de estabilización se obtiene únicamente en aquellos métodos en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unión a soportes activados. La inmovilización covalente multipuntual se puede combinar con la adición de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima. 2. Una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unión de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita su autolisis. 3. Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima retenidas en una determinada región del espacio. 4. Existe una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxígeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzima será muy alta y, como consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en esa

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zona que en el medio de reacción. En otros casos el soporte tiene un efecto tampón o buffer de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgánicos, la “hidrofilia” del soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la hidrofilia del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformación activa. Efectos en la actividad enzimática Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede ser debido a que:

1. La unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al sitio activo está impedido,

2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del sitio activo o que sea esencial para la actividad catalítica de la enzima,

3. La inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva, las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización de la enzima.

Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los cambios (disminución o aumento de la actividad enzimática) se deberán principalmente a efectos difusionales, electrostáticos, estéricos y/o del microentorno. 1) Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno.

a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de reacción, el sustrato deberá atravesar la película líquida estacionaria (capa de Nernst o de disfusión) que rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la concentración de sustrato es menor que en el resto de la disolución, puesto que existe un gradiente de concentración a través de la zona de difusión. Por tanto, los valores de km para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (km’); b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcápsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.

2) Efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsión mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atracción. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km’ aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en disolución.

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3) Impedimentos estéricos o de tamaño de sustrato. En un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una pérdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser válido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye drásticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes sólidos, a pesar de que son muy activas frente a sustratos pequeños, muestran una actividad muy baja hacia proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. Este “efecto estérico” se puede evitar mediante una inmovilización covalente a través de un brazo espaciador enzima-soporte más largo 4) Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo de la catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida a un soporte cargado negativamente tendrá en su microentorno una concentración mayor de iones hidrógeno que en el medio de reacción. Como resultado, la enzima inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente. MATERIALES

Materiales: o Espátulas de acero inoxidable. o Matraces Erlenmeyer. o Flotadores o Gradillas para microtubos o Termómetro o Tubos eppendorf 1.5 mL

Equipos: o Espectrofotómetro. o Refrigerador comercial. o Vórtex. o Parrillas con agitación o Pipetas de 100, 200 y 1000 μL

PARTE EXPERIMENTAL: Se realizará en las siguientes 3 o 4 sesiones, posteriores a la práctica 3, en al cual se inmovilizó y se conservó la enzima libre y las perlas de alginato con la enzima inmovilizada. Determinación de Actividad enzimática y constantes cinéticas: Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las diferentes concentraciones de sustrato. Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e inmovilizada (número de perlas necesarias para igualar la concentración de invertasa libre)

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Diluciones de sustrato: Tabla 1. Preparación de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones

Sacarosa (30 g/L) (mL) Acetatos 0.025 M,

pH 5.0 (mL) Concentración de sacarosa

(g/L)

1 9 3.0 3 7 9.0 4 6 12.0 5 5 15.0 8 2 24.0 10 0 30.0

La prueba se realizará por triplicado con un blanco y un testigo para cada concentración de sustrato. 1. Colocar en 4 tubos eppendorf el número de perlas correspondiente a 0.05mL de enzima libre y en otros 4 tubos eppendorf, 0.05 mL de enzima libre, y un blanco por concentración de sustrato (Tabla 1). 2. Agregar 0.95 mL de sustrato, para cada concentración (tabla 1), agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder la reacción durante 5 min. Excepto el testigo que es tiempo cero. Condiciones de la reacción: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en °C (temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar el experimento). 3. Inmediatamente después de terminada la reacción (0 o 5 min), tomar un alícuota de 0.1 mL y transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrólisis enzimática). *testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reacción e inmediatamente el reactivo de DNS 4. Los tubos sellados con película plástica, se calientan a ebullición en baño María durante 5 min. Se enfrían en baño de hielo, y posteriormente de adiciona 1.0 mL de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se leen a 540 nm en un espectrofotómetro, contra cada blanco (solución de sacarosa en buffer de acetatos) 5. Tomar las lecturas de Abs del método de azúcares reductores y determinar la concentración de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se hará en laboratorio o se proporcionará en función del tiempo). Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes tiempos con gráficos y cuadros adecuados.

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ANÁLISIS DE RESULTADOS

a) Calcular la actividad enzimática de la enzima libre y de la enzima inmovilizada en el día 2 y 10.

b) Determinar los parámetros cinéticos de la enzima inmovilizada y la enzima libre dos y diez días después de la inmovilización.

c) Determinar la actividad enzimática de la enzima inmovilizada contra la libre dos y diez días después de la inmovilización

d) Comparar los parámetros cinéticos y actividad enzimática de la enzima inmovilizada contra la libre el primer día (practica 3), a las 48 horas y a los 10 días.

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5. Adiestramiento en la operación de un biorreactor de laboratorio.5.1Manejo de un biorreactor5.2 Preparación y esterilización de medio de cultivo en el biorreactor.5.3 Preparación de de Inóculo e inoculación del medio en biorreactor.

5.1. Manejo de un Biorreactor

OBJETIVO.

Adquirir los conocimientos prácticos para reconocer las partes de un biorreactor delaboratorio, las funciones de cada parte constituyente del biorreactor, así como elmontaje de éstas y el funcionamiento del biorreactor y su módulo de control.

MARCO TEÓRICO.

1) CLASIFICACIÓN DE LOS BIORREACTORES.

La mayoría de las compañías industriales de fermentación tienen al menos unasección dedicada a los laboratorios de fermentación, los cuales usan parainvestigación pura de nuevos productos, selección de nuevos cultivos defermentación, desarrollo de nuevas materias primas, condiciones de proceso yescalamiento, por ejemplo: en la industria farmacéutica se aplica para el desarrollode nuevos antibióticos. En la industria de la cervecería y de los alimentos dondecontinuamente se desarrollan sustitutos de proteína.

En estas áreas de investigación y desarrollo el tipo de biorreactor puede variardesde un matraz de 10 0mL, hasta un fermentador de acero inoxidable de 100litros (L). En un área grande de desarrollo se pueden encontrar varios tamaños debiorreactores, desde uno de 5 L. pasando por uno de escala de entre 20 y 50 L, yfinalmente uno de escala piloto que podría ser de 100 a 1000 L. El número debiorreactores generalmente lo rigen los costos y la disponibilidad de mano de obra.

Un biorreactor es un contenedor físico en donde se efectúan reacciones biológicascatalizadas por microorganismos o partes de ellos. Las fronteras del biorreactorestán bien delimitadas. El biorreactor cuenta con espacios físicos que permiten poruna parte controlar las condiciones de reacción y por otra parte el monitoreo de lareacción biológica por medio de electrodos especiales.

Los nombres que se le han adjudicado a los biorreactores de laboratorio sonvariables a saber: biorreactores de mesa, propiamente de laboratorio, losbiorreactores de planta piloto y los biorreactores industriales.

Una definición aceptable de los tipos anteriores de biorreactores podría quedarcomo sigue:

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Biorreactores de Mesa o “Bench-Top” (Biorreactores de laboratorio): Poseenvolúmenes de trabajo de 0.5 a 10 L, el vaso puede ser de acero inoxidable, vidrioo una combinación de ambos y no son esterilizables in situ, su esterilizaciónrequiere la introducción del biorreactor dentro de una autoclave.

Biorreactores de planta piloto: Su desarrollo ha permitido encontrar formassofisticadas capaces de esterilizarse en diferentes tipos de fermentación; loscuales incluyen biorreactores de tanque agitado, air-lift, tipo torre, de camafluidificada y de disco rotario. Por lo general el material utilizado en suconstrucción es el acero inoxidable. Los volúmenes utilizados varían de 15 hasta100 L

Biorreactores industriales: Se construyen invariablemente con acero inoxidable. Elvolumen del biorreactor puede variar de 150 hasta 10000 L. Los biorreactoresindustriales se esterilizan forzosamente in situ.

2) VARIABLES DE CONTROL EN BIORREACTORES.

Por lo general, cualquier tipo de biorreactor posee características de diseño quepermiten, por medio de un módulo de control y electrodos, controlar al menos seisvariables básicas que definen el medio ambiente en donde los microorganismosse desarrollan, éstas son: la agitación, la temperatura, el pH del cultivo, laaireación del medio, la concentración de oxígeno disuelto, y el nivel de espumaexistente en el biorreactor.

2.1) Agitación.

La agitación del medio de cultivo permite mantener condiciones homogéneasdentro del biorreactor. La agitación se realiza, por lo general, por medio de unmotor acoplado a un eje que contiene impulsores de diversos tipos (de paleta tipoRushton, turbina hélice marina, etc.) Los impulsores definirán el patrón de flujo y lahidrodinámica que existirá en el reactor. La elección del tipo de impulsor dependede la reología del cultivo y del tipo de microorganismo que se utiliza en lafermentación teniendo especial cuidado en no dañar a las células que se estáncultivando. La agitación vigorosa en un biorreactor provoca la creación de unvórtice que no permite una completa homogenización del medio de cultivo; así losbiorreactores cuentan con bafles que impiden la formación del vórtice.

Los reactores tipo “air-lift“son agitados mediante la inyección de aire; el flujo deaire permite una adecuada agitación y aumenta la transferencia de oxígeno almedio de cultivo.

2.2) Temperatura

La temperatura representa una variable importante de control de unafermentación. La temperatura afecta el crecimiento microbiano de manera notable,debido a que los microorganismos de una especie determinada sólo pueden

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crecer en un rango restringido de temperaturas. Así los microorganismos sepueden clasificar en función de la temperatura de crecimiento: losmicroorganismos psicrófilos presentan un rango de temperatura de crecimiento de5 a 15°C; los mesófilos de 25 a 40°C y los termófilos de 45 a 60 °C, sin mebargose han reportado casos de crecimiento de hasta 94°C.

Para el control de la temperatura en los biorreactores, éstos a menudo cuentancon chaquetas por donde fluye agua fría o caliente y que funcionan comointercambiadores de calor. También los biorreactores cuentan con termoparesadaptados al cuerpo del biorreactor que de forma continua determina latemperatura del cultivo, con la ayuda del módulo de control. Así, continuamente elmódulo de control determina si hay que aumentar o disminuir la temperatura delcultivo de acuerdo a un valor de temperatura de fermentación preestablecido.

2.3) pH

El pH de una fermentación expresa la concentración de iones hidrógeno presentesen el medio de cultivo. Al igual que la temperatura de fermentación, el pHdetermina de forma importante la velocidad de crecimiento de losmicroorganismos y el rendimiento de bioconversión. El pH de crecimiento para unaespecie de microorganismo representa generalmente un máximo denominado pHóptimo. Debido a que durante las bioconversiones que se presentan, causadas porel desarrollo microbiano, el pH del medio de cultivo varía continuamente durante eltranscurso de una fermentación. Así, es necesario compensar dichas variacionesdel pH mediante la adición de soluciones ácidas o básicas que permiten mantenerun pH óptimo de crecimiento. Para ello, es necesario contar con un electrodo depH adaptado al biorreactor que provea continamente de lecturas instantáneas dela concentración de iones hidrógeno en el medio de cultivo. Los electrodos de pHutilizados en los biorreactores deben soportar temperaturas de esterilización yaque éstos deben estar sumergidos dentro del caldo de fermentación.

2.4) Oxigenación o aireación.

El oxígeno merece especial mención pues su ausencia o abundancia permite unaselección tanto de microorganismos como de productos del metabolismo. Cuandoel cultivo se produce en presencia de oxígeno molecular la fermentación sedenomina aeróbica, y cuando éste carece de oxígeno la fermentación sedenomina anaeróbica. La mayoría de los cultivos microbianos son de tipo aeróbicopor lo que es necesario proveer oxígeno al cultivo. Para ello, se inyecta aire uoxígeno de forma estéril al medio o caldo de cultivo por medio de un compresor. Elaire es inyectado desde la parte inferior del biorreactor, justo debajo de losimpulsores y distribuido en forma de burbujas con la ayuda de un difusor.Las burbujas son fracturadas por los impulsores en burbujas más pequeñas, loque provoca el aumento del área superficial de las burbujas; así la transferenciade oxígeno resulta efectiva.

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Para la determinación de la concentración de oxígeno disuelto en el caldo decultivo se utilizan electrodos galvanométricos y polarográficos que permitenrealizar lecturas de forma continua. Los impulsos eléctricos generados por elelectrodo son convertidos en el módulo de control del biorreactor en lecturas deporcentaje de oxígeno disuelto. El mismo módulo de control del biorreactor puedejustamente controlar la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de cultivo pormedio de la inyección de aire u oxígeno o en su caso de nitrógeno gaseoso, todoello con la ayuda de un conjunto de electro-válvulas. La adición de nitrógenogaseoso al medio de cultivo permite disminuir la concentración de oxígeno disueltoya que el nitrógeno desplaza al oxígeno disuelto. Así con base a unaconcentración de oxígeno disuelto predeterminada, el módulo de control puedeajustar la inyección de aire o de nitrógeno.

2.5) Nivel de espuma

La mayoría de los medio de cultivo utilizados para el crecimiento demicroorganismos contienen proteínas y péptidos que promueven la formación deespuma. La agitación vigorosa del medio de cultivo y la inyección de aire albiorreactor provocan aún más la formación de grandes cantidades de espuma;ésta puede incluso ser tan importante que puede ocupar todo el espacio vacío delbiorreactor (espacio de cabeza) y hasta salir por cualquier orificio de entrada deflujo al biorreactor que no ésta siendo empleado. La formación de espuma en elbiorreactor conlleva el incremento del riesgo de contaminación de la fermentación.Por ello es necesario controlar el nivel de espuma formada dentro del biorreactor.Para ello se emplea un electrodo instalado dentro del biorreactor cuya altura, conrespecto al nivel del líquido, puede ser modulada para permitir solo una pequeñacapa superficial de espuma. El electrodo está conectado al módulo de control delbiorreactor por donde transita una corriente eléctrica. La espuma al aumentar sunivel y ponerse en contacto con el electrodo cierra un circuito eléctrico, lo queprovoca la acción de una bomba peristáltica que inyecta antiespumante albiorreactor. Los antiespumantes algunos de origen mineral, tienen una rápidaacción contra la espuma presente, cortándola de forma inmediata.Por otra parte, la formación de espuma dentro del biorreactor promueve laadhesión de microorganismos sobre las paredes del biorreactor, lo que provocaque el cultivo microbiano pierda su homogeneidad. Por ello es imperioso evitar laformación de espuma dentro del biorreactor y en su caso controlar el nivel de ésta.

EQUIPO.-Biorreactor de laboratorio con su módulo de control, partes y electrodos(ya sea un biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarrade 5 litros o un biorreactor marca Applikon de jarra de 3 litros).

DESARROLLO EXPERIMENTAL.

a) El profesor describirá y mencionará los nombres de las partes queconstituyen el biorreactor y explicará las funciones de cada una de ellas.

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b) El profesor explicará el funcionamiento del módulo de control delbiorreactor.

c) El profesor desmontará todas las partes del Biorreactor indicando lasmedidas de cuidado que deberá tenerse al manipular el biorreactor y suspartes.

d) Los estudiantes tendrán que armar de nuevo el biorreactor y sus partes.

REPORTE DE RESULTADOS.

1. Elaborar un diagrama del biorreactor utilizado en la práctica señalando ynombrando cada una de las partes que constituyen el equipo.

2. Describir las funciones de cada una de las partes que constituyen elbiorreactor.

3. Describir las variables físicas y químicas que se controlan en el biorreactory que definen el medio ambiente en donde se desarrollan losmicroorganismos.

4. Describir as funciones del módulo de control del biorreactor.

BIBLIOGRAFÍA.

Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition,McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.

Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, SanDiego, 439p.

Lydersen, B.K. , D’elia, N.A. and Nleson, K.L. Bioprocess Engineering Systems,equipment and facilities, John Wiley & Sons, 1994, New York, 805p.

Schûgerl, K, Bioreactor engineering, volume 2; characteristics features ofbioreactors, John Wiley & Sons, 1981, Chichester, 393p.

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5.2 Preparación y esterilización de medio de cultivo y biorreactor

OBJETIVO.Adquirir conocimientos prácticos relacionados con el proceso de esterilización demedio de cultivo contenido en un biorreactor.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

1. Formulación de un medio de cultivo para el crecimiento demicroorganismos.

2. Conocimiento de una autoclave de laboratorio y su funcionamiento.3. Monitoreo del proceso de esterilización por calor húmedo4. Determinación cualitativa de la eficacia del proceso de esterilización por

calor húmedo.

MARCO TEÓRICO

La fermentación en general se debe llevar a cabo en un medio ambientecontrolado, independientemente de que el propósito sea de investigaciónacadémica, desarrollo de producto o proceso. Esto implica que debe garantizarseel crecimiento del microorganismo, microorganismos u obtención del productodeseado libre de contaminantes. De ahí que la esterilización sea una parte delproceso de fermentación que permite alcanzar este objetivo.

Si se tiene que llevar a cabo una fermentación usando un microorganismo definidopara un producto o conjunto de productos, la invasión por microorganismoscontaminantes afectará adversamente de una u otra manera la producción. Así elcontaminante competirá con el microorganismo deseado por los nutrientesafectando finalmente el rendimiento. Los microorganismos contaminantes puedenincluso degradarlo en pasos subsecuentes. Por otro lado la contaminaciónmicrobiana, sobre todo por bacilos y cocos afectará negativamente la recuperacióny purificación del producto final, sobre todo en las operaciones de filtrado yultrafiltrado. Por lo tanto, la contaminación debe evitarse, lo cual se logra:

Usando un cultivo puro, esterilizando el biorreactor y el medio de cultivo, así comolos recipientes adicionales y todo material y superficie que esté en contacto con elcultivo o el medio de cultivo. Se deben así mantener condiciones asépticasdurante toda la fermentación.

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La esterilización y el mantenimiento de las condiciones asépticas a vecesconducen a la pérdida o degradación de los cultivos. El diseño del procedimientode esterilización depende de:

1. La naturaleza del medio de cultivo y el contenido de los recipientesadicionales utilizados en la fermentación.

2. El tamaño y tipo de biorreactor, de los recipientes adicionales y el materialde construcción de éstos.

3. Los servicios generales disponibles en el laboratorio.4. Si los recipientes a ser esterilizados están vacíos o contienen medio de

cultivo u otras soluciones.

a) CRITERIOS PARA LA ESTERILIZACIÓN.

Es importante y aún vital evitar la contaminación de un sistema de fermentación.Sin embargo, en general, las medidas utilizadas son mas bien necesarias queseveras, con el fin de evitar daño al medio de cultivo y reducir los costos, por lotanto, el procedimiento de esterilización adoptado y el grado de remoción delcontaminante necesita ser relacionado a la naturaleza de la fermentación y supropósito.

Así en trabajos de escala menor como el tratamiento de desechos, durante laoxidación de lodos activados, se utilizan microorganismos presentes en formanatural. El equipo para dicho proceso probablemente no necesita ser esterilizado,excepto, tal vez, los recipientes y líneas que albergan los nutrientes.

Algunas fermentaciones en donde interviene un único microorganismo sedescriben como protegidas ya sea porque el medio de cultivo permitirá solamenteel crecimiento de un rango limitado de microorganismos (ejemplo: medio de cultivobasado en un solo hidrocarburo), o microorganismos que producen un medioambiente hostil que inhibe el desarrollo de otros organismos (ejemplo: etanolproducido por levaduras). En tales casos, el régimen empleado deberá ser no tanestricto, lo cual implica solo la limpieza de recipientes y líneas y el uso dedesinfectantes y/o hirviendo o pasteurizando el medio de cultivo, lo cual destruyela mayoria de microorganismos no esporulados aunque no a todas las esporaseventualmente presentes.

Sin embargo la mayoría de las fermentaciones en el laboratorio consideranfermentaciones de cultivo no protegidos, en cuyo caso, esencialmente todos loscontaminantes microbianos deben excluirse.

El caso ideal de la remoción total de microorganismos contaminantes está sinembargo lejos de alcanzarse. Por lo tanto, el criterio de probabilidad decontaminación es frecuentemente utilizado como objetivo más práctico.Una probabilidad comúnmente aceptada en fermentaciones industriales es de1x10-3; esto es la probabilidad de que 1 en 1000 lotes se contaminen después dela esterilización. Se pueden imponer mayor o menores criterios estrictos

8

dependiendo de la consecuencia de una falla. Un ejemplo es la de enlatado dealimentos, donde el criterio de esterilización se apoya en la típica probabilidad desobrevivencia de 1x10-12 de esporas de Clostridium botulinum. Un criteriosemejante aplicado a la fermentación se aplica para el caso de patógenospeligrosos o ciertos productos peligrosos involucrados en tecnología del DNArecombinante.

La selección del método de esterilización y el régimen a usarse debe por lo tantoser hecho a la luz de un criterio apropiado de esterilización.

b) MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

1. Calor húmedo2. Calor seco3. Filtración4. Compuestos químicos5. Radiación

El método de esterilización más común para recipientes es el de calor húmedo.Los factores importantes a considerar en determinar el método mas adecuado deesterilización son: La naturaleza del organismo empleado, la fermentación y elnivel de seguridad requerido.

MATERIALES, EQUIPO Y MÉTODO

a) Materiales-Cajas de Petri-Tubos de ensayo-Vasos de precipitado de diferentes volúmenes-Barras magnéticas para agitación (mosca)-Guantes de asbesto-Solución de Cloruro de Sodio al 0.09%-Pipetas de 1 y 10 mL-Pipetas automáticas de 1 y 10 mL-Portaobjetos y cubreobjetos.-Medio de cultivo (ver anerxo)

b) Equipo

-Biorreactor de laboratorio (ya sea un biorreactor New Brunswick Scientificmodelo Bioflo II de jarra de 5 litros o un biorreactor marca Applikon de jarra de 3litros).- Balanza analítica-Incubadora con control de temperatura-Autoclave eléctrica de 50 L de volumen-Campana de flujo laminar vertical-Microscopio óptico

9

-Agitador y Vortex-Placa de agitación magnética-Contador de Colonias

C) Método

a) Verificar que la autoclave eléctrica contenga agua hasta el nivel marcado porel tubo de vidrio que se encuentra a su costado (nivel de agua).

b) El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave. Verificar quela salida de aire del biorreactor esté abierta, de lo contrario se corre el riesgode que el biorreactor o alguna de sus partes se rompan durante el procesode esterilización.

c) Cerrar la puerta de la autoclaved) Encender la autoclave para provocar la generación de vapor.e) verificar que la salida de aire de la autoclave se encuentre totalmente abierta,

de esta forma, el aire contenido en la autoclave será excluido por el vaporque se genera.

f) Una vez que el vapor generado se escapa de forma importante por la válvulade salida de la autoclave, es posible cerrar ésta.

g) Esperar que la presión dentro de la autoclave sea de 1.5Kg/cm2 (indicado porel medidor de presión)y que a la vez la temperatura sea de 121°C (indicadopor el medidor de temperatura).

h) Una vez alcanzadas las condiciones de esterilización (1.5 kg/cm2 y 121 °C)mantenerlas durante 15 minutos, por medio del apagado y encendido de laautoclave.

i) Posterior al proceso de esterilización, esperar a que la presión y la temperaturade la autoclave disminuyan.

j) Una vez que el medidor de presión indique una presión de 0.1Kg/cm2 abrirlentamente la válvula de salida y dejar escapar el vapor que aún no se hacondensado. Evitar que la presión caiga por debajo de cero (Bajo vacío), yaque ello provoca riesgos de contaminación del material ya esterilizado.

k) Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de asbesto sacar elbiorreactor esterilizado. Dejar enfriar el biorreactor hasta temperaturaambiente antes de utilizarlo.

4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL

a)Preparación del medio de cultivo (clado nutritivo 2L) para el biorreactor.b)Preparar 14 cajas de Petri conteniendo Agar nutritivo sólidoc) Verter en la jarra del biorreactor el medio de cultivo.d)Esterilizar el biorreactor en la autoclave durante 15 min. A 120°C, de acuerdo

al método de esterilización por calor húmedo” descrito en el apartado deMateriales equipo y métodos.

e)Una vez esterilizado el biorreactor, dejar enfriar.f) Asépticamente tomar una muestra de 1 mL del medio de cultivo esterilizado

y realizar diluciones hasta un factor de 10-3, Sembrar por extensión en placa

10

y duplicado en cajas de petri conteniendo agar nutritivo sólido con lasdiluciones 10-1 a 10-3

g)Realizar una preparación en fresco del medio de cultivo esterilizado yobservarlo al microscopio visible.

h) Incubar las placas durante 24 -48 h a 37°C

BIBLIOGRAFÍA

-Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition,McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.

-Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, SanDiego, 439p.

-Quintero Ramírez, R. Ingeniería Bioquímica, teoría y aplicaciones, Alambramexicana, 1981, México, 332p.

5.3. Preparación de de Inóculo e inoculación del medio en biorreactor.

Preparación del inóculo

Para la preparación del inóculo, se puede partir de un cultivo en tubo o en placa, otambién podría ser de un preinoculo o precultivo líquido de la cepa deseada. En elcaso de levaduras puede ser de alguna presentación comercial como pasta opolvo. Se toma una asada del cultivo y se transfiere a 100 mL de medio de cultivonuevo y estéril, que se encuentra e un matraz de 250 mL. Se incuba a 30ºCdurante 18 h a 120 rpm.

Inoculación del Biorreactor.

Antes de inocular el medio cultivo (ya estéril), se toman 5 mL del medio delbiorreactor; para control de esterilidad; observando al microscopio y por cuenta enplaca.

Posteriormente se adiciona el inóculo (100 mL) en el biorrecator, cuidando lascondiciones de esterilidad.

11

ANEXO

Medio de Cultivo para Levaduras

g/LGlucosa 50Extracto de levadura 1KH2PO4 5(NH4)2SO4 2

MgSO4.7H2O 0.4

pH Ajustar a 5

Medio sólido para preservación de levaduras.

g/LGlucosa 20Extracto de levadura 10Agar agar 20




1

PRÁCTICA 6

PRODUCCIÓN DE UNA ENZIMA EN UN BIORREACTOR DE

LABORATORIO CON CÉLULAS LIBRES

La práctica se divide en dos secciones, la preparación del medio y la

esterilización del biorrecator con el medio, 6.1; y el segundo, el seguimiento

del cultivo y de la producción de enzima por Saccharomyces cerevisiae, 6.2.

6.1 Preparación y esterilización de Medio de Cultivo en el Biorreactor. OBJETIVO GENERAL

Adquirir conocimientos prácticos para establecer un birreactor con medio de

cultivo para un bioporoceso.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Formular un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos. 2. Conocer el funcionamiento de una autoclave. 3. Esterilizar el biorrector y medio por calor húmedo. 4. Determinar cualitativamente la eficacia del proceso de esterilización por

calor húmedo. 5. Conocer la manera de preparar el inóculo para una fermentación. 6. Conocer la manera de inocular un biorreactor de laboratorio.

MARCO TEÓRICO

Medios de Cultivo

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones

adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los

microorganismos. Estos medios son esenciales en las fermentaciones por lo

que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la

exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.




2

Esterilización de Medios de Cultivo

Una fermentación se debe llevar a cabo, en general, en un medio ambiente

controlado, independientemente de que el propósito sea de investigación

académica, desarrollo de producto o proceso. Esto implica que debe

garantizarse el crecimiento del microorganismo, microorganismos u obtención

del producto deseado libre de contaminación biológica. De ahí que la

esterilización sea una parte del proceso de fermentación que permite alcanzar

este objetivo.

La esterilización y el mantenimiento de las condiciones asépticas a veces

conducen a la pérdida o degradación de los nutrientes de los cultivos. El

diseño del procedimiento de esterilización depende de:

a) La naturaleza del medio de cultivo y el contenido de los recipientes adicionales utilizados en la fermentación.

b) El tamaño y tipo de biorreactor, de los recipientes adicionales y el material de construcción de éstos.

c) Los servicios generales disponibles en el laboratorio. d) Si los recipientes a ser esterilizados están vacíos o contienen medio

de cultivo u otras soluciones. e) De la carga microbiana del medio.

Criterios para la Esterilización Una probabilidad comúnmente aceptada en fermentaciones industriales es de

1x10-3; esto es la probabilidad de que 1 en 1000 lotes se contaminen después

de la esterilización. Se pueden imponer criterios más estrictos, dependiendo

de la consecuencia de una falla o el riesgo que se quiera asumir. Un ejemplo

es la de enlatado de alimentos, donde el criterio de esterilización se apoya en

la típica probabilidad de sobrevivencia de 1x10-12 de esporas de Clostridium

botulinum. Un criterio semejante aplicado a la fermentación se aplica para el

caso de patógenos o microorganismos genéticamente modificados. La

determinación de bacterias viables es un método sensible para determinar el

número de bacterias que sobrevivieron en el sistema.

Métodos de Esterilización La selección del método de esterilización y el régimen a usarse deben ser

hechos de acuerdo a criterios apropiados de esterilización; los métodos

pueden ser:Calor húmedo

1. Calor seco 2. Filtración 3. Compuestos químicos 4. Radiación




3

El método de esterilización más común para recipientes es el de calor húmedo. Al monitorear el proceso de esterilización por calor húmedo se puede observar que el ciclo de esterilización está formado por tres períodos:

a) Elevación de temperatura o calentamiento. b) Mantenimiento de temperatura. c) Descenso de temperatura o enfriamiento.

DESARROLLO EXPERIMENTAL Materiales - Cajas de Petri - Tubos de ensayo - Vasos de precipitado de diferentes volúmenes - Barras magnéticas para agitación (mosca) - Guantes de asbesto - Solución de Cloruro de Sodio al 0.85% - Pipetas de 1 y 10 mL - Pipetas automáticas de 1 y 10 mL - Portaobjetos y cubreobjetos - Medio de cultivo para levaduras - Matraces de 250 mL - Medio de cultivo para levaduras Equipo - Biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra de 5 L - Balanza analítica - Incubadora con control de temperatura - Autoclave eléctrica de 50 L de volumen - Campana de flujo laminar vertical - Microscopio óptico - Agitador Vortex - Placa de agitación magnética Procedimiento

a) Preparar de 2.5 L de medio de cultivo para levadura, composición por

litro de medio: Sacarosa, 30 g; Extracto de Levadura, 5 g; KH2PO4, 5 g; (NH4)2SO4, 2 g; MgSO4

. 7H2O, 0.4 g. Ajustar a pH 5

b) Preparar 14 cajas Petri con medio de cultivo sólido para levaduras

adicionado al medio 15 g/L de agar.

c) Antes de esterilizar el medio tomar muestra de 1 mL del medio de

cultivo, para realizar cuenta en placa. Sembrar por duplicado en las

cajas con medio sólido con las diluciones 100 (directo) a 10-2.




4

d) Realizar una preparación en fresco del medio de cultivo sin esterilizar y

una tinción de Gram y observarlo al microscopio.

e) Preparar el Biorreactor como se estableció en la práctica 5.

f) Verter en la jarra del biorreactor el medio de cultivo sin esterilizar.

g) Esterilizar el biorreactor en la autoclave:

1. Verificar que la autoclave contenga agua hasta el nivel marcado

por el tubo de vidrio que se encuentra a su costado (nivel de agua).

2. El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave.

Verificar que la salida de aire del biorreactor esté abierta, de lo

contrario se corre el riesgo de que el biorreactor o alguna de sus

partes se rompan durante el proceso de esterilización.

3. Cerrar la puerta de la autoclave

4. Encender la autoclave para provocar la generación de vapor.

5. Verificar que la salida de la válvula de purga se encuentre

totalmente abierta, de esta forma, el aire contenido en la autoclave

será excluido por el vapor que se genera.

6. Una vez que el vapor generado se escapa de forma importante por

la válvula de salida de la autoclave, se cierra.

7. Esperar que la presión dentro de la autoclave sea de 1.05 Kg/cm2 o

15 lbs (indicado por el medidor de presión) que equivale a 121°C

(indicado por el medidor de temperatura) y mantener (por medio del

apagado y encendido de la autoclave o controlando la flama)

durante 15 minutos.

8. Posterior al proceso de esterilización apagar o cerrar el gas y

esperar a que la presión llegue a 0.1Kg/cm2 abrir lentamente la

válvula de salida y dejar escapar el vapor que aún no se ha

condensado. Evitar que la presión caiga por debajo de cero (bajo

vacío), ya que ello provoca riesgos de contaminación del material

ya esterilizado.

9. Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de

asbesto sacar el biorreactor esterilizado.

h) Una vez esterilizado el biorreactor, dejar enfriar hasta temperatura

ambiente antes de utilizarlo.




5

i) Asépticamente tomar una muestra de 1.5 mL del medio de cultivo

esterilizado y determinar no de células por cuenta en placa con la

muestra directa y dos diluciones, hasta 10-2; cada dilución por

triplicado.

j) Realizar una preparación en fresco del medio de cultivo esterilizado y

observarlo al microscopio visible y otra en tinción de Gram.

Preparación del inóculo Para la preparación del inóculo, se puede partir de un cultivo en tubo inclinado

o en placa, o también podría ser de un preinóculo o precultivo líquido de la

cepa deseada. En el caso de levaduras puede ser de alguna presentación

comercial como pasta o polvo.

Inóculo A: tomar una asada del cultivo de Saccharomyces cerevisiae y se

transfiere a un matraz de 500 mL con 300 mL de medio de cultivo nuevo y

estéril. Se incuba a 30ºC durante 12 h a 18 h con una agitación de 120 rpm.

Antes de inocular el biorreactor con el medio de cultivo ya estéril, se prepara

un frotis de cada inóculo y tiñe con la técnica de Gram para corroborar la

pureza del inóculo.

REPORTE DE RESULTADOS

a) Elaborar una tabla de resultados en donde se reporten los resultados

del conteo de microorganismos en cada una de las cajas Petri

sembradas con las diluciones del medio de cultivo, antes y después del

proceso de esterilización. Comparar los resultados.

b) Calcular la concentración de contaminantes (UFC/mL) en el medio de

cultivo sin esterilizar.

c) En caso de que exista contaminación en el medio de cultivo ya

esterilizado, calcular la concentración de contaminantes (UFC/mL).

d) Elaborar sus conclusiones sobre el papel que juega la esterilización en

las bioconversiones, así como de la eficacia del método de

esterilización por calor húmedo en autoclave eléctrica.




6

BIBLIOGRAFÍA

Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition, McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.

Deindoerfer, F. H. y Humphrey, A. E., 1959. Appl. Microbiol. 7 : 256-264 Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San

Diego, 439p. Lydersen, B.K. , D’elia, N.A. and Nleson, K.L. Bioprocess Engineering

Systems, equipment and facilities, John Wiley & Sons, 1994, New York, 805p.

Quintero Ramírez, R. Ingeniería Bioquímica, teoría y aplicaciones, Alambra mexicana, 1981, México, 332p.

Schûgerl, K, Bioreactor engineering, volume 2; characteristics features of bioreactors, John Wiley & Sons, 1981, Chichester, 393p.

6.2. Producción de enzima en un biorreactor con células libres.

OBJETIVO GENERAL

Adquirir los conocimientos prácticos para producir una enzima extracelular por

medio de una fermentación con células libres.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Producir invertasa con células libres de levaduras en cultivo sumergido. 2. Monitorear y obtener la cinética de crecimiento de biomasa. 3. Monitorear y obtener la cinética de producción de enzima. 4. Determinar la actividad catalítica de la invertasa. 5. Establecer las constantes cinéticas (Km, Vmax) de la invertasa

MARCO TEÓRICO

Las Enzimas como Metabolitos

Los metabolitos primarios producidos durante un proceso de fermentación

representan productos finales de bajo peso molecular usados para la

producción de macromoléculas o son convertidos en coenzimas. Así también,

los metabolitos primarios pueden ser productos intermediarios en vías

metabólicas relacionadas con los productos finales. Los aminoácidos,

vitaminas, los nucleótidos y ciertas enzimas son considerados productos

primarios.




7

En el caso de las enzimas, éstas son consideradas metabolitos primarios

cuando la evolución de su producción guarda una relación estrecha con el

crecimiento microbiano. Existen diversos tipos de enzimas y pueden ser

obtenidas de diferentes fuentes.

Tipos de Enzimas y sus Fuentes

Al menos 75% de todas las enzimas industriales son de acción hidrolítica y

son usadas para la despolimerización de sustancias naturales. Las proteasas

representan el tipo de enzimas industriales predominantes (40%) utilizadas en

la industria lechera y detergentes. Las carbohidratasas utilizadas en las

industrias de panificación, cervecería, destilación, almidón y textiles

representan el segundo grupo más grande de enzimas industriales.

Las enzimas pueden ser obtenidas de diversas fuentes como tejidos

animales, plantas, hongos y bacterias. Las enzimas microbianas representan

90% de las enzimas industriales. Las enzimas de de origen vegetal más

importantes son la papaína, la bromelina, algunas enzimas amilolíticas de

cereales, lipoxigenasas de soya y enzimas de frutas cítricas. En cuanto a las

enzimas de origen animal, estas incluyen a las lipasas y proteinasas

pancreáticas, pepsinas y esterasas.

Levadura

Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular, es decir, un tipo de

levadura que ha servido como uno de los modelos más adecuados para el

estudio de problemas biológicos, por ser un sistema eucariota, con una

complejidad sólo ligeramente superior a la de las bacterias pero compartiendo

con ella muchas de sus ventajas técnicas.

Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la

producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido

de carbono y etanol durante el proceso de fermentación. En condiciones de

escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le

permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por tanto no realiza la

fermentación. Básicamente el proceso de fermentación se lleva a cabo

cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares, como

la sacarosa, y es por ello que en su metabolismo necesita sintetizar una

enzima que catalice la hidrólisis de sacarosa en glucosa y fructosa, siendo

una fuente productora de invertasa.

Invertasa

La invertasa, también conocida como sacarasa, es una enzima de interés

industrial utilizada en la hidrólisis de sacarosa para la obtención de jarabes

fructosados, los cuales son empleados ampliamente en la industria de los

http://es.wikipedia.org/wiki/Hongo

http://es.wikipedia.org/wiki/Unicelular

http://es.wikipedia.org/wiki/Di%C3%B3xido_de_carbono

http://es.wikipedia.org/wiki/Di%C3%B3xido_de_carbono

http://es.wikipedia.org/wiki/Etanol

http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Ruta_metab%C3%B3lica

http://es.wikipedia.org/wiki/Rendimiento

http://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcar




8

alimentos como en la industria refresquera, la de conservas, lácteos,

pastelería y confitería.

La invertasa desdobla la sacarosa en fructosa y glucosa, donde a la mezcla

resultante de estos se le denomina “azúcar invertido” debido a la inversión de

sus propiedades ópticas de una rotación positiva a una negativa. También se

cambian las propiedades químicas, por ejemplo, en el caso de la sacarosa, el

tipo de enlace que subsiste entre sus moléculas entrelazadas (α para la

glucosa y β para la fructosa) impide que dicha molécula contenga terminales

reductores, por lo que al hidrolizarse, estas moléculas que quedan libres

recuperan su poder reductor.

MATERIALES

- Vasos de precipitado de diferentes volúmenes - Barras magnéticas para agitación (mosca) - Guantes de asbesto - Agar nutritivo - Medio de cultivo para levaduras - Solución del reactivo DNS - Solución de glucosa, 2 g/L - Solución del reactivo de Bradford - Solución de anthrona - Solución de sacarosa, 30 g/L - Solución buffer fosfatos 0.1 M a pH 6.9 - Solución estéril de cloruro de sodio, 0.09% - Colorantes y soluciones para tinción de Gram - Pipetas de 1 y 10 mL - Portaobjetos - Charolas de aluminio de 5 cm de diámetro - Tiras de pH EQUIPO

- Biorreactor de laboratorio New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra de 5 L con su módulo de control, partes y electrodos. - Centrífuga para tubos falcón de 30 mL - Balanza analítica - Espectrofotómetro visible - Incubadora orbital con control de agitación y temperatura - Autoclave eléctrica de 50 L de volumen - Campana de flujo laminar - Microscopio óptico - Agitador Vortex - Baño de agua con control de temperatura




9

MÉTODOLOGÍA

Inoculación del Biorreactor. Posteriormente de confirmar la pureza del inóculo y la esterilidad del medio,

con ayuda del profesor se procederá a inocular, con 250 mL del inóculo, el

biorreactor. Antes de inocular se verifica que el medio de cultivo del

biorreactor esté libre de contaminantes. Después de inocular el biorreactor se

toman muestras de 20 mL para cada tiempo en base al siguiente programa de

muestreo:

Tabla 1. Programa de Muestreo

Tiempo Hora* Horas T0 8:00 0 T1 10:00 2 T2 12:00 4 T3 14:00 6 T4 16:00 8 T5 18:00 10 T6 20:00 12 T7 8:00 24 T8 10:00 26 T9 12:00 28

*Las horas no deben ser forzosamente exactas pero si apuntar la hora

exacta y el tiempo exacto de la muestra (Horas)

La muestra del tiempo cero (T0) se toma justo después de inocular el

biorreactor. Si en los tiempos T7, T8 y T9, no hay cambios significativos en la

evolución del crecimiento celular y en la producción de invertasa, se procede

a detener la fermentación.

* NOTA: El programa de muestreo anterior es una propuesta susceptible a

modificación.

Condiciones de fermentación: aireación de 1 VVM, temperatura de 35ºC,

pH inicial de 7.0 y agitación de 180 rpm.




10

De acuerdo al programa de muestreo, se irá llenando la “Hoja de control de

la cinética de producción de enzima con células libres” (se anexa al final

de la práctica), con los datos de los parámetros establecidos.

Se evaluarán los siguientes parámetros para cada una de las muestras:

1. Realizar un frotis de cultivo del biorrecator para realizar tinción de Gram y

observar al microscopio, para comprobar pureza.

2. Leer la temperatura que marca el módulo de control del biorreactor.

3. Determinar el pH del caldo de cultivo.

4. Establecer la biomasa por densidad óptica.

5. Establecer la concentración de biomasa por peso seco.

6. Establecer no de células por cuenta en cámara de Neubauer

7. Determinación de la producción de proteína extracelular (invertasa) por

medio del método de Bradford, utilizando al sobrenadante como muestra

problema y agua como blanco

8. Azúcares reductores del sobrenadante libre de células.

9. Determinación de la actividad enzimática (a los 5 minutos) de la invertasa

presente en el caldo de cultivo. De cada muestra centrifugada, tomar

0.05 mL del sobrenadante y se transferir a un microtubo. Adicionar 0.95

mL de solución de sacarosa 30 g/L y mezclar. Inmediatamente (testigo) y

a los 5 min. (triplicado), tomar 0.1 mL del tubo y transferir a otro tubo

con 0.1 mL de reactivo de DNS. Los tubos se colocan en agua hirviente

durante 5 minutos y luego en hielo. Adicionar 1 mL de agua destilada al

tubo eppendorf, posteriormente pasar a una celda y medir absorbancia a

540 nm.

Metodologías

Azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS9, seguir el protocolo descrito en la práctica No. 1. Realizar previamente una curva tipo con soluciones de glucosa.

a) pH: Medir el pH del caldo de cultivo a partir de una muestra (3 a 5 mL) extraída del biorreactor. Utilizar tiras o papel indicador de pH, o con un potenciómetro. La lectura de pH es continua por lo que se necesita únicamente anotar el valor de la lectura.




11

b) Biomasa por peso seco:

1. Poner 10 mL de muestra en un tubo falcon de 30 mL de volumen y

centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos. (recuperar sobrenadante para análisis: azúcares reductores, pH, AE, etc.))

2. Decantar el sobrenadante y mezclar la biomasa precipitada en el tubo falcon con 1 mL de solución salina isotónica.

3. Homogeneizar utilizando el Vortex. 4. Verter la suspensión celular en una charola de aluminio de peso

conocido. Enjuagar el tubo, para recuperar toda la biomasa, con 1 mL de solución salina isotónica.

5. Meter la charola conteniendo la suspensión celular dentro del horno a 80ºC y durante 24 horas o hasta peso constante.

6. Determinar el peso de la biomasa seca por diferencia de pesos. El peso de la muestra seca y el de la charola menos el peso de la charola, resulta en el peso seco de la biomasa contenida en los 10 mL de muestra.

7. Reportar la concentración de biomasa en mg de biomasa seca/mL de caldo de cultivo.

c) Biomasa por densidad óptica

1. Poner aproximadamente 1 mL de muestra homogénea en una celda 2. Ajustar el espectrofotómetro a absorbancia de cero utilizando el

sobrenadante de centrifugación como blanco (caldo de cultivo sin biomasa) obtenido en la técnica anterior de estimación de biomasa por peso seco.

3. Introducir la celda con la muestra problema en el espectrofotómetro y determinar la densidad óptica a 600 nm.

d) Proteína extracelular: Para determinar la concentración de la invertasa

producida, tomada en cuenta como proteína extracelular, se empleará el método de Bradford descrito en la práctica No. 1. Determinando proteína en el cultivo celular libre de células.

Al final de la fermentación:

a) Detener la fermentación apagando la agitación y el módulo de control.

Cerrar el flujo de agua de enfriamiento.

b) Desmontar el biorreactor de su módulo y esterilizarlo junto con su

contenido utilizando la autoclave eléctrica, no olvidando dejar la salida

de aire del biorreactor abierta.

c) Después de la esterilización, desmontar el biorreactor y sus partes y

efectuar su limpieza.




12

REPORTE DE RESULTADOS

a) Elaborar una tabla de los datos obtenidos.

b) Elaborar una gráfica de los resultados del crecimiento de la biomasa

(mg de biomasa seca/mL de caldo de cultivo), y de la densidad óptica a

600 nm contra tiempo (h).

c) Elaborar una gráfica de los resultados de la producción de invertasa

(mg de proteína) contra tiempo (h).

d) Elaborar una gráfica de los resultados del consumo de sustrato (mg de

sacarosa) contra tiempo (h).

e) Elaborar una gráfica de los resultados de la actividad enzimática

(U/mL) contra tiempo (h).

f) Elaborar una gráfica del monitoreo de pH.

g) Elaborar una gráfica del monitoreo de la temperatura.

h) Discutir sobre el comportamiento de las cinéticas, explicando lo que

ocurrió en cada fase de la fermentación.

i) Calcular las constantes cinéticas Vmax y Km mediante algún método

señalado en la práctica No. 2, “Determinación de Vmax y Km de

enzimas”.

j) Anexar la “Hoja de control de la cinética de producción de enzima con

células libres” utilizada durante el desarrollo de la práctica.

k) Si se realizaron las cuatro fermentaciones diferentes marcadas en la

práctica No. 5, “Adiestramiento en la operación de un biorreactor de

laboratorio”, comparar los resultados obtenidos entre ellas.

BIBLIOGRAFÍA

Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd

Edition, McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.




13

Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San

Diego, 439p.

López, Agustín; QUINTERO, Rodolfo. Tecnología Enzimática. UNAM. México,

1987.

Scragg, Alan. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en procesos

tecnológicos. Editorial Limusa. México, 1999.

Segel H. Irwin, Biochemical Calculations (How to solve mathematical

problems in general biochemestry). Editorial John Wiley & Sons, Segunda

edición, Estados Unidos de América 1976

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handbook. 2nd edition, Noyes Publications, 1997. New Jersey, 801p.




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CONDICIONES

Aireación (vvm)

Agitación (rpm)

Fecha y hora de inicio:

Fecha y hora de término:

MuestraTiempo

(h)T ( °C) pH

Pureza de

Cultivo (+,-)

Charola

(g)

Charola

con

Muestra PS

(g)

DO

(600 nm)

No de

Cel/mL

DNS (DO) se

sobrenadante

Bradford

(DO) de

sobrenadante

Observaciones

T0

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

HOJA DE CONTROL DE CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ENZIMA POR CÉLULAS LIBRES




1

PRÁCTICA 7

PRODUCCIÓN DE ENZIMA (INVERTASA) A PARTIR DE

Saccharomyces cerevisiae LIBRE E INMOVILIZADA EN UN BIORREACTOR A NIVEL LABORATORIO.

OBJETIVOS:

El alumno determinará la actividad enzimática de la invertasa producida por Saccharomyces cerevisiae en estado libre e inmovilizado en esferas de alginato de sodio, durante una fermentación en un biorreactor a nivel laboratorio.

Específicos: - El alumno diseñará y construirá un biorreactor nivel laboratorio para la

producción de enzimas a partir de levadura en estado libre e inmovilizado.

- El alumno inmovilizará células de S. cerevisiae en alginato de sodio. - El alumno preparará el medio de cultivo para el crecimiento de la

levadura y la producción de la enzima. - El alumno llevará a cabo el seguimiento de la cinética de crecimiento de

la levadura en estado libre e inmovilizado. - El alumno monitoreará la producción de proteína en las células (en

estado libre e inmovilizado) durante el tiempo de proceso. - El alumno determinará la actividad enzimática y la actividad enzimática

especifica de la invertasa producida por las células en estado libre e inmovilizado.

MARCO TEÓRICO

Inmovilización de células: La inmovilización celular se define como la localización de células en una región definida en el espacio con la preservación de las funciones celulares. Esta región de inmovilización debe ser una fase sólida que permita el intercambio de sustratos y productos con el medio exterior, no debe ser tóxica para las células y debo ser fácilmente manipulable. La inmovilización en soportes naturales y sintéticos ha mostrado por un lado, estabilidad en las funciones celulares, por otro lado, permite alcanzar altas concentraciones de microorganismos en volúmenes reducidos y permite la reutilización del biocatalizador y la implantación de sistemas continuos da producción, facilitando las etapas de separación.




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Los procesos biotecnológicos pueden ser sustancialmente optimizados utilizando microorganismos inmovilizados en comparación con los procesos que utilizan células libres.

La utilización de la inmovilización celular permite:

Facilitar las etapas de separación de biomasa y producto. La reutilización del biocatalizador microorganismos o

células vegetales o animales. Facilitar la implantación de sistemas continuos de

producción. Prolongar la actividad metabólica de los microorganismos o células vegetales o animales.

Prolonga el ciclo de vida de los microorganismos o células vegetales o animales.

Aumentar la tolerancia de las células a sustancias tóxicas. Métodos de inmovilización: Las diferentes técnicas que se utilizan para la inmovilización celular pueden ser clasificadas de la siguiente manera: adsorción física y enlaces covalentes, micro encapsulación, agregación, y atrapamiento o inclusión celular.

- Adsorción y enlaces covalentes. Las técnicas de adsorción y por enlaces covalentes se llevan acabo en los espacios libres de los poros del soporte, en donde existen grandes superficies. En este tipo de inmovilización, una gran parte de la superficie de la célula está en contacto directo con el medio, en contraste con la encapsulación o técnicas de atrapamiento, en donde un fragmento grande de las células es capturado y las limitaciones de transferencia de masa pueden estar presentes.

- Adsorción. Las células pueden anclarse naturalmente a una superficie, las células se anclan al soporte por atracciones electrostáticas (fuerzas de Van der Walls, iónicas y de puentes de hidrógeno). El crecimiento produce una biopelícula en la superficie del soporte y las limitaciones de transferencia de masa tienen lugar dentro de esta biopelícula. Los soportes incluyen trozos de madera, arena, resinas de intercambio iónico y materiales orgánicos corno la celulosa y carbón activado.

- Enlace covalente. En este tipo de inmovilización el fuerte enlace de la célula-soporte reduce la pérdida celular. La unión directa de las células a un soporte activado es posible por la modificación química de la matriz por medio de la utilización de sustancias que sirvan de puente de unión química. El glutaraldehído es usado para tal fin, sin embargo, el riesgo del daño celular, debido a los enlaces covalentes alrededor de la membrana celular, puede ser una limitante.




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- Micro-encapsulación.

La micro-encapsulación se usa en el área farmacéutica o en el campo de ¡ü medicina para producción de fármacos e inmovilización de enzimas. Una microcápsula consiste en una semi-membrana permeable, esférica, delgada y fuerte que rodea un centro liquido, con un diámetro que varia de unas mieras a 1mm. La membrana sin/e como una barrera semipermeable permitiendo la entrada cíe sustrato y la salida de metabolitos, pero no permite el paso de células.

- Atrapamiento o inclusión. De entre los métodos de inmovilización de células, el método de inclusión celular ha mostrado ser el que permite un mejor control de la inmovilización y es el que preserva mejor las funciones celulares. Este método consiste en atrapar las células en una red tridimensional rígida de hidrogel; los soportes de inmovilización pueden ser sintéticos (por ejemplo la poliacrilamida, el poliuretano) o naturales, (por ejemplo el agar, la gelatina, el alginato y la carragenina). Una de las características particulares del método de inclusión o atrapamiento celular está relacionada con las condiciones de gelificación del soporte y la reversibilidad del proceso de gelificación. La gelificación se realiza por cambios en la temperatura o por la presencia de iones. Además, la gelificación es reversible, así, bajo ciertas condiciones físicas se cuenta con una suspensión celular que puede ser gelificada, quedando las células atrapadas; posteriormente se puede volver a liberar las células aumentando la temperatura o retirando los iones. Uno de ios materiales más empleados para realizar la inmovilización por inclusión celular es la K-carragenina.

a) Kapa-carragenina. La K-carragenina es un polisacárido no tóxico, de fácil adquisición, aislado a partir de algas marinas. Es ampliamente usado en las industrias cosmética y alimentaria como agente gelificante, espesante y estabilizante. Es un polímero, el cual esta constituido por una estructura unitaria de sulfato de β-D galactosa y 3,6-anhidro-α-D-galactosa. La K-carragenina gelifica al enfriarse o al contacto con una solución de algún agente inductor del gel, tales corno iones potasio o calcio. Una ventaja al emplear K-carragenina es, que la inmovilización puede efectuarse bajo condiciones muy suaves, sin el uso de químicos que puedan inhibir la actividad enzimática de las células. Invertasa: la invertasa (β-D-fructofuranosidasa, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa, EC 3.2.1.26), cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores β-D-fructofuranosídicos de fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que actúa el más significado es, sin duda, la sacarosa, de ahí que el enzima se designe con el nombre de sacarasa. La denominación trivial de invertasa, con la que también se conoce, hace referencia al hecho de que los productos de la reacción son conocidos desde antiguo




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como “azúcar invertido” ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrólisis es levorrotatoria, por lo que en el proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de rotación óptica. Sacarosa ([α]

D= +66,5º) + H

2O → D-glucosa ([α]

D= +52,5º) + D-fructosa ([α]

D= -92º)

La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel importante en el catabolismo de fructanos y más específicamente en el de la sacarosa, en especial en aquellos organismos en los que dichos azúcares son utilizados como fuente de carbono y energía. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto desde un punto de vista académico como de investigación aplicada, siendo uno de los enzimas más conocidos. La invertasa es una enzima de interés industrial utilizada en la hidrólisis de sacarosa para la obtención de jarabes fructosados (JF), los cuales son empleados ampliamente en la industria de alimentos como la industria refresquera, la de conservas, lácteos, pastelería y confitería. Aplicación biotecnológica y biorreactores con células inmovilizadas. Los biorreactores más comunes usados con células inmovilizadas son: tanque agitado, lecho fluidizado, columna empacada, y reactor air-lift (Fig. 1). El tipo de biorreactor a utilizar depende del método de inmovilización empleado, del metabolismo las células y del requerimiento de transferencia de masa




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Figura 1. Biorreactores con células inmovilizadas A, Tanque agitado; B, air lift; C, Columna empacada; y D, Lecho fluidizado. Material, Equipo y Reactivos

Probetas. Termómetro Autoclave Baño María Potenciómetro. Microscopio óptico Centrífuga Balanza analítica Espectrofotómetro UV-VIS Campana de flujo laminar Tubos Falcón Tubos Eppendorf estériles (150

aprox.) Portaobjetos Asa bacteriológica Lámpara de alcohol Mechero de Bunsen

Micropipetas Encendedor Portaobjetos Puntas para micropipetas Tiras de medición de pH Charolas de aluminio secas Soluciones para realizar tinción de

Gram o Cristal Violeta o Lugol o Alcohol-cetona o Safranina

Reactivo DNS Reactivo de Bradford Solución de sacarosa al 30% Agua destilada Buffer pH 4 Buffer pH 7

Alimentación

Célulasinmovilizadas

Productos Productos


Productos

Alimentación

Aspersor de aire

Salida de aire

A B

DC

AlimentaciónAlimentación


Productos Productos


Productos

Alimentación

Aspersor de aire

Salida de aire

A B

DC

Alimentación




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Aceite de inmersión Solución de anthrona Alcohol al 70 % Solución de sacarosa Pinzas Charolas de aluminio Baño de hielo Sacarosa Extracto de levadura Vasos de precipitado de diferentes

volúmenes Barras magnéticas para agitación

(mosca)

Jeringa de 10 ml con punta roma Manguera de silicón de 2 mm de

diámetro para bomba peristáltica Agar nutritivo. Parrilla de agitación y

calentamiento Soporte Universal Solución estéril de cloruro de calcio

al 1%. Solución de alginato al 2% Pipetas de 1 y 10 mL 1 colador de cocina metálico

Primera parte: Cada equipo debe diseñar un reactor, considerando material que sea factible de conseguir, que esté en el laboratorio o bien matraces, frascos de vidrio, probetas, tubería etc. El reactor diseñado deberá garantizar la esterilidad del cultivo, además de proveer un sistema de agitación homogéneo, ya sea por medio de inyección de aire o con barras magnéticas. El volumen total de operación del reactor no deberá ser mayor a 1 L. Prueba de del biorrecator diseñado, funcionamiento y esterilidad: Preparar medio de cultivo agar nutritivo (el volumen dependerá del tamaño del reactor diseñado) y colocarlo en el reactor. Cerrar el reactor y someterlo a esterilización en autoclave, a 125 °C por 15 minutos. Posteriormente verificar que no se halla dañado el rector o sus partes durante el proceso y dejar funcionando durante 24 h. Al día siguiente, comprobar por medio de turbidez y cuenta en placa que no haya crecimiento en el reactor. Segunda parte Medio a utilizar en toda la práctica, composición por L de medio: sacarosa, 20 g; KH2PO4, 5 g; (NH4)2SO4, 7 g; NaCl, 0.5 g; MgSO4 7H2O, 0.5 g, CaCl2 2H2O, 0.25 g; extracto de levadura, 5.0 g Ajustar el pH a 5 con H2SO4 y NaOH 0.1 N, esterilizar a 120 oC y 1.5 Kg/cm2 durante 15 minutos. Preparar, un día antes de iniciar el experimento en el birreactor, un inóculo de S. cerevisiae en cuatro matraces de 500 mL con 250mL de medio estéril, pH 5. El profesor proporcionará un cultivo en caja de petri de la cepa Saccharomyces




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cerevisiae. De forma aséptica, tomar con el asa una porción de una colonia del cultivo sólido proporcionado e introducirla en el medio de cultivo estéril del matraz. Incubar a 35°C, con agitación de 120 rpm y durante 14 a 16 horas (toda la noche). Verificar la pureza del cultivo por tinción de gram Inmovilización de células. TODO el material donde se trabajará debe estar estéril, y manipular en la campana hasta que esté montado en reactor. Prever tener todo el material estéril, pipetas, coladores, matraces, mangueras, etc. Centrifigar 500 mL de medio a 5000 rpm, 15 min en tubos estériles y recuperar la pastilla celular, (eliminar sobrenadante), posteriormente resuspender la biomasa en 100 mL de solución isotónica estéril. 1. Contar el No de células por mL del inóculo, por cuenta en cámara de

Neubauer. 2. Adicionar a un matraz de 500 0 1000 mL que contiene 400 mL de alginato

de calcio al 2.5% a 40-45 ºC, la biomasa contenida en los 100 ml del inóculo (biomasa resuspendida).

3. Agita con una barra magnética para homogenizar la suspensión. 4. La suspensión se bombea por medio de una bomba peristáltica que

opera a 12 rpm y a través de una aguja hacia una solución de cloruro de calcio al 1% (estéril) en forma de gotas.

5. Las gotas al ponerse en contacto con la solución de cloruro de calcio solidifican instantáneamente formándose así esferas de aproximadamente 3 mm de diámetro.

6. La solución debe estar con agitación mínima (60 rpm), para evitar que las esferas se peguen entre ellas al momento de caer. Las esferas formadas permanecen en la solución de cloruro de calcio con agitación durante 30 min.

7. Posteriormente son retiradas de forma estéril (con un colador de cocina metálico estéril) e introducidas al biorreactor diseñado. Todo ello se realiza dentro de la campana de flujo laminar en condiciones de esterilidad.

8. Tomar una muestra de esferas para determinar el volumen y peso de la misma y establecer el número de células por esfera.

9. Tomar una muestra del cloruro de calcio para determinar las células no inmovilizadas, por cuenta en cámara de Neubauer.

Una vez obtenidas la células inmovilizadas montar los dos reactores diseñados, uno para células libres (inocularlo al 10 %) y otro para inmovilizadas. Tener listo la cantidad de medio de cultivo estéril necesario para los reactores, tener preparado más de lo necesario para el caso de cualquier contingencia y los blancos.




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La cinética se seguirá por 24 h, tomando 5 o 6 mL de medio en cada tiempo para análisis; Monitoreando los siguientes parámetros en el sobrenadante:

1. Densidad óptica (biomasa) (Volumen de muestra 1 mL máximo) 2. Cuenta en placa* (Volumen de muestra 0.1 mL) 3. Cuneta directa en cámara de Neubauer (Volumen de muestra 0.1 mL) 4. Tinción de Gram (Volumen de muestra 0.1 mL)

*Cuenta en placa se realizará al inicio, tiempo cero, un tiempo intermedio y tiempo final, por triplicado y tres diluciones, en medio para levaduras con 15 g/L de agar, inoculando con 0.1 mL de la dilución correspondiente (100 a 10-9 y extendiendo con varilla en “L”. (Se requieren de 54 cajas por equipo, puntas estériles de 1000 y 100 µL, para las diluciones: 30 tubos eppendorf estériles, solución isotónica estéril) En sobrenadante centrifugado a 5000 rpm 15 min determinar:

5. Proteína por Bradford (Volumen de muestra 0.75 mL) 6. Azúcares reductores (Volumen de muestra 0.3 mL) 7. Azúcares totales (Volumen de muestra 0.6 mL) 8. pH ((Volumen de muestra 1 mL) 9. Actividad enzimática: (Volumen de muestra 250 µL)

De cada muestra centrifugada, tomar 0.05 mL del sobrenadante y se transferir a un microtubo. Adicionar 0.95 mL de solución de sacarosa 30 g/L y mezclar. Inmediatamente y a los 5 min., tomar 0.1 mL del tubo y transferir a otro tubo con 0.1 mL de reactivo de DNS. Los tubos se colocan en agua hirviente durante 5 minutos y luego en hielo. Adicionar 1 mL de agua destilada y medir absorbancia a 540 nm.

Notas: IMPORTANTE, la única muestra que debe permanecer sin contaminar (tomada y manipulada en condiciones de esterilidad) es la usada para cuenta en placa. Tiempos recomendados: en función de los horarios de la clase, establecer el programa de muestreo, la principal actividad se lleva a cabo en las primeras 12-18 horas, por lo que dejar al inicio toda la noche el sistema puede hacer que se pierdan los puntos más interesantes. Se recomienda dejar todo listo, enfriar e iniciar en la mañana. Las muestras pueden ser tomadas y guardadas en refrigeración para el posterior análisis. Se recomienda hacer de forma inmediata la cuanta en placa y Tinción de Gram (esta última para asegurar que no hay contaminación).

Resultados y análisis de resultados 1.- Establecer el porcentaje de inmovilización de células 2.- Comparar la actividad y eficiencia de los dos reactores 3.- Establecer relaciones y correlaciones de los parámetros determinados. Curvas de crecimiento, degradación, actividad enzimática, consumos de sustrato, etc. 4.- Discutir los resultados obtenidos




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