OBTENCIÓN DE AZÚCARES FERMENTABLES A...
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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD DE INGENIERÍA DIVISIÓN DE POSTGRADO
PROGRAMA DE POSTGRADO EN INGENIERÍA QUÍMICA
OBTENCIÓN DE AZÚCARES FERMENTABLES A PARTIR DEL BAGAZO DE LA CAÑA DE AZÚCAR MEDIANTE LA HIDRÓLISIS ÁCIDA
DILUIDA EN DOS ETAPAS
Trabajo de Grado presentado ante la Ilustre Universidad del Zulia
para optar al Grado Académico de
MAGÍSTER SCIENTIARUM EN INGENIERÍA QUÍMICA
Autor: Ing. Nercy Josefina Villalobos Quintero. Tutora: Cintia Chandler
Co-tutora : Cateryna Aiello Mazzarri
Maracaibo, febrero de 2012.
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Villalobos Quintero, Nercy Josefina. Obtención de azúcares fermentables a partir del bagazo de la caña de azúcar mediante la hidrólisis ácida diluida en dos etapas (2012). Trabajo de Grado. Universidad del Zulia. Facultad de Ingeniería. División de Postgrado. Maracaibo. República Bolivariana de Venezuela. p.83. Tutora: Cintia Chandler. Co-tutora: Cateryna Aiello Mazzarri.
RESUMEN El objetivo de esta investigación fue obtener azúcares fermentables a partir de la hidrólisis ácida diluida en dos etapas del bagazo de la caña de azúcar. La hidrólisis se llevó a cabo en un reactor autoclave de 100mL de capacidad, tiempo de reacción de 3 minutos, 1%v/v de ácido sulfúrico y relación líquido-sólido de 15:1. La primera etapa de la hidrólisis se realizó en un rango de temperatura de 100-160 ºC. La fase sólida se separó de la fase líquida mediante filtración al vacío, el hidrolizado se almacenó bajo refrigeración a ± 4°C y el sólido remanente se utilizó en la segunda etapa, la cual se realizó a dos temperaturas: 160 y 180°C, manteniendo constante el resto de las condiciones. La temperatura tiene un efecto significativo sobre la producción de azúcares reductores, así como también en la generación de subproductos tóxicos para los microorganismos. Los mejores valores de temperatura para la hidrólisis del bagazo de caña de azúcar mediante dos etapas secuenciales por carga son 140°C para la primera etapa y 180°C para la segunda. La presencia de furfural, hidroximetilfurfural, acido acético y compuestos fenólicos indican que se producen reacciones de degradación asociadas tanto a pentosas y hexosas derivadas de la hidrólisis de la hemicelulosa y la celulosa. La conversión total de azúcares reductores, expresados como glucosa, a partir de las dos etapas secuenciales de hidrólisis fue de 306,07 g/Kg de bagazo seco, equivalente al 39,41% del valor teórico.
Palabras Clave: Bagazo de caña de azúcar, hidrólisis en dos etapas, ácida diluida, azúcares fermentables, compuestos inhibidores. E-mail: [email protected]
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Villalobos Quintero, Nercy Josefina. Obtaining fermentable sugars from bagasse of sugarcane by dilute acid hydrolysis in two stages (2012). Trabajo de grado. Universidad del Zulia. Facultad de Ingeniería. División de Postgrado. Maracaibo. República Bolivariana de Venezuela p.83.Tutora: Cintia Chandler. Co-tutora: Cateryna Aiello Mazzarri.
ABSTRACT
The aim of this research was to obtain fermentable sugars from two stages diluted-acid hydrolysis of sugarcane bagasse. The hydrolysis was conducted in a 100 mL autoclave reactor, reaction time of 3 minutes, 1% v/v sulphuric acid and liquid-solid ratio of 15:1. The first stage of hydrolysis was performed in a temperature range of 100-160ºC. The solid phase was separated from the liquid phase by vacuum filtration, the hydrolyzate was cooled to ± 4ºC and the remaining solid was used in the second stage, which was conducted at two temperatures: 160 and 180ºC, maintaining constant the other conditions. Temperature had a significant effect on the sugar production, as well as on the generation of by products toxic to microorganisms. The best values of temperature for the hydrolysis of sugar cane bagasse by two sequential batch stages were 140 and 180°C for the first and second, respectively. The presence of furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid, and phenolic compounds indicated that degradation reactions associated with both pentoses and hexoses, derived from the hemicellulose and cellulose hydrolysis were occurring. Total fermentable sugars yield from the sequential batch stages was 306, 41 g/Kg dry matter, equivalent to 39,41% of the theoretical value. Key words: Sugarcane bagasse, two-stage hydrolysis, dilute-acid hydrolysis, fermentable sugars, inhibitory compounds.
E-mail: [email protected]
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DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a lo más hermoso
que Dios me ha dado, mi hijo Jesús David
y a la memoria de mi querida madre, Nora
5
AGRADECIMIENTO
A Dios por sobre todas las cosas, por darme fortaleza para seguir adelante.
A mi madre que está en el cielo, por haber hecho de mí todo lo que soy.
A mi hijo Jesús David, por haber cambiado mi vida.
A mi familia, por apoyarme en todo momento y acompañarme a cumplir esta
meta. Sin ellos no hubiese sido posible.
A la Profesora Cintia Chandler, por darme la oportunidad de realizar este
trabajo de investigación, por sus sabios consejos, por decirme “si se puede”
cuando más lo necesité, por brindarme una buena relación tutor-tesista. A
usted profe mil gracias.
A la Profesora Cateryna Aiello, por su ayuda incondicional, su orientación y
su apoyo en todo momento.
A Elsy Arenas, por compartir conmigo sus conocimientos y ofrecerme siempre
una mano amiga.
A mis amigas Yadira Cubillán y Pragedes Paredes, por estar siempre
conmigo, brindándome su apoyo.
Al personal del Laboratorio de Tecnología de Alimentos y Fermentaciones
Industriales, en especial a la Profesora Marisela Rincón, al Ing. Albert Zabala,
al Br. Jhon Sánchez y a la Profesora Karelen Araujo por su inmensa
colaboración.
Al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico (CONDES),
por su apoyo en el financiamiento para la realización de la tesis.
Al Postgrado de Ingeniería por su colaboración en todo momento.
A la Profesora Gisela Páez, por su disposición incondicional y su
comprensión.
A los Profesores Gilberto Colina y Gerson Chávez, por contribuir con sus
conocimientos en la realización de este trabajo.
Al Instituto Zuliano de Investigaciones Tecnológicas (INZIT) por toda la
colaboración prestada, en especial al Dr. Alexis Ferrer y a la Lic. Josybel.
Ríos. Gracias amiga por todo tu apoyo.
A todo el personal del INSUC, por adoptarme como tesista del instituto y por
ayudarme en todo momento, especialmente a la Profesora Dora Finol y al
Profesor Eduardo González.
6
A Laira Chirinos, por los momentos de amistad compartidos y su ayuda.
Y a todas aquellas personas que de una u otra forma prestaron su más
sincera ayuda para hacer posible la realización de esta investigación.
Nercy
7
TABLA DE CONTENIDO
Página
RESUMEN……………………………………………………………………………. 3
ABSTRACT…………………………………………………………………………… 4
DEDICATORIA……………………………………………………………………….. 5
AGRADECIMIENTO…………………………………………………………………. 6
TABLA DE CONTENIDO. …………………………………………………………... 8
LISTA DE TABLAS…………………………………………………………………... 10
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………………. 11
INTRODUCCIÓN…………………….....……………………………………............ 12
CAPÍTULO
I REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA............... ………………………………………. 14
II METODOLOGÍA EXPERIMENTAL...........…………………………………… 32
2.1 Sustrato………………………………...................................................... 32
2.2 Caracterización del bagazo................................................................... 32
2.3 Hidrólisis ácida diluida……….……………………………………………. 33
2.4 Análisis de las muestras........................................................................ 34
2.5 Análisis de datos……………………………………………………………. 36
III RESULTADOS Y DISCUSIÓN…..........................………………………….. 37
3.1 Composición del bagazo de caña de azúcar……………………………. 37
3.2 Primera etapa de hidrólisis………………………………………………… 38
3.3 Segunda etapa de hidrólisis………………………………………………. 47
CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 51
RECOMENDACIONES…………………………………………………………….. 52
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………….. 53
APÉNDICES…................................................................................................... 58
A: Procedimiento para el manejo del reactor autoclave parr 4593……………... 58
B: Determinación de nitrógeno y proteína cruda…………………………………. 59
C: Determinación de fibra neutro detergente, fibra ácido detergente y lignina ácida detergente………………………………………………………………………
61
D: Método de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)……………………………………. 68
E. Determinación de compuestos fenólicos……………………………………….. 71
8
Página
F: Curvas de calibración para la determinación de compuestos fenólicos, ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural……………………………………….. 72
G: Cromatogramas............................................................................................. 75
H: Resultados experimentales............................................................................ 76
9
LISTA DE TABLAS
Tabla Página
1 Tipos de inhibidores y sus estructuras químicas…………………… 27
2 Caracterización del bagazo de caña de azúcar sin hidrolizar……. 37
3 Rendimiento de los azúcares reductores producidos en la primera etapa de la hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido-sólido de 15:1 y diferentes temperaturas…………………..
39
4 Contenido de celulosa y hemicelulosa en el bagazo de caña de azúcar sometido a la primera etapa de hidrólisis…………………... 41
5 Contenido de lignina en el bagazo de caña de azúcar sometido a la primera etapa de hidrólisis………………….................................
46
6 Valores promedio de los resultados obtenidos en la primera etapa de hidrólisis………………...............................................................
46
7 Producción de azúcares reductores durante la segunda etapa de la hidrólisis (H2E) del bagazo de la caña de azúcar con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido-sólido de 15:1 y diferentes temperaturas……………………………………………………………..
47
8 Contenido de furanos, ácido acético y compuestos fenólicos generados durante la segunda etapa de la hidrólisis (H2E) del bagazo de la caña de azúcar con ácido ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido-sólido de 15:1 y diferentes temperaturas …....
48
9 Temperaturas seleccionadas en las etapas de la hidrólisis ácida y concentración de los productos obtenidos en cada etapa………….
50
10
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Fuente de energía en la biomasa..................................................... 14
2 Representación de la estructura lignocelulósica.............................. 15
3 Estructura del polímero de celulosa…………………………………... 15
4 Estructura representativa de la celulosa……………………………… 16
5 Representación esquemática de la estructura de la hemicelulosa... 17
6 Representación esquemática de la estructura de química de la lignina...............................................................................................
20
7 Estructuras de los alcoholes precursores de la lignina……………... 21
8 Degradación de la celulosa y hemicelulosa…………………............ 28
9 Productos de la degradación de la lignina....................................... 30
10 Reactor Autoclave modelo 4593 (Pressure Reaction Apparatus, Parr Instruments)………………………………………………………..
34
11 Producción de azúcares reductores durante la primera etapa de las hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas (H1E-xxx : hidrólisis primera etapa a 100, 120,140 y 160°C)………………………………
38
12 Concentración de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)…………………………………………………………......
42
13 Concentración de ácido acético en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)……………………
44
14 Concentración de compuestos fenólicos en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)………...
45
11
INTRODUCCIÓN
El bagazo de caña de azúcar es un material lignocelulósico constituido
principalmente por celulosa (38-50%), hemicelulosa (17-32%) y lignina (15-30%). Se
obtiene como subproducto en los centrales azucareros y representa
aproximadamente entre el 25 y 40% del total de materia procesada, dependiendo del
contenido de fibra de la caña y la eficiencia en la extracción del jugo (Pernalete y
col., 2008; Vargas y col., 2011).
Debido al alto contenido de carbohidratos y al bajo contenido de lignina, así como
su disponibilidad a nivel agroindustrial, se considera que el bagazo es un residuo
agroindustrial con un alto potencial para obtener azúcares fermentables. Para tal
efecto se utilizan una serie de tratamientos, siendo la hidrólisis ácida uno de los
métodos más utilizado para solubilizar la fracción de hemicelulosa y permitir el
acceso hacia la celulosa. Estas hidrólisis se pueden realizar con ácido concentrado o
diluido, siendo el uso de ácidos concentrados menos atractivo para la producción de
etanol debido a la formación de compuestos inhibidores. Además, ocurren
problemas de corrosión en los equipos, difícil recuperación del ácido y alto costo de
mantenimiento operacional, lo que hace que el método de poco interés a escala
comercial (Alvira y col., 2010).
Con la hidrólisis ácida diluida se tienen las siguientes ventajas: consumir menos
cantidad de ácido comparado con la hidrólisis con ácido concentrado. Solubilizar la
hemicelulosa, principalmente xilano, facilitando así la conversión de azucares
fermentables. Sin embargo, dependiendo de la temperatura del proceso, se pueden
generar algunos compuestos de degradación de los azúcares, furfural e
hidroximetilfurfural, y de la lignina, los cuales afectan el metabolismo del
microorganismo en la etapa de fermentación (Alvira y col., 2010).
Quizás la mayor desventaja de la hidrólisis con ácidos diluidos radica en la
formación de compuestos que inhiben el crecimiento de microorganismos durante la
fermentación a etanol. Para evitar la degradación de los azúcares a altas
temperaturas, así como la formación de inhibidores, la hidrólisis se puede llevar a
cabo en dos etapas. Una primera etapa para convertir la hemicelulosa en sus
monómeros constituyentes, a temperaturas relativamente bajas (100-160ºC). Una
segunda etapa en la cual se hidroliza el sólido restante, transformando a la celulosa
12
en glucosa, bajo condiciones más severas, a temperaturas más elevadas, entre 200-
240 ºC (Sánchez y col., 2008; Gírio y col., 2010).
Estudios previos reportan que en la primera etapa se obtiene un rendimiento de
azúcares, pentosas y hexosas de la hemicelulosa, entre 80 y 95% de los azúcares
disponibles, mientras que en la segunda etapa el rendimiento de la hidrólisis de la
celulosa es bajo, entre 40 y 60% (Nguyen y col., 1999; Kim y col., 2005; Karimi y
col., 2006; Taherzadeh y col., 2007). Estos bajos rendimientos parecieran no ser un
problema si se consideran los bajos costos de los materiales lignocelulósicos y la
posibilidad de utilizar el material residual en la producción de energía. Sin embargo,
las condiciones de la hidrólisis en cada etapa deben ser estudiadas dependiendo del
material a utilizar, ya que la complejidad estructural y composición depende del tipo
de residuo o desechos que se esté utilizando.
El objetivo de esta investigación fue encontrar las mejores condiciones de
hidrólisis del bagazo de caña de azúcar, utilizando un proceso en dos etapas con
ácido sulfúrico diluido, que permitan obtener el mayor rendimiento en la producción
de azúcares, evaluando a su vez la formación de subproductos que puedan inhibir el
crecimiento de los microorganismos empleados en las fermentaciones.
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CAPÍTULO I
REVISION BIBLIOGRÁFICA
La caña de azúcar es una gramínea característica de las zonas tropicales y
subtropicales, la cual ha sido cultivada para producir azúcar y generar una gran
cantidad de productos, que a su vez se convierten en materia prima para la
producción de etanol, pasta de papel, alimento para animales, furfural e
hidroximetilfural, entre otros (Pattra y col., 2008; Abreu y De la Rosa, 2011).
El bagazo de caña de azúcar es un residuo poroso que se genera después de la
extracción del jugo de la caña de azúcar y representa el 25% de la masa total. Brasil
genera grandes cantidades de bagazo en la producción de azúcar; durante la zafra
del 2010-2011 más de 629 millones de toneladas de caña de azúcar fueron
trituradas, las cuales generaron alrededor de 229 millones de toneladas de residuos
sólidos (De Moraes y col., 2011). Este residuo está constituido por 43,8% celulosa,
28,6% de hemicelulosa, 23,5% de lignina, 1,3% de cenizas, y 2,8% de otros
componentes (Pereira y col., 2011).
La biomasa se define como toda aquella materia orgánica, ya sea vegetal, animal
o procedente de su transformación natural o artificial. Estas provienen de la
fotosíntesis, la cual es un proceso por el cual los cloroplastos presentes en las
células vegetales son capaces de formar sustancias más complejas a partir del CO2
existente en el aire, utilizando la energía solar como catalizador y promotor de esta
reacción (Figura 1).
Figura 1. Fuente de energía en la biomasa (Saidur, R. y col., 2011)
15
Básicamente la celulosa forma un esqueleto el cual está rodeado por
hemicelulosa y lignina, como se ilustra en la Figura 2. Adicionalmente, se encuentran
presentes las fracciones químicas como: el agua procedente de los fluidos biológicos
de la planta y del carácter higroscópico de los residuos, su proporción en los
materiales lignocelulósicos depende de las condiciones ambientales; las cenizas
procedentes de sales minerales tales como cloruros y sulfatos, así como también de
incrustaciones (sílice); los extractos correspondientes a restos de los fluidos
biológicos de las plantas y se denominan así por ser fácilmente extraíbles con
distintos disolventes y las proteínas (Caparrós, 2009).
Figura.2. Representación de la estructura lignocelulósica. (Mussato y col., 2010)
La celulosa, es un homopolímero lineal compuesto de monómeros de D-glucosa
unidos por enlaces glicosídicos (1-4), en los que dos moléculas de glucosas se
unen con la eliminación de una molécula de agua entre dos hidroxilos de los
carbonos 1 y 4, como se puede observar en la Figura 3.
Figura 3. Estructura del polímero de celulosa
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La configuración sólo es posible por la rotación de la unidad de glucosa
siguiente del eje C1-C4 del anillo de la piranosa, por eso la unidad de cadena de
celulosa que se repite es la celobiosa (disacárido). Los numerosos grupos hidroxilo
favorecen la formación de enlaces de hidrógeno intra e intermoleculares, formando
en cada unidad de glucosa dos enlaces intramoleculares y uno intermolecular. Los
enlaces de hidrógeno intermoleculares se establecen con otras cadenas que están
en el mismo plano, así como con cadenas en planos superiores e inferiores, de este
modo, las cadenas de celulosa se unen dando lugar a microfibrillas, y la unión de
estas entre sí a la fibra de la celulosa, cuyos agregados forman la pared celular
(Márques, 2010). En la Figura 4 se muestra una representación esquemática de la
estructura de la celulosa en la cual se distinguen los enlaces de hidrógeno que se
forman.
Figura 4. Estructura representativa de la celulosa (Adaptada de Márques, 2010)
Los enlaces de hidrógeno intermoleculares son los que permiten una estructura
altamente cristalina en la celulosa. En cambio, en las zonas amorfas el número de
enlaces por puentes de hidrógeno establecidos es menor y más desorganizado que
en las zonas cristalinas, siendo por lo tanto, la celulosa amorfa más fácil de disolver
y más reactiva, pues la accesibilidad a los grupos hidroxilos es mayor (Márques,
2010).
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Las regiones donde las microfibrillas presentan una estructura altamente
ordenada se llaman regiones cristalinas y las regiones con una estructura menos
ordenada se denominan amorfas, por ello la celulosa se considera un polímero
semicristalino. Las dos formas cristalinas que se encuentran en la celulosa nativa, es
decir, en las fibras naturales, son la celulosa I y la celulosa II, siendo la más
abundante la celulosa I, donde las cadenas de glucosa están orientadas
paralelamente. Por el contrario, en la celulosa nativa II, que es sintetizada
principalmente por algas y algunas bacterias, las cadenas de glucosa son
antiparalelas (Tomás, 2010).
La hemicelulosa es un heteropolisacárido de D-xilosa, D-glucosa, D-manosa, D-
galactosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico y ácido 4-O-metil-D-glucurónico, cuya
estructura se representa en la Figura 5. Es el segundo polisacárido más abundante
en el mundo vegetal después de la celulosa, representa aproximadamente el 25-
35% de la biomasa lignocelulósica. Dentro de las hemicelulosas pueden incluirse
otros componentes que presentan una estructura y composición química relacionada
con ella, aunque no formen parte de la pared celular, como las sustancias pécticas
(Waldford, 2008, Gómez F., 2008).
Figura 5. Representación esquemática de la estructura de la hemicelulosa
HOOC
HOOC
ácido p-cumáricoácido [4-metoxil]-D-glucurónico
ácido D-glucurónico
L-arabinof uranosa
ácido f erúlico
cadena central de D-xilopiranosa
O
HOH
HH
H
H
OOH
OH
O
HO
HH
H
H
OOH
H
O
HOH
HH
H
H
OOH
H
O
HOH
HH
H
H
OHO
H
O
OH
HH
H
H
H OHOH
O
HO
HH
H
H
OH
OH
O
OH
HH
H
H
H OHOCH3
OH
OH
H
H
OH
CH2
H
O
OH
OCH3
C
O
OH O
HO
HH
H
H
H
O
OH
O O
CH3
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Las hemicelulosas se clasifican de acuerdo al azúcar que esté presente en la
cadena principal del polímero en xilanos, mananos, galactanos, glucanos y
xiloglucanos.
Los xilanos son los heteropolímeros mayoritarios en las maderas de
frondosas (también llamadas maderas duras) y en residuos agrícolas,
apareciendo en porcentajes apreciables en las maderas resinosas (maderas
blandas). En las maderas de resinosas aparece como arabinoglucoxilano, que
corresponde a un esqueleto de xilosa con residuos laterales de ácido
metilglucurónico o arabinofuranosa (muy susceptible a los ácidos por su anillo
de cinco miembros), que estabilizan la molécula frente a las bases. En las
maderas de frondosas es frecuente la sustitución de xilanos con grupos 4-O-
acetil-metil-glucourónico. Es un polímero más largo (grado de polimerización
medio de aproximadamente 190 unidades) que también presenta sustitución
con grupos acetilo. Como promedio cada 7 monómeros de xilosa tienen un
sustituyente acetilo, unido por igual al carbono 2, al 3. Las ramificaciones son
de una o dos unidades, normalmente de ácido metilglucurónico o de grupos
acetilo, encontrándose trazas de arabinosa y otros monómeros. En los
materiales agrícolas encontramos diversidad de xilanos, normalmente más
parecidos a los de las frondosas pero con más arabinosa. Por ejemplo, en
materiales como el bambú, la cebada o canela, presentan heteropolímeros
similares a los de las maderas frondosas, con menor grado de polimerización
(90-130) y una distribución de azúcares diferente destacando la mayor
cantidad de arabinosa.
Los mananos son el heteropolímero principal en las maderas resinosas, y
aparece en pequeñas proporciones en maderas frondosas y en materiales
agrícolas. Los enlaces entre unidades de manosa son más fácilmente
hidrolizables por ácidos que entre unidades de glucosa. En las maderas
frondosas aparecen cadenas formadas por manosa y glucosa, sin
ramificaciones. En maderas resinosas y materiales agrícolas se observa el
mismo esqueleto pero con ramificaciones de galactosa, muy susceptibles a la
hidrólisis con ácidos, y ramificaciones de un grupo acetilo. Pueden
distinguirse dos tipos en función de la cantidad de galactosa (que recibe el
nombre de galactoglucomananos o glucomananos). A mayor número de
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unidades de galactosa aumenta la solubilidad en agua y disminuye la
solubilidad en álcalis.
Los galactanos están presentes en pequeñas proporciones en las maderas de
resinosas (0,5-3%) salvo en los alerces, en que pueden llegar al 25%.
Normalmente se encuentran en el espacio intercelular. Son polímeros muy
ramificados, con residuos laterales de arabinosa y/o ácidos urónicos o
cadenas de varias unidades que comienzan por galactosa. Los galactanos
son polisacáridos extracelulares muy solubles en agua, por lo que resulta
habitual introducirlos en la fracción de extractos. Aparecen también en
maderas de frondosas con ramnosa en las ramificaciones, pudiendo
encontrarse en menores proporciones xilosa, ácido glucurónico y ácido
galacturónico.
Los glucanos son polímeros compuestos mayoritariamente por unidades de
glucosa, sin incluir la celulosa. Hay un heteropolímero llamado laricina,
presente en maderas resinosas y algunos materiales agrícolas en porcentajes
del 2-4%, con grado de polimerización de 170-205, ramificado y con enlaces
, 1-3. La laricina presenta trazas de ácidos glucurónico y galacturónico y
fracciones (el 6-7% del total del polímero) pueden presentar enlaces , 1-4.
Los xiloglucanos están presentes en pequeñas proporciones en las maderas
resinosas. Es un heteropolímero de glucosa (con enlaces ,1-4) y xilosa (, 1-
6) que puede presentar trazas de arabinosa, galactosa, mucosa, ramnosa y
grupos acetilo. Probablemente desempeñen su función durante el crecimiento
de la planta.
La lignina es un polímero tridimensional aromático formado por la condensación
oxidativa de precursores fenólicos. Es muy amorfo y heterogéneo constituido a partir
de unidades de fenilpropano oxigenadas (p-coumaril, coniferil y alcohol sinapílico)
unidas por enlaces carbono-carbono o enlaces tipo éter (Figura 5). Es importante
destacar que es la única fibra no polisacárida que se conoce. Aumenta conforme la
planta madura y sus ligaduras químicas, en especial con la celulosa y la
hemicelulosa, reducen en forma notable la reactividad de esta última (Bieto y Talon,
1993; Thompson, 1993; Guarnizo y col., 2009; Caparrós, 2009; Ahuja, 2011).
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La lignina es extremadamente resistente al ataque químico y enzimático, rodea y
protege a las fibras de celulosa, proporcionado rigidez y soporte estructural a las
paredes de las células de las plantas. (Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000). Es un
componente característico de la pared celular de las plantas vasculares y su función
principal es actuar como material incrustante en las paredes de las fibras y como
cemento en la lámina media. De esta forma protege a la celulosa del ataque
microbiano y confiere estructura, resistencia e impermeabilidad a los materiales
lignificados. (Del Río y col., 2005).
Figura 6. Representación esquemática de la estructura química de la lignina (Adaptada de Waldford, 2008).
Los precursores de la lignina son los alcoholes p-hidroxicinamílicos (Figura 7),
que incluyen los alcoholes p-cumarílico (4-hidroxicinamílico); coniferílico (4-hidroxi-3-
metocinamílico) y sinapílico (4-hidroxi-3,5-dimetoxicinamílico) que difieren entre sí
por el número de grupos metoxilo sustituyentes. Estos precursores dan lugar a
unidades p-hidroxifenilo, unidades guayacilo y unidades siringilo respectivamente,
cuya proporción también varía en las maderas duras, maderas blandas y biomasa
herbácea (Tomás, 2010; Márques, 2010).
Lignina
Lignina
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Figura 7. Estructuras de los alcoholes precursores de la lignina
La polimerización de estos precursores durante la etapa de formación de la pared
celular se produce mediante la sucesión de una etapa enzimática y una etapa
química. En la primera, los precursores son oxidados por peroxidasas de la pared
dando radicales fenoxilo que, a continuación y durante la etapa química reaccionan
al azar entre ellos. En este proceso se originan una gran variedad de formas
resonantes que pueden reaccionar unas con otras, por ello la lignina no presenta
una única estructura (Domínguez, 2003).
La lignina confiere rigidez estructural al endurecer y sostener las fibras de
polisacáridos, además de participar en el transporte interno de agua, nutrientes y
metabolitos. Las uniones lignina-hemicelulosa se realizan mediante intermediarios
cinamílicos tales como el ácido ferúlico, el ácido diferúlico y el ácido p-cumárico, los
cuales se unen mediante diferentes intermediarios monoméricos a la cadena
principal del xilano ( Tomás, 2010).
Estos carbohidratos, celulosa y hemicelulosa, presentes en los materiales
lignocelulósicos a través de un proceso llamado hidrólisis se convierten en azúcares
simples, para su posterior fermentación y conversión en bioetanol (Taherzadeh y
col., 2007). Existen varios métodos para hidrolizar las lignocelulosas, sin embargo,
los más comúnmente aplicados son la hidrólisis ácida y la hidrólisis enzimática.
p-cumarílico coniferílico sinapílico
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Celulosa Hidrólisis Glucosa Fermentación Etanol (1)
Hemicelulosa Hidrólisis Pentosas y Hexosas Fermentación Etanol (2)
La hidrólisis es crucial para la conversión de los polisacáridos del bagazo,
principalmente celulosa, en productos de alto valor agregado. Sin embargo, el fuerte
arreglo cristalino de la celulosa y los efectos protectores de la lignina y de la
hemicelulosa dificultan el acceso de las enzimas y de los catalizadores ácidos a los
enlaces glucosídicos β 1-4, los cuales constituyen una serie de obstáculos para tal
proceso (De Moraes y col., 2011).
La hidrólisis enzimática requiere de la aplicación de pretratamientos a la
lignocelulosa, ya que el requisito para la hidrólisis es la accesibilidad a la superficie
celulósica por las enzimas celulolíticas. Estos pretratamientos pueden ser físicos,
que involucran la reducción de tamaño y la explosión con vapor; químicos en los
cuales se altera la estructura de la biomasa con solventes que promueven la
degradación de la celulosa, hemicelulosa y lignina; o biológicos que utilizan
microorganismos, como hongos para degradar la hemicelulosa y la lignina. (Ferrer y
col., 2002; Mateus, 2011). Hasta el presente la hidrólisis enzimática no ha tenido
éxito como para ser desarrollada a nivel industrial y se requerirá, previamente, un
esclarecimiento de manera integral, de los aspectos económicos del proceso, en los
que el costo de las enzimas tiene un rol determinante.
La hidrólisis ácida, en cambio, ha sido llevada a escala comercial desde 1909 en
EEUU y otros países de Europa y Asía, para fermentar la glucosa en alcohol,
utilizando madera como sustrato (Ferrer y col., 2002; Abreu y De la Rosa, 2011). Es
uno de los métodos de pretratamiento más investigado y documentado. Una gran
variedad de biomasa ha sido tratada con ácidos tales como sulfúrico, nítrico,
hidroclórico y fosfórico, siendo el sulfúrico el más común.
Hay dos tipos de hidrólisis ácida, una en la cual se usa ácidos concentrados y
otra en la que se usa ácido diluido. La hidrólisis concentrada toma lugar a bajas
temperaturas (por ejemplo 40ºC), usando una concentración de ácido de 30-72%.
Este método proporciona altos rendimientos de azúcares, cercanos al 100% del
rendimiento teórico de hexosas. Tiene la ventaja de trabajar a bajas temperaturas,
sin embargo, requiere de grandes volúmenes de ácido, los cuales son tóxicos y
23
corrosivos, requiriendo de reactores altamente resistentes a la corrosión (Leitäo,
2009).
La hidrólisis con ácido diluido es el más utilizado ya que tiene la ventaja de
consumir menos cantidades de ácido en comparación con la hidrólisis con ácido
concentrado Emplea bajas concentraciones de ácidos (0,3 - 5,0%) y altas
temperaturas (120 - 220ºC), con varios tiempos de tratamientos (de algunos minutos
a horas). Puede ser utilizado como un pretratamiento para incrementar la
accesibilidad de las enzimas a la celulosa, o como un método de sacarificación
directa (Leitäo, 2009).
Abreu y De la Rosa, (2011) evaluaron la producción de azucares fermentables
por hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar mediante ebullición a
reflujo, empleando ácido sulfúrico a varias concentraciones (0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 % v/v)
y tiempos de reacción (1,2, 3 y 4 h) con una relación líquido-sólido de 15:1, logrando
alcanzar un concentración máxima de azucares fermentables de 11,54 g/L a las 4
horas de reacción y 2% de ácido.
Pattra y col., (2008) realizaron hidrólisis del bagazo de la caña de azúcar en un
autoclave a 121 ºC 1.5 Kg/cm2, usando ácido sulfúrico a varias concentraciones
(0,25 - 7,0 % v/v) y tiempos de reacción (15 – 240 min.). Reportaron que las
condiciones óptimas fueron 0,5% de ácido y 60 min, con un rendimiento de azúcares
de 24,5 g/L. Indican que la concentración de glucosa, xilosa y arabinosa fueron de
11,00, 11,29 y 2,22 g/L, respectivamente, encontrando también, 2,48 g/L de ácido
acético y 0,12 g/L de furfural.
Piña y col., (2007) trabajaron con la hidrólisis ácida del bagacillo de la caña de
azúcar por medio de ebullición a reflujo variando la concentración de ácido sulfúrico
(1-4% v/v) y la relación líquido-sólido (30:1, 25:1, 20: y 15:1) con un volumen fijo de
ácido de 150 mL a un tiempo constante de 4h. Indican que obtuvieron la máxima
producción de azúcares reductores, 27,2 g/L, a una relación líquido-sólido de 15:1
para una concentración de ácido de 1%.
Aguilar y col., (2002) estudiaron la cinética del proceso de la hidrólisis ácida
diluida a diferentes temperaturas (100, 122 y 128 ºC) y concentraciones de ácido
sulfúrico (2, 4, y 6 %v/v) determinando la variación en el tiempo de la producción de
xilosa, glucosa, ácido acético y furfural. Encontraron que las condiciones óptimas de
24
fueron concentración de ácido de 2%, 122ºC y tiempo de reacción de 24 minutos,
indicando que aproximadamente el 90% de la hemicelulosa fue hidrolizada,
obteniendo un rendimiento de 21,6 g/L de xilosa, 3,0 g/L de glucosa, 0,5 g/L de
furfural y 3,65 g/L de ácido acético.
Lavarack y col., (2002) realizaron hidrólisis de bagazo y bagacillo de caña de
azúcar variando las condiciones de reacción, temperatura (80-200ºC), relación
líquido-sólido (1:5 – 1:20), concentración del ácido (0,25 – 8 %v/v), tipo de ácido
(H2SO4 o HCl) y tiempo de reacción (10 – 2000 min.). Encontraron que el HCl es
menos activo para la degradación de la xilosa en comparación con el H2SO4.
Reportan que el rendimiento máximo de xilosa estuvo por encima del 80% del valor
teórico.
Ferrer y col., (2002) estudiaron la producción de azúcares reductores a partir de
la hidrólisis ácida del bagacillo de caña de azúcar. Hidrolizaron el bagacillo tratado
por inmersión al agua a temperatura ambiente y el no tratado hidrolizado, mediante
ebullición a reflujo, utilizando diferentes concentraciones de ácido sulfúrico diluido
(2, 4, 6 y 8% v/v) a diferentes tiempos de reacción (4, 8 y 12h) con una relación
líquido-sólido de 30:1. Reportan que la mayor producción de de azucares (16,76 ±
1,7 g/L) la obtuvieron durante la hidrólisis del bagacillo no tratado a las 4h de
reacción utilizando ácido sulfúrico al 6% v/v.
La mayoría de los reportes de la literatura indican que la xilosa es el azúcar que
se presenta en mayor proporción como producto de la hidrólisis ácida diluida. Esto
muestra que la hidrólisis ácida diluida en una etapa ataca efectivamente a la
hemicelulosa, dejando libre el acceso a la celulosa en el material lignocelulósico. Sin
embargo, la mayor desventaja que quizás presenta la hidrólisis con ácidos diluidos
radica en la formación de compuestos que inhiben el crecimiento de
microorganismos durante la fermentación a etanol. A altas temperaturas ocurre la
descomposición de los monosacáridos en compuestos no deseables, disminuyendo
el rendimiento en azúcares y provocando la inhibición de los microorganismos que
intervienen en la formación de etanol durante el proceso de fermentación (Lenihan y
col., 2010). Estos compuestos son furfural, 5-hidroximetifurfural (HMF), ácidos
carboxílicos (fórmico, acético y levulínico), ácido urónico, ácido 4-hidroxibenzoico,
fenol, formaldehido, entre otros, (Chandel y col., 2006).
25
Para evitar la degradación de los azúcares a altas temperaturas, así como la
formación de inhibidores, la hidrólisis se puede llevar a cabo en dos o más etapas.
Una primera etapa para convertir la hemicelulosa en sus monómeros constituyentes,
a temperaturas relativamente bajas (100-160ºC), la cual sería equivalente a un
pretratamiento con ácido diluido. La segunda etapa en la cual se hidroliza el sólido
restante, transformando a la celulosa en glucosa, bajo condiciones más severas, a
temperaturas más elevadas, entre 200 - 240ºC (Domínguez y col., 2003; Sánchez y
col., 2008).
Estudios previos reportan que en la primera etapa se obtienen pentosas y
hexosas producto de la hidrólisis de la hemicelulosa, con un rendimiento entre 80 y
95% de los azucares disponibles, mientras que en la segunda etapa el rendimiento
es menor, entre 40 y 60% y corresponde a la hidrólisis de la celulosa. Estos bajos
rendimientos parecieran no ser un problema, si se consideran los bajos costos de los
materiales lignocelulósicos y la posibilidad de utilizar el material residual en la
producción de energía (Taherzadeh y col., 2007). Sin embargo, las condiciones de la
hidrólisis en cada etapa deben ser estudiadas dependiendo del material a utilizar, ya
que la complejidad estructural y composición depende del tipo de residuo o
desechos que se esté utilizando.
Cheng y col., (2008) llevaron a cabo hidrólisis de la hemicelulosa del bagazo de
caña de azúcar utilizando un proceso con reciclo de ácido sulfúrico, realizando la
detoxificación del hidrolizado por electrodiálisis. Encontraron que luego de dos
ciclos de ácido la concentración de azúcares reductores aumento de 28 a 63,5 g/l y
el consumo de ácido se redujo a 0,056 g por gramo de bagazo, recuperándose más
del 85% del ácido. Indican que luego de un tratamiento con electrodiálisis se retiró el
90% del acido acético producido.
Karimi y col., (2006) estudiaron la conversión de la paja de arroz a azúcares por
hidrólisis ácida diluida, a altas temperaturas y presiones en una y dos etapas. Las
hidrólisis fueron realizadas en un reactor de 10 L, donde fueron evaluados el tiempo
de reacción (3-10 min), la presión (10-35 bar) y la concentración del ácido (0-1%).
Los resultados muestran la habilidad de la primera etapa de despolimerizar el xilano
a xilosa con un máximo rendimiento de 80,8% a una presión de hidrólisis de 15 bar,
tiempo de retención de 10 minutos y una concentración de ácido del 0,5%. Sin
embargo, el rendimiento de la glucosa a partir del glucano fue relativamente bajo con
26
un máximo del 25,8%. Por otro lado, los rendimientos de todos los componentes
fueron prácticamente independientes del tamaño de partícula.
Los autores indicaron también que en la segunda etapa se obtuvieron los mejores
resultados al utilizar H2SO4 al 0,5%, presión de hidrólisis de 30 y 25 bar para un
tiempo de retención de 3 minutos, donde un total de 46,6% de glucano y 78,9% de
xilano fueron convertidos a glucosa y xilosa respectivamente. Además, los altos
rendimientos de glucosa y xilosa estuvieron acompañados por bajos contenidos de
furfural (8,9-9,1 g/Kg de paja de arroz) e hidroximetilfurfural (2,4-2,5 g/Kg de paja de
arroz), mientras que el contenido de ácido acético (22,9-26,9 g/Kg de paja de arroz)
se mantuvo casi constante a presiones tan altas como 10 bar y un tiempo total de
retención de 10 minutos.
Sánchez y col., (2004) estudiaron la hidrólisis ácida diluida para la fermentación
de la paja brava. Para el desarrollo de este estudio los investigadores precalentaron
la muestra seca, impregnaron con H2SO4 diluido (0,5-1,0 %p/p) y seguidamente la
hidrolizaron en un reactor a temperaturas entre 170-220 ºC, para la primera etapa,
con un tiempo de reacción entre 3 y 10 minutos. La segunda etapa la realizaron a
230 ºC con un tiempo de reacción de 10 minutos. Indicaron que condiciones
óptimas de la primera etapa fueron: concentración de H2SO4 al 0,5%, temperatura
de 190 ºC para hidrolizar la hemicelulosa con un tiempo de residencia de 5 minutos.
El rendimiento de xilosa reconvertida a estas condiciones fue cercano al 80% del
valor teórico. Para la segunda etapa obtuvieron un rendimiento de glucosa alrededor
del 30% del valor teórico.
Nguyen y col., (1999) trabajaron con astillas de maderas blandas para producir
etanol por hidrólisis ácida diluida en dos etapas. Impregnaron el material en H2SO4
diluido (0,4-0,7%) y lo hidrolizaron en un reactor a explosión de vapor durante un
tiempo de reacción de 3 a 5 min. La temperatura de la primera etapa estuvo
comprendida en un rango de 180-200ºC, mientras que para la segunda fue de 210 a
220ºC. Reportan que para la primera etapa, al utilizar concentración de H2SO4
0,7%, temperatura de 190ºC y tiempo de reacción de 3 min, obtuvieron las
concentraciones más altas de glucosa y manosa, siendo 27,8 y 33,9 g/L
respectivamente, con concentraciones de ácido acético de 7,0 g/L y furfural de 2,5
g/L. En la segunda etapa encontraron que las mejores condiciones fueron 0,4%, de
H2SO4, temperatura de 215ºC y tiempo de reacción de 3 min, a las cuales obtuvieron
una máxima concentración de glucosa de 74 g/L, con 5,8 g/L de hidroximetilfurfural.
27
La despolimerización de la hemicelulosa mediante procesos químicos produce
xilosa como principal fracción y arabinosa, manosa, galactosa y glucosa en
fracciones más pequeñas, además de compuestos que pueden actuar como
inhibidores potenciales de la fermentación (Chandel y col., 2007a; Chandel y col.,
2010a; Gíros y col., 2010). La naturaleza y concentración de estos compuestos
depende del tipo de biomasa, del pretratamiento utilizado, de las condiciones del
proceso y de la utilización o no de catalizadores ácidos (Sánchez y col., 2010),
Estos inhibidores tienen efectos tóxicos en los microorganismos de fermentación,
reduciendo el rendimiento y productividad en el proceso. Los niveles de toxicidad
dependen en parte de las variables de fermentación que incluye las condiciones
fisiológicas de la célula, la concentración del oxígeno disuelto y el pH de medio.
Además, los microorganismos pueden ser resistentes a los inhibidores o pueden
comenzar a adaptarse a su presencia. (Harmsen y col., 2010; Xiros y col., 2010).
En la Tabla 1 se muestran los tipos de compuestos inhibidores que son
generados durante la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica. El efecto inhibidor de
estos compuestos es mayor cuando ellos se encuentran juntos debido a su efecto
sinergístico (Mussato y col., 2004; Xiros y col, 2010).
Tabla 1. Tipos de inhibidores y sus estructuras químicas (Harmsen y col., 2010)
Compuesto Estructura Química
Furfural
Hidroximetilfurfural (HMF)
Acido fórmico
Acido acético
Acido levulínico
Los derivados del furano, furfural y 5-hidroximetilfurfural, son producto de la
degradación de la hemicelulosa y celulosa durante el pretratamiento a altas
temperaturas y tiempos de residencia prolongados (Figura 8). El furfural es formado
por la degradación de las pentosas xilosa y arabinosa, mientras que el 5–
28
hidroximetilfurfural (HMF) es obtenido por la degradación de las hexosas glucosa,
manosa y galactosa (Mateus, L., 2010).
Figura 8. Degradación de la celulosa y hemicelulosa (Tomado de Domínguez, 2003)
La toxicidad relativa de varios inhibidores para la fermentación del etanol se
puede resumir como compuestos fenólicos > furfural > HMF > ácido acético >
extractivos. El efecto tóxico de estos furanos produce reducción de la tasa específica
de crecimiento del microorganismo y disminución de la producción de biomasa,
debido a que causa daño en la membrana plasmática celular e inhiben la acción
enzimática y por ende ocurre disminución de la productividad volumétrica y
específica del etanol (Sánchez y col., 2010).
Se ha reportado que el furfural es un fuerte inhibidor de la Saccharomyces
cerevisiae. Una concentración de furfural de 1g/L puede disminuir significativamente
la tasa de crecimiento (liberación) de CO2 y el número de células totales en la fase
de fermentación. El HMF afecta la fermentación de forma similar que el furfural.
Arabinosa
Furfural
Glucosa Galactosa Manosa Xilosa
Äcido fórmico Ácido levulínico
Ácido acético
HMF
HEMICELULOSA CELULOSA
29
Delgenes y col. (1996) demostraron que concentraciones de furfural de 0,5; 1,0 y
2,0 g/l reducen el crecimiento de P. stipitis en 25%, 47% y 99% respectivamente.
Roberto y col., (1991b) observaron que a concentraciones de furfural menores de
0,5g/L se obtiene un efecto positivo en el crecimiento celular, mientras que a
concentraciones por encima de 2 g/L inhiben el crecimiento celular casi
completamente. Nigam (2001) encontró que una concentración de furfural de 0,25
g/L en un medio de fermentación, no reduce el rendimiento y productividad del
etanol, pero a concentraciones tan altas como 1,5 g/L interfiere en la respiración y
crecimiento del microorganismo, disminuyendo el rendimiento y productividad de
etanol en 90,4% y 85,1% respectivamente.
De acuerdo a Delgenes y col. (1996), el crecimiento de P. stipitis disminuyó en un
43%, 70% y 100% cuando la concentración del HMF en el medio fue de 0,5; 0,75 y
1,5 g/L respectivamente. Martínez y col. (2000) observaron que la producción de
etanol por E. coli a partir del hidrolizado hemicelulósico del bagazo de caña de
azúcar fue afectado por furanos, solo cuando su concentración fue mayor a 0,9 g/L.
Estudios reportan que una concentración de 4g/L de HMF disminuye en un 32%
la tasa de producción de CO2, la producción de etanol disminuye en un 40% y la tasa
específica de crecimiento disminuye en un 70% (Villalobos, 2010).
Palmqvist y col. (2000b) reportó que el HMF tiene un efecto similar al furfural, sin
embargo, es considerado menos tóxico, y su concentración en el hidrolizado
hemicelulósico es más bajo debido a tres factores: la baja cantidad de hexosas en
la hemicelulosa, las condiciones empleadas en el proceso hidrolítico, el cual no
degrada a las hexosas en grandes cantidades y a la alta reactividad de este
componente.
Durante la hidrólisis ácida, una parte de la lignina (Figura 9) también se degrada
originando una gran variedad de compuestos (aromáticos, poliaromáticos, fenólicos
y aldehídos). Se trata de un grupo de compuestos muy heterogéneo que se puede
encontrar en forma de monómeros, dímeros y polímeros con una gran variedad de
sustituyentes. Los fenoles originados en la hidrólisis varían según el tipo de biomasa,
ya que existe una gran diferenciación de la lignina atendiendo al grupo taxonómico al
que pertenezca la especie vegetal (Domínguez, 2003, Xiros y col., 2010).
30
Figura 9. Productos de la degradación de la lignina (Tomado de Domínguez, 2003).
Los compuestos fenólicos tienen un considerable efecto inhibitorio y son más
tóxicos que el furfural e HMF, incluso a bajas concentraciones. Se ha encontrado
que los compuestos fenólicos de bajo peso molecular son más tóxicos para la
Saccharomyces cerevisiae que los fenólicos de alto peso molecular. La posición del
sustituyente, para, orto, meta, es también significante en la toxicidad de la molécula
(Harmsen y col., 2010; Xiros y col., 2010).
Palmqvist y col., (2000b) reportaron que los compuestos fenólicos tienen un
considerable efecto inhibidor en la fermentación de los hidrolizados lignocelulósicos,
principalmente los de bajo peso molecular. Ellos causan una división y pérdida de la
integridad de la membrana celular, afectando su habilidad para servir como barreras
selectivas y matrices de las enzimas.
El ácido acético, fórmico y levulínico son los principales ácidos débiles presentes
en el hidrolizado lignocelulósico. El ácido acético es derivado a partir de los grupos
acetil en la hemicelulosa, mientras que el ácido fórmico y levulínico son productos de
la degradación del HMF. El ácido fórmico puede adicionalmente formarse a partir del
4-hidroxibenzaldehído
LIGNINA
Vainillina
Guayacol
Ácido vainillínico Ácido 4-hidroxibenzoíco
Siringaldheído
Catecol
Ácido siríngico
31
furfural bajo condiciones ácidas a elevadas temperaturas (Almeida y col., 2007;
Hamser y col., 2010).
Algunos investigadores indican que la presencia de ácido acético produce efectos
negativos en el crecimiento de los microorganismos utilizados en las fermentaciones
para la producción de etanol. Pattra y col., (2008) reportaron que el ácido acético
puede ser considerado como un inhibidor del crecimiento microbiano cuando su
concentración está entre 4 y 10 g/L, ya que puede difundirse a través de la
membrana celular, disminuyendo el pH intracelular y causando efectos adversos en
el metabolismo de los microorganimos.
Ferrari y col., (1992) encontraron que concentraciones de ácido acético de 10,5
g/L afectan el crecimeinto de Pichia stipitis. Sin embargo para otros investigadores el
efecto del ácido acetico sobre el crecimiento de los microrganismos no esta claro.
Palmqvist y col., (1999) encontraron que concentraciones entre 9 y 10 g/L de ácido
acético mejoran el crecimiento y productividad de etanol de Saccharomyces
cerevisiae.
32
CAPITULO II
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
2.1 Sustrato
Se utilizó bagazo de la caña de azúcar proveniente del Central Azucarero La
Pastora, ubicado en el Municipio Torres, Parroquia Cecilio Zubillaga, Carora, estado
Lara. El bagazo se secó en una estufa a una temperatura que oscilaba entre 80-90
ºC para disminuir la humedad hasta aproximadamente el 10%. El bagazo se molió
utilizando un molino de cuchillas (Thomas Wiley Laboratory Mill, Model 4). Luego se
pasó por un tamiz de 20 mesh, para obtener un tamaño de partícula ≤ 1mm y se
almacenó en bolsas plásticas de cierre hermético a temperatura ambiente hasta el
momento de su uso.
2.2 Caracterización del sustrato
Contenido de humedad
El contenido de humedad se determinó por el método 1156-79 descrito en la
norma Venezolana COVENIN (1983) para bagazo de caña de azúcar. Se pesó un
gramo de muestra y se coloraron en crisoles de porcelana previamente pesados. Se
introducen en la estufa a 103±2 °C por cinco horas. Luego, se colocaron los crisoles
con la muestra en el desecador por 15 minutos y se pesan hasta obtener un peso
constante.
Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina
El contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina presente en el bagazo de la caña
de azúcar se determinó a través de la metodología desarrollada por Goering y Van
Soest (1970), que se basa en las determinaciones de fibra neutro detergente (FND),
fibra ácido detergente (FAD) y lignina ácida, de acuerdo con las ecuaciones 3, 4 y 5.
Celulosa (%) = FAD (%) - LAD (%) (3)
Hemicelulosa (%) = FND (%) – FAD (%) (4)
Lignina (%) = LAD - cenizas (5)
33
Contenido de proteína cruda
El contenido de proteína cruda se determinó por el método de Kjeldahl descrito
en la norma 1195-80 (COVENIN, 1980), cuyo principio es transformar el nitrógeno
contenido en la muestra en sulfato de amonio, por medio de la digestión con ácido
sulfúrico en caliente. Los datos obtenidos se introdujeron en la fórmula para calcular
el contenido de nitrógeno y su conversión a proteína cruda que se muestra en las
ecuaciones 6 y 7:
%MS*muestraladegramos
100*1,4*N*V%N
HClHClgastado (6)
6.25*%N%PC (7)
Contenido de azúcares residuales
Para determinar el contenido de azúcares residuales, se mezcló el bagazo no
tratado (BNT) con agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, manteniendo
una relación L/S de 15:1. Luego, se coloco en un incubador rotatorio (Thermo
Electron Corporation) a 25°C y 150 rpm durante una hora. Los azúcares presentes
se midieron utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) propuesto por
Miller (1959). Los análisis se realizaron por triplicado.
2.3 Hidrólisis ácida diluida
Primera etapa
En la primera etapa, la hidrólisis ácida se realizó con ácido sulfúrico diluido al 1%
v/v en una relación líquido–sólido de 15:1, empleando diferentes temperaturas (100,
120, 140 y 160 ºC) por un tiempo de 3 min. Se utilizó un reactor autoclave modelo
4593 (Pressure Reaction Apparatus, Parr Instruments) de 100 mL de capacidad, el
cual se muestra en la Figura 10. El reactor está construido de acero inoxidable
(T316) y está provisto de un horno y un agitador eléctrico. La temperatura y
velocidad de agitación durante la hidrólisis fueron controladas y monitoreadas con
un controlador modular.
La fase líquida se separó de la fase sólida por filtración al vacío. La fracción
líquida o hidrolizado se guardó bajo refrigeración a ± 4 ºC para su posterior análisis.
La fracción de sólido fue lavada con agua destilada de 5 a 10 veces el líquido
34
extraído (Sánchez y col., 2004). El bagazo resultante se sometió a calentamiento por
2h a 120ºC para ser utilizado en la segunda etapa.
Figura 10. Reactor Autoclave Modelo 4593 (Pressure Reaction Apparatus, Parr
Instruments).
Segunda etapa
Una vez obtenidos los resultados de la primera etapa, se seleccionó la mejor
temperatura de la primera etapa, en la cual se obtuvo la mayor concentración de
azúcares reductores. El bagazo obtenido de la primera etapa a las condiciones
seleccionadas se sometió a la segunda etapa de la hidrólisis utilizando dos
temperaturas, 160 y 180 ºC durante un tiempo de 3 min. La cantidad de bagazo
recuperado se mezcló con la solución de H2SO4 al 1% v/v, manteniendo la relación
líquido-sólido de 15:1 y se empleó el mismo procedimiento utilizado en la primera
etapa para la separación de las fracciones liquida y sólida. El hidrolizado obtenido se
sometió a neutralización, ajustando el pH entre 4,5 y 5,5 con una solución 6N de
NaOH.
2.4 Análisis de las muestras
Las muestras del hidrolizado proveniente de la primera y segunda etapa de la
hidrólisis del bagazo de caña de azúcar se analizaron por triplicado, determinando el
contenido de azúcares reductores, furfural, hidroximetilfurfural y ácido acético,
utilizando la siguiente metodología:
35
Determinación de azúcares reductores
El contenido de azúcares reductores, presente en el hidrolizado se determinó
empleando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS), propuesto por Miller
(1959), utilizando glucosa como estándar. La absorbancia se midió en un
espectrofotómetro de rayos UV modelo (Genesys 10UV) a una longitud de onda de
550 nm.
Determinación de furfural y 5-hidroximetilfurfural (HMF)
El contenido de furfural e HMF generados durante la hidrólisis se determinó por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizando un cromatógrafo Agilent,
modelo Serie 1100 (Agilent Tecnologies, vacum degasser G1379A y Quatpump
G1311A.). Para el desarrollo del método se dispuso de una columna C18 (4,6 mm ID
x 150 mm ,5m), la cual se trabajó a temperatura ambiente, con una velocidad de
flujo de 1,0 mL/min y un volumen de inyección de 20μL.
La inyección de la muestra en el equipo, se realizó en forma manual y la
detección con un detector UV visible (G1314A) a una longitud de onda de 280 nm.
Se utilizaron patrones grado HPLC para furfural (0,05 – 1,5 mg/mL) e HMF (0,05 –
1,0 mg/mL) y como fase móvil acetonitrilo:agua en proporción 30:70.
Previo a la inyección, tanto los patrones como las muestras de hidrolizado
neutralizadas, se filtraron dos veces utilizando filtros de membrana de celulosa de
0,2 µm (Whatman) y luego utilizando una jeringa de filtrado de acetato de celulosa
de 0,20 µm estéril (Advantec, Dismic – 25cs).
Determinación de compuestos fenólicos
El contenido total de compuestos fenólicos en el hidrolizado, se determinó por el
método colorimétrico de Singleton y Rossi (1965) con algunas modificaciones
descritas por Kim y col., (2003) utilizando ácido gálico seco para la curva patrón. La
absorbancia se midió en un espectrofotómetro de UV visible (Genesys 10UV,
Thermo Scientific, Electron Corp.) a una longitud de onda de 750 nm.
Determinación de ácido acético
El contenido de ácido acético presente en el hidrolizado se cuantificó por
Cromatografía de Gases, utilizando un cromatógrafo Agilent 6890N (Agilent
Technologies) provisto de autoinyector, portal de muestras automático y detector de
ionización a la llama (FID). Se utilizó helio como gas de arrastre y una columna
36
Capilar HP-5, de 30 cm longitud, diámetro interno de 0,320 mm y 0,25 µm nominal.
El análisis se realizó con temperatura del inyector 230°C, flujo de 0,8 mL/min,
Presión de 5 psi, Split de 30:1, temperatura del horno 70°C con rampa de 10°C/min
hasta 140°C, temperatura del detector FID 250°C, fase estacionaria 5% de fenil metil
xiloxano. La curva patrón del ácido acético se preparó de 0 a 72 ppm.
2.5 Análisis de los Datos
Determinación de la Conversión y Rendimiento de la hidrólisis
La conversión se calculó como los mg de azúcares reductores producidos por
gramo de bagazo en base seca y el rendimiento en la producción de azúcares se
calculó como el porcentaje de conversión de la fracción de carbohidratos (celulosa +
hemicelulosa) presente en el bagazo de caña de azúcar hasta azúcares reductores
obtenido por el cociente entre los de azúcares producidos por gramo de sustrato
seco (mg glucosa/g MS) y la producción de azucares teórica, es decir, los azúcares
provenientes de la hidrólisis total en medio ácido (NREL,1994). La cantidad de
azúcares teóricos se determinó multiplicando la cantidad de celulosa presente en el
bagazo de caña de azúcar (no tratado) multiplicados por 1,1 que es el factor que se
introduce por la incorporación de una molécula de agua por cada enlace hidrolizado,
tal como se muestra en las ecuaciones 7 y 8.
% Azúcar Teórico= % celulosa x 1,1 (7)
(8)
Estimaciones estadísticas
Se realizaron análisis de varianza (ANOVA) y pruebas de media HSD de Tukey
para todos los resultados, utilizando el paquete estadístico SPSS statistics 17.0.
37
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Composición del bagazo de caña de azúcar
En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos de la caracterización del
bagazo de caña de azúcar sin hidrolizar (BSH) utilizado en todos las experiencias.
Cada valor corresponde a los promedios de dos réplicas. Los valores encontrados
son similares a los reportados por Ferrer y col., 2002 y Abreu y De la Rosa (2011).
Sin embargo el contenido de celulosa se encuentra por encima del rango de 30-50%
reportado en otros trabajos (Holtzapple y col., 1991, Martin y col., 2002, Pernalete y
col., 2008, Urribarri, 2011) mientras que la hemicelulosa se encuentra muy por
debajo (20-30%) y la lignina es ligeramente inferior (15-20%).
El alto contenido de carbohidratos permite afirmar, que el bagazo de caña de
azúcar es un residuo agroindustrial que posee un gran potencial para ser
transformado por las distintas vías de sacarificación y convertido en producto de
mayor valor agregado.
Tabla 2. Caracterización del bagazo de caña de azúcar sin hidrolizar.
Componente
BSH
Materia Seca (%) 94,81 ± 0,32
Solubles (%) 17,28 ± 0,04
Celulosa (%) 62,25 ± 0,89
Hemicelulosa (%) 7,99 ± 1,01
Lignina (%) 12,49 ± 0,08
Azúcares residuales (g/L) 0,34 ± 0,02
Proteínas (%) 1,75 ± 0,09 Nota: BSH: bagazo sin hidrolizar.
38
3.2 Primera etapa de hidrólisis
Producción de azúcares reductores
En la Figura 11 se muestra la producción de azúcares reductores, expresados
como glucosa, durante la primera etapa de las hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al
1% v/v, relación líquido–sólido de 15:1, tiempo de reacción de 3 minutos y
diferentes temperaturas. Se observa que la producción de azúcares reductores es
mayor cuando la hidrólisis se realiza a temperaturas mayores a 100°C, alcanzando
un máximo a 140°C. Sin embargo, al aumentar de 140 a 160°C el comportamiento
cambia, disminuyendo la cantidad de azúcares producidos. La máxima producción
de azúcares se alcanzó a 140°C y fue de 14,60 ± 0,21 g/L, valor este 9,7 veces al
mayor al obtenido a 100°C y 1,3 veces mayor al encontrado para 120 y 160°C.
Figura 11. Producción de azúcares reductores durante la primera etapa de las hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas (H1E-xxx : hidrólisis primera etapa a 100, 120,140 y 160°C)
39
En la Tabla 3 se presenta la conversión y el rendimiento en la producción de
azúcares durante la primera etapa de la hidrólisis del bagazo de caña de azúcar con
ácido sulfúrico diluido al 1% v/v, empleando una relación líquido–sólido de 15:1 y
diferentes temperaturas. La conversión se calculó como los mg de azúcares
reductores producidos por gramo de bagazo en base seca y el rendimiento en la
producción de azúcares se calculó como el porcentaje de conversión de la fracción
de carbohidratos (celulosa + hemicelulosa) presente en el bagazo de caña de azúcar
hasta azúcares reductores obtenido por el cociente entre los de azúcares producidos
por gramo de sustrato seco (mg glucosa/g MS) y la producción de azúcares teórica,
es decir los azúcares provenientes de la hidrólisis total en medio ácido.
Tabla 3. Rendimiento de los azúcares reductores producidos en la primera etapa de la hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
Hidrólisis Concentración de azucares reductores
(g glucosa/L)
Conversión
(g glucosa/Kg bagazo)
Rendimiento
(%)
H1E-100 1,51 ± 0,09a 18,60 2,41
H1E-120 10,70 ± 0,78b 162,97 21,09
H1E-140 14,60 ± 0,21c 224,23 29,02
H1E-160 11,05 ± 0,51b 168,46 21,80
Nota: Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas (p0,05). % Conversión; (g glucosa/Kg de bagazo seco), %Rendimiento: (mg azucares experimentales/mg azucares teóricos)*100. MS: materia seca H1E-xxx : hidrólisis primera etapa, donde xxx corresponde a 100, 120,140 y 160°C.
Tal como se esperaba a temperaturas bajas la concentración de azúcares
fermentables es baja, obteniéndose un valor máximo de 1,51 g/L que representa una
conversión del 18,60 g glucosa/Kg bagazo seco y un rendimiento del 2,41% en
relación a la cantidad de azúcar teórico. En la hidrólisis a 120°C aumenta la
concentración de azúcares, obteniéndose una conversión de 162,97 g glucosa/Kg
bagazo seco y un rendimiento del 21,09%. Estos valores representan un incremento
de más del 80% producto del incremento de la temperatura de la reacción de
hidrólisis de 100 a 120°C.
40
La máxima conversión, 224,23 g glucosa/Kg bagazo seco y el máximo
rendimiento, 29,02%, se obtuvieron en la hidrólisis a 140°C. Estos valores indican un
incremento en la producción de azúcares de más del 90% en comparación con la
hidrólisis realizada 100°C. Sin embargo, al aumentar la temperatura de la hidrólisis a
160°C la cantidad de azúcares producida disminuye en comparación con la obtenida
en la hidrólisis a 140°C, lo cual sugiere que pudieran estar ocurriendo algunas
reacciones de descomposición de los azúcares, por ejemplo hacia la formación de
furfural.
Este comportamiento es similar al reportado por Saucedo-Luna y col., (2010)
durante la primera etapa de la hidrólisis de bagazo de agave con ácido sulfúrico
diluido al 1%, quienes encontraron que a bajas temperaturas la concentración de
azúcares era muy baja, de 2,5 g/L a 100°C y diez minutos de reacción. Indican que
al aumentar la temperatura de la hidrólisis se produjo un aumento en la producción
de azúcares, alcanzando 15 g/L a 200°C y el mismo tiempo de reacción. Reportan
además que a 200°C la concentración de azúcares disminuye con el tiempo de
reacción, sugiriendo la existencia de reacciones de descomposición, con posible
formación de furfural.
Efecto de la hidrólisis ácida sobre la fracción de carbohidratos
En la Tabla 4 se muestra el contenido de celulosa y hemicelulosa del bagazo de
caña de azúcar que se obtiene como residuo sólido de la primera etapa de
hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1% v/v, empleando una relación líquido–sólido
de 15:1 a diferentes temperaturas. Los valores del bagazo de caña de azúcar no
hidrolizado se presentan para efectos de comparación.
Estos resultados indican que durante la primera etapa de hidrólisis ocurre una
solubilización de la fracción de carbohidratos presente en el bagazo (celulosa +
hemicelulosa), lo cual concuerda con la presencia de azúcares en el medio
hidrolizado.
El contenido de celulosa permanece prácticamente constante durante las
hidrólisis a 100 y 120 °C, no encontrándose diferencias significativas (p0,05) entre
los valores obtenidos y el contenido del bagazo no hidrolizado. La hidrólisis a 140°C
provocó una disminución del contenido de celulosa de 6,5%, mientras que a 160°C
fue de 8,2%.
41
El contenido de hemicelulosa disminuye al aumentar la temperatura. A bajas
temperaturas la solubilización es menor, encontrándose que a 100°C se solubilizó el
35% de la hemicelulosa presente en el bagazo no hidrolizado, lo cual junto con la no
solubilización de la celulosa explica la poca producción de azúcares encontrada
durante la hidrólisis a esta temperatura.
Tabla 4. Contenido de celulosa y hemicelulosa en el bagazo de caña de azúcar sometido a la primera etapa de hidrólisis.
SUSTRATO
Celulosa (%)
Hemicelulosa (%)
BNH 62,25 ± 0,89 a 7,99 ± 1,01a
BH1E-100 60,15 ± 0,50a 5,20 ± 1,00b
BH1E-120 60,92 ± 1,81a 4,58 ± 0,12c
BH1E-140 58,21 ± 0,01b 4,66 ± 0,39c
BH1E-160 57,12 ± 1,00c 2,83 ± 0,44c
Nota: Los valores están expresados en base seca. BNH: Bagazo no hidrolizado BH1E-xxx: bagazo resultante de la primera etapa de hidrólisis, donde xxx corresponde a 100, 120,140 y
160°C. Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas (p0,05).
Al aumentar la temperatura de la hidrólisis se observa que aumenta la
solubilización de la hemicelulosa, alcanzando un 42%, no existiendo diferencias
significativas en los valores obtenidos para la hidrólisis a 120 y 140°C. Esto coincide
con el aumento en la concentración de azúcares en el hidrolizado. A 140°C se
obtuvieron los valores máximos de conversión y rendimiento en la producción de
azúcares reductores, coincidiendo con el incremento en la solubilización de la
celulosa y de la hemicelulosa.
La mayor solubilización tanto de celulosa (8,2%) como de hemicelulosa (64,56%)
se encontró en la hidrólisis a 160°C, sin embargo la producción de azúcares fue
menor que a 140°C (p0,05) y similar a la encontrada a 120°C (p0.05). Esto indica
que existe una pérdida de azúcares, la cual puede estar asociada con reacciones de
degradación con la consecuente formación de furfural.
42
Efecto de la temperatura de hidrólisis sobre la producción de compuestos tóxicos
En las Figuras 12, 13 y 14 se muestra el contenido de la concentración de
furfural, hidroximetilfurfural (HMF), ácido acético y compuestos fenólicos encontrado
en el líquido hidrolizado, producto de las hidrólisis del bagazo de caña de azúcar con
ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1, tiempo de reacción de 3
minutos y diferentes temperaturas.
En la Figura 12 se puede observar que a todas las temperaturas (100, 120, 140 y
160°C) se encontró la presencia de furfural, mientras que el HMF solo se detectó en
las muestras de las hidrólisis a 140 y 160°C.
Figura 12. Concentración de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C).
43
El furfural resulta de la degradación de las pentosas, por ejemplo xilosa, mientras
que el HMF es formado a partir de las hexosas, como por ejemplo glucosa (Modig,
2002).
La concentración de furfural en el hidrolizado muestra una fuerte relación con la
temperatura de la hidrólisis. A medida que la temperatura de la hidrólisis es más alta,
la concentración de furfural es mayor, coincidiendo con la aparición de las pentosas
en el hidrolizado producto de la solubilización de la hemicelulosa. La máxima
concentración de furfural, 1,62 g/L se encontró en la hidrólisis realizada a 160°C.
El HMF no se detectó a las temperaturas más bajas (100 y 120 °C) lo cual es
lógico ya a estas temperaturas no se observa que se hidroliza la celulosa (Tabla 4) y
por lo tanto la concentración de glucosa en el medio debe ser muy baja. El HMF se
detecta a 140°C con una baja concentración, 0,047 ±0,008 g/L, indicando que a esta
temperatura comienza a descomponerse la glucosa presente en el medio. La
máxima concentración de HMF, 0,276 ± 0,002 g/L, se encontró para la hidrólisis
realizada a 160°C.
Los valores encontrados tanto para furfural como HMF se encuentran en los
rangos reportados por algunos autores. Según Almeida y col., (2007) los niveles de
los compuestos furanos varían de acuerdo al tipo de de sustrato y el pretratamiento
empleado. Por ejemplo, la concentración de HMF en el hidrolizado puede variar de
2,0 g/L a 5,9 g/L, dependiendo de si la hidrólisis ácida diluida se trabaja con una o
dos etapas, mientras que el furfural se mantiene en niveles más bajos entre 0,5 y 1,0
g/L. En cambio, al tratar el bagazo de caña de azúcar con explosión a vapor, se
obtienen niveles de concentración de furfural e HMF de 0,6 y 1,9 g/L
respectivamente.
La presencia de furfural e HMF en el hidrolizado es una fuente tóxica para los
microorganismos, principalmente para las levaduras, utilizados en los procesos de
fermentación destinados a la producción de etanol. Sin embargo, el nivel de
toxicidad de estos compuestos varía no solo con el sustrato y tipo de tratamiento
empleado, sino también del tipo de microorganismo utilizado y de las condiciones
empleadas durante la fermentación.
En la Figura 13 se observa que el ácido acético se produjo en todas las hidrólisis
a las diferentes temperaturas ensayadas, aumentando a medida que la temperatura
de la hidrólisis fue mayor. El ácido acético se forma principalmente a partir de los
44
azúcares acetilados de la hemicelulosa durante las reacciones de hidrólisis
catalizada por ácidos a condiciones moderadas, su producción no depende
significativamente de la severidad del proceso y puede producirse hasta en
concentraciones mayores a 10 g/L (Taherzadeh y Karimi, 2007, Xiros y col., 2010).
La menor concentración (0,019 g/L) se encontró en la hidrólisis a 100°C, mientras
que la mayor concentración (0,079 g/L) se obtuvo a 160°C, lo cual se corresponde
con la menor y la mayor solubilización de hemicelulosa, respectivamente. A 120 y
140 °C las concentraciones de ácido acético fueron similares, 0,061 y 0,058 g/L,
respectivamente, no encontrándose diferencias significativas entre estos valores
(p0,05).
Figura 13. Concentración de ácido acético en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)
Las concentraciones de ácido acético obtenidas durante la primera etapa de
hidrólisis (0,019 - 0,079 g/L) se encuentran muy por debajo de los rangos de
concentración reportados (4 - 10 g/L) que causan efectos negativos sobre el
crecimiento de los microorganismos (Cardona y col., 2010).
45
En la Figura 14 se observa que durante la primera etapa de la hidrólisis del
bagazo de caña de azúcar, con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido
de 15:1, tiempo de reacción de 3 minutos, a diferentes temperaturas se formaron
compuestos fenólicos.
Figura 14. Concentración de compuestos fenólicos en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)
El contenido de compuestos fenólicos aumenta con el incremento en la
temperatura de la hidrólisis. La mayor concentración, 1,578 g/L, se encontró en la
hidrólisis realizada a 160°C. Este valor es 2, 4 y 10 veces mayor a los encontrados
en las hidrólisis a 140, 120 y 100 °C, respectivamente. Este valor es similar al
reportado por Chandel y col., (2007) para la hidrólisis de bagazo de caña de azúcar
en una sola etapa, con ácido sulfúrico diluido al 1,5% durante 30 minutos (1,58 g/L),
y menor al valor reportado (2,75 g/L) cuando utilizaron la concentración de ácido de
2,5% y el mismo tiempo de reacción.
46
Algunos autores atribuyen la formación de estos compuestos a la degradación de
la lignina durante la hidrólisis (Taherzadeh y Karimi, 2007), sin embargo los análisis
realizados al bagazo de caña de azúcar no permiten observar que este haya sido el
caso.
En la Tabla 5 se observa que el contenido de lignina aumenta con el incremento
de la temperatura de la hidrólisis, pero este aumento no es real. El método utilizado
(Goering y Van Soest, 1970), descrito en el Apéndice C, es un método secuencial y
al ocurrir la solubilización de parte de la hemicelulosa y de la celulosa, se produce un
aparente aumento de la lignina.
Tabla 5. Contenido de lignina en el bagazo de caña de azúcar sometido a la primera etapa de hidrólisis
SUSTRATO BSH BH1E-100 BH1E-120 BH1E-140 BH1E-160
Lignina (%)
12,49 ± 0,08 20,11± 1,21a 19,33 ± 0,45a 21,77 ± 0,16a 24,50 ± 0,54b
Los valores están expresados en base seca. BNH: Bagazo no hidrolizado BH1E-xxx : bagazo resultante de la primera etapa de hidrólisis, donde xxx corresponde a 100, 120,140 y 160°C. Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas.
En la Tabla 6 se presenta un resumen de los resultados obtenidos del análisis de
las muestras del hidrolizado obtenido durante la primera etapa de las hidrólisis con
ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1, tiempo de reacción de 3
minutos y temperaturas de 100, 120, 140 y 160°C. El análisis de varianza (ANOVA)
indicó que la temperatura ejerce un efecto significativo (Pr<0,01) sobre todas las
variables (Apéndice H).
Tabla 6. Valores promedio de los resultados obtenidos en la primera etapa de hidrólisis.
Temperatura (°C)
AR (g/L)
Furfural
(g/L)
HMF
(g/L)
Ácido acético (g/L)
Compuestos fenólicos
(g/L)
100 1,51±0,09a 0,224±0,002a ND 0,019±0,001a 0,155±0,012a
120 10,70±0,78b 0,487±0,060b ND 0,061±0,003b 0,430±0,019b
140 14,60±0,21c 1,168±0,089c 0,047±0,008b 0,058±0,001b 0,717±0,047c
160 11,05±0,51b 1,656±0,016d 0,276±0,002c 0,079±0,003d 1,578±0,041d
Media con igual letra no difieren significativamente (p ≤ 0,05). ND: no detectable
47
En base a estos resultados, mayor rendimiento en la producción de azúcares
reductores y la menor formación de subproductos que puedan resultar tóxicos para
los microorganismos, se tomó la temperatura de 140°C como la mejor condición de
hidrólisis para la primera etapa y proceder a los ensayos de la segunda etapa a 160
y 180°C.
3.3 Segunda etapa de hidrólisis
En la Tabla 7 se muestran los resultados de la producción de azúcares
reductores luego de la segunda etapa de hidrólisis realizada al bagazo de caña de
azúcar previamente sometido a una primera etapa de hidrólisis a 140°C. En ambas
etapas la hidrólisis se realizó con ácido sulfúrico diluido al 1% y relación líquido
sólido de 15:1, durante 3 minutos.
Tabla 7. Producción de azúcares reductores durante la segunda etapa de la hidrólisis (H2E) del bagazo de caña de azúcar con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
Hidrólisis
Azúcares reductores
(g glucosa/L)
Conversión
(g glucosa/Kg bagazo)
Rendimiento
(%)
H2E-160 4,89 ± 0,13a 74,40 10,76
H2E-180 5,38 ± 0,07b 81,84 11,83
Nota: Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas (p0.05). % Conversión; (mg glucosa/g MS)*100, %Rendimiento: (mg azucares experimentales/mg azucares teóricos)*100. MS: materia seca. H2E-xxx : hidrólisis primera etapa, donde xxx corresponde a 160 y 180°C.
Se observa que cuando se incrementa la temperatura de la hidrólisis, se produce
un ligero aumento, en el orden del 10%, en la producción de azúcares,
alcanzándose un máximo de 5,38 ± 0,07 g/L a 180°C. Este valor representa una
conversión de 81,84% en función del bagazo seco y un rendimiento del 11,83% en
relación al valor teórico o cantidad de azúcar teórica presente en el sustrato.
Este mismo comportamiento fue reportado por Saucedo-Luna y col., (2010)
durante la segunda etapa de hidrólisis de bagazo de agave a diferentes
temperaturas (150, 175 y 200 °C) con ácido sulfúrico diluido al 2% previamente
hidrolizado a 150°C durante 10 minutos. Encontraron que la producción de azúcares
aumentó al aumentar la temperatura de la hidrólisis, con una producción máxima de
14 g/L de azúcares fermentables a los 10 minutos de reacción a 175°C, lo cual
48
equivale a una conversión de 84 g azucares/Kg de bagazo. Esta conversión es muy
similar a la encontrada en este estudio.
Como puede observarse en la Tabla 8, no se detectó la formación de furanos,
furfural e hidroximetilfurfural (HMF), en la segunda etapa de las hidrólisis realizadas
a 160 y 180°C, indicando que no se producen reacciones de degradación de los
azúcares.
Se observó generación de ácido acético en las hidrólisis realizadas tanto a
160°C, como a 180°C, con valores de 0,173 y 0,128 g/L respectivamente, no
encontrándose diferencias significativas (p0,05). Estos valores son superiores a los
encontrados en la primera etapa de las hidrólisis a las diferentes temperaturas
ensayadas y pudieran estar generándose cuando las reacciones de hidrólisis
ocurren a nivel de las pentosas acetiladas de la hemicelulosa (Rodríguez-Chong y
col., 2004). Sin embargo, las concentraciones encontradas están por debajo de los
valores reportados como tóxicos para los microorganismos.
Tabla 8. Contenido de furanos, ácido acético y compuestos fenólicos generados durante la segunda etapa de la hidrólisis (H2E) del bagazo de caña de azúcar con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
Hidrólisis
Furfural
(g/L) Hidroximetilfurfural
(g/L) Acido acético
(g/L) Compuestos
fenólicos (g/L)
H2E-160 ND ND 0,173 ± 0,034a 2,183 ± 0,018a
H2E-180 ND ND 0,128 ± 0,038a 2,746 ± 0,025b
Nota: Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas (p0.05). ND: no detectado H2E-xxx : hidrólisis primera etapa, donde xxx corresponde a 160 y 180°C.
El contenido total de compuestos fenólicos aumenta con el incremento en la
temperatura de la hidrólisis, encontrándose a 180°C (p0,05) con un valor de 2,746
g/L. El mismo es 25% mayor que el encontrado para la hidrólisis a 160°C. Ambos
contenidos son superiores a los valores encontrados en la primera etapa, lo cual
pudiera sugerir que existe una degradación de la lignina presente.
Se ha reportado que los productos de degradación de la lignina son más tóxicos
a los microorganismos que el furfural e HMF, incluso a bajas concentraciones. Los
compuestos fenólicos pueden penetrar las membranas biológicas causando pérdida
de integridad y de la capacidad de servir como barrera selectiva, afectando como
49
consecuencia el crecimiento celular, la asimilación de azúcar y por ende la
producción de etanol (Larsson y col., 1999, Palmqvist y col., 1999). Delgenes y col.,
(1996) reportaron que concentraciones de compuestos fenólicos (vainillina,
hidroxibenzaldehido y siringaldehido) de 1,0 g/L en el medio de fermentación inhiben
casi totalmente el crecimiento microbiano y la producción de etanol. Pajaró y col.,
(1998) indican que concentraciones de 3,5 y 5 g/L de vainillina inhiben parcial y
totalmente el metabolismo de Saccharomyces cerevisae.
En base a la mayor conversión de azúcares y dado que existe muy poca
diferencia en los valores encontrados de compuestos que pudieran causar inhibición
durante los procesos de fermentación, se puede indicar que la mejor temperatura
para la segunda etapa de hidrólisis es 180°C. Los posibles efectos que pudiera
causar la presencia de compuestos fenólicos en el hidrolizado pudieran solventarse
aplicando algún método de detoxificación, como por ejemplo tratamiento con
Ca(OH)2 a pH 10, que permita reducir los niveles a valores que no afecten el
metabolismo de los microorganismos utilizados (Martínez y col., 2001).
En la Tabla 9 se presenta un resumen de las condiciones seleccionadas y los
resultados obtenidos en cada etapa de la hidrólisis. La conversión total de azúcares
reductores, expresados como glucosa, a partir de las dos etapas secuenciales de
hidrólisis fue de 306,07 g/Kg de bagazo seco, equivalente al 39,41% del valor
teórico. Este rendimiento se considera aceptable tomando en cuenta que el bagazo
de caña de azúcar es un desecho lignocelulósico de muy bajo costo, además de la
posibilidad de utilizar el residuo sólido en procesos de combustión para generar
electricidad y calor.
54
Tabla 9. Temperaturas seleccionadas en las etapas de la hidrólisis ácida y concentraciones de los productos obtenidos en cada etapa
Hidrolisis
Etapa
Temperatura
(°C)
Azúcares reductores
(g glucosa/L)
Conversión
(g glucosa/Kg bagazo)
Furfural
(g/L)
HMF
(g/L)
Ácido acético
(g/L)
Compuestos fenólicos
(g/L)
1 140 14,60 ± 0.21
224,23 1,168±0,089 0,047±0,008 0,058±0,001 0,717±0,047
2 180 5,38 ± 0,07 81,84
N.D N.D 0,128± 0,038 2,746± 0,025
N.D.: no detectado, HMF: Hidroximetilfurfural.
51
CONCLUSIONES
Los mejores valores de temperatura para la hidrólisis del bagazo de caña de
azúcar con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido sólido de 15:1 durante 3
minutos, en un proceso de dos etapas secuenciales por carga son 140°C para la
primera etapa y 180°C para la segunda.
La temperatura tiene un efecto significativo sobre la producción de azúcares
reductores, así como también en la generación de subproductos que pueden causar
inhibición sobre el metabolismo de los microorganismos utilizados en los procesos
de fermentación para la producción de etanol.
La presencia de furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético y compuestos
fenólicos, indican que se producen reacciones de degradación asociadas tanto a
pentosas y hexosas (derivadas de la reacción de hidrólisis de la hemicelulosa y
celulosa) y de la lignina.
La conversión total de azúcares reductores, expresados como glucosa, a partir
de las dos etapas secuenciales de hidrólisis fue de 306,07 g/Kg de bagazo seco,
equivalente al 39,41% del valor teórico.
El bagazo de caña de azúcar es un desecho agroindustrial con gran potencial
para la producción de azúcares fermentables.
52
RECOMENDACIONES
Realizar perfiles de azúcares mediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) para determinar la cantidad de cada uno de los
monómeros presentes en el hidrolizado.
Utilizar mayores temperaturas tanto para la primera como para la segunda
etapa, con el fin de lograr una mayor solubilización de la hemicelulosa y
celulosa.
Evaluar la hidrólisis en cada una de las etapas a diferentes tiempos de
reacción para estudiar su efecto sobre la producción de azúcares y demás
subproductos.
Realizar la caracterización del sólido remanente de la hidrólisis en cada una
de sus etapas, mediante métodos analíticos que permitan calcular la cantidad
de celulosa, hemicelulosa y lignina con mayor precisión.
53
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58
APÉNDICE A
PROCEDIMIENTO PARA EL MANEJO DEL REACTOR AUTOCLAVE PARR 4593
La hidrólisis ácida se realizó por triplicado en un reactor autoclave modelo 4593
Pressure Reaction Apparatus de 100 mL de capacidad, el cual está construido de
T316 acero inoxidable. El reactor usa un horno y un agitador eléctrico (Parr
instruments, 100 mL). La temperatura y velocidad de agitación durante la hidrólisis
fueron controladas y monitoreadas con un controlador modular. La muestra del
bagazo se mezcló con una solución de ácido sulfúrico al 1%v/v en una relación
líquido–sólido de 15:1. Esta mezcla se trató a 100, 120, 140 y 160 ºC por un tiempo
de 3 min para la primera etapa y de 160ºC – 180ºC para la segunda etapa,
mantenido el resto de las condiciones invariables.
PROCEDIMIENTO:
1. Pesar la muestra y medir el volumen de la solución (H2SO4 al 1%v/v).
Colocarlos dentro del reactor. El volumen no debe exceder 70 mL, ya que la
capacidad del reactor es de 100 mL.
2. Ajustar las turcas del reactor.
3. Colocar el reactor en su base, ajustar el rotor y subir el horno.
4. Cebar la bomba y colocar la l entrada y salida de agua en el rotor.
5. Encender el controlador, ajustar el setpoint a la temperatura deseada,
encender el rotor, con una velocidad media y el botón de calentamiento (hacia
abajo si la temperatura es ≤ 100ºC y hacia arriba si la temperatura es mayor
de 100ºC).
6. Esperar que alcance la temperatura deseada. Cronometrar el tiempo de
reacción.
7. Una vez alcanzada la temperatura deseada, apagar el calentamiento y
esperar que se enfríe aproximadamente a 30ºC.
8. Desmontar el reactor y filtrar el contenido por succión al vacío.
9. Refrigerar el hidrolizado a ± 4ºC.
10. Realizar el lavado del sólido de 5 a 10 veces la cantidad de hidrolizado
recolectado, con el fin de disminuir el pH de bagazo.
11. Secar en la mufla el bagazo por 2 h.
59
APÉNDICE B
DETERMINACION DE NITRÓGENO Y PROTEÍNA CRUDA
El nitrógeno de las proteínas y otros compuestos se transforma en sulfato de
amonio por medio de la digestión con acido sulfúrico en caliente. El residuo se
enfría, se diluye con agua y se le agrega hidróxido de sodio, para formar hidróxido
de amonio que se destila y recibe en una solución de acido bórico que luego es
titulada con acido estandarizado. El acido bórico no necesita estar estandarizado o
medido con precisión cuando se trabaja con muestras de alto contenido de
nitrógeno.
Reactivos
A. Solución digestora: en 1 mL de ácido sulfúrico concentrado disolver 25 g de
sulfato de potasio, preferiblemente en cristales finos. Agregar mientras se agita
25 mL de una solución saturada de sulfato cúprico (7,9g/25ml) que contenga
5g de selenito de sodio. Agregar luego 10 g de polvo de oxido de rojo de
mercurio. Homogeneizar en un agitador magnético por 6 horas.
B. Solución de hidróxido de sodio 40% p/v: disolver 400 g de hidróxido de sodio
con enfriamiento en aproximadamente 600 mL de agua. Añada luego 60 g de
tío sulfato de sodio afore a un litro con agua destilada. Guarde la solución en
una botella de polietileno bien tapada.
C. Solución de ácido bórico: disolver 100 g de acido bórico en 6 L de agua
destilada. Agregar luego 100 mL de rojo de metilo al 0,1% en etanol y 70 mL de
verde de bromocresol al 0,1% en etanol. Añadirle después 5 mL de NaOH al
4%. Aforar a 10 litros con agua destilada.
D. Solución de acido clorhídrico 0,2 N: colocar 16,7 ml de HCL concentrado (12 N)
en un balón de un litro y aforar con agua destilada.
Método analítico
1. Pese aproximadamente 0,5 g de muestra en un trozo de papel de rectangular
de 5 x 4 cm. aproximadamente. Doblarlo bien e introducirlo dentro de un tubo
para digestión Tecator. Agregar 10 mL de la solución digestota debidamente
agitada.
60
2. Colocar el tubo con la muestra en el digestor y digerir por 45 minutos a 450ºC.
Es conveniente encender el digestor mientras se están pasando las muestras
para que alcance la temperatura deseada. Enfriar y luego agregarle 75 mL de
agua destilada, agitar bien y enfriar.
3. Encender el equipo de destilación automática TECATOR. Chequear el nivel
de agua en el generador de vapor. El nivel de agua debe estar por encima de
los electrodos. Abrir la válvula de entrada de agua y graduela hasta obtener la
temperatura adecuada (Remítase al manual de operación del equipo
TECATOR para más detalles).
4. Coloque el tubo en el aparato de destilación automática TECATOR y baje la
ventana de seguridad. Espere hasta que se complete la destilación y
titulación. Anote el volumen de HCl gastado.
5. Levante la ventana de seguridad, saque el tubo de digestión y se va a
continuar destilando otras muestras. Coloque un nuevo tubo y proceda como
antes.
Cálculos
Contenido de Nitrogeno
MSmuestraladegramos
NVN
HClHClgastado
%*
100*4,1**%
Contenido de Proteína cruda, PC:
25.6*% NPC
61
APÉNDICE C
DETERMINACIÓN DE FIBRA NEUTRO DETERGENTE, FIBRA ÁCIDA
DETERGENTE Y LIGNINA ÁCIDA
FIBRA NEUTRO DETERGENTE
Este método determina la fibra neutro detergente, la cual es el residuo remanente
después de la digestión en presencia de una solución de detergente neutro. El
procedimiento aparentemente divide la materia seca al punto de que separa los
constituyentes nutricionales solubles y accesibles, de aquellos que son totalmente
aprovechables los cuales dependen de la fermentación microbiológica para su
aprovechamiento. Los residuos de la fibra son predominantemente hemicelulosas,
celulosa, y lignina. Este método es aplicable a granos, alimentos, forrajes y todo
material con contenido de fibra.
Reactivos
A. Solución neutro detergente : adicionar 30 g de sodio lauril sulfato, USP; 18,61 g
de etilendiaminatetraaceticadisodicadihidratada (EDTA); 6,81 g de tetraborato
de sodio decahidratado; 4,56 g de fosfato de sodio dibásico, anhidro y 10 ml de
trietilen glicol, en 1L de agua destilada. Chequear que el pH se encuentre entre
6,9 y 7,1. Agitar y calentar.
B. Acetona: Libre de color y que no deje residuo al evaporarla.
Método analítico
Preparación de la muestra
Moler las muestras para obtener tamaño de partícula de 1 – 2 mm. Muestras
molidas mas finas pueden presentar perdida de partículas en las bolsas de filtro, lo
que puede resultar en valores bajos.
Procedimiento
1. Utilizar un marcador resistente a solventes para rotular las bolsas de filtro.
Pesar la bolsilla (W1) y tarar la balanza. Nota – no presecar las bolsas;
cualquier contenido de humedad será corregido a partir de la bolsa blanco.
2. Pesar 0,45 – 0,55 de la muestra preparada (W2) directamente en la bolsa.
Evitar introducir o colocar muestra por encima de 4 mm ésta.
62
3. Utilizando el sellador de calor, sellar completamente el borde superior de la
bolsa a 4 mm del tope. Nota: usar suficiente calor para sellar completamente
la bolsa y permitir que se enfríe el tiempo necesario (2 seg) antes de quitarla
del sellador.
4. Pesar una bolsa blanco e incluirla en la corrida para determinar la corrección
correspondiente (C1).
5. Colocar un máximo de 24 bolsas dentro del porta bolsas. La bandeja superior
actúa como cubierta y no debe contener bolsillas. Colocar tres bolsas por
bandeja. Insertar el porta bolsas (colocar el peso para mantenerlo sumergido)
dentro de la cámara de digestión del analizador de fibra. Nota: si antes de
introducir las muestras, la cámara de digestión aun permanece caliente como
consecuencia de una corrida anterior, se debe adicionar agua fría y abrir la
válvula de drenaje.
6. Si se van a procesar 24 muestras, adicionar 1900 – 2000 ml de solución de
detergente neutro a temperatura ambiente. Si se procesan menos de 20,
adicionar 100 ml/bolsa de detergente neutro (utilizar un mínimo de 1500, para
asegurara que el porta bolsa se cubra totalmente). Adicionar 20 g de sulfito de
sodio (0,5 g/50 ml de detergente neutro), y 4 mL de alfa amilasa.
7. Encender la agitación y la temperatura, cerrar la cámara de digestión, y
extraer por 75 min.
8. Al final de la extracción, detener la agitación y el calentamiento. Abrir la
válvula de drenaje (lentamente) y dejar que la solución caliente salga antes de
abrir la tapa de la cámara de digestión. Nota – la solución dentro de la cámara
de digestión esta bajo presión. Se debe abrir la válvula de drenaje para liberar
la presión y la solución antes de abrir la tapa de la cámara.
9. Después de que la solución haya sido drenada, cerrar la válvula y abrir la
cámara. Adicionar 1900 ml de (70 – 90 ºC) de agua destilada y 4 ml de alfa
amilasa. Encender la agitación por 5 min. La tapa puede estar cerrada con el
control de calentamiento encendido o permanecer abierta con el control de
temperatura apagado. Repetir el lavado con agua caliente para un total de
tres veces.
10. Completado el proceso de lavado, se procede a remover las muestras.
Suavemente presionar las bolsas para extraer el exceso de agua. Colocar las
63
bolsas en un matraz de 250 ml y adicionar suficiente acetona como para
cubrir las bolsas y dejar reposar de 3 – 5 min.
11. Retirar las bolsas de la acetona y colocarlas a airear. Completar el secado en
una estufa a 102±2 ºC (la mayoría de las estufas completan el secado
después de 2 – 4 horas). Nota: no colocar las bolsas en la estufa hasta que la
acetona se evapore completamente.
12. Retirar las bolsas de la estufa, y colocarlas directamente dentro de la bolsa
desecante, presionarla para remover el aire y sellarla. Enfriar a temperatura
ambiente y pesar las bolsas (W3).Nota: No utilizar un desecador
convencional.
Cálculos
Donde:
W1 = peso de la bolsa,
W2 = peso de la muestra,
W3 = peso de las bolsas secas después de la extracción,
C1= corrección de la bolsa blanco (promedio de la corrida de los pesos secos finales
dividido por el peso original de la bolsa blanco).
% NDF (en base recibida) =
(W3 – (W1 x C1))
W2
X 100
64
FIBRA ÁCIDO DETERGENTE
Este procedimiento permite una rápida determinación de la lignocelulosa en los
alimentos. Sin embargo, en esta fracción también aparece la sílice. La diferencia
entre el valor de las paredes celulares y la fibra ácido detergente, da una estimación
del valor de la hemicelulosa, ya que esta diferencia también incluye una fracción de
proteína adherida a las paredes celulares. El método de fibra por ácido detergente
también se emplea como paso preliminar en la determinación de lignina.
Reactivos
A. Solución ácido detergente: ácido sulfúrico, grado reactivo, estandarizado a 1 N.
Ello se logra agregando 49,04 g de H2SO4 por litro de agua destilada. Para
preparar 18 litros de solución, se necesitan 882.72 g de H2SO4. Agregue 20 g de
bromuro de amonio cetyltrimetil (CTAB), grado técnico por litro de la solución 1 N
de H2SO4 ó 360 g por 18 litros y agitese para facilitar la disolución.
B. Acetona: grado reactivo.
Método analítico
1. Pesar por diferencia aproximadamente 0,5 g de muestra y deposítela en un
Beaker de Berzelius de 600 mL.
2. Agregar 50 ml de solución de ácido detergente a temperatura ambiente.
Caliente la solución para que hierva en el término de 5 a 10 minutos. Cuando
se inicia la ebullición, baje el calor para evitar la formación de espuma y
manténgase en reflujo por 60 minutos contados a partir del inicio de la
ebullición que debe ser lenta durante todo el procedimiento.
3. Filtrar la solución con poca succión, a través de un crisol de vidrio (poro
grueso de fibra de vidrio tipo 50C) previamente tarado. Con una varilla de
vidrio, afloje la capa de muestra que se ha compactado en el fondo del crisol y
lávela dos veces con agua caliente (90 – 100°C). Lave las paredes del crisol
de la misma manera.
65
4. Repetir igualmente el lavado con acetona hasta que desaparezca totalmente
el color, desintegrando cualquier grumo que se haya formado para que el
solvente entre en contacto con todas las partículas de fibra.
5. Si la formación de grumos constituye un problema, lave la muestra con
hexano mientras aún contenga acetona. Mantenga la muestra bajo succión
hasta que se libere del hexano y séquela a 105°C por 8 horas o durante toda
la noche; luego se saca de la estufa, se enfría en un desecador y se pesa.
Cálculos
MSaalmenteestraparciPesodelamu
soltaradoPesodelcriFibraácidasolPesodelcriFAD
%*sec
100*100*%
66
LIGNINA ÁCIDA DETERGENTE
Este procedimiento utiliza como primer paso, la técnica empleada para la
determinación de fibra ácido detergente. El detergente extrae la proteína y otros
materiales solubles en ácido que interfieren con la determinación de lignina. El
principio de este procedimiento estriba en que el residuo de la fibra ácido detergente,
consiste principalmente de lignocelulosa de cuyo compuesto se disuelve y separa la
celulosa por medio de la solución de H2SO4 72% p/p o 24 N quedando la lignina y la
ceniza no-soluble en ácido.
Reactivos
A. Ácido sulfúrico, 72% p/p: utilice 735 g de H2SO4 al 98% de pureza y 265 g de
H2O destilada o cantidades equivalentes si se desea preparar mayor o menor
cantidad de solución. Pese el agua necesaria en un beaker de 2000 ml y en un
recipiente aparte, pese al ácido que se va a necesitar. Lentamente agregue el
ácido al agua contenida en el beaker de 2000 mL, asentado en agua fría y
agítese ocasionalmente con una varilla de vidrio. Determine la gravedad
especifica de una alícuota de 5 mL de la solución (a 20 °C) con una pipeta
volumétrica, colocando la muestra en una botella de pesar tapada y pesándola
en una balanza analítica. Ajuste la gravedad especifica a 1,634 a 20 °C
mediante el agregado de cantidades pequeñas y medidas de agua o de ácido.
B. Acetona: Libre de color y que no deje residuo al evaporarla
.
Método analítico
1. El primer paso es el de preparar la fibra ácido detergente tal como se
describió en el apéndice C.
2. Coloque las bolsas en un Beakers de 250 mL.
3. Cubra las bolsas con el H2SO4 al 72% o 24 N a temperatura ambiente durante
un tiempo de 3h.
4. Transcurridas las 3 horas, extraiga todo el exceso de acido de las bolsas.
5. Realice lavados con agua de grifo y agua destilada hasta que el pH de lavado
alcance el pH del agua destilada.
6. Coloque nuevamente las bolsas en un Beakers de 250 mL.
67
7. Cubras las bolsas con acetona durante un tiempo de 5 min.
8. Retire el contenido de acetona y deje airear el residuo de acetona por una
noche.
9. Complete el secado de las muestras en una estufa a 102±2 ºC durante 4
horas
10. Transcurrido el tiempo retirar las bolsas de la estufa y colocarlas directamente
en la bolsa hermética que contiene la bolsa desecante durante una hora.
11. Realice el pesado de las bolsas.
Cálculos
Donde:
W1 = peso de la bolsa,
W2 = peso de la muestra,
W3 = peso de las bolsas secas después de la extracción,
C1= corrección de la bolsa blanco (promedio de la corrida de los pesos secos finales
dividido por el peso original de la bolsa blanco).
% ADL (en base recibida) =
W2
X 100 (W3 – (W1 x C1))
68
APÉNDICE D
MÉTODO DE ÁCIDO 3,5 DINITROSALICÍLICO (DNS)
El uso del método ácido 3,5 dinitrosalicílico (Miller, 1959) es extensamente
aceptado para cuantificar azúcares reductores, particularmente aquellos generados
por la ruptura de la celulosa. Este método esta basado en la presunta reducción del
ácido 3,5 dinitrosalicílico por el azúcar a 3-amino-5-ácido dinitrosalicílico. El reactivo
DNS está compuesto de (además del ácido 3,5 dinitrosalicílico) tartrato de potasio
sódico (Sal de Rochelle) usado para prevenir la reacción con oxigeno disuelto, fenol
para incrementar la formación de color, metabisulfito de sodio para estabilizar éste
color e hidróxido de sodio que adecua el pH para la reacción reducción azúcar-DNS.
Las mayores desventajas del método son, la respuesta no lineal para bajas
concentraciones de azúcares reductores (menos de 0,1 g/L glucosa), la inhabilidad
para diferenciar entre los tipos de azúcares reductores (hexosas y pentosas
incluyendo monómeros u oligómeros) por lo que puede ser difícil interpretar los
resultados de la hidrólisis de la celulosa, y es influenciado por otras sustancias (por
ejemplo, ácido cítrico, carboxilmetilcelulosa) (Miller, 1959). La ventaja del método es
su simplicidad y la reproducibilidad de los resultados.
Reactivos
DNS: el orden de adición de los reactivos ha sido encontrado importante.
1. Disuelva 19,8 g de NaOH en 1416 mL de agua destilada.
2. Agregue 10.6 g de ácido dinitrosalicílico y agite hasta disolución completa.
3. Agregue 306 g de Na-K tartrato (sal de Rochelle) y 8,3 g de metabisulfito de
sodio. Agitar hasta disolución completa.
4. Fundir fenol a 50-60 °C y agregar 7,6 mL de fenol al reactivo. El fenol es un
agente cancerigeno. Sea extremamente cuidadoso. (Use guantes de
seguridad y mascara de gas con filtro para vapores orgánicos).
5. Mantener el reactivo en una botella color ámbar y refrigerar.
69
Curva Patrón:
1. Preparar una solución Patrón de Glucosa de 2,0 mg/mL
2. Preparar de los estándares de glucosa de acuerdo a la Tabla 8.
Tabla F-1. Estándares de Glucosa
Concentración (mg/mL)
Volumen Patrón (mL)
Volumen agregado de agua (mL)
0,0 0,0 1,0
0,2 0,1 0,9
0,6 0,3 0,7
1,0 0,5 0,5
1,4 0,7 0,3
1,8 0,9 0,1
2,0 1,0 0,0
Muestras:
Las muestras deben ser filtradas usando una membrana de 0,22 μm y diluidas
apropiadamente antes de realizar el método DNS.
1. Tomar 0,25 mL de muestra.
2. Agregar 0,75 mL del reactivo DNS a todos los tubos de ensayo.
3. Agitar bien el tubo.
4. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos.
5. Inmediatamente después introducirlos durante 5 minutos más en un baño de
agua fría.
6. Preparar otro juego de tubos debidamente etiquetados con 8 mL de agua
destilada cada uno y diluir 0.8mL de cada muestra con la ayuda de una
micropipeta.
7. Medir la absorbancia a cada tubo en el espectrofotómetro a 550nm.
8. Prepare una curva estándar de concentración de glucosa vs. absorbancia y
realice un análisis de regresión lineal (Figura 19).
9. Usando la ecuación de regresión lineal, calcule el equivalente de
concentración de glucosa para las muestras.
70
Figura F-1. Concentración de glucosa (mg/mL) vs absorbancia (nm)
Tabla F-2. Curva de calibración del DNS
Concentración (mg/mL)
0,2 0,6 1,0 1,4 1,8 2,0
Absorbancia (nm)
0,06 0,178 0,324 0,468 0,556 0,618
73
APÉNDICE E
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS
72
APÉNDICE F
CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS
FENÓLICOS, ÁCIDO ACÉTICO, FURFURAL E HIDROXIMETILFURFURAL (HMF)
Figura F-1. Concentración de compuestos fenólicos (mg/L) vs absorbancia (nm)
Tabla F-1. Curva de calibración de Compuestos fenólicos
Conc. 2,0 3,0 6,0 8,0 10 20
Abs 0,223 0,361 0,671 0,916 1,122 2,005
73
Figura F-2. Concentración de acido acético (ppm) vs área de pico
Figura F-3. Concentración de furfural (mg/mL) vs área de pico
Tabla F-3. Curva de calibración del furfural
Concentración 0,05 0,1 1,0 1,5
Área 11060,4 20633,1 82580,1 117545,0
74
Figura F-4. Concentración de HMF (mg/mL) vs área de pico
Tabla F-4. Curva de calibración del HMF
Conc. 0,025 0,05 0,5 1,0
Área 4195,7 15138,0 69377,0 125990,0
75
APÉNDICE G
CROMATOGRAMAS
Figura G-1. Cromatograma del ácido acético para la primera etapa (T= 140ºC)
Figura G-2. Cromatograma del ácido acético para la segunda etapa (T=180ºC)
76
APENDICE H
RESULTADOS EXPERIMENTALES
Tabla H-1. Contenido de Solubles, Celulosa, Hemicelulosa y Lignina del bagazo de caña de azúcar sometido a hidrólisis ácida diluida con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
SUSTRATO
Solubles (%) Celulosa (%) Hemicelulosa (%) Lignina (%)
PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS
BSH
17,25 17,28 0,04 61,62 62,25 0,89 8,70 7,99 1,01 12,43 12,49 0,08
17,31 62,88 7,27 12,54
BH1E-100
14,76 14,55 0,30 59,79 60,15 0,50 4,49 5,20 1,00 20,96 20,11 1,21
14,34 60,50 5,91 19,25
BHIE-120
16,06 15,18 1,24 59,64 60,92 1,81 4,66 4,58 0,12 19,64 19,33 0,45
14,30 62,20 4,49 19,01
BHIE-140
14,06 16,01 2,76 58,21 58,21 0,01 4,94 4,66 0,39 20,60 20,35 0,35
17,96 58,20 4,39 20,10
BHIE-160
14,91 15,55 0,91 57,83 57,12 1,00 3,14 2,83 0,44 24,12 24,50 0,54
16,19 56,41 2,52 24,88
BH2E-160
12,67 12,39 0,40 40,61 40,31 0,43 3,51 3,51 0,01 41,21 41,21 0,01
12,10 40,00 3,50 41,20
BH2E-180
21,58 20,79 1,12 33,04 33,02 0,03 3,95 3,95 0,01 41,43 41,37 0,09
20,00 33,00 3,94 41,30 Nota: BSH: Bagazo sin hidrolizar, BH1E- xxx: Bagazo hidrolizado primera etapa a 100, 120, 140 y 160 °C. BH2E- xxx: Bagazo hidrolizado segunda etapa a 160 y 180 °C
77
Tabla H-2. Concentración de azúcares reductores producto de la 1ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
Hidrólisis pHi pHf ABSORBANCIAS
Concentración de azucares reductores (mg/mL)
Promedio SD
H1-100 1,62 4,69 0,054 0,055 0,054 1,68 1,72 1,68 1,70 0,02
H2-100 1,43 4,76 0,037 0,038 0,037 1,14 1,17 1,14 1,15 0,02
H3-100 1,35 4,68 0,038 0,050 0,051 1,17 1,56 1,59 1,44 0,23
H1-120 1,55 4,64 0,358 0,352 0,350 11,40 11,21 11,15 11,25 0,13
H2-120 1,38 4,68 0,300 0,310 0,304 9,55 9,87 9,68 9,70 0,16
H3-120 1,34 4,38 0,321 0,322 0,312 10,22 10,25 9,93 10,14 0,18
H1-140 1,76 4,65 0,450 0,463 0,459 14,34 14,76 14,63 14,58 0,21
H2-140 1,44 4,50 0,461 0,478 0,436 14,70 15,24 13,90 14,61 0,68
H3-140 1,39 4,56 0,416 0,408 0,441 13,26 13,00 14,06 13,44 0,55
H1-160 1,35 4,43 0,358 0,365 0,352 11,40 11,63 11,21 11,41 0,21
H2-160 1,32 4,79 0,332 0,339 0,336 10,57 10,80 10,70 10,69 0,11
H3-160 1,33 4,87 0,282 0,277 0,312 8,97 8,81 9,93 9,24 0,61 H1, H2, H3: muestras de hidrolizado de cada experiencia. Hi-xxx: Hidrólisis i a xxx °C: 100,120,140,160,180
78
Tabla H-3. Concentración de azucares reductores producto de la 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y Temperatura de 160°C
Hidrólisis pHi pHf
ABSORBANCIAS
Concentración de azucares reductores (mg/mL)
Promedio SD
H1-160 1,72 4,66 0,071 0,064 0,058 5,20 4,97 4,77 4,98 0,21
H2-160 1,61 4,66 0,061 0,059 0,057 4,87 4,80 4,74 4,80 0,07 H1, H2: muestras de hidrolizado de cada experiencia.
Tabla H-4. Concentración de azucares reductores producto de la 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y Temperatura de 180°C
Hidrolisis pHi pHf
ABSORBANCIAS
Concentración (mg/mL)
Promedio SD
H1-180 1,71 4,92 0,076 0,079 0,079 5,36 5,46 5,46 5,43 0,06
H2-180 1,55 4,71 0,074 0,076 0,075 5,30 5,36 5,33 5,33 0,03 H1, H2: muestras de hidrolizado de cada experiencia.
79
Tabla H-5. Contenido de compuestos fenólicos en el hidrolizado producido en la 1ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
Hidrólisis pHi pHf ABSORBANCIAS
Compuestos fenólicos (mg/mL)
Promedio SD
H1-100 1,62 4,69 0,203 0,206 0,214 0,16 0,16 0,17 0,16 0,01
H2-100 1,43 4,76 0,174 0,174 0,172 0,12 0,12 0,12 0,12 0,00
H3-100 1,35 4,68 0,204 0,192 0,193 0,16 0,14 0,14 0,15 0,01
H1-120 1,55 4,64 0,468 0,463 0,472 0,49 0,49 0,50 0,49 0,00
H2-120 1,38 4,68 0,435 0,436 0,422 0,45 0,45 0,43 0,45 0,01
H3-120 1,34 4,38 0,409 0,404 0,412 0,42 0,41 0,42 0,42 0,00
H1-140 1,76 4,65 0,662 0,667 0,701 0,74 0,75 0,79 0,76 0,02
H2-140 1,44 4,50 0,761 0,789 0,845 0,87 0,90 0,97 0,91 0,04
H3-140 1,39 4,56 0,638 0,621 0,617 0,71 0,69 0,68 0,69 0,01
H1-160 1,35 4,43 1,239 1,291 1,368 1,47 1,54 1,64 1,55 0,07
H2-160 1,32 4,79 1,161 1,419 1,455 1,37 1,70 1,75 1,61 0,17
H3-160 1,33 4,87 1,434 1,533 1,472 1,72 1,85 1,77 1,78 0,05 H1, H2, H3: muestras de hidrolizado de cada experiencia. Hi-xxx: Hidrólisis a xxx °C: 100,120,140,160,180
80
Tabla H-6. Contenido de compuestos fenólicos en el hidrolizado producido en la 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y Temperatura de 160°C
Hidrólisis pHi pHf
ABSORBANCIAS
Concentración de azucares reductores (mg/mL)
Promedio SD
H1-160 1,72 4,66 0,963 0,953 0,996 2,16 2,14 2,24 2,18 0,05
H2-160 1,61 4,66 0,974 0,948 0,996 2,19 2,13 2,24 2,19 0,05 H1, H2: muestras de hidrolizado de cada experiencia.
Tabla H-7. Contenido de compuestos fenólicos en el hidrolizado producido en la 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y Temperatura de 180°C
Hidrolisis pHi pHf
ABSORBANCIAS
Concentración (mg/mL)
Promedio SD
H1-180 1,71 4,92 1,205 1,241 1,283 2,69 2,77 2,86 2,77 0,08
H2-180 1,55 4,71 1,203 1,232 1,253 2,69 2,75 2,80 2,74 0,05 H1, H2: muestras de hidrolizado de cada experiencia.
81
Tabla H-8. Contenido de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) en el hidrolizado producido en la 1ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
Hidrólisis Furfural (mg/mL)
Promedio SD Hidroximetilfurfural, HMF (mg/mL)
Promedio SD
H1-100 0,224 0,227 0,227 0,226 0,002 ND ND ND ND ND
H2-100 0,229 0,226 0,213 0,223 0,008 ND ND ND ND ND
H3-100 0,054 0,053 0,053 0,053 0,001 ND ND ND ND ND
H1-120 0,441 0,442 0,442 0,442 0,001 ND ND ND ND ND
H2-120 0,531 0,519 0,531 0,527 0,007 ND ND ND ND ND
H3-120 0,079 0,079 0,079 0,079 0,000 ND ND ND ND ND
H1-140 1,103 1,118 1,107 1,109 0,008 0,0509 0,0519 0,0218 0,042 0,017
H2-140 1,219 1,242 1,232 1,231 0,012 0,0515 0,0531 0,0520 0,052 0,001
H3-140 0,703 0,752 0,742 0,732 0,026 0,0142 0,0155 0,0165 0,015 0,001
H1-160 1,640 1,682 1,702 1,675 0,032 0,275 0,277 0,278 0,277 0,002
H2-160 1,548 1,632 1,651 1,610 0,055 0,224 0,227 0,223 0,225 0,002
H3-160 1,614 1,629 1,661 1,635 0,024 0,288 0,282 0,253 0,274 0,019
82
Tabla H-9. Contenido de ácido acético en el hidrolizado producido en la 1ª y 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
Hidrolisis
Concentración de ácido acético (mg/ml)
1ª ETAPA T (°C) 2ª ETAPA T (°C)
100 120 140 160 160 180
H1 0,020 0,068 0,058 0,098 0,197 0,155
H2 0,018 0,063 0,041 0,081 0,092 0,072
H3 0,032 0,059 0,057 0,077 0,149 0,102
Tabla H-10. Contenido de subproductos producidos en la 1ª y 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas
Hidrolizado Furfural (mg/mL) Hidroximetilfurfural (mg/ml) Acido acético (mg/mL) Compuestos fenólicos
(mg/ml)
H1E-100 0,227 ±0,001 ND
0,019 ±0,008a 0,155 ±0,003
H1E-120 0,487 ±0,060 ND
0,061 ±0,005b 0,451 ±0,003
H1E-140 1,168 ±0,089 0,047 ±0,008 0,058 ±0,011b 0,727 ±0,006
H1E-160 1,671 ±0,018 0,276 ±0,002 0,079 ±0,011c 1,646 ±0,062
83
Tabla H-11. Análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor para los resultados obtenidos en la primera etapa de hidrólisis
Origen de las variaciones
Variable dependiente
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Promedio de los cuadrados
F Pr
Azúcares reductores
187,41 3 62,47 282,62 0,00
Compuestos fenólicos
4,19 3 0,76 640,01 0,00
Temperatura Furfural 6,12 3 0,81 282,12 0,00
HMF 0,11 3 0,04 5778,37 0,00
Ácido acético 0,00 3 0,00 226,45 0,00
84