DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE AZÚCARES SOLUBLES EN PLANTAS DE Arabidopsis thaliana AFECTADAS EN...

8/16/2019 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE AZÚCARES SOLUBLES EN PLANTAS DE Arabidopsis thaliana AFECTADAS EN LA…

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UNIVERSIDADNACIONAL DE

EDUCACIÓN ADISTANCIA

MÁSTER EN CIENCIA Y TECNOLOGÍAQUÍMICA

DETERMINACIÓN DELCONTENIDO DE AZÚCARESSOLUBLES EN PLANTAS DE

Arabidopsis thaliana AFECTADAS ENLA SEÑALIZACIÓN POR

AZÚCARES

Santos Valera Martínez

Granada, 2015



Tutora: Dra. Rosa Mª Garcinuño Martínez

Dpto. Ciencias Analíticas - UNED



Granada, a 6 unio de !"#$

Este tra%a&o de 'n(esti)aci*n +a sido realizado en el Departaento de

iouíica, iolo)ía Molecular / Celular de plantas del )rupo de 'n(esti)aci*n de

Re)ulaci*n Redo0, 1eñalizaci*n por Az2cares / Respuesta a Estr3s i*tico / A%i*ticodel 4roceso 5otosint3tico en la Estaci*n E0periental del aidín del C1'C en Granada,

%a&o la direcci*n de la Dra. Maria 1a+ra7/ arra)8n / el Dr. Antonio es2s 1errato

Recio, constitu/e el 9ra%a&o 5in de M8ster de 'n(esti)aci*n del M8ster Uni(ersitario en

Ciencia / 9ecnolo)ía :uíica de la 5acultad de Ciencias ;UNED<, tutorizado por la

Dra. Rosa Mª Garcinuño Martínez ;UNED<.

https://www.eez.csic.es/?q=es/profile/profile_tax/18







Agradecimientos:



=ND'CE

IV. BIB%IOG&#& /

2



I.O;<et*=o e *nter9s +*entí>*+o del tra;a<o

I. O!"#i$% " i&#"'() *i"&#+,*%-" #'//!%

1



''. 9ra%a&o Bin de M8ster

I. O;<et*=o e *nter9s +*entí>*+o del tra;a<o

os az2cares solu%les 8s a%undantes en Arabidopsis thaliana son la

sacarosa, la )lucosa / la Bructosa. os az2cares son sintetizados para cu%rir lasnecesidades de creciiento de la planta, o en respuesta para la adaptaci*n a las

ca%iantes condiciones a%ientales. 4or esa raz*n, las plantas +an desarrollado

ecanisos de señalizaci*n para oruestar la síntesis / o(ilizaci*n de las diBerentes

tipos de az2cares. a interrupci*n de estas (ías de señalizaci*n puede pro(ocar ca%ios

en la síntesis / acuulaci*n de car%o+idratos en las c3lulas o %ien )enerar respuestas

an*alas en la resistenciaHsensi%ilidad a altas concentraciones de az2cares.

El eta%oliso cople&o de az2cares / señales +oronales est8n

entrecruzadas para inte)rar / transitir inBoraci*n (ital para la adaptaci*n de las

plantas a los ca%ios del entorno. 4or e&eplo, altas concentraciones de )lucosa in+i%en

el creciiento. 4or el contrario, concentraciones %a&as de az2car lo proue(en. 1in

e%ar)o, ueda uc+o por estudiar acerca de los ecanisos oleculares

in(olucrados, so%re todo en lo relati(o a la señalizaci*n de rutas especíBicas para la

Bructosa.

4ara ello el )rupo de in(esti)aci*n se +izo con una colecci*n de utantes

;utateca< de la planta odelo Arabidopsis thalianaI apro0iadaente de unas 6"""

líneas independientes, con el o%&eti(o de identiBicar / estudiar los eleentos iplicados

en la;s< ruta;s< de señalizaci*n por Bructosa.

Con dic+a utateca, pre(iaente se realiz* un cri%ado para localizar las líneas

utantes resistentes a altas concentraciones de Bructosa en el edio de creciiento

coo prier paso para la identiBicaci*n de nue(os eleentos en la señalizaci*n por este

az2car en plantas.

De dic+o cri%ado se seleccionaron para este tra%a&o las si)uientes líneas

utantes

• lac4-1 / lac5-1 Una de las razones por las ue seleccionaos estas líneas

se %asa en la interesante coincidencia de ue a%os utantes esta%an

aBectados en )enes pertenecientes a una isa Bailia de proteínas. Estas

2




enzias participarían en procesos de li)niBicaci*n ;lacasas< / no +an sido

descritas pre(iaente coo eleentos de señalizaci*n por az2cares.

• rp30-1 Este utante se encuentra aBectado en una de las proteínas de la

su%unidad ?"1 ri%osoal / podría estar controlando la traducci*n de ciertas proteínas en respuesta a az2cares.

• aep-1 El )en aBectado en este utante codiBica para una putati(a aspartil

endopeptidasa anclada a e%rana plas8tica. 4or su localizaci*n

su%celular podría ser un receptor de e%rana o una proteína de

señalizaci*n ue acti(e o inacti(e proteolíticaente a otros eleentos

señalizadores dentro de la isa ruta.

En un prier cri%ado en edio con Bructosa, estas @ líneas ostraron diBerencias

si)niBicati(as de creciiento con respecto a la línea sil(estre. El prier o%&eti(o

planteado en el tra%a&o consistir8 en corro%orar si dic+as líneas serían resistentes a altas

concentraciones de Bructosa o si, por el contrario, serían Balsos positi(os. El se)undo

o%&eti(o consistir8 en deterinar si dic+a resistencia es especíBica o no por Bructosa

;)lucosa / sacarosa<.

4or la relaci*n e0istente entre los az2cares / la +orona 8cido a%císico ;AA<,se estudiar8 ade8s el papel in+i%idor de la )erinaci*n de dic+a +orona, ue se

conoce es inducida por az2cares / ue %louea la )erinaci*n / el desarrollo de la

pl8ntula. 4lante8ndonos este o%&eti(o deterinaríaos si los putati(os eleentos

señalizadores por az2cares analizados en este tra%a&o dependen o no de la señalizaci*n

por AA.

5inalente, partiendo de la +ip*tesis de ue alteraciones en la percepci*n /

señalizaci*n por az2cares podría aBectar, consecuenteente, a los ni(eles de 3stos en la

planta, se lle(ar8 a ca%o la deterinaci*n del contenido en sacarosa, )lucosa / Bructosa

en +o&as epleando un 3todo enzi8tico de cuantiBicaci*n.

os resultados o%tenidos en este tra%a&o podrían a/udar a a%rir posteriores líneas

de in(esti)aci*n diri)idas al estudio en plantas de nue(as rutas de señalizaci*n por

az2cares.

3




II. TRABA0O FIN DE Má)#"'

4



''. 9ra%a&o Bin de M8ster #. 1eñalizaci*n de az2cares en plantas

1. S"2/i3/*i4& -" /35*/'")"& 6/&#/)

5




I.1 Se)al*za+*n de az-+ares

as plantas son or)anisos aut*troBos ue dependen de la ener)ía luinosa

pro(eniente del sol para Bi&ar el car%ono atosB3rico / o%tener car%o+idratos. 1iendo loscar%o+idratos 8s iportantes la sacarosa / el alid*n. Estos az2cares son Buente de

ener)ía / de car%ono celular para el creciiento / desarrolloI ta%i3n son los

coponentes esenciales en las Brutas, (erduras / tu%3rculos ue los seres +uanos

consuios en nuestra alientaci*n / &ue)an un papel u/ iportante coo

ol3culas señales.

a )lucosa / la Bructosa, ade8s de su iportancia coo Buente de car%ono

principal para uc+os or)anisos, es una ol3cula re)uladora, cla(e en el control de laBisiolo)ía del eta%oliso, ciclo celular, desarrollo / e0presi*n )3nica. En plantas

superiores, los az2cares odulan nuerosos procesos ue (an desde la )erinaci*n de

la seilla +asta la 2ltia etapa de senescencia. El papel de los az2cares coo

re)uladores, +a sido estudiado en a/or proBundidad en or)anisos unicelulares, ue

de%en enBrentarse a situaciones a%ientales continuaente ca%iantes / en uc+as

ocasiones ad(ersas, lo cual o%li)a a un rea&uste continuo del eta%oliso se)2n la

disponi%ilidad de nutrientes.

I.2 Vía de se)al*za+*n or az-+ares en lantas

a señalizaci*n / re)ulaci*n por az2cares es especialente cople&a en plantas.

>arios Bactores deterinan esta cople&idad la di(ersiBicaci*n suBrida por el

eta%oliso priario / secundario, ue conduce la síntesis / acuulaci*n de distintos

tipos de az2cares, la coe0istencia en el iso or)aniso de te&idos aut*troBos o+eter*troBos, con la consecuencia necesidad de una *ptia coordinaci*n eta%*lica /

Bisiol*)ica entre a%os tipos de te&idos, / la Buerte dependencia entre el desarrollo /

Bisiolo)ía de la planta de la capacidad Botosint3tica /, en consecuencia, de la capacidad

de %iosíntesis de car%o+idratos en respuesta a los ca%ios a%ientales. En la planta

e0isten te&idos ;Bi)ura #< ue pueden e0portar e iportar ;te&idos JBuenteK o

JsuiderosK<. a señalizaci*n )enerada a partir de estos az2cares le perite a la planta

conocer en cada oento el estado eta%*lico en sus c3lulas para re)ular / antener

un euili%rio en el Blu&o de az2cares entre sus distintos te&idos u *r)anos.

6




Figura 1. Relación de la fotosíntesis con los diferentes tejidos “fuente” y “sumideros” y la producción de azúcares.

Durante la e(oluci*n, los az2cares se +an colocado coo una (aria%le esencial

en Bunciones re)uladoras, en el control del eta%oliso, en la resistencia al estr3s, en el

proceso de creciiento / en el desarrollo de las %acterias, le(aduras, plantas /

aniales ;Bi)ura !<, de tal Bora ue los az2cares pueden alterar la e0presi*n de los

)enes de i)ual odo ue lo pueden +acer las +oronas. 4odríaos aBirar ue +a/ una

analo)ía entre la señalizaci*n por az2cares / las +oronas, aunue el inter(alo deconcentraci*n en el ue act2an a%as es u/ diBerentes.

Figura 2. Regulación de los procesos vitales por parte de los azúcares en plantas.

En las plantas, ue son or)anisos s3siles, el anteniiento de la +oeostasis,reuiere de ecanisos oleculares cople&os ue suplan su Balta de o(ilidad para

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escapar de situaciones ad(ersas. Estudios so%re las respuestas a az2cares en diBerentes

especies de plantas / utantes de A. thaliana +an re(elado ue los az2cares son cla(e

en la re)ulaci*n de la e0presi*n de )enes iplicados en diBerentes procesos

proliBeraci*n / uerte celular, )erinaci*n de las seillas, creciiento de las

inBlorescencias, raíces / tallos, e0pansi*n Boliar, en procesos de senescencia / en el

desarrollo de la seilla ;Loc+, L.E. #FF6I 1eeens, 1. !"""I Gi%son, 1.'. !""$I

Rolland, 5., / cols. !""6<.

as plantas poseen ecanisos de señalizaci*n por az2cares a lar)a distancia,

ue les perite la coordinaci*n entre los ca%ios Bisiol*)icos de sus diBerentes *r)anos

in+erentes al desarrollo o en respuesta a las alteraciones ue puedan darse en su entorno.

El eta%oliso de los az2cares es un proceso u/ din8ico, / los Blu&os de eta%olitos

/ las concentraciones de los az2cares se odiBican durante el desarrollo en respuesta a

las señales a%ientales coo los ca%ios de luz, teperatura / estreses %i*ticos /

a%i*ticos ;Roitsc+, 9.#FFFI oris&u, ., / cols. !""?I lsin), .E., / cols. !""$I

1it+, A.M., / cols. !""$I Oe%er, P., / cols. !""$<.

a Botosíntesis / la o(ilizaci*n / e0portaci*n de nutrientes son procesos

eta%*licos ue tienen lu)ar en los te&idos JBuenteK / ue son Ba(orecidos cuando laconcentraci*n de az2cares no supera un u%ral Bisiol*)ico, ientras ue las acti(idades

de los te&idos JsuideroK tales coo creciiento / alacenaiento se Ba(orecen

cuando las Buentes de car%ono son a%undantes.

Aunue la sacarosa, &unto al alid*n, es el producto Binal de la Botosíntesis,

otros az2cares, coo los ue pro(ienen de la de)radaci*n de la isa )lucosa /

Bructosa, coparten ecanisos re)uladores ue pueden aBectar al creciiento / al

eta%oliso ;Bi)ura ?<.

8




Figura . !odelo de los principales "ujos de car#ono en las c$lulas

fotosint$ticas y la formación de mol$culas se%al generadas por la fotosíntesis& el

transporte y la 'idrólisis de compuestos car#onados tanto durante la noc'e (parte

derec'a del es)uema* como durante el día (parte iz)uierda del es)uema*. +,+-

sacarosa fosfato sintasa& +,,- sacarosa fosfato fosfatasa& /,asa- 0,glucosa

pirofosforilasa& /,asa-& 0,glucosa pirofosforilasa& 345- invertasa& ++- sacarosa

sintasa.

En las c3lulas Botosint3ticas, el Botosintato )enerado en el ciclo de Cal(in es

e0portado, principalente coo triosas BosBato, desde el cloroplasto +asta el citosol,

donde entrar8 %ien en el eta%oliso cata%*lico ;)luc*lisis<, %ien en el ana%*lico

;)luconeo)3nesis<.

El e0ceso de Botosintato es transitoriaente alacenado coo alid*n en el

cloroplasto de las +o&as durante el día. a Buente 8s iportante de )lucosa durante la

noc+e pro(iene de la de)radaci*n del alid*n transitorio de los cloroplastos de las +o&as

;principalente (ía e0portaci*n de altosa / )lucosa< / de los ailoplastos en los

*r)anos ue alacenan alid*n. ;1it+, A.M., / cols. !""$<.

En los te&idos JsuideroK, la sacarosa puede ser iportada en las c3lulas a tra(3s

del plasodeso ;transporte sipl8stico< o a tra(3s de la pared celular ;transporte

apopl8stico<. a sacarosa intracelular es +idrolizada por la in(ertasa citopl8sica ;C-

'N><, )enerando )lucosa / Bructosa, o por la enzia sacarosa sintasa ;1U1<

produciendo Bructosa / uridina diBosBato-)lucosa ;UD4-)lucosa< ;5i). @<.

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Figura 6. /eneración y transporte de azúcares se%al en c$lulas “sumidero”.++- sacarosa sintasa& 7345- invetasa citosólica& 5345- invertasa vacuolar& ,7345-

invertasa de la pared celular .

a sacarosa puede ser iportada / alacenada en la (acuola donde la enzia

in(ertasa (acuolar ;>-'N>< es la a/or Buente intracelular de +e0osas en te&idos en

e0pansi*n. En el apoplasto, la sacarosa e0tracelular es +idrolizada por 4C-'N>

;in(ertasa de la pared celular<, el coponente 8s iportante ue proue(e el

transporte / la captaci*n de az2cares / el anteniiento del )radiente, / por lo tanto lael potencial de asiilaci*n de los te&idos JsuideroK. Estas enzias )eneran altos

ni(eles de )lucosa / Bructosa e0tracelular ue son reco)idos por los transportadores de

+e0osas / ue est8n re)ulados de Bora coordinada con la in(ertasa de la pared celular

;4C-'N>< ;Roitsc+, 9. and Gonz8lez, M.C. !""@<.

E0isten e(idencias de ue el transporte / la +idr*lisis de sacarosa &ue)an un

papel cla(e en la distri%uci*n / la )eneraci*n de señales por az2cares. a aplia

re)ulaci*n por retroalientaci*n de las enzias 'N> / 1U1 por señalizaci*n

por az2cares )enera un sistea de autorre)ulaci*n u/ sensi%le ;Loc+, L. !""@<.

Ade8s de la Botosíntesis / la de)radaci*n de sacarosa / alid*n, es u/

pro%a%le ue la +idr*lisis de los polisac8ridos ue se encuentran en la pared celular

)enere al)2n tipo de señalizaci*n por az2cares. >arias )lucosil-+idrolasas de la pared

celular son inducidas en situaciones de estr3s tales coo la oscuridad, la Balta de az2car,

la senescencia / la inBecci*n ;5u&ii, Q., / cols. !""#I ee, E.., / cols. !""@<.

Asiiso, la disponi%ilidad de nutrientes esenciales coo el nitr*)eno, BosBato /

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sulBato re)ulan a su (ez la señalizaci*n por az2cares ue periten la adaptaci*n de la

planta a la escasez o al e0ceso de nutrientes. os ca%ios diurnos de la disponi%ilidad

de los nutrientes son anticipados por la planta, / la re)ulaci*n circadiana de las enzias

iplicadas en la distri%uci*n del car%ono contri%u/e de Bora si)niBicati(a a un uso

*ptio de los recursos disponi%les. 4or otra parte, estudios recientes +an ostrado

Bundadas e(idencias acerca del papel esencial / crítico de la señal por az2car en la

actual re)ulaci*n diurna de la e0presi*n de los )enes ;lsin), .E., / cols. !""$I Dodd,

A.N., / cols. !""$<.

1.4 El ael de los az-+ares en el desarrollo 8 la adata+*n a;*ental

El descu%riiento del papel de los az2cares coo re)uladores en procesos dedesarrollo / creciiento, independienteente de su iportancia coo Buente de

car%ono, así coo su interacci*n con (ías de señalizaci*n +oronal, +a lle(ado a

considerarlos coo nue(as Bito+oronas ;Rolland et al., !""!%I e*n and 1+een,

!""?I Rolland et al., !""6<.

Coo /a se +a encionado anteriorente, los az2cares odulan procesos

(itales para la planta desde los estadios 8s iniciales, coo la Boraci*n de la

seilla, +asta los 2ltios estadios, coo la senescencia. 4or otra parte, la

)erinaci*n retardada por )lucosa es dependiente de AA, pero no causada por un

increento en su concentraci*n ;Deers et al., !""@<. as relaciones entre el 8cido

a%scísico ;AA< / )lucosa son cople&as pues dependen de sus concentraciones así

coo del estado de desarrollo de la planta, lo cual su)iere ue e0isten (arias de (ías

de señalizaci*n especíBicas ;Rolland et al., !""6<. El suinistro de az2cares

proue(e la Bloraci*n en condiciones de oscuridad / la adici*n en el edio de un #

de sacarosa resta%lece el Benotipo de Bloraci*n tardía de uc+os )enes ;Rold8net al.,#FFF<. Esta Bunci*n de los az2cares coo re)uladores en procesos de

reproducci*n es ta%i3n cople&a, pues e0isten de nue(o (ariaciones en las

respuestas se)2n la concentraci*n utilizada.

A lo lar)o de la (ida de la planta, 3sta se enBrenta a situaciones ad(ersas coo

es la Balta de nutrientes, / de%e responder parando su creciiento / rediri)iendo su

eta%oliso +acia procesos ener)3ticaente enos costosos para poder so%re(i(ir

;Contento et al., !""@<. Muc+as situaciones de estr3s a%iental coo la seuía,

11




el Brío o la salinidad pro(ocan alteraciones en el eta%oliso de car%o+idratos

;Pare et al., #FFI 9+oas+o7,#FFFI Oanner and untila ,#FFFI Laur et al. ,!"""<, /

la (ía de señalizaci*n por az2cares interacciona con (ías de estr3s con el Bin de

odular el eta%oliso.

4or 2ltio, en la Base Binal del ciclo %iol*)ico, coo es el período de

senescencia de la +o&a, coincide un auento de az2cares con la %a&ada en el

contenido de cloroBilas / la acti(idad Botosint3tica, ade8s de e0istir una relaci*n

entre la e0presi*n del sensor +e0ouinasa / el proceso de senescencia ;:uirino et al.,

!"""I Dai et al., #FFF<.

1.( Tre?alosa: ol9+ula se)al

a tre+alosa es un disac8rido copuesto por dos ol3culas de )lucosa ue se

sintetiza en una reacci*n con dos pasos secuenciales en el cual la tre+alosa-6-BosBato

;964< es sintetizada a partir de la )lucosa-6-BosBato ;G64< por la acci*n de la enzia

tre+alosa BosBato sintasa ;941< / ue a continuaci*n es desBosBorilada )racias a la

tre+alosa-6-BosBato BosBatasa ;944<. a tre+alosa-6-BosBato ;964< es un interediario en

la ruta de %iosíntesis de tre+alosa en %acteria, +on)os, in(erte%rados / plantas

;Ca%i%, E. and eloir, .5. #F$<. En le(adura, la 964 es una ol3cula señal esencial

in(olucrada en la re)ulaci*n de la entrada de )lucosa / Bructosa en la )luc*lisis

in+i%iendo la acti(idad +e0ouinasa ;l8zuez, M.a., / cols. #FF?<. 1al(o en el caso de

al)unas plantas ue usan la tre+alosa coo edio para so%re(i(ir a condiciones

e0treas de desecaci*n ;'turria)a, G., / cols. !"""<, la a/oría de las an)iosperas,

entre ellas A. thaliana, contienen peueñas cantidades de tre+alosa. 1in e%ar)o, se

+an encontrado e(idencias del iportante papel de esta ol3cula en el eta%oliso de

las plantas. Ade8s, la e0presi*n inducida de la proteína 941 en estas isas plantas pro(oca un retraso en el desarrollo (e)etati(o, siendo incapaces de Blorecer cuando la

941 no se induce a lo lar)o de todo el desarrollo ;(an Di&en, A..P., / cols. !""@<. os

eBectos o%ser(ados cuando se so%re e0presa la proteína 941 o 944 en A. thaliana

indican ue los ca%ios en los ni(eles de 964 son los responsa%les de los Benotipos de

las plantas utantes 8s ue la tre+alosa en sí isa ;1c+luepann, P., / cols. !""?<.

Ade8s, el papel de la 964 toa rele(ancia /a ue se +a copro%ado ue los ni(eles de

transcritos de 941 tanto coo de 944 en A. thaliana responden a los ca%ios en elcontenido de az2cares ;4rice, ., / cols. !""@I 1c+ei%le, O.R., / cols. !""@I

12




1c+luepann, P., / cols. !""@aI 9+i, ., / cols. !""@<. a so%ree0presi*n de Bora

constituti(a de 941 en plantas de A. thaliana supera la in+i%ici*n de la )erinaci*n por

eBecto de altas concentraciones de )lucosa o AA, / Ba(orece el creciiento en

un edio con una alta concentraci*n de sacarosa ;1c+luepann, P., / cols. !""?I

1c+luepann, P., / cols. !""@a<. 4or otra parte, la so%ree0presi*n de At941 ;A(once,

N., / cols. !""@%< o la adici*n de tre+alosa ;1c+luepann, P., / cols. !""@a< altera la

e0presi*n de otros )enes ue responden a az2cares. El )enoa de A. thaliana

contiene ## )enes ue codiBican para 941, al)unas de ellas son BosBoriladas por la

proteína 1nRL-# o por uinasas dependientes de calcio o pueden interaccionar con

proteínas #@-?-?I estando estos procesos aBectados por el contenido de az2cares de la

c3lula ;Moor+ead, G., / cols. #FFFI Glinsi, M. and Oec7ert+, O. !""$<. 9odos estos

datos indican ue e0iste una re)ulaci*n transcripcional de 964 en plantas dependiente

del contenido en az2cares así coo una re)ulaci*n post-transduccional de las enzias

941 / 944.

tro ne0o de uni*n entre el eta%oliso del car%ono / la 964 es la proteína

AD4-)lucosa piroBosBorilasa ;AG4asa<, dado ue se +a o%ser(ado ue si cloroplastos

aislados se incu%an con %a&as concentraciones de 964 la AG4asa es acti(ada

ediante la reducci*n de un puente disulBuro ;re)ulaci*n redo0< ;Lol%e, A., / cols.

!""$< entre las dos su%unidades peueñas de la enzia ;5u, Q.., / cols. #FF<, lo ue

reBuerza el papel de 964 en la acti(aci*n de la síntesis de alid*n ;unn, .E., / cols.

!""6<. Así, se puede considerar ue la 964 es un disac8rido ue Bunciona coo una

ol3cula señal ue es capaz de counicar al cloroplasto el ni(el de sacarosa del citosol.

Ade8s de estas propiedades, la tre+alosa-6-BosBato est8 asociada con la e0presi*n de

1nRL# ;1c+luepann, P., / cols.!""@%< / con el Bactor A'@ ;A(once, N., / cols.

!""@aI Raon, M., / cols.!""< ue re)ula la ruta de señalizaci*n de AA.

1.5 &z-+ares >os>or*lados +oo ol9+ulas se)al

os az2cares son detectados en el edio e0tra- o intracelular ediante la

interacci*n de una ol3cula de az2car con una proteína, produci3ndose así una señal.

Esta señal es el inicio de una cadena de reacciones ;JcascadaK de reacciones< en

13




respuestas celulares tales coo la alteraci*n en la e0presi*n o en la acti(idad

enzi8tica.

a señalizaci*n por parte de los az2cares aBecta a todas las etapas de la (ida de la planta desde la )erinaci*n, durante el creciiento (e)etati(o / el desarrollo

reproducti(o / +asta Boraci*n del Bruto.

@eAou*nasa

a +e0ouinasa ;PSL< es la enzia ue cataliza la priera reacci*n de la (ía

)lucolítica la BosBorilaci*n de la )lucosa ;/ cualuier +e0osa en )eneral< a )lucosa 6-BosBato, con el consuo de una ol3cula de A94I / es el sensor de )lucosa 8s

conser(ado en le(aduras, aíBeros / plantas ;Moore, ., / cols. !""?I Oilson, .E.

!""?I Dentin, R.. !""@I Moreno, 5., / cols. !""$<.

Figura 8. Reacción catalizada por la 9e:o)uinasa

E0isten dos tipos de +e0ouinasas en plantas la PSL tipo A con un p3ptido detr8nsito ue la diri)e al cloroplasto, ientras ue la PSL tipo posee un se)ento de

uni*n a e%rana ;lsson, 9., / cols. !""?<. Ade8s, en A. thaliana, la proteína

AtPSL# es capaz de pasar al n2cleo ;Qana)isa7a, 1., / cols. !""?<. Ade8s de estas

+e0ouinasas, las plantas tienen al)unas Bructouinasas ;+e0ouinasas especíBicas de

Bructosa<, al)unas de las cuales podrían estar in(olucradas en la señalizaci*n por az2car

;4e)o, .>. and 1eeens, 1.C. !"""<.

SnC DSu+rose non>erentat*n3 >a+tor elated C*naseF

14




as proteínas uinasas 1nRLs de plantas est8n relacionadas con la proteína 1nB#

de le(adura / la proteína de aíBeros AM4L ;PalBord, N.G., / cols. !""?<, aunue

e0isten diBerencias en la acti(aci*n de la isas. a acti(idad de estas uinasas est8

controlada por la BosBorilaci*n de un residuo treonina conser(ado en el JloopK de la

su%unidad catalítica. 1in e%ar)o, la re)ulaci*n / la acti(idad de esta enzia en plantas

est8 %ien deBinida e inclu/e la acti(aci*n por sacarosa / la BosBorilaci*n de enzias de

plantas / la acti(aci*n de la síntesis de alid*n en tu%3rculos de patata respecti(aente.

;PalBord, N.G., / cols. !""?<. Dado su papel en el alacenaiento de alid*n, la

presencia de az2cares BosBorilados, especialente la Glucosa-6-BosBato ;G64<, in+i%e la

acti(idad uinasa de 1nRL# ;9oroser, D., / cols. !"""<. Es una proteína +etero3rica

Bruto de la uni*n de la su%unidad catalítica con dos su%unidades, / ue est8n

re)uladas por las +oronas, las señales a%ientales, el tipo celular / de te&ido / el

estadío de desarrollo de la planta, lo ue le conBiere un ecaniso cople&o /

din8ico en la re)ulaci*n de su acti(idad ;Pardie, D.G., / cols. #FF< .

1./ e+etores de e;rana

A pesar de ue uc+os de los coponentes en la (ía de señalizaci*n

por az2cares est8n conser(ados entre le(aduras, aíBeros / plantas, e0isten

diBerencias nota%les, coo el +ec+o de ue la sacarosa es el principal az2car

transportado por las plantas.

a c3lula (e)etal posee diBerentes transportadores de az2cares coo los

transportadores de sacarosa ;1U9s< capaces de transportar sacarosa con diBerentes

aBinidades / ue est8n estructuralente relacionados con los transportadores PS9 /

GU9 de le(aduras / aíBeros, respecti(aente ;Oeise et al., !"""<. En al)unos

te&idos, la sacarosa se +idroliza a )lucosa / Bructosa por una in(ertasa localizada en la

pared celular. a iportaci*n de )lucosa puede realizarse a tra(3s de los

transportadores de onosac8ridos ;194s<, pero no la iportaci*n de Bructosa, cu/o

ecaniso de entrada en la c3lula no est8 claro ;PalBordand4aul, !""?<. 1e +a

su)erido, aunue sin %ase e0periental, ue la e0presi*n de diBerentes 'N>s / 194s

peritiría a la c3lula ca%iar la utilizaci*n de +e0osas coo respuesta a condiciones

a%ientales, iplicando ade8s a los 194s coo ol3culas sensoras de +e0osas

15




;1+ersonetal., !""?<. tro de los receptores e0tracelulares identiBicados recienteente

es la proteína G +eterotri3rica ;4erBus-ar%eoc+etal.,!""@<, iplicada en el control

de la )erinaci*n / el desarrollo de la seilla.

En plantas s*lo e0iste una proteína G, denoinada G4A# en A. thaliana. Estas

proteínas est8n iplicadas en una )ran (ariedad de procesos relacionados con el

desarrollo, la luz, los BosBolípidos, respuesta Brente a +oronas, estr3s o0idati(o /

resistencia Brente a pat*)enos ;4erBus-ar%eoc+, ., / cols. !""@<. a proteína G4A#

interacciona con un receptor acoplado a proteínas G ;GCR#< / con un re)ulador de la

acti(idad de la proteína anterior ;RG1#< ue re)ula ne)ati(aente el receptor GCR#,

acelerando su acti(idad G94asa. En concordancia con estos resultados, un enor

contenido en RG1# auenta la acti(idad de G4A#, lo ue resulta en un auento en la

elon)aci*n de los +ipocotilos en la oscuridad / un increento en la di(isi*n celular en

las raíces culti(adas en luz ;C+en, .G., / cols. !""?<. Ade8s, una in+i%ici*n de la

proteína RG1# +a ostrado una la insensi%ilidad a altas concentraciones de )lucosa

;6<, en plantas trans)3nicas, ientras ue ni(eles a/ores a los norales pro(oca el

eBecto contrario ;C+en, .G., / cols. !""?I C+en, .G. and ones, A.M. !""@<. Paciendo

uso de diBerentes an8lo)os de az2cares, se +a su)erido ue el papel de la proteína

AtRG1# es independiente de la ruta de señalizaci*n de la PSL ;C+en, .G. and ones,

A.M. !""@<.

tros sisteas pro%a%les de detecci*n de )lucosa o sacarosa en plantas

podría in(olucrar a proteínas an8lo)as a los transportadores de az2cares de le(adura

1nB? / RG9! ;alonde, 1., / cols. #FFF<. a proteína 1nB? detecta %a&as

concentraciones de )lucosa, ientras ue RG9! detecta altas concentraciones de

)lucosa. En e0perientos en los ue se +a utado al)una de estas dos proteínas se +a

copro%ado ue se desencadena una cascada de señales en ausencia de )lucosa ;zcan,

1., / cols.#FF6< ;Bi)ura 6<.

16




Figura ;. <s)uema de los elementos implicados en la se%alización de azúcares en lasc$lulas vegetales. /lc- glucosa& /;,- glucosa;fosfato& 9=>- 'e:o)uinasa& +ac- sacarosa&

?,+- tre'alosa fosfato sintasa& ?,,- tre'alosa fosfato fosfatasa& ?;,- tre'alosa;fosfato& ?re-

tre'alosa.

El +o*lo)o al transportador de sacarosa de A. thaliana / toate 1U9!, sin

acti(idad transportadora detecta%le, tiene un doinio citoplas8tico con alta +oolo)ía

estructural a 1nB?HRG9! lo ue su)iere ue las proteínas +o*lo)as a 1U9! ta%i3n

podrían tener un papel en la detecci*n de sacarosa ;arer, ., / cols. !"""<.

1.7 Me+an*sos de er+e+*n 8 transdu++*n de la se)al de az-+aresen lantas

Una (ez la )lucosa +a entrado en la c3lula, la PSL &ue)a un papel Bundaental en

la percepci*n / la transisi*n de la señal por az2cares. A pesar de ue /a en los años

F" e0istían e(idencias de la Bunci*n dual de la PSL en plantas, no se deostr*

claraente ue la PSL esta%a asociada a la percepci*n / señalizaci*n de az2cares

+asta un tra%a&o de Moore et col. En el año !""?, en el ue ediante uta)3nesis con

uno de los )enes PSL, se o%tu(o una enzia ue retenía la Bunci*n de señalizaci*n,

pero no la acti(idad catalítica. os estudios con ni(eles alterados de PSL, o con la

PSL +eter*lo)a de le(adura, +an peritido distin)uir / deBinir tres (ías de

señalizaci*n por )lucosa en plantas ;1+een et al., #FFF<, ue se detallan a

continuaci*n

1F na =ía @HC *ndeend*ente, por la ue se re)ula la e0presi*n de )enes coo

A1N#;Aspara)ina sintasa< o T-AMQ ;T-ailasa<, entre otros.

17




2F na =ía @HC 8 3lu+l*s*s deend*ente, ue reuiere la acti(idad catalítica de

PSL. os eta%olitos interediarios coo la )lucosa 6-BosBato ;9oroser et al, !"""<

o el acetato ;1+een et al., #FF"< podrían ser los responsa%les de transitir la señal de

az2cares. Mediante esta (ía se inducen los )enes 4R# / 4R$.

4F na =ía @HC deend*ente, *ndeend*ente de la a+t*=*dad u*nasa , ue re)ula la

e0presi*n de )enes CA ;proteína de uni*n a cloroBila a H%< o NR# ;nitrato reductasa

#<.

Coo podeos o%ser(ar en la Bi)ura , se conocen al)unos de los eta%olitos

ue pueden )enerar la señalizaci*n coo son la )lucosa, la tre+alosa-6-4, la sacarosa

o el eta%olito AM4, es un indicador del estado ener)3tico de la c3lula coo secoentar8 8s adelante. a proteína PSL tiene un papel iportante coo sensor de

los az2cares disponi%les, / ade8s de las /a caracterizadas PSL# / PSL!, el )enoa

de A. thaliana codiBica para otras cuatro +e0ouinasas ;PS de +e0oinaselie<

;Rolland et al, !""6<. a distri%uci*n de PSL / PS en diBerentes copartientos

su%celulares es un claro e&eplo de su participaci*n en diBerentes procesos. Ade8s,

su identiBicaci*n coo coponente en un cople&o ultiproteico asociado a

itocondria es un indicador de la optiizaci*n entre la disponi%ilidad de sustrato /la coordinaci*n entre el eta%oliso / la deanda.

18




Figura @. !odelo de se%alización por glucosa en la c$lula vegetal. (a* <lsensor 'e:o)uinasa (9=>* se encuentra principalmente asociado a mitocondria pero tam#i$n en núcleo& citosol y plastidios. (#* <n la mem#rana plasmAtica se

encuentran diferentes transportadores de disacAridos y 'e:osas )ue tam#i$n podrían funcionar como sensores. Ba sacarosa altera de manera especíCca lae:presión de factores de transcripción a trav$s de un mecanismo desconocido.(c* Bos receptores R/+1/7R1 asociados a proteína / actuarían posi#lemente enuna vía 'e:o)uinasa independiente. (d* <l complejo +nR>1 juega un papelcentral en la transducción de se%al fosforilando y modulando varios enzimas& y regulando la e:presión g$nica. (e* Ba tre'alosa tam#i$n tiene un papelse%alizador& aparentemente doDnstream de +nR>1. Bas "ec'as discontinuasindican interacciones no conCrmadas. daptado de Rolland et al.& 2EE; y 9alfordand ,aul& 2EE

1. Intera++*n de las =ías de se)al*za+*n de az-+ares +on =ías ?oronales

De%ido al iportante / cople&o papel ue &ue)an los az2cares en el control

del eta%oliso de la planta durante s u desarrollo, parece l*)ico ue

interaccionen con otras (ías de señalizaci*n +oronal, para así inte)rar de una

Bora 8s *ptia las condiciones Bisiol*)icas, los estíulos a%ientales / los

reueriientos de los diBerentes *r)anos / te&idos. En la 2ltia d3cada, estudios

)en3ticos de utantes de A. thaliana aBectados en la respuesta a az2cares, +an

re(elado nuerosas cone0iones entre la (ías de señalizaci*n por az2cares / las (ías+oronales cl8sicas, particularente la del AA / el etileno. Entre las estrate)ias

19




se)uidas para el aislaiento de estos utantes destacan las ue se %asan en el eBecto

de altas concentraciones de az2car en el edio, durante el desarrollo de la pl8ntula, o

en el ca%io en la e0presi*n de )enes de respuesta a az2cares ;Roo and e(an,

!""?<. 1e)2n su respuesta, estos utantes se +an clasiBicado en diBerentes )rupos ue

se resuen en la ta%la #.

?a#la1. Resumen de diferentes escrutinios realizados para la o#tención de

mutantes en la respuesta a azúcares. daptada de Roo and Gevan& 2EE.

20




a caracterizaci*n e identiBicaci*n de estos utantes +a re(elado nuerosas

cone0iones entre (ías +oronales, al deostrarse ue uc+os de ellos son al3licos a

utantes /a caracterizados de (ías +oronales coo la del AA. Así,

utantes insensi%les a )lucosa coo gin5 o gin6 +an resultado ser alelos de )enes de

%iosíntesis o de respuesta a AA ;AA? / A'@, respecti(aente< ;Arenas-Puertero

et al., !"""<. El etileno tiene ta%i3n (arias cone0iones con esta entraada (ía de

señalizaci*n. An8lisis epist8ticos sit2an a G'N#HAA! a)uas a%a&o del receptor de

etileno E9R# ;+ou et al., #FF<. 4or otra parte, el utante gin2 es relati(aente

insensi%le a au0inas / los utantes resistentes a au0inas axr1, axr2 y tir1 son

insensi%les a altas concentraciones de )lucosa. Callos de gin2 son

ade8s +ipersensi%les a citouininas, independienteente de la señalizaci*n por

etileno. os Benotipos de insensi%ilidad a )lucosa de plantas con una respuesta

constituti(a a citouininas conBira los eBectos anta)onistas de la )lucosa / las

citouininas ;Rolland et al., !""6<. En la Bi)ura se uestra un odelo de la (ía de

señalizaci*n por az2cares / su interacci*n con otras +oronas, adaptado de Rolland

et al., ;!""6<.

Figura H. !odelo de las interacciones entre la vía de se%alización por azúcares y otras vías 'ormonales deducidas a partir de estudios gen$ticos conmutantes de . t'aliana. Ba se%alización por glucosa a trav$s del sensor 'e:o)uinasa (9=>* induce la e:presión de genes de #iosíntesis y repuestas a G atrav$s de un incremento en esta Cto'ormona. Ba glucosa converge de manera

antagonista con la vía del etileno regulando la esta#ilidad del factor detranscripción <34. Ba vía dependiente de 'e:o)uinasa interacciona positivamente y negativamente con au:inas y cito)uinas& respectivamente. Bas

21




cone:iones 'ipot$ticas se se%alan con "ec'as punteadas. daptado de Rolland et al.& (2EE;*.

9oda esta red de interacciones, en la ue toda(ía uedan uc+os coponentes

por descu%rir, / en la ue se inte)ran señales intrínsecas / e0trínsecas, es pro%a%leente la responsa%le de la plasticidad durante el desarrollo / el creciiento

de las plantas.

as 2ltiples Bunciones ue los az2cares son capaces de re)ular, la

especiBicidad ue e&ercen en diBerentes te&idos / estadios, así coo su interacci*n

con otras (ías de señalizaci*n reuiere a su (ez 2ltiples sensores, transportadores,

proteínas re)uladoras /, pro%a%leente ensa&eros secundarios coo el Ca!V

capaces de transitir la señal / otor)ar una respuesta, ue perita a la planta

adaptarse a la nue(a situaci*n a tra(3s del control de su eta%oliso. En plantas, los

coponentes de estas (ías no est8n tan %ien identiBicados coo en le(adura, /

uc+os de ellos se +an caracterizado por analo)ía con el sistea de le(adura.

22



''. 9ra%a&o Bin de M8ster !. Mecanisos oleculares en la re)ulaci*n por az2cares

8. M"*/&i)9%) 9%"*:/'")

"& / '"g:/*i4& 6%'

/35*/'")

23




2.1 $*>erentes utas de Se)al*za+*n

1e pueden distin)uir tres tipos de transducci*n de señales dependiente de

)lucosa en plantas en Bunci*n de la enzia PSL ;Siao, O., / cols. !"""<. En la prieraruta la e0presi*n de los )enes est8 ediada por la acti(idad señalizadora de la PSL. El

papel principal de esta ruta es la de repriir la e0presi*n de )enes ue participan en la

Botosíntesis ;Siao, O., / cols. !"""I Moore, ., / cols. !""?<. a se)unda ruta es

dependiente de la )lic*lisis coo sucede en el caso de la inducci*n por )lucosa de los

)enes 4R# / 4R$ ;4at+o)enesis-Related )ene< ;Siao, O., / cols. !"""<. 4or 2ltio,

e0isten e(idencias de re)ulaci*n por )lucosa sin la participaci*n de la enzia PSL,

coo resulta en las inducciones de los )enes chs ;c+alcone s/ntase< , pal# ;Benilalanina

aonio-liasa< / los )enes ue codiBican para la enzia AG4asa / la represi*n de as#

;aspara)ine s/nt+etase< cu/a e0presi*n es independienteente de los ni(eles de la

enzia AtPSL ;Siao, O., / cols. !"""<.

Ade8s de estas tres rutas de señalizaci*n para el caso de la )lucosa, e0iste una

ruta de señalizaci*n especíBica para la sacarosa iplicando la e0istencia de, al enos,

un sistea de señalizaci*n de disac8ridos en la e%rana celular ;oreti, E., / cols.

!"""I 5ernie, A.R. and Oillitzer, .!""#I Atanasso(a, R., / cols. !""?I 9iessen, A., /cols. !""?<.

2.2 "ontrol trans+r*+*onal 8 osttrans+r*+*onal

Un )ran n2ero de )enes son re)ulados transcripcionalente por az2cares, en

relaci*n con la re)ulaci*n ue e0iste entre las acti(idades eta%*licas de los te&idos

JBuenteK / los te&idos JsuideroK. Al)unos )enes ue participan en la )eneraci*n de

señales de az2cares son re)ulados por retroalientaci*n por sus propios productos.

Ade8s, cuando los ni(eles de az2cares son altos, se induce el alacenaiento de

car%o+idratos a tra(3s de la síntesis de alid*n Ba(oreciendo la e0presi*n de la

enzia AG4asa ;Cre(ill3n, 4., / cols. !""$<. 9anto la BosBorilaci*n o desBosBorilaci*n

para esta%ilizar las proteínas, coo la re)ulaci*n redo0 est8n sur)iendo coo un

ecaniso iportante en el control post-transduccional del eta%oliso de los

az2cares de la planta. ;9iessen, A., / cols. !""?<. Es conocida la acti(aci*n re(ersi%le de

(arias enzias Botoinduci%les del cloroplasto (ía re)ulaci*n redo0.

2.4 Esta;*l*dad del trans+r*to 8 ro+esa*ento.

24




os az2cares no solo controlan la e0presi*n / el contenido de ARN a ni(el

transcripcional sino ta%i3n a ni(el post-transcripcional. a represi*n del )en de

arroz β-Amy3 iplica una re)ulaci*n tanto a ni(el transcripcional coo a ni(el de

la esta%ilidad del ARN. E0isten secuencias especíBicas en la re)i*n ?WU9R de los

transcritos ue pueden controlar la esta%ilidad del ARN por edio de az2cares ;C+an,

M.9. and Qu, 1.M. #FF<. Cuando se utiliza un a)ente ue %louea el proceso de la

transcripci*n ;actinoicina D< para estudiar la (ida edia de ARN, se +an podido

detectar otros )enes iplicados en procesos de respuesta Brente a estr3s / relacionarlos

con el creciiento de la planta / cu/a esta%ilidad de las ol3culas de ARN est8

controlada por los az2cares ;Po, 1., / cols.!""#<.

2.( Tradu++*n

El ecaniso de re)ulaci*n de los az2cares a este ni(el iplica la presencia de

un icro arco a%ierto de lectura ;R5< en la secuencia $WU9R del )en ue aBecta

positi(aente, o ne)ati(aente, en la traducci*n de la secuencia codiBicante ue se

encuentra a)uas a%a&o. Un e&eplo de este caso es la transcripci*n de los Bactores trans

de clase 1 del tipo %'4 A9!H%'4## de A. thaliana ue presentan una secuencia $

WU9R anoralente lar)a / ue son estiulados tanto por la luz coo por

az2cares, pero su posterior traducci*n es repriida ante ni(eles altos de sacarosa ;Roo,

5., / cols. #FF<. El control de estas secuencias icro R5 por la sacarosa est8

conser(ado en otros Bactores de transcripci*n relacionados con procesos de deBensa

Brente a estr3s / con la e0presi*n de +oronas, lo ue indica ue este tipo de re)ulaci*n

est8 )eneralizado en los Bactores de transcripci*n de plantas %'4 ;Oiese, A., / cols.

!""@<.

2.5 Esta;*l*dad rote*+a

Una (ez ue la proteína +a sido sintetizada, su acti(idad puede ser re)ulada de

uc+as aneras, / una de ellas es por el control de su esta%ilidad a tra(3s de la

proteolisis. a )lucosa es capaz de contrarrestar los eBectos del etileno auentando la

de)radaci*n del re)ulador transcripcional E'N? en el n2cleo ediada por proteosoa;Qana)isa7a, 1., / cols. !""?<, ientras ue el etileno auenta la esta%ilidad de dic+o

25




Bactor ;Qana)isa7a, 1., / cols. !""?I Ga)ne, .M., / cols. !""@<. Curiosaente, la

acti(idad de la )lucosa so%re el Bactor E'N? es dependiente de la acti(idad uinasa de

AtPSL# ue est8 presente en el n2cleo. El proteosoa es capaz de odular uc+as

uinasas dependientes de ciclinas ;1alle, . and >ierstra, R.D.!""@<, coo la ciclina

tipo D CQCD?I#, ue es transcripcionalente re)ulada por az2cares peritiendo la

transici*n G#H1 en el ciclo celular ;Riou-L+alic+i, C., / cols. !"""<, es una proteína

u/ inesta%le / es de)radada por el proteosoa cuando es BosBorilada en condiciones

de ni(eles reducidos de sacarosa ;4lanc+ais, 1., / cols. !""@<.

26



''. 9ra%a&o Bin de M8ster 3. Arabidopsis thaliana

3. Arabidopsis thaliana

3.1 Arabidopsis thaliana

27




Arabidopsis thaliana es una planta peueña ;Bi)ura F< ue se utiliza apliaente

coo un or)aniso odelo en %iolo)ía (e)etal. A. thaliana es un ie%ro de la

Bailia de la ostaza ;rassicaceae<, ue inclu/e las especies culti(adas coo la col /

el r8%ano. Arabidopsis no es de )ran iportancia a)ron*ica, pero oBrece (enta&as

iportantes para la in(esti)aci*n %8sica en la )en3tica / la %iolo)ía olecular.

Es una planta ue puede edir entre diez /

treinta centíetros de altura sin incluir la raíz.

En la %ase tiene una roseta de +o&as anc+as

ientras ue en el tallo las +o&as son 8s

del)adas / alar)adas. as Blores son u/

peueñas / +eraBroditas ;con *r)anosreproductores asculinos / Beeninos< de

color %lanco ue se a)rupan Borando

peueños )rupos de Blores o inBlorescencias. El

Bruto es una silicua de un par de centíetros de

lar)o / dos ilíetros de anc+o, ue puede lle)ar a contener cerca de treinta seillas.

Xstas se dispersan a tra(3s del (iento al a%rirse la silicua adura.

Coparte Bailia con un aplio a%anico de especies de inter3s a)rícola coo lacol ; rassica oleracea<, el na%o ; rassica nap!s< o el r8%ano ; "aphan!s sati#!s< /

culinario coo la ostaza ; rassica campestris<, la ostaza %lanca ;1inapis al%a< / la

ne)ra ; rassica nigra<. 9a%i3n est8 eparentada con la r2cula ; $r!ca #esicaria<, s*lo

por citar al)unos e&eplos de la aplia Bailia de las %rasicaceas a la ue pertenece A.

thaliana. Dentro del )3nero Ara%idopsis, se a)rupan F especies / su%especies.

Ara%idopsis es una planta cosopolita ue se encuentra distri%uida en todos los

continentes, si %ien es poco a%undante en Asia / YBrica, / escasa en al)unas re)iones de

A3rica. En clias c8lidos / teplados, se la encuentra en prados, 8r)enes de caino

o terrenos a%andonados. 1e +an identiBicado cientos de (ariedades con diBerencias en la

Bora, el creciiento o el tiepo de Bloraci*n, coo adaptaci*n a las condiciones

a%ientales.

1u ciclo de (ida es corto, )eneralente inBerior a un año, aunue en el

la%oratorio se puede copletar en un período de entre seis a oc+o seanas. En clias

teplados esta planta Blorece entre los eses de Be%rero / &unio. a Blor es el *r)ano

28

5i)ura F. Arabidopsis thaliana




reproducti(o / contiene los esta%res ;aparato asculino< / los carpelos ;aparato

Beenino<. El )rano de polen se une al *(ulo, situado en el o(ario, / de la Becundaci*n

resulta la seilla. Cuando el Bruto est8 preparado, se a%re / dispersa las seillasI lle)an

al suelo / se antienen en estado duriente +asta ue las condiciones a%ientales son

las adecuadas para la )erinaci*n, dando lu)ar a una nue(a planta.

4.2 Mutantes de Arabidopsis thaliana

Una t3cnica ue perite introducir )enes Bor8neos en las c3lulas (e)etales / su

inte)raci*n de Bora esta%le en el )enoa, utiliz8ndose la %acteria Agrobacteri!m

t!me%aciens. Esta t3cnica se counic* en #F6 / Bue u/ %ien reci%ida por la

counidadI en pocos años, se perBeccion* / o%tu(o un aplio a%anico de utantes u/2tiles para in(esti)ar las Bunciones de los )enes en los procesos de desarrollo de la

planta.

a %acteria Agrobacteri!m t!me%aciens era conocida en el 8%ito cientíBico por

causar tuores en las plantas )racias a su +a%ilidad de transitir 8cido

deso0irri%onucleico ;ADN<. Esta propiedad Bue apro(ec+ada para introducir nue(os

)enes de inter3s de Bora controlada. 'nicialente se tra%a&* con culti(os de te&idos

;+o&as o raíces< ue eran inBectados con la %acteria. M8s adelante, se perBeccion* la

t3cnica para no depender de los culti(os. a idea era suer)ir las inBlorescencias en una

soluci*n acuosa ue contu(iese la %acteria ;adecuadaente odiBicada con el )en de

inter3s< de anera ue la planta podía incorporar la odiBicaci*n a su )enoa /

transitirla a la descendencia a tra(3s de las seillas transBoradas. Esta t3cnica

perite o%tener B8cilente una )ran cantidad de plantas trans)3nicas portadoras de la

utaci*n o de la resistencia deseada

os utantes con los ue se +a tra%a&ado en este tra%a&oHpro/ecto de

in(esti)aci*n Bin de aster son los si)uientes

a;*(

El Bactor de transcripci*n AA 'N1EN1'9'>E @ ;A'@<, descu%ierto +ace casi

#" años, &ue)a un papel central en una (ariedad de Bunciones en las plantas, inclu/endo

las respuestas de az2car. a odulaci*n de la e0presi*n )3nica es uno de los principales

ecanisos de la re)ulaci*n del az2car en las plantas. 1in e%ar)o, los Bactores detranscripci*n iplicados en la re)ulaci*n de las respuestas de az2car / su papel durante

29




la cascada de transducci*n de señales si)uen estando al deBinidas. 9a%i3n es

iportante para la e0presi*n ediada por la )lucosa de los )enes abi5 / s%e!.!.

Estudios anteriores encontraron ue A'@ Bunciona coo un represor transcripcional de

)enes re)ulados por az2cares, por lo tanto, este Bactor de transcripci*n es una proteína

(ers8til con Bunciones duales para la odulaci*n de la e0presi*n )3nica.

%o+us: &T5G4/2/0 Daep-1F

Descripci*n 4roteína de la Bailia aspartil proteasa eucariota.

5unciones en acti(idad endopeptidasa de tipo asp8rtico.

4articipa en prote*lisisI

U%icada en anclada a la e%rana, e0presado en estructuras de la planta, etapa

polen aduro, M )erin* etapa polen, @ antesis, la diBerenciaci*n de p3talos / de la

etapa de e0pansi*n.

4roceso iol*)ico in(olucrado la odiBicaci*n del tipo de planta de la pared celular, el

desarrollo del tu%o polínico, el creciiento del tu%o polínico, prote*lisis.

Estructura de la planta e0presada en estructura colecti(a de la +o&a, Blor, p3talo, polen,

c3lulas del tu%o polínico, s3palo ;Bi)ura #"<.

30

Figura 1E. Bugar de e:presión del gen en la planta (iz)uierda*& localización de la proteína en la c$lula (derec'a*




%o+us: &T5G5//0 Dsp30-1F

Descripci*n 4roteína ri%osoal proteína de la Bailia 1?".

5unciones en coponente estructural de los ri%osoas.

4articipa en traducci*n.

U%icada en citosol, peueña su%unidad ri%osoal, ri%osoa.

E0presado en !? estructuras de las plantas, #$ etapas de creciiento

4roceso %iol*)ico in(olucrado RNA etilaci*n , traducci*n.

Creciiento / Etapas del desarrollo e0presado durante etapa de senescencia de @

+o&as , C etapa )lo%ular , D Base %ilateral , E estadio de cotiledones apliado , etapa

e%rionaria adura 5 , etapa polen aduro , 4."! dos +o&as etapa (isi%le , 4."@

cuatro +o&as etapa (isi%le , 4."6 seis +o&as (isi%les etapa , 4." oc+o +o&as etapa

(isi%le , 4.#" diez +o&as etapa (isi%le , 4.#! doce +o&as etapa (isi%le , M )erin*

etapa polen , etapa de Bloraci*n , p3talo diBerenciaci*n / la etapa de e0pansi*n

Estructura de la planta carpelo , +o&a caulinar , estructura colecti(a de +o&as ,

cotiledones , Blor , c3lulas )uardas , +ipocotilo , eristeo de la inBlorescencia , +o&as

8pice , %ase de la l8ina de la +o&a , pedicelo , p3talo , peciolo , e%ri*n de la planta , el

polen , las c3lulas del tu%o polínico , raíces , seillas , s3palo , disparar 8pice , sistea

de lanzaiento , esta%re , tallo , +o&a (ascular ;5i)ura ##<.

31

Figura 11. Bugar de e:presión del gen en la planta (iz)uierda*& localización de la proteína en la c$lula (derec'a*




%o+us: &T230(550 Dlac5F

Descripci*n lacasa, un ie%ro de la Bailia de )enes de lacasa ;# ie%ros enAra%idopsis<.

4roceso iol*)ico in(olucrado proceso cata%*lico de li)nina, proceso de o0idaci*n-reducci*n, respuesta a iones de co%re ;Bi)ura #!<.

5unci*n Molecular con un doinio de uni*n a co%re, +idrouinona acti(idad

o0idorreductasa de o0í)eno.

%o+us:&T23400 Dlac4F

Descripci*n AC@ parece tener acti(idad lacasa %asado en ensa/os enzi8ticos realiz*

utilizando utantes AC@. Estos utantes ta%i3n +an reducido los ni(eles de li)nina.

AC@ se e0presa en los +aces (asculares / Bi%ras / pro%a%leente contri%u/e a la

%iosíntesis de la li)nina, / por lo tanto %iosíntesis de la pared celular, allí. Mutantes

AC@ H ir0#! tienen un Benotipo 0ilea irre)ular le(e.

4roceso iol*)ico in(olucrado %iosíntesis de la li)nina, proceso cata%*lico li)nina,

proceso de o0idaci*n-reducci*n, de tipo (e)etal pared celular secundaria %io)3nesis,

proceso %iosint3tico 0ilano ;Bi)ura #?<.

5unci*n Molecular con un doinio de uni*n a co%re, +idrouinona acti(idad

o0idorreductasa de o0í)eno.

32

Figura 12. Bugar de e:presión del gen en la planta (iz)uierda*& localización de la

proteína en la c$lula (derec'a*




33

Figura 1. Bugar de e:presión del gen en la planta (iz)uierda*& localización de la proteína en la c$lula (derec'a*



'''. 4ro/ecto Bin de 8ster

III. Proyecto fn de máster

34



'''. 4ro/ecto Bin de 8ster #. Materiales / 3todos

1. A!"#IA$"% & '!()(%

35




1.1 Eu*o Instruental 8 ater*ales de la;orator*o

C8ara 1an/o para siulaci*n de ciclo díaHnoc+e. C8ara de Blu&o lainar 9elstar. Pa%itaci*n acondicionada para luz contin2a.

4CR ioetra. Euipo de electroBoresis Mupid-ne de iorad. 9ransiluindor de iorad. pP-etro C/%er1can $#". ector de placas 1unrise.

Autocla(e. Cuarto de reBri)eraci*n ;para estratiBicaci*n<. alanza precisi*n de d Z #). Material de uso co2n en la%oratorio.

1.2 "ult*=o en t*erra de Arabidopsis thaliana

as seillas de Arabidopsis thaliana& ecotipo Colu%ia, se +icieron )erinar

en una ezcla de copostH(ericulita. 1e%radas en seilleros / colocadas en una

%ande&a con a)ua. 9ras ! días en la c8ara de estratiBicaci*n a @[C Bueron culti(adas en

una c8ara de culti(o cu/o Botoperíodo Bue de #6 +oras de luz / +oras de oscuridad,

#!" \olHm¿¿¿

s<, !# - !! [C de teperatura / una +uedad de 6". Desde el oento

ue son se%radas / lle(adas a estratiBicaci*n son tapadas con un pl8sticoI para

antener la +uedad interior +asta (er %ien desarrollados los cotiledones / en ese

oento se retir* dic+o pl8stico.

1.4 Med*o de +ult*=o

4ara el creciiento de pl8ntulas de Arabidopsis in (itro se se%raron en placas

4etri en (arias odalidades

• 4laca 4etri de F" de di8etro, #@,! de altura• 4laca 4etri de F" de di8etro, #@,! de altura con cuatro

di(isiones.• 4laca de pocillos de !@ pocillos Bondo plano / tapa.• 4laca cuadrada #!" 0 #!"

El edio de culti(o se prepara%a con

36




• Medio de culti(o M1 ;Muras+i)e and 1oo), #F6!<.• ME1 ","$ .• 4+/toa)ar al ", .

El pP se a&usta%a a $, con una disoluci*n de LP al # M.

Una (ez preparado el edio era esterilizando en autocla(e a ##" [C / ?" in.

Al edio preparado anteriorente se añade antes de autocla(ar la cantidad

)lucosa, Bructosa, anitol, sacarosa en la concentraci*n necesaria se)2n el e0periento

lo reuiera.

4ara el e0periento con la +orona AA a partir de una soluci*n concentrada

de #"M de AA contenido en un tu%o EppendorB se prepara una disoluci*n #,$

μM en AA en un tu%o 5alcon de @$ l donde se añade @" l de edio M1 licuado

con 6 μL de la concentraci*n de #" M.

os edios una (ez autocla(ados al enBriarse se )eliBican / para poder e0tender

dic+os edios en las placas, +a/ ue introducirlos en el icroondasI a%riendo

le(eente el tap*n / calentaos +asta ue est3 copletaente líuido.

4ara ue todas las placas ten)a la isa cantidad de edio, antes de e0tender el

edio en las placas, con un tu%o 5alcon esterilizado / )raduado de $" l añadios ?"

l del edio / a continuaci*n en las placas 4etri F" de di8etro. 1i la placa 4etri es

de cuatro secciones se realiza i)ualente pero añadiendo ,$ l por secci*n. 4ara las

placas de pocillos se rellenaran con icropipeta / #, $ l por pocillo.

1.( Ester*l*za+*n de se*llas 8 s*e;ra *n =*tro

1e realiza en la c8ara de Blu&o lainar una (ez lipia / esterilizada. Pa/ ue

la(arlas anos con etanol al " antes de epezar a tra%a&ar. 1e coloca en la c8ara

de Blu&o lainar rect8n)ulos de papel de Biltro en n2ero i)ual a la cantidad de líneas de

seillas a esterilizar. Con pul(erizador epapaos dic+o rect8n)ulos de papel de Biltro

/ esperaos a ue se seuen.

as seillas a esterilizar se colocan en un tu%o EppendorB, en prier lu)ar se

esterilizan con una soluci*n de etanol al $" /-9riton-S#"" ",$, a)intando la

37




suspensi*n con las seillas re)ularente durante @ in, transcurrido este tiepo, se

e0trae la soluci*n con icropipeta / se añade etanol al F" +asta itad de tu%o

EppendorB, se la(an unas cuantas (eces / se depositan las seillas so%re los papales

preparados anteriorente.

a sie%ra en las placas con el edio se realiza co)iendo seilla a seilla con

una punta de icropipeta +uedecida en el propio edio, la seilla se ueda en la

punta de icropipeta / la depositaos en la placa con el edio.

as placas con las seillas se lle(an a estratiBicaci*n a @ [C durante dos días, al

ca%o de los cuales se pasan a una c8ara de culti(o 1an/o ;Modelo MR-?$"< con un

Botoperiodo de #6 +oras de luz / +oras de oscuridad, o en una +a%itaci*n de culti(o

con unas condiciones de luz continua a #"" \olH

m¿¿¿

s< de intensidad, !# - !! [C de

teperatura / una +uedad relati(a de 6" .

1.5 e+o3*da de se*llas

4ara la reco)ida de las seillas la silicua de%e de estar de+iscente. 1o%re un

papel de Biltro se coloca la planta en +orizontal so%re el papel / se a)ita le(eente, para

ue cai)an las seillas, una (ez +ec+o esto se +acen pasar por (arios taices, con el Bin

de solo uedarnos con las seillas / eliinar la posi%le tierra / +o&as ue ta%i3n

cai)an al principio. 4or 2ltio )uardaos las seillas en tu%o de EppendorB / se

alacenan en el Bri)oríBico a @[C.

1./ Mutantes de Arabidopsis Thaliana

as líneas utantes de Ara%idopsisI +ooci)otas por inserci*n de 9-DNA,

Bueron o%tenidas de la%oratorios 1al ;'nstitute Genoic Anal/sis a%orator/< / de

GA'-Lat.

os utantes seleccionados para tra%a&ar en este tra%a&oHpro/ecto de

in(esti)aci*n son los si)uientes abi4, lac4 locus At!)?"", lac5 locus At!)"@$$",

aep1 locus At$)?6!6", sp30-1 locus At$)$66"

38




1. Ol*3onu+let*dos

as secuencias de los oli)onucle*tidos utilizados en este tra%a&oHpro/ecto dein(esti)aci*n son los si)uientes son los si)uientes ;ta%la !<

9a%la !. No%re / secuencia de los oli)onucle*tidos utilizados.

No%re li)o nol 1ecuencia $W ?WAC@-#5 ?,! 9ACAAAACAGAG999GCCCAC@-#R @, CCCA9C9CCC9C9C9A9CAC$-$5 $F, GG99ACAGA9ACGACAG9AG9ACCAC$-$R 6,# GCAGGGAGGA9AGGCA9G

AE4-!?5 @,? GGAGGCGAGA9A9GA999CAE4-!?R 6,! AC9GG9GCACAA99AACCC

En las Bi)uras

#@,#$ / #6 podeos

o%ser(ar la situaci*n de

los oli)onucle*tidos para

apliBicar los diBerentes

Bra)entos del prootor

/ la secuencia

nucleotídica de las líneas

utantes seleccionadas

ediante una pol/erase

c+ain reactionI traducido

reacci*n en cadena de la polierasa ;4CR<.

39

Figura 16. <s)uema de la situación de los oligonucleótidos para ampliCcar los diferentes fragmentos del promotor y la secuencia nucleotídica del

lac61 y lac81.




Figura 18. <s)uema de la situación de los oligonucleótidos para ampliCcar los diferentes fragmentos del promotor y la secuencia nucleotídica de <, .

Figura 1;. <s)uema de la situación de los oligonucleótidos para ampliCcar los

diferentes fragmentos del promotor r y la secuencia nucleotídica de mi1I.

6reara+*n de los ol*3os sol*+*tados

os oli)os son suinstrados de la casa 1'GMA, cada uno de ellos (iene en unos

tu%os con una cantidad deterinada ;nol<, a dic+o tu%o se le añadir8 a)ua ili: para

conse)uir la concentraci*n de ",# M, de auí se toara $ μL / se lle(ar8 a un tu%o

de EppendorB &unto con @$ μL de a)ua ili:. El tu%o ori)inal con la disoluci*n se

)uarda en reBri)eraci*n @ [C. Q el EppedorB se rotula / se con)ela a -#[C para +acer

uso de 3l.

1. 6"

1..1 6reara+*n de los eAtra+tos ara la 6"

40




De las plantas se%radas en tierra, se toa una uestra de cada líneaI a ser

posi%le de +o&a, la cual es pesada, por cada ! ? ) de peso de +o&a se añade tap*n

de e0tracci*n de ADN %uBBer #0 ;protocolo r8pido< en un tu%o de EppendorB. 4ara

conse)uir roper la +o&a / producir e&or la lisis de las c3lulas se us* un %astoncillo

esterilizado, con el cual aprieto la +o&a contra las paredes del tu%o. Pasta +oo)enizar

%ien la disoluci*n. Dic+os e0tractos se pueden con)elar a -#[C. 1e tra%a&* con )uantes

desde el prier oento.

1..2 6reara+*n de la d*solu+*n del 6"

4or cada línea utante se prepar* un tu%o de 4CR al cual se le añadi* las

si)uientes cantidades ;ta%la ?<, con sus oli)os respecti(os. a uestra de ADN ue

pro(iene de los e0tractos realizados anteriorente, se añadir8 la 2ltia.

9a%la ?. Reacti(os / (ol2enes utilizados en la 4CR

Reactivo Cantidad en l

por cada tubo de PCR

Cantidad en l

para 3,5 tubos

ADN 1 14

Buffer 5x mytaq 4 1,4

Oligo1 10 µM 0,4 1,4

Oligo2 10 µM 0,4 1,4

LBsalk 10 µM 0,4 0,85

!aq DNA "olimerasa #mytaq$ 0,1 0,%5

Agua mili& 1%, 4,'5

Volumen final 20 31,5

El 4CR se pro)raa con los si)uientes ciclos ;ta%la @<

9a%la @. 4ro)raaci*n de la 4CR.

Nº ciclos Temperaturas Tiempo

1 '5() 5*

35 55 () %0**

1 2() 15*1 4() +-efii-o

41




1..4 6reara+*n de los 3eles de a3arosa ara la ele+tro>ores*s

4ara la preparaci*n de los )eles de a)arosa se us* 9E ;@$ M 9ris %ase, @$

M 8cido %*rico, # M ED9A<. a concentraci*n Binal de a)arosa de%e de ser #,$ .

Añadi3ndose ta%i3n %rouro de etidio a una concentraci*n "]$\)Hl, para poder

(isualizar las %andas de DNA. 1e pes* la cantidad adecuada de a)arosa / se añadi* el

9E se o%tu(o así una suspensi*n de a)arosa seca en pol(o en un tap*n acuoso, tras

lo cual se +izo +er(ir ;icroondas< la ezcla +asta ue la a)arosa se Bundi* / se

con(irti* en una soluci*n transparente. A continuaci*n, se (erti* esta soluci*n en un

olde para )elI con el peine necesario para reproducir los pocillos donde car)areos el

ADN apliBicado de la 4CR / se de&* enBriar a teperatura a%iente +asta ue se

Bor* un )el rí)ido.

as uestras una (ez realizada la 4CR se car)ar*n ;@µL$ en el )el utilizando

tap*n de car)a 9C DNA 8s )el led 60 ^6"M ED9A, #"M 9ris-PCl ;pP .6<,

","? azul de %rooBenol, 6" )licerol_ para Bacilitar la dispensaci*n / e(itar la diBusi*n

de la uestra, así coo (isualizar el Brente. El potencial el3ctrico aplicado

posteriorente, Bue de #"" > durante !" inutos, us8ndose el iso 9E en la cu%eta

de electroBoresis. 1e usa arcador P/peradder #%.

4ara o%ser(ar las %andas ue se +an desplazado en el )el, se us* un

transiluinador siendo la lon)itud de onda aplicada de !$@n.

1. EAtra++*n de az-+ares

El prier paso en el an8lisis del contenido en az2cares solu%les de las uestras

Bue anotar la cantidad de asa de cada una de las uestras. Una (ez ue se +an pesado

cada una de las +o&as, se aceraron con a/uda de un ortero / nitr*)eno líuido. 9ras

acerar las uestras, se añadi* $"" \l de etanol " diluido con tap*n PE4E1-

LP #" M pP ,$, / se incu%* a " [C durante ?" inutos. 9rascurrido ese periodo

de tiepo, se centriBu)* la suspensi*n $ in a #?.""" rp / se to* el so%renadante

42




ue se pas* a un tu%o EppendorB lipio. Despu3s se procedi* de i)ual odo, / se

añadi* $"" \l de etanol " diluido con tap*n PE4E1 / se incu%* otros ?" inutos

a " [C. A continuaci*n se (ol(i* a centriBu)ar en las isas condiciones anteriores /

se (ol(i* a toar el so%renadante. Acto se)uido, se añadi* etanol $" diluido con

tap*n PE4E1 / se incu%* otros ?" in a " [C se centriBu)*. A Continuaci*n en las

condiciones descritas anteriorente / se (ol(i* a toar el so%renadante. 5inalente, se

incu%aron las uestras ?" inutos a " [C con a)ua / se (ol(i* a centriBu)ar / toar el

so%renadante tras la centriBu)aci*n, al i)ual ue en las situaciones anteriores. El

so%renadante recolectado es utilizado para las ediciones / se puede conser(ar a @[ C.

1.10 $eter*na+*n del +onten*do de az-+ares solu;les

El an8lisis de los az2cares se %asa en una reacci*n enzi8tica 2ltiple en la ue

participa la +e0ouinasa acoplada a la enzia )lucosa-6-BosBato-des+idro)enasa

;G64GD< ue da lu)ar a la producci*n de NAD4P / se puede edir a ?@" n de

lon)itud de onda. 4ara el an8lisis de az2cares solu%les en los te&idos de +o&as, se utiliz*

un (oluen de $" \l del (oluen del e0tracto. 1e prepar* la ezcla de reacci*n con

#?,# l tap*n #"" M PE4E1-LP pP ," / ? M

MgCl2

/ ,6 ) denicotinaida adenina dinucle*tido BosBato ;NAD4< ;1'GMA N"$"$<, #?,# ) A94 /

#?,# \l G64GD.

1e prepar* una placa de F6 pocillos icrolite, so%re la ue se lle(* a ca%o las

ediciones, las uestras con los (ol2enes descritos anteriorente / se coloc* en un

lector de placas, se idi* la (ariaci*n en la a%sor%ancia a ?@" n, utilizando la lon)itud

de onda de reBerencia a @"$ n. Una (ez copletado los ##" ciclos de edida, se

añadieron $ ` a cada pocillo, de disoluci*n preparada con !,@ ` de +e0ouinasa con

?!6,6 ` de#"" M PE4E1-LP pP ," / ? M MgCl2 a cada celda. 1e esper* a

pasaran otros ##" de edia para añadir a cada pocillo $ ` una disoluci*n preparada

con !,@ \) de BosBo)lucoisoerasa en ?!6,66 ` de#"" M PE4E1-LP pP ," / ?

M MgCl2 . 9ras otros ##" ciclos de edici*n, se añadi* Binalente $ ` a cada

pocillo de enzia in(ertasa preparada con ","!@ ) de dic+a enzia / ?$$ ` de#""

43




M PE4E1-LP pP ," / ? M MgCl2 , esperando despu3s los 2ltios ##" ciclos

de edidas. os datos son reco)idos auto8ticaente en una +o&a de c8lculo de E0cel.

1.11 e+ursos onl*ne

os recursos on-line utilizados para o%tener la inBoraci*n %i%lio)r8Bica son

• +ttpHH777.nc%i.nl.ni+.)o(H• +ttpHH777.eez.csic.es

ases de datos cientíBicas

• +ttpsHH777.ara%idopsis.or)H• 9+e European Ara%idopsis 1toc Centre uNA1C ;+ttpHHara%idopsis.inBoH<

44

http://www.eez.csic.es/

https://www.arabidopsis.org/

http://www.eez.csic.es/

https://www.arabidopsis.org/



'''. 4ro/ecto Bin de 8ster !. Resultados

8. R"):#/-%)

45




2.1 "ontroles os*t*=o 8 ne3at*=o

4ara (eriBicar la resistencia o sensi%ilidad a diBerentes az2cares de las líneas

utantes pre-seleccionadas para este tra%a&o, utilizareos un control ne)ati(o, la

(ariedad Col" de Arabidopsis thaliana sil(estre ;en adelante reBerida coo sil(estre oO9< / control positi(o, el utante abi4-1 en un Bactor de transcripci*n ue Bora parte

de un ecaniso AA-dependiente de señalizaci*n por az2caresI a%as líneas

coparten el iso Bondo )en3tico ue los utantes analizados en este tra%a&o. A

diBerencia de la (ariedad sil(estre, el utante abi4-1 capaz de desarrollarse en presencia

de +asta ?$ M ;< de )lucosa ;Bi)ura #<.

Figura 1@. Resistencia a glucosa de J? vs a#i 61

2.2 es*sten+*a a >ru+tosa

4ara analizar la resistencia a Bructosa / deterinar si esta resistencia seria especiBica

de este az2car. Dstintas (ariedades Bueron se%radas en placa de cuatro secciones en

edio M1, dic+o edio de culti(o supleentado con concentraciones crecientes deBructosa / )lucosa al ?, @,$ / .

El e0periento se lle(* a ca%o en condiciones de luz continua.

9ranscurridos #! días desde la sie%ra in (itro el resultado ue o%tu(ios puede

(erse en las Bi)uras #, #F / !".

46




Figura 1H. 7ontroles positivo y negativo a diferentes concentraciones de glucosa y

fructosa

47




Figura 1I. Bíneas mutantes lac61 y lac81 en diferentes concentraciones de

glucosa y fructosa

48




Figura 2E. Bíneas mutantes rpE1 y aep1 en diferentes concentraciones deglucosa y fructosa.

Di(ersos estudios +an docuentado la in+i%ici*n de la )erinaci*n ocasionada

por di(ersos az2cares ;)lucosa, Bructosa / sacarosa< / estos an8lisis +a peritido el

aislaiento de utantes insensi%les a az2cares ;Eastond et al. !""!I 1c+luepann et

al. !""@I Arenas-Puertero et al. !"""<. En este sentido, los e0perientos realizados para

este tra%a&o +an reproducido los resultados de otros tra%a&os. En ellos pudo o%ser(arse

c*o el increento en las concentraciones in+i%ía la )erinaci*n, aBecta%a

ne)ati(aente al creciiento de las pl8ntulas e inducía la acuulaci*n de antocianinas,

aprecia%les a siple (ista por la coloraci*n aoratada ue aduirían las pl8ntulas. a

acuulaci*n de antocianinas es un síntoa sur)e por el estr3s al ue est8n soetidas las

49




plantas cuando crecen con altas concentraciones de az2cares en el edio de culti(o

;Bi)ura !#<.

50




Figura 21. Resultado general de las líneas mutantes seleccionadas junto a

los controles a concentraciones de glucosa y fructosa diferentes.

A la 80ia concentraci*n tanto )lucosa coo de Bructosa ;<, el sil(estre presenta%a un desarrollo uc+o enor, con un color 8s aoratado ue el control

positi(o ;abi4-1<, ue no present* nin)2n %loueo en el desarrollo ni e0pansi*n de los

cotiledones / ue iniciaron el creciiento de las prieras +o&as (erdaderas ;+o&as de

roseta<.

4ara las líneas utantes lac4-1 / aep-1, se apreci* en el sector de 80ia

concentraci*n, un creciiento siilar en 80ia concentraci*n al control positi(o ;abi

4-1<. Mientras ue la línea utante rp30-1 tiene un desarrollo 8s parecido al O9 tanto

para alta concentraci*n de )lucosa coo de Bructosa.

a luz es un Bactor a%iental de sua iportancia para la BotoorBo)3nesis

;desarrollo de los cloroplastos<. 4or este oti(o, uisios analizar si el estíulo

51




constante de la luz podía arro&ar distintos resultados ue cuando culti(aos las plantas

con un ciclo díaHnoc+e ;Bi)uras !! / !?<.

Figura 22. 7recimiento en presencia de azúcares en ciclo de díaKnoc'e.

Figura 2. 7recimiento en presencia de azúcares en luz continúa

52




Corro%orando resultados anteriores, las líneas utantes lac4-1 / aep-1 presentaron un

desarrollo siilar al control positi(o abi4-1, a diBerencia de rp30-1, ue en las isas

condiciones tenían una %a&a tasa de )erinaci*n.

Coo esper8%aos, en luz continua pudios o%ser(ar un creciiento a/or en

el edio control sin az2cares, posi%leente de%ido a una a/or Bi&aci*n del C O2 por

el a/or tiepo de e0posici*n a la luzI sin e%ar)o, no se o%ser(aron diBerencias en los

dos Botoperiodos ensa/ados.

2.4 es*sten+*a a sa+arosa

Con o%&eto de poder deterinar la resistencia a sacarosa, los distintos utantes de

Ara%idopsis Bueron culti(ados con distintas concentraciones de sacarosa ;6, F /

#!< presentes en el edio de culti(o / en condiciones de luz continua.

El creciiento de los utantes puede o%ser(arse en las Bi)uras !?, !@, !$, !6 / !.

Figura 2. 7ultivo de ra#idopsis t'aliana silvestre a diferentes concentraciones de

sacarosa

53




Figura 28 7ultivo de línea mutante rpE1 a diferentes concentraciones de sacarosa

54

Figura 26. 7ultivo de línea mutante lac61 a diferentesconcentraciones de sacarosa




Figura 2;. 7ultivo de línea mutante aep1 a diferentes concentraciones de sacarosa

A la concentraci*n 8s alta de sacarosa #! s*lo lac4-1 / aep-1 ostraron un

des%loueo de las rutas de %iosíntesis de los pi)entos Botosint3ticosI presentando el

resto de líneas ;lac5-1 / rp30-1< un creciiento siilar al sil(estre.

55

Figura. 2@ 7ultivo de línea mutante lac81 a diferentesconcentraciones de sacarosa




2.( E>e+to del &B& so;re la 3er*na+*n de los utantes *nsens*;les a az-+ares

Pace unos años, se puedo deostrar ue plantas insensi%les a )lucosa ;abi4-1<

ta%i3n podían serlo a la Bto+orona ;Arenas-Puertero et al, !"""<. 4ara deterinar el

eBecto del AA so%re la )erinaci*n de las líneas utantes caracterizadas durante este

tra%a&o.

1e realizar*n ensa/os de )erinaci*n en presencia de dic+a +orona, a una

concentraci*n Binal en el edio de #,$ `M, / se copararon las tasas de )erinaci*n

con respecto al edio no adicionado con AA. El coportaiento )erinati(o de las

diBerentes líneas puede apreciarse en las Bi)uras !, !F / ?". Este e0periento se lle(* a

ca%o en condiciones de luz de día lar)o ;# + luzH6 + oscuridad<.

Figura. 2H. 7ultivo de J? y a#i61 en medio de cultivo con y sin G

56




Figura 2I. 7ultivo de lac61 y aep1 en medio de cultivo con y sin G

Figura E. 7ultivo de lac81 y rpE1 en medio de cultivo con y sin G

Coo podíaos esperar, abi4-1 es insensi%le a AA ientras ue el sil(estre tiene

una tasa de )erinaci*n u/ %a&a / auellas ue no )erinaron no Bueron capaces de

e0pandir los cotiledones.

57




De todas las líneas ensa/adas, lac4-1 ostr* una alta tasa de )erinaci*n,

siilar al abi4-1 en el periodo ensa/ado. 1in e%ar)o, e0isti* un desBase en la

)erinaci*n de lac4-1 con respecto a abi4-1 de !-? días. Esto podría su)erir un papel

enor del AA en la señalizaci*n por lac4-1. El resto de línea no )erinaron o, coo

es el caso de lac5-1, no lle)aron a e0pandir los cotiledones, descartando al AA coo

eleento constitu/ente en las putati(as (ías de señalizaci*n por az2cares estudiadas en

este tra%a&o.

2.5 esultado 6"

El re(elado de la electroBoresis ;Bi)ura ?#< correspondiente a la 4CR ue serealiz* a los estratos de cada una de las líneas utantes coparado con una uestrasil(estre.

Figura 1. Revelado de gel de agarosa de la líneas mutantes lac61& lac81&

rpE1 y aep1

4odeos certiBicar ue a la altura a la salen cada %anda para cada utante se

corresponde con el peso de los oli)os solicitados.

2./ "uant*>*+a+*n de az-+ares

4ara la prue%a de recuperaci*n ;ta%las $, 6 / <, se adicionaron !,$ `l de ",! \)H`l

de los patrones de )lucosa, Bructosa / sacarosa a una uestra del sil(estre, cu/a

concentraci*n inicial /a se deterin* pre(iaente para lue)o coparar la cantidad

Binalente edida respecto a la concentraci*n te*rica esperada. as prue%as se

realizaron con e0tractos de plantas sil(estres procedentes de #"" ) de +o&as de roseta.

1e realizaron tres replicas %iol*)icas uestreando ? o 8s plantas por repetici*n,

o%teniendo una des(iaci*n est8ndar enor al ","@ \)H) de peso BrescoI para cada uno de

los az2cares. 9eniendo una recuperaci*n a/or al ", ue indic* la ausencia de un

eBecto atriz si)niBicati(o.

58




'abla 5. 7Alculo del L de recuperación de glucosa& en la e:tracción en silvestre.

?a#la ;. 7Alculo del L de recuperación de fructosa& en la e:tracción en silvestre.

?a#la@. 7Alculo del L de recuperación de sacarosa& en la e:tracción en silvestre.

Con tres patrones internos al ",! \)H` de )lucosa, Bructosa / sacarosa, se

prepararon las si)uientes cur(as de cali%rado ;)r8Bico #, ! / ?<.

59

"on+entra+*n

MuestraD33F

&ortadosD33F

"on+entra+*nTer*+aD33F

"on+entra+*n

Med*daD33F

e+uera+*nDKF

!," #,!$ @,"$ ?,6"

"on+entra+*n

MuestraD33F

&ortadosD33F

"on+entra+*n

Ter*+aD33F

"on+entra+*

nMed*daD33F

e+uera+*n

DKF

",6? #,!$ #,F?? #,6" !

"on+entra+*n

Muestra

D33F

&ortadosD33F

"on+entra+*nTer*+aD33F

"on+entra+*n

Med*daD33F

e+uera+*nDKF

!,#F #,!$ ?,@@ !," #




0 0 0 0.01 0.01 0.01 0.010.0000

0.0500

0.1000

0.1500

0.2000

*+,- 15.87, / 0.01# 1

C:'$/ -" */i'/-% G:*%)/

;g< -" G:*%)/

A)%'/&*i/

(r)%ico 1. *!r#a de calibrado (l!cosa

0 0 0 0.01 0.01 0.01 0.010.0000

0.0500

0.1000

0.15000.2000

0.2500

0.3000

0.3500

*+,- 30.01, / 0.01# 1

C:'$/ -" */i'/-% F':*#%)/

3l de #ru+tosa

A)%'/&*i/

/rACco 2. 7urva de cali#rado fructosa

60




0 0 0 0.01 0.01 0.01 0.010.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

0.7000

*+,- 41.92, / 0.17# 0.99

"ur=a de +al*;rado Sa+arosa

3l de Sa+arosa

&;sor;an+*a

(r)%ico 3. *!r#a de calibrado +acarosa

El líite de detecci*n se calcul* considerando la concentraci*n de analito ue

proporciona una señal i)ual a la señal del %lanco, 8s tres (eces la des(iaci*n est8ndar

del %lanco. El líite de cuantiBicaci*n se calcul* considerando la señal del %lanco, 8s

$ (eces la des(iaci*n est8ndar del %lanco.El líite de detecci*n o%tenido para la )lucosa es de ",""@? \)H \l, / el líite de

cuantiBicaci*n Bue de ",""6@ \)H`l.El líite de detecci*n o%tenido para la Bructosa es de ",""@ \)H \l, / el líite de

cuantiBicaci*n Bue de ",""$F \)H`l.El líite de detecci*n o%tenido para la sacarosa es de ",#F \)H \l, / el líite de

cuantiBicaci*n Bue de ",!! \)H`l.

"onten*do de az-+ares solu;les en las uestras

a cuantiBicaci*n de la )lucosa, Bructosa / sacarosa se lle(* a ca%o con las líneassil(estre, abi4-1, lac4-1, lac5-1, lac5-2, lac5-3, aep-1, aep2, aep3 y rp30-1.

"onten*do de 3lu+osa en las uestrasa cantidad de )lucosa deterinada por )rao de peso Bresco de cada línea est8

representado en el )r8Bico @.

61




! ai41ac41ac51ac52ac53 ae1 ae2 ae3 r300

1

2

3

4

5

6

C%&#"&i-% 9"-i% -" g.:*%)/ "& )i.$")#'" = 9:#/&#")

%iestre y m7tantes

edia contenido

de g7cosa +mg8g-

(r)%ico 4. *ontenido medio de gl!cosa en sil#estre y m!tantes.

"onten*do de >ru+tosa en las uestrasa cantidad de Bructosa deterinada por )rao de peso Bresco de cada línea est8

representado en el )r8Bico $.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

C%&#"&i-% 9"-i% -" >':*#%)/ "& )i.$")#'" = 9:#/&#")

%iestre y m7tantes

edia de contenido de *r7ctosa +9gg-

(r)%ico 5. *ontenido medio de %r!ctosa en sil#estre y m!tantes.

62




"onten*do de sa+arosa en las uestrasa cantidad de sacarosa deterinada por )rao de peso Bresco de cada línea est8

representado en el )r8Bico 6.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

C%&#"&i-% 9"-i% -" )/*/'%)/ "& )i.$")#'" = 9:#/&#")

%iestre y m7tantes

edia de contenido en sacarosa +9gmg-

(r)%ico 6. *ontenido medio de %r!ctosa en sil#estre y m!tantes.

De estos resultados podeos destacar la alta concentraci*n de )lucosa /

sacarosa de los utantes lac4-1 / aep-1, superior al control positi(o abi4-1. Q unadiBerencia de concentraci*n en Bructosa de los tres utantes aep-#, -! / -? con respecto

a los de8s, lo ue uiz8s podría indicarnos una resistencia especiBicaI de al)uno de

ellos, a Bructosa. En el )r8Bico 6 se o%ser(a una diBerencia entre los utantes / el

sil(estre en cuanto a la concentraci*n de sacarosa, pero si)ue siendo 8s alta para lac4-

1 / aep-1.

63



'''. 4ro/ecto Bin de 8ster ?. Discusi*n

4. DISCUSIÓN

64



'''. 4ro/ecto Bin de 8ster ?. Discusi*n

$*s+us*n $*s+ut*r ta;*9n so;e ae

El estudio olecular de los procesos de señalizaci*n en plantas +a puesto de

aniBiesto el papel crucial de los Bactores )enerales de la transcripci*n coo

coponentes oleculares centrales para inte)rar los di(ersos Ben*enos a%ientales /dar respuesta *ptia en la adaptaci*n de las plantas a las situaciones estr3s.

a sensi%ilidad a )lucosa / a Bructosa Bora parte de cople&os procesos ue

podeos estudiar con detalle en plantas. Pasta la Bec+a no e0istían estudios ue

identiBicaran a los )enes A*-4-# / A$ coo eleentosde (íasde señalizaci*n por

az2cares. Con los resultados o%tenidos durante este tra%a&o, podeos aBirar ue lac4-

1 es resistente a )lucosa, Bructosa / sacarosa est8 relacionada al estr3s / ue podría

tener al)una relaci*n con las respuestas ediadas por AA. Esta o%ser(aci*n iplicaríaue A*4 podría Borar parte de una cascada de señalizaci*n parcialente dependiente

de AA.

as prue%as de )erinaci*n en anitol indican ue todas las líneas tienen la isa

sensi%ilidad a anitol / podríaos, por tanto, eliinar el coponente os*tico /

aBirar ue la resistencia ostrada por las (ariedades insensi%les es especíBica a

az2cares.

El +ec+o de ue la utante lac4-1insensi%le a )lucosa, Bructosa / sacarosa, sea

ta%i3n parcialente insensi%le a AA, su)iere ue la re)ulaci*n ediada por A*4

podría estar por encia del punto de re)ulaci*n por AA. Estos resultados apuntan a

ue A*4 actuaría coo un re)ulador ne)ati(o de la transcripci*n en condiciones de

estr3s por az2cares en plantas sil(estres.

Durante este tra%a&o partios de la +ip*tesis de ue una desre)ulaci*n en la

respuesta a az2cares produciría in+erenteente alteraciones en el contenido celular delos az2cares. os resultados o%tenidos de las edidas de los az2cares solu%les ;)lucosa,

Bructosa / sacarosa< (alidarían esta +ip*tesis de partida, /a ue se +an o%ser(ado

increentos si)niBicati(os en )lucosa / Bructosa en los utantes lac4-1 / aep-#, -! / -?,

respecti(aente.

65



'''. 4ro/ecto Bin de 8ster @. Conclusiones

?. *%&*:)i%&")

66



'''. 4ro/ecto Bin de 8ster @. Conclusiones

(. "on+lus*ones

•

as líneas utantes lac4-1 y aep-1 son resistentes a Bructosa, sin e%ar)o, s*lo

aep-1 sería especiBica de este az2car.

•

as líneas utante lac5-1 / rp30-1 son Balsos positi(os.

•

a ruta de señalizaci*n por A*4 podría ser parcialente dependiente de AA.

67



'>. i%lio)raBía

IV.BIBLIOGRAFÍA

68



'>. i%lio)raBía

IV. B*;l*o3ra>ía

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DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE AZÚCARES SOLUBLES EN PLANTAS DE Arabidopsis thaliana AFECTADAS EN...

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