ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

BIOQUÍMICA I

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I

INFORME N° 3

TEMA:

DOSIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL

MÉTODO COLORIMÉTRICO DE SOMOGYI-NELSON

INTEGRANTES:

Mauricio Orna 2194Henry Jara 2198Jessica Peña 1635Sabrina Yucailla 1958

DOCENTE:

Dr. Carlos Donoso

RIOBAMBA - ECUADOR

INTRODUCCIÓN

Los Azúcares reductores son aquellos azúcares que poseen su grupo carbonilo (grupo funcional) intacto, y que a través del mismo pueden reaccionar con otras moléculas. Los azúcares reductores provocan la alteración de las proteínas mediante la reacción de glucosilación no enzimática también denominada reacción de Maillard o glicación. Esta reacción se produce en varias etapas: las iníciales son reversibles y se completan en tiempos relativamente cortos, mientras que las posteriores transcurren más lentamente y son irreversibles. Se postula que tanto las etapas iníciales como las finales de la glucosilación están implicadas en los procesos de envejecimiento celular y en el desarrollo de las complicaciones crónicas de la diabetes.

En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor está dado básicamente por un balance entre azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los polisacáridos estructurales.

Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis y suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de CO2, H2O y ENERGÍA la cual queda disponible para la biosíntesis de otros componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos azucarados, glucósidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de azúcares aumenta casi invariablemente básicamente por hidrólisis que experimentan los polisacáridos, aunque algunos azúcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio.

Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)6

3- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.

JUSTIFICACIÓN

Este método colorimétrico es muy útil para determinar las concentraciones de azúcares reductores, por lo cual tiene una gran importancia en la determinación de azucares a nivel sanguíneo como es el caso del a glucosa en los diabéticos.

El nivel de glucosa en la sangre es la cantidad de glucosa (azúcar) que contiene la sangre. El nivel de glucosa en sangre también se denomina glucosa en suero y glucemia. La cantidad de glucosa que contiene la sangre se mide en milimoles por litro (mmol/l) o en miligramos por decilitro (mg/dl) Normalmente, el nivel de glucosa en sangre se mantienen dentro de límites estrechos a lo largo del día (72-145 mg/dl; 4-8 mmol/l).

Sin embargo, sube después de las comidas y es más bajo por la mañana antes del desayuno. Las personas con diabetes se caracterizan por tener niveles de glucosa más altos de lo normal

OBJETIVOS

General:

Aplicar el método de Somogyi-Nelson

Específicos:

Determinar la absorbancia de azucares reductores en una muestra

Realizar una curva de calibración

Determinar la concentración de azúcares de biomolèculas mediante técnicas de

colorimetría

FUNDAMENTOS

La glucosa reduce una solución de sulfato cúprico alcalino en caliente a oxido cuproso. La reacción depende de la alcalinidad, temperatura, tiempo de calentamiento y concentración de los reactivos.

El óxido cuproso formando una reacción con el reactivo de arsenomolibdato para dar un complejo azul que presenta una alta absorbancia a 540 nm.

La oxidación del oxido cuproso por acción del oxigeno del aire se impide utilizando el sulfato de sodio, que disminuye la solubilidad del oxigeno.

Es un micrómetro, que cuantifica glúcidos reductores entre cero y 180 microgramos óseos un micro mol de glucosa.

La curva patrón desecha con el glúcido patrón más adecuado los cuales pueden ser glucosa o maltosa.

REACCIONES

Cu2O +

Arsenomolibdato Complejo de color azul

RESULTADOS

Tubo

Nº

Agua

destilada

Estándar

de

glucosa

Muestra

proble

ma

Reactivo

de Cu

alcalino

Reactivo de

Arsenomolib

dato

Agua

destilada

Concentración

de glucosa

(mg/dl)

Absorbancia

1 1.0 0 1 1 7 0.0 0

2 0.9 0.1 1 1 7 10 0.084

3 0.7 0.3 1 1 7 30 0.150

4 0.5 0.5 1 1 7 50 0.285

5 0.3 0.7 1 1 7 70 0.373

6 0 1 1 1 7 100 0.542

7 0 0 0.3 1 1 7 24.986 0.235

8 0 0 0.5 1 1 7 33.201 0.314

9 0 0 0.1 1 1 7 84.776 0.810

GRAFICAS

0 20 40 60 80 100 1200

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.00529345794392523 x + 0.00961682242990652

Curva de calibración para la determinación de azú-cares reductores

AbsorvanciaLinear (Absorvancia)

Concentración de glucosa

Abso

rban

cia

Curva de calibración directa para encontrar la determinación de azucares por el método de Somogyl-Nelson, con una longitud de onda de 540nm.

0 20 40 60 80 100 1200.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1.000

Curva de Calibración para ladeterminación de Azúcares Reductores de

Somogyi-Nelson(Corregida)

ABSORBANCIA

CONCENTRACIÓN (µg)

ABSO

RBAN

CIA

Curva de calibración con datos corregidos para encontrar la determinación de azucares por el método de Somogyl-Nelson, con una longitud de onda de 540nm.

MATERIALES:

9 Tubos de ensayo.

1 Gradillas

1 Reverbero

3 Pipetas graduadas de ,1 Y 10

mL.

1 Vaso de precipitación de 500 mL.

REACTIVOS:

Reactivo de Cobre Alcalino de Nelson

Reactivo de Arsemolibdato

Solución estándar de glucosa

CONCLUSIONES:

Mediante la aplicación del método de Somogyi Nelson se logró determinar la siguientes concentraciones para cada una de las muestras:

Concentraciones la glucosa (ug/dl) Absorbancias

0 0

10 0.084

30 0.150

50 0.285

70 0.373

100 0.542

? 0.235

? 0.314

? 0.810

Se realizó la curva de calibración con las concentraciones ya conocidas con sus respectivas

absorbancias para hallar las concentraciones desconocidas

Gracias a las concentraciones obtenidas se logro establecer la curva de calibración para poder determinar las concentraciones de muestras desconocidas. Las cuales fueron:

24.986 0.235

33.201 0.314

84.776 0.810

RECOMENDACIONES:

Es necesario que los reactivos sean preparados o elaborados un día antes de la práctica, o mucho mejor aun en el día en que van a ser empleados, todo esto con el fin de obtener buenos resultados.

Antes de las prácticas de laboratorio es recomendable hacer un recuento de los reactivos que se van a emplear, es decir, verificar si contamos con todos los reactivos necesarios para la práctica.

BIBLIOGRAFIA:

http://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcar_reductor http://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcares http://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcar

CUESTIONARIO

1) ¿En qué consiste la ley de Lambert y Beer?

ENUNCIADO : “ Si en una radiación monocromática se incrementa unas partículas semejantes absorbentes , están absorberán fracciones semejantes a la radiación”

Utiliza un haz de luz enfocado de manera precisa para penetrar el elemento del procesado. Una célula fotoeléctrica de silicio mide la intensidad resultante de luz. La alteración de la intensidad de la luz, causada por la absorción y/o difusión está explicada en la Ley Lambert-Beer.

La Ley Lambert Beer es un medio matemático de expresar cómo la materia absorbe la luz. Esta ley afirma que la cantidad de luz que sale de una muestra es disminuida por tres fenómenos físicos:

1. La cantidad de material de absorción en su trayectoria (concentración)

2. La distancia que la luz debe atravesar a través de la muestra (distancia de la trayectoria óptica)

3. La probabilidad de que el fotón de esa amplitud particular de onda sea absorbido por el

material (absorbencia o coeficiente de extinción)

Esta relación puede ser expresada como:

A = εbcDonde:

A = Absorbenciaε = Coeficiente molar de extinciónb= Distancia en cmc = Concentración molar

OTRAS MANERAS DE CALCULAR LA ABSORVANCIA

A = -log10 T= log Po/P

La absorbancia es directamente proporcional a la trayectoria de la radiación a través de la solución y a la concentración de la especia que produce la absorción.

2) Esquema de un espectrofotómetro

3) ¿En qué consiste la determinación de D-glucosa en sangre por el método de la glucosa-

oxidasa (método enzimático)?

Los reactivos de glucosa oxidasa son solamente para uso IN VITRO en la determinación cuantitativa de Glucosa en muestras de suero o plasma usando procedimientos manuales o automatizados.

Fundamento: La Glucosa Oxidasa cataliza la oxidación de la Glucosa formando así el peróxido de hidrogeno y D-glucano-d-lactona. El peróxido de hidrógeno se cuantifica vía la reacción de peroxidasa donde el oxígeno se transfiere del peróxido de hidrógeno a un aceptador cromático produciendo un tinte de quinoneimina. La intensidad del color del tinte es directamente proporcional a la concentración de la glucosa en la muestra del suero.

El esquema de la reacción ilustra los eventos que ocurren en este procedimiento:

ReactivoLos reactivos de Glucosa Oxidasa de Catachem están formulados en forma líquidalisto para-su-uso de trabajo. Su estabilidad es por lo menos de 60 días a 2-8ºC después de abrir el frasco con su contenido.

Almacenamiento del ReactivoEl reactivo de Glucosa Oxidasa es almacenado a temperatura de 2-8ºC y puede ser usado hasta la fecha de caducidad del lote indicada en la etiqueta. La estabilidad del reactivo durante almacenamiento es por lo menos de 18 meses. VALORES NORMALES: En ayunas: [Glucosa] = de 60 mg/dL a 110 mg/dL

Características Específicas del Desempeño

Sensibilidad: Una absorbancia-delta de 0.0008-0.0012 por mg/dL usando una cubeta de reacción de un cm. de longitud debe ser observada.

Linealidad: El método de Glucosa Oxidasa de Catachem es lineal dentro del rango de 0-600 mg/dL.

4) Consulte otros métodos que se emplean para la determinaciones de azucares totales y

azucares reductores?

1. Determinación cuantitativa de azúcares reductores y totales (método de Lane y Eynon). Existen diversos métodos de cuantificación de carbohidratos basados en la capacidad reductora de los azúcares que tienen libre el grupo carbonilo. Estos carbohidratos son capaces de reducir elementos como el cobre (Cu+2), el hierro (Fe+3) o el yodo (I0). En el caso específico del cobre, este es reducido desde Cu+2 a Cu+1. En este sentido, en el método de Lane y Eynon (1923) se hace reaccionar sulfato cúprico con azúcar reductor en medio alcalino, formándose oxido cuproso, el cual forma un precipitado rojo ladrillo. Este método utiliza azul de metileno como indicador, el cual es decolorado una vez que todo el cobre ha sido reducido, lo que indica el fin de la titulación.

2. Métodos espectrofotométricos: El término espectrofotometría se refiere al uso de la luz para medir las concentraciones de sustancias químicas.Cuando una molécula absorbe un fotón, su energía se incrementa. Se dice que pasa a un estado excitado. Si por el contrario emite un fotón, su energía disminuye. El estado de menor energía de una molécula se denomina estado basal o fundamental.En la siguiente figura se describe un esquema básico de un espectrofotómetro:Monocromador - Celda con el analito - Detector de luz Fuente de luz - (Selección de longitud de onda)Una fuente de luz se hace pasar por un monocromador. Éste permite seleccionar un haz de luz con una única longitud de onda.

5) ¿Cómo determinaría la concentración total de almidones en un alimento?

El almidón es el carbohidrato de reserva de la mayoría de los vegetales y es particularmente abundante en cereales; está formado por amilosa (cadenas lineales de glucosa unidas por enlaces a-1,4) y por amilopectina (cadenas lineales de glucosa con ramificaciones a-1,6). El contenido en almidón de los alimentos se puede determinar por métodos enzimáticos ó polarimétricos. Las dextrinas son productos intermedios de la digestión del almidón.

Evaluación del estado físico del almidón

La evaluación de la microestructura de los almidones se realiza mediante distintas técnicas que tratan de estimar el orden interno de los gránulos, a través de determinar distintos parámetros o valores que son dependientes del ordenamiento molecular del almidón. Entre las técnicas más usadas se cuentan la calorimetría diferencial de barrido (DSC, por su nombre en inglés), que determina la temperatura a la cual suceden cambios de estado (cambio en orden interno) y el flujo de calor involucrado en dichos cambios (10); difractometría de rayos X, la cual entrega espectros característicos (gráficas) para cada tipo de almidón en cuanto a su estructura interna (diferencias de fracción cristalina) (20); y el procesamiento y análisis de imágenes (procesamiento y análisis computacional), con lo que se obtiene información numérica que describe cuantitativamente la forma de los gránulos, número, o cualquier otro parámetro extraíble de imágenes obtenidas por microscopía.

Identificación de polisacáridos: identificación de almidón mediante la prueba del Lugol

En solución acuosa, la amilosa forma estructuras helicoidales lineales y la amilopectina ramificadas, gracias a la formación de puentes de H entre los grupos OH de la glucosa y las moléculas de H2O. Si a una dilución de almidón de le añade I, esta toma un color azul intenso. Esta característica es específica del almidón, debido a su estructura, y se debe a la adsorción del I por las cadenas helicoidales, especialmente de la amilosa. Por tanto no es una reacción química, sino una interacción física reversible por métodos físicos. Esto se puede comprobar fácilmente, pues al calentar la mezcla, el color azul desaparece, y al enfriarla vuelve a aparecer.

ANEXOS

Equipo que determina las concentraciones de azúcar en cada una de las soluciones.

Tubos con las soluciones antes de ser agregadas cada una de las respectivas.

Soluciones.

Tubos con las soluciones listas para determinar la concentración.

En este grafico se puede observar que a diferentes concentraciones la tonalidad de

las soluciones es diferente.