Cuantificación del contenido de azúcares reductores

XIII Congreso de Fitomejoramiento:

Contribuyendo al sostenimiento de la vida a través del fitomejoramiento 6 - 8 de noviembre, Corpoica, Tibaitatá – Mosquera, Cundinamarca

Cuantificación del contenido de azúcares reductores y no reductores y su asociación genética con marcadores

SNPs en Solanum tuberosum grupo Phureja (Resultados preliminares)

Diana Duarte-Delgado, Luz Patricia Restrepo, Ajjamada Kushalappa y Teresa Mosquera

Incremento en la demanda de alimentos

procesados (FAO, 2009)

Cambios en los hábitos de consumo a nivel

mundial (FAO, 2009)

Oportunidad: Papa criolla (Solanum tuberosum grupo Phureja)

Incrementar valor agregado

Contribuir a la seguridad alimentaria en

comunidades vulnerables

Introducción

Cultivar de papa criolla para procesamiento en hojuela:

necesita desarrollo

Problema: contenido de azúcares reductores

Werij et al., 2012

Contenido de azúcares reductores

amino acid

+

Reductores

+

No reductores

Reacción de Maillard

Nader, 2011

Degradación del almidón en células de almacenamiento

Cultivar de papa criolla para procesamiento en hojuela:

necesita desarrollo

Problema: contenido de azúcares reductores

Calidad de procesamiento en hojuela: rasgo complejo

Werij et al., 2012

Contenido de azúcares reductores

Basic science

Molecular maps

Function maps for pathogen resistance

and tuber traits Comparative maps

Genome structure and evolution

Application

Markers for introgression

breeding

R-gene cloning Candidate genes

Genomic sequencing

*omics

Diagnostic markers for population-based

MAS

Engineering agronomic traits

Precision breeding

The molecular basis of complex traits

Biodiversity, haplotypes

Association studies

Ch. Gebhardt MPIZ

Balding, 2006

Mapeo por asociación

Phenotypic trait

Cuello de botella…

Pregunta de investigación ¿Cuáles regiones del genoma de papa se asocian al contenido de azúcares reductores y no reductores en una población natural de Solanum tuberosum grupo Phureja, al emplear marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos?

Objetivo General

Explorar la variación alélica de Solanum tuberosum grupo Phureja y su asociación genética con contenidos de azúcares reductores y no reductores

1.Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC. 2.Caracterizar fenotípicamente la Colección Central Colombiana (CCC) de grupo Phureja y otros genotipos por su contenido de azúcares. 3.Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos.

Objetivos específicos

Mapeo por Asociación

10 genes candidatos: Diseño y amplificación de

primers Identificación de SNPs

Aproximación GWAS: Metodología GBS

110 accessiones Colección Central Colombiana (CCC)

4 Cultivares comerciales Caracterización fenotípica del contenido de

azúcares : Latice rectangular triple

8 accessiones IPK German Germplasm Bank

• Agua • Doble tratamiento con MeOH • MeOH con carbón activado • MeOH con reflujo

 

 

Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex Detector: Índice de refracción Shodex Columna: Aminex HPX 87H 300 mm x 7.8 mm Fase movil: Ácido sulfúrico 10 mM

Condiciones cromatográficas

Métodos de extracción de azúcares

Ajustes para el análisis del contenido de

azúcares

Materiales y métodos

Mapeo por Asociación

10 genes candidatos: Diseño y amplificación

de Primers Identificación de SNPs

Aproximación GWAS: Metodología GBS

110 accessiones Colección Central Colombiana (CCC)

4 Cultivares comerciales Caracterización fenotípica del contenido de

azúcares : Latice rectangular triple

8 accessiones IPK German Germplasm Bank

• Agua • Doble tratamiento con MeOH • MeOH con carbón activado • MeOH con reflujo

 

 

Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex Detector: Índice de refracción Shodex Columna: Aminex HPX 87H 300 mm x 7.8 mm Fase móvil: Ácido sulfúrico 10 mM

Condiciones cromatográficas

Métodos de extracción de azúcares

Ajustes para el análisis del contenido de

azúcares

Materiales y métodos

Objetivo específico 1 Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC. •  Condiciones cromatográficas:

Condiciones cromatográficas  

Temperatura de la columna   18°C  

Temperatura del detector   35°C  

Fase móvil   Ácido sulfúrico 10mM  

Fase de almacenamiento   Ácido sulfúrico 5mM  

Fase de limpieza   Acetonitrilo 2,5% en ácido sulfúrico 5mM  

Flujo   0,3ml/min  

Volumen de inyección   20 µl  

Tiempo por muestra   35 min  

Resultados

•  Selección de la metodología para extracción de azúcares: Análisis

de un DCA y pruebas de Tukey

Método   Concentración promedio sacarosa (ppm)  

Agua (Cunningham et al., 1988)   2566,22 a  

Doble tratamiento con MeOH (Karkacier et al., 2003)   4925,64 c  

MeOH con carbón activado (Marangoni et al., 1997)   3479,68 ab  

MeOH con reflujo (Arevalo & Sastoque, 1999)   4322,76 b  

•  Validación del método de cuantificación

  Reproducibilidad   Repetibilidad   Linealidad     Promedio (ppm)  CV (%)  Promedio (ppm)   CV (%)   Promedio R²   SD  

Glucosa 40.08   1.21   52.06   4.61   0.9998   0.00015  Fructosa 40.42   0.83   41.33   3.67   0.9997   0.00021  Sacarosa 40.41   0.72   40.49   4.44   0.9997   0.00016  

Límite de

detección (ppm) Límite de

cuantificación (ppm) % de Recuperación

Glucosa 4 5 111.47 Fructosa 2 3 103.10 Sacarosa 2 2 96.13

a. Cromatograma de patrones en mezcla b. Cromatograma de Col 102

a. b.

Cromatogramas de patrones y de tubérculo crudo

Cromatogramas de genotipos contrastantes a. Col 52 b. IPK-170031

a. b.

Cromatogramas para azúcares en tubérculo crudo

Objetivo específico 3 Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos.

Genes candidatos seleccionados para diseño de primers

Gen Candidato Función Cromosoma

InvGE Apoplastic invertase IX Pain-1 Vacuolar acid invertase III Stp23 Plastidic starch phosphorylase III StpL Plastidic starch phosphorylase V AGPaseS-a ADP-glucose pyrophosphorylase I SssI Soluble starch synthase III GWD Glucan-water dikinase V UGPase UDP-glucose pyrophosphorylase XI Sps Sucrose phosphate synthase VII G6pdh Glucose-6-phosphate dehydrogenase II

Nader, 2011

Degradación del almidón en células de almacenamiento

•  Se ha ajustado una metodología cromatográfica precisa, reproducible y repetible para la cuantificación de azúcares en tubérculos de grupo Phureja.

•  Los resultados obtenidos revelan variabilidad en el contenido de azúcares de genotipos de grupo Phureja.

•  Una vez se cuenten con los datos fenotípicos completos, el análisis

de asociación será llevado a cabo a partir de SNPs con el propósito de identificar regiones genómicas con influencia en la calidad de fritura, en este importante grupo de papas cultivadas para Colombia.

Conclusiones y perspectivas

Seguridad Alimentaria y Nutrición

Proyecto desarrollado con el apoyo financiero del International Development Research Centre (IDRC), www.idrc.ca, y el Gobierno de Canadá, a través del Department of Foreign Affairs, Trade and Development Canada (DFATD), Canada, www.international.gc.ca

El  mejoramiento  de  la  producción  de  papa  como  contribución  a  la  seguridad    alimentaria  en  comunidades  nativas  en  Colombia  

Agradecimientos

Contrato de acceso al recurso genético RGE0069

Grupo: Genética de rasgos de interés agronómico

¡Gracias por su atención!