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I

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

“EXPRESIÓN DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE ENDOTELINA Y

ÓXIDO NÍTRICO SINTASA EN ÚTERO HUMANO CON MIOMATOSIS”

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS

EN MORFOLOGÍA

PRESENTA

M. C y P. AMÉRICA GUADALUPE SOTO LÓPEZ

DIRECTORA DE TESIS

DRA. CLAUDIA CAMELIA CALZADA MENDOZA

MÉXICO, D.F, 2008.

2

ESTA TESIS SE REALIZÓ EN EL LABORATORIO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR DE LA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN, ESM-IPN, BAJO LA DIRECCIÓN DE LA DOCTORA CLAUDIA CAMELIA CALZADA MENDOZA.

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4

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AGRADECIMIENTOS.

Al Instituto Politécnico Nacional y a la Escuela Superior de Medicina por el apoyo

recibido para la realización de mis estudios de posgrado.

A la sección de becas institucionales IPN por la beca proporcionada para mis

estudios de maestría.

A Dios por caminar a mi lado y brindarme su protección y amor.

A mis Padres y Hermanos por estar en todo momento conmigo, por el amor que

nos tenemos, y por ser lo mejor que tengo.

A Mario: sin ti, esto no hubiera sido posible, gracias por recordarme la fortaleza de

mi ser y por invitarme a caminar juntos.

A la Dra. Claudia C. Calzada Mendoza, por todo tu tiempo, tus enseñanzas y tu

paciencia.

A la Dra. Adriana Becerril Montes por ser una maestra en toda la extensión de la

palabra.

A Maru: tu apoyo, tus palabras, tu sonrrisa y tu tiempo son de inigualable valor.

A Alejandra, por tu amistad, tus enseñanzas y toda tu ayuda.

A todos mis profesores en la maestría por todas sus enseñanzas.

A Héctor: por tu mensaje de vida.

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INDICE DE CONTENIDOS

CONTENIDO PAGINA

I Resumen 11

II Summary 13

III Marco teórico

1 Miomatosis uterina, definición y descripción 15

2 Epidemiología 17

3 Etiología 17

3.1 Factores de riesgo 18

3.2 Factores iniciadores (aspectos genéticos) 21

3.3 Factores promotores y efectores: Expresión de 21

factores de crecimiento, hormonas y sus receptores

en miomas

3.3.1 Estrógenos 22

3.3.1.1 Receptores de estrógenos 23

3.3.1.2 Estrógenos y miomatosis uterina 26

3.3.2 Progesterona 27

3.3.2.1 Receptores de progesterona 28

3.3.2.2 Progesterona y miomatosis uterina 29

3.3.3 Otros mediadores del crecimiento del mioma

3.3.3.1 Factores de crecimiento 31

3.3.4 Enzima convertidora de endotelina 35

3.3.5 Sintasa de óxido nítrico 39

4 Angiogénesis 44

5 Diagnóstico y tratamiento 46

8

IV Justificación 52

V Pregunta de investigación 53

VI Hipótesis 53

VII Objetivo general 53

VIII Objetivos específicos 53

IX Diseño experimental

1. Tipo de estudio 54

2. Material 54

3. Metodología

3.1 Toma de muestras 54

3.2 Western Blot 55

3.3 Ánalisis estadístico 56

X Resultados 57

XI Discusión 65

XII Conclusión 78

XIII Perspectivas 78

VIV Bibliografía 79

XV Anexos

1.- Consentimiento informado 88

2.- Lista de materiales para Western Blot 92

3.- Descripción macroscópica de las regiones estudiadas: 93

miometrio, nodo subtumoral y mioma.

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INDICE DE FIGURAS Y TABLAS

CONTENIDO PAGINA

Figura 1. Clasificación de los miomas uterinos según su localización. 16

Figura 2. Patogénesis de los miomas. 20

Figura 3. Esteroides sexuales como principales responsables de la 22

patogénesis de los miomas.

Figura 4. Mecanismos de acción de los estrógenos. 25

Figura 5. Mecanismo de acción genómica de la progesterona. 28

Figura 6. Síntesis de endotelina-1 /Factores de estimulación e inhibición. 37

Figura 7. Mecanismo de acción sobre receptores “A” de endotelina. 38

Figura 8. Estructura de la sintasa de óxido nítrico. 40

Figura 9. Expresión del receptor alfa estrogénico en mioma, 58

tejido subtumoral y mioma en fase proliferativa (a) y secretora (b).

Figura10. Receptor de progesterona subtipo A, en el miometrio, 58

tejido subtumoral y mioma de la fase proliferativa (a) y secretora (b).

Figura11. Receptor de progesterona subtipo B, en el miometrio, 59

tejido subtumoral y mioma de la fase proliferativa (a) y secretora (b).

Figura12. Expresión de eNOS en tejidos uterinos en fase proliferativa (a) 60

y secretora (b)

Figura13. Expresíon de ECE en tejidos uterinos en fase proliferativa (a) 60

y secretora (b).

Figura14. Relación entre la prescencia de ER y PR con la expresión 61

de ECE y eNOS en miometrio (a), tejido subtumoral (b) y

mioma (c) en fase proliferativa.

Figura 15. Relación entre la prescencia de ER y PR con la expresión 63

de ECE y eNOS en miometrio (a), tejido subtumoral (b) y

mioma (c) en fase secretora.

10

TABLAS

Tabla 1. Localización de receptores estrogénicos. 24

Tabla 2. Características funcionales de los receptores A y B 29

de progesterona.

Tabla 3. Nomenclatura y características generales de las NOS. 41

Tabla 4. Datos de las pacientes sometidas a histerectomía en fase 57

proliferativa del ciclo menstrual.

Tabla 5. Datos de las pacientes sometidas a histerectomía en fase 57

secretora del ciclo menstrual.

11

GLOSARIO

ADN: Ácido desoxirribonucleico.

AR: Receptores de andrógenos

E1: Estrona.

E2: 17 β-estradiol.

E3: Estriol.

ECE: Enzima convertidora de endotelina

EGF: Factor de crecimiento endotelial.

eNOS: Sintasa de óxido nítrico endotelial.

ERE: Elementos de respuesta a estrógenos.

ER: Receptores estrogénicos.

ERα: Receptor α de estrógenos.

ERβ: Receptor β de estrógenos.

ET: Endotelina.

ETA: Receptor A de endotelina.

ETB: Receptor B de endotelina.

FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos.

FNT-α: Factor de necrosis tumoral α.

FSH: Hormona folículo estimulante.

GnRH: Hormona liberadora de gonadotropinas.

HCG: Gonadotrofina coriónica humana.

HG: Hormona de crecimiento.

17β-HSD: 17β hidroxiesteroide deshidrogenasa.

IGF: Factor de crecimiento insulinico.

IGF-1: Factor de crecimiento insulinico tipo 1.

IMC: Indice de masa corporal.

INFα: Interferon α.

iNOS: Sintasa de óxido nítrico calcio independiente.

LH: Hormona luteinizante.

LH-RH: Hormona liberadora de hormona luteinizante

nNOS. Sintasa de óxido nítrico neuronal.

12

NO: Óxido nítrico.

PCNA: Antígeno de proliferación celular nuclear.

PDGF: Factor de crecimiento derivado de plaquetas.

PGE: Prostaciclina.

PR: Receptores de progesterona.

P4: Progesterona

PR-A: Receptor “A” de progesterona.

PR-B: Receptor “B” de progesterona.

PRL: Prolactina.

SHBG: Globulina fijadora de hormonas sexuales.

SPRMs: Moduladores selectivos de receptores de progesterona

TGF-β1: Factor de crecimiento transformante β1.

TGF-β3: Factor de crecimiento transformante β3.

VEGF: Factor de crecimiento vascular endotelial.

13

RESUMEN

La miomatosis uterina a pesar de ser la neoplasia pélvica más común en la

mujer, es un tópico poco estudiado de la patología femenina. No siempre es

sintomática, pero la tendencia actual a retrasar la maternidad hace que resalte la

asociación de miomatosis uterina e infertilidad y complicaciones obstétricas. Esta

patología representa en la actualidad un problema de salud pública que merece

especial atención debido a las repercusiones que tiene para la paciente y la

sociedad, pues aparte de los trastornos menstruales y de fertilidad, también

implica riesgos quirúrgicos, trastornos psicosexuales, bajas laborales y gastos

hospitalarios, consultas, ecografías, tratamientos hormonales, tratamientos

antianémicos y/o cirugías.

Los sistemas autocrinos y paracrinos regulan la proliferación celular y el

desarrollo de los órganos a través de la producción local de factores de

crecimiento y hormonas, siendo igualmente importante el receptor de cada uno de

éstos. En la miomatosis uterina no se conoce aún con precisión el o los factores

que promueven su desarrollo, sin embargo, se sabe que en su patogénesis existe

una interacción entre alteraciones genéticas, de esteroides sexuales y factores de

crecimiento. Entre estos factores están los angiogénicos (VEGF, EGF, FGF) que

le son necesarios al tumor para cubrir sus necesidades nutricias y sustentar su

crecimiento; de hecho, muchos de los factores estimulados por hormonas

esteroideas participan de modo importante en los procesos de neovascularización.

Las hormonas relacionadas con el desarrollo del mioma son los estrógenos

y la progesterona, éstas a su vez modulan la expresión de endotelina y óxido

nítrico. Ambas proteínas son síntetizadas en el endotelio vascular a través de las

enzimas convertidora de endotelina (ECE) y sintasa del oxido nítrico (NOS); de

las que se sabe, ejercen acciones proliferativas sobre las células de músculo liso

vascular, participan en la adhesión celular, modulan la síntesis de componentes

14

de la matriz extracelular y promoueven la producción de factores de crecimiento

implicados en dicho proceso.

De lo anterior surge la necesidad de saber de que manera son reguladas

ECE y eNOS en el tumor uterino, bajo la acción de dichas hormonas (en base a la

etapa del ciclo menstrual). Este estudio se realizó en pacientes sometidas a

histerectomía total abdominal por miomatosis uterina de pequeños y medianos

elementos; las muestras se clasificaron de acuerdo a la etapa del ciclo menstrual,

posteriormente se analizaron con la técnica de western blot, los resultados

obtenidos indican que ambas enzimas pueden interactuar entre ellas y con los

receptores hormonales, para dar lugar al crecimiento miomatoso, de esta manera

eNOS es estimulada por estrógenos y ECE estimulada tanto por progesterona

como por estradiol.

15

SUMMARY

In spite uterine leiomyomas is the most common pelvic tumor in the woman,

relatively little is known about this pathology. Not always is symptomatic, but the

current trend to delay the maternity does that resalte the association of uterine

miomatosis with infertility and obstetrics complications. This pathology represents

in the actuality a problem of public health that deserves special attention because

of the repercussions that has for the patient and the society, for example:

excessive uterine bleeding, anemia, infertility, loss of pregnancy, surgery and

surgical risks, lost labour and the clinical attention is expensive.

Autocrine and paracrine systems regulate the cellular proliferation and the

development of the organs through the local production of growth factors and

hormones, being equally important the receptor of each one of these. In the uterine

miomatosis do not know still with accuracy the, or the factors that promote his

development, however, is known that in the pathogenesis of this neoplasm exists

an interaction between genetic alterations, sexual steroids and growth factors.

Between these factors are the angiogenics (VEGF, EGF, FGF) necessary for the

development of leiomyoma; in fact, many of the factors stimulated by steroids

hormones take part of important way in the processes of newvascularization.

The growth of leiomyoma is related to gonadal steroids mainly estrogen and

progesterone. These hormones modulate the expression of endotelin and nitric

oxide. Both proteins are produced by endothelial cells through the endotelin

transforming enzim (ECE) and nitric oxide synthase(NOS), of which know , exert

proliferatives actions on vascular smooth muscle cells, take part in the cellular

adhesión, modulate the synthesis of components of the extracellular matrix and

promote the production of growth factors involved in such process.

Of the previous arises the need of knowledge that ways are regulated ECE

and eNOS in the uterine tumor, under the action of those hormones (in base to the

16

stage of the menstrual cycle). This study was realized in samples derived from

patients whose to practiced histerectomy by uterine miomatosis of small and

medium elements; the tissues were classified of agreement a the stage of the

menstrual cycle, subsequently analysed with the technical of western blot. The

results obtained indicated that both enzims can cross-talk between them and with

the hormonal receptors, to give place to the leiomyoma growth, of this way, eNOS

is stimulated by oestrogens and ECE is stimulated by progesterone and estradiol.

17

MARCO TEÓRICO

MIOMATOSIS UTERINA.

DEFINICIÓN Y DESCRIPCIÓN

También llamado leiomioma (del griego leio:liso, mio:músculo, oma:tumor o

conjunto), fibroma, escleroma fibroide o miofibroma, el mioma uterino es un tumor

benigno monoclonal derivado de células de músculo liso con elementos conectivos

fibrosos que afecta el cuerpo uterino (Kasai y cols, 2004); son tumores bien

circunscritos, no encapsulados, pero limitados por una delgada capa de tejido

conectivo, separados, firmes, de color blanco–grisáceo con un aspecto

arremolinado característico y cuyo tamaño varia desde nòdulos pequeños

fácilmente visibles a tumores masivos que pueden abarcar toda la pelvis y

provocar síntomas compresivos (Mata y cols., 2001); rara vez se maligniza (0.5%),

transformándose en un leiomiosarcoma. El término benigno no puede ser

realmente aplicado a ciertos leiomiomas que durante la fase lútea llegan a exhibir

40 o más figuras de mitosis por 100 campos de gran aumento. Estos son los

llamados "tumores de potencial maligno desconocido". La actividad mitótica es

más alta en mujeres jóvenes, de edades comprendidas entre los 30 y 35 años que

pueden tener tumores relativamente pequeños comparados con edades

comprendidas entre los 45 y 55 años (Robboy y cols, 2000).

Los miomas uterinos, compuestos de músculo liso y tejido conectivo como

elemento de sostén, se originan en el miometrio y se clasifican de acuerdo a su

localización anatómica en: a) submucosos, se encuentran debajo del endometrio y

tienden a comprimirlo a medida que crecen hacia la cavidad uterina, es decir que

tienden a distorsionarla, son los más propensos a producir hemorragias profusas;

b) intramurales o intersticiales, se sitúan en la musculatura uterina, si son múltiples

y de gran tamaño aumentan de forma considerable el tamaño del útero; c)

subserosos o subperitoneales, se hallan en la superficie serosa del útero, tienden

18

a ser pediculados y semejar neoplasias, y d) intraligamentosos, que se ubican

entre las dos hojas peritoneales del ligamento ancho (figura 1) (Bañuelos, 2000).

Cada uno de éstos puede desarrollar pedículos y protruir al interior de la cavidad

uterina y a veces hasta pasar a través del conducto cervical (Wexler y Pernoll,

2000). Con relativa frecuencia los miomas pueden sufrir fenómenos de

degeneración: hialina o mixoide, quística, roja y/o calcificación (Bañuelos, 2000).

La sociedad Europea de Histeroscopia clasifica los leiomiomas submucosos

en tres subtipos: tipo 0-leiomioma pediculado sin extensión intramural, tipo I-sésil

con extensión intramural del leiomioma ~50%, y tipo II- sésil con extensión

intramural del 50% o más (Saavedra, 2003).

Figura 1. Clasificación de los miomas según su localización.

Entre los cambios endometriales descritos en úteros miomatosos se

encuentran atrofia, hiperplasia e inflamación, así como alteraciones en el

sarcolema de los miocitos del miometrio no neoplásico, que lleva a un acúmulo de

calcio intracelular, lo cual provoca anomalías en las contracciones rítmicas del

útero de mujeres con miomas (Robboy y cols, 2000).

Este tumor causa anormalidades menstruales, anemia, dolor pélvico,

frecuencia urinaria y otros síntomas de compresión a órganos adyacentes que

dependen del volumen uterino y que afectan de manera importante la calidad de

vida de las mujeres; la hemorragia uterina se debe a ruptura del tejido endometrial

19

o a dilatación del sistema venoso uterino. Son índices de mal pronóstico un

tamaño mayor a 5 cm y aquellos que se localizan en el fondo uterino o son

submucosos. Son causa importante de abortos espontáneos, embarazos

ectópicos o complicaciones obstétricas que incluyen abrupto placentario,

sangrado, contracciones uterinas prematuras, parto pretermino, ruptura prematura

de membranas, presentaciones anormales, limitaciones en el crecimiento del

producto o en la circulación materno–fetal (Bañuelos, 2000). Los miomas

submucosos son los que están especialmente asociados con este tipo de

complicaciones (Saavedra, 2003).

EPIDEMIOLOGÍA.

Es la neoplasia ginecológica más común; se presenta entre el 20-30% de

las mujeres después de los 30 años de edad, y su frecuencia aumenta con la

edad, aunque existe una reducción significativa en el tamaño del tumor miomatoso

en la postmenopausia (Cramer y cols, 2000). Prevalece en el 89% de las mujeres

de raza negra y en 59% de mujeres de raza blanca, teniendo como características

entre las primeras que son más jóvenes, obesas y con diferentes grados de

anemia (Morton, 2000; Stanley y cols., 2000); una de cada 4 mujeres latinas entre

los 34 y 45 años de edad presentan esta enfermedad (Mata y cols, 2006).

En la población general se encuentra en 1 de cada 4 mujeres en edad

reproductiva; representa un tercio de los ingresos hospitalarios ginecológicos, son

la causa más frecuente de histerectomía en mujeres premenopausicas y en

necropsias se ha detectado en un 50% (Sumitani y cols, 2000; Haney, 2000).

ETIOLOGIA.

Para abordar el análisis del desarrollo de leiomioma uterino, se han

subdividido los factores que pueden estar relacionados a ello, describiendose

20

como: factores de riesgo o predisponentes, iniciadores, promotores, y efectores.

Los factores de riesgo son características asociadas a una condición,

generalmente identificadas por estudios epidemiológicos; los iniciadores del

fibroma se desconocen en su totalidad, sin embargo, la aparición de aberraciones

genéticas se consideran dentro de estos factores; el papel de promotores y

efectores de crecimiento de los fibromas pertenece a las hormonas ováricas

estrógenos y progesterona (Flake y cols, 2003).

FACTORES DE RIESGO.

Los factores de riesgo asociados a los miomas son: a) menarca temprana,

ello relacionado con la aparición temprana de los ciclos menstruales que pueden

aumentar el número de divisiones celulares a los que se somete el miometrio

durante los años reproductivos, resultando esto en una mayor posibilidad de

mutaciones genéticas que alteren la proliferación celular; b) paridad, varios

estudios han demostrado una relación inversa entre paridad y el riesgo de

fibromas, ello es debido al incremento en el tiempo de exposición a los

estrógenos; c) edad, la incidencia de fibromas es mayor durante los años

reproductivos de la mujer; d) obesidad: varios estudios demuestran una asociación

entre la obesidad y una mayor incidencia de miomas uterinos (obesidad oculta

:IMC< 24 y porcentaje de grasa corporal mayor o igual a 30%, asi como

distribución de la grasa en el tronco superior del cuerpo (Bañuelos, 2000)), esto

puede relacionarse con factores hormonales, por ejemplo el incremento en la

conversión de andrógenos suprarrenales circulantes a estrona por el exceso de

tejido adiposo. En las mujeres premenopáusicas obesas, existe una disminución

del metabolismo de estradiol por la vía de conversión de la 2-hidroxilación, lo cual

reduce la conversión de estradiol a metabolitos inactivos, y ello genera un estado

relativamente hiperestrogenico; e) diferencias raciales, los fibromas uterinos

prevalecen en mujeres negras en relación a las de raza blanca, además, éstos

suelen ser más grandes, numerosos y sintómaticos y se desarrollan a una edad

más temprana entre las primeras. En varios estudios se ha observado que las

mujeres afroamericanas tienen niveles séricos de estrona, estradiol y estradiol

21

libre significativamente más altos que las mujeres caucásicas; f) tabaquismo:

varios estudios han puesto de manifiesto un menor riesgo de fibromas asociados

con el hábito tabáquico. Esto se ha visto que se debe a un aumento en la 2-

hidroxilación del estradiol, lo que disminuye la biodisponibilidad de estrógenos en

los tejidos diana además de que la nicotina reduce el efecto de aromatasa de

convertir los andrógenos a estrona g) anticonceptivos orales, existe un riesgo

mayor de presentar miofibromas en mujeres que usan anticonceptivos orales

desde edades tempranas en comparación con aquellas que nunca los han

utilizado (Flake y cols, 2003); h) factores alimentarios, debido a que en ocasiones

la carne consumida esta contaminada con hormonas (Bañuelos, 2000) (Flake y

cols, 2003).

La elevada frecuencia de los leiomiomas en la población humana también

podría explicarse por la participación de factores ambientales, tal como lo señalan

las investigaciones del Departamento de Carcinogénesis del Anderson Cancer

Center de la Universidad de Texas, en las que se ha demostrado que pesticidas

como nonifenol, bisfenol A y otros derivados industriales tienen actividad

estrogénica sobre el tejido miometrial (Fontes y cols, 2002).

Los factores que inician el desarrollo de los miomas no son conocidos

totalmente. La mayoría de los autores concuerdan con la teoría de Meyer, emitida

en 1930, quién sugirió que se originan de células musculares lisas inmaduras,

aunque también se han implicado células conjuntivas indiferenciadas y de la pared

de los vasos sanguíneos (Briseño y cols, 2001). Ya se ha demostrado que se trata

de un tumor monoclonal que surge de una mutación somática del miocito

progenitor (Rein, 2000) Esta mutación somática sola o asociada a otros factores

genéticos hace que el miocito mutado prolifere, lo que lleva a una serie de

alteraciones (cromosómicas, vasculares, anatómicas y en el metabolismo y

fisiología esteroidea y de factores de crecimiento) que favorecerán el crecimiento

del mioma y que podrían explicar las hemorragias uterinas, dismenorreas y

esterilidad asociadas a los miomas (Robboy y cols, 2000; Schwartz y cols, 2000).

La herencia familiar no se ha determinado con exactitud, sin embargo, el

boletín informativo número 23 de la FEMEGO (Federación Mexicana de

22

Ginecología y Obstetricia) de 1999 reportó que las pacientes con historia familiar

de miomas tienen dos veces más frecuencia de miomatosis que las que no tienen

este antecedente (Mata y cols., 2001).

La dependencia hormonal a estrógenos y progesterona de estos tumores

está ampliamente demostrada, pues se ha visto que sus receptores son

significativamente mayores en el mioma que en el tejido miometrial normal y la

expresión de la enzima P450 aromatasa también es mayor en el mioma, lo cual

indica que el mismo mioma sintetiza estradiol endógeno (Sumitani y cols, 2000;

Fontes y cols, 2002). En muchos casos se ha podido establecer una relación

entre los esteroides ováricos y distintas proteínas y factores de crecimiento que

regulan directamente la proliferación, apoptosis y producción de matriz

extracelular, así como la proliferación y migración de células endoteliales (figura 2)

(Fontes y cols, 2002; Bañuelos, 2000).

Fig 2. Patogénesis de los miomas.

23

FACTORES INICIADORES (ASPECTOS GENÉTICOS) DEL MIOMA.

En el desarrollo de los miomas existen aberraciones cromosómicas hasta

en el 40% de los casos (Bañuelos, 2000). Los trastornos genéticos más frecuentes

son translocaciones entre los brazos largos de los cromosomas 12 y 14 y

delecciones del brazo largo del cromosoma 7 (Rein, 2000; Morton, 2000; Carrera,

2001). Se encuentran con más frecuencia anomalías de traslocación en los

miomas grandes y de delección en miomas menores (4-5cm). Por otra parte, los

miomas submucosos tienen menos anomalías citogenéticas que los intramurales y

subserosos (Carrera, 2001). Otra alteración cromosómica que se ha encontrado

en estas pacientes es la desregulación del gen HMGIC (Bañuelos, 2000; Morton,

2000).

FACTORES PROMOTORES Y EFECTORES: EXPRESIÓN DE

FACTORES DE CRECIMIENTO, HORMONAS Y SUS RECEPTORES EN LOS

MIOMAS.

Los sistemas autocrinos y paracrinos regulan la proliferación celular y el

desarrollo de los órganos a través de la producción local de factores de

crecimiento y hormonas, siendo igualmente importante el receptor de cada uno de

éstos, pues sin el receptor apropiado, ninguna célula reacciona a un factor de

crecimiento ni hormona determinada, independientemente de su concentración.

En el caso del mioma, se ha postulado que son las hormonas esteroideas

sexuales ováricas, factores de crecimiento y factores relacionados con apoptosis

los que regulan su crecimiento (ver figura 3) (Dixon y cols, 2000; Hyder y cols,

2000; Maruo y cols., 2004)

24

Figura 3. Esteroides sexuales como principales responsables de la patogénesis de los miomas.

Estrógenos.

Evidencias epidemiológicas como son la mayor frecuencia en edad fértil o la

disminución del tamaño tumoral con la menopausia sugieren una relación directa

de los miomas con los estrógenos (Cramer y cols, 2000; Sumitami y cols, 2000).

Ademas, se ha comprobado que en el tejido miomatoso existe mayor conversión

de andrógenos a estrógenos y menor formación de estrona a partir de estradiol.

Todo ello hace que en el mioma exista un ambiente hiperestrógenico (Rein, 2000),

Los estrógenos (17 β-estradiol o E2, estrona o E1 y estriol o E3) son

hormonas sexuales esteroideas derivadas del colesterol producidas en la mujer

principalmente por las células de la teca y de la granulosa en los ovarios. Las

células de la teca secretan andrógenos que difunden a las células de la granulosa

para ser aromatizados a estrógenos; ambos tipos de células son capaces de

sintetizar andrógenos y estrógenos. En tejidos periféricos, la producción de

diferentes estrógenos y su interconversión depende de la expresión local y de la

actividad de aromatasa, deshidrogenasa 17β-hidroxiesteroide y estrona-

sulfatasas. Dicha producción extragonadal depende de la presencia de

25

precursores androgénicos C19, debido a la incapacidad de los tejidos periféricos

de convertir el colesterol en esteroides C19; como consecuencia, los niveles

circulantes de testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona (DHEA) y

sulfato- dehidroepiandrosterona (DHEAS), llegan a ser muy importantes en

cuestión de proveer un adecuado substrato para la biosíntesis de estrógenos en

esos sitios, además de la formación de estrona y estriol en el hígado(Gruber y

cols, 2002; Simpson y cols, 2005; Yager y Davidson, 2006).

La aromatización es una reacción catalizada por la enzima aromatasa

(CYP19), en la que mediante tres hidroxilaciones consecutivas forma estrona y

estradiol a partir de androstenediona y testosterona respectivamente (Yager y

Davidson, 2006).

Los estrógenos poseen funciones en la fisiología reproductiva femenina y

masculina, estimulando el crecimiento y diferenciación celular de tejido mamario,

de útero, vagina, ovarios, testículos, epididímo y próstata; incrementan la

producción de proteínas hepáticas, como son los factores de coagulación,

intervienen en el mantenimiento de las características sexuales secundarias de la

mujer, del embarazo, en el control del ciclo menstrual- ovulatorio y en la

modulación de algunos procesos metabólicos. Estas hormonas tienen un papel

importante en la fisiología cardiovascular (Franco y cols, 2003), además son

vasodilatadores debido a que incrementan la formación y liberación del oxído

nítrico y prostaciclinas de células endoteliales (Gruber y cols, 2002) ; también son

requeridos para el crecimiento y diferenciación neuronal interviniendo en las

funciones cognitivas y del estado de ánimo, adicionalmente son neuroprotectores

y también intervienen en el desarrollo del hueso y el mantenimiento de la densidad

ósea (Sumitani y cols, 2000; Franco y cols., 2003; Simpson y cols, 2005).

Receptores de estrógenos.

Las acciones de los estrógenos son realizadas a tráves de la interacción

con sus receptores (ER), los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en el

organismo (cerebro, mama, útero, piel, endotelio, músculo liso) y a nivel celular se

26

clasifican: a) de localización intranuclear, cuya activación induce la síntesis

proteica; b) de localización intracitoplásmica y membranal, su activación provoca

la estimulación de diversas vías de señalización (Tommaso y Gennazzani, 2003;

Björnström y Sjöberg, 2005)

Desde el punto de vista estructural, se han identificado dos formas de ER:

ERα y ERβ. El gen codificador de ERα se encuentra en el cromosoma 6, este

receptor se ubica principalmente en el endometrio, en el estroma ovárico, en

células de cáncer de mama, hipotálamo y núcleo ventromedial en cerebro; el gen

del ERβ se encuentra en el cromosoma 14, se ubica principalmente en las células

de la granulosa, aunque también se ha encontrado en riñón, mucosa intestinal,

parénquima pulmonar, médula ósea, hueso, cerebro, células endoteliales y

glándula prostática (ver tabla 1) (Gruber y cols, 2002).

RECEPTOR α RECEPTOR β

Útero Epitelio mamario Estroma prostático Estroma mamario Celulas de la teca en ovario Cerebro Hueso Ganglios simpáticos Epitelio mamario Colon Estroma mamario Epitelio prostático Vagina Celulas de la granulosa Músculo liso vascular Espina dorsal Cerebro Médula ósea Riñón Parénquima pulmonar

Tabla 1. Localización de receptores estrogénicos (Tomado de TRENDS in Pharmacological Sciences, 2003, 24).

A través de sus receptores, los estrógenos pueden tener los siguientes

mecanismos de acción: genómicos y no genómicos. En el modo genómico, en

general se acepta que el complejo receptor-estrógeno se une a DNA y estabiliza a

otro complejo de proteínas que incluyen a la RNA-polimerasa y otras proteínas

necesarias para el inicio eficaz de la síntesis de RNA; las respuestas a los

estrógenos en algunos tejidos pueden deberse a la activación directa de un solo

gen o a un número limitado de genes. Así, para respuestas más complejas, se

cree que el complejo estrógeno-receptor activa inicialmente la transcripción de

27

“genes” de acción temprana” cuyos productos regulan una cascada de fenómenos

secundarios comprendidos en la respuesta tisular general. Ambos subtipos de

receptores pueden mediar la transcripción genética por dos vías distintas: 1)

interactuando con secuencias de nucleótidos específicas: los elementos de

reacción estrogénica (ERE), lo cual permite la regulación de la transcripción de

genes regulados por hormonas, o 2) por la activación de la vía AP-1, un factor de

transcripción nuclear involucrado en la inducción de respuesta de factores de

crecimiento (Sánchez y Benítez, 2003). El modo de acción no genómico de los

estrógenos, es rápido y solo requiere la unión del esteroide con un receptor

ubicado en la membrana citoplasmática e inicia una cascada de fosforilación de

una serie de enzimas citosólicas (figura 4) (Lee y McEwen, 2001).).

Fig 4. Mecanismos de acción de los estrógenos. A) Mecanismo genómico directo: la forma nuclear del receptor estrogénico ERα o ERβ se asocia al ERE (elemento de respuesta al estrógeno) o a heteodímeros fos/jun que, a su vez, se unirán a sitios AP-1. B) Mecanismos genómicos indirectos: activación de un ER asociado a sistemas de señalización de segundos mensajeros los cuales convergen con la vía genómica. En una de estas vías Ras activa a Raf, con la fosforilación y activación de MAPK/ERK; ERK activada se traslada al núcleo e interactua con factores nucleares de transcripción o a través de la activación de proteínas intermedias de señalización hasta unirse con las regiones reguladoras de ADN: CRE (elementos de respuesta al AMPc) y SER (elementos de respuesta del suero). Los efectos estrogénicos no genómicos se alcanzan con altas concentraciones e implican mecanismos antioxidantes no mediados por ERs.

(Tomado de Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2001; 41:569-591).

28

En el útero se han descrito las dos isoformas de receptores de estrógenos,

siendo el principal, el receptor proteíco alfa que media la clásica acción

estrogénica en las glándulas y estroma endometrial (Vasconcellos y cols, 2005).

Estrógenos y miomatosis uterina.

El tejido miomatoso responde por efecto de los estrógenos sintetizando

factores de crecimiento y componentes de la matriz extracelular, por lo que se

deduce que estas homonas tienen efecto fibrótico en el mioma, mediante la

inducción directa o indirecta de componentes de la matriz extracelular (Cesen-

Cummings y cols, 2000).

Los esteroides ováricos aumentan el tamaño del leiomioma al mismo

tiempo que preservan su actividad benigna manteniendo su diferenciación; 50%

de los miomas presentan un aumento de la actividad mitótica durante la fase

luteinica del ciclo, mientras que permanecen relativamente inactivos durante la

fase folicular (Mata y cols., 2001).

La concentración fisiológica normal de estradiol en sangre de mujeres

premenopáusicas es de 20 a 400 pg/ml (en mujeres postmenopáusicas es de 5 a

25 pg/ml) y dentro de los miomas estos niveles se incrementan de 2 a 3 veces

(Lierh, 2000; Parker, 2007).

El ovario representa la fuente principal de estrógenos (y probablemente de

progesterona) para el crecimiento del mioma; sin embargo, el tejido miomatoso por

si mismo sintetiza estrógenos, pues se ha demostrado la expresión de aromatasa

en el tumor (Kasai y cols, 2004; Shozu y cols, 2003; Sumitani y cols, 2000), y de

igual manera, 17β-Hidroxiesteroide deshidrogenasa (17 β-HSD) tipo 1, se

encuentra sobreexpresada en células de mioma en comparación al miometrio

adyacente (Kasai y cols, 2004).

Así, los estrógenos promueven el crecimiento del leiomioma a través de la

estimulación de la síntesis del mRNA de colágena I y III, la proteína conexina 43

de las uniones GAP, el factor de crecimiento epidérmico (Rein, 2000), y por otra

parte inhiben la expresión del p53 (Maruo y cols, 2004). Los efectos mitogénicos

de los estrógenos en el leiomioma se deben a la activación de MAPK y a la

29

estimulación de la transcripción de proteína tirosina cinasa, de proteínas

intracelulares como la asociada al crecimiento (GAP), fosfatidilinositol-3- cinasa

(PI-3-K), y fosfolipasa C (PLC) (Barbarisi y cols., 2001).

En el mioma, los estrógenos estimulan la síntesis de diferentes factores de

crecimiento como el factor transformante β3 (TGF-β3), el cual también es capaz

de inducir la síntesis de componentes de la matriz extracelular; estas hormonas

también inducen la síntesis de receptores de progesterona y otros factores de

crecimiento y sus receptores: factor de crecimiento insulina (IGF) tipo I y tipo II,

factor de crecimiento epidérmico (EGF), proteína relacionada con la hormona

paratiroidea, prolactina, miembros de la familia de factores de crecimiento que fijan

heparina (factor derivado de plaquetas, factor de crecimiento del endotelio

vascular, factor fibroblástico básico, factor de crecimiento epidérmico que liga

heparina) (Cesen-Cummings y cols, 2000; Maruo y cols, 2004). El factor derivado

de plaquetas (PDGF) es un potente mitógeno para las células de músculo liso y

los fibroblastos, por lo que estimulan la síntesis de DNA y la proliferación celular

en miomas (Dixon y cols, 2000; Arici y Sozen, 2003).

Dentro de los tumores endometriales se ha descrito la presencia de ERα y

ERβ en las células perivasculares, mientras que ERβ solo se ubica en endotelio

de microvasos endometriales de humano, sugiriendo que estos últimos responden

a alguno de los efectos directos de los estrógenos sobre los vasos, teniendo un

efecto inhibitorio sobre la angiogénesis (Vasconcellos y cols, 2005).

Progesterona.

La progesterona es una hormona que se produce en el cuerpo lúteo ovárico

durante la segunda parte del ciclo menstrual. Es un esteroide de 21 átomos de

carbono que procede de la pregnenolona. Su función principal es la preparación

de la membrana mucosa del útero para la recepción del óvulo; también estimula la

formación de estructuras saculares en las mamas, las prepara para la producción

de leche y mantiene esta función durante la lactancia; influye en el crecimiento, la

maduración, la diferenciación sexual, la excitabilidad neuronal y el despliegue de

la conducta sexual en el sistema nervioso central de los mamiferos (Gutierrez y

30

cols, 2000; Guerra y Camacho, 2000). Asimismo, la progesterona contribuye a la

inhibición de las contracciones uterinas, disminuye las conexiones gap, estimula la

actividad del óxido nítrico sintetasa uterina y regula la secreción de citocinas

(Barrera y cols, 2007).

Esta hormona ejerce sus acciones en gran parte porque promueve la

transcripción de genes específicos dependiendo del tipo celular. Por otra parte, a

través de su acción no genómica, la progesterona tiene efectos de inicio “rápido”

(segundos a minutos) los cuales resultan de la activación de diferentes vías de

señalización que involucran proteínas de membrana (ver figura 5) (Barrera y cols,

2007).

Fig 5. Mecanismo de acción genómica de progesterona. A) Formación del complejo hormona-receptor, dimerización e interacción con el DNA sobre elementos de respuesta a P4 para iniciar la transcripción. B) Biosíntesis de andrógenos y estrógenos a partir de P4 mediante sus correspondientes citocromos P-450C-17 y P450 aromatasa. C) Principales componentes del

receptor de Progesterona (hRP)(Tomado de Revista de Investigación clínica, 2007, 59:139-145).

Receptores de progesterona

En el ser humano existen principalmente dos isoformas del receptor para

progesterona que son estructuralmente similares, pero diferentes funcionalmente:

el receptor A (hPRA) de 72-86 kDa y el B (hRPB) de 110-120 kDa; la diferencia

31

entre éstas es de 164 aminoácidos presentes en el extremo amino-terminal de PR-

B (Guerra y Camacho, 2000); ambos pertenecen a la familia del tipo I de los

receptores a hormonas nucleares (Barrera y cols, 2007). Las dos isoformas de

receptores de progesterona tienen distintas funciones; PR-B funciona como un

activador transcripcional de genes de progesterona, mientras que PR-A puede

funcionar como un inhibidor transcripcional (ver tabla 2) (Chein y cols, 2006).

PR “A” PR “B”

Represor de la actividad transcripcional Activador transcripcional de genes Mayor afinidad por correpresores transcripcionales

Poca afinidad por correpresores transcripcionales

Incapaz de reclutar coactivadores transcripcionales

Recluta coactivadores transcripcionales

Principal modulador de los efectos como hormona esteroidea

Localización principalmente en cerebro: hipotálamo, área preóptica, hipófisis

Inhibe la actividad transcripcional de receptores estrogénicos

En útero su expresión es inducida por estradiol

Mayor localización en útero: endometrio, epitelio glandular y estroma

Tabla 2. Características funcionales de los receptores “A” y “B” de progesterona. (Tomado de La Rev de Inv Clín, 2000,52:686-691).

La progesterona a nivel molecular inhibe la síntesis y reposición de los

receptores de estrógenos, de tal manera que puede actuar disminuyendo el

número de receptores estrogénicos y haciendo que las células disminuyan su

reactividad a los mismos (Vasconcellos y cols, 2005).

Progesterona y miomatosis uterina

En cuanto a la relación de la progesterona con el mioma, se ha encontrado

una sobreexpresión del receptor de progesterona en el mismo, la cual es capaz de

inducir mitosis e inhibir la apoptosis in Vitro en miocitos de miomas (Rein, 2000;

Maruo y cols, 2000).

Se ha demostrado que esta hormona eleva la expresión o altera la función

de distintos factores de crecimiento y sus receptores específicos; un ejemplo de

ello es el factor de crecimiento epidérmico (EGF) que tiene actividad mitógena en

ovario y endometrio. La producción de EGF parece ser uno de los mecanismos a

32

través de los cuales la progesterona estimula la actividad mitótica en los

leiomiomas durante la fase lútea (Rein, 2000; Mata* y cols., 2001). De igual

manera, esta hormona estímula la expresión del factor de crecimiento

transformante (TGF1 y TGFβ3), estimula la sobreexpresiòn de Bcl-2 con lo cual

inhibe la apoptosis (Rein, 2000) y aumenta ligeramente la expresión del TNF en

células de leiomioma (Nowak, 2001; Maruo y cols, 2004). El efecto inhibitorio de

esta hormona respecto al crecimiento y supervivencia de estos tumores, ocurre al

disminuir la expresión de IGF-1 (Yamada y cols., 2004)

Las progestinas también inducen la expresión (aunque en menor cantidad y

frecuencia) de VEGF, principalmente en el estroma del útero; elevan los niveles de

mRNA de VEGF de modo uniforme por todo el estroma, mientras que los

estrógenos activan su expresión principalmente en la región del estroma cercana

al lumen uterino. La expresión de VEGF en el útero es bloqueada por mifepristona

(RU-486). Así, al regular la expresión de VEGF y otros factores como el factor de

crecimiento de fibroblastos (FGF), progesterona y estrógenos intervienen de

manera muy importante en la angiogénesis (Salman y cols., 2000).

El factor de necrosis tumoral alfa (FNT-) es una citocina producida por

macrófagos activados y por varios tipos celulares en los órganos reproductores

femeninos. Se trata de un inductor importante de apoptosis a través de la

activación de caspasas. (Maruo y cols, 2004). Kurachi y colaboradores en 2001

demostraron que la expresión de FNT- es más alta en mioma que en miometrio

durante la fase proliferativa del ciclo celular.

La proteína antiapoptótica Bcl2 se expresa de manera considerable en los

miomas, aumenta su efecto con la progesterona y su expresión se mantiene en el

tratamiento con análogos agonistas de LH-RH (Bañuelos, 2000).

33

OTROS MEDIADORES DEL CRECIMIENTO DEL MIOMA. FACTORES DE

CRECIMIENTO.

Adicionalmente a estradiol y progesterona, los andrógenos y prolactina se

han relacionado con la leiomiomatosis uterina.

Andrógenos: En varios estudios se ha demostrado que los niveles de

androstenediona y testosterona se encuentran por encima de las concentraciones

normales en pacientes con estos tumores (Yager y Davidson, 2006).

La testosterona es una hormona androgénica producida por las células de

Leydig en el testículo; se sintetiza a partir del colesterol y para realizar su acción

fisiológica debe reducirse y formar 5-alfa-dihidrotestosterona, que es la hormona

activa. También se puede sintetizar en la zona rugosa de la corteza suprarrenal,

en las células tecales del ovario y en la placenta. La hormona luteinizante es la

hormona reguladora específica de la producción de testosterona (Heinlein y

Chang, 2002).

La actividad biológica de testosterona y dihydrotestosterona ocurre a través

de su unión a receptores de andrógenos (AR). Estas hormonas inducen una

rápida activación de la cascada de señalización de cinasas, es decir tienen un

modo de acción no genómico, y a través de ello contribuye a la regulación

transcripcional de la actividad de los AR, o de la globulina fijadora de hormonas

sexuales (SHBG) (Heinlein y Chang, 2002). Por otro lado, la testosterona y los

andrógenos atraviesan fácilmente la membrana celular y se unen a receptores

intracelulares específicos. Estos receptores que han sido purificados, son

proteínas con un peso molecular de aproximadamente 120 kilodaltons. Su síntesis

está determinada genéticamente en el cromosoma X. La dihidrotestosterona se

une al receptor cerca del carboxilo Terminal (Tommaso y Genazzani, 2003).

Por otra parte se ha reportado que existe un incremento significativo en la

actividad de 5α-reductasa en miomas en comparación al endometrio y miometrio

(Rein, 2000), asi mismo la 17β-HSD cataliza la interconversión entre

androstenediona y testosterona, y entre estrona y estradiol; de este modo, se

asegura el crecimiento del mioma de modo paracrino/autocrino/intacrino (Shozu y

cols, 2004; Sumitani y cols, 2000).

34

Prolactina: Aunque no esta totalmente definido el papel de prolactina en los

miomas, si se ha encontrado mayor cantidad de sus receptores en estos tumores,

(Maruo y cols, 2004). In vitro la prolactina (PRL) tiene actividad mitógena en

células de leiomioma, y se conoce que tanto células del miometrio como de

leiomiomas producen PRL en respuesta a la gonadotrofina coriónica humana

(HCG). Los estrógenos también estimulan la secreción de prolactina en cultivo

celular de tejido miomatoso, y por otro lado, la progesterona tiene un efecto

supresor sobre esta hormona (Flake y cols, 2003).

Se han identificado varios factores de crecimiento y sus receptores en

mioma y miometrio, aquellos que han recibido mayor atención en la literatura han

sido los siguientes:

El factor de crecimiento insulínico (IGF-I) es un polipéptido de 70

aminoácidos cuya molécula presenta aproximadamente un 50% de similitud en

secuencia a la proinsulina; se produce en respuesta a señales de la hormona de

crecimiento (HG). LA familia de IGFs consiste en dos IGFs (IGF-I e IGF-II), dos

receptores de membrana celular (IGF-IR e IGF-IIR), y en seis proteínas IGF de

unión; son producidos por la mayoría de tejidos en el cuerpo, abundan en la

circulación y pueden ejercer sus efectos de modo autocrino, endocrino o paracrino

(Flake y cols, 2003; Dixon y cols, 2000). Es un importante mitógeno y coopera con

el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) para aumentar la

capacidad de las células en la síntesis de ADN (Craig y cols, 2002). Se une a su

receptor específico ejerciendo un efecto mitógeno tanto sobre el ovario como

sobre el endometrio. El factor de crecimiento tipo insulina I y II son el principal

agente anabólico responsable del crecimiento y diferenciación celular, además

regula el efecto biológico de la hormona de crecimiento (HG) en varios tipos

celulares (Horiuchi y cols, 2000). IGF –I y IGF-II son producidos por células

uterinas y su expresión es regulada por los esteroides ováricos. Se ha identificado

la presencia de RNAm para IGF-I e IGF-II y sus receptores en miometrio y

tumores fibrosos. IGF-I es un importante promotor de mitosis en cultivos celular de

leiomiomas (Flake y cols, 2003). El IGF-I es mitogénico para las células

musculares lisas de útero, sobre todo en combinación con EGF y el factor de

35

crecimiento derivado de plaquetas (Rein, 2000; Fontes y cols, 2002). IGF-1 puede

promover el crecimiento de miomas de modo autócrino/parácrino (Duan 2002). Se

ha encontrado que la expresión de genes para IGF-I es más abundante en

miomas durante la fase proliferativa del ciclo menstrual, lo cual sugiere que son los

estrógenos los que promueven la sobreexpresión de este factor (Rein, 2000; Flake

y cols, 2003). Además, este factor promueve la supervivencia porque promueve la

sobreexpresiòn de Bcl-2 y PCNA (Gao y cols., 2001). IGF-I en leiomiomas decrece

significativamente en las pacientes menopaúsicas o durante el tratamiento con

aGnRH (Fontes y cols, 2002).

El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es un mediador de los

estrógenos y juega un papel importante en la regulación del crecimiento del mioma

(Dixon y cols, 2000). La adición de estradiol 10 ng/ml o de progesterona 100 ng/ml

a cultivos de células de leiomiomas resulta en un incremento de la expresión de

antígenos nucleares de dichas células, pero en cultivos de células miometriales

normales ocurre el mismo fenómeno con estradiol pero no con progesterona. El

análisis inmunoblot revela que las células de leiomioma contienen EGF y que la

progesterona incrementa su expresión, mientras que los receptores de EGF se

ven incrementados con el tratamiento con estradiol pero no con progesterona. Por

ello el estradiol y progesterona actúan en combinación para estimular la

proliferación del mioma a través de la inducción de EGF y de la expresión de sus

receptores (Fontes y cols, 2002).

Los miembros del factor de crecimiento transformante β, son citocinas que

tienen un papel importante en la morfogénesis y el crecimiento celular (Ingman y

Robertson, 2002). Se trata de una superfamilia que incluye más de 30 polipéptidos

relacionados estructuralmente, los cuales actúan como citocinas multifuncionales

que pueden inhibir o estimular la replicación celular; son polipéptidos análogos

estructuralmente a la inhibina y a la sustancia inhibidora Müllerina (MIS). Los

efectos de IGF-β pueden ser estimulantes o inhibitorios dependiendo de varios

factores los cuales incluyen la concentración del mismo, la especificidad de la

célula blanco y la presencia de otras moléculas reguladoras. Así, a bajas

concentraciones TGF-βI y TGF-β3 estimulan la proliferación de células de

36

músculo liso (Flake y cols, 2003), y por otra parte tienen actividad inhibitoria sobre

el crecimiento a través del bloqueo de la acción mitógena del EGF y de

Interleucina-2. Así, en algunos tejidos y bajo ciertas condiciones, TGFβ está

considerado como un gen supresor debido a que su acción antiproliferativa

supera en algunas ocasiones la acción de los mitógenos. En miometrio humano se

ha demostrado la presencia de los tres tipos de TGF-B al igual que los niveles del

mRNA de TGF-β3 (3.5 veces mayor en miomas) (Flake y cols, 2003). Los niveles

más altos aparecen en la fase folicular tardía y comienzo de la fase lútea, para

disminuir al final de la misma, lo que hace pensar que TGF –β3 es estimulado por

los estrogénos e inhibido por la progesterona en el tejido uterino humano. Además

puede inhibir la actividad mitógena del IGF-I y IGF-II durante la fase folicular.

Finalmente la TGFβ estimula la formación de la matriz extracelular acelerando la

incorporación de fibronectina y colágeno e induciendo la producción del péptido

relacionado con la Hormona Paratiroidea (PTHrP) (Maruo y cols, 2004). El

contenido extracelular de TGFβ en los leiomiomas sugiere que estimulan su

crecimiento al incrementar la expresión de los componentes de la matriz

extracelular durante la fase folicular (Mata y cols., 2001).

El factor de crecimiento transformante α (TGF- α), se expresa en las células

de músculo liso de leiomiosarcomas uterinos, pues se conoce que esta

involucrado en la transformación de fibroblastos normales a un fenotipo maligno

(Dixon y cols, 2000).

El factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) regula la angiogénesis, éste

factor incrementa la proliferación, migración y diferenciación de células

endoteliales, de músculo liso y de fibroblastos, los cuales expresan receptores

para dicho factor. El FGF actúa sinérgicamente y estímula la síntesis de VEGF

(Salman y cols, 2000). Se ha demostrado que existe una mayor expresión del

mRNA de FGF y de su receptor tipo I en miomas que en miometrio. Stewart y

Nowak en 1998 sugieren que TGF-β3 y FGF tienen un papel central en la

patogénesis del mioma uterino (Flake y cols, 2003; Dixon y cols, 2000).

Los factores de crecimiento ligados a la heparina juegan un importante

papel en el desarrollo de los miomas, son factores angiogénicos y estimulan la

37

proliferación de vasos siendo algunos mitogénicos para las fibras musculares

lisas (Fontes y cols, 2002).

El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un potente

mitógeno para las células de músculo liso vasculares. Debido a su capacidad para

ligar heparina, estos factores pueden secuestrar componentes de la matriz

extracelular, lo cual es una de las principales características de los fibromas y por

tanto, servir como un reservorio para estos factores de crecimiento. Los valores

de RNAm de PDGF son similares en mioma y miometrio, sin embargo, existe

mayor cantidad de receptores de este factor en mioma que en miometrio. La

importancia de este factor en el desarrollo de los miomas esta aunado a su acción

conjunta con otros factores tales como IGF y EGF, por ejemplo, cuando las células

del miometrio son tratadas al mismo tiempo con PDGF y EGF hay un incremento

sinérgico en la síntesis de DNA, de igual modo, insulina y PDGF experimentan un

efecto aditivo en la síntesis de DNA en células de miometrio y mioma (Flake y

cols, 2003).

Hormona de crecimiento. Se ha demostrado la presencia de receptores de

la hormona de crecimiento (HC) en estos tumores. Por otro lado, se ha observado

una alta incidencia de leiomiomas (81%) en pacientes con acromegalia, en

quienes el exceso de hormona de crecimiento se piensa que tenga un papel

importante como causa de miomas (Saavedra, 2003).

Otro hallazgo importante es la proteína Bcl-2, inhibidora de apoptosis, que

se expresa abundantemente en los miomas y es regulada al alza por progesterona

pero a la baja por estradiol (Fontes y cols, 2002), además de que su expresión se

mantiene en el tratamiento con análogos agonistas de LH-RH (Bañuelos 2000).

ENZIMA CONVERTIDORA DE ENDOTELINA

La enzima convertidora de endotelina (ECE) es la responsable de la

conversión de prehormonas a péptidos activos, dando como resultado las

endotelinas, de las cuales las más importantes son ECE1 y ECE2 (Baltazares y

cols, 2005).

38

Las endotelinas son una familia de péptidos de 21 aminoácidos integrada

por ET-1, ET-2 y ET-3 que son secretadas por diferentes tejidos (Ouviña y cols,

2004)

La endotelina-1 es la isoforma más importante y predominante de las tres;

es sintetizada principalmente por las células del endotelio, aunque también la

sintetizan las células del músculo liso vascular, células mesangiales, células de la

glia neuronal y células hepáticas. La ET–1 no es una hormona circulante, sino que

actúa como un factor autocrino/paracrino en múltiples sitios. Ejerce una acción

vasoconstrictora y proliferativa sobre las células del músculo liso vascular;

promueve la producción de fibroblastos, modula la síntesis de la matriz

extracelular, causa hipertrofia de las células de músculo liso vascular y células

mesangiales, afecta la permeabilidad vascular, interviene en la inflamación y es

estimulante del sistema nervioso simpático. La síntesis de las endotelinas es

regulada por factores fisicoquímicos, tensión pulsátil, lesión endotelial y pH; el

ejercicio miocárdico sobrerregula la expresión de ET-1; de igual manera, la

hipoxia y la isquemia son importantes estímulos para su producción, también

puede ser inducida por catecolaminas, angiotensina, lipoproteínas de alta y baja

densidad, glucosa, TGFb, citocinas, iones de calcio, moléculas de adhesión,

niveles elevados de colesterol, obesidad, mediadores pro-coagulantes semejantes

a trombina y la deficiencia de estrógenos (Melgarejo, 2005). En contraste,

vasodilatadores como el oxído nítrico y prostaciclina (PGE1, PGE2) inhiben la

producción de endotelina -1 a través de mecanismos comunes que involucran la

producción de guanosin monofosfato cíclico (GMPc). El péptido natriurético, inhibe

la producción basal de endotelina. Estas mismas hormonas inhiben el efecto

mitógeno y vasoconstrictor estimulado por la endotelina (Baltazares y cols, 2005).

El 2-hidroxiestradiol y 2-metoxiestradiol, inhiben la secreción de endotelina–1 por

un mecanismo independiente de receptores de endotelina, por inhibición de la

activación de MAPK en células vasculares de músculo liso (figura 6) (Raghvendra

y cols, 2001). La endotelina a su vez, estímula la secreción de NO, péptido

natriurético, aldosterona y prostaglandinas (De la Vega y cols, 2005).

39

Fig 6. Célula endotelial: síntesis de endotelina-1 / factores de estimulación e inhibición (Tomado de Rev Ins Nal Enf Resp Mex, 2005,18:308-320).

La ET – 1 y el receptor ETA participan en el mantenimiento basal del tono

vasomotor y de la presión sanguínea en los humanos. Por otro lado, la ET–1 es un

mitógeno directo de células de músculo liso que actúa por activación de ambos

receptores (ETA –ETB) y estimula, a su vez, la producción de citocinas y factores

de crecimiento. También induce la formación de proteínas de la matriz extracelular

y fibronectina, y potencia el efecto del factor de crecimiento transformante-beta

(TGF-b) y del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). El efecto en la

producción de colágena es mediada por ambos receptores ETA y ETB, y en

fibroblastos de piel; en fibroblastos cardíacos el mediador son los receptores ETB.

La ET-1 también posee una potente acción proinflamatoria; por otro lado, induce

agregación plaquetaria y estimula la producción de aldosterona por un mecanismo

mediado por receptores ETB (Baltazares y cols, 2005).

La endotelina–2 es producida primariamente en el riñón, en intestino y en

menor cantidad en placenta, útero y miocardio (Baltazares y cols, 2005).

La endotelina-3 es la de menor efecto vasoconstrictor y se produce en

cerebro, vías digestivas y en menor proporción en pulmones y riñón (Baltazares y

cols, 2005).

40

Cada uno de los péptidos de endotelina es codificado por un gen

independiente en diferentes cromosomas 6(1), 1(2) y 20(3), y una vez sintetizada,

la endotelina se une a receptores específicos y actúa como una sustancia

paracrina/autocrina (Baltazares y cols, 2005).

Se han caracterizado dos subtipos de receptores de alta afinidad que

pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G, a través de los

cuales se median los efectos de ET, receptores ET A y ET B. Los receptores tipo

ET A tienen 10 veces más afinidad por ET-1 y ET-2 y se encuentran sobre las

células de músculo liso vascular y en los cardimiocitos y son mediadores de

vasoconstricción. Los receptores ET B se encuentran principalmente en las células

endoteliales y en menor proporción en las células de músculo liso, riñón, hígado y

útero; su estimulación produce vasoconstricción y vasodilatación, ésta última

mediada por un aumento en la producción de ON y prostaciclina (figura 7)

(Goraca, 2002)

Fig 7. Mecanismo de acción sobre receptores ET-A (Tomado de Rev Ins Nal Enf Resp

Mex, 2005,18:308-320).

41

Receptores para endotelina 1 y 2 se han detectado en miometrio y

leiomioma, aunque la isoforma A es mucho más abundante en el leiomioma

(Breuiller-Fouché y cols, 1997 Maruo y cols, 2004)). En cultivo célula celular la

endotelina -1 no puede estimular por si misma la síntesis de DNA, pero si puede

favorecer el crecimiento del leiomioma a través del efecto de FGF, EGF, IGF-I e

IGF-II por vía proteína cinasa C dependiente, así pues, la endotelina estimula el

crecimiento del leiomioma de forma autócrina/paracrina (Eude y cols, 2001).

Endotelina 1 y 3 actúan por vía del receptor de ETB, y estimula la migración

celular endotelial y la proliferación. Se ha demostrado que la ocupación de los

receptores de endotelina ETB se acompaña de la activación de la óxido nítrico

sintasa endotelial, lo cual implica que los efectos mitógenos de los miembros de la

familia de endotelina esta mediada por la liberación de óxido nítrico. Así pues, hay

evidencias recientes de que la liberación de óxido nítrico es un requisito para la

motilidad celular epitelial y endotelial. La producción de la actividad angiogénica

por monocitos activados es dependiente de L-arginina y sintasa de óxido nítrico.

Así pues, el efecto de endotelina-1 sobre la migración celular es mediada por vía

del receptor de ETB y requiere de la generación de NO (Noiri y cols, 1997).

SINTASA DE ÓXIDO NÍTRICO.

La sintasa de óxido nítrico (NOS) es la enzima que cataliza la reacción en la

cual se libera oxído nítrico por la conversión de L-arginina en L-citrulina, reacción

para la cual también se requiere la presencia de calmodulina y de cuatro

cofactores que son: flavin mononucleotido, flavin adenina dinucleótido,

tetrahidrobiopterina y NADPH (figura8) (Rodrigo y cols, 2000; Searles, 2006).

42

Figura 8. Estructura de la sintasa de óxido nítrico. Cada subunidad consta de un dominio con actividad de reductasa y otro de oxidasa. El dominio reductasa es capaz de transferir electrones de NADPH a FAD y FMN; tiene la función de reducir oxígeno molecular a O.-. Los monómeros y el dominio reductasa se unen a calmodulina (CaM), para estimular el flujo de electrones, pero no se pueden unir a BH4 o L-arginina, por lo que no se puede producir NO. La presencia del grupo hem permite la dimerización de NOS. En presencia de L-arginina, BH4 y el grupo hem, ocurre la dimerización y la reducción del oxígeno molecular, con la consecuente producción de NO. (Tomado de Förstermann y Münzel, 2006).

Se han identificado tres isoformas de esta enzima: la endotelial o tipo III

(eNOS), presente en las células endoteliales tanto en grandes vasos como en

microvasos y capilares; la neural o tipo I (nNOS), y la calcio independiente (iNOS).

Las dos primeras son calcio/calmodulina dependientes, se encuentran en el

citosol, y solo producen cantidades importantes de NO al ser activadas por una

elevación de calcio intracelular. La iNOS o calcio independiente, es inducible en

macrófagos, hepatocitos, neutrófilos, músculo liso y endotelio en respuesta a

diferentes estímulos inmunológicos tales como interferón gama, factor de necrosis

tumoral alfa y lipopolisácarido bacteriano, los cuales generan gran cantidad de NO

que puede ser tóxico para las células tumorales o infectadas por virus (Ouvina y

cols, 2004).

La isoforma nNOS es un homodímero soluble de 155kDa, o también se

describe como un monómero de 150kDa; la isoforma eNOS tiene un tamaño de

135kDa; por su parte la iNOS tiene una conformación dimérica y una masa

molecular de 135kDa (Rodrigo y cols, 2000).

43

NOMENCLATURA

NUMERICA NOMENCLATURA DESCRIPTIVA CARACTERISTICAS

NOS1

e-NOS (constitutiva o reguladora de calcio b-eNOS (de cerebro) bc-eNOS (constitutiva cerebral) n-NOS (neuronal) en-NOS (constitutiva neuronal)

- Se expresa constitutivamente - Su actividad esta regulada por calcio - Prototipo presente en neuronas -produce cantidades bajas (pmol) de NO, que cumple funciones de señalización celular

NOS2 i-NOS (inducible) mac-NOS (de macrófagos) hep-NOS (de hepatocitos)

- Es inducida por citocinas - Su actividad es independiente de calcio - Prototipo presente en macrófagos de murinos. - Produce cantidades altas (μmol) de NO que cumple funciones citotoxicas, citostaticas o citoprotectoras.

NOS3

e-NOS (constitutiva o dependiente de calcio. e-NOS (endotelial) ec-NOS (endotelial constitutiva)

- Se expresa constitutivamente - Su actividad esta regulada por calcio. - Prototipo presente en neuronas - Produce cantidades bajas (ρmol) de NO, que cumple funciones de señalización celular

Tabla 3. Nomenclatura y características generales de las NOS.

El principal estímulo físico para la liberación del NO es la presión de

rozamiento o shear estrés sobre la pared vascular que se genera por el aumento

de flujo dentro de una arteria y que conduce a una vasodilatación cuya magnitud

es directamente proporcional a la cantidad de NO liberado por el endotelio

(Melgarejo, 2005); esto se debe a que en los vasos sanguíneos existe un factor

físico que activa a los mecanorreceptores de la pared vascular induciendo la

síntesis de NO por las células endoteliales a partir de la eNOS (Searles, 2006; De

la Vega y cols., 2005). La eNOS también puede ser estimulada por acetilcolina,

bradicinina, histamina, trombina, ADP y ATP. La isoforma iNOS es inducible por

lipopolisacáridos y citocinas proinflamatorias tales como el factor de necrosis

tumoral-α (TNFα) (Ouviña y cols., 2004)

La reacción de liberación del NO puede ser inhibida por derivados

estructurales de arginina como son: N-mono-metil-L-arginina (LNMMA), N-nitro-L-

arginina metiléster (LNAME) y otros (Searles, 2006; De la Vega y cols, 2005).

Cuando una célula produce NO, éste difunde en la membrana celular y se

distribuye a las proximidades; al no requerir de receptores de superficie, esta

44

molécula puede actuar sobre la misma célula que la produce o en cualquier célula

cercana que pueda responder a ella (Alfieri, 2005).

El NO a temperatura y presión atmosférica es un gas y actúa como un

soluto no cargado en la mayoría de los procesos biológicos. Al tener un electrón

despareado actúa como un radical libre y por tanto es muy reactivo, debido a esto

tiene una vida media de segundos y es capaz de combinarse con rapidez con

otros radicales libres. Una vez que es liberado y ejerce sus efectos, se

descompone para producir dos metabolitos estables, los radicales nitrito y nitrato,

en una reacción que puede ser catalizada por metales de transición, incluyendo el

hierro (Searles, 2006; Alfieri, 2005).

Hay una amplia gama de funciones biológicas en las que el NO esta

implicado; estos procesos incluyen diferentes mecanismos de activación de

factores de transcripción, la translocación de los RNAm, el metabolismo del hierro,

la mutagénesis, neurotransmisión, la apoptosis, la glicólisis y el transporte de

electrones mitocondriales, la acilación de proteínas, la síntesis de

desoxinucleótidos, la fusión de mioblastos, la adhesión de las plaquetas y

neutrófilos, la proliferación de los promotores de células mieloides, la producción

de células T, de queratinocitos y células tumorales, estimulante de la síntesis del

músculo liso vascular, antiagregante plaquetario la liberación de hormonas

pituitarias, la regulación del tono bronquial y el de los esfínteres, la regulación del

peristaltismo esofágico, la contracción del estómago e intestino, la del útero y

corazón, la regulación del pulmón y la erección del pene, participando en la

tolerancia y toxicidad de los opioides, en la regulación de la memoria, sueño y

presión sanguínea ( Rodrigo y cols, 2000). La producción de óxido nítrico es un

prerrequisito para la migración celular epitelial guiada por varios mitógenos

incluyendo el factor de crecimiento de hepatocitos y el factor de crecimiento

epidérmico (Papetti y Herman, 2002).

El NO induce la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular

(VEGF), uno de los mayores inductores de la angiogénesis, a su vez, el VEGF – C

es capaz de estimular la liberación del propio NO desde las células endoteliales

(Sotomayor, 2005).

45

El NO puede producir efectos proapoptóticos y antiapoptóticos así, el NO

producido por la NOS2 parece participar en la apoptosis inducida por citocinas,

LPS, angiotensina II, hiperglucemia o isquemia/reperfusión a través de diversos

mecanismos, a) la generación de peroxinitrito (NO + O2= →ONOO-), un potente

oxidante que aumenta la expresión de la proteína Bax, activa el gen supresor de

tumores p53, inhibe los complejos I y II de la cadena respiratoria y facilita la

apertura del poro de transición, lo cual promueve la liberación del citrocomo C

hacia el citoplasma celular, donde activa el factor liberador de apoptosis (APAF-1)

y las caspasas 3 y 9; b) activación de la vía GMPc-PKG; c) activación del factor de

transcripción AP-1, un efecto mediado a través de las proteincinasas activadas por

mitógenos, d) activación del gen supresor de tumores p53, que induce la

expresión de proteínas Bax, Bad y Bid que actúan promoviendo la liberación de

citocromo C desde la mitocondria; e) inactivación de la ADN-ligasa que impide la

reparación del daño en el ADN, f) activación de la cinasa de lk B (IKK) que fosforila

y degrada al inhibidor (lk Bα) del INF –k B, que se transloca al núcleo donde

induce la expresión de factores proapoptóticos y (Searles, 2006; González y cols,

2004).

Por otro lado, a concentraciones fisiológicas, el NO también puede inhibir la

apoptosis por: a) oxidar el glutatión reducido y estimular las proteínas de choque

térmico Hsp 32 y 70 que protegen a la célula del estrés oxidativo, inhiben la

activación de las caspasas y previenen la liberación del citocromo C; b) aumentar

los valores del CMPC, lo que disminuye la concentración del calcio, un potente

estímulo de la apoptosis, e inhibe la activación de caspasas; c) inducir la S-

nitrosilación (Cys 163) y la inactivación de las caspasas 3 y 9 y de las cinasas JNK

y ASK-1; d) inhibir la degradación de Bcl-2 y Bcl – XL, que se encuentran en la

membrana externa de la mitoondria e inhiben la liberación del citocromo C

(González y cols, 2004).

46

ANGIOGÉNESIS.

El término angiogénesis, es la formación de nuevos vasos sanguíneos,

durante este proceso se distinguen la vasculogénesis que ocurre para establecer

el patrón vascular del adulto y la formación de nuevos capilares a partir de otros ya

existentes; cuando se ha completado el crecimiento vascular, la angiogénesis se

convierte en un proceso patológico que acompaña y favorece enfermedades

neoplásicas y no neoplásicas. Ocurre como un proceso fisiológico en el

endometrio, durante el ciclo reproductivo de la mujer fértil, en el ovario durante el

crecimiento de la red capilar folicular y en la formación de la placenta; es

fundamental para la actividad reproductiva y la reparación de los tejidos (Gargett y

cols, 2000; Carrero y cols, 2006). La angiogénesis es un proceso importante y

esencial para la inflamación crónica y la fibrosis, para el crecimiento tumoral y la

formación de nuevos vasos sanguíneos adyacentes al tejido.

La velocidad de crecimiento tumoral depende de la cinética celular y la

irrigación. Los tumores no pueden crecer más de 1 a 2 mm de diámetro de grosor,

salvo que estén vascularizados. Es probable que la zona de 1 a 2 mm represente

la distancia de difusión máxima de oxígeno y los elementos nutritivos a partir de

los vasos sanguíneos; más allá de estos límites el tumor no puede seguir

creciendo sin recibir vascularización, ya que la hipoxia provocaría apoptosis a

través de la activación de p53.

La neovascularización tiene un efecto doble en el crecimiento tumoral. Por

una parte aporta elementos nutritivos y oxígeno y por otra parte las células

endoteliales recién formadas estimulan el crecimiento de las células tumorales

adyacentes mediante la secreción de ciertos polipéptidos, como IGF-1, PDGF,

GM-CSF o IL-1 (Carrero y cols, 2006).

En el caso de la proliferación vascular dentro de los tumores, el proceso se

inicia aparentemente por la secresión de factores quimiotácticos y proliferativos del

endotelio por parte de las células tumorales; este hecho determina un cambio

funcional del endotelio que adquiere capacidad migratoira, proliferativa y de

degradación proteolítica de la membrana basal (Caramelo y cols, 1998).

47

Se describe una relación dinámica entre los factores estímulantes e

inhibidores de la angiogénesis, dentro de los cuales se encuentran los macrófagos

asociados al tumor y las proteasas; entre los factores angiogénicos más conocidos

se encuentra el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), los prostanoides

y moléculas como el óxido nítrico (Carrero y cols, 2006).

El factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) se ubica

principalmente en las células epiteliales y mesenquimatosas en varios tejidos y

esta fuertemente expresado en la mayoría de los tumores (Cross y Claesson-

Welsh, 2001). Se trata de una glucoproteína homodimérica de 34 – 46 kDa que se

sintetiza en al menos cuatro isoformas de diferente longitud (121, 165, 189 y 206

aminoácidos), el VEGF 165 es la forma más abundante (Caramelo y cols, 1998;

Hyder y cols, 2000).

El VEGF tiene cuatro actividades biológicas principales que contribuyen

todas ellas a la inducción de la angiogénesis: crecimiento y proliferación de células

endoteliales vasculares, migración de células endoteliales vasculares estimulada

por óxido nítrico, supervivencia de células endoteliales inmaduras mediante la

prevención de la apoptosis y aumento de la permeabilidad vascular de los

capilares (Papetti y Herman, 2002). Los estímulos capaces de influir en la

producción de VEGF son: hipoxia, productos avanzados de glicosilación (AGEs),

interleucinas 1 y 6, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de

crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento tisular β (TGF-β), radicales libres

de O2, adenomas y metales de transición; otros factores que pueden regular la

expresión de VEGF son el grado de diferenciación de la célula, las

concentraciones locales de glucosa y prostaglandinas y estimuladores de la

adenilato cilcasa. Existen varios tipos celulares capaces de liberar VEGF como

son: células tumorales, células folículo-estelares de la pituitaria anterior, músculo

liso vascular y miocardio, células mesangiales, monocitos, fibroblastos,

queratinocitos, osteoblastos y astrocitos.

Las alteraciones angiogénicas en los tumores miomatosos consisten en la

expansión de la vasculatura del miometrio a partir de un vaso dentro de estos

tumores orientado en dirección a las células musculares, de igual modo se

48

encuentran cambios en la vasculatura distal al tumor, con dilatación y congestión

de los vasos contralaterales al sitio de ubicación del mioma (Walocha y cols, 2003

DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO.

El diagnóstico es fundamentalmente clínico, aunque pueden utilizarse como

auxiliares el ultrasonido, tomografía computarizada y la resonancia magnética

(Bañuelos, 2000, Carrera, 2001).

La histeroscopia permite la visualización directa de la alteración intrauterina,

la toma de muestras dirigida, así como una serie de características básicas para el

tratamiento del mioma como son: número de miomas, protrusión en la cavidad,

existencia de otra patología cavitaria que contraindique la miomectomía y biopsia

dirigida en su caso, extensión de la superficie intrauterina del mioma y tamaño del

mioma (Stewart y cols, 2002).

Debe hacerse diagnóstico diferencial con adenomiosis, poliposis uterina,

tumores sólidos de anexos y el leiomiosarcoma (Bañuelos, 2000).

El tratamiento del mioma uterino ha sido clásicamente el quirúrgico,

causando un gran número de histerectomías por año en todo el mundo, si bien

hoy en día debería ser más factible ofrecer a las pacientes un panorama con

mayor número de opciones. Si se excluye la actitud expectante (abstención de

tratamiento) en miomas pequeños y asintomáticos sin cambios en controles

periódicos, en miomas asintomáticos de pacientes próximas a la menopausia o en

miomas durante la gestación siempre y cuando no ocasionen un abdomen agudo

por torsión o degeneración, el tratamiento médico podría tenerse en consideración

en una paciente con deseos genésicos no satisfechos, próxima a la menopausia o

que simplemente desea evitar en lo posible el riesgo quirúrgico, con el objetivo de

reducir el tamaño del tumor para aliviar la sintomatología que produce

(menorragias, dolor pélvico, síntomas compresivos locales o esterilidad). El ideal

del tratamiento médico debería ser la total regresión del mioma, para facilitar un

segundo tiempo quirúrgico tradicional o de cirugía endoscópica, si bien podrían

hacer no visible algunos miomas que no son extirpados y recidivan con

posterioridad (Mata y cols, 2006) (Fontes y cols, 2002; Tadayuki y cols, 2004).

49

Son varios los tratamientos farmacológicos que se utilizado a lo largo de los

años. Así, hoy en día se puede elegir alguna de las siguientes opciones:

-Análogos de GnRH. Son derivados de la hormona GnRH y tienen afinidad

por los receptores y a su resistencia a la degradación por peptidasas (Fontes y

cols, 2002). Estos fármacos inhiben la liberación de FSH-LH a partir de la hipófisis

por desensibilización de receptores, disminuyendo la secreción de estrógenos y

progesterona a partir del ovario. Así, con estos fármacos se ha logrado la

reducción del volumen del mioma, lo cual puede ser causado por una disminución

en la proliferación celular, por disminuir la pérdida celular por apoptosis o necrosis

y atrofia celular (Bifulco y cols, 2004). La disminución del tamaño (que puede ser

entre otras causas por disminución del factor de crecimiento local) se calcula entre

un 30 -70%, y se ha observado que el mayor porcentaje de reducción ocurre tras

el primer mes de tratamiento, no existiendo reducciones o siendo éstas mínimas

después del tercer mes; en miomas pediculados o con gran proporción de calcio o

calágeno (hialinización) la respuesta es también menor (Fontes y cols, 2002).

El antígeno Ki-67 es una proteína nuclear que esta presente en las fases

G1, S, G2 y M del ciclo celular, pero no en la fase G0 y se utiliza como un índice

muy específico de la proliferación celular; cuando se da tratamiento con GnRH,

generalmente a la cuarta semana de que se ha iniciado, se observa una

disminución significantiva de Ki-67 en las células; en el mismo lapso, también se

presenta un incremento de la apoptosis. La disminución del flujo arterial sanguíneo

del útero y del mioma causado por el hipoestrogenismo inducido por el tratamiento

con GnRH, puede ser otro de los mecanismos por los que actúan estos fármacos

(Mizutani y cols, 1998). Chegini y cols, en 1996 reportaron que miometrio y mioma

tienen receptores para GnRH, y que los agonistas GnRH inhiben directamente la

síntesis de DNA en presencia o ausencia de estrógenos y/o progesterona, lo cual

indica que los fármacos inhiben directamente la proliferación celular.

La reducción del flujo de la arteria uterina reduce la hemorragia

intraoperatoria, facilitando la intervención laparoscópica y por supuesto, en la

cirugía conservadora, la integridad de la cavidad uterina.

50

Ejemplos de estos fármacos son: goserelina, buserelina, triptorelina o

leuprolide (Bifulco y cols, 2004).

-Moduladores selectivos de receptores de progesterona (SPRMs).

Asoprisnil pertenece a esta novedosa clase de fármacos. Se trata de ligandos de

receptores de progesterona que inhiben la menstruación e inducen una mezcla de

efectos agonistas y antagonistas de esta hormona en el epitelio glandular, el

estroma y en las paredes vasculares arteriales en el endometrio sin provocar

hiperplasia (Chen y cols, 2006). Este fármaco se usa para tratamiento de

miomatosis uterina y endometriosis, reduce el volumen uterino y de miomas en

modo, dosis y tiempo dependiente, disminuye la intensidad y duración del

sangrado uterino. Los efectos de este fármaco son debidos a la inhibición de la

proliferación de células del mioma por disminución de la expresión de PCNA,

inducción de la apoptosis por estimular la expresión de caspasa-3 y disminuir la

expresión de Bcl-2. Así pues, la disminución progresiva del tamaño de miomas

que se observa con asoprisnil se debe a la regulación directa del fármaco sobre

los receptores de progesterona (Chen y cols, 2006).

-Los Moduladores Selectivos de Receptores Estrógenicos (SERM) son una

nueva clase de compuestos que se unen al receptor de estrógenos y exhiben una

actividad agonista o antagonista; en terapia hormonal sustitutiva tiene importantes

beneficios por actuar como estrógenos en hueso, cerebro y corazón,

comportándose como antiestrógenos a nivel mamario. Mientras que tamoxifeno es

un parcial agonista a nivel de endometrio incrementando el riesgo de carcinoma,

raloxifeno no parece tener actividad a este nivel; aunque ninguno de estos

componentes han sido estudiados en mujeres con miomas, estudios preclínicos en

ratas han demostrado como producen reducciones de un 40-60% de la incidencia

y una disminución de la capacidad proliferativa en comparación con tumores no

tratados (Fontes y cols, 2002).

-Esteroides androgénicos (Danazol y Gastrinona). Se trata de fármacos que

muestran una importante afinidad por los receptores de andrógenos, menor

afinidad por los receptores de progesterona y mucho menor por los receptores de

estrógenos. El danazol y la gastrinona inhiben la acumulación del AMP cíclico en

51

las células de las capas granulosa y lútea, en respuesta a las hormonas

gonadotrópicas; al igual que alteran el ciclo de producción de FSH y LH (Goodman

y Gilman, 2002).

Al actuar a distintos niveles del eje hipotálamo-hipofisiario-ovario, se obtiene

un estado de hipoestrogenismo y amenorrea (interacción con la esteroidogénesis

suprarrenal y ovárica) así como de androgenismo e hipertiroidismo al desplazar a

estas hormonas de sus proteínas transportadoras (Fontes y cols, 2002).

El efecto supresor de estos fármacos sobre el eje hipotálamo-hipófisis-

gonadal es reversible, su actividad cíclica se restablece dentro de los 60 a 90 días

siguientes de la suspensión del tratamiento (Goodman y Gilman, 2002). En virtud

de su efecto directo sobre el endometrio, reducen de modo importante la pérdida

menstrual y el grado de anemia relacionado con la misma. El volumen del mioma

uterino se reduce un 20% al inicio del tratamiento. Representan, pues una

alternativa en cuanto al alivio de los síntomas, pero a largo plazo tienen efectos

colaterales androgénicos (acné, hirsutismo, seborrea y aumento de peso) que los

hacen no idóneos (Shozu y cols, 2003; Banuelos, 2000).

-Inhibidores no esteroideos de aromatasa. Los inhibidores de aromatosa

actúan compitiendo con los precursores de andrógenos para la enzima aromatasa;

estos fármacos establecen uniones iónicas, inactivando temporalmente a la

enzima. Son ejemplos el fradozole, letrozol y anastrozol (Bueso y cols, 2005). El

fradozole suprime la síntesis de estrógenos derivada de las células de mioma con

lo cual inhibe la proliferación de las mismas (Shozu y cols, 2003).

-Antagonistas de GnRH (Cetrorelix). El Cetrorelix produce una inhibición

rápida del eje hipotálamo-hipófisis-ovario al disminuir la síntesis de RNAm con

regulación negativa de receptores hipofisiarios a LH-RH después de 6 a 9 horas

de iniciada su administración (Bañuelos 2000). Cetrorelix es un antagonista de la

hormona liberadora de gonadotropinas (Gn-RH); la GnRH se une a los receptores

de membrana de las células de la hipófisis. Cetrorelix compite con la Gn-RH

endógena en la unión a dichos receptores; por su mecanismo de acción, este

fármaco controla la secreción de gonadotropinas (LH y FSH) (Felberbaum y cols,

1998). Al tener efecto rápido sobre el eje evitan la estimulación inicial de

52

producción de gonadotrofinas y esteroides sexuales, y por lo tanto la exacerbación

de la sintomatología en enfermedades hormonodependientes, que normalmente

se observan con el uso de los agonistas. Cetrorelix está libre de efectos

alergénicos y su acción es más potente que otros análogos antagonistas como

Nal-Glu, detirelix, ganirelix o antide (Bañuelos 2000). Estos fármacos reducen el

tamaño de los miomas hasta en un 50% a los 14 días de iniciado en tratamiento;

con estos fármacos la función ovárica puede restablecerse en corto tiempo en

comparación con los agonistas de GnRH (Cook y Walker, 2004).

-Antagonistas de Progesterona. La RU-486 (Mifepristone) tiene un efecto

competitivo sobre los receptores de progesterona en endometrio, miometrio, cuello

uterino y placenta (Chwalisz y cols, 2005). No esta claro si el efecto de la

progesterona sobre los miomas es sinérgico o antagónico a la acción de los

estrógenos. El hecho de encontrar mayor cantidad de receptores de progesterona

en tejido procedente de leiomiomas y un número mayor de mitosis en éstos

durante la fase lútea, así como la eficacia de RU-486 para inhibir la ovulación e

inducir luteolisis y destruir la integridad miometrial, promovió su utilización en

pacientes con miomas en edad fértil. Con este fármaco el tamaño del mioma se

reduce hasta un 49% a las 12 semanas (Fontes y cols, 2002).

El tratamiento quirúrgico, es otra modalidad para controlar la miomatosis.

Se indica cirugía en caso de miomatosis infectada, torsión aguda, sangrado

profuso o sintomatología obstructiva lo cual puede llevarse a cabo por

miomectomía o histerectomía. La cirugía se realiza por vía abdominal o vaginal,

esta última con asistencia laparoscópica en úteros menores de 500g, lo que alarga

el tiempo quirúrgico con relación al procedimiento abdominal, pero acorta el

tiempo de recuperación (Bañuelos, 2000).

La embolización uterina consiste en a embolización laparoscópica de las

arterias uterinas con partículas de alcohol polivinílico, lo que disminuye el

sangrado uterino anormal en 90% de los casos. Otra opción muy semejante a la

embolización es la coagulación del mioma (miólisis) que utiliza como fuente de

energía el laser (Nd: YAG), aunque este no es recomendable cuando se desea

fertilidad. El laser percutáneo es una alternativa a la cirugía abierta y reduce el

53

volumen uterino 37.54% con monitoreo a 3 meses (Bañuelos, 2000, Mata y cols,

20)06.

La ablación ultrasónica guiada por resonancia magnética, es otra una nueva

manera de tratar la miomatosis. Se trata de ondas de alta energía ultrasónica que

logran la ablación (destrucción) del tejido anormal en combinación con imágenes

guiadas por resonancia magnética. La difusión de las ondas ultrasónicas se

producen por medio de un transductor (aparato que convierte la energía eléctrica

en ultrasónica) en un volumen focal pequeño. Este dispositivo de forma cónica

produce ondas de sonido que penetran a través de los tejidos (Palavecino, 2004).

El conocimiento actual de la biología de los miomas uterinos y de la

regulación de su crecimiento en el que se ven implicados como ya hemos citados

anteriormente hormonas y varios factores de crecimiento, han permitido el

desarrollo de las actuales modalidades de tratamiento, y de igual manera permiten

el planteamiento de nuevas pautas. El principal objetivo para el tratamiento del

mioma en los próximos años será determinar una estrategia de prevención

adecuada en pacientes genéticamente predispuestos y ello repercutirá en las

siguientes ventajas: detección precoz del mioma, reducir el crecimiento del mioma,

identificar los mecanismos por los que provoca esterilidad, desarrollo de mejores

técnicas quirúrgicas, reducir las recurrencias tras miomectomía y el desarrollo de

opciones no quirúrgicas de tratamiento.

54

JUSTIFICACIÓN.

La miomatosis uterina es la neoplasia pélvica benigna más común en la

mujer y su incidencia aumenta día con día. La tendencia actual a retrasar la

maternidad hace que sea muy fuerte la asociación de miomatosis uterina e

infertilidad y complicaciones obstétricas (Payson y cols, 2006; Fontes y cols,

2002), además, representa un serio problema salud pública que merece especial

atención debido a las repercusiones que tiene para la paciente y la sociedad, pues

aparte de los trastornos menstruales y de fertilidad, también implica riesgos

quirúrgicos, trastornos psicosexuales, bajas laborales y gastos hospitalarios:

consultas, ecografías, tratamientos hormonales, tratamientos antianémicos y/o

cirugías. (Reche, 2002) (Mata y cols, 2006).

A pesar de ser una enfermedad descrita ya desde hace mucho tiempo, y

que se sabe afecta al 25% de la población femenina fértil y que llega a

encontrarse hasta en el 77% de los estudios anatomopatológicos tras

histerectomía (Haney, 2000; Carrera, 2001) aún queda por determinar con

precisión la caracterización genética, las vías de señalización entre hormonas y

factores de crecimiento (Hunter y cols, 2000; Haney y cols, 2000).

Oxído nítrico y endotelina son dos proteínas que tienen importantes efectos

en el mantenimiento de la integridad vascular a través de la interacción entre ellas

y con otros factores dentro de los cuales se encuentran de manera importante los

hormonales, principalmente estrógenos y progesterona (Vural y cols, 2001;

Lüscher y Barton, 2000) La alteración de esta relación a nivel del sistema vascular

uterino y en el propio miometrio puede ser una de las causas que contribuyan al

crecimiento tumoral miomatoso.

Asi, para resolver algunos de los cuestionamientos aún pendientes en esta

patologia, en este trabajo se propone estudiar la relación que existe entre la

enzima convertidora de endotelina, sintasa de óxido nítrico, receptores de

estrógenos y receptores de progesterona, con ello contribuiremos al conocimiento

patológico de esta entidad desde un punto de vista vascular y probablemente local

a nivel de miometrio.

55

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

La expresión de las enzimas convertidora de endotelina y óxido nítrico

sintasa, están participando en el desarrollo del mioma uterino?

HIPÓTESIS.

La relación de expresión de eNOS y ECE, en diferentes regiones del útero,

indicará su grado participación en el desarrollo del mioma.

OBJETIVO GENERAL.

Relacionar la expresión de la enzima convertidora de endotelina y eNOS

con el desarrollo del mioma uterino.

OBJETIVOS ESPECIFICOS.

Localizar y cuantificar a la enzima convertidora de endotelina y óxido nítrico

sintasa en miometrio adyacente al tumor, tejido subtumoral y nodo miomatoso.

Relacionar la expresión de eNOS y ECE con la celularidad y

vascularización del mioma.

56

DISEÑO EXPERIMENTAL.

TIPO DE ESTUDIO

El presente es un estudio de tipo descriptivo de corte transversal, el cual

implicó el análisis de 35 pacientes sometidas a histerectomía por diagnóstico

clínico de miomatosis uterina de medianos elementos en el Hospital General de

Naucalpan del I.M.S.S. No. 194 de febrero de 2007 a mayo de 2008. El rango de

edad de las pacientes fue de 35 a 49 años y ninguna de ellas había recibido

tratamiento hormonal un año previo a la cirugía ni tratamiento radio o

quimioterapéutico. Se obtuvo el consentimiento informado (anexo 1) de cada una

de las pacientes antes de la cirugía para el empleo de las piezas uterinas

extirpadas en nuestro trabajo de experimentación. De las 35 pacientes, se

excluyeron aquellas con diagnóstico histopatológico distinto de miomatosis uterina,

quedando únicamente 20 pacientes como positivas para este diagnóstico. De

estas 20 muestras, se obtuvieron secciones de 2cm3 cada una del mioma, tejido

subtumoral y miometrio adyacente (anexo 3) para su posterior procesamiento por

Western Blot.

MATERIAL.

-Técnica de Western Blot: ver anexo 2

METODOLOGÍA.

| Toma de muestras:

Una vez que el médico informó de la programación para histerectomía, se

hizo una revisión del expediente para deteminar si la paciente entraba en nuestro

grupo de estudio en base a la edad y a los otros criterios de inclusión ya descritos.

Bajo las correspondientes condiciones de asepsia y antisepsia, se recibió de

manos del instrumentista la pieza quirúrgica (útero, en ocasiones acompañada por

57

sus anexos) la cual se examinó externamente y se palpo para determinar la

localización de los miomas, o bien hallar otra patología. Se realizó una incisión

transversal al útero, se examinó internamente y se localizaron el (los) mioma (s)

en base a sus características macroscópicas (anexo 3). Se tomaron 2 cm3 del

mioma, tejido subtumoral y miometrio adyacente sano y cada una de las muestras

se coloco en frascos previamente esterilizados y se guardaron para su transporte

en hielo seco hasta su almacenamiento a una temperatura de -80oC.

Western Blot. (Sumitani y cols, 2000; Chen y cols, 2006).

Las muestras obtenidas fueron conservadas a -80o C hasta su

procesamiento.

Bajo condiciones de esterilidad se maceraron las muestras con

nitrógeno líquido hasta obtener un granulado fino.

Se agregaron 300µl de tampón de homogenización (PIK +

inhibidores de proteasas)

Las muestras se homogenizaron durante 15-30 segundos en un

potter metido en un tubo cónico con hielo.

Se centrifugó 10 min a10000 rpm a 4oC

Se recogio el sobrenadante con cuidado de no arrastrar el

sedimento.

La cuantificación de proteínas se realizó por el método de Bradford.

Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de

poliacrilamida, al 10% (glicerol 50%, agua, tris 1.5M, acril-bis y SDS

10%.

En cada carril se depositaron 50µg de proteína y la electroforesis se

llevo a cabo a 90V por 30 min, a temperatura ambiente, seguido de

110V por dos horas más.

La inmunoelectrotransferencia se realizo a 20V por 45 min en una

cámara semiseca.

58

El bloqueo de la membrana se realizó por 1hora a temperatura

ambiente con leche svealty al 5% en TBS-tween.

La Incubación del anticuerpo primario (1:200 en TBS-T) se desarrollo

a 4º C, por 12hrs con agitación. Se realizan lavados TBS-tween 3X5.

La incubación del anticuerpo secundario se realizó a una dilución

1:1000 en TBS-tween; durante 1hr a temperatura ambiente en

agitación. Se realizan tres lavados con TBS-tween en agitación y a

temperatura ambiente.

La presencia de las proteínas de interes se reveló mediante

quimioluminiscencia.

Los densitogramas de las bandas se realizaron con el analizador de

imágenes Quantity One (Biorad)

Los resultados obtenidos se analizaron con Anova de una vía, y

cuando procedio Student-Neuman Keuls, con un p<0.05.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Los densitogramas se realizaron con el software Quantity One.

Los estadísticos de prueba utilizados fueron: ANOVA de una vía y Student-

Newman-Keuls, considerando a p0.05 como estadísticamente significativa.

59

Total de pacientes 9

Edad promedio: 40.8 años

Peso promedio: 65.2 Kg

Edad promedio de menarca: 12 años

Número de gestas promedio: 3

Anticonceptivo usado: a: 1 d:2 p:2 q:2 r:2

Antecedentes familiares tumorales distintos de miomas:

Ninguno

Antecedentes familiares de miomas:

1 : Prima1 : Tía materna

Duración promedio del cuadro clínico:

9.1 meses

Total de pacientes 11

Edad promedio: 41.5 años

Peso promedio: 64.6 Kg

Edad promedio de menarca: 11.5 años

Número de gestas promedio: 3

Anticonceptivo usado: a: 2 d:1 p:1 q:3 r:4

Antecedentes familiares tumorales distintos de miomas:

1 : Cáncer de mama1 : Cáncer de pulmón

Antecedentes familiares de miomas:

1 : Hermana1 : Tía materna

Duración promedio del cuadro clínico:

8 meses

RESULTADOS

Tabla 4. Datos de las pacientes sometidas a histerectomía en fase proliferativa del ciclo

menstrual. a: abstención, r:ritmo, p:preservativo, d:dispositivo intrauterino, q:quirúrgico (OTB).

Tabla 5. Datos de las pacientes sometidas a histerectomía en fase secretora del ciclo menstrual. a:abstención, r:ritmo, p:preservativo, d:dispositivo intrauterino, q:quirúrgico (OTB).

60

Expresión de ER en útero con miomatosis.

Figura 9. Expresión del receptor alfa estrogénico en mioma, tejido subtumoral y mioma en fase proliferativa (a) y secretora (b).

El receptor alfa estrégnico, estuvo presente en el miometrio, tejido

subtumoral y mioma en ambas fases del ciclo celular, y solamente en el tejido

tumoral se evidenció su sobre expresión en ambas fases, indicando su probable

participación en el crecimiento del tumor, como se indica en las figuras 9a y 9b.

Expresión de PR-A en útero con miomatosis.

Figura 10. Receptor de progesterona subtipo A, en el miometrio, tejido subtumoral y mioma de la fase proliferativa (a) y secretora (b).

61

La cantidad de receptor A de progesterona básicamente no se modifica en

las tres regiones del útero en fase proliferativa (a), pero si se observa un

incremento importante en la masa tumoral del útero en fase secretora (b).

Expresión de PR-B en útero con miomatosis

Figura 11. Receptor de progesterona subtipo B, en el miometrio, tejido subtumoral y mioma de la fase proliferativa (a) y secretora (b).

La expresión de la isoforma B del receptor de progesterona en fase

proliferativa se mantuvo constante, mientras que en la fase secretora se observó

un aligera tendencia a incrementarse en el mioma con respecto al miometrio.

62

Expresión de eNOS en útero con miomatosis

.

Figura 12. Expresión de eNOSen tejidos uterinos que se encontraban en fase proliferativa (a) y secretora (b)

La sintasa del óxido nítrico, estuvo presente en mayor proporción en el

tejido miomatoso, de tejidos uterinos en fase proliferativa (Fig 12a), en tanto que

en la fase secretora, aunque se observa una tendencia similar, no hay diferencias

estadísticamente significativas (Fig 12b), esto nos sugiere que expresión de eNOS

esta influida por estrógenos presentes en fase proliferativa

Expresión de ECE en útero con miomatosis

Figura 13. Expresío de ECE en tejidos uterinos en fase proliferativa (a) y secretora (b).

63

Los niveles de la proteína enzima convertidora de endotelina, presentaron

una tendencia a incrementarse conforme las células se desregulaban para dar

formar el tumor, esta difeencia tuvo significancia estadística entre el mioma con

respecto al miometrio (Fig 13a). En tanto que en la fase secretora se observo un

marcadpo incremento de su expresión en en el mioma con respecto al tejido

subtumoral y en consecuencia del miometrio (Fig 13b).

Relación entre la prescencia de ER y PR con la expresion de ECE y eNOS

en fase proliferativa

Figura 14. Relación entre la prescencia de ER y PR con la expresion de ECE y eNOS en miometrio (a), tejido subtumoral (b) y mioma (c) en fase proliferativa.

64

Miometrio

De las proteínas analizadas en el miometrio, encontramos que solo hubo

diferencias estadísticamente significativas entre la expresión de la sintasa del

óxido nítrico con respecto a la isoforma B del receptor de progesterona, situación

acorde a la influencia reportada de estrógenos sobre la formación del óxido nítrico

por la eNOS (Fig 14a).

Tejido subtumoral

eNOS y ECE fueron mayores que los receptores tanto de estrogénos como

de progesteona, mientras que no hubo prevalencia de una enzima con respecto a

la otra (Fig 14b) .

Mioma

Encontramos que eNOS se expresa en mayor grado que ECE y que los

receptores hormonales; por otra parte ECE fue mayor con respecto a los

receptores de progesterona (Fig 14c).

65

Relacion entre la prescencia de ER y PR con la expresion de ECE y eNOS

en fase secretora

Figura 15. Relación entre la prescencia de ER y PR con la expresion de ECE y eNOS en miometrio (a), tejido subtumoral (b) y mioma (c) en fase secretora.

66

Miometrio

De manera general no se observan diferencias estadísticas, entre las

proteínas analizadas, excepto ECE fue mayor que PR-B.

Tejido subtumoral

No se evidenció la prevalencia de un receptor, sin embargo, la expresión de

ECE con respecto a PR-B fue claramente superior.

Mioma

En este tejido, observamos el evidente incremento en la expresión de ECE,

de la misma manera en que se incrementaron también el receptor de estrógenos y

la isoforma A de progesterona.

67

DISCUSIÓN

Expresión del receptor alfa estrogénico.

Los resultados obtenidos en este estudio muestran que ER se encuentra

presente a lo largo del ciclo menstrual, y se incrementan en el tejido miomatoso de

manera estadísticamente significativa, corroborando la importante influencia que

ejercen los estrógenos en el crecimiento tumoral a través de los efectos

proliferativos que ejercen estas hormonas.

El crecimiento del mioma uterino es un proceso en el que están implicadas

las hormonas ováricas esteroideas: estrógenos y progesterona. Ya se ha

reportado que los receptores de ambas hormonas tienen mayor expresión en el

tejido miomatoso que en el miometrio normal adyacente (Robboy y cols, 2000;

Kasai y cols, 2004; Chen y cols, 2006). En nuestro estudio corroboramos la

presencia de los receptores de estrógenos y progesterona en mioma, tejido

subtumoral y miometrio, siendo destacable el hecho de la mayor expresión de

ambos en el tejido tumoral. Mas aún, encontramos que en el mioma, ER se

mantiene constantemente elevada durante la fase proliferativa y secretora del

ciclo, es decir, no se ve afectada, mientras que la expresión de PR en el mioma si

disminuye en la fase proliferativa. Esto concuerda con lo referido previamente por

Richards y Tiltman en 1996, quienes reportaron que la fase del ciclo menstrual no

afecta el contenido total del receptor de estrógenos ni en miometrio ni en el tumor

miomatoso y es probablemente este hallazgo por lo que inicialmente se pensaba

en los estrógenos como los únicos responsables de la patogénesis miomatosa.

ERα fue la isoforma que analizamos en el presente estudio. Sakaguchi y

colaboradores en 2003 demostraron que a pesar de estar presentes las dos

isoformas del ER, ERα predomina sobre ERβ en miometrio. Anteriormente,

Kovacs y colaboradores en el 2001 habían obtenido resultados similares, pero

además, reportaron la presencia de las dos isoformas en el mioma, con relevancia

el REα. Otros autores (Less y cols, 1997), no encontraron diferencias de expresión

de ambos receptores de estrógenos, ni entre ellos ni con respecto al mioma y

miometrio, la discordancia en estos hallazgos, puede deberse a variaciones

68

anatómicas en las concentraciones de ER en el miometrio (Kovács y cols, 2001).

En general, la isoforma α, es la implicada principalmente en las funciones de

promoción y regulación de la división celular (como en el caso de remodelación

ósea) y aunque éstos no son los principales efectos de la isoforma β, hay algunas

células en las cuales es importante la participación de estos receptores en este

aspecto (ejemplo: hiperplasia mamaria) (Pérez y cols, 2005). Esto es debido entre

otros factores al efecto que tiene las dos isoformas del receptor de estrógenos

sobre AP-1, uno de los principales elementos implicados en los efectos

transcripcionales de las hormonas esteroideas, pues mientras la isoforma alfa

estimula la activación de AP-1, ERβ la inhibe (Kovács y cols, 2001). ER-α tiene

una afinidad 5 veces mayor por el estradiol que los receptores β, éste último

disminuye la sensibilidad de la isoforma α a estrógenos, actuando como un

regulador fisiológico de los efectos proliferativos de ER-α (Sánchez y Benítez,

2003). Así, en este estudio, la expresión de ER es un reflejo de ERα y su mayor

expresión en mioma con respecto a miometrio es una fuerte evidencia de las

acciones proliferativas en las que esta implicada esta isoforma.

.

En el mioma, estos efectos proliferativos de los estrógenos, se reflejan en la

síntesis de factores de crecimiento (IGF-I, EGF, PDGF, VEGF, PR) y

componentes de la matriz extracelular (conexina 43, colágena I y III) (Dixon y cols,

2000) ya sea por la vía de acción genómica o no genómica de estas hormonas.

En la vía genómico directa el complejo formado por el estrógeno con los

receptores nucleares donde actúa como factor de transcripción y se une a

secuencias específicas en el DNA (Elementos de Respuesta a Estrógenos, ERE)

o a heterodímeros fos-jun que, a su vez, se unen a AP-1. Por efecto genómico

indirecto la activación de un receptor, que puede estar localizado en la membrana,

estimula sistemas de segundos mensajeros (adenilil ciclasa, PKA, PKB, PKC,

MAPK/ERK) con fosforilaciones posteriores de diversas proteínas, de CREB (por

la PKA) o del complejo (SRF)-Elk-1 (por la MAPK). Algunas de estas proteínas

fosforiladas actuarán después en el núcleo sobre sitios específicos del ADN. Estas

vías de señalización, a su vez pueden ser activadas por otros ligandos, originando

69

comunicación cruzada entre diversos sistemas; además de la activación de

proteínas cinasas asociadas a la membrana que son clave para la síntesis de

algunos factores de crecimiento; otras consecuencias de la estimulación de estos

receptores son el flujo de iones, desencadenamiento de potenciales de acción, o

la descarga de vesículas secretoras, este es el caso del aumento intracelular de

calcio, ión necesario para la activación de la sintasa del óxido nítrico. El hecho de

que algunos RE implicados estén localizados en membranas indica que las

respuestas pueden ser relativamente inmediatas, y que estas respuestas pueden

facilitar o perturbar las inducidas por otros ligandos, además de que no requiere de

los procesos de transcripción y síntesis de nuevas proteínas para poder producir

su efecto primario. En los efectos no genómicos producidos por altas

concentraciones de estrógenos se requiere de otras vías activadas por ER porque

la actividad se consigue tanto con el estradiol -17β como con estradiol 17α; este

mecanismo es rápido y solo requiere la unión del esteroide con un receptor

ubicado en la membrana citoplasmática e inicia una cascada de fosforilación de

una serie de enzimas citosólicas (Caramelo y cols, 1998; Tommaso y Genazzani,

2003). Es muy importante el hecho de que varios de los factores de crecimiento

sintetizados por efecto de los mismos estrógenos como EGF e IGF-I, pueden por

si solos estimular la cascada de señalización que inicia el ER. Por otro lado, una

de las vías genómicas indirectas activadas por estrógenos, la vía PI3K/AKT, es

muy importante en la promoción de la proliferación y la respuesta antiapoptótica

(Fernández y cols, 2004).

En mioma y tejido miometrial normal se expresa el RNAm para los

protooncogenes c-jun, c-myc y c-fos, éstos son genes regulados por hormonas

sexuales esteroideas que participan en procesos de proliferación y diferenciación

celular. c-fos, está implicado en la progresión maligna de los tumores, en el

mioma, sus niveles son bajos , siendo éste el responsable de la benignidad de

este tumor (Lessl, y cols, 1997).

La proliferación celular es la base de la progresión tumoral y además de

implicar diferentes factores de crecimiento, involucra una gran variedad de

ciclinas y complejos de éstas que son dependientes de cinasas. Los estrógenos,

70

en especial el estradiol son potentes mitógenos que regulan la proliferación celular

en mama, útero y otros órganos. En estas células, el estradiol actúa en las

primeras etapas de la fase G1 del ciclo celular, y permite la entrada a la fase S del

ciclo a través de estimular la acción de cdk4 y cdk2, dos cinasas que favorecen la

expresión de ciclina D1, importante en la progresión del ciclo. Por otro lado, el

estradiol también disminuyen los niveles de los inhibidores de cdk. Los niveles de

ciclina D1 son mayores en el mioma que en el miometrio (Liehr, 2000). Esta

relación estrógenos-ciclina D1-proliferación celular, nuevamente indica la fuerte

influencia de estas hormonas en la patogénesis del mioma (Kovácks y cols, 2001).

Expresión del receptor A y B de progesterona.

Nuestro estudio demostró la presencia de las dos isoformas de PR tanto en

el tejido tumoral como en miometrio, siendo mayor en mioma únicamente durante

la fase secretora del ciclo, dado que en la fase proliferativa su expresión fue muy

similar en el mioma y miometrio; datos similares ya habían sido reportados por

Brandon y cols en 1993 y Nisolle y cols en 1999. Estos mismos autores, al igual

que Vu y colaboradores en 1998, y Pavlovich y colaboradores en 2003,

demostraron que existe mayor actividad proliferativa en mioma que en miometrio y

que esta actividad se incrementa en la fase secretora del ciclo menstrual, lo cual

es un fuerte indicativo de la influencia que tiene progesterona en el crecimiento

miomatoso.

Progesterona, al ser una hormona esteroidea, también esta implicada en

procesos de proliferación y diferenciación celular su intervención en la ovulación,

el desarrollo de la glándula mamaria y el mantenimiento del embarazo, son claro

ejemplo de ello (Barrera y cols, 2007; Chwalisz y cols, 2005). Su intervención en la

miomatosis como uno de los principales responsables de su etiología ha sido

fundamentada ya por varios autores como Brandon y cols en 1993, Matsuo y cols

en 1997, Maruo y cols en 2000, Rein y cols en 2000; además, la regresión de

este tumor con antiprogestagenos (Chen y cols, 2006; Chwalisz y cols, 2005) y el

incremento de su tamaño durante el embazo, cuando los niveles de progesterona

71

son altos(Horiuchi y cols, 2000; Cesen-Cummings y cols, 2000) son un sustento

más de esta relación entre mioma y progesterona.

En el útero la progesterona controla el crecimiento y la diferenciación

de endometrio y miometrio y regula una variedad de funciones celulares ya sea

por estimulación o inhibición estructural y funcional de proteínas (Chwalisz y cols,

2005).

En el caso del mioma son varias las razones que fundamentan su desarrollo

a causa de progesterona: Bcl-2 es una proteína antiapoptótica cuya expresión se

ve incrementada de manera importante en el mioma sobre todo en la fase

secretora del ciclo, es decir, su expresión se da por influencia de progesterona

(Matsuo y cols, 1997). De igual manera, en esta misma fase, hay sobreexpresión

de Wnt5b, un gen perteneciente a la familia Wnt que regulan el crecimiento y la

supervivencia de varios tipos celulares. Este gen esta muy relacionado con la

presencia de cáncer, y en el caso del mioma, su expresión se encuentra muy

elevada, especialmente en la fase secretora (Mangioni y cols, 2005).

Por otro lado, progesterona (al igual que estrógenos) como parte de los

mecanismos implicados en la vía genómica, activa la vía de señalización de MAP

cinasa (ERK 1/2), importante en la regulación del crecimiento y diferenciación

celular, pues una vez activada lleva a cabo la fosforilación del factor de

transcripción nuclear Elk-1 e induce así la expresión de genes mitógenos (Bifulco y

cols, 2004).

Progesterona es pues, una hormona con importantes efectos proliferativos

en el mioma, Shimomura y colaboradores en 1998 también lo constataron al

encontrar muy incrementado el grado de mitosis y a PCNA en el mioma durante la

fase secretora del ciclo mentrual.

Con el presente estudio, al demostrar incremento de ER y PR en el tejido

tumoral con respecto al tejido sano adyacente corroboramos la importante

influencia de ambas hormonas en los eventos proliferativos que dan lugar al

crecimiento miomatoso. La participación de progesterona en esta patología como

ya hemos venido mencionando consiste básicamente en inhibir la apoptosis, en

tanto que los estrógenos intervienen estimulando el potencial proliferativo de las

72

células miomatosas (Matsuo y cols, 1997), y sin dejar te tener el efecto una de la

otra el resultado es un elevado índice mitótico que incrementa y facilita la

propagación de mutaciones somáticas. Además de sus efectos mitógenos,

progesterona, al igual que estrógenos por vía genómica y no genómica estimula la

producción de factores de crecimiento y los receptores de éstos (estrógenos

producen EGF y progesterona produce EGF-R), de componentes de la matriz

extracelular, citocinas y otras proteínas que intervienen de manera importante en

el crecimiento de tejidos (Rein, 2000; Shimomura y cols, 1998).

Así, por ejemplo, progesterona estimula la producción del factor estimulante

de colonias de macrófagos en el útero que a su vez induce la producción de

citocinas implicadas en eventos proliferativos y angiogénicos que favorecen el

desarrollo de tejidos (Hatayama y cols, 1994) y de manera importante también

regula los receptores de hormonas esteroideas en útero (Iwai y cols, 1995).

En nuestros resultados existe mayoría de ER que de PR, y aún en la fase

secretora del ciclo, aunque de manera muy ligera, persiste este patrón de

expresión. Estrógenos estimulan la producción de PR y ER (Adams, 1993; Rein,

2000). En el caso del mioma el incremento en PR puede ser debido al aumento de

E y ER o bien, a alteraciones en el nivel de factores de crecimiento, especialmente

IGF-1 (producido por estrógenos), que estimula producción de PR (Rein, 2000;

Brandon y cols, 1993). Los datos que obtuvimos pueden ser una evidencia más de

lo expuesto por estos últimos autores.

De manera específica, en cuanto a la expresión de las isoformas del

receptor a progesterona, nuestros datos muestran que ambas se incrementan en

el mioma y que existe una sobre expresión de PR-A sobre PR-B. Esto concuerda

con lo antes reportado por Viville y colaboradores en 1997 y Nisolle y

colaboradores en 1999.

En útero, PR-A es la isoforma predominante, aunque también se ha descrito

la presencia de PR-B en el epitelio glandular uterino (Chwalisz y cols, 2005).

PR-B actúa como un activador transcripcional de genes, mientras que PR-A

no activa la transcripción, pero funciona como un fuerte represor de la actividad

transcripcional mediado tanto por PR-B, como por otros receptores a hormonas

73

esteroideas como los receptores a estrógenos, andrógenos y mineralocorticoides

(Li y O’Mallen, 2003); sin embargo, el nivel relativo de la isoformas de PR en una

célula blanco pueden determinar la naturaleza y la magnitud de la respuesta a la

progesterona(Chwalisz y cols, 2005). Así, PR-A, puede tener un doble papel ya

sea como activador o como represor de la actividad transcripcional (Nisolle y cols,

1999). Quizá, las elevadas concentraciones de PR-A existentes en el mioma son

un ejemplo de cómo puede la isoforma de un receptor tener esta dualidad de

efectos, o bien, puede ser que indirectamente al ejercer esta isoforma sus efectos

represores el resultado final sea la activación de la transcripción génica; hacen

falta más estudios que definan con precisión las vías y los mecanismos

moleculares implicados en los efectos proliferativos de progesterona por tipo y

cantidad de receptor.

Expresión de la sintasa de óxido nítrico endotelial y su relación con ER y PR.

En nuestros resultados observamos que eNOS se encuentra presente tanto

en fase proliferativa como secretora, y en ambos casos, la concentración de esta

enzima se incrementa en el tejido miomatoso; esta expresión de eNOS es mucho

mayor durante la fase proliferativa, en donde aumenta al doble con respecto al

miometrio, no habiendo diferencias significativas en la fase secretora. Esto podría

indicar que los estrógenos muy probablablemente están implicados de manera

directa en la expresión de eNOS en el mioma uterino; apoyado por el hecho de

que los receptores de estrógenos fueron los que más se expresaron. Esto

concuerda con los resultados obtenidos por Rupnow y colaboradores en 2001, y

López y colaboradores en 2005 en los cuales se concluye que en útero, son los

estrógenos las hormonas que tienen mayor influencia en la expresión de eNOS.

La presencia de eNOS en el tejido tumoral, puede explicarse por el hecho

de que participa en la reparación y mantenimiento de los tejidos (Mena y Riveron,

1999; Navarro y cols, 2005; Vural y cols, 2001). Una de sus principales funciones

es la proliferación celular del músculo liso vascular y recientemente se le ha

74

implicado, en la modulación de la síntesis de proteínas de la matriz extracelular a

través de la estimulación de cinasas dependientes de GMPc, el cual a su vez es

activado por NO, producto de eNOS (López y cols, 1998; Ouviña y cols, 2004).

Aunque en el útero, la presencia y la importancia de esta molécula en

condiciones fisiológicas se ve reflejada en la regulación del endotelio vascular

uterino a través del ciclo menstrual y en el embarazo, así como en la modulación

de la actividad miometrial, especialmente en el mantenimiento del tono uterino

(Batra y cols, 2003); también se le ha relacionado con efectos patológicos, por

ejemplo los efectos proliferativos que ejerce el NO sobre sus células blanco,

pueden ser ambivalentes en el proceso de la muerte celular programada, es decir,

puede ser un estimulante (cuando esta en su forma no oxidada) o un inhibidor

apoptótico (cuando se oxida hasta peroxinitrito), ello dependerá, de la célula, las

cinasas y las condiciones en que sea liberada esta molécula (Mena y Riverón,

1999; De la Vega y cols, 2005). Para el caso de sus efectos antiapoptóticos,

algunos de los mecanismos implicados son: oxidar el glutatión reducido y

estimular las proteínas del choque térmico Hsp32 y 70 que protegen a la célula del

estrés oxidativo, inhibir la activación de las caspasas y de las cinasas JNK y ASK-

1 (apoptosis signal-regulating kinase), prevenir la liberación de citocromo c e

inhibir la degradación de Bcl-2 y Bcl-XL, que se encuentran en la membrana

externa de la mitocondria (Myeong y cols, 1998; De la Vega y cols, 2005).

En el caso de tumores, como el mioma uterino, la interacción entre citocinas

proinflamatorias, especies reactivas de oxígeno y las altas concentraciones de NO

que se pueden alcanzar dentro de estos tejidos, provocan que se genere el anión

peroxinitrito, que se ha visto tiene importantes funciones en la promoción y

proliferación celular (Vural y cols, 2001).

NO es una molécula que esta implicada de manera muy importante en el

proceso angiogénico: es un prerrequisito para la migración celular epitelial y

endotelial (Noiri y cols, 1997). Sotomayor y colaboradores en 2005 demostraron

que NO estimula la expresión de VEGF, uno de los mayores inductores de la

angiogenésis, y a su vez VEGF-C es capaz de estimular la liberación del NO

desde las células endoteliales. Por otro lado, a través de receptores acoplados a

75

proteína G que activan la vía MAPK-ERK1/2, NO interviene en la síntesis de

factores de crecimiento como EGF y PCNA, importantes también en este proceso

de neo formación vascular (Navarro y cols, 2005). Todos ellos son factores

importantes que favorecen el crecimiento de tumores, y pueden ser algunos de los

mecanismos por los cuales NO interviene en el desarrollo del tejido miomatoso.

Nuestros resultados a través de la mayor expresión de ER indican que son

los estrógenos las hormonas que más estimulan la producción de NO dentro del

mioma. Si bien en nuestro estudio los resultados no reflejan una fuerte influencia

de P4 sobre NO, tampoco la descartan, pues aunque no muy alta, la expresión de

PR también estuvo presente.

Estrógenos y progesterona tienen una fuerte influencia en la producción de

NO, aunque, a nivel uterino, son los estrógenos, principalmente a través del

receptor alfa, los que mayormente sintetizan esta molécula (Rupnow y cols, 2001).

Ambas hormonas regulan la producción de vasodilatadores como el NO por vía

no genómica activando sistemas de segundos mensajeros intracelulares. La

síntesis de NO inducida por progesterona depende de las vía mensajera activada

por mitógenos (MAPK) y de la vía PLC/PKC/ IP3. Esta última es la responsable de

proveer del calcio necesario para la activación de la enzima responsable de

producir NO, la óxido nítrico sintasa (NOS). E2 y E1 también estimulan la síntesis

de NO. La estimulación de NOS por E2 es calcio dependiente e involucra al

sistema PI3K/Akt, mientras que la E1 regula NOS en ausencia de calcio e

independiente de PI3K. (López y cols, 2005; Massheimer, 2008)

En útero, especialmente en endometrio se ha observado que el resultado

de la relación NO – progesterona es proapoptótico a través de estimulación

sinérgica para activar p38 – MAPK (Yang y cols, 2001); de igual manera, Villalobo

en 2006 concluyó que progesterona a través de óxido nítrico puede inhibir la

proliferación celular por la inhibición de la actividad promotora del factor de

trascripción c-fos, además de que NO también puede regular la activación de Ras

que desacopla la respuesta entre EGRF y MAPK, tomando en cuenta que Ras es

un importante factor antiproliferativo. Son quizá estas las razones por las cuales

en el mioma la relación entre esta hormona y eNOS es mínima.

76

Expresión de enzima convertidora de endotelina y su relación con ER y PR.

Los resultados obtenidos en la expresión de ECE muestran a esta enzima

presente en ambas fases del ciclo, pero con predominio en la fase secretora y en

el tejido miomatoso en donde su incremento con respecto al miometrio es el doble.

La localización que habitualmente se describe para ECE es en endotelio,

células de musculo liso, cardiomiocitos y macrófagos. La expresión de esta

enzima es regulada principalmente por mecanismos dependientes de protein-

cinasa-C, aunque hay otras vías que contribuyen a su producción (Lüscher y

Barton, 2000).

Anteriormente, Pekonen y colaboradores en 1994 y Breuiller-Fouche y

colaboradores en 1997, ya habían descrito la presencia de ET-1 y sus receptores

ET-A y ET-B en mioma y miometrio, siendo la isoforma A, la más abundante en

mioma; sin embargo, las determinaciones se realizaron en cultivo de células

musculares de siete pacientes, en comparación con nuestro trabajo en el que

analizamos las muestras inmediatamente de ser obtenidas, sin influir en la

expresión de proteínas, con medios de cultivo, como ocurre en el trabajo reportado

anteriormente.

ET es un importante factor con acciones profibróticas y mitógenas (Goraca,

2002 y Sticherling, 2006) que induce la proliferación y migración celular

(Hutchison, 1996; Noiri y cols, 1997), modula la síntesis de componentes de la

matriz extracelular y provoca hipertofia de células de musculo liso vascular

(Goraca, 2002). Sus efectos son importantes en la fisiología vascular (Hutchison,

1996; Baltazares y cols, 2005). A nivel uterino, es responsable de mantener el

tono de este órgano, es inductor de las contracciones durante el parto, regula en

flujo sanguíneo uterino y participa en mecanismos de vasoconstricción de las

arterias espirales y la subsecuente menstruación; a través de sus efectos

mitógenos promueve la reepitelización del endometrio durante el ciclo menstrual,

mientras que en condiciones patológicas es uno de los principales estímulos para

77

los procesos de fibrosis, angiogénesis e hipertrofia en este órgano (Plonowski y

cols, 1999; Baron, 1999; Sticherling, 2006). ,

Los efectos proliferativos de ET están dados por su intervención en la

producción de citocinas y factores de crecimiento de modo paracrino o autocrino

(Eude y cols, 2004; Baltazares y cols, 2005). Así, por ejemplo, a través de la vía

dependiente de protein-cinasa-C (PKC), ET es uno de los estímulos para la

síntesis de FGF, EGF, IGF-I, PDGF y TGF-β, todos ellos factores importantes en

el crecimiento tumoral, y puede ser ésta la manera en como ET interviene en el

crecimiento del mioma, pues en condiciones fisiológicas, es uno de los

mecanismos por los que se da la proliferación muscular (Goraca, 2002;Padilla,

2004; Maruo y cols, 2004; Robin y cols, 2004). A su vez, algunos de estos factores

de crecimiento, en especial EGF y TGF-β favorecen la expresión del gen de pre-

proendotelina (Goraca, 2002; Melgarejo, 2005) a través de la activación de c-fos y

c-jun y con la activación de los sitios de unión para factor-1, AP-1 y GATA-2

(Lüscher y Barton, 2000); esta interacción habla del probable papel de ET en la

patogénesis de tumores (Bagnato y Catt, 1998). Otros efectos mitógenos

importantes de ET son: promover la progresión del ciclo celular (Lüscher y Barton,

2000), estimula la síntesis de ADN por vía ERK a través de la activación

secuencial de PKC, Src y Ras (Robin y cols, 2004), y tiene un importante papel en

la expresión de los protooncogenes c-myc y c-fos que preceden a la proliferación

celular (Vural y cols, 2001).

En cuanto a los receptores de ET (pertenecientes a la familia de receptores

acoplados a proteína G, Lüscher y Barton, 2000), a pesar de saber que ET-A tiene

10 veces más afinidad por ET-1, todavía existe discrepancia por la isoforma

predominante en el mioma; por un lado Plonowski y colaboradores en 1999,

Lüscher y Barton en 2000, y Baltazares y colaboradores en 2005 tomando en

cuenta sus efectos proliferativos y mitógenos sobre musculo liso, describieron a

ET-A como el principalmente implicado en esta patología, y por otra parte, Ortega

en 1997 encontró que los efectos de proliferación y diferenciación que se llevan a

cabo en el útero a través de la endotelina están mediados por sus receptores B,

porque estos tienen la capacidad de activar la vía de cinasas activadoras de

78

mitógenos (MAPK), por lo que se considera la posibilidad de que sea este el

receptor responsable del crecimiento uterino en caso de enfermedades orgánicas

como el mioma, además, ET-B, es el responsable de interaccionar con eNOS para

la liberación de NO en las células endoteliales para efectos de migración celular y

mantenimiento de la integridad vascular (Noiri y cols, 1997; Lüscher y Barton,

2000).

Los datos aportados por nuestro estudio en cuanto a la expresión de ECE

por fase del ciclo menstrual indican que cuando están incrementados los niveles

de ER y PR, también lo está ECE, siendo más evidente esta relación, en la fase

secretora, agregando la influencia de progesterona. Por lo anterior sugerimos que

esta enzima esta modulada por ambas hormonas, y principalmente por

progesterona. Apoyando nuestros datos, los trabajos de Ortega en 1997 y Padilla

en 2004, mostraron en modelo animal que la densidad de receptores a ET en

miometrio se incrementa de manera dosis dependiente en presencia de 17β-

estradiol y progesterona. Estas hormonas, por efecto no genómico, intervenen en

la modulación de la síntesis de citocinas como FNT-α o IL-1, que son importantes

estímulos para la producción de endotelina; esta es importante en los procesos de

inflamación, crecimiento tumoral y angiogénesis (Vural y cols, 2001), esto explica

que en ambas fases se haya elevado su concentración en el tejido miomatoso.

Por otro lado, también se ha descrito que la baja concentración de

estrógenos es uno de los estímulos para la síntesis de endotelina (Baltazares y

cols, 2005), y es quizá este hecho, el que explique que ECE esté más expresado

en el mioma durante la fase secretora, pues es aquí donde existen bajas

concentraciones de estrógenos.

Interacción entre eNOS, ECE, ER y PR en el desarrollo miomatoso.

El miometrio esta sometido a diversos cambios fisiológicos como hipertrofia,

hiperplasia, contracción y apoptosis, todos ellos importantes en la actividad

uterina; estos efectos en condiciones fisiológicas están modulados por hormonas

79

esteroideas, hormonas peptídicas, factores de crecimiento, prostaglandinas y

neurotransmisores a través de una compleja red de vías de señalización que

involucran vías dependientes e independientes de PKC, de receptores acoplados

a proteína G y receptores tirosin-cinasa que dan por resultado los efectos

proliferativos de las células miometriales y que tienen un importante papel en las

funciones fisiológicas uterinas (Robin y cols, 2004; Vural y cols, 2001; Ouviña y

cols, 2004; Sticherling, 2006)). La elevación conjunta de ET y NO provoca

hipersecreción de algunos factores de crecimiento como FGF lo cual implica un de

los múltiples estímulos del crecimiento tumoral.

Falta definir con detalle otros mecanismos moleculares por los cuales

estrógenos y progesterona interactúan e intervienen en el crecimiento del mioma,

sin embargo nuestros datos contribuyen al mejor entendimiento de esta patología

a través de los efectos proliferativos y mitógenos que se dan por interacción entre

endotelina y óxido nítrico y con estas hormonas. Por otro lado, la confirmación de

la influencia de endotelina en esta patología nos permite sugerir a los inhibidores

de ECE como una posibilidad de tratamiento, Lüscher y Barton en 2000 ya

reportaron resultados positivos de estos fármacos en otras enfermedades en las

que ET esta implicada de manera importante como la hipertensión arterial

pulmonar o la ateroesclerosis.

80

CONCLUSIONES

FASE PROLIFERATIVA

1.- En las tres regiones analizadas, la enzima eNOS, se expresó en mayor

proporción que ECE, sin embargo, en la región tumoral, ésta estuvo relacionada

con el aumento en la expresión de ER.

2.- La presencia de ECE se incremento paulatinamente de miometrio al tumor, sin

alcanzar la sobre expresión de eNOS.

3.- Sugerimos la influencia positiva de estradiol sobre la expresión de eNOS.

FASE SECRETORA

1.- ECE aumento su expresión en relación directa a los receptores de estradiol y

progesterona en el tumor, no así en miometrio y tejido subtumoral.

2.- Muy probablemente ECE esta modulada por estradiol y progesterona en el

mioma.

PERSPECTIVAS

En base a estos hallazgos, hacen falta más estudios en los que se

determine la presencia y los efectos de ambos receptores de endotelina en la

patología miomatosa, podría ser que tanto ET-A como ET-B estuvieran implicados

y no solamente una de las isoformas.

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ANEXOS

ANEXO 1: CONSENTIMIENTO INFORMADO

CONSENTIMIENTO INFORMADO.

Iniciales de la paciente_______________ Texto de información para la paciente y consentimiento informado para ella.

Expresión De La Enzima Convertidora De Endotelina y Oxido Nítrico Sintasa En Útero Humano Con Miomatosis

INFORMACIÓN PARA LA PACIENTE

Usted ha sido escogida por su médico para participar de forma voluntaria en

un estudio de investigación. Este formulario le proporcionará información

detallada sobre este estudio. Léalo atentamente y si lo desea coméntelo con su

familiar o pareja. Si hay algo que no entienda o si desea tener más información,

por favor pregunte a su médico.

OBJETIVO DEL ESTUDIO.

El objetivo del presente estudio es relacionar la expresión de la enzima

convertidora de endotelina y eNOS con el desarrollo del mioma uterino.

91

TEJIDO DE ESTUDIO. El tejido de estudio es una porción del útero que a usted le será extirpado

por razones médicas. En dicho tejido se analizará la presencia de proteínas

relacionadas con el crecimiento del tumor. Al realizar la cuantificación de las

proteínas antes mencionadas, se tratará de encontrar una asociación entre ellas y

de este modo contribuir a una posible explicación en la etiopatogenia del tumor.

Es importante mencionar que la obtención del fragmento del útero no

interfiere en nada con la cirugía que se le practicará, y tampoco con el tratamiento

o precauciones que deberá tener, pues el tejido utilizado procederá de la pieza

quirúrgica obtenida de la cirugía realizada con carácter terapéutico (miomatosis

uterina o prolapso uterino).

BENEFICIOS. Su médico le ha pedido que participe en este estudio porque está seguro

que no le perjudicará y por el contrario ayudará a estudiar enfermedades como la

suya, pudiendo con ello plantear opciones de prevención y/o tratamiento más

específicos y eficaces.

PARTICIPACIÓN VOLUNTARIA. Su participación en este estudio es voluntaria, por lo que usted no recibirá

ningún pago. Si usted decide participar en el estudio podrá retirarse de éste en

cualquier momento sin penalizaciones, ni se vera afectada su atención médica en

el futuro.

Su muestra puede no ser tomada bajo las siguientes circunstancias:

1) Si el tejido no está en buenas condiciones

2) Si a usted recientemente se le detecto algún trastorno hormonal o

estuvo bajo tratamiento de éstos en el año previo a su cirugía

3) Si usted no regresa para las evaluaciones pertinentes

4) Si usted decide en el último momento no participar.

CONFIDENCIALIDAD. Al firmar el consentimiento informado usted autoriza tanto al personal del

Instituto Politécnico Nacional-Escuela Superior de Medicina, del Hospital General

de Naucalpan del IMSS No. 194 y miembros del Cómite de Etica para revisar su

expediente clínico.

92

Cualquier información recogida por estas personas se mantendrá de

manera confidencial.

Los datos y los resultados obtenidos durante la investigación estarán

disponibles para la paciente, el médico tratante y el equipo de investigadores que

realizan la investigación. Los documentos que los identifica con su nombre se

mantendrán de manera confidencial y si los resultados del estudio se publican, su

identidad permanecerá también confidencial.

Su doctor le entregará una copia del texto de información del

consentimiento informado.

Para cualquier duda sobre el presente protocolo se puede dirigir con los

investigadores responsables del proyecto: Dra. Claudia C. Calzada Mendoza o

con el Dr. Guillermo Ceballos Reyes de la Escuela Superior de Medicina

93

CONSENTIMIENTO INFORMADO.

Por medio de la presente certifico que voluntariamente acepto participar en

el proyecto “Expresión de la enzima convertidora de endotelina y oxido nítrico

sintasa en útero humano con miomatosis” y confirmo que he leído y recibido copia

de la información para la paciente y del “consentimiento informado”.

Firma del paciente:______________

Fecha:________________________

Nombre de la paciente:_____________________________________________

Firma del médico:_______________

Nombre del médico:________________________________________________

Firma del testigo:_______________

Fecha:_______________________

Nombre del testigo:________________________________________________

Dirección del testigo:_______________________________________________

Relación con el paciente:___________________________________________

Firma del testigo:_______________

Fecha:_______________________

Nombre del testigo:________________________________________________

Dirección del testigo:_______________________________________________

Relación con el paciente:___________________________________________

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ANEXO 2. MATERIAL PARA TECNICA DE WESTERN BLOT.

-PIK + inhibidores de proteasas -Solución de Bradfford -Solución separadora (resolving) y concentradora (stacking) *Glicerol 50% *Tris 0.5 M, pH 6.8 *Tris 1.5 M, pH 8.8 *S.D.S al 10% *Acrylamida/Bis al 30% *TEMED *Persulfato de amonio

-Buffer de carga -Metanol -Buffer de transferencia -Buffer de electroforesis -Leche Svelty al 5% -TBS-tween -Solución A y B de luminol (Santa Cruz) -Solución Reveladora -Solución Fijadora

Anticuerpos.

Anticuerpos primarios: -Anticuerpo policlonal de conejo anti-ECE-1 (Santa Cruz) -Anticuerpo policlonal de conejo anti-NOS3 (Santa Cruz) -Anticuerpo policlonal de conejo anti- PR (Santa Cruz) -Anticuerpo policlonal de conejo anti-ERα (Santa Cruz) Anticuerpos secundarios: -Burro anti-IgG de conejo (Santa Cruz)

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ANEXO 3. DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA DE LAS REGIONES ESTUDIADAS

EN UTERO CON MIOMATOSIS AL MOMENTO DE HACER LA TOMA DE LA

MUESTRA.

Al corte transversal del útero, distinguimos las siguientes regiones:

Mioma: se trato de masas bien circunscritas, firmes, duras, de color

aperlado, con un aspecto arremolinado muy característico y su tamaño varió

desde nòdulos pequeños fácilmente distinguibles (5 a 8 mm) hasta, hasta 4 cm, de

diámetro en promedio.Al tacto, la masa sobresalía del resto del tejido, lo que

permitió identificar el tumor, el tejido subtumoral y el miometrio adyacente.

Para nuestro estudio se empleo los miomas de localización intramural, y la toma

se realizó del centro de la masa tumoral, siendo aproximadamente 2 cm3 los que

se extrajeron.

Tejido subtumoral: la toma se realizó a partir de uno de los bordes del

mioma con dirección hacia el miometrio, también fueron 2 cm3 los que se

extrajeron. Esta región del tejido, incluyó el mioma y miometrio, aunque ya no

tenía el aspecto arremolinado del mioma, aún se sentía muy firme y duro al corte

además de la porción semidura del miometrio, .

Miometrio: Para la toma de muestra se elijió la zona más alejada posible del

mioma, y lo distinguíamos por su color rosado y su consistencia firme, pero no

dura. Éste y los demás cortes los hicimos hacia el fondo en la capa muscular,

evitando tomar endometrio.