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Introduccin a La Apoptosis Introduccin a La Terapia Gnica Curso 2008-09

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Introduccin a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: Induccin Control Ejecucin Implicaciones: Funcin fisiolgica Implicaciones patolgicas

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Introduccin a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: Induccin Control Ejecucin Implicaciones: Funcin fisiolgica Implicaciones patolgicas

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Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. & Currie, A.R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon With Wide Ranging Implications In Tissue Kinetics British Journal of Cancer (1972), 26: 239.

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Qu Es La Apoptosis? Cada de la hoja (Kerr et al., 1972). Suicidio celular. Autodestruccin de las clulas, activa y genticamente controlada, caracterizada por una morfologa especfica.

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Apoptosis Necrosis Necrosis: Tipo de muerte celular, que ocurre como consecuencia de un dao masivo de tejido, asociada con una rpida incapacitacin de las principales funciones celulares como son la expresin gnica, sntesis de ATP y potencial de membrana.

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Apoptosis versus Necrosis ApoptosisNecrosis Causas Falta factores crecimiento Influencia hormonal Toxicidad suave Anoxia Dao fsico o qumico Morfologa Cel. EncogidaCel. Inflada Ncleo Condensacin, segmentacin, fragmentacin ADN Degradacin ADN Membrana celular Protuberancias, cambios en la distribucin de fosfatidilserina Lisa, lisis Mitocondria Cambios molecularesInflamiento Expresin + Expresin gnica, sntesis proteica, activacin proteasas -

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Website designed by Phil Dash: www.sghms.ac.uk/depts/immunology/ ~dash/apoptosis/intro.html Apoptosis de una clula trofoblstica:

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Introduccin a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: Induccin Control Ejecucin Implicaciones: Funcin fisiolgica Implicaciones patolgicas

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Mecanismos Moleculares Caenorhabditis elegans: Adulto: 1090 clulas somticas 131 mueren por apoptosis Bsicamente, 4 genes mayores controlan la MCP (ced = cell death defective): Mutaciones en egl-1, ced-3 y ced-4: clulas sobreviven (promotores de MCP) Mutacin en ced-9: aumenta la apoptosis (inhibidor) Genes homlogos en mamferos

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Proteinas Apoptticas En C. elegans Hengartner, M. (1998) Science 281: 1298-99

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Genes Homlogos En Mamferos Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281: 1322-26

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Introduccin a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: Induccin Control Ejecucin Implicaciones: Funcin fisiolgica Implicaciones patolgicas

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Induccin De La Apoptosis Interacciones ligando-receptor. Estrs celular: Qumicos, Radiaciones, Infecciones virales. Linfocitos T citotxicos (granzima). www.sghms.ac.uk/depts/immunology/ ~dash/apoptosis/intro.html

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1. Interaccin Ligando- Receptor Death receptors (Superfamilia de TNF): CD95 (Fas) TNFR1 TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand): DR4 y DR5

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Induccin Va CD95/Fas Muerte celular mediada por las clulas T citotxicas. Respuesta inmune: supresin de clulas T activadas. Sitios inmunoprivilegiados: destruccin de clulas inmunes e inflamatorias. www.sghms.ac.uk/depts/immunology/ ~dash/apoptosis/intro.html DISC

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Induccin Va TNFR1 TNF se produce por clulas T y Macrfagos activados en respuesta a la infeccin. Activacin de NF- B y AP-1 Induccin de genes proinflamatorios (1). Induccin de apoptosis (2) 1 2 www.sghms.ac.uk/depts/immunology/ ~dash/apoptosis/intro.html

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Induccin Va TRAIL Accin similar a CD95. Unin a receptores DR4 y DR5. Expresin constitutiva en muchos tejidos Mecanismos de proteccin celular mediante la expresin de receptores seuelo DcR1 y DcR2. www.uchsc.edu/sm/neuro/tylerlab/pennyclarke/pennyclarketrail.html

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2. Estrs celular: Dao genotxico Agentes intercalantes (Cisplatin, mytomicin C, formaldehyde). Inductores de aductos al ADN (Polycyclic aromatic hydrocarbons: benzo(a)pyrene). Agente alquilante (ethyl Methanesulphonate, n-ethyl-n- nitrosurea). Productores de radicales libres (Niquel, arsenic, H 2 O 2 ). Inhibidores de microtbulos (Taxol). Inhibidores de la Topoisomerasa (Etoposide, doxorubicin). Perturbadores del balance nucleotdico (methotrexate). Radiaciones (x-ray).

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Protena de unin al ADN con dominios de activacin de la trascripcin. Previene la replicacin del ADN daado. Supresor tumoral. Mutaciones de p53 en el 50% de los tumores humanos (60-70% cancer asociados al ambiente). p53: El Guardin Del Genoma Lane (1992)

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Funciones De p53 ADN daadoATMp53 P MDM 1. Parada del ciclo celular: p21 p53P Cdk2 S phase (DNA synthesis) G2G2 G1G1 M 2a. ADN reparado: ATM p53 MDM 2b. Apoptosis: Bax, Fas/FasL Bcl-2

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Regulacin De p53 Stanchina et al. (1998) Genes and Development 12: 2434-42 MDM

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3. Linfocitos T Citotxicos http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Students/spring2000/woodall/perforine.html

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http://www.nature.com/nri/journal/v2/n4/slideshow/nri775_bx2.html

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Introduccin a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: Induccin Control Ejecucin Implicaciones: Funcin fisiolgica Implicaciones patolgicas

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Funcin de la Mitocondria Localizacin de miembros de la familia de Bcl-2 en la membrana mitocondrial. Promover o prevenir la formacin de poros en la membrana controlando la liberacin de citocromo C. www.sghms.ac.uk/depts/immunology/ ~dash/apoptosis/intro.html

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Familia de Bcl-2 Homlogos a las protenas ced-9 y egl-1. Miembros pro- y anti-apoptticos http://www.geocities.com/CollegePark/Lab/1580/bcl-2.html Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281: 1322-26

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Estructura proteica Formacin de homo- y hetero-dmeros. Similar a las protenas de formacin de poros bacterianas. Dominios de unin a membrana en el extremo C terminal. Localizacin en la membrana externa mitocondrial. Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281: 1322-26

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Regulacin de la apoptosis por la familia de Bcl-2 Liberacin de Cyt C Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281: 1322-26 Activacin de caspasas

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Regulacin de la apoptosis por la familia de Bcl-2 La sensibilidad de la clula a un estmulo apopttico depende del balance entre miembros pro y anti-apoptticos. Estmulo apopttico Bax Bcl-2 Cyt C

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Regulacin de la apoptosis por la familia de Bcl-2 Modelos de control de apoptosis: A Bcl-2 Bax B Bcl-2 C BaxBcl-2 Chau, D.T. & Korsmeyer, S.J. (1998) Annual Review in Immunology 16: 395-419 A + B+ C

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Regulacin de la apoptosis por la familia de Bcl-2 Regulacin post-traduccin: BH3 only Chau, D.T. & Korsmeyer, S.J. (1998) Annual Review in Immunology 16: 395-419 PI3-K AKT

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Regulacin de la apoptosis por la familia de Bcl-2 Regulacin post-traduccin: BH3 only Caspasa-8 Bid Desagher et al. (1999) JBC 144: 891-901

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Introduccin a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: Induccin Control Ejecucin Implicaciones: Funcin fisiolgica Implicaciones patolgicas

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Familia De Caspasas Homlogos a ced-3. Cystein proteasas (Cys en su sitio activo). Ampliamente expresadas en forma de proenzimas. Digestin de protenas en los residuos de cido asprtico.

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Clases De Caspasas Iniciadoras (like caspasa-9) Ejecutoras (like Caspasa-3) Digestin de protenas Cambios morflogicos celulares. Thornberry, N.A.. & Lazebnik, Y. (1998) Science 281: 1312-16

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CaspasaNombre alternativo SubstratoFuncin Caspasa-1 ICEpre-Interleukin-1b Interleukin-18 Lamins Processing of interleukins (inflammation). Can also induce apoptosis depending on isoform and if overexpressed. Caspasa-2 Ich-1 (human), Nedd2 (rat, mouse) Golgin-160 Lamins (?) Apoptosis (activity supressed by serum deprivation) Caspasa-3 CPP32, Yama, apopain PARP SREBs Gelsolin Caspase-6 Caspase-7 Caspase-9 DNA-PK MDM2 Gas2 Fodrin -Catenin Lamins NuMA HnRNP proteins Topoisomerase I FAK Calpastatin p21 Waf1 Presenelin2 ICAD Apoptosis

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CaspasaNombre alternativo SubstratoFuncin Caspasa-4 Ich-2, ICE rel IICaspase-1Inflammation/Apoptosis (note: this could be the human form of mouse caspase-11). Related to human caspase-5 and caspase-1 Caspasa-5 ICE rel III, TY?Inflammation/Apoptosis (related to human caspase-4 and caspase-1) Caspasa-6 Mch2PARP Lamins NuMA FAK Caspase-3 Keratin-18 Apoptosis Caspasa-7 Mch3, ICE-LAP3, CMH-1 PARP Gas2 SREB1 EMAP II FAK Calpastatin p21 Waf1 Apoptosis (activity blocked by cIAP1 and cIAP2) Similar in structure and substrate specificity to caspase-3

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CaspasaNombre alternativo SubstratoFuncin Caspasa-8 FLICE, MACH, Mch5Caspase-3 Caspase-4 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-9 Caspase-10 Caspase-13 PARP Bid Apoptosis (death receptors) Caspasa-9 Apaf-3, ICE-LAP6, Mch6 Caspase-3 pro-Caspase-9 Caspase-7 PARP Apoptosis Caspasa-10 FLICE-2, Mch4Caspase-3 Caspase-4 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-8 Caspase-9 Apoptosis (death receptors) Caspasa-11 Ich-3, ICE_B?Murine caspase similar to human caspase-4. Belongs to the same family as caspase-3 of enzymes. May be involved in inflammation and apoptosis

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CaspasaNombre alternativo SubstratoFuncin Caspasa-12 ICE_C?Involved in mediating apoptosis following ER stress. Related to mouse caspase-1 and caspase- 11 and human caspase-4 and caspase-5 Caspasa-13 ERICE?Member of the ICE family of caspases that include caspase-1 and caspases- 4, -5 and 11. Involved in inflammation. http://www.sghms.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/caspases.html

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Regulacin De Las Caspasas Raff, M. (1998) Nature 396: 119

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Regulacin De Las Caspasas Thornberry, N.A.. & Lazebnik, Y. (1998) Science 281: 1312-16

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Regulacin De Las Caspasas Slee et L. (1999) Jounal of Cell Biology 144: 281-91 http://www.sghms.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/caspases.html

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Caspasa-8 Bid Desagher et al. (1999) JBC 144: 891-901 Regulacin De Las Caspasas

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Efectos De Las Caspasas Thornberry, N.A.. & Lazebnik, Y. (1998) Science 281: 1312-16

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Efectos En El Ncleo Inhibicin de enzimas de reparacin [Poly (ADP- ribosa) polimerasa o PARP]. Inhibicin de enzimas de replicacin celular (DNA topoisomerasa II). Ruptura de protenas estructurales nucleares (Caspasa-6 lamina). Fragmentacin del ADN. http://www.sghms.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/caspases.html

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Apoptosis Independiente De caspasas (AIF) AIF (Apoptosis Inducing Factor) se localiza en la mitocondria. Apoptosis: AIF migra al ncleo. AIF se une al ADN y desencadena la destruccin del mismo y la muerte celular. Mecanismo observado en neuronas.

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Eliminacin De Las Clulas Apoptticas Prdida de la asimetra de membrana exposicin de la fosfatidil serina en la capa externa

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Mecanismos moleculares de la apoptosis Terapia Cncer Enfermedades cardiacas Infartos SIDA Enfermedades autoinmunes Enfermedades neurodegenerativas

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Introduccin a La Apoptosis To be continued...

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Introduccin a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: Induccin Control Ejecucin Implicaciones: Funcin fisiolgica Implicaciones patolgicas

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Implicaciones Funcin fisiolgica: * Desarrollo embrionario * Homeostasia tisular y diferenciacin tisular * Respuesta inmune

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Desarrollo Eliminacin de rganos transitorios. Remodelacin Tisular. Formacin de conexiones neuronales adecuadas. Inhibicin de apoptosis mediante seales extrnsecas: Factores Neurotrficos Supervivencia neuronal. Factor Stell de las crestas genitales Supervivencia de las clulas germinales primordiales. Andrgenos Supervivencia de las clulas de la prstata.

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Respuesta Inmune Seleccin de clulas B con anticuerpos de alta afinidad CDF B Apoptosis del 90% de centrocitos Bcl-2

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Mantenimiento De La Integridad De Sitios inmunoprivilegiados Organos: ojo, odo interno, testculo o cerebro. Expresin de FasL e induccin de apoptosis en linfocitos Fas+. Clula cornea Linfocito Utilizacin para permitir la tolerancia a transplantes.

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Eliminacin De Clulas Peligrosas Para La Integridad Del Organismo Clulas infectadas con virus (CTL). Clulas del sistema inmune. Clulas con el ADN daado. Clulas cancerosas.

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Introduccin a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: Induccin Control Ejecucin Implicaciones: Funcin fisiolgica Implicaciones patolgicas

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Implicaciones Implicacin patolgica: * Cncer * SIDA * Dao txico * Enfermedades Neurodegenerativas

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Apoptosis Y Cncer

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Oncogenes / Supresores tumorales Apoptosis Cancer ras c-myc p53Bcl-2 p53* 50% tumores Bcl-2 90% adenocarcinomas colorectales 30-60% cancer de prstata 70% leucemias linfocitarias 20% cancer de pulmn

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P53 El guardian Del Genoma p53 p53* Carcingenos genotxicos radiacin - Arresto del ciclo celular en G1 - Induccin de la apoptosis

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Apoptosis Y Cncer cls. hematop. epitelios APOPTOSIS CANCER Intestino delgado (stem cells) Colon

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Iniciacin Y Promocin 80-90 % de las clulas pretumorales (GST-P+) no desarrollan lesiones observables. apoptosis por promotores tumorales (Fenobarbital, acetato de ciproterona). apoptosis mediante restriccin alimentaria

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Progresin Y Crecimiento Apoptosis: hepatocitos, foci, adenoma, carcinoma Dao gentico. Ausencia de factor de supervivencia (mitgenos, hormonas) regresin y potencial eliminacin de tumores. !

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Apoptosis En Tumores ApoptosisProliferacin 0.05% 0.5%/h 5%/h Apoptosis Crecimiento < 5% del esperado Higado

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BaxBcl-2 Bax Bcl-2Bax Bcl-2Bax Quimioterapia Radiacin p53 Bcl-2 Bax Apoptosis Induccin de Apoptosis De Clulas Tumorales

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Cncer causado por virus: HPV: Inactivacin de p53 por E6. Epstein-Barr Virus: Produccin de protena similar a Bcl-2, Incremento en la produccin de Bcl-2 celular. Leucemias de clulas B: traslocacin del gen de Bcl-2. Melanoma: Inhibicin de la expresin del gen de Apaf-1. Mecanismos De Escape De La Apoptosis

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Mantenimiento del tumor como un sitio inmunoprivilegiado: Secrecin de molculas seuelo que se unen a FasL de los CTL. Expresin de altos niveles de FasL e induccin de la apoptosis de linfocitos T activados. Mecanismos De Escape De La Apoptosis

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APOPTOSIS Y SIDA

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Sndrome de Inmuno-Deficiencia Adquirida 1.Infeccin aguda: Altos niveles de viremia e infeccin de clulas CD4+, macrfagos, otras,... Respuesta inmune celular y Ac. 2.Estado asintomtico: Replicacin viral/Respuesta inmune celular, Disminucin Ac. 3.Estado sintomtico: Disminucin de CD4+ y aumento de carga viral. Sintomatologa, infecciones oportunista, neoplasias, demencia...

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Apoptosis de clulas inmunitarias gp120-gp41 CD4+ Apoptosis: CD8+ Clulas B NK Granulocitos Monocitos Mecanismo indirecto de induccin de apoptosis? Expresin de altos niveles de FasL

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Demencia en SIDA Prdida de neuronas en ganglios basales, materia blanca y corteza cerebral. Infeccin por HIV de macrfagos, microglia y astrocitos. No neuronas. Actividad neurotxica: Protenas virales: gp120, Tat. Secreciones de macrfagos y microgla activados: TNF-, excitoxinas, NO