introduccion a la cromatografia
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t0 1 2 3
211299 Análisis Instrumental II – Quimicos Analistas 2006
CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL
I: PRINCIPIOS Y PARAMETROS
Dr. Dietrich von Baer v. L.Dra. Claudia Mardones P.
Universidad de ConcepciónFacultad de Farmacia
Departamento de Análisis Instrumental
CROMATOGRAFIACHROMATOS = COLORGRAPHEIN = ESCRIBIR
Columna deCarbonato de Calcio
Mikhail Tswett: 1906: separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella
D. von Baer/C. Mardones 2008
Pigmentos naturales
CROMATOGRAFIACHROMATOS = COLORGRAPHEIN = ESCRIBIR
Columna deCarbonato de Calcio
Mikhail Tswett: 1906: separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella
Eter de petróleo
Pigmentos naturales
D. von Baer/C. Mardones 2008
CROMATOGRAFIACHROMATOS = COLORGRAPHEIN = ESCRIBIR
Columna deCarbonato de Calcio
Mikhail Tswett: 1906: separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella
Martin y Synge (1952): Obtienen Premio Nóbel de Química por la invención de la Cromatografía de Partición en Papel: Clave para la separación de aminoácidos y diversos otros compuestos de interés biológico en mezcla.
Eter de petróleo
Pigmentos naturales
Martin y James (1952):Inventan Cromatografíade Gas (1er método instrumental)
D. von Baer/C. Mardones 2008
CROMATOGRAFIACHROMATOS = COLORGRAPHEIN = ESCRIBIR
Columna deCarbonato de Calcio
Mikhail Tswett (1906): separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella
HOY: Conjunto de métodos de análisis químico instrumental que permiten separar los componentes de una mezcla, los cuales se distribuyen SELECTIVAMENTE entre:
FASE ESTACIONARIA (en reposo)
FASE MOVIL (se hace pasar a través de o en torno a FASE ESTACIONARIA )
Martin y Synge (1952): Reciben Premio Nóbel de Química por la invención de la Cromatografía de Partición en Papel: Clave para la separación de aminoácidos y diversos otros compuestos de interés biológico en mezcla.
Eter de petróleo
Pigmentos naturales
Martin y James (1952):Inventan Cromatografíade Gas (1er método instrumental)
D. von Baer/C. Mardones 2008
CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS Según ESTADO FISICO de las FASES:
Crom. LIQ-
LIQUIDO
Crom. GAS-
LIQUIDO
Crom. LIQ -
SOLIDO
Crom. GAS –
SOLIDO
FASE MOVIL:
Líquido Gas
FASE ESTA- CIONARIA:
Líquido
Sólido
Cromatógrafode Líquidos
Cromatógrafode Gases
INSTRUMENTO
CROMATOGRAFODE LIQUIDOS
CROMATOGRAFO
DE GASES
D. von Baer/C. Mardones 2008
CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS
Según el OBJETIVO:
Identificar y cuantificar componentes de una mezcla
Compuesto %
A 12,5B 25,0C 50,0D 12,5
• Analítica
• Preparativa
Aislar componentes de una mezcla
D. von Baer/C. Mardones 2008
• PLANAR
Fase estacionaria
Fase móvilp1 p2 p3 m1 m2
D. von Baer/C. Mardones 2003
Según la FORMA de hacerla:
En COLUMNA
COLUMNAS DE HPLC COLUMNA DE GC
Fase móvil
Fase estacionaria
p1 p2 p3 m1 m2
• PLANAR
COLUMNAS DE HPLC COLUMNA DE GC
Según la FORMA de hacerla:
En COLUMNA
D. von Baer/C. Mardones 2008
Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:
• PARTICION O REPARTO: Solubilidad selectiva entre dos fases. Lo SIMILAR ES SOLUBLE EN LO SIMILARFase Estacionaria: LIQUIDOFase Móvil: LIQUIDO o GAS
D. von Baer/C. Mardones 2003
• PARTICION O REPARTO• ADSORCION• INTERCAMBIO IONICO• EXCLUSION
• Para retener la fase estacionaria líquida, en la mayoría de los casos esta se une física- o química-mente a un soporte sólido
• EN CROMATOGRAFIA LIQUIDO/LIQUIDO: Para evitar que se mezclen las fases, se usan dos
líquidos no miscibles como fase estacionaria y móvil, uno polar y uno apolar.
F. est. polar /F. móvil apolar: Fase Normal F. est. apolar/ F. móvil polar: Fase Inversa• Casos particulares Crom. Reparto: - Crom. en Papel
y Crom. Liquida en Fase Inversa
Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:
• PARTICION O REPARTO• ADSORCION• INTERCAMBIO IONICO• EXCLUSION
• ADSORCION: Fenómeno de SUPERFICIELos solutos se concentran sobre la superficie de un sólidoFase Estacionaria: SOLIDO ADSORBENTE
• Centros activos en la superficie del sólido interac-cionan con grupos polares de los solutos, los cuales son desplazados por la fase móvil.
• Retención depende de área superficial, la cual depende del tamaño de partícula y de la superficie interna ido interaccionan con grupos polares de los solutos, los cuales son desplazados por la fase móvil.
D. von Baer/C. Mardones 2008
• INTERCAMBIO IONICO:Intercambio estequiométrico de IONES de Muestra y Fase Móvil, que compiten unirse a Fase Estacionaria IONICA.
+++
+
+
+++
+
Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:
• PARTICION O REPARTO• ADSORCION• INTERCAMBIO IONICO• EXCLUSION
Fase estacionaria: Matriz rígida en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva- o negativamente y contraiones de carga opuesta, susceptibles de intercam-biarse con iones de la misma carga contenidos en en la Fase Móvil, la cual suele ser una solución tamponada,
SEPARACION se produce por competencia entre iones analito y de la Fase Móvil por los grupos ionizados de la Fase Estacionaria.
D. von Baer/C. Mardones 2008
• EXCLUSION: Separación en función de tamaño molecular. Solutos más pequeños penetran más en poros de Fase Estacio-naria POROSA (tamiz molecular)
Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:
• PARTICION O REPARTO• ADSORCION• INTERCAMBIO IONICO• EXCLUSION
Fase estacionaria: Matriz inerte que contiene pequeños poros en los cuales pueden penetran más las moléculas más pequeñas y menos las más grandes.
La retención depende del tamaño de las moléculas solvatadas y del tamaño de los poros.
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FASEESTACIONARIA
DETECTOR
FASE MOVIL
tm > retardo< retardo< retardo
COLUMNA
D. von Baer/C. Mardones 2003
FASEESTACIONARIA
DETECTOR
FASE MOVIL
tm
COLUMNA
D. von Baer/C. Mardones 2008
FASEESTACIONARIA
DETECTOR
FASE MOVIL
tm > retardo< retardo< retardo
COLUMNA
D. von Baer/C. Mardones 2008
FASEESTACIONARIA
DETECTOR
FASE MOVIL
tm > retardo< retardo< retardo
COLUMNA
D. von Baer/C. Mardones 2008
Señal
t
CROMATOGRAMA
INFORMACIÓN CUALITATIVA
INF
OR
MA
CIÓ
N C
UA
NT
ITA
TIV
A tM
0 1 2 3
D. von Baer/C. Mardones 2008
Señal
t
CROMATOGRAMA
INFORMACIÓN CUALITATIVA
INF
OR
MA
CIÓ
N C
UA
NT
ITA
TIV
A tM tR1
0 1 2 3
D. von Baer/C. Mardones 2008
Señal
t
CROMATOGRAMA
INFORMACIÓN CUALITATIVA
INF
OR
MA
CIÓ
N C
UA
NT
ITA
TIV
A tM tR1 tR2
0 1 2 3
D. von Baer/C. Mardones 2003
Señal
t0 1 2 3
CROMATOGRAMA
INFORMACIÓN CUALITATIVA
INF
OR
MA
CIÓ
N C
UA
NT
ITA
TIV
A
tM
tR1
tR2
D. von Baer/C. Mardones 2008
Señal
t0 1 2 3
CROMATOGRAMA
INFORMACIÓN CUALITATIVA
INF
OR
MA
CIÓ
N C
UA
NT
ITA
TIV
A
tM
tR1’tR2’
tR1
tR2
tR ’ = t
R- t
M
D. von Baer/C. Mardones 2008
Fase estacionaria
Fase móvil
PARAMETROS CROMATOGRAFICOS
I. Factor de Retención (Factor de Capacidad)
= tR – tM
tM
ktR = tiempo de retención
tM = tiempo muerto (to )
Como tR’ = tR- tM
= tR’
tM
k tiempo del soluto en Fase Estacionaria
tiempo del soluto no retardado en Fase Móvil
Idealmente, k’ debe estar entre 2 y 10. En la práctica 1< k < 20 es satisfactorio.
D. von Baer/C. Mardones 2008
D. von Baer/C. Mardones 2003
Para modificar k: En HPLC modificando la proporción de modificador
orgánico de la fase móvil
EN GC: Variando T°
= tR2’
tR1’
para tR2’ > tR1’
= k2
k1
para k2 > k1
o bien
II. Factor de Separación (Factor de Selectividad)
El factor de separación describe la migración de un pico presente en la mezcla en relación al otro que sufre menos retardo > 1
recomendable que 1.1 < 1.5
D. von Baer/C. Mardones 2008
= tR2’
tR1’
para tR2’ > tR1’
= k2
k1
para k2 > k1
Columna C-1
Columna C-8
o bien
(2,1) = 1.6
(2,1) = 2.1
II. Factor de Separación (Factor de Selectividad)
D. von Baer/C. Mardones 2008
= tR2’
tR1’
para tR2’ > tR1’
= k2
k1
para k2 > k1
¿ Es igual la calidad de la separación en casos A y B ?
o bien
II. Factor de Separación (Factor de Selectividad)
= tR2’ ( cte)
tR1’ (cte)
D. von Baer/C. Mardones 2008
Señ
al
t0 1 2 3 4
tR2
k y constantes, perocalidad separación no es constante
tM
tR1
Si tM, tR1 , tR2 = constantes
III. Eficiencia
N = Número de Platos Teóricos
h
w
< ancho > eficiencia: deseable
h
w
> ancho < eficiencia: NO deseable
D. von Baer/C. Mardones 2008
Eficiencia N
N = Número de Platos Teóricos
Señ
al
t01 2
3
tR2
h
16 tR
wb
N =wb = ancho de pico
en la base
= 4
[ ]2
D. von Baer/C. Mardones 2008
Eficiencia N
N = Número de Platos Teóricos
Señ
al
t01 2
3
tR2
h
5,545 tR
wh
N = [ ]2 wh = ancho de pico
a mitad de altura
16 tR
wb
N =wb = ancho de pico
en la base
[ ]2
D. von Baer/C. Mardones 2008
N = 14
HETP = 2
HETP
N = 28
HETP = 1
HETP
HETP = 4
N = 7
HETP
> N,< HEPT = Mayor eficiencia
< N, > HEPT = Menor eficiencia
Altura Equivalente de Plato Teórico (HETP)Sección eficaz responsable de un equilibrio de intercambio
= L N
HETP
L = largo columnaN = número de platos teóricos
HE
TP
Fase móvilFase móvil
Fase estacionaria
L
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A: Efecto de camino múltiple o de laberinto
HETP = A + B/ + C .
Ecuación de van Deemter
velocidad lineal media de lafase móvil
MMM
M
M
M
• A depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de separación > Eficiencia con partículas pequeñas de tamaño uniforme
• A NO depende del flujo de fase móvil
A = 2 . dp
=factor de empaque
dp = diámetro de partícula
D. von Baer/C. Mardones 2008
A:Efecto de camino múltiple
MMM M
M
M
HETP = A + B/ + C .
Ecuación de van Deemter
velocidad lineal media de lafase móvil
• A depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de separación > Eficiencia con partículas pequeñas de tamaño uniforme
Forma partículaPartículas irregulares > A < eficiencia
Partículas esféricas < A > eficiencia
Incidencia Tamaño partícula
D. von Baer/C. Mardones 2008
B: Difusión longitudinal o axial
HETP = A + B/ + C .
Ecuación de van Deemter
velocidad lineal media de lafase móvil
t1
D. von Baer/C. Mardones 2008
B: Difusión longitudinal o axial
B depende de:• DM= Coeficiente difusión soluto en Fáse Móvil: mucho >
en un GAS que en un líquido + importante en GC que en HPLC
• = Factor de obstrucción o tortuosidad (sólo en columnas empacadas, 0 en columnas capilares)
HETP = A + B/ + C .
Ecuación de van Deemter
velocidad lineal media de lafase móvil
t1 t2
B/ depende del flujo a >< contribución de B/ a la
HETP > Eficiencia
Difusión longitudinal aumenta a medida que analitos permanecen más tiempo en la columna
D. von Baer/C. Mardones 2008
C: Resistencia a la transferencia de masaC: Resistencia a la transferencia de masa
HETP = A + B/ + C .
Ecuación de van Deemter
velocidad lineal media de lafase móvil
Equilibrio
No equilibrio
• Término C Ec. van Deemter se refiere a la transferencia de masa del analito hacia y desde la Fase Estacionaria.
C * : aumenta directamente con el flujo
a > > C y < Eficiencia
Distribución del analito en situación de:
D. von Baer/C. Mardones 2008
Efecto del flujo sobre el ensanchamiento del peak cromatografico
HETP= A + B/ + C*
HETP
C*A
B/
Global
Flujo óptimo
Crom. de Gas
Incidencia B mucho menor en Cromatografía Liquida que Gaseosa, pues DM es < en un líquido que en gas, pero Transf. Masa en Fase Móvil (Cm) adquiere > importancia.
HETP
Crom. Líquida
D. von Baer/C. Mardones 2008
PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO:
RESOLUCION: Medida cuantitativa de las separación entre dos analitos contiguos en el cromatograma, considerando los anchos de los peaks en sus bases.
Señ
al
tR2- tR1
D. von Baer/C. Mardones 2008
PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO:
2 tR2 – tR1
wb1+ wb2
Rs=
Wb1 y Wb2 = ancho en la
base de dos picos vecinos
Rs = Resolución
Señ
al
tR2- tR1
RESOLUCION: Medida cuantitativa de las separación entre dos analitos contiguos en el cromatograma, considerando los anchos de los peaks en sus bases.
D. von Baer/C. Mardones 2008
PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO:
2 tR2 – tR1
wb1+ wb2
Rs= Wb1 y Wb2 = ancho en la
base de dos picos vecinos
Ecuación Maestra de la Cromatografía
Rs = Resolución
Si Wb1 ≈ Wb2
Rs = ( ) - 1
( ) k k + 1 ( )√
4N
Rs = 1,0 —> 97,9 % separación
= 1,25 —> 99,4 % separación = 1,5 —> 99,7 % separación > 2,0 —> separación TOTAL
Si dos picos vecinos tienen tamaño similar
D. von Baer/C. Mardones 2008
Influencia de la eficiencia sobre la resolución cromatográfica
N = 712Rs=1.0
N= 1.600Rs=1.5
N = 2.844Rs=2.0
N = 11.344Rs=4.0
1:1 1:4 1:16
Rs=1.25
Rs=1.0
Rs=0.8
Rs=0.6
1:1 2:11:1 4:1 8:1 16:1 32:1
Resolución vs. proporciones de área de 2 picos vecinos
98 %
99,7 %
Total
Total
D. von Baer/C. Mardones 2008
Influencia de factor de separación)sobre la resolución
cromatográfica
= 1.25Rs (3,4) = 2.0
= 1.15Rs (3,4) = 1.2
D. von Baer 2002
C8
C18
Factor de Asimetría (Tailing)
T = b0,1 / a0.1
(definición IUPAC)
T idealmente = 1, en la práctica T > 1
D. von Baer/C. Mardones 2008
Nunca la primera separación es la mejor
D. von Baer/C. Mardones 2008
Nunca la primera separación es la mejor
D. von Baer/C. Mardones 2008
Nunca la primera separación es la mejor
D. von Baer/C. Mardones 2008
Nunca la primera separación es la mejor
Separaciones DEBEN OPTIMIZARSED. von Baer/C. Mardones 2008