Cromatografia 2015 Fin

Qu es la cromatografa?

Qu es la cromatografa?

???

Fase Fija

Fase Mvil

Consiste en un solido o un liquido fijado a un solido

por donde el cual pasa la fase mvil

Consiste en un liquido o un gas que es arrastrado

a travs de la fase estacionaria

Tipos de cromatografa

Plana

En papel

Papel (FE)

Solvente (FM)

Tapa

Cubeta

Mezcla a resolver

Anlisis cualitativo (NO CUANTITATIVOS!!!)

Fase estacionaria: papel de filtro

Se basa en la diferencia de velocidad con la que se desplazan los componentes de la muestra, lo cual esta dado por el tipo de

interaccin con la fase mvil

(segn la disposicin de la fase estacionaria)


Plana

En papel En capa fina

Anlisis cualitativo

Fase estacionaria: placa (papel) recubierta con una capa delgada

de fase estacionaria, generalmente se utiliza slice


Plana


En Columna

Gases Lquidos

Fluido supercrtico

(segn tipo de fase mvil)

Utiliza una columna que se llena con un soporte slido adsorbente (gel de slice (SiO2) y almina (Al2O3)) y se hace pasar a travs de ella la fase mvil.

La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna.

Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin.


En Columna

DESVENTAJAS columna de vidrio Es un proceso lento Es un proceso poco eficaz tanto por la capacidad de separacin, como por el

nmero de solutos que se pueden separar. Es una tcnica laboriosa No proporciona directamente la composicin de las fracciones Solo se pueden separar muestras del orden de gramos a mgr.


Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)

En Columna

VENTAJAS Aumentar la eficacia de la separacin Se reduce el tiempo de separacin Permite acoplar un sistema de deteccin

continuo a la salida de la columna, (on line) Aumenta el orden de deteccin (g)


Intercambio inico

Exclusin molecular

De particin


En Columna

Fase normal Fase reversa

FASE MOVIL LIQUIDO


En Columna

Exclusin molecular

Las molculas se separan en solucin segn su peso molecular (tamao).

La fase estacionaria consiste en pequeas perlas que contienen cavidades de tamao exactamente conocido.



En Columna

Intercambio inico

La fase estacionaria tiene grupos cargados que interaccionan electrostticamente con iones de signo contrario que se encuentran en la fase.

permite la separacin de iones y molculas polares


En Columna



De particin

Fase normal

Fase estacionaria: muy polar Fase mvil: solvente no polar Orden elusin: sale primero el

componente menos polar

Fase mvil

Fase estacionaria

Orden elusin

En Columna



De particin

Fase estacionaria: no polar Fase mvil: solvente polar Orden elusin: sale primero el

componente ms polar

Fase reversa

Fase mvil

Fase estacionaria

Orden elusin

En Columna



De particin

Fase normal

Fase reversa

De particin

Fase estacionaria: no polar Fase mvil: solvente polar Orden elusin: sale primero el

componente ms polar

Fase estacionaria: muy polar Fase mvil: solvente no polar Orden elusin: sale primero el

componente menos polar

Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC), EQUIPAMIENTO

Recipiente de fase mvil: de vidrio o plstico capacidad de o 2 litros. A la hora de separar se debe elegir, la fase mvil de manera que se

consiga la mejor separacin de los solutos en un tiempo de anlisis adecuado

ofrecer un amplio rango de presiones de trabajo

poder utilizarse con distintos caudales de fase mvil,

originar un flujo de fase mvil libre de fluctuaciones

ser qumicamente inertes, no reaccionar con la fase mvil ni con los

solutos, su interior es de acero inoxidable o de tefln

Volmenes de trabajo pequeos Debe evitar despresurizacin Dos tipos de inyectores ser qumicamente inertes, no reaccionar con la fase mvil ni con los solutos,

su interior es de acero inoxidable o de tefln

Volmenes de trabajo pequeos

Debe evitar despresurizacin Dos tipos de inyectores ser qumicamente inertes, no reaccionar con la fase mvil

ni con los solutos, su interior es de acero inoxidable o de tefln

Son de acero inoxidable Su longitud es entre 10 y 30 cm Su dimetro 4 a 10 mm Tamao de partcula de fase

estacionaria 3.5 a 10 m

Rellenos comunes..

Columna

Caractersticas principales que debe reunir un detector

Todos los detectores producen una seal que se

relaciona con la concentracin de las

especies en disolucin

TIPOS DE DETECTORES

Absorbancia

til para sustancias que absorben radiacin UV-Vis Mas empleado Fotomultiplicador o arreglo de diodos Longitud de onda fija o variable

ndice de refraccin

Mide la diferencia de ndices de refraccin entra la FM y la FM+M Baja sensibilidad Deben estar termostatizados

Conductividad

Para analitos fluorescentes o derivados Se debe elegir exc y emisin Alta sensibilidad

Electroqumico

Fluorescencia

Espectrometra de masas

Principalmente se lo usa en cromatografa de intercambio inico Baja sensibilidad Sensibles a impurezas en la FM


Plana


En Columna

Gases Lquidos

Fluido supercrtico

(segn tipo de fase mvil)


Gases En Columna

FASE MOVIL GAS

Funcin: transportar los componentes de la muestra a travs de la fase estacionaria

Caractersticas: debe ser gas inerte, de alta pureza (99.9995%) Flujo: Su flujo esta directamente relacionado con la separacin

de la muestra, debe ser controlado para lograr una separacin ptima.

Gas portador o carrier : Fase mvil

Que gas elijo?

Sistema de inyeccin

Objetivo: vaporizar a muestra a analizar e incorporarla en la corriente del gas portador que se dirige a la columna.

Requisitos: vaporizacin e inyeccin muestras: la vaporizacin debe ser lo mas rpida posible, se deben vaporizar todos los componentes de la muestra.

Caractersticas: bloque metlico capaz de mantener la T cte y aislamiento trmico, dentro del cual se encuentra el sistema de inyeccin.

Capacidad de autosellado ( en el momento en que se retira la aguja)

Muestra

Mezclas cuyos constituyentes sean voltiles

Temperaturas de ebullicin hasta 300 C Que sean trmicamente estables

Horno

La T debe ser igual o ligeramente mayor al Peb promedio de la muestra

Para muestras con amplio intervalo en ebullicin se usan rampas de T

Debe mantener la T constante en todo su volumen

Estn hechas de acero inoxidable o vidrio Longitud de 1 a 15 metros Dimetro de 2 a 4 mm Mayor capacidad de muestra que las capilares

Columna

Son mas eficientes Longitud hasta 100 metros Diametro de 0.2 a 0.3 mm Requieren menor capacidad de muestra y menos

flujo de carrier

Columnas empacadas

Columnas capilares

Detectores

Caractersticas principales de un detector

Tipos de Detectores

Universales Responden prcticamente a cualquier compuesto

Conductividad trmica Responde a la diferencia de conductividad trmica entre el

carrier puro y el carrier + muestra. El cambio de temperatura se traduce en una variacin de

la seal elctrica. No destructivo.

Tipos de Detectores

Ionizacin de llama (FID) La mayora de los compuestos

orgnicos se pirolizan a la temperatura de la llama y producen iones/electrones que conducen la electricidad a travs de la llama.

Elevada sensibilidad, gran estabilidad y rango lineal elevado.

destructivo

Tipos de Detectores


Tipos de Detectores

Captura electrnica Muy sensible

Altamente selectivo Se usa particularmente para halgenos

y grupos nitro Se basa en la captura de electrones

libres procedentes de la ionizacin del gas portador disminuyendo la intensidad de la corriente

No destructivo

Tipos de Detectores


Tipos de Detectores

FID

Tipos de Detectores Universales

Responden prcticamente a cualquier compuesto

Conductividad trmica

Captura electrnica

Anlisis cromatogrfico

Anlisis Cualitativo

Identificacin individual de especies presentes en la muestra

Determinacin de la identidad de la muestra

Esta basado en la medida de parmetros cromatogrficos

Retencin: uso de datos de retencin de un analito para su identificacin

Tiempo de Retencin tR

es funcin de:

Naturaleza de la fase estacionaria Longitud de la columna Naturaleza y flujo de la fase mvil Temperatura de la columna Tamao de la muestra

En condiciones experimentales CONSTANTES

el tR es caracterstico de cada sustancia, pero OJO no es

universal!!!

Esta tcnica permite no solo separar los componentes de una muestra sino tambin su identificacin y cuantificacin

Anlisis Cuantitativo

Esta basado en la medida de alturas u reas de picos cromatogrficos que se relacionan con la concentracin

Parmetros cromatogrficos

Deben ser comparados con una sustancia patrn

tR :tiempo transcurrido desde la inyeccin de la muestra al mximo del pico

tR: tiempo retencin ajustado: tR = tR - tM

tM: tiempo necesario para que la fase movil atraviese la columna

tR,1

tR,2

tM tR

Anlisis Cuantitativo rea Concentracin

Fase Fija

De particin Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)

Fase reversa

Cmo?

Columna analtica C18 de fase reversa

Fase Mvil

55% de Buffer fosfato 0.25 M, pH 3 45% de metanol

gd

Elegir longitud de onda de trabajo

Detector

UV-VISIBLE Cmo?

IDEM PARA: CIDO BENZOICO Y ASPARTAMO

Cmo?

Inyectar cada estndar e identificar el tR en las condiciones de trabajo

tR,caf tM

IDEM PARA: CIDO BENZOICO Y ASPARTAMO

Cmo?


tR,caf tM

t / min

Inte

nsi

dad

/ u

.a.

Cmo?


ACIDO BENZOICO Y ASPARTAMO

Obtener el porcentaje de cada componente en la bebida cola

, CIDO BENZOICO Y ASPARTAMO

Determinacin de cidos grasos por cromatografa gaseosa

Analizar la influencia de los diversos parmetros instrumentales en la identificacin y separacin de los componentes presentes en una mezcla de steres metlicos.

Seleccionar las condiciones instrumentales ptimas para dicha separacin.

Resolver una mezcla de metil-steres de cidos grasos.

Fase Fija

Cromatografa Gaseosa Cmo?

Columna capilar Supelco SPB-2250 (50 % metil - 50 % fenil siloxano), Longitud: 30 m, dimetro interno: 0,25 mm, espesor de film: 0,20 mm.

Fase Mvil

He, N2 confirmar! Flujo

1.- Inyectar el patrn de steres metlicos de triglicridos de origen marino 2.- Optimizar la resolucin de la muestra variando distintas condiciones instrumentales como la temperatura del horno y el flujo del gas portador.

Discutir los resultados obtenidos. Informar las condiciones experimentales, los tiempos de retencin de cada

componente de la mezcla y Informar la composicin porcentual de cidos grasos en las muestras. Obtener los parmetros que caracterizan la eficiencia de la columna para estos

analitos en las condiciones de trabajo (k, a, N y H).

Procedimiento experimental

Anlisis de los resultados

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