Qu es la cromatografa?
Qu es la cromatografa?
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Fase Fija
Fase Mvil
Consiste en un solido o un liquido fijado a un solido
por donde el cual pasa la fase mvil
Consiste en un liquido o un gas que es arrastrado
a travs de la fase estacionaria
Tipos de cromatografa
Plana
En papel
Papel (FE)
Solvente (FM)
Tapa
Cubeta
Mezcla a resolver
Anlisis cualitativo (NO CUANTITATIVOS!!!)
Fase estacionaria: papel de filtro
Se basa en la diferencia de velocidad con la que se desplazan los componentes de la muestra, lo cual esta dado por el tipo de
interaccin con la fase mvil
(segn la disposicin de la fase estacionaria)
Tipos de cromatografa
Plana
En papel En capa fina
Anlisis cualitativo
Fase estacionaria: placa (papel) recubierta con una capa delgada
de fase estacionaria, generalmente se utiliza slice
Tipos de cromatografa
Plana
En papel En capa fina
En Columna
Gases Lquidos
Fluido supercrtico
(segn tipo de fase mvil)
Utiliza una columna que se llena con un soporte slido adsorbente (gel de slice (SiO2) y almina (Al2O3)) y se hace pasar a travs de ella la fase mvil.
La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna.
Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin.
Tipos de cromatografa
En Columna
DESVENTAJAS columna de vidrio Es un proceso lento Es un proceso poco eficaz tanto por la capacidad de separacin, como por el
nmero de solutos que se pueden separar. Es una tcnica laboriosa No proporciona directamente la composicin de las fracciones Solo se pueden separar muestras del orden de gramos a mgr.
Tipos de cromatografa
Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)
En Columna
VENTAJAS Aumentar la eficacia de la separacin Se reduce el tiempo de separacin Permite acoplar un sistema de deteccin
continuo a la salida de la columna, (on line) Aumenta el orden de deteccin (g)
Tipos de cromatografa
Intercambio inico
Exclusin molecular
De particin
Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)
En Columna
Fase normal Fase reversa
FASE MOVIL LIQUIDO
Tipos de cromatografa
En Columna
Exclusin molecular
Las molculas se separan en solucin segn su peso molecular (tamao).
La fase estacionaria consiste en pequeas perlas que contienen cavidades de tamao exactamente conocido.
Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)
Tipos de cromatografa
En Columna
Intercambio inico
La fase estacionaria tiene grupos cargados que interaccionan electrostticamente con iones de signo contrario que se encuentran en la fase.
permite la separacin de iones y molculas polares
Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)
En Columna
Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)
Tipos de cromatografa
De particin
Fase normal
Fase estacionaria: muy polar Fase mvil: solvente no polar Orden elusin: sale primero el
componente menos polar
Fase mvil
Fase estacionaria
Orden elusin
En Columna
Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)
Tipos de cromatografa
De particin
Fase estacionaria: no polar Fase mvil: solvente polar Orden elusin: sale primero el
componente ms polar
Fase reversa
Fase mvil
Fase estacionaria
Orden elusin
En Columna
Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)
Tipos de cromatografa
De particin
Fase normal
Fase reversa
De particin
Fase estacionaria: no polar Fase mvil: solvente polar Orden elusin: sale primero el
componente ms polar
Fase estacionaria: muy polar Fase mvil: solvente no polar Orden elusin: sale primero el
componente menos polar
Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC), EQUIPAMIENTO
Recipiente de fase mvil: de vidrio o plstico capacidad de o 2 litros. A la hora de separar se debe elegir, la fase mvil de manera que se
consiga la mejor separacin de los solutos en un tiempo de anlisis adecuado
ofrecer un amplio rango de presiones de trabajo
poder utilizarse con distintos caudales de fase mvil,
originar un flujo de fase mvil libre de fluctuaciones
ser qumicamente inertes, no reaccionar con la fase mvil ni con los
solutos, su interior es de acero inoxidable o de tefln
Volmenes de trabajo pequeos Debe evitar despresurizacin Dos tipos de inyectores ser qumicamente inertes, no reaccionar con la fase mvil ni con los solutos,
su interior es de acero inoxidable o de tefln
Volmenes de trabajo pequeos
Debe evitar despresurizacin Dos tipos de inyectores ser qumicamente inertes, no reaccionar con la fase mvil
ni con los solutos, su interior es de acero inoxidable o de tefln
Son de acero inoxidable Su longitud es entre 10 y 30 cm Su dimetro 4 a 10 mm Tamao de partcula de fase
estacionaria 3.5 a 10 m
Rellenos comunes..
Columna
Caractersticas principales que debe reunir un detector
Todos los detectores producen una seal que se
relaciona con la concentracin de las
especies en disolucin
TIPOS DE DETECTORES
Absorbancia
til para sustancias que absorben radiacin UV-Vis Mas empleado Fotomultiplicador o arreglo de diodos Longitud de onda fija o variable
ndice de refraccin
Mide la diferencia de ndices de refraccin entra la FM y la FM+M Baja sensibilidad Deben estar termostatizados
Conductividad
Para analitos fluorescentes o derivados Se debe elegir exc y emisin Alta sensibilidad
Electroqumico
Fluorescencia
Espectrometra de masas
Principalmente se lo usa en cromatografa de intercambio inico Baja sensibilidad Sensibles a impurezas en la FM
Tipos de cromatografa
Plana
En papel En capa fina
En Columna
Gases Lquidos
Fluido supercrtico
(segn tipo de fase mvil)
Tipos de cromatografa
Gases En Columna
FASE MOVIL GAS
Funcin: transportar los componentes de la muestra a travs de la fase estacionaria
Caractersticas: debe ser gas inerte, de alta pureza (99.9995%) Flujo: Su flujo esta directamente relacionado con la separacin
de la muestra, debe ser controlado para lograr una separacin ptima.
Gas portador o carrier : Fase mvil
Que gas elijo?
Sistema de inyeccin
Objetivo: vaporizar a muestra a analizar e incorporarla en la corriente del gas portador que se dirige a la columna.
Requisitos: vaporizacin e inyeccin muestras: la vaporizacin debe ser lo mas rpida posible, se deben vaporizar todos los componentes de la muestra.
Caractersticas: bloque metlico capaz de mantener la T cte y aislamiento trmico, dentro del cual se encuentra el sistema de inyeccin.
Capacidad de autosellado ( en el momento en que se retira la aguja)
Muestra
Mezclas cuyos constituyentes sean voltiles
Temperaturas de ebullicin hasta 300 C Que sean trmicamente estables
Horno
La T debe ser igual o ligeramente mayor al Peb promedio de la muestra
Para muestras con amplio intervalo en ebullicin se usan rampas de T
Debe mantener la T constante en todo su volumen
Estn hechas de acero inoxidable o vidrio Longitud de 1 a 15 metros Dimetro de 2 a 4 mm Mayor capacidad de muestra que las capilares
Columna
Son mas eficientes Longitud hasta 100 metros Diametro de 0.2 a 0.3 mm Requieren menor capacidad de muestra y menos
flujo de carrier
Columnas empacadas
Columnas capilares
Detectores
Caractersticas principales de un detector
Tipos de Detectores
Universales Responden prcticamente a cualquier compuesto
Conductividad trmica Responde a la diferencia de conductividad trmica entre el
carrier puro y el carrier + muestra. El cambio de temperatura se traduce en una variacin de
la seal elctrica. No destructivo.
Tipos de Detectores
Ionizacin de llama (FID) La mayora de los compuestos
orgnicos se pirolizan a la temperatura de la llama y producen iones/electrones que conducen la electricidad a travs de la llama.
Elevada sensibilidad, gran estabilidad y rango lineal elevado.
destructivo
Tipos de Detectores
Universales Responden prcticamente a cualquier compuesto
Tipos de Detectores
Captura electrnica Muy sensible
Altamente selectivo Se usa particularmente para halgenos
y grupos nitro Se basa en la captura de electrones
libres procedentes de la ionizacin del gas portador disminuyendo la intensidad de la corriente
No destructivo
Tipos de Detectores
Universales Responden prcticamente a cualquier compuesto
Tipos de Detectores
FID
Tipos de Detectores Universales
Responden prcticamente a cualquier compuesto
Conductividad trmica
Captura electrnica
Anlisis cromatogrfico
Anlisis Cualitativo
Identificacin individual de especies presentes en la muestra
Determinacin de la identidad de la muestra
Esta basado en la medida de parmetros cromatogrficos
Retencin: uso de datos de retencin de un analito para su identificacin
Tiempo de Retencin tR
es funcin de:
Naturaleza de la fase estacionaria Longitud de la columna Naturaleza y flujo de la fase mvil Temperatura de la columna Tamao de la muestra
En condiciones experimentales CONSTANTES
el tR es caracterstico de cada sustancia, pero OJO no es
universal!!!
Esta tcnica permite no solo separar los componentes de una muestra sino tambin su identificacin y cuantificacin
Anlisis Cuantitativo
Esta basado en la medida de alturas u reas de picos cromatogrficos que se relacionan con la concentracin
Parmetros cromatogrficos
Deben ser comparados con una sustancia patrn
tR :tiempo transcurrido desde la inyeccin de la muestra al mximo del pico
tR: tiempo retencin ajustado: tR = tR - tM
tM: tiempo necesario para que la fase movil atraviese la columna
tR,1
tR,2
tM tR
Anlisis Cuantitativo rea Concentracin
Fase Fija
De particin Cromatografa Liquida de Alta Presin (HPLC)
Fase reversa
Cmo?
Columna analtica C18 de fase reversa
Fase Mvil
55% de Buffer fosfato 0.25 M, pH 3 45% de metanol
gd
Elegir longitud de onda de trabajo
Detector
UV-VISIBLE Cmo?
IDEM PARA: CIDO BENZOICO Y ASPARTAMO
Cmo?
Inyectar cada estndar e identificar el tR en las condiciones de trabajo
tR,caf tM
IDEM PARA: CIDO BENZOICO Y ASPARTAMO
Cmo?
Inyectar cada estndar e identificar el tR en las condiciones de trabajo
tR,caf tM
t / min
Inte
nsi
dad
/ u
.a.
Cmo?
Inyectar cada estndar e identificar el tR en las condiciones de trabajo
ACIDO BENZOICO Y ASPARTAMO
Obtener el porcentaje de cada componente en la bebida cola
, CIDO BENZOICO Y ASPARTAMO
Determinacin de cidos grasos por cromatografa gaseosa
Analizar la influencia de los diversos parmetros instrumentales en la identificacin y separacin de los componentes presentes en una mezcla de steres metlicos.
Seleccionar las condiciones instrumentales ptimas para dicha separacin.
Resolver una mezcla de metil-steres de cidos grasos.
Fase Fija
Cromatografa Gaseosa Cmo?
Columna capilar Supelco SPB-2250 (50 % metil - 50 % fenil siloxano), Longitud: 30 m, dimetro interno: 0,25 mm, espesor de film: 0,20 mm.
Fase Mvil
He, N2 confirmar! Flujo
1.- Inyectar el patrn de steres metlicos de triglicridos de origen marino 2.- Optimizar la resolucin de la muestra variando distintas condiciones instrumentales como la temperatura del horno y el flujo del gas portador.
Discutir los resultados obtenidos. Informar las condiciones experimentales, los tiempos de retencin de cada
componente de la mezcla y Informar la composicin porcentual de cidos grasos en las muestras. Obtener los parmetros que caracterizan la eficiencia de la columna para estos
analitos en las condiciones de trabajo (k, a, N y H).
Procedimiento experimental
Anlisis de los resultados
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