La ausencia de sealizacin de la insulina en el corazn induce cambios en potasio canal de expresin y la repolarizacin ventricular Anglica Lpez-Izquierdo, 1 Renata O. Pereira, 2,3 Adam R. Wende, 2,4 Bonnie B. Punske, 1 E. Dale Abel, 2,3 y Martin Tristani-Firouzi1 1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Instituto de Investigacin y Formacin de la Universidad de Utah, Salt Lake City, Utah; 2Program en Medicina Molecular y de la Divisin de Endocrinologa, Metabolismo y Diabetes de la Universidad de Utah, Salt Lake City, Utah; 3Fraternal Order of Eagles Diabetes Centro de Investigacin y de la Divisin de Endocrinologa y Metabolismo, Roy J. y Lucille A. CarverCollege of Medicine, Universidad de Iowa, Iowa City, Iowa; y 4Molecular y Patologa Celular del Departamento de Patologa de la Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, Alabama Enviado 28 de octubre 2013; aceptados en forma definitiva 24 de diciembre 2013 Lpez-Izquierdo A, Pereira RO, Wende AR, Punske BB, Abel ED, Tristani-Firouzi M. La ausencia de sealizacin de la insulina en los induce al corazn cambios en la expresin del canal de potasio y la repolarizacin ventricular. amJ Physiol Corazn CircPhysiol 306:. H747-H754, 2014 Publicado por primera vez 27 de diciembre 2013; doi: 10.1152/ajpheart.00849.2013.-Diabetes mellitus aumenta el riesgo de disfuncin cardaca, insuficiencia cardaca, y repentina la muerte. La amplia gama de cambios neurohormonales asociadas con diabetes plantean un desafo a la comprensin de los roles de concreto vas que alteran la funcin cardaca. Aqu, nosotros usamos un modelo de ratn con eliminacin de cardiomiocitos con restriccin de receptores de insulina (CIRKO, cardacas-knockout especfico del receptor de insulina) para estudiar los efectos especficos de deterioro de la sealizacin de la insulina en la repolarizacin ventricular cardiaca, independiente de los trastornos metablicos asociados con generalizadas la diabetes. Deterioro de la accin de la insulina caus una reduccin en el ARNm y la expresin de protenas de varios K clave? canales que dominan ventricular repolarizacin. Especficamente, los componentes de transitoria hacia afuera K?actual componente rpido (Ito, rpido; Kv4.2 y KChiP2) se redujeron, coherente con una reduccin en la amplitud de Ito, rpido en aislados izquierda miocitos ventriculares CIRKO, en comparacin con los controles de la misma camada. lareduccin en Ito, dio como resultado rpido en accin ventricular prolongacin del potencial y la prolongacin del intervalo QT en el ECG de superficie. Estos resultados apoyar la idea de que la falta de sealizacin de la insulina en el corazn es suficiente para causar las alteraciones de la repolarizacin descritos en otra modelos animales de diabetes. receptor de la insulina cardiaca; los canales de potasio; la repolarizacin ventricular Miocardiopata diabtica se asocia a disfuncin cardiaca, tales como diastlico alterado y la funcin sistlica, adems a los cambios estructurales y metablicos en el miocardio. Disfuncin cardiovascular asociados a la diabetes puede conducir a insuficiencia cardiaca, independientemente de la enfermedad de la arteria coronaria yhipertensin (3). La diabetes est asociada con un electrocardiograma (ECG) alteraciones que pueden aumentar el riesgo de arritmias. En concreto, la prolongacin del intervalo QT ha sido reportado como consecuencia de un aumento de la accin ventricular potencial (AP) duracin (APD) (6, 7). electrofisiolgicolos estudios han demostrado que una reduccin en K? repolarizacin corrientes es responsable de la prolongacin de APD en los cardiomiocitosaislado de animales diabticos (8, 15, 30). Especficamente, la atenuacin del transitorio cardiaca activar rpidamente e inactivar hacia el exterior de K? actual (Ito) subyace prolongacin APD en tipo I y II modelos diabticos de una variedad de especies, incluyendo perro, conejo, rata y ratn (15, 33, 34). En concordancia con estos hallazgos, los genes y los niveles de protena de la subunidades que forman poros de canal se redujo en los pacientes diabticos corazones (20, 25). Dos componentes Ito con la cintica de recuperacin distintos, denominados a los componentes como rpidos y lentos de Ito (Ito, rpido e Ito, lento, , respectivamente), se han distinguido en la mayora de las clulas cardacas tipos (35). Ambos componentes de Ito se expresan diferencialmente y contribuir a la heterogeneidad regional en las formas de onda de AP (5). En miocitos de ratones, de Ito es altamente expresado y domina el fase de repolarizacin, causando un AP abreviada, un tpico funcin de estas clulas cardiacas (19, 21). Por lo tanto, de Ito tiene un papel destacado en la repolarizacin ventricular cardiaca y cambios en esta corriente pueden afectar significativamente la APD en murinocorazones (13, 21). Ito, canales rpidos son heteromultmeros, compuesto de Kv4.2 y Kv4.3? subunidades. En contraste, Ito, canales lentos estn codificadas por la?-subunidad Kv1.4 (5, 14). El citoplsmicaProtena KChIP2 es un componente esencial de Ito cardaca, rpido en la que co-expresin con subunidades KCHIP modula la biofsica propiedades y aumenta la expresin en la superficie celular de Kv4 canales (26, 37). Otros estudios sugieren que la expresin de Kv4 y protenas KChIP2 estn regulados recprocamente (9, 10). Mientras que diversos modelos animales se han utilizado para caracterizar las consecuencias funcionales de la diabetes en el corazn (3, 28, 36), analizar los efectos especficos de sealizacin de la insulina en el corazn de los efectos sistmicos de confusin de metabolismo alterado (tales como la hiperglucemia y la hiperlipidemia) sigue siendo un desafo. En este trabajo, se utiliz un receptor especfico del corazn de la insulina knockout (CIRKO) modelo de ratn que nos permiti examinar las consecuencias elctricos de sealizacin de la insulina ausente en el corazn en los niveles de los animales moleculares, celulares y enteros. lafenotipo cardaco de los ratones CIRKO se ha descrito previamente e incluye una reduccin en el tamao del corazn y los cambios en la utilizacin de sustratos cardiaca (2, 4, 27). Hay una modesta reduccin de los ndices ecocardiogrficos de la funcin ventricular (2, 4), aunque el gasto cardaco permanece normal (4). La modesta reducciones en la contractilidad cardaca no conducen a la insuficiencia cardaca. MTODOS Generacin Mouse. CIRKO ratones fueron generados por el cruce de ratones que eran homocigotos para un alelo del receptor de insulina en el que floxedsitios loxP flanquean el exn 4 del gen del receptor de la insulina (IRlox / LOX) con IRlox / lox ratones transgnicos con expresin especfica del corazn de la recombinasacre(dirigido por el promotor de la cadena pesada?-miosina). CIRKO ratones tienen la Cre-IRlox/lox genotipo, y sus controles de camadatienenel genotipoIRlox/lox[en lo sucesivo denominados de tipo salvaje (WT) compaeros de camada], como en los estudiosdeAbel ycolegas(1, 2). Anteriormente, No se demostrarondiferencias en latolerancia a la glucosa, la captacin de glucosa, concentracin deinsulina ometablicassustratos,peso corporal/corazn, o rendimiento contrctilentre los ratoneslox/lox(homocigotos loxPratones sinexpresincre)y los ratonesWT (1). Clula de aislamiento. Ventricular izquierda(LV) miocitosse aislaron a partirCIRKO(genotipo Cre-IRlox/lox) los ratones, ysus compaeros de camadaWTde control(genotipoIRlox/lox) (22-25 semanas de edad) por digestinenzimticase handescritoanteriormente en detalle(2, 28). En pocas palabras,despus dela heparinala inyeccin, los ratones se anestesiaroncon hidrato de cloral(1 mg / g decuerpoen peso) por inyeccin intraperitoneal. Se retir elcorazn, rpidamentecanulado, y luegoperfundidosretrgradamenteen unade Langendorffmodificadaaparato a travs dela aortacon la siguiente solucin: (en mM) 126de NaCl; 4,4de KCl; 1MgCl2; 4NaHCO3; 10de HEPES; 302,3-butanodiona monoxima; 5,5glucosa;1.8piruvato; 0.025de CaCl2(pH 7,3); y0,3tipomg/ml de colagenasaIV(WorthingtonBiochemical). siguientecolagenasa tipoIV-solucin que contiene, la pared libredel VI fuedisecadosy se tritursuavementeen la solucinKraftbruhehastacelulardisociacin. Miocitosaisladosse almacenaronen solucinKraftbruhea 4 C hasta su uso. Durantetodo elprotocolo de perfusin, lassolucionesse mantuvieron a37C.Todos los animales procedimientosfueron aprobados porlaComisin de la UniversidadInstitucional Cuidado de Animalesy UsodeUtah.Grabacinde patch-clamp. Voltage-gated K?Se registraroncorrientesentoda laconfiguracin de la celdadela tcnicade patch-clampusandoun amplificadorAxopatch200B(Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Todos los experimentos serealizaron a temperatura ambiente(21-23 C). Potencialesde adquisicin de datosy de mandoerancontroladopor el softwarede ordenador pClamp8.0(Molecular Devices). parchepipetasfueron hechas devidriode borosilicatocapilares(WorldPrecisionInstruments,Sarasota, FL), con una resistencia de2-3M? cuando se llena conla siguiente solucininterna: (en mM) 135KCl, 1MgCl2, 10EGTA, 10HEPES; y5glucosa (pH 7,2). El baosolucincontena (enmM) 136NaCl; 4de KCl; 1de CaCl2, 2MgCl2, 5CoCl2, 10HEPES, y10de glucosa(pH 7,4). Ito, rpido se registren presenciadetetraetilamonio(TEA; 25mM). Para la corriente-experimentosde fijacin, CoCl2seomiten desolucin del bao. Capacitanciacelular se midimediante la integracin delasuperficie deel transitoriocapacitivaevocadosdurante?Pasos de voltajede 10mV. La compensacin porla resistencia en serie(80%) y la capacitanciaeranrealizadopor va electrnica.Para cadapulso de prueba, la amplitud deItose midicomo la diferenciaentre elmximohacia afueraactual y el nivelde corrienteal finaldel pulsodespolarizante. Enlas grabaciones decorriente-clamp, APsmiocitosfueron grabados conelSistema de amplificacinAxoclamp-2A (AxonInstruments)en modopuente.APsfueron desencadenados por2msde pulsocuadrado dedespolarizacinintracelularactuala 1 Hzy se registrandespus de alcanzar elestado estacionario. Datos dePatch-clampse procesaron utilizandoClampfit10.2(MolecularDispositivos)y analizada enOrigen7.5(OriginLab, Northampton, MA). Corrientesamplitudesfueron normalizadospara la capacitanciacelular (en PapF? 1). Las fasesde desintegracin dela idaK?Se midieron lascorrientesmediante el ajuste dela suma dedosfunciones exponencialesusando elsiguiente ecuacin: y?t? ?ExpA1?? T /?1? ?ExpA2?? T /?2? ?Bdnde?es el tiempo,?1y?2 son lasconstantes de tiempo dedecaimiento de lala inactivacin deK?corrientes, A1 y A2sonlas amplitudes delainactivacincomponentes de la corriente, y B esla amplitud de lade estado estacionario, noninactivatingcomponentedel totalhacia el exteriorK?corrientes. laSe determin ladependencia del voltajedela inactivacinen estado estacionario deItopor la normalizacin depicos de corrienteprovocados porlosimpulsos de pruebacomoIto/Ito, mxy se representacomo una funcindeacondicionadoVm. Lasrelaciones eranmontado enuna ecuacin deBoltzmannde la forma:Ito/Itomax? 1/?1? exp? Vm? V1/2? /K?dondeVmes el voltajeacondicionadoy V1/2yk sonlahalfmaximalpotencial deinactivaciny la pendiente dela curva, respectivamente. Western blot yanlisis de PCRcuantitativaen tiempo real. la superficiede la clulapreparaciones de membranase extrajerona partir de tejidoLVdeWT yCorazonesCIRKO. Las muestras de tejidosutilizados enlaspreparaciones de membranase congelaronrpidamenteen nitrgeno lquidodespus de la cosechade rganos.Lostejidosa continuacin,se homogeneizaronutilizando untampn de homogeneizacinque contienesacarosaun cctelinhibidor de la proteasaDetener yfosfatasa(Pierce, Rockford, IL) y se centrifugaron durante20min a4000rpm. Elsobrenadantefue transferido altubo deultracentrfugay se centrifug durante50min a90.000rpm. La fraccin de membranasedimento resultante seseresuspendieronen el ensayo deradioinmunoprecipitacinque contiene unHaltproteasayfosfatasacctel inhibidory se almacen a?80C hasta que seutilizar. El anlisis de transferenciaWestern se realizcomo se describi previamente(31). La concentracin de protenadecada una de lasmuestrassolubilizadaseradeterminada usando el kitde ensayo de protenasMicroBCA (Pierce) conalbmina de suero bovinocomo el estndar. Para el anlisisde transferencia de Western, las clulasprotena de membranaenriquecidase cargy se fraccionen un10% Gel de SDS-poliacrilamida yse electrotransfirieronadifluoruro depolivinilidenomembranas, comandos, yseguido de incubacindurante la noche a4C conuno de lossiguientesanticuerpos primariosmonoclonales. laLos anticuerposutilizados fueron anti-Kv4.2, Kv4.3anti-, anti-Kv1.5, anti-KChIP2 [Universidad de California (UC), Institutos Davis/Nacionales de laSalud(NIH) instalacinNeuroMab], en diluciones de1:200. azul de Coomassie(Bio-Rad, Hercules, CA) se utilizcomo control de carga. Encuadernacin primariaanticuerpo se detectcon una dilucin1:10.000deanticuerpo de cabra anti-ratn Alexa Fluor 680(Invitrogen) y de cabra anti-conejo 800(LI-COR Biosciences,Lincoln, NE). La deteccin se realizmediante la medicin deintensidad defluorescencia deanticuerpos secundariosutilizando elOdysseySistema de imgenesde infrarrojos, y la cuantificacinse hizo consusoftware que lo acompaa(versin3.0,LI-COR Biosciences).estbamosincapaz de detectarcualquier sealen WTLVutilizando dosmonoclonalseparadaanticuerpos contraKv2.1(COOH-terminal y extracelularS1-S2 eptoposde bucle, respectivamente; UCDavis/ NIHinstalacinNeuroMab), a pesar de detectar una sealfuerteen cerebro de ratn(datos no mostrados). asNo hay msexperimentos se realizaronpara medirla protenaKv2.1. Se consiguiel anlisis de PCRcuantitativa en tiemporealpara determinarlaniveles de mRNA expresinrelativade los genesque codificanKv4.2, Kv4.3, KChIP2, Kv1.5, Kv2.1, y el ratnter-a-go-goenLVdeWT yCorazones del ratnCIRKO. ARN fueextrado por medio dereactivoTRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA) y se purificaron usandoelARN totalRNAeasyKit de aislamiento(Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el fabricantede instrucciones. ARN(3 g) se sintetiza cDNA utilizandoSuperndiceIIItranscriptasa inversa(Invitrogen). Cuantitativo en tiemporeal PCRse realiz conABIPrism7900HTReal-TimePCR System(AppliedBiosystems, Foster City, CA) usando placas de384pocillos. SYBRMecolorante fluorescenteverde(Molecular Sondas-Invitrogen) se utiliz paracuantificar losniveles de ARNmrelativos.Todas las reaccionesse realizaron enpor triplicado.Los niveles de transcripcinpara elgen de mantenimientoconstitutivaciclofilinaproducto, tambinse midieroncuantitativamenteen cada muestra. PCR datosse calcularoninicialmente comoel nmero de transcripcionespornmero demolculasde ciclofilina, ylosdatos se normalizarona lavalor medioPESO. Registro de ECGde superficie. Registros de ECGde superficieestndarfueronobtenido a partir de(22 a 25 semanas de edad) los ratones anestesiadosWT yCIRKO. ECGde superficiefueron registradasconelectrodos de platacolocados en elpiel enposicionesoptimizadaspara obtenergrabacionesde amplitudmxima.Los datos fueron registradosy analizados medianteLabChart7Prosoftware(ADInstruments, Colorado Springs,CO) yQT, QTc, QRS, relaciones pblicas, ylos intervalos RRfueron determinados; valores medios dese reportanlos animalesindividuales. El anlisis estadstico. Los resultados sepresentan como medias?SE.en totalexperimentos, n representael nmero declulas. Prueba tde Student oANOVAse aplic para compararconjuntos de datosindividuales.Adosde colavalor de probabilidadde 0,05(P0,05) se consider estadsticamentesignificativo. RESULTADOSVentricularprotenacanales Kvy los nivelesde mRNA fuerondisminuidaen los ratonesCIRKO. Hallazgos previosinformaron quehacia el exteriorde K?corrientesse redujeronsignificativamente enCIRKOlos ratones(28). As,nos hemos centradonuestro anlisis enla expresinlos nivelesdelos genes que codificanelventrculomurinodirectorCanales Kv(Kv4.2, Kv4.3, KChIP2, Kv1.5, Kv2.1) enLVtejido deCIRKOysucamadade controlcorazones(WT) (22-25semanas de edad). Como se muestraen la figura. 1, la expresin de mRNAKv4.2, uno de los componentesdeIto, rpido, se redujo en un? 80% en ratonesCIRKO. Encontraste, el otro componentedeIto, rpido, Kv4.3, se mantuvo sin cambiosen ratonesCIRKO. KChIP2, lasubunidadaccesoriodeIto, rpido, se redujo en un?50%. geneexpresin delassubunidades? formadores de porosdelainactivarlentamenteK? actual (IK, lento),Kv1.5yKv2.1, eran ambosdisminuidopor? 70%. A continuacin se investigel efecto de laespecficacardiacaausentesealizacin de la insulinaenlos niveles de protenasde los canales inicos. Se realizWestern blot deprotena de membranaenriquecidade clulasenLVdeWT yCIRKOcorazones (Fig. 2). canalKv4.2protenase redujo en? 50% en ratonesCIRKO(fig. 2). nose encontrdiferencia enlos nivelesde membranaKv4.3entrePESOy corazonesCIRKO. Los niveles de protenadeKChIP2disminuyeronpor?40% en los corazonesCIRKOcomparacincon el WT. Adems, Kv1.5banda densidadesde membranase redujo en?50% enCorazonesCIRKO. Estos resultadosparalelasla disminucinen el ARNmexpresin. Reducidohacia afueraK?corrientesen ratonesCIRKO. En el ratnmiocitosventriculares, diverso voltaje-gated K? corrientestienensido identificados, que son cinticamentey farmacolgicamentedistinta(35): Ito, rpido, Ito,,IK, de estado estacionariolento ylentohacia el exterioractual (ISS). Ito, rpido e Ito, lento sonresistentes a la exposicinTEA(25 mM), mientras que tanto IK, lento yIssse reducenpor?60%. As,se analiz laactualqueda despus de25mMde TEA(Fig.3). Hacia el exteriorde K?corrientesfueron provocadospordespolarizaciones4-s de pasoentre? 40 y?60mV, desde un?70mVpotencial de mantenimiento. Tantoel picode salida de K?densidades de corriente(Fig.3B) yla corrienteal finaldel pulso(fig. 3C) erandisminuidoen ratonesCIRKO. La densidad de corrientepico a?40mVse redujo significativamente enCIRKO(52? 2), en comparacinconmiocitosWT (16? 3, n?5, *P0,05). Como se informpreviamente(35), lasfasesde desintegracin dela idaK?corrientesevocadodurantepulsosde despolarizacinlargosestn bien descritosporla suma dedos exponenciales. Nuestros datosfueron descritos porelsuma dedos exponencialesen presencia de25mMdeTEA(significa?SE).constantes de tiempode inactivacin(? decaimiento) en PESOmiocitosfueron395? 14 y36? 1ms. Estos valoresde decaimiento?nofueron significativamente diferentes delos miocitosCIRKO: 349? 11y37? 1ms, respectivamente. Anlisisde las fasesde desintegracinestn representadosen la figura. 3D. Enlos prximosexperimentos, se determin si la ausenciade la sealizacin dela insulinacardiacoalterado laspropiedades biofsicasdeIto, rpido. La Figura4compara ladependencia de voltajedeestado estacionariola inactivacindeIto, rpido en miocitosLVaisladode WTy los ratonesCIRKO. Las corrientes seexaminaron usandoun voltajepasosprotocolo?50mVdespus de5sprepulsosacondicionadoparapotencialesentre?100 y?10mV. Las amplitudes deIto, rpido en WTyCIRKOse determinarona partir deun nicoajuste exponenciala las fasesde desintegracin delascorrientes evocadasen?50mV delpotencial decadaprepulsoy luegonormalizada asu respectivaamplitud de la corrientemximaevocadaa partir de?100mV(en la misma celda). NormalizadoIto, amplitudesrpidoserantrazadacomo una funcindepotencialacondicionadocomo se ilustra enHigo. 4B yequipadaconuna nica funcinde Boltzmann. NiV1/2nikse altersignificativamenteen los miocitosCIRKO(V1/2? ?31? 1mV, yK? 3.7? 1mVpara WT; y V1/2? ?34? 2mV, yK? 4.3? 2mV paraCIRKO; n? 8). laanlisis dela recuperacin deIto, rpido de la inactivacinen estado estacionariose muestraen la figura. 5. Las clulas sedespolarizanprimeroa?50mV para5spara inactivarIto,rpido, entonceshiperpolarizadosa?70mV paratiempos que vande 0 a1.300msvariable, y finalmenteescalonadaa?50mV.La amplitud deIto,evocrpidamentea?50mVdespusel perodo de recuperacinsedetermina a partir deun soloexponencialadaptarsea las fasesde desintegracindeltotal dela corriente externaynormalizadaa la amplitud decorriente provocadadespus de la recuperacintiempo(en la misma celda). ElnormalizadoIto, amplitudes rpidastrazadacomo una funcin deltiempo de recuperacinse presentanen la figura. 5B. Los datosde recuperacin deIto, rpido fueronbien descritaspor un soloexponencial conconstantes de tiempo de19? 2ms paraWT y16? 1ms paramiocitosCIRKO(n?5). Nuestros datos muestran queIto,densidad de corrienterpidase redujosignificativamente; Sin embargo, ni el tiempo nilas propiedadesdependientes de voltajedeIto, rpido se vieron afectadosen los miocitosCIRKO. Los estudios previos delos animales diabticoshan demostrado queelinteriormenterectificadorK?actual(IK1) no se ve afectadopor la diabetes(8, 33). Aqu, hemos explorado si la ausencia dela insulinareceptoren el coraznpodra afectarIK1. La Figura6ilustra queIK1densidad de corrienteno se ha modificadosignificativamenteen los miocitosaisladode ratonesCIRKOmice.CIRKOmostrarAPDyprolongacin del intervalo QT. Para determinarlosefectos de los receptoresde insulinaausentescardiacaen elnivel celular, registramos AP enmiocitosaislados debaja tensinWT yCIRKOratones.Como se muestraen la figura. 7A, APS formas de ondase prolongaronen miocitosCIRKO. El anlisis cuantitativodeAPDen50y90% derepolarizacinrevelsignificativaprolongacinenCIRKO(7,3? 0,9y78,3? 7ms, n?10) en comparacinconmiocitosWT (3? 0,2y25,8? 2,2ms, n? 7). Por el contrario,los potenciales de membranaen reposo, APDen10%, de APDa 25%, y APamplitudesse mantuvieron sin cambios(los datos seresumen en la Tabla1). Adems,la carrera ascendentemximala velocidadno fue diferente entreel WTyAPsratonesCIRKO. Por ltimo, se analiz el efecto de laausenciareceptores de insulinacardiacasa nivelde todo el organismomediante la medicin dela actividadde ECGen ratonesanestesiados. Figura8ilustra la comparacinde las grabacionesde ECGde WTyRatonesCIRKO. Los anlisis delosparmetros del ECGconfirmaronunprolongacin significativaenQRS, QT yQTcenRatonesCIRKOrelacin con el controlde camada(n 6;?P0,05). Corregidode tasaTantoysin corregirlos intervalos QTfueron significativamentems largoen los animalesCIRKO. DISCUSINLa diabetes mellitusafecta a ms de8% delacorriente de los EstadosLos Estadosde la poblacin,y la epidemiamundial de obesidadyestilo de vida sedentariose prev queresultar enms de 300 milloneslas personas con diabetesen 2025. Los pacientes condiabetes tienenunriesgo significativo dedesarrollo decardiomiopata, que se caracterizaporhipertrofia cardiaca, disfuncin ventricular, yun aumento del riesgode arritmiasletales. Resistencia a la insulinacardiacaesun factor quecontribuye ala miocardiopata diabtica(17, 18). La amplia gama decambiosneurohormonalesasociadascon diabetespresentan un desafoa la comprensin delas funciones de loscaminos especficosque estn alteradosen esta enfermedadcompleja. Aqu, tomamos ventaja delos ratonesCIRKOestudiar laespecficaefectos de laalteracin dela sealizacin de insulinacardiacoventricularenrepolarizacin, independiente delasalteraciones metablicasgeneralizadasasociada con la diabetes. Reduccin deK?gen del canaly laexpresin de protenas enCIRKOcorazones.Encontramosque la accinde la insulinadeterioradacaus una reduccinen el mensajeyla expresin de protenasdevariosKclave?canalesque dominanla repolarizacinventricular; especficamente, componentesdeIto, rpido (Kv4.2 yKChiP2) yKv1.5fuerondownregulateden los corazonesCIRKO. Al igual que ennuestro estudio deausentessealizacin de la insulinaen el corazn, algunos estudiosenmodelos animales dediabetes tambinrevelauna reduccinen el mensajey protenaslos nivelesdeloscomponentesdeIto, rpido (25). Por el contrario, otroestudios que utilizanun modelo de ratadediabetes de tipo Iinformaron queKv4.2, pero noKv4.3, la expresin de ARNmse downregulated(20). enniveles denuestrotrabajo, ni mensajesKv4.3ode expresin de protenasfueron alteradosen ratonesCIRKO; ms bien,una reduccin deKv4.2yMensajeKChiP2y protenasproporcionan labase molecular de laItoreducida. Un aspecto especfico dela insulinaen la modulacin deK?la expresin del gendel canales apoyado porla observacin de queincubacinde los miocitosaislados decorazonesdiabticosconinsulinarestauradoactualIto(16, 29, 33). Estos hallazgos demuestranelefecto moduladorde la insulina sobreK?gen del canalyexpresin de la protena. Adems, unarelacin mecanicistaentresealizacin de la insulinay K?la expresin del gendel canalviene dela observacin de quela activacindelos receptores de insulinaen un factorneurotrficoinducemRNA yexpresin de la protenadeKv4.2y aumentael transitoriohacia afueraK? actual (IA) densidades enratasneuronas granulares de cerebelo. Por otra parte, la insulinabloqueodel receptor vareducidaneurotrficomediada por el factorinduccin de laIAdensidades de corrienteylos niveles de protenaKv4.2. En este contexto, se especula que la supresindelos cardiomiocitosreceptores de insulinaafectageny de la protenamediada por la insulinaregulacin de laespecficaK?canales. Estudioscoexpressionheterlogosdemostraron queIto, rpido canalesse generanpor la asamblea deKv4.2/Kv4.3yKChIP2subunidades (12). En este trabajo, demostramos que Kv4.2yGenKChIP2y expresin de protenasson downregulatedenCorazonesCIRKO, yestosresultados son consistentes conla reduccindeIto, densidades de corrienterpida. Sin embargo, la alternativa?SubunidadcomponentedeIto, rpido Kv4.3no se ve afectada. Hay una fuerteevidencia de quelos canalesKv4.3no son necesarios parala generacindeItofuncional, canales rpidosenratones (21). Orientados supresindeKv4.2elimina completamenteIto, rpido en el ratnadultoventrculos, mientras que enratones que carecen deKv4.3, lasdensidades de corrientey el tiempoy las propiedadesdependientes de voltajedeIto,fueron rpidossimilar alos ratones WT. Estos resultados indicaban quelas subunidades deKv4.2son fundamentalespara la generacin deventricularIto,canales rpidosen los ventrculosde ratn adulto(11, 21). As, loscambios enKv4.2yKChIP2gen del canaly lasuperficie de la protenade membranaexpresin observadaen nuestro estudioaltersignificativamenteIto,densidad de corrienterpidaen los corazonesCIRKO. Del mismo modo, Kv1.5yMensajesde mRNAKv2.1se ven disminuidos, lo que sugiere IK, lento reduccin de ladensidad de corrienteen ratones con-cardiomiocitosselectivasupresindel receptor de insulina. Hacia el exteriorde K?las corrientesse reducenenCIRKOventrculo. En consonancia conla observacin de ladisminucin de la expresinde la superficie celulardeprotenaKv4.2yKChiP2, se observ una reduccinen Itodensidad de corriente enCIRKOventrculo.El voltajela dependenciay la cinticadeIto, rpido no se vieron afectadospor elausencia desealizacin de la insulinacardaco.La ausencia detensincambiosdependientes/cinticoses consistente conel hallazgo de quedisminuyeronlas protenastantoKv4.2yKChIP2. KChIP2esconocidopara aumentarla densidad de corrienteymodificar elbiofsicopropiedades decanalesKv4, alterando el tiempo-y voltagedependentpropiedades delas corrientes(9). Una reduccinenKChIP2expresin por s sola, suprimeIto, rpido y ralentizala cintica deelcomponente rpidodela inactivacin(23). Sin embargo, se especula que lareduccin combinadaKChIP2yKv4.2preservalapropiedadesdependientes de voltajedeIto, rpido. Nose encontr ningunalas diferencias enladependencia de voltajedela inactivacino la recuperacinde la inactivacindeIto, rpido en ratonesCIRKOen comparacinconCanales deWT.APDsignificativosyprolongacin del intervalo QTen ratonesCIRKO. lareduccin enlas densidades de lascorrientes derepolarizacinenKV4ventrculosratn adultomodificalas formas de onday contribuyeAPa la dispersinanormal derepolarizacin(13, 24). nuestrohallazgos sugierenque, como consecuenciadela reduccin de expresindeIto,componentes rpido, ventricularAPDse prolong enCIRKOMiocitosLV,que a su vez, producenuna prolongacin delintervalo QTintervaloen el ECG desuperficie.Del mismo modo, la prolongacinde APDventricularse inform enotros estudiosde la diabetes (8, 33). QTprolongacines unconocido factor de riesgode muerte cardiaca sbitayprolongacin del intervalo QTcconstituye unpredictor independientefactor defuturosaccidentes cerebrovasculares enpacientescon diabetes tipo2(6). Nuestroestudio pone de relievela contribucin especfica dedeterioroinsulinacardiomiocitossealizacina K?la expresin del gende canalque conduce a laprolongacin del intervalo QT, independiente de lasistmicatrastornos metablicosque acompaan ala diabetes. ademsestudios paradelinear losmecanismos molecularesmediante el cuallos controlesde insulinadel ion dela expresin del gendel canal en lacorazn. Limitaciones.Sealizacin de la insulinajuegaun papel importante enregulandoel tamaocardacopostnatal, la expresin gnica isoformade miosina, yla utilizacin de sustratosen el corazn. Las alteraciones enresultado probableencambios secundariosen la expresindeuna variedad degenes, algunos de los cualespuedeninfluir en la expresino funcinde los canales inicoscardacosparadar lugar alos cambios observados enrepolarizacin. A medida que nuestraatencin selimita acardiacaespecficacanales inicos, no podemos excluir la posibilidadde que las alteracionesen otros genestambin influyen enla repolarizacinen ratonesCIRKO. Por otra parte, se conocela insuficiencia cardacapara inducir cambios enionesla expresin del gendel canalque puede causarla prolongacin delQTintervalo.Mientras que los ratonesCIRKOexhibencambios modestos encardiacola contractilidad(2, 4, 27), queno desarrollaninsuficiencia cardacayPor lo tanto,los cambios observadosen la expresinde canales de ioneseneste estudio nosonprobablemente una consecuenciade la insuficiencia cardiacaen s.Haydiferencias significativas enel repertorio deionesgenes de los canalesque modulanla repolarizacinenel roedoryventrculohumano.Considerando queItodominala repolarizacin ventricularen roedores, el rectificadorretardadoK?corrientesI Kryconocimientos indgenassonlas principales corrientesrepolarizarenel ventrculohumano(19, 22, 23). Mientras que nuestrosresultados indicanque la ausencia dela insulinasealizacinen el coraznmurinoaltera la expresinderepolarizacinprotenas de los canales, no queda claro si los cambiossimilaresque podra ocurrir enlos seres humanos.Varios estudios indicanla importancia delatransmuralgradientedeIto ylas diferencias regionales enla DPAcomoconsecuenciade lascorrientes inicasexistentesen todo elLVlibrepared (25, 32). Centramosnuestra investigacinenlos miocitosaislado deLVcomo la masadel VIcontrola principalmentelaIntervalo QT enel ECG de superficie. Sin embargo, transmuralylas diferencias regionalesen la expresindel canal inicotal vezseandiferencialmentereguladapor la insulinaola falta desealizacin de la insulina. Adems, no tenemospruebas de que laprolongacin del intervalo QTobservadaen ratonesCIRKOtraduce enarritmiasventriculares, ya queno se realizla telemetracontinua.Mientras que nuestroproyecto secentra principalmente enlos efectos de ladeficiencia de insulinacardiacaenla repolarizacin ventricular, tambin observadoprolongacin del QRSen ratonesCIRKO. No hubodiferencia enla velocidad decarrera ascendentemximaentre el controlyratones transgnicos, lo que sugiere queNa? la funcin del canaleraNosensiblemente diferentes. Es posibleque la ausencia dedeficiencia de insulinacardiaca oconsecuencias secundariasde los mismospuedeinfluir en la expresinde los genesconexinapara prolongar laComplejoQRS.Conclusiones. En resumen, laaccin de la insulinacon problemasen elcorazncaus una reduccinen el mensajeyla expresin de protenasdevariosKclave?canalesque dominanla repolarizacinventricular. Kv4.2y el mensajeKChiP2y protenasse redujeron, que conduce auna reduccinenla amplitud deIto, rpido enaisladoLVMiocitosCIRKO. Comoconsecuencia de la reduccinde Ito, rpido, ventricularIntervalosde APDy QTfueron prolongadas. Estos resultadosapoyarel concepto de quela falta desealizacin de la insulinaen elcoraznessuficiente para hacer quelasalteraciones de la repolarizacindescritoen otros modelosanimales de diabetes. SUBVENCIONESEste trabajo fue apoyadopor la FundacinNoraEcclesTreadwellyporla American HeartAssociation (AHA) SubvencionesRO1DK092065yUO1HL087947(a EDAbel,un investigadorestablecidoAHA). A.R.Wendefue apoyadopor la Fundacin deInvestigacin de Diabetes JuvenilAvanzadaPostdoctoralFellowship10-2009-672yNacional del Corazn, los Pulmones y la SangreInstitute (NHLBI) de subvencinK99-HL-111322. R.O.Pereirafue apoyado porAHA(Afiliados occidental)beca postdoctoral delaypor el NHLBIconcederT32-HL-007576. REVELACIONESNo hay conflictos deintersfinanciero o de otra, se declaranpor el autor(s).Hipertensin posmenopusica: papel del sistema nervioso simptico en un modelo animal Rodrigo O. Maran, 1,2 Roberta Lima, 1,2 Mohammed Mathbout, 4 Jussara M. do Carmo, 2 John E. Hall, 2 Richard J. Romano, 1,3 y Jane F. Reckelhoff1, 2 Centro de Investigacin en Salud de 1Women, 2 Departamento de Fisiologa y Biofsica, 3 Departamento de Farmacologa y Toxicologa de la Universidad de Mississippi Medical Center, Jackson, Mississippi; y 4Alfaissal UniversityCollege of Medicine, Riad, Reino de Arabia Saudita Enviado 31 de octubre 2013; aceptados en forma definitiva 18 de diciembre 2013 Maran RO, Lima R, Mathbout M, do Carmo JM, Hall JE, Romano RJ, Reckelhoff JF. Hipertensin posmenopusica: papel de la sistema nervioso simptico en un modelo animal. Am J PhysiolRegulIntegrCompPhysiol 306:. R248-R256, 2014 Publicado por primera vez diciembre 31, 2013; doi: 10.1152/ajpregu.00490.2013.-In posmenopusica las mujeres los mecanismos responsables de la hipertensin no han sido completamente dilucidado, y no existen directrices especficas de gnero para las mujeres a pesar de los estudios que muestran que la presin arterial no es as controlado a la meta en las mujeres como en los hombres. En el presente estudio se evalu la hiptesis de que el sistema nervioso simptico y el renal nervios simpticos contribuyen a la hipertensin en el envejecimiento de las ratas hembras, que la activacin simptica puede ser mediada por la melanocortina 3/4 receptor (MC3/4R), y que la activacin MC3/4R pueden deberse a aumenta en la leptina. ? 1,? -1,2-Adrenrgico bloqueo reducido de sangre presin en tanto jvenes (3-4 meses) y mayores (18-19 meses) hembra espontneamente ratas hipertensas (SHR). Denervacin renal atenu la la hipertensin en las mujeres ms viejas que en las mujeres jvenes. MC3/4R antagonismo con SHU-9119 dado tena intracerebroventricularmente no efecto sobre la presin arterial, ya sea en las mujeres jvenes o viejos, pero significativamente presin sangunea reducida en los hombres de edad. Niveles de leptina en plasma fueron similar en edad, macho y hembra SHR y en viejos contra los jvenes hembras. Estos datos sugieren que la hipertensin en edad femenina SHR es, en parte, debido a la activacin del sistema nervioso simptico, que el renal nervios contribuyen a la hipertensin, y que el mecanismo responsable para la activacin simptica en viejas hembras es independiente de la MC3/4R. envejecimiento; denervacin renal; leptina; melanocortina 3/4 del receptor; las diferencias de sexo ENVEJECIMIENTO EN LOS DOS MUJERES Y HOMBRES se asocia con aumentos en la presin arterial. Sin embargo, el Sistema Nacional de Salud y Nutricin (NHANES 1999-2004) mostr que despus de 50 aos de edad, la prevalencia de la hipertensin es mayor en las mujeres que en los hombres, independientemente de su origen tnico (6). De hecho, cardiovasculares enfermedad es uno de los factores causales ms importantes en un aumento de la mortalidad y la morbilidad en las mujeres, y la hipertensin es un principal factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular (20, 23, 27, 41). Los mecanismos responsables para el aumento en la sangre la presin en las mujeres posmenopusicas que no han sido completamente determinado. Al igual que en muchas mujeres, a medida que envejecen, las mujeres de manera espontnea ratas hipertensas (SHR) muestran aumentos en la presin arterial de tal manera que para el momento en que lleguen a 16-18 meses de edad, su sangre la presin es similar o mayor que en los varones de la misma edad (20, 41). Hemos evaluado varios sistemas que se sabe que contribuir al control de la presin arterial en estas viejas hembras, tales como el sistema renina-angiotensina, el sistema de la endotelina, y eicosanoides tales como vas de 20-HETE (21, 38-40). nosotros encontrado que el bloqueo de estas vas por separado y / o en combinacin reduce la presin arterial en la edad femenina SHR, pero no normalizar la presin arterial (21, 38-40), por lo tanto lo que sugiere sistemas adicionales puede contribuir a la hipertensin. Si bien las causas de la hipertensin en los seres humanos envejecen, no tienen sido completamente dilucidado, la activacin de la nervioso simptico sistema (SNS) ha sido implicado (1, 16). creciente la evidencia sugiere que el SNS acta a travs de la simptica renal nervios, el aumento de la liberacin de renina, la alteracin de la glomerular la tasa de filtracin, y el aumento de la reabsorcin tubular de sodio, y puede haber diferencias de gnero en estos efectos (1, 9, 15, 25). Hemos demostrado anteriormente que la denervacin simptica renal reduce la presin arterial en jvenes de sexo masculino y femenino SHR en el mismo porcentaje (17). As, mientras renal simptico actividad nerviosa contribuye a la hipertensin en hombres y hembra SHR mientras son jvenes, no explica el sexo diferencia en la presin de la sangre que se encuentra en estas ratas. El papel que el sistema nervioso simptico desempea y, en particular, el papel que los nervios simpticos renales pueden desempear en la mediacin la hipertensin en edad femenina SHR no se ha determinado a nuestro conocimiento. Una de las maneras en la que el sistema nervioso simptico puede ser estimulado es a travs de la activacin de pro-opiomelanocortina(POMC), las neuronas y de melanocortina 3/4 receptores (MC3/4R). Esta va se cree que desempean un papel en la mediacin de la obesidad hipertensin con uno de los factores activadores siendo la leptina (10, 12, 14). da Silva y sus colegas (8) mostraron previamente que a pesar de no ser obeso, el bloqueo de la MC3/4R con SHU-9119 en varn joven SHR reduce la presin arterial, lo que sugiere la va MC3/4R es un mecanismo responsable de La activacin del SNS en los hombres jvenes. Ya sea MC3/4Rs juegan un papel en la mediacin de la hipertensin en el envejecimiento femenino SHR no est claro. Los estudios han demostrado que los niveles de leptina aumentan con el envejecimiento en mujeres (7) y son tpicamente ms altos en las mujeres que los hombres (22), ya que la leptina es liberada por el tejido adiposo y las mujeres tienen tejido adiposo ms especialmente con el envejecimiento, incluso cuando no estn sobrepeso. Adems, se encontr que los niveles de leptina a ser asociado con hipertensin en mujeres postmenopusicas en la Estudio del Corazn de la Familia (22). Una vez ms, si los niveles de leptina son mayor en edad, sexo femenino SHR que en los hombres, y si esto podra contribuir a su hipertensin es desconocida. Sobre la base de estos datos y los datos que muestran que simptico activacin desempea un papel en muchas formas de hipertensin esencial primaria en los seres humanos, hemos probado la hiptesis de que 1) la regulacin positiva del SNS de hecho contribuye a la hipertensin en el envejecimiento hembra SHR; 2) los nervios simpticos renales contribuyen a la hipertensin en edad femenina SHR ms que en las mujeres jvenes; y 3) que el mecanismo responsable de la activacin de la SNS en edad, las mujeres est mediada, en parte, a travs de MC3/4R y tal vez se debe a los niveles ms altos de leptina que activan MC3/4R. Materiales y mtodos ratas Hembras reproductoras jubilados se obtuvieron del vendedor (TaconicFarms, Germantown, PA) a 4-9 meses de edad, con edades en el Laboratorio Instalaciones Animal (LAF) en la Universidad de Mississippi Medical Center (UMMC), y se utiliza a 18-20 meses de edad. Masculino SHR eran obtenido del proveedor a 10-12 semanas de edad y se dej envejecer a 18-20 mo en el UMMC LAF. Se obtuvieron femenina joven SHR desde el proveedor a las 10 semanas de edad y se utiliza a 12-16 semanas de edad. Las ratas se mantuvieron con pienso estndar para ratas (Teklad, Harlan SD, Indianapolis, IN) y el agua del grifo en un ambiente con 12 horas de 12-h de luz-oscuridad ciclo mientras que el envejecimiento y a travs de los protocolos. Los protocolos cumplido con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por los Institutos Nacionales de Salud y se han revisado y aprobado por el Comit de Cuidado de Animales institucional y el uso al UMMC. Diseo experimental Protocolo 1. Bloqueo adrenrgico. SHR ratas hembra, 12 aos sem y 18 meses, se dividieron en dos grupos (n 5? por grupo). Transmisores de radiotelemetra (TA11PA-C40; Data Sciences International, St. Paul, MN) se implantaron en la aorta abdominal utilizando anestesia con isoflurano, como hemos descrito previamente (17, 21, 39). Despus de 2 semanas de la recuperacin de la ciruga, la presin arterial media (MAP) fue medido durante 5 das como perodo de lnea de base. Despus de eso, ambos grupos fueron tratados con terazosina (10 mg kg 1 da 1 pb;?? un 1-selectivo del receptor? antagonista) y propranolol (10 mg kg 1 da 1 pb;?? un selectivo Antagonista de? 1,2-receptor) a travs de minibombas osmticas (Alzet) durante 7 das con la medicin MAPA continua. Durante el perodo de tratamiento, todos los ratas bebieron cantidades similares de agua (30-35 ml / da) y se excretan cantidades similares de orina (29,6 -33,5 ml / da), y los pesos corporales eran similar en todo el estudio. ? - Y?-Bloqueo adecuacin se puso a prueba en el da 5 del bloqueo a travs de catteres venosos femorales utilizando fenilefrina (4? g/200? l iv) siguieron 5 minutos ms tarde con isoproterenol (0,7? G/200? L iv). La infusin agonista se program exactamente, y sus efectos tanto en el MAP y la frecuencia cardaca (FC) se registraron 1 min despus de cada bolo y se compara con el MAP y HR inmediatamente antes de la infusin (2, 3, 5, 24, 28). adrenrgicobloqueo tambin fue probado en mujeres jvenes sin tratar como SHR los controles (n? 3). Protocolo 2. Denervacin renal. Macho y hembra SHR, 3 aos de edad o 16 a 18 meses (n? 6/grupo), fueron sometidos a uninefrectoma derecho (UNX) a travs de la incisin dorsal durante la anestesia con isoflurano. Despus de 2 semanas la recuperacin, las ratas se sometieron a la lnea media incisin abdominal bajo anestesia con isoflurano, y denervacin renal izquierda se realiz por pintando los nervios renales izquierda y la arteria renal izquierda con 10% de fenol en solucin de etanol y luego cortar todos los nervios renales visibles, como lo se ha descrito previamente (17). Todos los animales de simulacin tambin recibi dejaron UNX 2 sem antes de, y en el da de la ciruga, se identificaron los nervios renales pero deja en paz. Inmediatamente despus de la denervacin renal, radiotelemetratransmisores (TA11PA-C40, Data Sciences Internacional Transoma) se implantaron en la aorta abdominal por debajo de las arterias renales, como previamente descrito (21, 39). Dos semanas despus de la denervacin renal y la implantacin de telemetra, PAM y FC se medirn de forma continua en todos los animales durante 5 das como previamente descrito (21, 39). Al final del experimento, la los animales fueron anestesiados con isoflurano, y se retiraron los riones y broche de congelados en nitrgeno lquido para la medicin de la noradrenalina contenido por espectroscopa cromatografa / masa de lquido (17, 42), en el Colegio Mdico de Wisconsin, bajo la direccin del Dr. David Mattson. Protocolo 3. Inhibicin de MC3/4R CON SHU-9119. Joven (N? 16) y viejos mujeres (n? 12) SHR, con edades de 12 semanas o 18-20 meses, respectivamente, y los machos viejos, de edad 18 a 20 meses (n 6? por grupo), se implantaron con transmisores de radiotelemetra utilizando anestesia con isoflurano. despusimplantacin del transmisor, una cnula de acero inoxidable (calibre 26, 10 mm de longitud) se implant en el ventrculo cerebral lateral derecho, como se ha descrito previamente (8). La cnula gua estaba anclado en su lugar con dos tornillos de acero inoxidable de la mquina, una tapa de metal y dental acrlico, y un estilete se insert para sellar la cnula para evitar que se se obstruya. Varios das despus de que las ratas se recuperaron de la ciruga, la precisin de la colocacin de la cnula se ensay mediante la medicin de la respuesta dipsogenic (beber inmediata de al menos 5 ml de agua en 10 min) a un intracerebroventricular (icv) de inyeccin de 100 ng de angiotensina II. Despus se midieron 2 semanas de recuperacin, PAM y FC durante un perodo de lnea de base 5-das, y luego una minibomba osmtica (Alzet) se implant por va subcutnea en la regin escapular y conectado a la cnula intracerebroventricular se utilice tubera de polietileno para infusin del antagonista SHU-9119 MC3/4R (1 nmol / h, 0,5? l / h icv) durante 10 das. La dosis de infusin SHU-9119 se basa en nuestra estudios previos que muestran que esta dosis bloquea eficazmente MC3/4R y aumenta la ingesta de alimentos (8). Desde SHU-9119 causa un aumento en la ingesta de alimentos, se midi el peso corporal antes intracerebroventricularla implantacin de la cnula y de nuevo al final del estudio, y la ingesta de alimentos se registr diariamente. Despus del experimento, los animales fueron sacrificados, y los cerebros se extrajeron, se seccionaron, y se tieron con cresilvioleta para confirmar la colocacin de la cnula en el lateral derecha ventrculo. Los niveles de leptina en plasma. Leptina en plasma se midi usando un enzymelinked(ELISA; CrystalChem, Downers Grove, IL) segn las instrucciones del fabricante. Para las mediciones de leptina que comparan hombres y mujeres de edad, se extrajo sangre a la eutanasia en controlar y despus del tratamiento SHU. SHU no tuvo ningn efecto sobre la leptina plasmtica niveles, por lo que los datos se combinaron para el control y ratas tratadas con SHU (N? 12/grupo). Para la comparacin entre las mujeres jvenes y mayores, leptina se midi en sangre tomada de diferentes ratas no tratadas que descrito anteriormente para el estudio SHU (N? 8/grupo). estadsticaLos datos se presentan como medios? SE. La significacin de la diferencia en los valores medios entre y dentro de los grupos se determin usando un ANOVA de dos vas para medidas repetidas y test de Dunn para comparaciones planeadas de antemano utilizando software SigmaPlot. La importancia cambio de absoluta y / o el porcentaje de la presin arterial despus adrenrgicos bloqueo y la denervacin renal en varios valorada entre los grupos fue realizado utilizando una prueba t no pareada utilizando GraphPadPrism. La importancia de diferencias en los niveles de leptina entre los grupos fueron tambin analizados mediante una prueba t no pareada. P? 0,05 fue considerado para ser estadsticamente significativa. RESULTADOS Protocolo 1 Bloqueo adrenrgico. MAP fue significativamente mayor en edad las hembras que en las mujeres jvenes durante el perodo de referencia (Fig. 1A). El bloqueo de?1,? Receptores 1/2-adrenergic redujeron significativamente MAP en las mujeres jvenes y mayores. En hembras de mayor edad MAPA se redujo de 182? 4 a 104? 4 mmHg durante la primera 24 h, pero aument gradualmente a 141? 7 mmHg durante el da 7 de la infusin. En las mujeres jvenes, el MAP tambin disminuy significativamente desde 126? 2-91? 2 mmHg durante las primeras 24 h y aumentado gradualmente de nuevo a 108? 2 mmHg por da 7 de infusin. Ambos grupos incrementaron MAPA volver a los niveles de control por el da 4-5 de la recuperacin. Como se muestra en la figura. 1B, el porcentaje caer en la PAM en el da 8 (tratamiento), en comparacin con el da 4 (lnea de base) fue significativamente mayor en las hembras de edad (? 27? 3%) que las mujeres jvenes (18? 2%, p? 0.04). Adecuacin de bloqueo. Como se muestra en la Tabla 1, el bloqueo era probado como se describe en Materiales y mtodos. Despus de?-Adrenrgicos bloqueo, ni la fenilefrina ni isoproterenol tenan un efecto significativo en el MAP o de recursos humanos en las mujeres mayores y jvenes. Estos datos sugieren bloqueo adecuada con?1,? 1,2-adrenrgico bloqueantes en jvenes y adultos hembra SHR. Protocolo 2 Denervacin renal. Como se muestra en la figura. 2A, MAP fue ms alta en Hembra uninefrectomizadas (UNX) sham SHR que en jvenes fundas UNX femenino. Denervacin renal en las mujeres UNX reducida MAP en ambos grupos, pero tuvo un efecto mayor sobre la edad las hembras que en las mujeres jvenes tanto numricamente (viejas mujeres: ? 30? 1; las mujeres jvenes:? 17? 1 mm de Hg; P? 0,01) y por porcentuales (viejas mujeres: 17,6 0,4%; hembras jvenes??: ? 12.2? 0,4%, P? 0,05). Niveles de norepinefrina renales fueron similar en jvenes y ancianos fundas UNX mujeres y la disminucin de niveles similares con denervacin renal en ambos grupos (Fig. 2B). HR fue similar en jvenes y adultos hembras farsa UNX y fue no afectada por la denervacin renal en ninguno de los grupos (edad femenina UNX farsa: 330? 11 vs viejo UNX renal denervada: 336? 3 latidos / min; y la hembra joven UNX farsa: 343? 7 vs joven UNX denervado: 344? 5 latidos / min; P? NS). Protocolo 3 Melanocortina 3/4 antagonismo del receptor. Como se muestra en la Tabla 2 y. Fig. 3A, el tratamiento-SHU 9119 aument la ingesta de alimentos por 69? 8% de las mujeres jvenes SHR y el peso corporal en un 29? 4%. Jvenes hembras tratados con vehculo tambin mostraron un aumento en peso corporal durante el periodo experimental de 17? 6% (aumento de la ingesta de alimentos de 18? 0,7%). A pesar del efecto en la ingesta de alimentos, un sello distintivo de bloqueo, MC3/4R antagonismo tuvo ningn efecto sobre MAP (Fig. 3B), pero redujo significativamente los recursos humanos en hembra joven SHR en comparacin con los controles del vehculo no tratados (Fig. 3C). En la vieja hembra SHR, el antagonismo MC3/4R crnica con SHU-9119 aument la ingesta de alimentos en un 65? 6% (Fig. 4A) y aumento del peso corporal en un 18? 2% (Fig. 4A, Cuadro 2). desemejanteen las mujeres jvenes, sin embargo, las mujeres de edad tratados con vehculo no lo hicieron tener un aumento en el peso corporal durante el periodo experimental (Tabla 2). Como se ha indicado en la figura. 4A, mapas eran diferentes en algunos da de medicin de lnea de base entre ratas destinadas a obtener SHU-9119 tratamiento y controles destinados a ser tratada, ya que aleatorizado a las ratas a los grupos sin mirar el mapa en la lnea de base. Sin embargo, al igual que en las mujeres jvenes SHR, el tratamiento-SHU 9119 no tuvo efecto sobre MAP en la vieja hembra SHR en comparacin con controles de vehculo (Fig. 4B). HR tampoco se vio afectada por SHU-9119 (Fig. 4C). En el viejo macho SHR, crnica MC3 / 4 antagonismo aument alimentos ingesta en un 58? 9% y el peso corporal en un 23? 3% (Fig. 5A y Tabla 2). Sin embargo, a diferencia de los jvenes y viejos femenino SHR, MC3/4R antagonismo redujo la PAM y la FC en los viejos machos SHR niveles de leptinaComparacin de los niveles de leptina en plasma en hombres y mujeres de edad no mostr diferencias entre los dos grupos [varones (n 12?): 4.18? 1,12; las hembras (n 10?): 3,87? 0,88 ng / ml, P? NS]. Los niveles de leptina en otros grupos de la misma edad joven (n? 7) y las hembras de edad (n? 9) (no incluido en el estudio SHU) fueron Tampoco diferente (joven: 2,21 0,42; edad:?? 2,55 0,42 ng / ml, p NS). DISCUSIN Las principales conclusiones de estos estudios son los siguientes. En primer lugar, el sistema nervioso simptico contribuye a la hipertensin en jvenes y viejos femenino SHR; Sin embargo, la disminucin en la sangre presin con bloqueo adrenrgico es mayor en edad, las mujeres en comparacin con las mujeres jvenes, lo que sugiere una mayor contribucin del sistema nervioso simptico a la hipertensin en la edad las hembras. En segundo lugar, la denervacin renal tambin se reduce la sangre presin en las mujeres jvenes y mayores, y mientras que el depresor respuesta fue ligeramente mayor en las mujeres de edad, lo ms importante, MAPA despus de la denervacin renal se mantuvo por encima de 140 mmHg en la edad, las mujeres, el apoyo a nuestros estudios anteriores que muestran que los mecanismos distintos de los nervios renales tambin contribuyen a la hipertensin en edad femenina SHR. En tercer lugar, el antagonismo MC3/4R presin sangunea reducida en los hombres de edad [como se muestra anteriormente en varones jvenes (5)], pero no tuvo efecto en las mujeres jvenes o viejos, lo que sugiere que, mientras que la activacin simptica juega un importante papel en la mediacin de la hipertensin en las mujeres, los mecanismos responsable de la activacin del SNS es probable independiente de la activacin MC3/4R. Por ltimo, los niveles de leptina no son diferentes en edad SHR macho y hembra, dejando el papel de la leptinaen la mediacin de la activacin de MC3/4R en los hombres de edad en cuestin. El envejecimiento en los seres humanos se asocia con un aumento significativo en la actividad nerviosa simptica muscular (ANSM), con las mujeres que presentan ANSM mayor que los hombres despus de la edad de 60 aos (25, 26, 30). Adems, hay evidencia en mujeres premenopusicasque la actividad del nervio simptico se puede reducir por el estradiol (35, 36). En apoyo de esta hiptesis, Narkiewicz y colegas (25) reportaron que ANSM aument ms con la edad en las mujeres que en los hombres. Tank y sus colegas (33) reportaron que ANSM correlaciona bien con el envejecimiento en los hombres y las mujeres, y pero esa relacin cada vez mayor entre cintura y cadera, la masa corporal y cintura circunferencia correlacionado con el aumento de ANSM en los hombres, pero no en las mujeres. Vianna y colaboradores (34) tambin informaron que el aumento de la PAM despus de ANSM explosin fue atenuada con envejecimiento, pero fue atenuada ms en las mujeres que los hombres. Nuestros estudios actuales apoyan la idea de que el SNS tiene un papel esencial en la mediacin de la hipertensin en el envejecimiento femenino SHR. Hemos demostrado previamente que el sistema renina-angiotensina (39), el sistema de la endotelina (38), y la sntesis de eicosanoides, particularmente 20-HETE (40), tambin contribuyen a la hipertensin en el envejecimiento femenino SHR. De hecho, recientemente hemos demostrado que el bloqueo de todos los tres de estos sistemas todava no permite normalizar la MAPA a 100 mmHg (21). Los resultados del presente estudio sugieren que la activacin del SNS puede explicar fcilmente la elevacin restante de la presin arterial. Anteriormente puso de manifiesto que el SNS renal desempea un papel en la mediacin de la hipertensin en los jvenes de sexo masculino y femenino SHR (17). Adems, puso de manifiesto que la diferencia de sexo en la sangre presin en estas ratas jvenes no podra explicarse sobre la base de la activacin del nervio renal solos ya que la reduccin porcentual de la PAM con denervacin renal fue similar en varones jvenes y hembras (17). En nuestro estudio, la denervacin renal en edad hembra SHR caus una reduccin en la presin arterial que fue mayor (numricamente y por porcentaje) que en joven las hembras. Es importante destacar que, el MAP se mantuvo en 139? 4 mmHg en las viejas mujeres, apoyando a nuestros estudios previos de otros mecanismos no renales SNS contribuyen a su hipertensin. La actividad nerviosa simptica renal disminuye con la edad en los seres humanos, como se muestra por Esler y sus colegas (49), pero se incrementa en presencia de aumento de peso y el sndrome metablico (12, 31), los incidentes ms comunes en las mujeres posmenopusicas. desemejantelas mujeres posmenopusicas, la vieja mujer SHR no ganar peso con el envejecimiento hacindolos atpico en comparacin con la mayora las mujeres posmenopusicas. En los seres humanos, el uso de radiofrecuencia la ablacin del nervio renal ha tenido bastante xito en el tratamiento de la hipertensin resistentes (29, 30). Sin embargo, para nuestro conocimiento, no se han realizado estudios en los que las diferencias de gnero en la eficacia de la ablacin del nervio renal para reducir la presin arterial tiene sido evaluado. En base a los estudios actuales, es posible que la ablacin del nervio renal puede ser ms eficaz en mujeres mayores que en las mujeres ms jvenes. Dicho esto, los estudios preliminares en dos mujeres jvenes con sndrome de ovario poliqustico (SOP) mostr que la ablacin del nervio renal radiofrecuencia atenuada su presin arterial sistlica? 8 mmHg en una y 27 mmHg en la otra mujer (19, 32), pero las mujeres se mantuvieron hipertensiva. Diversos estudios han demostrado que la hipertensin en las mujeres, en particular las mujeres de edad, no est tan bien controlados para teraputica objetivo que en los hombres (11, 18, 27). directrices Farmacoterapia para el tratamiento de la hipertensin es similar en hombres y mujeres ya que no hay evidencia de que ambos sexos responden con similares eficacia (11, 27). El uso de?-Bloqueantes como tratamiento de primera lnea en hipertensin no complicada se ha debatido y ya no se recomienda en personas con riesgo promedio (27). Sin embargo, ?-bloqueantes son considerados como terapia de primera lnea en mujeres con aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular, tal como en mujeres con la enfermedad cardaca coronaria conocida, enfermedad vascular perifrica, o un riesgo de Framingham 10-ao puntuacin superior a 20% (27). Nuestros datos en la vieja hembra SHR apoyaran el concepto que el uso del bloqueo adrenrgico en forma crnica hipertensiva las mujeres posmenopusicas pueden ser tiles en el control de su la presin arterial. En el presente estudio tambin se evalu el papel de la MC3/4R en la mediacin de la hipertensin en mujeres SHR. daSilva y colegas (8) informaron de que el bloqueo de la MC3/4R en varn joven SHR redujeron su presin arterial por? 25 mmHg. Basndose en estos datos, nos sorprendi cuando nos enteramos ninguna respuesta depresor de SHU-9119 en cualquier viejo o joven SHR hembra. Por lo tanto, se determin si la hipertensin en el viejo macho SHR respondera a MC3/4R antagonismo y encontr que SHU-9119 caus? 15 mmHg disminucin de su la presin arterial, similar a los varones jvenes (8). As, el hecho de que el antagonismo MC3/4R no redujo significativamente la sangre presin en hembra SHR sugiere que diferentes mecanismos puede ser responsable de la activacin del SNS en hombres y SHR hembra. Estos mecanismos no son probable que sea debido a leptina, leptina aunque se cree que desempean un papel importante en activacin de proopiomelanocortina (POMC), las neuronas que liberan hormona?-estimulante de los melanocitos (?-MSH), la primaria agonista para el MC3/4R. En nuestro estudio, encontramos que niveles de leptina en plasma no son diferentes en edad, macho y hembra SHR. Sin embargo, es posible que los niveles de leptina en el cerebro puedeser diferente entre hombres y mujeres de edad y por lo tanto todava contribuir a la activacin de la MC3/4R en los hombres y la activacin de SNS. Alternativamente, las diferencias en los esteroides sexuales pueden ser importantes en la regulacin de la expresin de POMC y por lo tanto-? MSH liberacin y la activacin MC3/4R. Por ejemplo, las ratas tratadas con testosterona tener niveles ms altos de expresin de POMC en el ncleo arqueado de el hipotlamo (4), y hay una disminucin relacionada con la edad en Expresin de POMC en ratas macho (13). Ya sea mayor testosterona niveles en SHR macho, machos, especialmente los jvenes, podran explicar la mayor efecto de MC3 / 4 bloqueo a disminuir la presin arterial en comparacin con la hembra SHR est claro. Otro hallazgo interesante de nuestros estudios es que el efecto de Inhibicin MC3/4R en la ingesta de alimentos se disocia de la sangre presin en las mujeres, pero no en los hombres. Estos datos sugieren que quizs en femenino SHR, las reas del cerebro que controlan los alimentos ingesta son diferentes de los que controlan la presin arterial, pero que estas reas pueden solaparse en los hombres. Este hallazgo puede ser una cepa la diferencia ms que una diferencia de sexo, ya que tenemos preliminar datos en nuestro modelo de sndrome de ovario poliqustico en ratas Sprague-Dawley que MC3/4R antagonismo atena el aumento de la presin arterial, pero aumenta la ingesta de alimentos (datos no mostrados). Alternativamente, como se mencion anteriormente, andrgenos pueden upregulate la MC3/4R, y el modelo SOP es hecha dando a los andrgenos ratas (4, 13). Para evaluar el papel de los MC3/4R, vamos a tener que realizar estudios en otro hipertensiva modelos, como Dahl sensibles a la sal ratas o modelos no genticos a evaluar ms a fondo las posibles diferencias de sexo. Con respecto a otros mecanismos potenciales que podran afectar la actividad nerviosa simptica en las mujeres, Xue y colaboradores (37) inform de que la activacin de los receptores de estrgenos (ER)? en el ncleo paraventricular y atena mdula rostroventrolateralla actividad nerviosa simptica y reduce la presin arterial en hipertensin aldosterona en ratas hembras. Por lo tanto, es posible que una reduccin de los estrgenos con el envejecimiento podra contribuir a SNSmediatedhipertensin en las mujeres. Esto no es probable que sea el mecanismo de activacin simptica en nuestras viejas hembras, ya que ovariectoma tiene poco efecto sobre la presin arterial en mujeres SHR, independientemente de si son jvenes o mayores (39). Limitaciones de los Estudios Una limitacin de nuestro estudio es que no hemos medido la expresin o la unin de ligando de los receptores adrenrgicos en nuestra hembra jvenes y ancianos SHR. Por lo tanto, es posible que el la expresin del receptor adrenrgico o disminuye la afinidad de unin con la edad, de tal manera que las viejas hembras no responden tan bien como mujeres jvenes hacen para adrenrgico bloqueo. Adems, se utiliz bloqueo adrenrgico como un indicador de que el Sistema Nacional de Salud, en general, es...