La hemofilia B Leyden y mutaciones cis - reguladores antiguamente misteriosas

La hemofilia B es un clsico, la coagulacin de la sangre es una enfermedad monognica causada por mutaciones en el factor de coagulacinIX ( F9 ) locus . Aunque la interpretacin de mutaciones dentro del gen en s mismo ha sido relativamente sencillo , atribuyendomecanismos moleculares a la suite completa de mutaciones, dentro de la regin del promotor ha demostrado ser un tanto difcil y se ha logrado recientemente. Estas mutaciones, que estn agrupadas en el factor de transcripcin discreto a sitios de unin, dinmicamente cambian la expresin del desarrollo de F9 de diferentes formas. Ellos ilustran cmo mutaciones de un solo nucletido en las regiones cis-regulador puede tener ramificaciones drsticas para el control de la expresin del gen y en algunos casos ser causante de la enfermedad Aqu presentamos el promotor F9 humano como ejemplo de modelo para que la cartografa mutacin saturacin ha puesto de manifiesto los mecanismos de su regulacin. Por otra parte ,sugerimos que el creciente nmero de genomewide estudios de la actividad del factor de transcripcin se acelerar tanto el descubrimiento y la comprensin de regulador polimorfismos y mutaciones .

Polimorfismos de un solo nucletido (SNPs) en reguladorregiones son una fuerza impulsora en la evolucin

Los avances tecnolgicos que facilitan la recopilacin de datos puedetener efectos profundos . La secuenciacin del genoma revel por primera vezque , al contrario de algunas expectativas , el genoma humanono contiene mucho ms genes que otros organismos[ 1,2 ] . Ms recientemente, como las tecnologas de secuenciacin a gran escalahan progresado , los estudios de asociacin de genoma completo ( GWAS )han revelado que una gran proporcin de potencialmente funcionalSNPs no residen en regiones codificantes , pero se encuentran aguas arribao aguas abajo de los genes en lo que puede ser reguladorregiones . En la actualidad se piensa generalmente que las diferencias fenotpicas ,no slo entre especies , sino tambin entre los individuos ,son en gran parte debido a la diferencia de los perfiles de expresin de genesque surgen de cis-regulador mutaciones [3-5] . De hecho , enfactor de ocupacin de los seres humanos , la expresin de genes y transcripcindiferir considerablemente entre los individuos , debido en partede SNPs y las variaciones genticas en las regiones reguladoras[ 6,7 ] . La comprensin de cmo regulador SNPs y mutaciones funcionan y afectan a la expresin de sus genes diana tienepor lo tanto convertido en una prioridad en la biologa.Sorprendentemente, sin embargo, aunque muchos SNPsse han identificado en las regiones reguladoras putativas , que tienemenudo result difcil determinar su mecanismo deaccin o incluso para estar seguro de que son funcionalmente impor -tantes cambios , en lugar de simplemente marcadores que estn vinculadosa an por descubrir mutaciones funcionales [ 8,9 ] . muchosinvestigadores pueden sentirse decepcionados por la aparente lentitudtasa de progreso . En esta revisin se cubre 20 aos deanlisis de variantes de un solo nucletido en la coagulacinpromotor del factor IX ( F9 ) proximal para proporcionar una sorprendenteejemplo de lo difcil que se ha de definir el meca-nismo por el cual tales mutaciones operan . Lo ms importante ,sugerimos que los actuales avances en nuestra comprensin defactores de transcripcin y sus sitios de reconocimiento , en particularderivados de la secuenciacin de inmunoprecipitacin de la cromatina( Chip- Seq ) los estudios , pueden acelerar rpidamenteprogreso.

La hemofilia B Leyden : una enfermedad gentica inusual queresuelve despus de la pubertad

La hemofilia B se vincula X -an, hered trastorno hemorrgicoque resulta de mutaciones en el gen F9 y fue primeroreconocido como una condicin distinta de la hemofilia A( otra enfermedad ligada al cromosoma X ) en la dcada de 1950 [ 10 ] . En 1970, unforma particularmente inusual de la hemofilia B se describeen los Pases Bajos [ 11 ] . Este subtipo de la enfermedad , denominadahemofilia B Leyden, fue notable en el de los afectadosmachos exhiben sntomas en la niez , pero poco a pocomejorado, y, a menudo recuperado clnicamente , despus de la pubertad[ 12 ] . A lo largo de los aos 1980 y 1990 fami - independientementiras de muchos pases tambin fueron identificados con hemo -filia B , que se resolvi despus de la pubertad [ 13-26 ] . Hoy msde 100 casos de hemofilia B Leyden se han reportado[ 27,28 ] .La secuenciacin de la regin de codificacin F9 , los sitios de empalme , yregiones de regulacin aguas arriba de familias con Leydenlikesntomas identificaron mutaciones puntuales en el proximalpromotor [ 15,16,18,20,21,23,25,26,29,30 ] . Ms de 20 diferentesmutaciones puntuales se han identificado , en la agrupacintres regiones : uno alrededor de 20 pb aguas arriba de los principalessitio de inicio de transcripcin (TSS , 1 ); uno a -5 ; y la tercerainmediatamente aguas abajo de la SAT , en torno a 10( Figura 1 ) . Estos sitios fueron reconocidos inmediatamente comoelementos reguladores potenciales . Se plante la hiptesis de quecada grupo de mutaciones interrumpe el sitio de unin para unprotena activadora de la transcripcin y de ese modo la alteracinla expresin del gen F9 , al menos hasta la pubertad .Estas mutaciones son de particular inters en quedemostraron cmo las mutaciones puntuales individuales podranasociarse con profundas alteraciones en el desarrollotiempo mental de la expresin gnica . Cada uno de estos un solomutaciones de nucletidos es suficiente para cambiar de un genque se expresa a lo largo de la vida slo despus de la pubertad( Figura 2 ) .

Mapeando el promotor F9 en vivo a travs de forma naturalocurren , mutaciones de un solo nucletido

La bsqueda de los factores de transcripcin que se unen a los treselementos funcionales reguladores cis en el promotor F9comenz a finales de 1980 en el momento en que el primero de los mamferosse estn identificando factores de transcripcin . F9 esexpresado principalmente en los hepatocitos , y porque el hgadoes grande y relativamente homognea que era un modelo adecuadorgano para los estudios iniciales en la purificacin del factor de transcripcin .Varios grupos tuvieron xito en la identificacin , purificacin ,y en ltima instancia, la clonacin de los ADNc de hgado especficosProtenas de unin al ADN [ 31,32 ] . Fue posible definiraproximar , aunque , secuencias de consenso imperfectas paraestos factores de transcripcin y , en consecuencia , algunos DNAbindingprotenas se identificaron como candidatos que podranregular el gen F9 . La primera candidata ensayada fue laCCAAT protena cremallera de leucina / potenciador de unin protena al(C / EBPA ), que se sabe que se une la TTGNNCAA sitio,una secuencia que es similar a la regin 10 de la F9promotor ( Figura 1 ) .Se encontr que el C / EBPA enlazado a la regin 10 yque las mutaciones asociadas con la expresin del gen F9 reducidaantes de la pubertad interrumpido de unin [ 17 ] . estudios posterioresen ratones knockout C / EBPA , cuando estuvieran disponibles ,confirm que C / EBPA se requiere funcionalmente paralos niveles normales de expresin F9 [ 33 ] .El siguiente factor de transcripcin fue investigado hepatocitosel factor nuclear 4 ( HNF4 ) . El gen se clon en Hnf4la dcada de 1990 [ 32 ] y la protena purificada se muestran aunirse a la regin -20 del promotor F9 y para activarel promotor de reportero ensayos [34,35] . Una vez ms , la conocidamutaciones interrumpidos transactivacin de unin e inhibidopor HNF4 , lo que confirma que se requiere funcionalmente parala expresin gnica .

Polimorfismos de un solo nucletido (SNPs) en regulador regiones son una fuerza impulsora en la evolucin

Los avances tecnolgicos que facilitan la recopilacin de datos puede tener efectos profundos. La secuenciacin del genoma revel por primera vez que, al contrario de algunas expectativas, el genoma humano no contiene mucho ms genes que otros organismos [1,2]. Ms recientemente, como las tecnologas de secuenciacin a gran escala han progresado, los estudios de asociacin de genoma completo (GWAS) han revelado que una gran proporcin de potencialmente funcional SNPs no residen en regiones codificantes, pero se encuentran aguas arriba o aguas abajo de los genes en lo que puede ser regulador regiones. En la actualidad se piensa generalmente que las diferencias fenotpicas, no slo entre especies, sino tambin entre los individuos, son en gran parte debido a la diferencia de los perfiles de expresin de genes que surgen de cis-regulador mutaciones [3-5]. De hecho, en factor de ocupacin de los seres humanos, la expresin de genes y transcripcin diferir considerablemente entre los individuos, debido en parte de SNPs y las variaciones genticas en las regiones reguladoras [6,7]. La comprensin de cmo regulador SNPs y mutaciones funcionan y afectan a la expresin de sus genes diana tiene por lo tanto convertido en una prioridad en la biologa. Sorprendentemente, sin embargo, aunque muchos SNPs se han identificado en las regiones reguladoras putativas, que tiene menudo result difcil determinar su mecanismo de accin o incluso para estar seguro de que son funcionalmente impor- tantes cambios, en lugar de simplemente marcadores que estn vinculados a an por descubrir mutaciones funcionales [8,9]. Muchos investigadores pueden sentirse decepcionados por la aparente lentitud tasa de progreso. En esta revisin se cubre 20 aos de anlisis de variantes de un solo nucletido en la coagulacin promotor del factor IX (F9) proximal para proporcionar una sorprendente ejemplo de lo difcil que se ha de definir el meca- nismo por el cual tales mutaciones operan. Lo ms importante, sugerimos que los actuales avances en nuestra comprensin de factores de transcripcin y sus sitios de reconocimiento, en particular derivados de la secuenciacin de inmunoprecipitacin de la cromatina (chip-Seq) los estudios, pueden acelerar rpidamente progreso.

La hemofilia B Leyden: una enfermedad gentica inusual que resuelve despus de la pubertad

La hemofilia B se vincula X-an, hered trastorno hemorrgico que resulta de mutaciones en el gen F9 y fue primero reconocido como una condicin distinta de la hemofilia A (Otra enfermedad ligada al cromosoma X) en la dcada de 1950 [10]. En 1970, un forma particularmente inusual de la hemofilia B se describe en los Pases Bajos [11]. Este subtipo de la enfermedad, denominada hemofilia B Leyden, fue notable en el de los afectados machos exhiben sntomas en la niez, pero poco a poco mejorado, y, a menudo recuperado clnicamente, despus de la pubertad [12]. A lo largo de los aos 1980 y 1990 fami-independiente mentiras de muchos pases tambin fueron identificados con hemo- filia B, que se resolvi despus de la pubertad [13-26]. Hoy ms de 100 casos de hemofilia B Leyden se han reportado [27,28]. La secuenciacin de la regin de codificacin F9, los sitios de empalme, y regiones de regulacin aguas arriba de familias con Leydenlike sntomas identificaron mutaciones puntuales en el proximal promotor [15,16,18,20,21,23,25,26,29,30]. Ms de 20 diferentes mutaciones puntuales se han identificado, en la agrupacin tres regiones: uno alrededor de 20 pb aguas arriba de los principales sitio de inicio de transcripcin (TSS, 1); uno a -5; y la tercera inmediatamente aguas abajo de la SAT, en torno a 10 (Figura 1). Estos sitios fueron reconocidos inmediatamente como elementos reguladores potenciales. Se plante la hiptesis de que cada grupo de mutaciones interrumpe el sitio de unin para un protena activadora de la transcripcin y de ese modo la alteracin la expresin del gen F9, al menos hasta la pubertad. Estas mutaciones son de particular inters en que demostraron cmo las mutaciones puntuales individuales podran asociarse con profundas alteraciones en el desarrollo tiempo mental de la expresin gnica. Cada uno de estos un solo mutaciones de nucletidos es suficiente para cambiar de un gen que se expresa a lo largo de la vida slo despus de la pubertad (Figura 2).

Mapeando el promotor F9 en vivo a travs de forma natural ocurren, mutaciones de un solo nucletido

La bsqueda de los factores de transcripcin que se unen a los tres elementos funcionales reguladores cis en el promotor F9 comenz a finales de 1980 en el momento en que el primero de los mamferos se estn identificando factores de transcripcin. F9 es expresado principalmente en los hepatocitos, y porque el hgado es grande y relativamente homognea que era un modelo adecuado rgano para los estudios iniciales en la purificacin del factor de transcripcin. Varios grupos tuvieron xito en la identificacin, purificacin, y en ltima instancia, la clonacin de los ADNc de hgado especficos Protenas de unin al ADN [31,32]. Fue posible definir aproximar, aunque, secuencias de consenso imperfectas para estos factores de transcripcin y, en consecuencia, algunos DNAbinding protenas se identificaron como candidatos que podran regular el gen F9. La primera candidata ensayada fue la CCAAT protena cremallera de leucina / potenciador de unin protena al (C / EBPA), que se sabe que se une la TTGNNCAA sitio, una secuencia que es similar a la regin 10 de la F9 promotor (Figura 1). Se encontr que el C / EBPA enlazado a la regin 10 y que las mutaciones asociadas con la expresin del gen F9 reducida antes de la pubertad interrumpido de unin [17]. Estudios posteriores en ratones knockout C / EBPA, cuando estuvieran disponibles, confirm que C / EBPA se requiere funcionalmente para los niveles normales de expresin F9 [33]. El siguiente factor de transcripcin fue investigado hepatocitos el factor nuclear 4 (HNF4). El gen se clon en Hnf4 la dcada de 1990 [32] y la protena purificada se muestran a unirse a la regin -20 del promotor F9 y para activar el promotor de reportero ensayos [34,35]. Una vez ms, la conocida mutaciones interrumpidos transactivacin de unin e inhibido por HNF4, lo que confirma que se requiere funcionalmente para la expresin gnica.

El mecanismo de recuperacin de la hemofilia B despus de pubertad

Por la misma poca, los investigadores comenzaron a investigar la causa del aumento de la expresin de F9 en pacientes Leyden despus de la pubertad. El anlisis sistemtico de la hemofilia B pacientes mediante la secuenciacin del gen F9 identificaron otro nuevo subtipo de la enfermedad, denominada hemofilia B Branden- burg [35]. Los individuos afectados presentaron hemorrgico sntomas durante toda la vida y se exhiben los niveles muy bajos de F9. Se encontr que las regiones normales de codificacin F9 y los sitios de empalme, pero llevado a mutaciones en la posicin -26 en el promotor proximal (Figura 1) [27,28,35-39]. Estos Muta- ciones eran de particular inters en que, a diferencia de todos los dems mutaciones en el promotor F9, que no se asociaron con recuperacin espontnea en la pubertad (Figura 2). Se observ que esta regin del promotor se asemejaba un elemento de respuesta a andrgenos (ARE), el sitio de unin para los el receptor de andrgenos (AR) factor de transcripcin. La AR la protena es una transcripcin zinc dedo de la familia de receptores de esteroides factor que se une a secuencias de ADN conformes a la SON consenso y activa la transcripcin en presencia de testosterona. Se demostr que la AR puede unirse a la regin -26 y que el Brandenburg hemofilia B mutaciones alteran la unin [35]. Por consiguiente, era llegaron a la conclusin de que los pacientes con hemofilia B Brandenburg hicieron No recibir un impulso en la expresin F9 despus de la pubertad, debido a interrupcin de la ARE a -26. Por el contrario, todos los dems pacientes con mutaciones del promotor que la actividad deteriorados (Es decir, en torno a -20, -5, y 10) hizo experimentar un aumento en F9 despus de la pubertad porque sus AREs estaban intactos y sensible a la testosterona. Por ltimo, cabe sealar que el ARE se solapa parcialmente con el elemento de HNF4 a -20 (Figura 1). Como tales, las mutaciones Brandenburg abolir ambos sitios y la inhibicin de la unin de HNF4 y AR juntos se cree que causa una forma de hemofilia que no puede ser resuelto por la testosterona [38]. Adems de las mutaciones -26 Brandenburgo, dos adicionales Se han notificado mutaciones en -23 y -24, y Estos tambin se predicen para interrumpir tanto la AR y HNF4 sitios (Figura 1). Estos pacientes tambin seran no espera para recuperarse despus de la pubertad, pero hasta donde sabemos esto no tiene sido confirmada por anlisis longitudinal [28,40]. La importancia de una intacta SE a -26 es tambin coherente con la observacin de que la administracin de testosterona y los esteroides anablicos es suficiente para elevar F9 expresin en un paciente pre-pubescente de Leyden [13]. Ms Recientemente, un caso ha sido reportado en la cual un individuo con hemofilia B Leyden estaba utilizando esteroides anablicos para la mejora de atltico [41]. Cuando este individuo descontinuado el uso de esteroides a sus niveles F9 declin. En conjunto, estos estudios proporcionan una fuerte evidencia de que los andrgenos estn involucrados en el aumento de F9 observado en la hemofilia Pacientes B Leyden despus de la pubertad. La observacin de que los andrgenos afectar los niveles F9 en Pacientes Leyden plantea la cuestin de si los esteroides sexuales normalmente jugar un papel en la regulacin fisiolgica de F9 expresin. La visin alternativa es que la ARE es normalmente en gran medida no slo se convierte en funcional y significativa cuando el promotor F9 se ve comprometida por la mutacin en los -20, -5, o 10 pginas. Aunque esta cuestin es difcil para resolver observamos que la ARE no se conserva en otros mamferos, por ejemplo en el ratn. Adems, en contraste a los pacientes Leyden, los niveles de F9 en machos normales no lo hacen aumentar dramticamente despus de la pubertad (Figura 2) [42] y son similares a los encontrados en las mujeres [43]. Por lo tanto parece bastante posible que la ARE es normalmente un elemento no funcional que se ha convertido en importante slo en el contexto de la hemofilia B Leyden. Si este es el caso, es una excelente ejemplo de cmo los diferentes patrones de desarrollo y regulacin sensible a hormonas puede evolucionar en diferentes especies, e incluso de personas diferentes en la misma especie, a travs de mutaciones muy sutiles que, bsicamente, desenmascaran consenso sitios que pueden estar presentes por casualidad de unin.

La pieza final del rompecabezas

Dado que el mecanismo por el cual el -20 y 10 punto racimos de mutacin operados, y que la contabilidad defecto para la hemofilia B Brandenburgo se explica todo en la dcada de 1990, se podra haber esperado que la transcripcin factor de unin para el tercer grupo de mutaciones, los ah -5, tambin se encontrara rpidamente. El mpetu para encontrar esta protena fue particularmente fuerte debido a que el -5 cmulo de mutaciones representa alrededor de la mitad de los casos de hemofilia Pacientes B Leyden [27,28]. La regin -5 contiene un Sitios dinucletidos CpG y tales haban observado en el momento ser hotspots mutacionales en el gen F9 y otros loci [44]. Por otra parte, las diversas mutaciones en este sitio se asocian con diferentes niveles de gravedad de la enfermedad [18,19,21,28], y por lo tanto la comprensin de sus mecanismos de accin era de algunos inters. Sin embargo, a pesar de un inters significativo por investigadores, no se hizo ningn progreso durante ms de 20 aos, ilustra lo difcil que puede ser para determinar el mecanismo por el cual regulador SNPs y mutaciones afectan a la la expresin de los genes cercanos. El -5 rompecabezas fue resuelto finalmente por dos grupos simultneamente quien recientemente public sus resultados en conjunto [45]. El progreso en varios frentes prepar el terreno para la avanzar. La clonacin de virtualmente todas las protenas de unin al ADN y el advenimiento de ChIP-Seq eran fundamentales para la avance. Hace veinte aos, no todo el ADN vinculante protenas haban sido identificados, y que por lo tanto no era posible probar todos los factores candidatos. Ahora, ms que 1.500 factores de transcripcin humanos putativos se conocen [46] y anlisis sistemtico, a pesar de ser de trabajo intensivo, es por lo menos posible [47,48]. Los datos de la Seq-chip para la factor de transcripcin ONECUT1 (tambin conocido como hepatocitos factor nuclear 6, HNF6) jug un papel decisivo en lo que sugiere que como un candidato para la unin al elemento de -5 en el F9 promotor [49]. Adems, los datos Chip-a-chip siempre evidencia de que (en el ratn por lo menos) ONECUT1 ocupada el promotor proximal del gen F9 en hepatocitos [50]. Estudios-chip Sec. extensos han demostrado que ONECUT1 se une especficamente a la regin -5 de la F9 promotor en hepatocitos humanos [45] (Figura 1). ONECUT1 funcionalmente activa el promotor de reportero de expe- mentos, y los embriones de ratn knockout deficientes en ONECUT1 han reducido los niveles de F9 [45]. Curiosamente, el factor relacionado ONECUT2 tambin se une el sitio -5 in vitro y estudios sobre Onecut1/Onecut2 doble knockout embriones confirmaron que cuando ambas protenas estn ausentes el locus F9 es prcticamente silencioso [45]. Es importante destacar que las diversas mutaciones se encuentren dentro del -5 Cluster todo perturbar la unin de los factores Onecut in vitro e inhibir la transactivacin en ensayos celulares [45]. Curiosamente, el grado de inhibicin vara, y existe un amplio acuerdo entre la severidad de la hemofilia y el grado en que los interrumpe mutacin de unin. Hay que subrayar, sin embargo, que adicional factores, tales como otros gentica, epigentica, o ambiental efectos, tambin pueden influir en los sntomas - y por lo tanto la clnica gravedad de la hemofilia B no se puede predecir de forma fiable conocimiento puramente a travs de la mutacin.

El gen F9: mapeo de saturacin de un promotor humana

El gen F9 fue uno de los primeros genes humanos aislados y desde entonces ms de 1.000 mutaciones diferentes tienen sido identificados en miles de pacientes en todo el mundo [27,28]. El nmero de mutaciones es tal que es posible que el gen efectivamente ha sido sometido a mutagnesis de saturacin in vivo y la mayora de las mutaciones funcionales tener ahora se ha identificado [40]. El gen F9 codifica una serina proteasa y muchas mutaciones interfieren con la actividad o la estabilidad de esta enzima. Otras mutaciones afectan postraduccional procesamiento, incluyendo la escisin de la pre-y propptidos, o modificaciones tales como g-carboxilacin o b-hidroxilacin. Tambin hay mutaciones que afectan a ARN procesamiento en el nivel de corte y empalme, como en el caso de la "real enfermedad "que afligi a los descendientes de la reina Victoria [51]. Las 21 mutaciones distintas en el promotor proximal muy posiblemente identificar todos los elementos esenciales en la reglamentacin regin. Esto no quiere decir que no hay otros factores de transcripcin unirse y contribuir a la expresin, sino ms bien que si hay son otros sitios en el promotor que no estn obligados a sostener clnicamente niveles pertinentes de F9. Tambin existe la posibilidad de que haya casos de hemofilia B para los que ninguna mutacin se ha identificado an, tal vez lo ms probable en regiones distales que pueden no haber sido objeto de investigacin por secuenciacin de rutina de la regin de codificacin F9 y promotor. Estas mutaciones, si existen, pueden un da ser encontrados a asignar a un promotor esencial o a algn otro gen que es requerida para la expresin o actividad F9. De hecho, una aguas arriba regin reguladora parece ser necesario para sostenida expresin de F9 en ratones transgnicos [52]; Sin embargo, no hay mutaciones humanas asociadas con hemofilia han sido reportados en esta regin.

El reto de la asignacin de funciones a los SNPs de reglamentacin y mutaciones

Histricamente, las mutaciones que causan enfermedades eran frecuentes descrito en las regiones codificantes de los genes en lugar de en cis-regulador regiones [8]. Esto fue en parte debido a que el impacto funcional podra ser mucho ms fcil asignar a tales mutaciones, sino tambin porque la secuencia de promotor y elementos potenciadores era raramente una parte de la rutina pruebas de diagnstico [53]. Por otra parte, las regiones reguladoras de el genoma eran difciles de definir y no siempre puede ser pronosticado por la secuencia de conservacin [54-56]. Hoy en da, sin embargo, mutaciones reguladoras representan una fraccin cada vez mayor de todas las enfermedades que causan variantes (en la actualidad el 1,9% en el Human Gene Mutacin base de datos, agosto de 2013 [9,57]). GWAS y vinculacin anlisis han revelado muchos SNPs que estn vinculados a una serie de trastornos genticos, y es espera que muchos de estos tambin influir en la expresin de genes mediante la interrupcin de sitios de unin de factores de transcripcin [8]. Ser tambin tomar mucho tiempo para identificar el correspondiente factores de transcripcin? En algunos casos se puede. En el caso de la hemofilia B Leyden el trastorno estaba claramente definido, las mutaciones residan en el promotor proximal, que se encontraron repetidamente en pacientes independientes con fenotipos similares, y por lo general alteran los niveles de expresin F9 por lo menos un orden de magnitud, tanto in vivo como in ensayos de transfeccin celular in vitro. Por el contrario, muchos SNPs que estn vinculadas a otros trastornos genticos sern ms difcil. Algunos residen en potenciadores distal o cartuchos del silenciador que estn involucrados en las interacciones de largo alcance y puede no funcionar correctamente en ensayos de reportero - y que por lo tanto ser ms difcil de estudiar. Algunos pueden ser gainof- funcin de las mutaciones que crean nuevo factor de transcripcin sitios que no ordinariamente ser detectados mediante la unin Chip anlisis-Seq de tejido de tipo salvaje, como en [58,59]. Otros tendr efectos sutiles pero clnicamente relevantes que son difcil de evaluar en un contexto de otra gentica, epigentica, y los factores ambientales. Sin embargo, los recientes avances en la definicin tanto de la reglamentacin componentes del genoma humano, as como la ocupacin genmico de factores de transcripcin es probable que acelerar la elucidacin de los mecanismos moleculares por los que SNPs y mutaciones reguladoras operan. En el estudios recientes ENCODE, DNasa-Seq se realiz para una gran variedad de tipos de clulas, destacando las regiones del regulador potencial [60]. Adems, los experimentos de ChIP-Sec se llevaron a cabo durante 119 protenas de unin a ADN, ms la definicin de los de unin al ADN in vivo matrices de preferencia en por estos factores [48]. Otros avances tcnicos recientes incluyen mtodos para determinar con precisin la transcripcin de todo el genoma ocupacin del factor [61], y tcnicas de alto rendimiento para la validacin funcional de elementos reguladores [62] y la determinacin del factor de transcripcin de unin a consensos [47,63]. En conjunto, estos estudios estn informando a nuestra clasificacin de los segmentos reguladores del genoma. En el futuro, los SNPs vinculada a condiciones genticas a travs de GWAS experimentos cada vez ms pueden asignar directamente a las compilaciones de ChIP-Seq y los datos-DNasa Sec para ver si alguno residir en, in vivo conocidos sitios de unin para cualquier estudiado factores de transcripcin en el tejido de inters, como en [64]. Un mejor conocimiento de las matrices para el factor de transcripcin unin in vivo permitir predicciones sobre si el SNP no influir significativamente la afinidad de de unin al factor de transcripcin. El impacto previsto puede fcilmente ser evaluada por ensayos in vitro de unin al ADN en o, siempre que sea posible, los estudios-chip Sec en muestras de pacientes. La mutacin del motivo candidato en vivo ahora pueden ms ser fcilmente logrado con emergente ingeniera genmica tecnologas que utilizan las nucleasas de dedos de zinc artificiales, la transcripcin nucleasas activador de efectores (Talens), y agrupado repeticin palindrmicas cortas intercaladas reglamentario Nucleasas (CRISPR) asociados [65]. Verificacin funcional de la contribucin que el factor de transcripcin hace a la expresin gnica puede ser probado ya sea por RNAi desmontables experimentos en ensayos celulares o por examen de modelos animales knockout, que son cada vez ms disponibles desde los grandes depsitos (como EUCOMM, http:// www.eucomm.org/; KOMP, https://www.komp.org/; y MMRRC, http://www.mmrrc.org/). As, una serie de avances tcnicos significa que es ahora ms fcil para asignar la funcin a regulador SNPs y mutaciones de lo que era en el pasado. Hay, sin duda, mltiple retos que seguirn obstaculizando el progreso. Por ejemplo, Estudios-chip Sec. han demostrado que la transcripcin factores se unen tpicamente a miles de sitios del genoma de ancho, y muchos eventos tal unin se cree que son funcionalmente insignificante [66]. Por otra parte, eucromtica regiones cis-reguladoras son frecuentemente co-ocupados por una multitud de factores de transcripcin [66]. Como tal, exigente protenas funcionalmente relevantes de los que se unen como un mero consecuencia de la accesibilidad de la cromatina puede resultar difcil. Adems, los ensayos de chip-Seq estndar normalmente definen relativamente amplias regiones de ocupacin que pueden contener numerosos supuestos sitios de unin para una transcripcin dada Revise Trends in Genetics 01 2014, vol. 30, N 1 factor de. En tales casos, bona fide sitios de unin especficos podra slo ser identificado por validacin funcional subsiguiente o por tcnicas de alta resolucin como chip-exo [61]. Por ltimo, aunque el nmero de conjuntos de datos ChIP-Seq disponible es de hecho en aumento, sigue siendo una empresa elaborada para investigar la cohorte completa de la transcripcin humana FAC- res a travs de una amplia gama de tipos de clulas que pueden o no recapitular tpica regulacin gnica in vivo. Regulacin gnica seguir siendo un sutil y sofisticado campo, y es inevitable que el mecanismo de accin, y de hecho, la relevancia funcional, de muchos SNPs y mutaciones seguir siendo un misterio durante muchos aos por venir. Sin embargo, los grandes saltos hacia adelante en la tcnica dos ltimas dcadas indican que el progreso importancia ser hecho en la comprensin de cmo los genes de enfermedades y otros loci estn regulados, y proceder ms rpidamente en el futuro.