La reacción de PCR y sus aplicaciones. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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La reacción de PCR y sus aplicaciones
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
nº ciclos
DN
A p
rod
ucto
pri
mers
PCR: cinética
RT
92ºC
55ºC
72ºC 92ºC 92ºC
55ºC 55ºC
72ºC 72ºC
Desnaturalización:
Lo mas corto posible
Evita inactivación
enzima
Anillamiento:Lo mas cerca
posible de las Tm de los primers
Extensión:Lo mas extenso
posible para asegurar
fragmentos completos
PCR: diseñando ciclos
nº ciclos
DN
A p
rod
ucto
pri
mers
En
zym
e a
cti
vit
y
PCR: cinética
DNA polimerasas termoestables
• Procesividad: 5’-3’ actividad de síntesis• Fidelidad: 3’-5’ exonucleasa• Adición de As
5’ 3’3’ 5’
5’ 3’3’ 5’
Tiempo de extensión:Taq polimerasa: 2 Kb/minPfu polimerasa: 0.5 Kb/ minPwo polimerasa: 1 Kb/min
Procesividad
5’ 3’3’ 5’
5’ 3’3’ 5’
5’ 3’3’ 5’
Polimerasa 3’-5’ exo Tasa de error % productos con mutación
Taq polimerasa NO 8.0x10-6 16.0
Pfu polimerasa SI 1.3x10-6 2.6
Pwo polimerasa SI 0.4x10-6 0.7
Fidelidad en la PCR
-A3’
5’3’A- 5’
Adición de As:Taq polimerasa: SIPfu polimerasa: NOPwo polimerasa: NO
-A3’
-T3’ 3’T- -T A
AT
Adición de As
Optimización de PCR• Parametros del ciclo
– Minimo numero de ciclos– Las tres reglas
• Diseño de oligos– Tm’s 55-80ºC– No concentrar GC en el extremo 3’
• Concentración de Mg2+ (0.5-3 mM)– Demasiado da inespecificidad– Poco da poca producción
• Coadyuvantes– BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no
especificos– Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (moldes
ricos en GC)– DMSO: Ayuda la elongación en moldes ricos en GC
• Mezcla de polimerasas• Hot start
• Obtener genes– PCR degenerada– PCR reversa
• Modificar genes– Introducir sitios de restricción– Mutagénesis dirigida– Mutagénesis al azar
Algunas aplicaciones
ADRGT YKILP
5’ACNGCYTGNTGRCGN3’ 5’NTTNCAYGARTCYTT3’
PCR degenerada
• PCR en condiciones poco estrictas– Temperatura– Mg++
– Concentracion de oligos• Diseño de los primers:
– Tamaño minimo (21 mer)– Evitar aminoacidos con mas de un tipo
de codon– No mas de tres G o C seguidas en los
ultimos tres nucleotidos• PCR con primers en solitario
PCR reversa
Touch-down PCR
Nested touch-down PCR
PCR reversa
X bp Y bp
X bp Y bp
Fragmento A: Z pb
Fragmento B: Z -(X+Y)pb
Nested PCR
Touch-down PCR
94ºC
60-65ºC
RE1
RE2
RE1RE2 RE1 RE2
RE1 RE2
Introduciendo sitios de restricción
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
• PCR en condiciones de baja fidelidad
– Desbalance de nucleotidos– Mn ++ en vez de Mg++
– Polimerasas mutantes
Mutagénesis al azar localizada
RE1
RE2MUT1
MUT2
RE1 RE2
RE1+MUT1 RE2+MUT2
RE2RE1
Mutagénesis sitio-específica