PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real es una variante de la PCR donde que se emplea para la cuantificación de muestras de

ADN

En esta técnica se usan sondas que son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del

fragmento de ADN que se quiere amplificar.

Que es PCR La PCR (polimerase chain reaction) es una técnica con la que se pueden producir varias copias de un fragmento de ADN especifico millones de estas incluso en la presencia de otras células,los únicos requerimientos es que este la materia prima para fabricar el ADN y una pequeña cadena de ADN que se pueda unir a la cadena que vamos a copiar la cual se llama primer o cebadora.

Es una técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Aplicaciones Cuantificación viral

Control de eficacia de fármacos

Detección de patógenos

Diagnostico de tumores

Cuantificación de expresión génica

Instrumentación

Termociclador

Lector de fluorescencia

Recolector de datos

Reactivos necesarios 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

2 cebadores o primers que delimitan la zona de ADN a amplificar

ADN molde donde se contiene la región de ADN que se va a amplificar

1 iones monovalente

1 iones divalentes

Sistemas de detección usados en pcr en tiempo real

Sist. de Detección

Colorantes de unión al ADN

Oligonucleótidos específicos

Sondas fluorescentes

Primers fluorescentes

Las tecnologías fluorecentes usadas incluyen

Colorantes de unión al ADN

Sondas que fluorecen luego de su hidrolisis (sondas taqman)

Sondas de hibridación

SYBER Green Con sucesivos ciclos se va acumulando el producto de la reacción ,en el cual se intercala el colorante aumentando la fluorescencia emitida en cada ciclo

Ventajas • el mismo colorante puede usarse

en diferentes blancos de amplificación

• Relativamente económico• Fácil optimización de las

condiciones de reacción

Desventajas • La presencia de de dímeros de

primers y de amplificaciones inespecíficas generan falsos positivos

• Es necesaria una curva de disociación

• No permite realizar PCR multiplex

Curvas de disociación

PCR en tiempo real: Detección mediante sondas de hibridación

El método utiliza dos primers (F y R) y dos sondas marcadas con fluorocromos, las cuales hibridan adyacentemente

Ventajas y desventajas Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas.

PCR en tiempo real: detección mediante sondas de hidrolisis

Se lleva a cabo mediante la hibridación con una sonda complementaria a una región interna de la secuencia blanco, previamente a la amplificación. Tm sonda debe ser 10ºC > que el de los cebadores, de modo que hibride antes que los mismos.

Ventajas y desventajas

ventajas• Incremento en la especificad de la

reacción• Permite la realización de PCR

multiplex• Permite realizar discriminación

alélica mediante uso de sondas ASO

desventajas

• Debe diseñarse una sonda diferente para cada blanco a estudiar

• Relativamente mas costosa

Sondas beacon Estas son similares a las sondas de hidrolisis, tienen una molécula donadora en el extremo 5’ y una aceptora en el extremo 3’ pero, además, presentan una estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unión específica con el ADN diana.

Tipos de cuantificación Tipos de cuantificación

Absoluta: Necesita del uso de patrones, que deben ser incluidos en cada PCR realizada.

Relativa: Da idea de los cambios generados en el nivel de un gen de interés, en comparación con un gen control que

no varía con el tratamiento realizado.