Reacción en cadena de la polimerasa (pcr
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[PCR] PCR DEFINICION DEFINICIO N CONT REQUISITO S DE PCR ADN MOLD E PRIMERS TAQ POLIMERAS A MG d N T P s s o l u c i o n b u f f e r t e r m o c i c l a d o r p a s o s d e p c r d e s n a t u r a l i z a c i o n h i b r i d a c i o n e l o n g a c i o n a m p l i f i c a c i o n a n a l i s i s d e m u e s t r a t i p o s d e p c r a p l i c a c i o n e s v e n t a j a s d e s v e n t a j a s r e f e r e n c i a s
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[PCR]
PCR
DEFINICION
DEFINICION CONT
REQUISITOS DE PCRADN
MOLDE
PRIMERS
TAQ POLIMERASA
MG
dNTPs
solucion buffer
termociclador
pasos de pcr
desnaturalizacion
hibridacion
elongacion
amplificacion
analisis de muestra
tipos de pcr
aplicaciones
ventajas
desventajas
referencias
Reacción en cadena de la Polimerasa
(PCR)
Biología MolecularBioq. Jans Velarde Negrete
DEFINICIÓN Es una técnica desarrollada por el biólogo Kary Mullis, diseñada para amplificar de forma directa una región específica de DNA o indirecta de un ARN a través de su ADN complementario. Al producto final obtenido de la amplificación se lo denomina Amplicón.
Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.
La PCR es una reacción en cadena porque el número de cadenas nuevas de DNA se dobla a cada ciclo, y las nuevas cadenas, junto con las viejas, sirven de molde para el siguiente ciclo.
DEFINICIÓN
REQUISITOS PARA PCR
DNA molde. Primers o cebadores. Enzima DNA polimerasa. Mg ++ Agua libre de nucleasas. Solución buffer. dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP) Termociclador.
ADN molde
El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble, circular o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa.
El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.
No necesariamente puro, pero libre de altas concentraciones de EDTA o cationes que pueden actuar como quelantes.
La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la muestra de partida. Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reacción de PCR.
Primers o cebadores. Longitud de la región complementaria al ADN molde de entre 18-25pb.
Deben ser específicos.
No deben presentar auto-complementariedad.
No deben ser complementarios entre ellos.
El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%.
5´5´
3´3´
Primer forward (fw) o sense (se) Primer reverse (rev) o antisense (as)
Enzima DNA polimerasa. Taq ADN polimerasa es aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas
termales).
Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena que sirve de molde.
Necesitan la presencia de Mg para funcionar.
Mg++ Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas
La concentración de MgCl influye directamente en la actividad de la polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:
Muy poco – la polimerasa no funciona correctamente, afectando el rendimiento de la reacción
Mucho – favorece el annealing de los primers a lugares que no son 100 % complementarios, afectando la especificidad y el rendimiento de la reacción
dNTPs Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que varían entre 200 – 250 μM de c/u.
No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén formando complejos con los dNTPs y no disponibles como cofactores para la enzima. Se afecta el rendimiento de la reacción y la fidelidad del producto final
Solución buffer
El buffer es en general Tris base ajustado a un pH específico con HCl.
pH 8.3 es el óptimo para Taq.
El pH óptimo mantiene la enzima plegada en una conformación a la cual es enzimáticamente activa.
Termociclador Un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las
muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
Pasos de una PCR
Desnaturalización.
Hibridación.
Elongación.
PASO 1: Desnaturalización
Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.
Paso 2: Hibridación
Los “primers”, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases.
Paso 3: Elongación
Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, y coloca nucleótidos de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde
Amplificación exponencial
Análisis de la Muestra La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante
electroforesis.
Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.
La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV).
Ladder: pesos conocidos1: Fragmento a 1857 pb2 y 4: Fragmento a 800 pb3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)
Tipos de PCR
PCR-semicuantitativa
PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo real)
RT-PCR
PCR-multiplex.
PCR-anidada.
PCR-aleloespecífica.
PCR-mutagénesis dirigida
Aplicaciones Rastreo de mutaciones.
Diagnóstico de enfermedades.
Detección de organismos infecciosos.
Medicina forense y determinación de paternidad.
Cuantificación de mRNA y DNA (PCR en Tiempo Real)
Polimorfismo de secuencia.
Ventajas La PCR es rápida, y puede realizarse en unas pocas horas, en vez de
días, en comparación con la clonación basada en células.
El diseño de los primers para la PCR se hace automáticamente con un programa de ordenado, y la síntesis comercial de oligonucleótidos también es rápida y económica.
Es muy sensible y, amplifica secuencias específicas de DNA a partir de pequeñas muestras de DNA prácticamente indetectables.
También se pueden usar muestras de DNA que están parcialmente degradadas, que se encuentran mezcladas con otros materiales, o que están incluida en un medio (como el ámbar), lo que sería díficil o imposible con las técnicas de clonación convencional.
Desventajas Se debe disponer de alguna información sobre la secuencia de
nucleótidos del DNA diana, y cualquier contaminación de la muestra con DNA de otras fuentes, por pequeña que sea, puede causar problemas.
Por ejemplo, células desprendidas de la piel del investigador pueden contaminar las muestras recogidas del escenario de un crimen o tomadas de un fósil, lo que dificulta la obtención de resultados precisos.
Las PCR siempre deben realizarse con controles adecuados cuidadosamente diseñados.
Referencias http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml
http://www.slideshare.net/rild27/reaccin-en-cadena-de-la-polimerasa
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/PCR.pdf
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf
http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n6.pdf
