laboratorio artesanal
46
UNIVERSIDAD EARTH ESTUDIO TÉCNICO PARA LA PLANIFICACIÓN Y EL DISEÑO DE UN LABORATORIO ARTESANAL PARA LA PRODUCCIÓN DE ORQUÍDEAS IN VITRO María Mercedes Mendieta Teller Trabajo de Graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniera Agrónoma con el grado de Licenciatura Guácimo, Costa Rica Diciembre, 2002
-
Upload
camilo-garcia -
Category
Documents
-
view
14 -
download
0
Transcript of laboratorio artesanal
UNIVERSIDAD EARTH
ESTUDIO TÉCNICO PARA LA PLANIFICACIÓN Y EL DISEÑO DE UN LABORATORIO ARTESANAL PARA LA PRODUCCIÓN DE ORQUÍDEAS IN
VITRO
María Mercedes Mendieta Teller
Trabajo de Graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniera Agrónoma con el grado de Licenciatura
Guácimo, Costa Rica
Diciembre, 2002
Trabajo de Graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniera Agrónoma con el grado de Licenciatura
Profesor Asesor Humberto Leblanc, M. Sc.
Profesor Coasesor Héctor Medrano, Ph. D.
Decano Daniel Sherrard, Ph. D.
Candidata María Mercedes Mendieta Teller
Diciembre, 2002
ii
DEDICATORIA
A mi abuelo Jorge por haber formado una familia tan unida y enseñarnos
con el ejemplo que el que persevera alcanza.
A la familia Teller por ser ejemplo de esfuerzo, perseverancia y amor.
A la familia Mendieta por ser ejemplo de sencillez, cariño e inculcarme el
amor por la naturaleza.
A mi patria Nicaragua por quién quiero trabajar hasta verla libre.
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco a los profesores Humberto Leblanc y Héctor Medrano por su
colaboración invaluable en este trabajo.
A NORAD por ser los impulsores de mis estudios en EARTH.
A las personas entrevistadas durante el proceso de obtención de datos para
la elaboración de este trabajo.
A mis amigos.
iv
RESUMEN
Las orquídeas, son una de las especies más admiradas y apreciadas por la
majestuosa belleza de sus flores. Actualmente la producción y venta de las
orquídeas es una de las actividades más lucrativas dentro del mercado de plantas
ornamentales tanto en el ámbito nacional como internacional. Esta situación las ha
colocado en peligro de extinción debido a que son extraídas de su hábitat natural
de una manera descontrolada.
Una de las formas más eficaces para la reproducción de orquídeas y evitar
la extracción indiscriminada de esta especie es la micropropagación.
Lamentablemente, esta técnica no está al alcance del pequeño y mediano
empresario. Es por esta razón que surge la idea de realizar un estudio técnico
para la planificación y diseño de un laboratorio artesanal de orquídeas in vitro que
este al alcance del pequeño y mediano empresario.
Este estudio tiene por objetivo determinar el equipo y materiales
alternativos mínimos, necesarios para un laboratorio artesanal de
micropropagación de orquídeas; adaptando la tecnología convencional a las
condiciones artesanales de un pequeño o mediano empresario.
El estudio demostró que existen costos de un laboratorio convencional que
no podrán ser sustituidos en un laboratorio artesanal. Sin embargo, la mayor
reducción de gastos se obtuvo al momento de sustituir un auto clave por una olla
de presión, la cámara de flujo laminar por una construida artesanalmente bajo los
principios de aislamiento y por sustituir el sistema de destilación de agua por agua
hervida.
Palabras claves: laboratorio artesanal, cultivo in vitro, reducción de costos.
MENDIETA, M. 2002. Estudio técnico para la planificación y diseño de un laboratorio artesanal para la producción de orquídeas in vitro. Universidad EARTH. Guácimo, Costa Rica. 42 p
v
ABSTRACT
Orchids are one of the most admired species because of their beauty.
Presently, the orchid industry is one of the most lucrative among the ornamentals
market, both nationally and internationally. However, these species are becoming
endangered because of irresponsible extraction form their habitats.
There are several techniques for mass reproduction of orchids without
endangering their existence. One of the most effective ways is through tissue
culture propagation. However, this technique is very expensive, making it less
attractive and for small and medium scale entrepreneurs. The main goal of this
project was to design a small-scale laboratory for orchid tissue culture.
The study primarily focused on identifying the most essential equipment
needed to operate a small-scale laboratory to reproduce orchids, adapting
conventional technology to the conditions of a small or medium scale entrepreneur.
The study showed that there are some costs from a conventional laboratory
that cannot be replaced in a small-scale laboratory. Nevertheless, substituting a
pressure cooker for the autoclave, a small-scale chamber for the laminar flow
chamber, and substituting boiling water for the water distillation system could result
in a significant cost reduction.
Key words: Artesian laboratory, tissue culture propagation, cost reduction.
MENDIETA, M. 2002. Estudio técnico para la planificación y diseño de un laboratorio artesanal para la producción de orquídeas in vitro. Universidad EARTH. Guácimo, Costa Rica. 42 p
vi
TABLA DE CONTENIDO
Página DEDICATORIA ................................................................................................. III AGRADECIMIENTO ........................................................................................ IV RESUMEN........................................................................................................ V ABSTRACT...................................................................................................... VI TABLA DE CONTENIDO ................................................................................ VII LISTA DE CUADROS ...................................................................................... IX LISTA DE FIGURAS ......................................................................................... X LISTA DE ANEXOS......................................................................................... XI
1. INTRODUCCIÓN...............................................................................................1
2. OBJETIVOS ......................................................................................................3
2.1. GENERAL .................................................................................................3 2.2. ESPECÍFICOS ..........................................................................................3
3. REVISIÓN DE LITERATURA............................................................................4
3.1. BIOLOGÍA DE LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS.......4 3.2. FUNDAMENTOS DE LA GERMINACIÓN DE ORQUÍDEAS IN VITRO ....4 3.3. INFRAESTRUCTURA DE UN LABORATORIO CONVENCIONAL DE
CULTIVO DE TEJIDOS.............................................................................5 3.4. MEDIDAS DE ASEPSIA EN UN LABORATORIO .....................................6 3.5. MEDIOS DE CULTIVO PARA ORQUÍDEAS.............................................9 3.6. MICROPROPAGACIÓN DE ORQUÍDEAS..............................................10
3.6.1. Cultivo de meristemos ...............................................................10 3.6.2. Cultivo de semillas.....................................................................11
4. MATERIALES Y METODOS...........................................................................13
5. RESULTADOS................................................................................................16
5.1. DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO ..........................................................16 5.2. LOCALIZACIÓN, TAMAÑO Y DESCRIPCIÓN DEL LABORATORIO
ARTESANAL ...........................................................................................16 5.3. PRINCIPIOS TÉCNICOS DE TRABAJO IN VITRO DENTRO DEL
PROCESO PRODUCTIVO......................................................................18 5.4. TIEMPO Y MOVIMIENTO DEL PRODUCTO ..........................................20 5.5. PERSONAL .............................................................................................22
vii
5.6. TECNOLOGIA ARTESANAL...................................................................22 5.6.1. Tecnología artesanal para la cámara de flujo laminar ...............25 5.6.2. Tecnología artesanal para la esterilización ...............................25 5.6.3. Tecnología artesanal para los recipientes .................................26 5.6.4. Tecnología artesanal para la incubación ...................................26
6. CONCLUSIONES............................................................................................27
7. RECOMENDACIONES ...................................................................................29
8. LITERATURA CITADA ...................................................................................30
9. ANEXOS .........................................................................................................32
viii
LISTA DE CUADROS
Página CUADRO 1. COMPOSICIÓN DE UN MEDIO PARA EL CULTIVO IN VITRO DE ORQUÍDEAS ............... 9 CUADRO 2. COSTOS DEL EQUIPO PARA UN LABORATORIO ARTESANAL.................................. 23 CUADRO 3. COSTOS DEL EQUIPO PARA UN LABORATORIO CONVENCIONAL ........................... 24
ix
LISTA DE FIGURAS
Página FIGURA 1. FLUJOGRAMA DE LOS PROCESOS DENTRO DEL LABORATORIO............................... 21
x
LISTA DE ANEXOS
Página ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE Y SKOOG. MEDIO DE
CULTIVO DE KNUDSON. ............................................................................. 33 ANEXO 2. SUPLEMENTOS NO DEFINIDOS QUE SE PUEDEN AGREGAR
A LOS MEDIOS PARA EL CULTIVO DE ORQUÍDEAS ............................ 34 ANEXO 3. CAMARA DE FLUJO LAMINAR ARTESANAL.......................................... 35
xi
1. INTRODUCCIÓN
Las orquídeas han sido una de las plantas más admiradas y apreciadas
desde hace muchos siglos por diferentes civilizaciones, debido a la belleza y
vistosidad de sus flores. Actualmente se conocen más de 20, 000 especies,
repartidas en el mundo. La flora Latinoamericana cuenta con una gran variedad de
orquídeas, distribuidas en las costas, las sierras y las selvas, encontrándose en
mayor densidad en las zonas selváticas (Quiñónez, 2000).
En la actualidad, la deforestación de nuestra selva y la extracción
indiscriminada de estas plantas de tan majestuosas flores, debido al buen precio
que se obtiene de la venta de estas en los mercados nacionales como en el
extranjero, vienen ocasionando que una gran cantidad de orquídeas nativas se
encuentren hoy en peligro de extinción (Mckendrick, 2002).
Conservar no quiere decir no hacer uso de los recursos, sino saber como
usarlos y en que proporciones hacerlo para conservar y mantener la productividad.
Por tanto si queremos comercializar estas especies debemos primero asegurarnos
que no se agoten por causa de una extracción irracional (Quiñónez, 2000). La
biotecnología nos permite reproducir plantas y por ende salvar aquellas que están
en peligro de extinción. Una de las formas más eficaces para la conservación de
cualquier especie es la propagación in vitro (Mckendrick, 2002).
Se puede definir como cultivo in vitro “el cultivo de plantas, semillas,
embriones, órganos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores sobre un
medio nutritivo en condiciones estériles” (Pierik, 1989).
De manera general, se puede decir que la micropropagación presenta
grandes ventajas sobre otros métodos de propagación vegetativa. Como por
ejemplo que permite el incremento acelerado del número de plantas por genotipo y
la reducción del período de multiplicación. Aumenta la capacidad de multiplicar
grandes cantidades de material en un espacio reducido, lo que permite un ahorro
1
considerable en espacio y energía (Pierik, 1989). De igual manera se pueden
enunciar ventajas más específicas que se le pueden en el caso de las orquídeas
adjudicar a la micropropagación, como el establecimiento de híbridos y el
mejoramiento de la industria y del comercio de orquídeas (Quiñónez, 2000).
Además, no es necesario esperar a que la semilla presente su estado de madurez
para poder sembrarla si se hace en condiciones controladas como se hace en el
cultivo in vitro, ya que cuando la semilla ha alcanzado las tres cuartas partes de su
madurez se pueden sembrar y se evita así la contaminación de la misma (Aguilar,
1998).
Lamentablemente la mayoría de la tecnología para la propagación in vitro
de orquídeas se realiza con ayuda de laboratorios sofisticados, los cuales no son
factibles de ser instalados por el pequeño o mediano empresario. Por este motivo
la elaboración de un estudio técnico para montar un laboratorio artesanal de
propagación de orquídeas constituye una gran oportunidad para el incremento de
la exportación de productos no tradicionales para Latinoamérica, más acordes con
los recursos disponibles de un pequeño y mediano empresario que comienza.
Es aquí donde surge la idea de realizar un estudio técnico que ayude a la
planificación y diseño de un laboratorio artesanal, para la reproducción de
orquídeas in vitro, el cual permita propagar eficientemente estas especies y así
poder ayudar a la conservación de las mismas.
2
2. OBJETIVOS
2.1. GENERAL
• Diseñar un estudio técnico que permita planificar y organizar un
laboratorio artesanal para la producción de orquídeas in vitro.
2.2. ESPECÍFICOS
• Determinar la infraestructura, equipo y materiales alternativos
mínimos, necesarios para un laboratorio artesanal de
micropropagación de orquídeas.
• Adaptar la tecnología convencional existente para micropropagar
orquídeas, a las condiciones artesanales de un pequeño y mediano
productor o empresario.
3
3. REVISIÓN DE LITERATURA
3.1. BIOLOGÍA DE LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS
Según Mckendrick (2000), cuando las semillas de orquídeas germinan
producen una masa indiferenciada de células llamadas protocormo, las cuales
continúan su crecimiento por varias semanas, meses o incluso años hasta que
alcancen la edad apropiada para producir hojas y raíces. En el caso de orquídeas
terrestres, se requiere de la presencia de un hongo (micorriza) el cual sirve de
extensión de las raíces y por consiguiente para absorber nutrientes durante los
estados tempranos del ciclo de vida de la planta. Caso contrario en los
protocormos de orquídeas epífitas que forman esta asociación.
Las semillas de orquídeas por su tamaño tan pequeño, contienen pocas o
ninguna reserva para llevar a cabo su germinación, prácticamente no presentan
endospermo por lo que al trabajar in vitro, deben suministrársele los nutrientes
necesarios en los medios estériles (Pierik, 1990).
3.2. FUNDAMENTOS DE LA GERMINACIÓN DE ORQUÍDEAS IN VITRO
Mediante la germinación in vitro, se reproducen semillas en frascos de
vidrio o plásticos sobre un medio nutritivo que contiene una fuente de carbono
(azúcar) y nutrientes necesarios para que las semillas germinen y crezcan.
Existen dos tipos de germinación in vitro: simbiótica y no simbiótica. En la
simbiótica, las semillas se siembran con una pequeña porción del hongo micorriza
apropiado. El hongo crece en el medio, coloniza las semillas en el proceso de
germinación y se origina una relación simbiótica que se espera alimente al
protocormo hasta que éste produzca hojas y se vuelva autótrofo. Esta es la
técnica que da mejores resultados en propagación de orquídeas terrestres en las
zonas templadas. Este método tiene la ventaja de usar un medio simple, como
avena en polvo con una pequeña cantidad de extracto de levadura. Este medio
4
produce plantas micorrizales más fuertes y resistentes a infecciones que las
cultivadas asimbióticamente. Sin embargo, la desventaja de este sistema es que
se necesita obligatoriamente seleccionar el tipo de hongo adecuado para que se
origine la simbiosis y prevenir el parasitismo y consecuentemente la muerte de las
semillas (Mckendrick, 2000).
La germinación no simbiótica se realiza más comúnmente en orquídeas
tropicales. El medio que se utiliza para este tipo de germinación es más complejo,
ya que todos los nutrientes orgánicos e inorgánicos y los azúcares deben estar
disponibles para las orquídeas en una forma apropiada puesto que no existe la
simbiosis con el hongo como en el caso de las orquídeas terrestres de zona
templada (Mckendrick, 2000).
3.3. INFRAESTRUCTURA DE UN LABORATORIO CONVENCIONAL DE CULTIVO DE TEJIDOS
Todo laboratorio de cultivo de tejidos debe de contemplar en su planeación
la norma elemental de asepsia. Para esto se requiere que el diseño de un
laboratorio se haga pensando en el aislamiento de las áreas según el uso que se
les asignará.
Según Alvarenga (2002) un laboratorio de cultivo de tejido debe de tener las
siguientes áreas de trabajo como requisito básico para considerarse un buen
laboratorio:
• Sala de preparación de medios.
Dentro de esta sala se deben de preparar las soluciones madres y medios
de cultivo. En esta sala encontraremos reactivos, balanzas de precisión,
medidores de pH, agitadores magnéticos, cristalería, sistemas de destilación de
agua, refrigeradora, etc.
• Sala de lavado y esterilización.
5
Esta sala debe de contar con autoclave, fregadero o pila, estantes,
detergentes, cepillos para botellas, esponjas para lavar cristalería, etc.
• Sala de siembra.
Es necesario contar dentro de esta sala con una cámara de flujo laminar,
sistemas de extracción de aire, mecheros, desinfectantes, bisturís, pinzas, etc.
• Sala de incubación.
En esta área se requiere de estantes, sistemas de aire acondicionado para
le control de temperatura, termómetro, y un sistema de iluminación (tubos
fluorescentes). El cultivo de orquídeas in vitro requiere de un ciclo de 16 horas luz
con una temperatura no mayor a los 26 0C.
3.4. MEDIDAS DE ASEPSIA EN UN LABORATORIO
Dentro de un laboratorio de cultivo de tejidos es necesario manejar técnicas
de esterilización y realizar todo tipo de manipulación de la manera más aséptica
posible. Todo buen laboratorio toma en cuenta la asepsia desde el momento de su
diseño y construcción.
La razón principal por la cual todo laboratorio de cultivo de tejidos debe de
mantener las condiciones de asepsia es sin duda alguna que todos los medios
empleados contienen nutrientes, los cuales facilitan el crecimiento de muchas
bacterias y hongos. El crecimiento de dichos microorganismos provocaría la
contaminación del material vegetativo que deseamos reproducir (Leblanc, 2002)1.
La manera de combatir dichos microorganismos no deseados dentro de un
sistema de micropropagación es mediante la eliminación de sus células
vegetativas, esporas y otras estructuras reproductivas. Esto se logra gracias a la
1 LEBLANC, H. 2002. Comunicación personal.
6
esterilización de medios, instrumentos y recipientes de cultivo, así como la
limpieza personal (Merino, 1988).
El método más común de esterilización de medios de cultivo y cristalería es
la utilización del autoclave. Esto consiste en la destrucción del patógeno por altas
temperaturas, 120 0C y 15 lb/in2. Es necesario que siempre se tome en cuenta ese
tiempo para evitar la sobre esterilización que produce la pérdida de valor nutritivo
del medio y la caramelización de los azúcares. El tiempo para los medios es de 20
minutos, para la cristalería es de 30 minutos a 120 0C. Los instrumentos como
espátulas, pinzas, tijeras bisturís, etc se envuelven en papel aluminio para
someterlos a la esterilización, y luego se mantienen sumergidos en alcohol hasta
el momento de su uso (Merino, 1988).
El material vegetativo u órgano empleado también exige una desinfección
antes de comenzar a trabajarlo. El agente más adecuado debe estar en
dependencia del material vegetativo u órgano con que se cuenta. Generalmente
se usan soluciones de hipoclorito de calcio o de sodio a concentraciones de 0.1 a
2 y 2 a 10 % respectivamente. También puede utilizarse peróxido de hidrógeno
(agua oxigenada), agua de bromo, nitrato de plata y cloruro mercúrico. Estos
agentes desinfectantes posteriormente son enjuagados con agua destilada
(Merino, 1988).
El trabajo que se realiza en la sala de siembra debe de llevarse a cabo
dentro de un área estéril proporcionada por una cámara de flujo laminar. La
limpieza personal de cada uno de los operadores en la siembra y de los
empleados en general dentro de un laboratorio también es requisito fundamental
para que se logren niveles altos de asepsia. Así que es necesario que el personal
utilice bata solo dentro del laboratorio para evitar contaminar la bata lo más que se
pueda. El cabello en caso de mujeres que lo acostumbran largo debe de estar
recogido y para todo el personal en general es necesario que utilice una maya o
7
redecilla. Se requiere de mascarillas y botas de tela en caso que sea el área de
siembra.
Puesto que la cámara de flujo laminar es el área de mayor importancia al
momento de la siembra, es necesario al utilizarla seguir los siguientes pasos
descritos por McKendrick (2002):
• Lávese las manos, fregándose bien las uñas usando un jabón
antibacterial, séquese y desinféctese las manos con alcohol.
Asegúrese de estar utilizando la bata al momento de estar dentro del
área de cultivo.
• Desinfecte la cámara por completo usando alcohol al 70%. Usando
un atomizador y algodón limpie todas las superficies de la cámara,
incluyendo las paredes y el techo.
• Todo lo que ingresará en la cámara debe de estar esterilizado. Los
frascos que se utilizarán para la siembra al igual que todos los
instrumentos a utilizar deben de haberse autoclavado y envueltos en
papel de aluminio hasta el momento de la siembra.
• Recuerde que cualquier espora de bacteria u hongo dentro de la
cámara flotará hacia el exterior y en dirección a su persona. No
ponga las manos, las mangas u otro objeto sobre o en dirección de
algo desinfectado (como el medio). Mantenga movimientos leves y
evite crear turbulencia de aire que pueda ocasionar contaminación.
No hable, tosa o estornude dentro de la cámara. Trabaje en lo
posible hacia el fondo de la cámara y minimice el tiempo de
exposición de los medios cuanto sea posible.
• Mantenga las condiciones de esterilización mediante la limpieza
regular de la cámara con alcohol, desinfecte nuevamente los
8
instrumentos luego de su uso y una vez en la cámara desinféctese
con alcohol después de haber tenido contacto con cualquier objeto
fuera de la cámara. De manera especial, no se toque el cabello o la
cara.
3.5. MEDIOS DE CULTIVO PARA ORQUÍDEAS
Un medio para el cultivo in vitro de orquídeas, esta compuesto básicamente
por: agua, sales minerales, azúcar, vitaminas, y en algunos casos reguladores de
crecimiento (Cuadro 1). Además hace falta un elemento que de consistencia la
medio que suele ser el agar o gelatina simple. En los laboratorios convencionales
existen se utilizan medios de cultivos ya preparados previamente por industrias en
cargadas de la rama (anexo 1) (Grupo Orquideófilo Canarias, 2002).
La adición de extracto de levadura es muy beneficiosa, pues proporciona
vitaminas inusuales, algo de nitrógeno en forma de aminoácidos y ologopéptidos
(fragmentos muy cortos de proteínas de entre 2 y 10 aminoácidos), oligoelementos
y cofactores (Grupo Orquideófilo Canarias, 2002).
Cuadro 1. Composición de un medio para el cultivo in vitro de orquídeas Elementos Cantidad Abono mineral 20-20-20 (sin urea) 1 g Agar 8 g Agua 1 L Azúcar comercial 10 g Extracto de levadura 1 g Complejo de vitamina B 1 ampolla Otros aditivos (agua de coco, banano, etc) depende del aditivo Fuente: Chavarri, Y. 2002
En los medios de cultivo para orquídeas también se usan suplementos no
definidos como el agua de coco que se filtra por medio de un filtro normal de café
(20 ml por cada litro de medio), papilla de banano (muy fina) a razón de media
banana por litro ó 25 ml de zumo de piña natural filtrado, aunque pare este es
necesario controlar el pH, pues es muy ácido y hay que corregirlo después
9
necesitando por consiguiente de un pH-metro (Grupo Orquideófilo Canarias,
2002).
Para el Grupo Orquideófilo Canarias (2002) es necesario tomar en cuenta:
• El agua de coco es mejor utilizada para la germinación y el banano
para el desarrollo de plántulas. No usar los dos a la vez.
• El banano como aditivo funciona muy bien (no debe de estar sobre
maduro, los que están entre verdes y amarillos son ideales).
• El agua a utilizar debe de ser destilada, aunque se podría usar agua
de lluvia que este bien limpia.
• Si se usa vermiculita como soporte no se añade agar.
3.6. MICROPROPAGACIÓN DE ORQUÍDEAS
3.6.1. Cultivo de meristemos
El cultivo de meristemos de orquídeas permite producir plantas libres de
virus y patógenos, al igual que reproducir las características de la planta madre.
Para esto sé aísla el meristemo de la planta y se hace crecer en un medio nutritivo
estéril (Muñoz, 1998). Esta técnica se utiliza cuando el material vegetativo
presenta más de un meristemo y su utilización como explante, no involucra el
daño o pérdida de la planta madre de la cual se tomó (Muñoz, 1998).
Según Morel (1965) cada meristemo cultivado in vitro desarrolla brotes y
raíces o se dividen en dos o más masas de tejidos, que al ser colocados en
diferentes secciones pueden proliferar para desarrollar más plántulas.
El cultivo de meristemos es un método efectivo para la eliminación de
infecciones virales debido a que carece de tejidos vasculares que es por donde se
propagan los virus, además que el meristemo apical tiene mayor velocidad de
10
crecimiento y en consecuencia el virus no alcanza los meristemos, otros factores
que interviene en la eficiencia de este tipo de cultivo es que en una célula
meristemática el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas,
debido a que estas células tienen un código de trabajo muy definido y que existe
una competencia por uso de algunos metabolitos entre células y virus (Grupo
Orquídeofilo Canarias,2002).
Por lo general los meristemos se cultivan sobre medios sólidos a pH entre
5,4- 6,0. El contenido de sacarosa es de un 2-4 %. Se utilizan las vitaminas B1,
piridoxina, ácido nicotínico y ácido pantoténico, los reguladores que se utilizan en
bajas concentraciones (0,1-0,5 mg) son auxinas, citoquininas para promover la
división celular (Grupo Orquídeofilo Canarias, 2002).
Con respecto a la intensidad lumínica que deben de recibir los meristemas,
Morel (1965), recomienda desde 100 hasta 200 lux con un fotoperíodo de 12 a 16
horas y un rango de temperatura de 22 a los 25 0C.
3.6.2. Cultivo de semillas
Los hongos juegan un rol muy importante en la germinación de las semillas
de orquídeas en condiciones naturales. Los hongos del género Rhizoctonia forman
una simbiosis con las raíces de orquídeas a la cual se denomina micorriza. La
micropropagación de orquídeas por semillas permitió que se puedan reproducir
estas plantas sin necesidad de dicha simbiosis (Cuya, 2002)
Gracias a la utilización de la técnica in vitro para la siembra de semillas la
colección de orquídeas va aumentando cada año. Las razones de esta práctica in
vitro son, según Pierik (1988):
• Las semillas de las orquídeas son muy pequeñas y contienen poca o
nada reserva alimenticia. Por lo tanto la germinación tiene más
probabilidades de éxito in vitro.
11
• En la naturaleza depende de una relación simbiótica con un hongo;
Sin embargo, in vitro es posible sustituir la acción del hongo por un
medio nutritivo.
• Como resultado de un cruce se obtiene un limitado número de
semillas, eligiendo un medio nutritivo apropiado, se puede conseguir
que todos germinen in vitro.
• La generación y desarrollo tiene lugar de una manera más rápida si
se realiza in vitro ya que se realiza en un ambiente acondicionado, y
sin competencia con hongos y bacterias.
Dependiendo de las especies las semillas crecen en cultivos diferentes sin
embargo deben contener al menos carbohidrato como fuente de carbono y
energía, minerales y agar como medio de soporte para algunos medios y
vitaminas, amino ácidos, reguladores de crecimientos en otros. Los medios son
esterilizados en un autoclave. El cuarto de cultivo debe de estar condicionado con
las respectivas horas luz y temperatura.
12
4. MATERIALES Y METODOS
En este estudio técnico, se realizó la planificación y diseño de un laboratorio
de cultivo de tejidos artesanal. Para alcanzar los objetivos de este estudio,
primeramente se hizo la descripción del producto que se deseaba obtener, luego
la localización y tamaño del laboratorio, seguido de los principios técnicos del
trabajo in vitro dentro del proceso productivo. Terminada esta primera etapa se
procedió a establecer el flujograma del producto, se estipuló el tiempo y
movimiento del producto al igual que el del personal y se realizó la descripción de
lo que sería el laboratorio artesanal y sus componentes. Finalmente se realizó una
comparación de costos entre un laboratorio convencional y el artesanal
presentado en este estudio.
Para determinar la ubicación del laboratorio artesanal se analizaron los
recursos con los que se contaban (terreno y construcción) para así minimizar
costos. Luego de determinar la ubicación del terreno se procedió a buscar la
información adecuada mediante entrevistas personales, visitas a laboratorios, y
revisión de literatura que pudieran ser útiles para la planificación y diseño del
laboratorio artesanal.
La recolección de datos e información a través de investigaciones se realizó
en la biblioteca de la universidad EARTH, así como en los laboratorios de ciencias
naturales de la misma entidad. De igual manera se realizaron visitas a otros
laboratorios e invernaderos donde cuentan con los equipos necesarios para la
micropropagación de orquídeas. Se contó con el apoyo de personas capacitadas
en la rama que aportaron con sus conocimientos en lo que respecta al cultivo de
tejidos, botánica y cultivo de orquídeas.
Para determinar los costos de los instrumentos necesarios para un
laboratorio convencional se hicieron cotizaciones a través de visitas y llamadas a
empresas encargadas de la distribución de instrumentos para laboratorios en
13
Costa Rica; también se investigó el costo de los instrumentos y materiales que
podían sustituir a los tradicionales y que podrían adaptarse a un laboratorio
artesanal y disminuir los costos.
Los laboratorios visitados fueron:
• Taisuco de Costa Rica, S.A.
Cuenta con alta tecnología para la micropropagación. El laboratorio
se encuentra ubicado dentro de la zona franca “Best”, Costa Rica.
• Invernadero “Costa Brava”
Es un laboratorio artesanal dedicado a la producción in vitro,
aclimatación y comercialización de orquídeas. Se encuentra ubicado
en Orotina de Alajuela, Costa Rica.
• Jardín botánico LANKASTER
Es un jardín botánico donde se muestra una gran variedad de
orquídeas. Esta ubicado en Cartago, Costa Rica.
• Invernadero “Lomas de San Isidro”
Invernadero de orquídea. Está ubicado en San Isidro de Heredia,
Costa Rica.
Las personas entrevistadas fueron:
• Ingeniera Agrónoma Yolanda Chavarri
Conferencista y asesora en la producción y mantenimiento de
plantas ornamentales con gran énfasis en orquídeas.
• Rodolfo Galván
14
Encargado del laboratorio de cultivo de tejidos de la Universidad
EARTH
• Celina Merino
Encargada de la parte de cultivo de tejidos dentro de la clase de
biotecnología impartido en la Universidad EARTH.
Las cotizaciones se realizaron en:
• AUDRÍN Y JIMÉNEZ, S.A.
• Almacén “El Gallo más Gallo”.
• Importadora Monje.
• Almacén el Verdugo.
15
5. RESULTADOS
5.1. DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO
El producto final que se desea obtener son plántulas de orquídeas para
exportación que han sido producidas en un laboratorio de cultivo in vitro. Para la
obtención de las plántulas se recolectan las semillas que pueden comprarse o bien
se puede tener un banco de semilla de donde obtenerlas, otra manera de obtener
las plántulas es por la siembra de meristemos. Una vez obtenido el material a
sembrar se prepara el medio de cultivo y se realiza la siembra. Las plántulas
finales habrán pasado todas sus etapas de desarrollo dentro del laboratorio.
5.2. LOCALIZACIÓN, TAMAÑO Y DESCRIPCIÓN DEL LABORATORIO ARTESANAL
El laboratorio que se pretende construir fue planeado para estar al alcance
de un pequeño o mediano empresario. Por esto surge la idea de llamarlo
laboratorio artesanal.
El laboratorio estará ubicado en Managua, Nicaragua. En una zona
comercial, con vías públicas y de fácil acceso al aeropuerto (25 minutos del
aeropuerto).
El laboratorio se diseñó basándose en una casa que actualmente no está
en uso. Se analizó para realizar las modificaciones necesarias y habilitarla como
un laboratorio.
El área total del terreno es de 250 m2 de los cuales 120 m2 son de
construcción y serán los que se adaptarán a las áreas y cuartos que tendrá el
laboratorio.
16
El laboratorio artesanal que se diseño contará con las siguientes áreas o
salas de trabajo. Área de recepción, área de lavado y desinfección de materiales,
bodega, cuarto de siembra, cuarto de incubación, invernadero y área de empaque.
El área de recepción con capacidad de trabajo para una persona estará
equipada con: un escritorio, 3 sillas, computadora, teléfono y un archivador. La
función principal de esta oficina es la atención de pedidos, y el control de compra
de materiales que bodega reporte como agotados, así como el control en general
de todos los movimientos internos de materiales y personal. En esta sala se
encontrara en la pared una especie de armario donde se colocarán las batas de
laboratorio, mascarillas (para área de siembra), mayas para la cabeza y botas de
tela que el personal deberá ponerse antes de ingresar a cualquier área del
laboratorio. Esta es la única área que estará abierta al público, en el piso de la
entrada se encontrará una bandeja plástica con una sustancia desinfectante por la
cual toda persona que desee entrar debe pasar y desinfectar así los zapatos.
La sala de lavado con capacidad para dos personas estará equipada con
un lavadero, llave de agua potable, mueble de repisas (4 repisas) cada repisa de
maya o cedazo (para secar materiales), aquí se encontrará la hoya de presión que
suplirá las funciones de un autoclave. Esta área de lavado se ocupará igualmente
para la preparación de los medios de cultivos, por tal razón se encontrará una
mesa de trabajo de madera forrada en su parte superior con una lámina de
aluminio, una refrigeradora donde se guardarán los medios y soluciones que
necesiten refrigeración. Para guardar los materiales (vasos químicos, probetas,
plato petri, etc.) se ocupará un armario con puertas.
La bodega será un cuarto pequeño donde se encontrará un mueble estilo
armario para colocar todos los productos necesarios para la elaboración de los
medios, algodón, alcohol, etc.
El área de siembra será un cuarto pequeño de paredes altas (al techo) pero
de vidrio que permitan saber cuando alguien está dentro de la sala ya que aquí se
17
maneja fuego y alcohol altamente inflamable. Esta sala con capacidad para dos
personas contará con una cámara de flujo laminar (artesanal), dos sillas, y aire
acondicionado, y sistema de luz fluorescente. En esta sala se realizarán todos los
trabajos de siembra, multiplicación y establecimiento.
La sala de incubación será un cuarto cerrado, pequeño con estantes de
cuatro repisas donde se colocarán los frascos con las semillas o plántulas que se
desean desarrollar, cada repisa tiene por la parte de abajo luz fluorescente ya que
el cultivo necesita fotoperíodos de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. La
habitación contará con sistema de aire condicionado y un termómetro para control
de la temperatura la cual debe de ser de 26 0C ± 1.
El piso de cada una de las salas anteriormente mencionadas será de
cemento para evitar acumulaciones de agua u otra materia que pueda ser
hospedera de patógenos. Cada esquina de los cuartos se rellenará con cemento
con el fin de que no haya acumulaciones de basura, agua o cualquier sustancia
que produzca un hábitat ideal para la reproducción de bacterias y hongos. Se
evitarán ventiladores que puedan esparcir esporas por todo el laboratorio, por tal
razón se instalaran aires acondicionados. La pintura de las paredes será de color
blanca para facilitar visibilidad a la hora de que estén sucias y dar mayor claridad a
los cuartos.
5.3. PRINCIPIOS TÉCNICOS DE TRABAJO IN VITRO DENTRO DEL PROCESO PRODUCTIVO
La técnica de producción in vitro puede ser dividida en cuatro partes. La
primera podría calificarse como la preparación de la solución del medio nutritivo en
donde se sembraran las semillas o meristemos. Para esto es necesario preparar el
medio de cultivo. Una vez preparado el medio de cultivo se distribuyen en los
frascos donde se sembraran las orquídeas y se tapan, luego se introducen en la
hoya de presión para esterilizarlos por 20 minutos. Los frascos ya esterilizados se
dejan enfriar antes de hacer la siembra por lo general el tiempo de enfriado es de
18
un día para otro por lo que se deja el material dentro de la hoya hasta el día
siguiente que se utilice.
Para la segunda parte que corresponde a la siembra se requiere que se
cumpla estrictamente con las normas de asepsia. Antes de comenzar la siembra
es necesario asegurarse que se cuenta con todos los materiales necesarios dentro
de la sala, una vez comenzada la siembra no se permite salir a buscar nada. El
piso de la habitación debe estar limpio y desinfectado, para ello puede utilizarse
cloro. La cámara de flujo laminar debe desinfectarse (por completo) con alcohol
70% antes de comenzar la siembra, las pinzas y bisturís se colocan en dentro de
la cámara en un recipiente con alcohol, los mecheros de alcohol, encendedores y
los frascos de igual manera se introducen a la cámara. A diferencia de las demás
áreas en esta se requiere que se utilice mascarilla. Las semillas o meristemos que
se sembrarán están dentro de la cámara, tienen que ser desinfectadas
previamente. Aunque todo el trabajo se realizará dentro de la cámara que
remplazará la de flujo laminar se debe colocar una lámina de vidrio para trabajar
específicamente sobre ella. Las manos nunca deben ser apoyadas a la cámara.
Una vez listos y dispuestos a comenzar el trabajo se enciende el mechero de
alcohol. Los frascos a sembrar no deben de abrirse todos a la vez; si no nada más
el que se utilizará. Al frasco donde se sembrara se le flamea la tapa de una
manera muy rápida y luego una vez abierto el frasco se flamea la boca. Las
pinzas, bisturí a utilizar se flamea, con las pinzas se colocan las semillas o
meristemo dentro del frasco, otra vez se flamea el borde y se tapa. El bisturí se
utilizará en caso que se desee remover algo de lo que se va a sembrar.
El cuarto paso dentro del trabajo de micropropagación luego de la siembra
es la incubación del material. Se llevan a un cuarto con condiciones controladas
de temperatura (26±1 0C) y luz (16 horas luz y 8 horas oscuridad). Es necesario
estar en constante revisión de que el material no se haya contaminado, en caso
contrario es necesario sacar las muestras, autoclavarlas antes de abrir los frascos
y repetir todos los pasos desde la preparación de medios para recuperar el
19
material perdido. Otra labor cultural que se realiza dentro de esta etapa es la de
subcultivar o dar mantenimiento y sirve para multiplicar. Esta técnica de
mantenimiento se hace cuando las semillas o meristemos han germinado y
crecido hasta alcanzar medio centímetro de altura. Esta práctica consiste en
transplantar de 3 – 4 plántulas por frascos a un nuevo medio nutritivo. La rapidez
de germinación y crecimiento depende de la especia aunque por lo general esto
toma de 1 –1 ½ mes para realizar el subcultivo (Merino, 2002).
Una vez cumplido el tiempo de desarrollo de las plántulas, estas
comenzarán su proceso de aclimatación. Para esto se pasan a bandejas con
sustratos y se llevan al invernadero. Según el tamaño que vallan desarrollando se
van pasando a macetas más grandes. El sustrato que se utiliza en las primeras
etapas de aclimatación es aserrín y luego se cambia a fibra de coco. En esta
etapa es necesario estarle proporcionando a la plántula los elementos que
requiere para su desarrollo.
5.4. TIEMPO Y MOVIMIENTO DEL PRODUCTO
Lo primero que se debe de hacer es la recolección de las semillas o
meristemos que se desean sembrar (Figura 1). En caso de las semillas pueden
ser colectadas a partir de cápsulas verdes que están madurando o ya maduras.
Las semillas colectadas deben de ponerse a secar, la manera más práctica de
hacer esto es a temperatura ambiente en una habitación seca. Una vez secas las
semillas pueden almacenarse por muchos meses en frascos cerrados dentro del
refrigerador a una temperatura de 4-5 0C. El tiempo de maduración de las semillas
varían según la especie; Por ejemplo, especies como Epidendrum requieren
aproximadamente 3.5 meses para madurar, mientras que las semillas
Odontoglossum requieren alrededor de 18 meses (McKendrick, 2002).
El tiempo que se requiere para la preparación del medio es de
aproximadamente 30 minutos, luego se coloca por 20 minutos en el autoclave y
se espera 1 hora para poder abrirlo.
20
El tiempo de la siembra está en dependencia de la rapidez y práctica del
operador y de la cantidad de semillas o meristemos que se deseen sembrar. Se
puede hacer un cálculo a sabiendas que de un litro de solución nutritiva salen 32
frascos de 30 ml cada uno. Para la siembra de meristemos se utiliza
aproximadamente 4 horas tomando en cuenta el tiempo que se toma la
desinfección entre cada siembra. etc. Para la siembra de semillas se hace en
menor tiempo.
El tiempo que el producto este en la sala de incubación esta en
dependencia de la especie y si la planta está recibiendo las condiciones óptimas
para su desarrollo.
Escogencia del material Desinfectarlo Almacenamiento
Preparación de medio nutritivo
Desinfección de materiales a utilizar
Siembra Incubación
Figura 1. Flujograma de los procesos dentro del laboratorio
21
5.5. PERSONAL
Para este laboratorio es necesario contar con una secretaria y dos
personas encargadas de preparar los medios de cultivo, siembra y lavado de
cristalería, etc. Estas personas serán capacitadas para ejercer sus funciones en
un área específica, por que dentro del laboratorio no existe la posibilidad de rotar
el personal. Las funciones de estas dos personas se definieron mediante la
experiencia personal adquirida dentro del laboratorio de Ciencias de la
Universidad EARTH.
5.6. TECNOLOGIA ARTESANAL
Los costos del laboratorio artesanal son menores a los de uno convencional
al sustituir algunos de los equipos que tienen mayores costos. El quemador
Bunsen se puede sustituir por uno estilo casero utilizando frascos con tapaderas
estilo “Gerber”, retazos de tela y alcohol. En el caso de una botella con gotero de
30 ml, se buscan botellas ya utilizadas que posean goteros sin importar la medida
ya que únicamente se requieren para la solución ácida o alcalina que ayuden a
regular el pH del medio. El papel parafina puede sustituirse por rollos de plástico
adhesivo de cocina, el mismo que se puede partir con tijera y sacar hasta tres
rollitos de uno solo. El agua destilada puede sustituirse por agua hervida o agua
pura certificada. El autoclave se cambia por una olla de presión de las que se
utilizan en las casas. La cámara de flujo laminar se puede construir como se
explicó anteriormente (cuadros 2 y 3).
22
Cuadro 2. Costos del equipo para un laboratorio artesanal $1 = 370 colones
Cant. DescripciónPrecio unit. en
colones Im puestosPrecio en
dólares1 Balanza de precisión 1,011,840.00 0 2734.701 olla 20,000.00 0 54.051 pHm etro 349,103.00 0 943.521 Agitador m agnético 40,488.00 0 109.431 P inzas 12.7 cm largo, curvas 3,329.00 0 9.001 P inzas 114 m m recta 2,879.00 0 7.781 Term óm etro de m ercurio 1,112.00 0 3.011 Beaker 50 m l 926.00 0 2.501 Beaker 100 m l 1,105.00 0 2.991 Beaker 150 m l 1,105.00 0 2.991 Beaker 250 m l 1,135.00 0 3.071 Beaker 600 m l 1,614.00 0 4.361 Beaker 1000 m l 2,582.00 0 6.981 Beaker 2000 m l 4,512.00 0 12.191 P ipeta volum étrica 10 m l 1,507.00 0 4.071 P ipeta volum étrica 50 m l 3,899.00 0 10.541 P lato Petri de vidrio 100*15 m m 1,678.00 0 4.541 P izeta 500 m l 882.00 0 2.381 P izeta 1000 m l 967.00 0 2.61
Total 1,450,663.00 3920.71
Fuente: Audrín y Jiménez S.A.
23
Cuadro 3. Costos del equipo para un laboratorio convencional
$1 = 370 colones
Cant. DescripciónPrecio unidad en
colones impuestoPrecio unidad
en dólares1 Balanza de presición 1,011,840.00 0 2734.701 pHmetro 349,103.00 943.521 Agitador magnético 40,488.00 109.431 Quemador Bunsen 15,531.00 41.98
1Pinzas 12.7 cm largo
con punta curva 3,329.00 9.001 Pinza 114 mm recta 2,879.00 7.78
1Termómetro de
mercurio 1,112.00 3.011 Beaker 50 ml 926.00 2.501 Beaker 100 ml 1,105.00 2.991 Beaker 150 ml 1,105.00 2.991 Beaker 250 ml 1,135.00 3.071 Beaker 600 ml 1,614.00 4.361 Beaker 1000 ml 2,582.00 6.981 Beaker 2000 ml 4,512.00 12.19
1Pipeta volumétrica 10
ml 1,507.00 4.07
1Pipeta volumétrica 50
ml 3,899.00 10.54
1Plato petri de vidrio 100
* 15 mm 1,678.00 4.54
1Botella con gotero 30
ml 551.00 1.491 Pizeta 500 ml 882.00 2.381 Pizeta 1000 ml 967.00 2.61
1Papel parafilm 10
cm*76 mtrs 14,210.00 38.411 Destilador de agua 945,000.00 2554.051 Auto clave 2,046,000.00 5529.73
1 Cámara de flujo laminar 3,600,000.00 9729.73Total 8,051,955.00 21762.04
Fuente. Audrín y Jiménez S.A.
24
5.6.1. Tecnología artesanal para la cámara de flujo laminar
Para la siembra de semillas y meristemos se requiere de una cámara de
flujo laminar, debido a que esta es de alto costo (uno de los más altos dentro de
los materiales del laboratorio) se requiere de una que al menos cumpla con la
función de aislar el cultivo y medio del entorno a la hora de la siembra. Para esto
se hace una caja de madera y vidrio puede estar por dentro forrada de lámina de
aluminio en la parte donde se encuentra la madera, de unos 40 cm de altura por
60 de ancho y 40 de profundidad (Anexo 3). En la parte frontal la cual es de vidrio
para mejor visibilidad (al igual que la parte superior), se hacen unos orificios
adecuados para introducir las manos a los que se les acoplan mangas largas que
dejen libre las manos para poder operar con mayor facilidad. El ancho de los
agujeros debe ser lo suficiente para brazos anchos o delgados. La manera más
conveniente para la instalación de los guantes es colocar bolsas largas pegadas
con cinta adhesiva al agujero por la parte exterior dejando una abertura al final
para las manos que en todo momento deben de estar desinfectadas con alcohol.
5.6.2. Tecnología artesanal para la esterilización
Para la esterilización de los materiales se requiere de un autoclave que
igual que la cámara de flujo laminar representa un gran gasto. Para esto se
recomienda que se utilice ollas de presión, las mismas que se usan en nuestras
casas y bajo los mismos principios de seguridad.
Para evitar riegos de incendio las mesas de trabajo en un laboratorio
convencional están recubiertas de un material especial antiinflamable; sin
embargo resulta costoso querer comprar este estilo de mesa para un laboratorio
artesanal, por lo que se recomienda se forren las mesas de trabajo con una lámina
de aluminio.
25
5.6.3. Tecnología artesanal para los recipientes
Los frascos en los que se realizan la siembra y algunas práctica culturales
como el subcultivo si se compran resultan caros, por lo cual se recomienda
recolectar los que usualmente hay en las casas que son las de estilo Gerber, en
donde se venden alimentos para bebés. Es necesario que los frascos sean
tapados pero estas tapas también representan un costo por lo que lo más común y
de mejores resultados han sido taparlas con bolsas plásticas y sujetarlas con
hules.
5.6.4. Tecnología artesanal para la incubación
Los muebles para la colocación de los frascos ya con el cultivo dentro,
pueden ser elaborados en una pequeña fabrica de herrería ya que no necesitan de
ningún equipo en especial y pueden ser hechos localmente. A este mueble se le
deben hacer las conexiones necesarias para la instalación del sistema de luces.
La luz que se debe de usar en el laboratorio es la fluorescente, esto debido
a que es la más fría y no interfiere en el proceso de mantener la temperatura
adecuada para el cultivo.
El instrumento para la medición de la temperatura dentro de la sala de
incubación es un termómetro de mercurio.
La energía que se utilizará para este laboratorio es la que actualmente se
utiliza en la casa donde se instalará, esta es energía eléctrica. Sin ninguna
objeción se puede catalogar el uso de la energía eléctrica como una de las
materias primas de mayor importancia debido a que todos los procesos desde la
preparación de medios, siembra e incubación requieren exclusivamente de este
tipo de energía.
26
6. CONCLUSIONES
- El estudio técnico demostró que es factible implementar un laboratorio
artesanal para el cultivo de orquídeas in vitro.
- El aspecto medular para la implementación de este laboratorio artesanal,
resultó ser las condiciones de asepsia, sin las cuales el laboratorio no podría
funcionar.
- Dentro de las condiciones de asepsia se encontró que para reducir costos
y mantener la funcionalidad del laboratorio, era fundamental reemplazar la cámara
de flujo laminar por una artesanal y el autoclave para esterilizar por una olla de
presión.
- Muchos de los materiales utilizados en un laboratorio convencional,
pueden ser sustituidos por materiales de más bajo costo, como por ejemplo se
puede sustituir el uso del destilador de agua por agua hervida y los recipientes de
cultivo por frascos de alimentos para infantes resistentes al calor (frascos
“Gerber”).
- Los costos más altos de los equipos del laboratorio convencional los
dieron, la cámara de flujo laminar con 9,729 dólares, esta puede sustituirse por
una caja de madera y vidrio manteniendo el principio de aislamiento y resulta de
menor costo. En segundo lugar estuvo el autoclave con un costo de 5,529 dólares
pero puede sustituirse por una olla de presión con un costo de 54 dólares. En
tercer lugar está el sistema de destilación de agua con un costo de 2,554 dólares,
el cual puede ser sustituido por agua hervida.
- El equipo de laboratorio mínimo necesario para un laboratorio
convencional dio un costo de 21,762 dólares, en cambio el equipo mínimo
necesario para el laboratorio artesanal dio un costo de 3,920 dólares.
27
- El laboratorio artesanal propuesto en este estudio, está al alcance del
pequeño y mediano empresario que desee incursiona en el mercado de orquídeas
in vitro.
- Aunque el objetivo de este laboratorio es la producción in vitro de
orquídeas, el mismo puede ser utilizado para la micropropagación de otras
especies.
28
7. RECOMENDACIONES
Para determinar la rentabilidad del laboratorio artesanal propuesto, es
necesario que se realice un estudio de factibilidad completo donde se tomen en
cuenta los estudios de mercado, financiero, de impacto social y el de impacto
ambiental.
29
8. LITERATURA CITADA
AGUILAR, M. 1988. Micropropagación de cattleya dowiana y c. Skinneri Batem, dos orquídeas de Costa Rica en vías de extinción. Congreso de la PCCMA, XXIV Reunión, Costa Rica. 267p.
ALVARENGA, S. 2002. Laboratorio de Cultivo de tejidos. Instituto Tecnológico de Costa Rica. Escuela de Biología. 64p.
AUDRÍN Y JIMÉNEZ S.A. Distribuidora Científica. Contacto personal. Tel. (00505) 277-2547. Telefax. (00505) 227-9270.
CHAVERRI, Y. 2002. Entrevista personal. San José, Costa Rica
CUYA, M. 2002. Micropropagación de orquídeas in vitro. LA MOLINA. Perú. En Línea.http://www.lamolina.edu.pe/FACULTAD/Agronomia/horticultura/propagacion/biotecnologia/cuya_resumen.htm
GALVÁN, R. 2002. Entrevista personal. EARTH. Costa Rica.
GRUPO ORQUIDEOFILO CANARIAS. Orquídeas su cultivo in vitro en el ámbito doméstico. (en línea). España. Consultado el 11 de febrero del 2002 Disponible en: http://www.lanzarote.net/ogro/gocarticuloinvitrojmsv.htm
McKENDRICK, S. 2000. Manual para la germinación in vitro de orquídeas. Ceiba Foundation. USFQ. Quito, Ecuador. 76 p.
MERINO, C. 2002. Cultivo de tejidos. Material de curso. Biotecnología, 2002 Universidad EARTH.
MERINO, M. 1988. Técnicas de esterilización y manipulaciones asépticas. Material de curso. Biotecnología, 2002. Universidad EARTH.
MOREL, G. 1965. Tissue culture: a new means of clonal propagation of orchids. Sin fecha. México, D.F. México.
MUÑOZ, A. 1998. Cultivo de mersitemas de tres especies de orquídeas y evaluación de un producto para su conservación. Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica. 77p.
PIERIK, R. 1989. Cultivo in vitro de plantas superiores. (en línea) Consultado el 20 de marzo del 2002. Disponible en: http://www.iztacala.unam.mx/temas/foropaea/02TB13la.htm
30
QUIÑÓNEZ, M. 2000. Micropropagación de orquídeas Peruanas a escala piloto. Universidad Ricardo Palma. CONCYTEC. Lima, Perú. 98 p.
RIVERA, G. 1998. Orquídeas. Generalidades y su cultivo. EFUNA. Heredia, Costa Rica. 266p
31
9. ANEXOS
ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE Y SKOOG. MEDIO DE CULTIVO DE KNUDSON.
Medio de Murashige y skoog.
Nutrientes Gramos / litro Nitrato de potasio - KNO3 1.9 Nitrato de amonio - NH4NO3 1.65 Cloruro de calcio - CaCl2 0.44 Sulfato de magnesio - MgSO4.7H2O 0.37 Fosfato monobásico de potasio – KH2PO4 0.17 Sodio – EDTA - Na – EDTA 0.0373 Sulfato de hierro - FeSo4.5H2O 0.0278 Sulfato de manganeso - MnSO4.4H2O 0.0223 Sulfato de Zinc – ZnSO4.4H2O 0.0086 Acido Bórico - H3BO3 0.0062 Yoduro de potasio – KI 0.00083 Molibdato de sodio - Na2MoO4.2HO 0.00025 Sulfato de cobre – Cu3O4.5H2O 0.000025 Cloruro de cobalto - CaCl2.2H2O 0.000025 Azúcar 30 Fuente: Chavarria, 2002.
Medio de Knudson.
Nutrientes Gramos / litro Nitrato de calcio - CaNO3 1 Sulfato de amonio - SO4NO3 0.5 Sulfato de magnesio - MgSO4.7H2O 0.25 Fosfato monobásico de potasio – KH2PO4 0.25 Sulfato de hierro - FeSO4.5H20 0.025 Sulfato de manganeso – MnSO4.4H2O 0.0075 Azúcar 30 Fuente: Chavarria, 2002.
33
ANEXO 2. SUPLEMENTOS NO DEFINIDOS QUE SE PUEDEN AGREGAR A LOS MEDIOS PARA EL CULTIVO DE ORQUÍDEAS
Nutrientes Agua de coco 150 ml / l Banano 50 g / l Manzana 20 g / l Agua de pipa 100 ml / l Papa 100 g / l
34
ANEXO 3. CAMARA DE FLUJO LAMINAR ARTESANAL
Fuente: Grupo orquideofilo. 2002
Nota: Dimensiones en centímetros
35
