Libro def · 2015-05-08 · EDITA: CONSELLERIA DE SANIDADE DA XUNTA DE GALICIA DISEÑO...

El impacto de labiología molecular

en la sociedadmoderna

EDITA: CONSELLERIA DE SANIDADE DA XUNTA DE GALICIA

DISEÑO PORTADA: CARLOS CIDRANES Y ANDRÉS FROIZ

MAQUETACIÓN Y PRODUCCIÓN: CLIZIA COMUNICACIÓN

DEP. LEGAL: PO-000-04

En este libro se recogen los textos de las ponencias que seexpusieron durante la jornada celebrada el día 4 de septiembrede 2003 organizada por el Centro de Estudios Avanzados-Casa de Europa de la Universidad de Santiago de Compostela,con el patrocinio de Dupont y la colaboración de la Conselleríade Sanidad de la Xunta de Galicia.

INDICE

Saluda J.M Hernández Cochón, conselleiro de Sanidad...................................Pág. 11

Saluda Carlos Acuña Castroviejo, director del Centro de Estudios Avanzados - Casa de Europa de la USC....................................................Pág. 15

Saluda Pascual Sisto, presidente de Dupont Ibérica............................................Pág. 19

Saluda Santiago Grisolía, presidente del jurado del PremioDupont de la Ciencia..................................................................................................Pág 23

Conceptos básicos sobre el genoma y retos de la investigación genómicaJaime Gómez Márquez, catedrático de bioquímica y biología molecular.Decano de la Facultad de Biología de la USC..........................................................Pág. 27

Uso de animales modificados genéticamente para el estudio de enfermedades en el hombreJuan Bautista Zalvide Torrente, departamento de Fisiología,facultad de Medicina de la USC...............................................................................Pág. 43

La medicina genómica: desde el laboratorio de investigación a la cama del pacienteFernando Domínguez Puente y otros, departamento de Fiosiología,facultad de Medicina de la USC................................................................................Pág 51

El uso de la nueva biotecnología en el descubrimiento de fármacosMaría Isabel Loza García, departamento de Farmacología,facultad de Farmacia de la USC...............................................................................Pág. 59

Investigación de los factores genéticos de las enfermedades autoinmunes complejasAntonio González Martínez-Pedrayo, investigador del programade reincorporación del INSALUD-FIS, servicio de Reumatología,complejo hospitalario de la USC...............................................................................Pág. 69

José María Hernández CochónConselleiro de Sanidad

Valgan estas palabras introductorias para agradecer muysinceramente al Centro de Estudios Avanzados de la Universidad deSantiago de Compostela y al profesor Carlos Acuña Castroviejo, suamable invitación para asistir a este coloquio sobre “El impacto dela biología molecular en la sociedad moderna”.

Cuando todavía no habían pasado cincuenta años desde queWatson y Crick anunciaran al mundo la estructura en doble hélice delDNA, el nuevo milenio comenzaba ya con buenos augurios para lahumanidad al publicar, simultáneamente, dos prestigiosas revistascientíficas, el borrador de la secuenciación completa del genomahumano. Hoy, dos años después, en el seguimiento cotidiano de lasnoticias médicas, raro es el día que no aparece una nuevapublicación que da cuenta de un hallazgo relevante en cualquiera delos campos de la genómica o de la biología molecular; y hay quedecir que estas noticias casi siempre llevan implícitas unasrepercusiones presentes y/o futuras sobre la salud o laenfermedad del individuo.

Es cierto que en el objetivo genérico y común de mejorar la saludde la población queda todavía muchísimo trabajo querealizar en I+D; pero los progresos sólo se lograránaunando esfuerzos y potenciando sinergiasdesde todos los campos y ramas de lasbiociencias. Ahora, más que nunca, esnecesario compilar, compartir los saberes yponerlos a disposición de la comunidad

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El impacto de la biología molecular en la sociedad moderna

científica, para poder enfrentarse a los nuevos desafíos e irsolucionando los problemas que, al mismo tiempo, vayan surgiendo.

En esta línea, la empresa privada, la Universidad y las distintasadministraciones públicas, necesariamente han de colaborar. Estamesa redonda es una buena prueba de que es posible esaintersección que haga compatibles los intereses de todos.

Estamos, desde luego, viviendo un momento crucial en la historiade la humanidad; y no solamente visto desde una perspectivamédica o biológica, sino social, como muy bien reconoce el título deesta jornada científica. Nunca antes disciplinas específicas y áreasmuy especializadas de la investigación estuvieron tan cerca de lospacientes.

La trascendencia de los descubrimientos futuros condicionará elejercicio de la medicina, desde luego, pero sus repercusionestambién se harán patentes en aspectos tan dispares como lasociología, la economía e incluso la ética.

Los temas de la mesa redonda que se recogen en el presentevolumen no sólo consolidan el prestigio de la Universidadcompostelana, sino que acreditan a este Centro de EstudiosAvanzados como promotor de esa investigación de calidad que,efectivamente, nos une a Europa y nos iguala con el resto de los

países industrializados, en la búsqueda del bienestarpara todos los ciudadanos del mundo.

Felicito pues al Centro de EstudiosAvanzados por este importante foro y deseoque esta Casa de Europa siga reuniendo aprestigiosos profesores y especialistas que,

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desde Santiago de Compostela, proyecten al mundo los logros de laciencia y, desde luego, que ésta se ponga siempre al servicio de lasalud y el bienestar humanos.

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Carlos Acuña CastroviejoDirector Centro de Estudios Avanzados-Casa de Europa

Universidade de Santiago de Compostela

El año 1953 fue importante para muchos por que en GranBretaña se celebró la coronación de la Reina Elizabeth, aunquepara otros el acontecimiento fuese el primer ascenso al monteEverest. Sin embargo, el acontecimiento relevante para lahumanidad –que recibió muchísima menos publicidad en aquellosmomentos- habría ser el descubrimiento de Watson y Crick delmodelo de DNA. Efectivamente, el impresionante desarrollo de labiología molecular desde 1953 es la razón principal de la atenciónque se le da hoy al modelo de Watson y Crick, en la celebraciónde su aniversario de oro.

En este aniversario DuPont Ibérica fallará el Premio DuPont dela Ciencia en Santiago de Compostela y, en línea con este espíritu,colabora en este coloquio en el Centro de Estudios Avanzados dela Universidad de Santiago de Compostela sobre el impacto de labiología molecular en nuestra sociedad.Este impacto se refleja enlas intervenciones que vendrán a continuación del Presidente delJurado del Premio DuPont de la Ciencia, el profesor SantiagoGrisolía, y de profesores de la Universidad de Santiago quienesexpondrán el efecto que el descubrimiento del modelode DNA ha tenido en la investigación básica,instrumentos de diagnóstico o desarrollo denuevos fármacos.

Gracias al Conselleiro de Sanidad, JoséMaría Hernández Cochón, por su presencia y

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apoyo a las actividades científicas; al Presidente de DuPontIbérica, Pascual Sisto; a todos los participantes y asistentes ybienvenidos al Centro de Estudios Avanzados.

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Pascual SistoPresidente de Dupont Ibérica

Excelentísimas autoridades, señoras y señores:

Quisiera agradecer en nombre de DuPont Ibérica a laUniversidad de Santiago la hospitalidad que ha demostrado alacoger con tanto interés este acto que hoy celebramos.

A nivel personal he de reconocer que me siento como en casapor partida doble. Soy y ejerzo de gallego, por lo que cualquieroportunidad de pisar esta tierra ya es motivo de alegría para mí.Además, como antiguo alumno de esta Universidad, muchas delas caras que ahora mismo contemplo hacen que recuerde mismejores años de estudiante.

Sobre esta base, es un placer para mí haber traído a Galicialos actos del Fallo de la décimotercera edición del PremioDuPont a la Ciencia.

DuPont es una compañía de ciencia, y este Premio uno de loselementos con los que impulsamos la investigación, tannecesaria en el desarrollo de nuestros productos y nuestrasactividades.

Este galardón se ha hecho ya un huecoentre los grandes de la península: DonSevero Ochoa, primer Presidente del Juradoy, desde que él nos dejara, el ProfesorSantiago Grisolía han dado en el clavo año

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tras año, reconociendo la carrera de científicos que luego se hanvisto reconocidos a nivel internacional. Estoy seguro de quemañana volverán a acertar en su elección del premiado de estaedición.

La presencia de D. Santiago con motivo del fallo de nuestroPremio es una oportunidad única, y su generosidad nos va apermitir ahora disfrutar de este debate sobre “El impacto de labiología molecular en la sanidad moderna”, al que no quierorobarle ya más tiempo…

Muchas gracias

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Santiago GrisolíaPresidente del Jurado del Premio DuPont de la Ciencia

Excelentísimo Señor José María Hernández Cochón,Conselleiro de Sanidad; Excelentísimo Señor Eduardo García-Rodeja Gayoso, Vicerector de Investigación e Innovación de laUnivesidad de Santiago; Señor Don Carlos Acuña Castroviejo,Director del Centro de Estudios Avanzados y Casa de Europa;Señor Don Pascual Sisto, Presidente de DuPont Ibérica;Autoridades, Señoras y Señores.

Tengo mucho gusto en encontrarme una vez más enSantiago. En primer lugar deseo agradecer y felicitar a DuPontIbérica y al Centro de Estudios Avanzados y Casa de Europa, dela Universidad de Santiago por la organización de esta reuniónsobre El impacto de la Biología Molecular en la sociedadmoderna, que va a tener lugar hoy con motivo de la reunión delJurado del Premio DuPont en su XIII edición y coincidiendo conel 50 aniversario de la propuesta del modelo de la doble hélicedel ADN por Watson y Crick. Curiosamente al principio estapropuesta se acogió con interés pero no con gran entusiasmo,éste se produjo cuando se sugirió la secuenciación del GenomaHumano, inicialmente a través de un artículo dirigido a la revistaScience por el profesor Renato Dulbecco, en el queproponía que una de los medios más eficacespara avanzar en la lucha contra el cáncer erael conocer la secuenciación del GenomaHumano. Es de señalar que aún no se poseíala tecnología adecuada para intentar estegran proyecto. Aunque no se tenían las

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técnicas de hoy día el solo hecho de tener un objetivo claroprovocó un rápido desarrollo de la secuenciación en 13 años enlugar de 15 como calculó Watson en su principio. Curiosamenteahora que se habla tanto de estos descubrimientos se olvidarecordar la gran labor del profesor Severo Ochoa, granenzimólogo que recibió el Premio Nobel por la síntesis de unácido nucléico, por primera vez y por casualidad, en un tubo deensayo. Ello le llevó a interesarse por la Biología Molecular en laque hizo grandes descubrimientos, y en relación con estereunión su participación en una carrera apasionante con elprofesor Niremberg para conseguir entre los dos el códigogenético que es universal, en tres años y medio.

Yo soy también enzimólogo y no genetista pero algunoshechos muy importantes de mi vida hicieron que me interesasepor la Genética. Así mi primer maestro, el profesor José GarcíaBlanco que fue Catedrático aquí en Santiago, trabajase conPhebus Levene quien sugirió que la composición de los ácidosnucléicos estaba formada por purinas y pirimidinas. Muchosaños más tarde, a mi ida a los Estados Unidos, asistí en miprimer seminario en los Estados Unidos a la discusión sobreADN, recién sugerido por McArthy y colaboradores como elvector de la información genética. Luego en la Universidad deKansas donde trabajé durante mucho tiempo, conocí los trabajosde Walter Sutton, cuyas sugerencias son después de Mendel las

más importantes que ha habido en genética hasta lapropuesta de Watson y Crick. Pues bien, a pesar

de la ignorancia inicial sobre el modelo deWatson y Crick, el que se dio pronto cuentade este descubrimiento fue Salvador Dalí,así a los 2 ó 3 años hizo una pintura sobreeste tema y luego continuó con varias otras,

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especialmente la llamada por él “La Escalera de Jacob” querepresenta un ADN al que Dalí identifica con una escalera por lacual se puede llegar al cielo e incluye como ángeles los RNAmensajeros!. Este dibujo es de una gran belleza y recuerdo ver aDalí explicándole al profesor Ochoa su significado.

Finalmente, les repito mi satisfacción por volver a estar conustedes aquí en Galicia, especialmente ya que como Presidentedel Consell Valencià de Cultura conozco el Consello da CulturaGalega que junto con el de Valencia son los únicos Consejos deCultura que hay en España.

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Conceptos Básicos sobreel Genoma y

Retos de la InvestigaciónGenómica

Jaime Gómez MárquezCatedrático de Bioquímica y Biología Molecular

Decano de la Facultad de Biología de la USC

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I.- Conceptos Básicos sobre el Genoma

¿Qué es y dónde se localiza el Genoma?

Es el conjunto del material genético de una especie, de unorganismo o de la célula.

En los organismos eucariotas, donde se incluyen los animales ylas plantas, el genoma se localiza en las células del organismo,dentro del núcleo asociado a proteínas formando la cromatina o loscromosomas; también hay una pequeña parte del genoma que seencuentra en las mitocondrias, unos orgánulos de las célulasespecializados en producir energía. Además, en las plantas existeotra pequeña parte del genoma en los cloroplastos, unos orgánulosde las células vegetales especializados en la fotosíntesis.

En los organismos procariotas, donde se incluyen a lasbacterias y arquibacterias, el genoma se encuentra en elcitoplasma de la célula formando el denominado “cromosomabacteriano”. En los virus, que no tienen estructura celular, elmaterial genético se encuentra recubierto por la cápside viral.

¿Cuál es la naturaleza molecular del Genoma?

La molécula que contiene la información genéticaen todos los organismos de la naturaleza, excepto

en algunos virus, es el ácidodesoxirribonucleico más conocido como ADN(abreviatura en español) o DNA (abreviaturainglesa e internacional).

En el año 2003 se celebra el 5028


Conceptos Básicos sobre el Genoma y Retos de la Investigación Genómica.Jaime Gómez Márquez, catedrático de Bioquímica y Biología Molecular. Decano de la Facultad de Biología de la USC.

aniversario de uno de los descubrimientos más importantes de laHistoria de la Ciencia: la estructura en Dóble Hélice del DNA.Este descubrimiento, realizado por James Watson & Francis Crick,marcó el inicio de una rreevvoolluucciióónn bbiioollóóggiiccaa que ha supuesto uncambio impresionante en la comprensión de la vida y en eldesarrollo de la Biología (especialmente de la Biología Molecular),la Medicina, la Biotecnología y de nuestra Sociedad.

Quisiera mencionar que el Dr. James Watson ha tenido lagentileza de donar un ejemplar de su último libro “DNA: TheSecret of Life” dedicado a la Facultad de Biología de la USC.

¿Cómo se encuentra codificada la informacióngenética?

Las cadenas de DNA se forman por la unión de 4 tiposdiferentes de moléculas denominadas nucleótidos y que seconocen de forma abreviada como AA,, CC,, GG,, TT. Todos los genomasestán formados por combinaciones de estas 4 “letras”. Ejemplode una cadena de DNA: AAAATTCCGGGGTTAACCTTGGCCCCCCCCTTAACCGG

¿Cómo se expresa la información genética?

En términos moleculares el flujo de la información genéticase resume en el Dogma Central de la Biología Molecular que deforma sencilla se resume así:



La información genética se encuentra en el DNA. Dentro delDNA están los genes, que se expresan formando el RNAmensajero en un proceso conocido como la Transcripción. EsteRNA dirige la síntesis de las proteínas en un proceso conocidocomo la Traducción y las proteínas son las principalesresponsables de las funciones vitales de las células y losorganismos.

¿Qué tipos de secuencias de DNA hay en losgenomas?

En la siguiente figura se muestra un diagrama con lasprincipales clases de secuencias de DNA presentes en elgenoma humano y en otros genomas. Entre estas secuenciasestán los genes que podemos definir como la unidad básica de laherencia o como la unidad de información para producir unaproteína o un ácido ribonucleico, es decir, un ARN (abreviaturaen español) o RNA (abreviatura inglesa e internacional).

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II.- El Proyecto Genoma

El Proyecto Genoma Humano

El Proyecto Genoma Humano representa uno de los principalesretos del la Historia de la Ciencia. Pretende conocer al serhumano a su nivel más básico, es decir, el de su informacióngenética para así poder comprender mejor a la especie humana entérminos biológicos. Para ello, el objetivo primario del ProyectoGenoma Humano fue establecer la secuencia (el orden) de losnucleótidos en los 24 cromosomas (22 autosomas más loscromosomas sexuales X e Y) de la especie humana.

En el año 2001 se publicó simultáneamente en las revistasNature y Science el “borrador”completo del genoma humano. Esmuy probable que entre el 2004 y el 2005 se conozca, casiperfectamente, la secuencia completa de todos los cromosomas.Sin duda, el conocimiento del genoma humano es un hitofundamental en la historia de la ciencia y marca el nacimiento dela Era Genómica.

Algunos datos sobre el Genoma Humano

1. Contiene aproximadamente 3100 millones de nucleótidos(A,C,G,T).

2. El número exacto de genes de laespecie humana no se sabe, pero podríaestar entre 30000-40000. Esta parte delgenoma con capacidad para codificarproteínas equivale ~ 1-2% del total del

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genoma. Es decir, la inmensa mayoría del genoma no forma partede los genes.

3. Las personas comparten aproximadamente el 99.9% desus genomas entre sí.

4. El genoma humano tiene mucho más DNA no codificador(no forma parte de los genes) que los genomas conocidos deotros animales.

5. La parte del genoma no codificadora está compuesta ~50% por DNA repetitivo. Este DNA a veces se llama DNA“basura”. Sin embargo, emplear esta terminología es un error ysimplemente refleja nuestra ignorancia. Cada vez es más obvioque este tipo de DNA juega un papel importante en la estructuray dinámica de los genomas.

Los otros Proyectos Genoma

Hay otros Proyectos Genoma, ya finalizados o en marcha,que están dirigidos principalmente hacia el conocimiento delgenoma de especies de gran relevancia en la investigaciónbiológica. El análisis de estos genomas será esencial para elestudio de la evolución y funcionamiento de los genomas.

Hasta el presente se han secuenciadocompletamente más de 100 genomas, lamayoría de organismos procariotas(bacterias y arquibacterias) y virus. Entrelas especies que se emplean comoorganismos modelo en las investigaciones

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biológicas y biomédicas cuyo genoma ha sido secuenciadoprácticamente en su totalidad están las siguientes:

Entre los proyectos genoma que se están realizando en estosmomentos destaca el del Chimpancé (Pan troglodytes) ya que esnuestro pariente evolutivo más próximo. Pronto podremos saberlo que nos diferencia de este primate y así comprenderemosmejor el origen evolutivo de nuestra especie, el Homo sapiens.

Algunos datos sobre Genómica Comparativa

1. El genoma humano es ~ 25 veces mayor que el genomade la mosca Drosophila y ~ 200 veces mayor que el de la

levadura de la cerveza Saccharomyces cerevisiae.

2. El número de genes de la especiehumana es “solamente” de 2-3 veces mayorque el de la mosca Drosophila y muy similaral número de genes de ratón.34



3. Aproximadamente el 99% de los genes de ratón tienen suequivalente en el genoma humano.

4. La diferencia entre los genomas humano y de chimpancépuede estar alrededor del 1.2%.

Bibliografía más destacada:

1.- International Human Genome Sequencing Consortium. Nature, vol.

409, pag. 860-921 (2001) Este artículo está en el nº de la revista científica

Nature dedicado fundamentalmente a la publicación del primer borrador del

genoma humano .

2.- Venter, J. C. et al. The Human Genome. Science, vol. 291, pag.

1304-1351 (2001). Este artículo está en el nº de la revista científica Science

dedicado fundamentalmente a la publicación del primer borrador del genoma

humano conseguido por la empresa Celera Genomics.

3.- Mouse Genome Sequencing Consortium. Nature,

vol. 420, pag. 520-590 (2002).

4.- El genoma humano se puede consultar en la

página web http://ensembl.org

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III.- Retos de la Investigación Genómica

A) En relación con el desarrollo de la Biología

OBJETIVOS PRINCIPALES:

1. Identificar el número real de genes y de proteínas (elProteoma) así como los elementos reguladores de la expresióngénica y los elementos estructurales implicados en la dinámicacromosómica

2. Establecer las interacciones entre genes (redes degenes) y entre proteínas (señalización celular y rutasmetabólicas) necesarias para modular la actividad celular ygenerar el fenotipo de los organismos

3. Conocer la variabilidad del genoma (polimorfismo),especialmente en las poblaciones humanas, lo que facilitará entender

las relaciones entre genotipo y función

4. Analizar las semejanzas ydiferencias entre los genomas de diferentesespecies (Genómica Comparativa)

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B) En relación con la Salud


1. Desarrollar estrategias para identificar la base genética delas enfermedades y de la respuesta a drogas o medicamentos

2. Identificar las variantes genéticas que contribuyen a unabuena salud y a la resistencia a enfermedades

3. Desarrollar sistemas de predicción de susceptibilidad aenfermedades, de diagnóstico precoz y de respuesta a fármacosu otro tipo de drogas

4. Desarrollar nuevos sistemas terapéuticos (Terapia Génica yFarmacogenómica)

5. Aplicar en la Medicina Preventiva tambiénlos conocimientos del genoma

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C) En relación con la Sociedad


1. Promover una legislación que evite que la informaciónsobre el genoma pueda producir discriminación social o laboral yque se haga un uso indebido de los avances de la genómica

2. Desarrollar políticas que faciliten la difusión de lainformación del genoma tanto a la comunidad científica como ala sociedad (importancia de los medios de comunicación)

3. Fomentar la educación en todos estos aspectos yestablecer un debate racional sobre los límites éticos de lasinvestigaciones relacionadas con el genoma

Bibliografía más destacada:

1.- The double helix - 50 years. Nature, vol. 421,

pag. 396-453 (2003)

2.- Collins, F. et al. A vision for the future of

genomics research. Nature, vol. 422, pag. 835-847

(2003).38



IV.- Nuestra Investigación en el GenomaHumano

Desde el año 1984, estamos investigando un tipo desecuencias repetitivas del genoma humano, denominadasMinisatélites (secuencias de DNA repetidas en tandem).Durante estos años hemos descubierto 3 nuevos minisatélitesdenominados MsH42, MsH43 y MsH44.

11)) EEll mmiinniissaattéélliittee MMssHH4422 ddeell GGeennoommaa HHuummaannoo::- Es muy poco polimórfico (existen 3 alelos), reconocido

por proteínas y presenta la capacidad de “slippage”(deslizamiento durante la replicación).

- Es capaz de promover la recombinación homólogaintramolecular in vitro.

- El origen evolutivo de esta secuencia tuvo lugar cuandose originaron los primates, aproximadamente hace 40 millonesde años. El chimpancé tiene la secuencia más parecida a lahumana.

Los resultados de estas investigaciones han sido publicadosen:

FFEEBBSS LLeetttteerrss vol. 418, pag. 251-257 (1997)JJoouurrnnaall MMoolleeccuullaarr BBiioollooggyy vol.278, pag. 499-505 (1998)BBiioocchheemmiissttrryy vol.41, pag. 2166-2176 (2002)MMoolleeccuullaarr BBiioollooggyy aanndd EEvvoolluuttiioonn vol.21, pag.

228-235, (2004)

22)) EEll mmiinniissaattéélliittee MMssHH4433 ddeell GGeennoommaaHHuummaannoo::

La investigación sobre este minisatéliteestá comenzando a dar los primeros

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resultados, destacando dos resultados muy relevantes: i) sucapacidad de formar cuadruplexes, es decir estructuras de 4cadenas cuando lo normal son estructuras dúplex (2 cadenascomo la doble hélice) y ii) su reconocimiento por proteínas delcerebro.

33)) EEll mmiinniissaattéélliittee MMssHH4444 ddeell GGeennoommaa HHuummaannoo:: Todavía está prácticamente sin analizar pero datos

preliminares sugieren que está alterado en pacientes condeterminados tipos de cáncer:



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Uso de animalesmodificados genéticamente

para el estudio deenfermedades en el

hombre

Juan Bautista Zalvide Torrente. Departamento deFisiología. Universidade de Santiago de Compostela.

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Hoy voy a hablar principalmente del ratón, de su utilidad eninvestigación biomédica, y de cómo puede ayudarnos a descifrarel significado de la secuencia que hemos obtenido gracias alproyecto genoma humano. También hablaremos de suslimitaciones en este respecto, y de posibles alternativas a su usoen la búsqueda de funciones de los genes que son parte delgenoma.

Hay dos formas principales en las que el ratón puedeayudarnos a descifrar el significado del genoma. La primeradepende de la secuenciación del genoma del propio ratón. Eldisponer de la secuencia genómica de un segundo mamíferohace posible su comparación con la secuencia humana, y laidentificación de nuevos genes gracias a ella. A pesar de lautilidad de esta estrategia, hoy no hablaré de ella, sino de lautilización del ratón como herramienta para el estudio de lafunción de los genes.

Una de las formas de empezar a conocer la función de un genes estudiar los efectos de su sobreexpresión, y para hacerlo invivo, el modelo de elección es por supuesto el ratón transgénico.Hay varias formas de crear un ratón transgénico, aunque novamos a entrar en ellas. Lo importante es que una vezconseguimos sobreexpresar un gen en el ratón, podemosobservar sus efectos. En la figura 1A se muestra uno de los

primeros ratones transgénicos que se desarrollaron(1), que sobreexpresa el gen de la hormona de

crecimiento (GH). El ratón es claramentemayor que sus equivalentes normales, lo quees un indicación clara que la hormona decrecimiento sirve realmente para crecer. Elproblema con este tipo de aproximación es

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Uso de animales modificados genéticamente para el estudio de enfermedadesen el hombreJuan Bautista Zavilde Torrente. Departamento de Fisiología. Universidade de Santiago de Compostela

que nos puede conducir a error con mucha facilidad. Unaproteína sobreexpresada puede tener efectos que no tengannada que ver con las acciones de esa proteína enconcentraciones normales. En realidad, la mejor forma dedescubrir la función de un gen es eliminarlo y estudiar el efectoque resulta de ello. Para esto el ratón es una herramienta casiinsustituible. De hecho es el único mamífero donde hoy por hoyse pueden eliminar genes prácticamente a voluntad. Esto seconsigue gracias a la generación de los ratones llamadosknockout por recombinación homóloga. Sin entrar en detallessobre el procedimiento, debe quedar claro que es muy laboriosoy que requiere en varios de sus pasos equipo muy costoso y muyespecífico. El resultado sin embargo, ha supuesto una auténticarevolución en la investigación biomédica. Es un procedimientomuy poderoso para el estudio de la función de genes. En lafigura 1B vemos en el centro un ratón al que se le ha eliminadoel gen del receptor de la hormona de crecimiento (2). Su aspectoya es una indicación clara de la importancia de este gen en elcrecimiento del animal.

Los ratones modificados genéticamente no sólo nosproporcionan información importantísima sobre la funcióngénica. También constituyen modelos de enfermedades humanaso de estados fisiológicos importantes, que permiten responder auna gran cantidad de preguntas que no serían abordables sinellos.

Como ejemplo me gustaría mencionar elratón knockout para p53 (3), que tiene unasusceptibilidad grande a padecer muchostipos distintos de cáncer. Además dedemostrar que p53 es un gen supresor de

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tumores, este ratón nos permite realizar experimentos sobrecarcinógenos, tratamientos, susceptibilidad al cáncer, etc., queno serían posibles sin él. En este momento la utilización de estetipo de ratones es ubicua en los laboratorios de investigaciónbiomédica. Sin ir más lejos, en el Departamento de Fisiologíatrabajamos ahora con siete genotipos distintos de ratonesknockout. Hay que tener en cuenta que además de los genotiposoriginales, se pueden obtener prácticamente todas lascombinaciones posibles de varios de los genes, lo que multiplicael número de animales. Esto supone una demanda sobre losanimalarios, tanto en superficie como en infraestructuras, quevamos a necesitar resolver en el futuro inmediato.

La reunión de hoy tiene como motivo la genómica, más que lainvestigación biomédica en general. Por eso debemospreguntarnos si los ratones knockout son una herramienta útil paraabordar la función génica desde una perspectiva genómica, esdecir, sistemática. Es difícil que lleguemos a generar knockouts detodos los genes del ratón, por las dificultades técnicas queconllevaría, por lo que debemos buscar alternativas para inactivargenes de una forma que no comporte tanto tiempo y esfuerzo.

En este sentido, es prometedora la técnica de interferenciade RNA (RNAi). El fenómeno de la interferencia de RNA sedescubrió en el nematodo C. elegans, donde se descubrió que la

inyección de RNA bicatenario con la secuencia de ungen endógeno inducía la degradación del mRNA

de ese gen (4). Hoy día sabemos que elmecanismo de acción de la RNAi implica lainteracción del RNA entrante con uncomplejo proteico llamado Dicer, que cortael RNA en fragmentos pequeños, de 21

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nucleótidos (5). Estos fragmentos se unen a un segundocomplejo, DISC, y median la degradación del RNA diana. Ladilucidación de este mecanismo fue muy importante, porque hizoposible la utilización de fragmentos pequeños de RNA, de 21nucleótidos, en lugar de los grandes fragmentos que se usabanhasta el momento. Esto es importante, porque el RNAbicatenario grande provoca en células de mamífero unarespuesta antiviral tal que hace imposible su utilización. Encambio, los fragmentos pequeños no provocan tal respuesta y síque se pueden utilizar en mamífero.

Nosotros estamos utilizando esta técnica de siRNAs ennuestro laboratorio, y tenemos en diferentes fases elsilenciamiento de cinco genes diferentes, lo que da una idea dela capacidad de multiplicar el número de genes que se estudian,con respecto a los ratones knockout. Utilizamos varias técnicas,bien transfectando RNA doble sintetizado in vitro, bienintroduciendo en las células plásmidos o retrovirus capaces deproducir RNAs activos en la RNAi. Para esto utilizamos vectoresque producen RNAs en horquilla, que se han demostrado activosen RNAi. Como muestra voy a enseñar un experimento quedemuestra e eficacia de uno de estos RNAs. En la figura 2vemos un western de la proteína p16 en células tumoraleshumanas, que han sido transfectadas con un vector que producesiRNA para p16, un siRNA irrelevante (contra la luciferasa, unenzima que no existe en células humanas), o no hansido transfectadas. Como se ve, a medida quepasan los días tras la transfección disminuyenlos niveles de p16.

Por tanto, los siRNAs pueden ser unaherramienta muy útil para conocer la función

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de un gran número de genes. Entre sus ventajas se encuentransu economía y relativa sencillez técnica, que hacen posible susistematización. Además se puede aplicar a células humanas, almenos en cultivo. Tiene en cambio como desventajas que elefecto es temporal, que inducen sólo un silenciamiento génico, yno una eliminación completa del gen en cuestión, y que sondifíciles de aplicar in vivo, aunque esto ya se está empezando aconseguir. Me gustaría resaltar que algunas de estasdesventajas son convenientes para una aplicación concreta, lavalidación de dianas de fármacos. La acción temporal y nocompleta de los siRNAs emula la acción de un fármaco que actúecontra una proteína determinada, que no va a eliminar su funciónde forma permanente ni probablemente completa.

Bibliografía

1. Palmiter y cols. (1982) Nature 300: 611-5.

2. Zhou y cols. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 13215-20.

3. Donehower y cols. (1992) Nature 356: 215-21.

4. Fire y cols. (1998) Nature 391: 806-11.

5. Bernstein y cols. (2001) RNA 11: 1509-21.

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Figuras

Figura 1. A. Ratón transgénico para hormona de crecimiento(GH) (izquierda), junto a ratón no modificado. B. Ratón knockoutpara el receptor de GH centro), junto a ratones que expresan el gen.

Figura 2. Silenciamiento génico de p16 por interferencia deRNA por RNAs pequeños (siRNAs). Se muestra un ensayo tipowestern de la proteína p16 en células tumorales humanas(SaOS-2). Como se ve, las células sin transfectar (control)tienen niveles altos de p16, que no se afectan al sertransfectados con un siRNA irrelevante (contra el enzimaluciferasa, que estas células no expresan). La transfección conun siRNA contra p16 (siRNA p16), induce una disminución de laexpresión de p16 entre los 2 y los 6 días tras la transfección.

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La Medicina Genómica:desde el Laboratorio de

Investigación a la cama delPaciente

Fernando Domínguez1,2, Lourdes Loidi, FranciscoBarros y Ángel Carracedo1,3

1 Unidad de Medicina Molecular, INGO, CHUS yDepartamento de Fisiología2 y Departamento de

Anatomía Patológica y Ciencias Forenses3, Facultad deMedicina , Universidade de Santiago de Compostela

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La genética molecular ha tenido un desarrollo tan enormeque las repercusiones de sus hallazgos transcienden loslaboratorios de investigación para alcanzar la cama del enfermo.En efecto, en la última década, la comunidad científicainternacional utilizando, fundamentalmente, técnicas degenética molecular ha podido identificar miles de alteracionesgénicas responsables de patologías humanas. Ese esfuerzo haservido para crear un catálogo de alteraciones génicas(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/) que se aplica actoseguido en la clínica para diagnosticar a los pacientessospechosos de padecer una patología genética. La demanda deeste tipo de pruebas desde el ámbito asistencial ha crecidoexponencialmente y ha llevado a la creación de laboratoriosdedicados exclusivamente al diagnóstico genético con finesclínicos. Galicia fue una de las comunidades españolas pionerasen organizar este tipo de actividades dentro del sistema públicode salud. Por iniciativa de la Consellería de Sanidade y delProfesor Sánchez Salorio se creó la Unidad de MedicinaMolecular (UMM) integrada en la Fundación Instituto Gallego deOftalmología. La Unidad de Medicina Molecular, sita en elCHUS pero con personal e infraestructuras de la Universidad deSantiago de Compostela, es un ejemplo de colaboración entreestructuras hospitalarias y universitarias lo que resulta en unaimportante actividad asistencial y de I+D.

Desde su apertura en Enero de 1997 la UMM harealizado más de 10.000 informes solicitados por

76 centros públicos y privados,fundamentalmente de Galicia. La figura 1refleja el crecimiento anual de solicitudesdesde la fundación de la UMM. Con uncrecimiento medio de aproximadamente un

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La Medicina Genómica: desde el Laboratorio de Investigación a la cama del PacienteFernando Domínguez Puente y otros, departamento de Fiosiología, facultad de Medicina de la USC

20%, el aumento de la demanda se debe fundamentalmente ados factores. Por una parte cada vez son más las especialidadesmédicas que solicitan pruebas. Buen ejemplo de ello es quemientras en 1998 la UMM ofertaba la posibilidad de analizarcuarenta y dos patologías diferentes hoy superamos el centenar.El otro factor que ha influido decisivamente en el crecimiento dela UMM ha sido el incremento en el número de centrossolicitantes (figura 2). Es digno de ser destacado el hecho deque la gran mayoría de centros hospitalarios gallegos sonusuarios de la UMM. Debemos concluir, por tanto, que losprofesionales de la salud tienen un conocimiento muy extendidode la nuevas tecnologías como indica el grado depenetración que la UMM ha tenido en la redhospitalaria gallega.

La Medicina Molecular es una disciplinaemergente que se está desarrollando a granvelocidad pero que no está igualmente

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implantada en las distintas especialidades médicas. Aunqueprácticamente todos los servicios solicitan o pueden solicitarpruebas genéticas, hay una gran diferencia entre unos y otros encuanto a la frecuencia con que se realizan tales consultas (TablaI). El grado de introducción de los análisis genéticos, así como suutilidad, es variable según la especialidad (Tabla I). Hayespecialidades como la Hematología en la que la contribución dela UMM está bien establecida. Hay por el contrario otras comola Anatomía Patológica donde es necesario establecerprotocolos consensuados para valorar la repercusión de la UMMy, por fin, existen especialidades como la Nefrología donde laparticipación de la UMM decrece ya que un gran número de

familias gallegas con estas patologías han sido yaestudiadas y, es que, las patologías hereditarias

tienen una muy baja incidencia. Es difícil, puesestablecer la demandas de estos serviciospor la sanidad pública teniendo en cuentaque además es imposible saber cuantasenfermedades genéticas mendelianas van a

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detectarse en Galicia dada la baja incidencia de las mismas.Estas dificultades limitan el desarrollo de protocolos por lo queel catálogo de pruebas que la UMM oferta es muy variable. Todoello requiere la necesidad de una continua renovación, tanto delcatálogo de pruebas como de las tecnologías utilizadas, queexige rigurosos controles de calidad y la participación enprogramas de control de la misma.

En los últimos años la UMM se habeneficiado del enorme avance tecnológicoque el programa Genoma Humano hasupuesto. La secuenciación automática degenes es hoy una realidad que ha permitidoabordar de forma rutinaria el estudio de



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genes que por su complejidad resultaba imposible hacerlo haceun lustro. Los nuevos avances de la especialidad en relación conel diagnóstico de las enfermedades genéticas simples pasan porla implantación de protocolos consensuados sobre cuando ycomo se deben hacer el diagnóstico molecular y el desarrollodel consejo genético. Es necesario desarrollar los mecanismosadministrativos que permitan regular adecuadamente estaactividad en la sanidad pública.

Si bien es cierto que se ha podido dar una respuestaaceptable al desafío tecnológico que suponen el diagnóstico delas enfermedades genéticas, todavía queda mucho por hacer a lahora de: a) diagnosticar enfermedades genéticas complejas; b)tratar de predecir la evolución de un paciente en un estadioinicial de la enfermedad y conocer su repuesta a diferentestratamientos antes de que se instauren; en fin, establecer lasconsecuencias médicas que puedan tener la diferenciasgenéticas existentes en una población. La tarea a la que nosenfrentamos en un futuro inmediato es desarrollar tecnologíasque de forma fiable y rápidamente permitan analizar lasvariables génicas o polimorfismos propios de cada individuo quetengan interés médico. Aunque afortunadamente sólo el 0.1 %de nuestro genoma varía entre individuos, teniendo en cuenta eltamaño total del genoma, unos 3.000 millones de pares debases, la tarea de estudiarlo exhaustivamente es muy ardua. Es

necesario, por tanto, reducir el número depolimorfismos que se estudian. La comunidad

científica inicialmente ha apostado -pordiversas razones que no vienen al caso- porlos polimorfismos de una sola base o SNPs.Se ha hecho ya una base de datos en dondese recogen todos los SNPs conocidos y

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aquellos que desde un punto de vista médico tienen un mayorinterés. Un gran avance que facilita mucho la aplicación rutinariade estos polimorfismos ha sido comprobar que los SNPs seheredan en bloque. Basta determinar un número reducido deSNPs de un gen para conocer todo el conjunto de SNPs de esegen (al conjunto de los SNPs se le denomina haplotipo) porquelos SNPs que forman un haplotipo se heredan conjuntamente.Desde un punto de vista práctico se calcula que el estudio de500.000 SNPs será suficiente para analizar las diferencias másrelevantes entre individuos. Ello supone un avance importante yaque reducimos el genoma, 3 mil millones de bases, a 500.000bases. Sin embargo queda mucho por hacer: en primer lugar esnecesario crear una base de datos que identifique aquelloshaplotipos relevantes desde un punto de vista médico. Para ellose está desarrollando un nuevo proyecto internacional de granalcance, el proyecto MapVar, continuación del proyecto HapMap(la creación del mapa de haplotipos, http://www.genome.gov/)en el que nuestro grupoparticipará como uno de los tres nodosdel Centro Nacional de Genotipado, creado por Genoma Españapara desarrollar proyectos de biomedicina mediante análisisgenotípicos. Además de incorporar en nuestro entornoplataformas de genotipado masivo, esta experiencia nospermitirá establecer que tecnologías son las más robustas paraimplantarlas en la práctica clínica. Y, por último y más importantenos queda por saber hasta que punto todo estos avances setraducirán en un beneficio real para los enfermos.Sólo el futuro tiene la respuesta, lo que sipodemos asegurar es la UMM de Galicia seencuentra preparada para hacer frente aestos desafíos.

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El uso de la nuevabiotecnología en eldescubrimiento de

fármacos

María Isabel Loza García. Departamento deFarmacología. Universidade de Santiago de Compostela

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A finales del siglo XIX, la industria química alemana de loscolorantes producía cientos de nuevos compuestos. Por esaépoca, Paul Ehrlich (Premio Nóbel de Medicina en 1908), sesentía fascinado por los colorantes y soñaba con teñirselectivamente los microorganismos patógenos y quizásmatarlos, sin daño para las células del huésped.

Del colorante azul de metileno se pasó desde el rojo triptan,al atoxil, el salvarsan, el prontosil… hasta las sulfamidas. Pero elsueño de Ehrlich culminó con el descubrimiento de la penicilina,el fármaco estrella del siglo XX, que supuso un antes y undespués en la farmacología antiinfecciosa. Descrita porAlexander Fleming en 1928, se anunciaba en los carteles de lafábricas de penicilina durante la Segunda Guerra Mundial comoel nuevo fármaco que salva la vida.

La apasionante aventura de buscar nuevas formas de curarcon fármacos sigue mejorando la calidad de la vida humana. Enlos últimos años, se han descubierto fármacos convencionales(de bajo peso molecular) como la fluoxetina (ProzacTM, inhibidorselectivo del recaptador de serotonina) que mejorósustancialmente la calidad de vida de los pacientes tratados conantidepresivos, o el sildenafilo (ViagraTM, inhibidor defosfodiesterasa 5) la de los pacientes con disfunción eréctil. Delmismo modo, el descubrimiento de fármacos biotecnológicos,

como el etanercept (EnbreTM, receptor soluble) y elinfliximab (RemicadeTM , anticuerpo monoclonal)

que inhiben la actividad biológica del factor denecrosis tumoral (TNF-α) cambiaron lasperspectivas de vida de los pacientes conenfermedad de Crohn y con artritisreumatoide; el imatinib (GleevecTM, un

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El uso de la nueva biotecnología en el descubrimiento de fármacos.María Isabel Loza García. Departamento de Farmacología. Universidade de Santiago de Compostela

inhibidor de protein-tirosin kinasas) cambió la de los pacientescon leucemia mieloide crónica.

Es más, desde que en junio de 2001 se anunció que se habíacompletado el borrador del genoma humano, surgió unaapasionante expectativa, con el acceso a la informacióngenómica como medio de acelerar, tanto la comprensión de lascausas de la enfermedad, como el descubrimiento de fármacos,guiados por la explosión proteómica que se predice que existenentre 200.000 y dos millones de proteínas, codificadas por los 30a 40.000 genes humanos.

Ello vendría a apoyar la idea de que el descubrimiento defármacos ha sido, hasta ahora, una historia de éxitos. En efecto,entre 1965 y 1996 la disminución en la relación de muertes con lostratamientos farmacológicos muestra cifras espectaculares: un83% en fiebres reumáticas y enfermedad cardiáca, un 74% enarterioesclerosis, un 72 % en úlceras de estómago y duodeno, etc.

Sin embargo, la continuación de esta cadena de éxitos se estáinterrumpiendo ante las perspectivas del incremento masivo decostes de investigación y desarrollo (I+D) de los fármacos, loscuales se encuentran en un proceso de crecimiento tal, queresultan difíciles de asumir. El coste de sacar un nuevo fármaco almercado estaba por debajo de los 150 millones de dolares en ladécada de los 70, en torno a 500 millones de dólares en1990 (contabilizando la investigación fracasada) y,ha pasado en la actualidad a más de 800millones, con una media de 15 años deinvestigación. Estas cifras sirven comoindicador del hecho de que la industriafarmacéutica está muy condicionada por la

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rentabilidad en las prioridades de su actividad de I+D, con lo queeso significa, por ejemplo, en la búsqueda de nuevos fármacos enenfermedades poco frecuentes.

La opción que se impone al problema del excesivoencarecimiento de los costes es la aplicación de las nuevasherramientas y tecnologías genómicas, con ellas, cálculosrealistas estiman que se podría reducir el coste en torno a 300millones de dólares y el proceso en mas de dos años en eltiempo.

En los últimos años hemos asistido a la llegada de losllamados medicamentos biotecnológicos, desde las primerasproteínas recombinantes humanas, insulina, hormona decrecimiento, interferones, etc; obtenidas mediante tecnologíasde clonación (algunas de las cuales, como la hormona delcrecimiento, hasta hace pocos años dramáticamente escasas yhoy con tal facilidad de obtención que se proponen nuevasindicaciones), pasando por el uso de anticuerpos y receptoressolubles (anteriormente comentados), hasta conceptos conmenor validación clínica, como la terapia génica.

No obstante, la gran mayoría de los medicamentos continúansiendo fármacos de bajo peso molecular, probablemente porqueresultan más fáciles de sintetizar, de hacerlos biodisponibles por

vía oral y de predecir sus niveles plasmáticosterapéuticos y tóxicos y, por ello, de prevenir sus

reacciones adversas.

El paradigma clásico en el proceso dedescubrimiento de fármacos consta devarias fases secuenciales: identificación de

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nuevas dianas terapéuticas, validación in vitro en in vivo deestas dianas y, posteriormente, selección de moléculas activasen ellas, hasta la obtención de fármacos candidatos al desarrollopreclínico y posterior evaluación clínica de su seguridad yeficacia. Las últimas fases de esta evaluación clínica se realizanya con el fármaco en el mercado.

Las nuevas herramientas biotecnológicas han permitidocambiar el paradigma: la asociación en la búsqueda de nuevasdianas terapéuticas de la farmacogenómica, lafármacoproteómica y la toxicogenómica, junto con lacombinación de las técnicas de alto rendimiento en el cribado decompuestos (high-throughput screening, HTS), la químicacombinatoria y la bioinformática, permiten el abordajesimultáneo de los procesos de identificación y validación dedianas terapéuticas, con los de producción de fármacoscandidatos, acortando sustancialmente el proceso de I+D defármacos.



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Por último, las nuevas tecnologías genómicas y proteómicas,además de permitir obtener fármacos biotecnológicos, permitenplantear nuevas estrategias moleculares en el diseño defármacos de bajo peso molecular, con mecanismos de acción demuy elevada especificidad. Un ejemplo de esto último son losresultados de distintas disciplinas científicas que demuestranque las proteínas existen como un conjunto de diferentesconformaciones en equilibrio, susceptibles de mediar distintasfunciones, con diferentes afinidades y eficacias por losfármacos. Este es el caso de los receptores acoplados aproteínas G, mecanismo por el que actúa una parte mayoritariade los fármacos actuales. La existencia de selectividadconformacional abre la posibilidad de diseñar fármacos quemodifican sólo porciones del comportamiento de un receptor,una promesa de eficacia terapéutica específica con una mínimaalteración del funcionamiento celular en términos de reaccionesadversas. Esta posibilidad requiere de tecnologías sistemáticasde estudio conformacional en el descubrimiento de fármacos conselectividad basada no sólo en el genotipo, sino también en elfenotipo. Estas tecnologías y su aplicación a la obtención defármacos con selectividad conformacional constituyen elpróximo reto en la farmacología de receptores.

En conclusión, el paradigma derivado del uso de las nuevabiotecnología en el descubrimiento de fármacos permite, a)

obtener nuevos medicamentos biotecnológicos; b)acortar el tiempo y el coste de obtención de los

medicamentos convencionales de bajo pesomolecular y, c) utilizar nuevas estrategiaspara obtener medicamentos de bajo pesomolecular mas específicos y con menosreacciones adversas.

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Este nuevo paradigma es el que se aplica en la Universidadde Santiago de Compostela, en los equipos multidisciplinaresque aunamos esfuerzos y recursos experimentales y clínicos enI+D de fármacos, con éxito en la publicación de resultadosinnovadores y de patentes de cobertura mundial, apoyados porrecursos públicos, tanto europeos como nacionales y/odirectamente financiados por compañías farmacéuticas lideresen el sector.

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Investigación de losfactores genéticos de lasenfermedades complejas(con especial referencia a

las enfermedadesautoinmunes).

Dr. Antonio González Martínez-Pedrayo.Laboratorio de Investigación 2. Reumatología.

Hospital Clínico Universitario de Santiago.

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Factores genéticos en las enfermedadescomplejas

La investigación de los factores genéticos que predisponen alas enfermedades complejas es un área de gran interés ya queen los próximos años se van a descubrir con toda probabilidad ungran número de estos factores y de esta forma se va a contribuiral control de muchas enfermedades. En esta breve revisión seanaliza el estado actual de la investigación con especialreferencia a las enfermedades autoinmunes.

En primer lugar, es necesario aclarar en qué sentido se utilizael nombre de enfermedades complejas en la investigacióngenética. Para ello, resulta más sencillo comenzar por lo que sedenominan, en este contexto, enfermedades simples.Enfermedades como las enfermedades infecciosas, lasenfermedades hereditarias clásicas y las lesiones causadas portraumatismos o por exposición aguda a agentes tóxicos seconsideran enfermedades simples. Esto es enfermedades que secaracterizan por tener una causa única, o al menos, una causaprincipal identificable.

Por el contrario enfermedades complejas son todas aquellasen las que no existe una causa única identificable sino toda unaserie de factores de riesgo que contribuyen a la enfermedad.

Entre ellas se encuentran las enfermedades másfrecuentes y las que suponen una mayor carga

social como: la enfermedad isquémicacardiaca, las enfermedades cerebrovasculares,la enfermedad de Alzheimer, la artrosis, elcáncer, ...y la mayor parte de lasenfermedades autoinmunes, como la psoriasis,

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Investigacion de los factores genéticos de las enfermedades autoinmunes complejasAntonio González Martínez-Pedrayo, Laboratorio de Investigación 2. Reumatología. Hospital Clínico Universitario de Santiago.

la enfermedad de Graves, la artritis reumatoide, la diabetes tipo1, el vitíligo,...

Todo parece indicar que en estas enfermedades no existe unacausa principal sino que son la consecuencia de una serie defactores actuando conjuntamente. Sin embargo, es necesarioconsiderar que la investigación futura puede demostrar quealgunas de las enfermedades que ahora consideramos complejasen realidad tienen una causa principal identificable que no hasido descubierta todavía. Un ejemplo claro y bien conocido deeste cambio conceptual es el de la úlcera péptica que ha dejadode considerarse una enfermedad compleja desde el momentoque se descubrió que la infección por Helicobacter pylori es elfactor causal crítico [1].

Los factores de riesgo que contribuyen a las enfermedadescomplejas son en gran medida desconocidos. Para su estudio sedividen en ambientales y genéticos. Algunos de los factores deriesgo ambientales han sido identificados por la investigaciónepidemiológica desde hace años. Los factores ambientalesrelacionados con las enfermedades más comunes son bienconocidos por la población, como el tabaquismo para el cáncerde pulmón y otros tipos de cáncer, la exposición a los rayosultravioleta para el cáncer de piel, ... Los factores de riesgogenéticos han sido menos estudiados y son menos conocidos anivel general, aunque en los últimos años se estáproduciendo un gran incremento en la cantidad yla calidad de los estudios genéticos de formaque el número de los factores genéticosconocidos aumenta continuamente. Algunosde los más conocidos son las mutaciones enlos genes BCRA1 y BCRA2 para el cáncer

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de mama, una variante del gen APOE para la enfermedad deAlzheimer; y en el campo de las enfermedades autoinmunes, elejemplo más conocido es el de determinados alelos de lasmoléculas del complejo mayor de histocompatilibilidad o HLA. Larelación del HLA con las enfermedades autoinmunes seestableció por primera vez hace más de 25 años por métodosque no dependían de la biología molecular. Desde entoncesapenas se identificaron otros factores genéticos desusceptibilidad para las enfermedades autoinmunes complejashasta que en los últimos años el incremento en el conocimientodel genoma humano ha permitido su estudio sistemático.

Para interpretar correctamente la relación entre los factoresgenéticos y las enfermedades complejas hay que comprenderque esta relación no es univoca y que, por lo tanto, muchosindividuos sanos van a tener las variantes genéticas desusceptibilidad y del mismo modo no todos los pacientes van atener todos los factores genéticos de susceptibilidad para laenfermedad que padecen. Por eso sólo se puede hablar conpropiedad de factores genéticos de predisposición o desusceptibilidad pues lo que hacen es influir la probabilidad depadecer la enfermedad. De forma similar aunque lasenfermedades complejas son más frecuentes entre los familiaresde los pacientes que en la población general, muchos de loscasos son esporádicos, esto es que no tienen ningún familiar

afecto. Incluso en las familias en las que hay variosindividuos que padecen la misma enfermedad

compleja no se observa un patrón de herenciadefinido (Figura 1). Todas estascaracterísticas diferencian a lasenfermedades complejas en las que existeun componente genético de las

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enfermedades hereditarias y complican la identificación de losfactores genéticos involucrados.

Identificación de los factores genéticos

¿Cómo se pueden identificar las variantes genéticas quecontribuyen a las enfermedades complejas en la inmensidad delgenoma? No es fácil. El primer objetivo es identificar regionesdel genoma que se hereden asociadas con la enfermedad enfamilias multicaso, con más de un paciente, mediante estudiosde genoma completo [2].

Este tipo de estudios sólo ha sido posible gracias aldesarrollo de mapas genéticos del genoma humano (Figura 2).Los mapas genéticos contienen información sobre la posiciónrelativa en cada uno de los cromosomas de marcadoresgenéticos. En la figura 2 se muestran alineados tres mapasgenéticos del cromosoma 1. Cada uno de los trazos horizontalescorresponde a uno de los marcadores que definen el mapa. Estosmarcadores son secuencias de DNA muy variables: la mayoríade los individuos somos diferentes en estos marcadores, lo quepermite seguir con facilidad como se heredan en los estudios defamilias. Estos mapas genéticos son un paso previo alconocimiento de la secuencia pues es posible conocerla posición de los marcadores sin saber que hayentre ellos.

Un estudio de ligamiento de genomacompleto (Figura 3) analiza como seheredan unos 300 marcadores de un mapa

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genético, seleccionados de forma que cubran el genoma con unespaciado regular, en una colección de familias multicaso. Estetipo de estudios permite obtener gráficos como el que semuestra en la figura 3. En estos mapas se representa laintensidad de la relación entre cada uno de los cromosomas y laenfermedad. En el eje de abscisas se representan las posicionesa lo largo de cada uno de los cromosomas y en el eje deordenadas una medida de la intensidad de la relación con laenfermedad. Observando esta figura es fácil ver que hayalgunos picos claramente evidentes en los que probablementese encuentren factores genéticos de susceptibilidad, como lospicos en el cromosoma 6 y el cromosoma 16. Pero al mismotiempo se observa que hay otras zonas en las que puede queexista una relación pero los resultados del estudio no sonconcluyentes como en los cromosomas 14 y 20 y todavía otrasmás dudosas (como en los cromosomas 1, 2, 3, 4, 11 y 15).

El primer mapa genético del genoma humano se publicó en1987 [3] y el primer estudio de ligamiento de genoma completofue realizado en 1992 [4]. Se trataba de una enfermedadhereditaria simple la fiebre mediterránea familiar que esautosómica recesiva. Los primeros estudios en una enfermedadcompleja se publicaron al año siguiente en relación con lapsicosis maniaco depresiva [5]. La primera enfermedadautoinmune compleja estudiada fue las diabetes tipo 1 de la que

se publicaron dos estudios en 1994 [6,7]. El númerode estudios ha ido aumentando de forma

paulatina como se representa en la figura 4.Sin embargo este gráfico sobreestima elnúmero de estudios pues en los últimosaños muchos de los trabajos publicados noson nuevos estudios sino ampliaciones o

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reanálisis de estudios previos. Por desgracia España no haparticipado significativamente en la investigación genética delas enfermedades complejas y ninguno de los estudios deligamiento de genoma completo ha sido realizado en nuestropaís, aunque algunos grupos han aportado familias de pacientesa estudios de ámbito europeo.

Un ejemplo de investigación de una enfermedad compleja detipo autoinmune es la identificación de variantes del gen NOD2como factor de riesgo para la enfermedad de Crohn [8,9]. Estaenfermedad se caracteriza por inflamación recidivante queafecta a toda la pared del tubo digestivo en cualquierlocalización aunque con predominio en el intestino delgado. Laafectación es segmentaria y puede llevar a la formación deúlceras, fístulas y nódulos. Tiene una incidencia aproximada del0.1% y se observa con una frecuencia 15 a 30 veces superior enfamiliares de los pacientes.

En la figura 5 se representa un sumario de los 6 estudios deligamiento de genoma completo que se han realizado en laenfermedad de Crohn. Además de estos se han realizadomuchos otros estudios focalizados en regiones específicas delgenoma. En el más pequeño de los estudios de genomacompleto se incluyeron 78 familias multicaso en las que seestudiaron 270 marcadores. Como se ve los estudios deligamiento de genoma completo son estudios de unamagnitud considerable. Entre los resultados deestos estudios nos vamos a fijar en la relacióncon el cromosoma 16q. Esta relación seobservó en 4 de los 6 estudios. En ningunode ellos aparecía como claramente definida(significativa), sino que era de grado

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sugestivo en uno de ellos y sólo vagamente aparente (nominal)en los otros tres estudios. Sin embargo esta región delcromosoma 16q contiene las variantes del gen NOD2 quepredisponen a la enfermedad de Crohn. Sólo fue posible obtenerevidencia clara de la relación del cromosoma 16q con laenfermedad gracias a un estudio colaborativo internacional queincluyó más de 600 familias. Investigaciones posteriorespermitieron identificar las variantes en el gen NOD2responsables de la susceptibilidad. Este ha sido el primer genimplicado en una enfermedad autoinmune compleja identificadoa partir de evidencias puramente genéticas (con anterioridad sehabían identificado otros a partir del conocimiento de su papelen la enfermedad).

Estudios similares a los descritos en relación con laenfermedad de Crohn han llevado en los últimos años aldescubrimiento de otros factores genéticos de susceptibilidad aenfermedades complejas. En la figura 6 se muestra en unaescala temporal como el descubrimiento de nuevos genesimplicados en enfermedades complejas autoinmunes pareceestar acelerándose de una forma dramática. Desde mayo del2001 en que se publico la participación de NOD2 en laenfermedad de Crohn hasta este mes de agosto de 2003 en elque se ha demostrado la participación del gen PADI4 en laartritis reumatoide [10]. Parece que el camino que se abrió con

los mapas genéticos y con los estudios de ligamentode genoma completo empieza a dar sus frutos.

Paralelamente a la realización deestudios de ligamiento de genoma completoen las distintas enfermedades complejas sehan ido desarrollando nuevos métodos de

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investigación, de forma que es posible predecir que en lospróximos años el ritmo de descubrimiento de factores genéticosse va a acelerar todavía más. El principal desarrollo ha sido laobtención de un nuevo tipo de mapas del genoma humano: losmapas de variabilidad. Este es un proceso que todavía está enmarcha y que se puede considerar como la continuación delproyecto de secuenciación del genoma humano. Consiste en laidentificación de las variantes individuales más frecuentes a lolargo de todo genoma. La mayoría de estas variantes frecuentesson del tipo llamado SNPs, esto es cambios en un úniconucleótido. Ya se encuentran 2.5 millones de estas variantes enlas bases de datos de acceso público y constituyen el mapa másdenso y fácil de estudiar de la variabilidad humana. Sin embargo,todavía no es posible realizar un estudio de genoma completomediante el estudio de los SNPs, ya que sería necesario estudiarun número ingente en cada individuo (las estimaciones varíanentre 30 mil y más de 500 mil) [11]. La solución de esteproblema probablemente pasa por dos vías de investigación quese están siguiendo con gran intensidad: el desarrollo de nuevastécnicas de genotipado con capacidad de obtener cientos demiles de resultados al día y el estudio de la estructura dehaplotipos del genoma que permitirá escoger los SNPs másinformativos para su estudio.

Acabamos de ver como los avances de la biología moleculary el conocimiento del genoma nos están permitiendoabordar problemas genéticos muy complejoscomo la susceptibilidad a la artritisreumatoide, al lupus eritematoso sistémico,a la enfermedad de Crohn o a la diabetestipo 1, enfermedades que dependen demúltiples factores incluyendo múltiples

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factores genéticos. Sin embargo, para comprender laimportancia de estos descubrimientos debemos considerar quebeneficios podemos obtener de los mismos.

Beneficios derivados de la identificaciónde factores genéticos de susceptibilidad.

Los beneficios que se pueden esperar de la identificación delos factores genéticos de susceptibilidad se pueden agrupar entres grupos: aumento del conocimiento, capacidad de predicciónde las enfermedades, desarrollo de nuevas estrategias deprevención y de tratamiento de las enfermedades. En algunasenfermedades complejas, como en algunas enfermedadeshematológicas o en el cáncer de mama, los factores genéticosde predisposición ya se están utilizando en la definición deestrategias de prevención o en la toma de decisiones entretratamientos alternativos. Sin embargo, no existe todavía ningúntratamiento dirigido a modificar la actividad de los genesimplicados que se haya desarrollado a partir de los estudiosgenéticos.

En las enfermedades autoinmunes todavía no se ha llegado auna situación tan avanzada. Ninguno de los factores de riesgo

genéticos se utiliza todavía en la prevención o eltratamiento. Sin embargo, algunos de los

factores genéticos identificados han permitidoavances en el conocimiento abriendo camposde investigación totalmente insospechadosy otros se empiezan a utilizar en lapredicción de enfermedades. Por ejemplo,

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una variante en la región reguladora del gen de la insulina estáimplicada en la predisposición a la diabetes tipo 1. De formatotalmente inesperada se observó que el efecto interesante deesta variante no se localizaba en el páncreas sino en unapoblación pequeña y casi completamente desconocida de célulasen la médula del timo [12,13]. La variante asociada conpredisposición a la diabetes determina una menor producción deinsulina por estas células con lo que la tolerancia inmunológicafrente a la insulina es imperfecta y por lo tanto es más fácil quese desencadene la respuesta autoinmune que causa ladestrucción de las células beta del páncreas. Las mismas célulasde la médula del timo también producen toda una serie deproteínas que se creían específicas de otros órganos y, por lotanto, parecen tener un papel central en la prevención de lasenfermedades autoinmunes órgano-específicas.

Otro ejemplo en el que el descubrimiento de un factor desusceptibilidad genética está abriendo nuevas perspectivas en elconocimiento de la enfermedad es el del gen NOD2 en relacióncon la enfermedad de Crohn. La proteína NOD2 es un receptorintracelular para productos bacterianos, que al unirse a ellosinduce una respuesta inflamatoria. En el intestino NOD2 seexpresa casi de forma exclusiva en las células de Paneth [12].Todavía desconocemos los acontecimientos que desencadenanla enfermedad de Crohn, pero estos datos han redirigido lainvestigación hacia las bacterias presentes en la flora intestinal,la inmunidad innata y las células de Paneth. Ningunode estos campos era prioritario en lainvestigación de la enfermedad de Crohnantes del descubrimiento de la participaciónde variantes de NOD2 en la susceptibilidada esta enfermedad. La participación de lascélulas de Paneth, en especial, ha sido una

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completa sorpresa, ya que hasta ahora nadie había consideradola posibilidad de que tuviesen un papel en la enfermedad. Estascélulas se consideraban simplemente como células secretorassin ninguna participación en respuestas inflamatorias o inmunes.

En relación con la predicción de enfermedades autoinmunes,ya hay resultados fiables del valor predictivo de algunos deestos factores genéticos. El valor predictivo de cada factorconsiderado individualmente es bajo pero utilizados encombinación o con otros criterios de historia familiar o criteriosfuncionales pueden ser de utilidad. Sin embargo, el desarrollo deesta aplicación está limitado por la ausencia de medidaspreventivas de eficacia probada: es inútil predecir unaenfermedad que no se puede prevenir. Una enfermedad en laque se están evaluando en la actualidad varios protocolos deprevención (tolerancia nasal u oral con insulina, administraciónde insulina subcutánea, nicotinamida,...) es la diabetes tipo I. Enlos experimentos encaminados a evaluar estos protocolospreventivos se incluyen individuos en los que el riesgo dedesarrollar la enfermedad es muy alto. Como criterio deselección de los sujetos de alto riesgo se incluye el estudio delos alelos del HLA. El efecto de los alelos HLA de susceptibilidadaumenta notablemente el riesgo de padecer la enfermedad tantoentre hermanos de enfermos como en la población general(Figura 7). Así mientras el riesgo medio en la población es de

1/300, el riesgo asociado al genotipo de mayorpredisposición es 20 veces mayor, 1/15. Si a

este genotipo de alto riesgo se une tener unhermano enfermo el riesgo de padecerdiabetes llega al 20%. Sin embargo, estosriesgos aunque muy aumentados no seconsideran suficientes para usar el genotipo

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HLA como criterio de predicción aislado. Esto es claro sitenemos en cuenta la elevada proporción de la población quepresenta estos alelos (Figura 7), y que debería ser tratada conlas medidas de prevención. Por lo tanto, los alelos HLA tienenque usarse de forma combinada con otros criterios de riesgo.Dos ejemplos de este uso combinado se muestran en las figuras8 y 9. Ambos representan protocolos de selección de sujetos dealto riesgo para su inclusión en estudios de eficacia de medidaspreventivas de la diabetes tipo I. En el primer caso [15] lacombinación de factores de riesgo utilizada para predecir unriesgo elevado de diabetes incluye además del genotipo HLA (elcriterio utilizado en este caso concreto es la ausencia de un aleloprotector el DQB1*0602): ser hermano de un paciente,determinaciones de autoanticuerpos frente a antígenospancreáticos (GABA, ICA o IA2) y un test metabólico. En lafigura 9 el ejemplo es de un estudio que pretende evaluar laeficacia de la tolerancia nasal en niños con riesgo elevadoaunque no tengan antecedentes familiares [16]. En este estudioque se está realizando en Finlandia, los alelos HLA de riesgo (enconcreto los DQB1 de riesgo) tienen un papel más importantepues son el criterio que decide la inclusión del niño. La tolerancianasal con insulina sólo se intentará si en medidas subsecuentesse encuentra que se han desarrollado autoanticuerpos frente alas células de los islotes del páncreas (ICA).

Es de esperar que en los próximos años eldescubrimiento de un gran número de factoresgenéticos de susceptibilidad a lasenfermedades autoinmunes permitiráencontrar muchos más ejemplos debeneficios derivados de su conocimiento entodos los aspectos considerados: desde la

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comprensión de la enfermedad hasta el desarrollo de nuevostratamientos dirigidos a modificarlos.

Conclusión

Los ejemplos presentados dan una idea del estado actual dela investigación de los factores genéticos en las enfermedadescomplejas. No cabe duda de que la investigación en este campotiene todavía mucho camino por recorrer pero los instrumentostecnológicos no han cesado de desarrollarse y la secuenciacióndel genoma humano y el estudio de su variación proporcionanherramientas adicionales que facilitan más la tarea. Un áreafundamental es el desarrollo de colecciones de muestras depacientes. Este es un campo que en algunos países está muyavanzado, habiendo generado tanto entusiasmo que incluso sehan generado colecciones de DNA de toda la población como enel caso de Islandia. La participación en estas colecciones abre laposibilidad a muchos médicos y a muchos pacientes decontribuir a una empresa de investigación de gran envergadura.Gracias a todos estos esfuerzos y avances, vamos a ser testigosen los próximos años del descubrimiento de muchos factores deriesgo genético. Unos serán más útiles que otros, pero todos vana contribuir a un mejor conocimiento de las enfermedades y, por

lo tanto, van a permitir un uso más efectivo denuestros recursos en la investigación, la

prevención y el tratamiento.

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Figura 1. Ejemplo de la ausencia de un patrón hereditariodefinido en una familia con múltiples casos de una enfermedadcompleja con componente hereditario. Los círculos correspondena las mujeres de la familia y las figuras rellena a los individuosque tienen la enfermedad.

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Figura 2. Esquema de los tres mapas genéticos másutilizados correspondientes al cromosoma 1 tal como seobtienen de la base de datos del NCBI. En la parte superior seencuentra el nombre del mapa (deCODE, Genethon yMarshfield), la línea vertical debajo de los nombres representa lalongitud del cromosoma cortado por trazos horizontales, cadauno de los cuales representa uno de los marcadores muyvariables que se ha utilizado para obtener el mapa. Los nombresde algunos de los marcadores aparecen a la derecha delcromosoma.



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Figura 3. Resultados de un estudio de ligamiento degenoma completo. Cada gráfico corresponde al cromosoma quese menciona en el ángulo superior izquierdo. El eje de abscisasrepresenta la longitud del cromosoma, como se ve por la escalahay gran diferencia en el tamaño con cromosomas grandes comoel 1 y otros mucho más pequeños como el 21. En el eje deabscisas se representan dos medidas de la intensidad de larelación con la enfermedad (en línea continua y en línea detrazos). La línea de trazos horizontal a nivel 2 indica el nivel apartir del cual se considera que la relación es sugestiva. Unarelación significativa debe situarse por encima de 3.6.



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Figura 4. Evolución del número de estudios de ligamientode genoma completo (tanto para enfermedades hereditariascomo para enfermedades complejas con un componentehereditario). El aumento más acentuado a partir del año 1999resulta en parte de la inclusión de algunos estudios que sonampliación o reanálisis de estudios anteriores. La cifra del año2003 incluye los estudios publicados hasta agosto.

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Figura 5. Resumen de resultados de los estudios deligamiento de genoma completo de la enfermedad de Crohn. Seindican el primer autor del estudio y el año de publicación, elnúmero de familias multicaso participantes y su nacionalidad, elnúmero de marcadores estudiados a lo largo del genoma y lasregiones del genoma que se encontraron relacionadas consusceptibilidad a la enfermedad de Crohn. Se indica el grado deintensidad de la relación: siginifcativo ( sugestivo ( nominal.

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Figura 6. Progresión temporal del descubrimiento pormedios puramente genéticos de factores genéticos depredisposición a enfermedades autoinmunes complejas.

Figura 7. Riesgo relativo determinado por los distintosalelos de una de las moléculas del HLA para padecer diabetestipo I en ausencia de antecedentes familiares. La primeracolumna de la izquierda muestra el riesgo a los 20 años, lacolumna del medio los alelos asociados con ese riesgo y en lacolumna de la derecha la frecuencia de ese genotipo en lapoblación. Se puede ver que incluso los alelos que causan unmayor riesgo tienen un valor predictivo positivo bajo.

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Figura 8. Esquema representando un protocolo de inclusiónen un estudio de prevención de diabetes tipo I en hermanos deenfermos. Se utilizan en análisis combinado toda una serie decriterios, que incluyen la exclusión de un alelo de HLA protectivoademás de datos de la historia y determinación de anticuerposfrente autoantígenos pancreáticos y un test metabólico.

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Conceptos Basicos sobre el Genoma y Retos de la Investigacion Genomica.Jaime Gomez Marquez, catedratico de Bioquimica y Biologia Molecular. Decano de la Facultad de Biologia de la USC.

Figura 9. Esquema de un protocolo de estudio deprevención de la diabetes tipo I en la población general deFinlandia (país con una prevalencia de diabetes tipo I cercana al5%). Todos los recién nacidos con HLA de riesgo se siguen condeterminaciones seriadas de anticuerpos frente a las células delos islotes del páncreas y si éstos se hacen positivos se inicianlas medidas preventivas a evaluar.

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Investigación de los factores genéticos de las enfermedades complejas Antonio González Martínez-Pedrayo. Laboratorio de Investigación 2. Reumatología. Hospital Clínico Universitario de Santiago

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