Lineamientos Para La Vigilancia de Rotavirus (1)

Direccin General de Epidemiologa

Instituto de Diagnstico y referencia EpidemiolgicosDr. Manuel Martnez Bez

lineamientos para la vigilancia epidemiolgicadel rotavirus por laboratorio

Rotavirus Pgina 1 de 43 Versin No.01 InDRE-RNLSP

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA DEL ROTAVIRUS POR LABORATORIO

DGE-InDRERNLSP 2015

Fotografa de la portada propiedad de HKS Arquitectos


PRIMERA EDICIN, 2015 ROTAVIRUSRNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE CONFORMAN EL GRUPO TCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMIT NACIONAL PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY, INDRE-SECRETARA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA DE ROTAVIRUS POR LABORATORIO VERSIN NO. 01. INDRE, 2015. COLECCIN PUBLICACIONES TCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS DR. MANUEL MARTNEZ BEZ FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. LVARO OBREGN, C. P. 01480, MXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOS ALBERTO DAZ QUINEZ EL DISEO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LPEZ IMPRESO EN MXICO. PRINTED IN MEXICO


SECRETARA DE SALUD

DRA. MERCEDES JUAN LPEZ SECRETARIA DE SALUD

DR. EDUARDO GONZLEZ PIER

SUBSECRETARIO DE INTEGRACIN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD

DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIN Y PROMOCIN DE LA SALUD

LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZLEZ

SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIN Y FINANZAS

DR. GABRIEL OSHEA CUEVAS COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIN SOCIAL EN SALUD

LIC. MIKEL ARRIOLA PEALOZA

COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIN CONTRA RIESGOS SANITARIOS

DR. JOS MELJEM MOCTEZUMA COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MDICO

DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS

TITULAR DE LA COMISIN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD

LIC. RODRIGO REINA LICEAGA

TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIN Y PARTICIPACIN SOCIAL

DR. NELLY AGUILERA ABURTO TITULAR DE LA UNIDAD DE ANLISIS ECONMICO

LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA

DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIN SOCIAL

DR. JESS FELIPE GONZLEZ ROLDAN DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL

DE ENFERMEDADES

DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIN DE LA SALUD

DR. CUITLHUAC RUIZ MATUS

DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGA


LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIN EN SALUD


INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS DR. MANUEL MARTNEZ BEZ

DR. JOS ALBERTO DAZ QUINEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

BIOL. IRMA LPEZ MARTNEZ DIRECTORA DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCA HERNNDEZ RIVAS

DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TCNICO

LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA SUBDIRECTORA DE OPERACIN

QBP. IRMA HERNNDEZ MONROY

ASESORA TCNICA DE LA DIRECCIN

BIOL. NORMA ANGLICA MONTES COLIMA JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGA

M. EN C. BELN TORRES LONGORIA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGA

QFB. ROBERTO VZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS

M. EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGA

M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. JOS ERNESTO RAMREZ GONZLEZ

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y VALIDACIN DE TCNICAS

DRA. HERLINDA GARCA LOZANO JEFA DEL LABORATORIO DE VIRUS GASTROINTESTINALES

COORDINADORA DE LA RED DE ROTAVIRUS


GRUPO DE TRABAJO

DRA. HERLINDA GARCA LOZANO JEFA DEL LABORATORIO DE VIRUS GASTROINTESTINALES

COORDINADORA DE LA RED DE ROTAVIRUS

QFB. HEIDI LIZBETH TERN VEGA ADSCRITA AL LABORATORIO DE VIRUS GASTROINTESTINALES

BIOL. IRMA LPEZ MARTNEZ

DIRECTORA DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA

DR. HUGO MARTNEZ ROJANO ASESOR TCNICO DE LA DIRECCIN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE

COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL

DR. JOS ALBERTO DAZ QUINEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO


LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA DEL ROTAVIRUS

POR LABORATORIO

DGE-InDRERNLSP 2015


NDICE

INTRODUCCIN ................................................................................................................... 9

ANTECEDENTES DE LA RED PARA EL DIAGNSTICO DE ROTAVIRUS ...................... 10

MARCO LEGAL DEL LABORATORIO ................................................................................ 12

DEFINICIONES OPERATIVAS ........................................................................................... 12

OBJETIVOS .......................................................................................................................... 13

Objetivo general ................................................................................................................ 13

Objetivos especficos ......................................................................................................... 13

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PBLICA PARA EL DIAGNSTICO DE ROTAVIRUS ................................................................................................................... 14

ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ROTAVIRUS ..........15

Laboratorio de Virus Gastrointestinales: Laboratorio Nacional de Referencia, el cual realiza las siguientes tcnicas diagnsticas: .......................................................................15

Red de Laboratorios Estatales de Salud Pblica ................................................................15

FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED ........................................................... 16

Funciones del laboratorio de virus gastrointestinales. Laboratorio Nacional de Referencia.......................................................................................................................... 16

Funciones de los Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP). ................................. 16

TOMA, MANEJO Y ENVO DE MUESTRAS ....................................................................... 18

ALMACENAMIENTO Y ENVO DE MUESTRAS ................................................................ 19

ALGORITMOS DE DIAGNSTICO DE TIPIFICACIN Y SECUENCIACIN PARA ROTAVIRUS Y OTROS VIRUS GASTROINTESTINALES .................................................. 22

ESTNDARES DE CALIDAD ............................................................................................... 23

CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS .............................................................................. 25

PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED) .......................... 26

BANCO DE MATERIAL BIOLGICO .................................................................................. 27

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES PARA LA RED DE ROTAVIRUS ............................... 29

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................................... 30

ANEXO I: DISPOSITIVOS MDICOS ................................................................................. 32

ANEXO II: PREPARACIN DE REACTIVOS...................................................................... 33

ANEXO III: ESPECIFICACIONES DE LOS REACTIVOS PARA ROTAFORESIS .............. 37

ANEXO IV: ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIN DE REACTIVOS PARA PAGE. .... 39

ANEXO V: LINEAMIENTOS PARA LA SOLICITUD DE INSUMOS .................................. 41

ANEXO VII: FORMATO PARA LA VIGILANCIA DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) POR ROTAVIRUS ....................................................................................... 43


INTRODUCCIN

La enfermedad diarreica aguda (EDA) es un problema de salud pblica y la

segunda causa de mortalidad y morbilidad en la poblacin infantil a nivel mundial.

Los rotavirus humanos del grupo A son los principales agentes virales causantes de

cuadros diarreicos con deshidratacin severa. Anualmente en Amrica Latina y el

Caribe se presentan 15000 muertes, 75000 hospitalizaciones, 2 millones de visitas

clnicas y 10 millones de casos de cuadros diarreicos. La EDA es causada por

diferentes agentes etiolgicos entre los que se incluyen bacterias, parsitos y virus.

Los rotavirus humanos son la principal causa de episodios diarreicos en nios

menores de 5 aos ocasionando aproximadamente el 70% de estos casos. Los nios

de 6 a 24 meses de edad tienen mayor riesgo de adquirir la infeccin y se estima

que estos grupos etarios, por lo menos, cursan de uno a tres eventos de

gastroenteritis en su vida.

La gastroenteritis puede transmitirse por diferentes rutas, el principal mecanismo

es la va fecal-oral debido al consumo de alimentos o contacto de manos y objetos

contaminados con materia fecal. Adems existen evidencias de propagacin a

travs de aerosoles y secreciones.

En pases industrializados, los nios menores de tres aos presentan en promedio

tres episodios de diarrea al ao, en los pases en vas de desarrollo los individuos

presentan un mayor nmero de eventos diarreicos. Esto hace necesario que estn

sujetos a la vigilancia epidemiolgica para identificar de forma oportuna los

eventos que signifiquen un riesgo para la salud de la poblacin y con base en los

hallazgos, se tomen decisiones para las acciones de planeacin, control y

prevencin de las enfermedades sujetas a vigilancia.

En Mxico las acciones de vigilancia se apoyan en el Sistema Nacional de Vigilancia

Epidemiolgica (SiNaVE), el cual cuenta con el subsistema de laboratorio para

llevar a cabo las actividades de manera oportuna y uniforme para el diagnstico de

rotavirus, y otros virus gastrointestinales como son los Norovirus, Sapovirus,

Astrovirus y Adenovirus entricos asociados a la enfermedad diarreica aguda.

El presente documento establece los lineamientos de operacin que debe realizar la

Red Nacional de Laboratorios Estatales de Salud Pblica (RNLSP) para la

vigilancia basada en el laboratorio de la gastroenteritis viral incluyendo las

funciones por niveles; la toma, manejo y envo de muestras; la metodologa para el

anlisis de muestras (mtodos convencionales y mtodos moleculares); la

evaluacin del desempeo as como, los estndares de calidad.


ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica

La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP) es el conjunto de

laboratorios de vigilancia epidemiolgica con objetivos especficos que le han

permitido unificar mtodos de diagnstico, criterios de interpretacin de

resultados, transferencia tecnolgica, generacin de conocimiento y formacin de

recursos humanos. Es el soporte tcnico-cientfico til para la vigilancia

epidemiolgica, que genera informacin de calidad para la toma oportuna de

decisiones a travs de la confirmacin de diagnsticos mediante estudios de

laboratorio en muestras biolgicas.

La RNLSP depende de la Secretara de Salud y es el Instituto de Diagnstico y

Referencia Epidemiolgicos (InDRE) su rgano rector en el rea de vigilancia

epidemiolgica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-

SSA2-2012, para la vigilancia epidemiolgica y est conformada por 31

Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP) de las 32 entidades federativas del

pas (el Distrito Federal enva sus muestras al InDRE).

El Marco Analtico Bsico de la RNLSP consta de 27 diagnsticos, distribuidos en

16 redes de vigilancia especfica.

ANTECEDENTES DE LA RED PARA EL DIAGNSTICO DE ROTAVIRUS

Desde 1994, que fue integrada esta red de diagnstico, el laboratorio de virus

gastrointestinales del InDRE ha ofrecido a sus integrantes cursos de capacitacin y

actualizacin, capacitacin en servicio, supervisin, asesora, apoyo con equipo e

insumos en caso de emergencia y desastres as como el envo de reactivos para

realizar el proceso del mtodo de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE).

Posteriormente se inici el Programa de control de calidad en el que se les solicit a

los integrantes de la red enviaran el 100% de las muestras diarreicas positivas y

50% de las negativas a rotavirus para la evaluacin inicial de la red.

En el ao 2002 la RNLSP se incorpor al Programa Caminando a la Excelencia

para evaluar el desempeo tcnico del personal de la RNLSP respecto a los

programas prioritarios de la salud y fomentar su desarrollo.

Durante los aos 2002 a 2004 se utilizaron cinco indicadores para la evaluacin

del Boletn Caminando a la Excelencia: capacidad analtica, muestras enviadas para

control de calidad, calidad de las muestras, concordancia-cumplimiento e

independencia diagnstica, con los que se garantiz la calidad de los diagnsticos

emitidos por los LESP.

Sin embargo, este ltimo ao 2013, se plante la necesidad de contar con una

herramienta que de manera ms confiable, permitiera entre otros aspectos evaluar


la capacidad tcnica, detectar las necesidades de capacitacin y mantener una

mejora continua de los miembros de la red de diagnstico por lo que se re-

evaluaron los indicadores para el Boletn Caminando a la Excelencia quedando

incluidos los parmetros de concordancia, cumplimiento y evaluacin del

desempeo.

A partir del ao 2005 y hasta la fecha, se preparan y envan anualmente a toda la

red, paneles de eficiencia para medir el indicador de evaluacin al desempeo.

Estos paneles contienen 10 muestras de evacuaciones diarreicas previamente

caracterizadas en el laboratorio de virus gastrointestinales del InDRE.

La conformacin de la red de diagnstico ha cambiado a travs de los aos de la

siguiente manera:

Durante el ao 2007

La red de Rotavirus estaba constituida por 20 LESP.

Enviaban el 50% de muestras positivas y el 10% de negativas.

Se inici por parte de los LESP el envo de muestras para referencia

(constitucin del banco).

En el ao 2008

La red se constituy de 25 LESP debido a la inclusin de Durango, Tlaxcala,

Oaxaca y Quertaro los cuales participaron en la evaluacin de los dos paneles

de ese ao.

A mediados de este ao se incluy Sonora participando nicamente en el

segundo panel de evaluacin.

Los LESP enviaban el 10% de muestras positivas y el 5% de negativas

De los 25 LESP, casi la mitad de ellos (12) enviaban muestras para el banco

general de Rotavirus.

En el ao 2009

Se integran Aguascalientes y Sinaloa a la red de diagnstico, los cuales enviaban

muestras para la conformacin del banco general de Rotavirus conforme lo

dispuesto para toda la red.

En el ao 2010

La red estaba constituida por 29 LESP. Este ao se integraron Baja California y

Guanajuato, quienes participaron en la evaluacin del segundo panel del 2010.

En el ao 2012

Durante este ao se cumpli con la implementacin de la red de Rotavirus en todo

el pas, a partir de ese ao la RNLSP cuenta con equipo y personal de laboratorio,

previamente capacitado en el InDRE.


MARCO LEGAL DEL LABORATORIO

1. Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos. Artculo 4. DOF

05/02/1917, ltima Reforma D.O.F. 15/02/2012.

2. Ley General de Salud. Artculo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y

141. DOF 7/02/1984, ltima Reforma DOF 07/06/2012.

3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-, Para la vigilancia epidemiolgica.

DOF: 19/02/2013.

4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Proteccin

ambiental-salud ambiental-residuos peligrosos biolgico-infecciosos-

clasificacin y especificaciones de manejo.

5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las

caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados

de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.

6. Norma Oficial Mexicana NOM-031-SSA2-1999, Para la atencin a la salud

del nio.

7. Secretara de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial

de la Federacin DOF: 12/12/2013.

8. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federacin,

DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx

9. Secretara de Salud. Programa de Accin Especfico 2013-2018. Sistema

Nacional de Vigilancia Epidemiolgica, primera edicin 2014.

10. Lineamientos para programas de evaluacin externa del desempeo de la

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, InDRE- Secretara de Salud,

Mxico 2014.

11. Criterios de Operacin para la Red Nacional de Laboratorios de Salud

Pblica, InDRE-Secretara de Salud, Mxico 2014.

12. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organizacin y

funcionamiento de los laboratorios clnicos. D.O.F. 27-03-2012.

DEFINICIONES OPERATIVAS

Definicin de casos

Caso sospechoso

Todo nio menor de 5 aos hospitalizado por diarrea aguda.

Se define como:

Nio menor de 5 aos: todo nio de cero a cuatro aos, 11 meses y 29 das de

edad.

Hospitalizado: nio ingresado a la sala de rehidratacin o a la de hospitalizacin.

En los hospitales donde no existe una sala de rehidratacin, se considera


hospitalizado todo nio que reciba rehidratacin oral o parenteral en el ambiente

hospitalario, aunque no sea ingresado en la sala de hospitalizacin.

Diarrea aguda: tres o ms evacuaciones lquidas o semilquidas en las ltimas 24

horas, con hasta 14 das de duracin. Si bien la consistencia de las heces es ms

importante que el nmero de evacuaciones, considerar que los nios con lactancia

materna exclusiva suelen presentar heces lquidas.

Deben ser considerados los siguientes criterios de exclusin de caso:

Tener 5 aos de edad cumplidos o ms.

Presentar diarrea prolongada (ms de 14 das de duracin).

Haber sido hospitalizado por otra razn, aunque presente diarrea.

Haber tomado la muestra de heces despus de 48 horas post-ingreso

hospitalario, por el riesgo de tratarse de una infeccin intrahospitalaria sin

embargo, en el caso de EDA en adultos puede ser considerado para la realizacin

de estudios de laboratorio.

Caso confirmado

Caso sospechoso que tiene una muestra de heces oportuna cuyo resultado de

laboratorio es positivo para Rotavirus. En el caso de estudio de brote, se confirma

en aquellos en los que se establezca el nexo epidemiolgico con un caso confirmado

por laboratorio.

OBJETIVOS

Objetivo general

Establecer los criterios y procedimientos adecuados para la aplicacin del

algoritmo del diagnstico y tipificacin de Rotavirus, y del algoritmo diferencial

para el diagnstico de otros virus gastrointestinales; as como analizar la

informacin generada por la RNLSP para proporcionar informacin

epidemiolgica convencional y de vigilancia basada en el laboratorio.

Objetivos especficos

Determinar el panorama epidemiolgico de las diarreas por Rotavirus en

Mxico.

Disponer de datos para generar informacin sobre el ndice de morbilidad y

mortalidad de la enfermedad diarreica aguda (EDA).

Determinar la circulacin de los diferentes genotipos de Rotavirus en el pas.

Identificar los genotipos emergentes y re-emergentes de Rotavirus asociados

con la EDA.


Fortalecer la red de laboratorios para el diagnstico oportuno de Rotavirus.

Proporcionar informacin epidemiolgica convencional y vigilancia basada en

el laboratorio.

Identificar los agentes virales asociados con EDA a travs del servicio de

NuTraVE-EDA, a travs del algoritmo diferencial para otros agentes virales.

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PBLICA PARA EL

DIAGNSTICO DE ROTAVIRUS

Figura. 1.- Conformacin de la red para el diagnstico de rotavirus en Mxico, 2014


ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE

ROTAVIRUS

La RNLSP para el diagnstico de Rotavirus est basada en los siguientes niveles de

organizacin:

Laboratorio de Virus Gastrointestinales: Laboratorio Nacional de

Referencia, el cual realiza las siguientes tcnicas diagnsticas:

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE) para el diagnstico y control

de calidad de Rotavirus.

RT-PCR punto final para la tipificacin a VP7 y VP4 de las cepas de Rotavirus

grupo A, para el servicio de referencia solicitado por los LESP (Tcnica del CDC,

Atlanta, GA) (Manual of Rotavirus detection and Characterization Methods).

World Health Organization, 2009 y en apoyo a la vigilancia epidemiolgica.

Diagnstico diferencial para otros virus gastrointestinales mediante Ensayo Inmunoenzimtico (ELISA) para la identificacin de cada uno de los siguientes virus: Rotavirus, Norovirus, Astrovirus, Adenovirus entricos 40 y 41 a partir de heces, para el servicio de referencia solicitado por la RNLSP.

Tcnica de RT-PCR punto final para la identificacin y tipificacin de otros virus gastrointestinales: Norovirus, Sapovirus, Astrovirus, Adenovirus entricos 40 y 41, para el servicio de referencia solicitado por los LESP (Tcnica del CDC, Atlanta, GA) (Manual of Rotavirus Detection and Characterization Methods). World Health Organization, 2009.

Propagacin de las cepas prototipo de Rotavirus: Wa, DS-1, Price, ST3 a travs del cultivo de clulas MA-104 (Tcnica del CDC, Atlanta, GA) para la obtencin de controles positivos y complementar el envo de Kits y paneles de eficiencia.

Anlisis filogentico de los productos obtenidos de cADN de las cepas de Rotavirus circulantes para el estudio de la epidemiologa molecular de estos agentes virales en apoyo a la vigilancia epidemiolgica de la EDA por Rotavirus as como el monitoreo de las cepas emergentes y re-emergentes en el pas.

Red de Laboratorios Estatales de Salud Pblica

En la actualidad la red est conformada por 31 LESP (Aguascalientes, Baja California Sur, Baja California, Campeche, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Colima, Durango, Estado de Mxico, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacn, Morelos, Nayarit, Nuevo Len, Oaxaca, Puebla, Quertaro, Quintana Roo, San Luis Potos, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tlaxcala Tamaulipas, Veracruz, Yucatn y Zacatecas):

Todos ellos utilizan el mtodo de prueba que consiste en la Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE) para la identificacin del virus (Manual de Vigilancia de la Diarrea para Rotavirus, OPS. 2009).


FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED

Funciones del laboratorio de virus gastrointestinales. Laboratorio Nacional de Referencia

Coordinar la red para el diagnstico de rotavirus, que es fundamental para la vigilancia epidemiolgica de la diarrea por Rotavirus.

Tipificar los VP7 y VP4 de las cepas de Rotavirus circulantes en el pas.

Preparar y enviar los reactivos que conforman el Kit de Rotaforesis para los LESP.

Preparar y enviar los paneles de eficiencia para la red de rotavirus.

Evaluar los mtodos de prueba para transferirlos a la red de rotavirus.

Implementar las metodologas de punta para el diagnstico de virus gastrointestinales.

Capacitar y apoyar al personal de salud involucrado en el diagnstico de rotavirus para el fortalecimiento de la red.

Actualizar el diagnstico de rotavirus y otros virus gastrointestinales a travs de cursos.

Proporcionar informacin para la vigilancia epidemiolgica basada en el laboratorio de las diferentes cepas circulantes en el pas.

Realizar el diagnstico diferencial a travs de NuTraVE-EDA para otros virus gastrointestinales asociados con la enfermedad diarreica aguda mediante pruebas de biologa molecular.

Realizar anlisis filogentico de las cepas virales circulantes en el pas.

Realizar control de calidad a travs de una evaluacin del desempeo. Con base a la calificacin final se definir el porcentaje de muestras a enviar al InDRE si el desempeo es satisfactorio se continuar con este tipo de evaluacin.

Realizar la captura y emisin de resultados en la plataforma de Infolab y de NuTraVE-EDA del InDRE as como la informacin completa de las muestras que lleguen directamente al laboratorio.

Proporcionar los resultados en forma oportuna y confiable a los usuarios de la red.

Promover la investigacin aplicada en apoyo a la vigilancia, para los programas prioritarios de salud.

Funciones de los Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP).

Los laboratorios estales (Aguascalientes, Baja California Sur, Baja California, Campeche, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Colima, Durango, Estado de Mxico, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacn, Morelos, Nayarit, Nuevo Len, Oaxaca, Puebla, Quertaro, Quintana Roo, San Luis Potos, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tlaxcala, Tamaulipas, Veracruz, Yucatn y Zacatecas) con capacidad instalada para el diagnstico de rotavirus por PAGE llevan a cabo las siguientes funciones:


Realizar el diagnstico de rotavirus por la tcnica de PAGE con la metodologa estandarizada que es proporcionada en la capacitacin en el InDRE.

Participar en el Programa Externo de Evaluacin del Desempeo a travs de los paneles de eficiencia para la evaluacin del desempeo, dos veces por ao y obtener una calificacin aprobatoria.

Solicitar un nuevo panel de evaluacin y enviar las acciones de mejoras, en el caso de haber obtenido una calificacin no aprobatoria.

Enviar al laboratorio de virus gastrointestinales el 10% de las muestras positivas de casos de EDA para control de calidad al InDRE en apoyo a la vigilancia epidemiolgica convencional.

Enviar al laboratorio de virus gastrointestinales el 5% de muestras negativas de casos de EDA para control de calidad al InDRE.

Enviar al laboratorio de virus gastrointestinales el resto de las muestras positivas y negativas para conformacin del banco general de Rotavirus y la tipificacin de los genotipos circulantes en el pas, en apoyo a la vigilancia basada en el laboratorio.

Tener la capacidad instalada para procesar 50 muestras semanales, segn la infraestructura del laboratorio y contar con personal de salud capacitado para realizar el diagnstico.

Almacenar y conservar de forma adecuada los reactivos que se utilizan en la tcnica de PAGE (anexo IV).

Solicitar al InDRE los reactivos para la tcnica de PAGE de acuerdo a la calendarizacin programada (anexo V).

Asistencia del personal responsable a los cursos anuales de actualizacin, de diagnstico de rotavirus y otros virus gastrointestinales, impartidos por el InDRE.

Solicitar al InDRE capacitacin en servicio para el personal de nuevo ingreso o bien cuando exista una nueva asignacin de analista, que ser el responsable del diagnstico.

Enviar muestras negativas a Rotavirus por la tcnica de PAGE al servicio de NuTraVE-EDA en apoyo a la vigilancia basada en el laboratorio.

Estandarizacin del servicio de envo de muestras de control de calidad al InDRE, que a partir de la fecha de ser recibida en el LESP es de 15 das, (no almacenar en refrigeracin las muestras, por perodos mayores a un mes).

Proporcionar al personal de otras instituciones de salud los formatos y lineamientos vigentes establecidos por el InDRE para la toma y envo de muestras al LESP.

Cumplir con los requerimientos establecidos en el Manual para la Toma, Envo, Almacenamiento y Recepcin de muestras (REMU-MA-01/1); as como el uso del Formato nico de Muestras (REMU F-05) vigente para el caso de la vigilancia convencional. En el caso de NuTraVE-EDA utilizar el formato impreso directamente de la plataforma que contiene el nmero de folio completo.

Proporcionar los resultados en forma oportuna y confiable a sus usuarios a travs del informe de prueba.


Cumplir con el envo de muestras clnicas al InDRE para fortalecer la vigilancia convencional y la vigilancia basada en el laboratorio.

TOMA, MANEJO Y ENVO DE MUESTRAS Criterios de aceptacin de muestra

1. Se aceptarn las muestras que cumplan con la definicin operacional de

EDA.

2. Muestras registradas en la plataforma del InDRE.

3. Muestras con volumen suficiente (5.020 mL), y perfectamente etiquetadas.

4. Muestras que hayan sido tomadas en frasco de plstico con tapn de rosca.

5. Muestras que hayan sido tomadas dentro de las primeras 24 horas de haber

iniciado los sntomas en el paciente.

6. Muestras almacenadas a una temperatura de 4 a 8 C

7. Muestras que cumplan los lineamientos del manual de toma y envo de

muestras editado por el InDRE (REMU-MA-01).

Tipos de muestras En los casos de EDA, se tomar muestra de materia fecal dentro de las primeras 24 horas de iniciados los sntomas en los pacientes que cumplan con los criterios inclusin. Criterios de rechazo de muestra

1. Se rechazarn las muestras que no cumplan con la definicin operacional de

EDA.

2. Muestras sin formato nico de muestras del InDRE, ni solicitud de oficio.

3. Muestras de referencia y control de calidad que no tengan resultado en

formato.

4. Muestras con volumen insuficiente (


Toma de la muestra clnica

Colocar al paciente un paal desechable puesto al revs y vaciar la muestra en un frasco recolector de polipropileno graduado con una capacidad de 20 mL.

Si la muestra es lquida vaciar en un vaso recolector de 5.0 a 10 mL de la muestra diarreica directamente en un frasco limpio con tapa de rosca. Si la muestra es slida, utilizar un abatelenguas y colocar en un frasco recolector (ver figura 2).

Identificar el frasco con el nombre del paciente y fecha de la toma de muestra.

Introducir el frasco en una bolsa de plstico individual para evitar el derrame accidental de la muestra.

Llenar el formato adecuadamente.

Enviar la muestra al laboratorio, adjuntando solicitud de oficio y relacin de nombres de los pacientes en caso de ser varios.

Figura 2. Toma y recoleccin de la muestra clnica para Rotavirus y otros virus

gastrointestinales ALMACENAMIENTO Y ENVO DE MUESTRAS

La muestra debe ser almacenada, por un mximo de siete das, en el refrigerador entre 4 a 8 C hasta su envo al laboratorio. Una vez almacenadas las muestras clnicas debern ser enviadas al laboratorio de referencia [1] en cajas de unicel acompaadas de refrigerantes y en un sobre, colocar

1 El sistema bsico de triple embalaje consiste en la utilizacin de un recipiente primario, en el cual est contenida la muestra biolgica (exudado farngeo, exudado nasofarngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermtico para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o nmero de


el oficio de solicitud y formatos debidamente completados (pegado en el interior de la tapa superior), ver la figura 3 y 4.

muestra del paciente. El recipiente primario deber rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermtico a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deber usar una gradilla y material absorbente para evitar algn derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 C. Los recipientes secundarios debern llevar las etiquetas de riesgo biolgico y seal de orientacin del recipiente, a su vez el recipiente secundario deber ir contenido en un paquete externo de envo (caja de cartn o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y seal de orientacin. La documentacin que se integre al triple embalaje deber colocarse en la parte interior del paquete.

MUESTRA

Slida: 5-10 g

Lquida: 5-20 ml

nombreedadfechaprocedencia

Llenar

la encuesta

Almacenar a 4C

Etiquetar

Caja de envo

ENCUESTA

Lista de

nombres y

resultados

OFICIO

DirectorDx.Tcnica


TOMA Y ENVIO

DE MUESTRAS

MUESTRA

Slida: 5-10 g

Lquida: 5-20 ml



Llenar

la encuesta

Almacenar a 4C

Etiquetar

Caja de envo

ENCUESTAENCUESTA

Lista de

nombres y

resultados

Lista de

nombres y

resultados

OFICIO

DirectorDx.Tcnica

OFICIO

DirectorDx.Tcnica



TOMA Y ENVIO

DE MUESTRAS

REMU-F-12

NuTraVE-EDA

No. Folio


Figura. 3. Toma y envo de muestras para gastroenteritis viral.

Figura.4. Logstica de trabajo (desde la toma de muestra, hasta la difusin del informe).


ALGORITMOS DE DIAGNSTICO DE TIPIFICACIN Y SECUENCIACIN PARA ROTAVIRUS Y OTROS VIRUS

GASTROINTESTINALES

Figura. 5. Algoritmo ampliado para NuTraVE-EDA. Clave de tabulador:

1A2510004, 1A2510005, 1A2510101, 1A2510302, 1A2510304, 1A2510006, 1A2510201, 1A2510301, 1A2510303


Figura. 6. Algoritmo para control de calidad y tipificacin de Rotavirus. Clave de

tabulador: 1A251000, 1A2510004, 1A2510005 ESTNDARES DE CALIDAD La funcionalidad de una red de diagnstico para la vigilancia epidemiolgica de Rotavirus puede evaluarse en tres fases: 1) pre-analtica, 2) analtica y 3) post-analtica. 1) Fase pre-analtica

En la fase pre-analtica se evala la oportunidad de la toma de la muestra y la calidad de la misma. Se habla de una muestra adecuada si el paciente a quien se la toman cumple con la definicin de caso, el tipo de muestra de acuerdo al diagnstico presuntivo de gastroenteritis viral y que la cantidad de muestra sea suficiente, que se haya cumplido el protocolo para la toma de la muestra, el material, la temperatura, el embalaje y el transporte sean los adecuados. Esta fase ocurre entre el inicio de los sntomas y el momento de la toma de la muestra. El primer indicador para evaluar esta fase, es el ndice de rechazo de muestras inadecuadas. El punto de corte del mismo es que no rebase el 10%. La construccin del indicador es el siguiente:


NDICE DE RECHAZO = Nmero de muestras rechazadas

N de muestras que llegan a la institucin para diagnstico El segundo indicador de la fase pre-analtica es la oportunidad de la toma de la muestra. Este indicador mide el tiempo ptimo de la toma de la muestra con respecto al inicio de los sntomas de la enfermedad. El cumplimiento de este indicador es indispensable para mantener la adecuada sensibilidad de la prueba. Oportunidad Resultados de diagnstico informados en tiempo estndar entre el nmero de muestras recibidas para diagnstico por 100. Meta Cumplir con la emisin de los resultados de diagnstico en tiempo estndar por lo menos el 90% de las muestras procesadas mensualmente. 2) Fase analtica

Comprende todo el flujo de muestra dentro del proceso analtico y se utilizarn dos indicadores: a) Desempeo tcnico b) Oportunidad del proceso analtico El indicador de desempeo tcnico ser obtenido a travs de paneles de eficiencia dos veces por ao, cumplimiento de cdula de verificacin en visitas de supervisin (una vez al ao), concordancia con las muestras enviadas para cultivo viral y el 10% de negativas y cumplimiento con las bases del sistema vectorial de caminando a la excelencia.

ndice de desempeo tcnico Confiabilidad Paneles aprobados con el 90% o ms sobre paneles recibidos por 100. Meta Cumplir con el 85% o ms del programa de evaluacin del desempeo para cada diagnstico.

3) Fase post-analtica El indicador de la fase post-analtica es la emisin de resultado, el cual medir el tiempo transcurrido entre el trmino del anlisis de PAGE y la llegada de la informacin a la base de datos (plataforma de vigilancia epidemiolgica). Todos los laboratorios que realizan el diagnstico para esta red deben informar los resultados por da de proceso y no acumular los resultados para capturar resultados en el sistema de informacin general. Tiempo entre procesamiento, captura y envo de informacin dentro de las primeras 24 horas de terminado el proceso:


La fuente de informacin de los indicadores, ser la plataforma Infolab y la de NuTraVE-EDA actual, y la plataforma SiNaVE a partir del 19 de octubre de 2012. El seguimiento de los indicadores en el InDRE se efecta por el personal de la Direccin de Servicios de Apoyo, en combinacin con el rea de coordinacin de la RNLSP y son revisados semanalmente, excepto el de desempeo tcnico que se evala trimestralmente. CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS

La captura de los datos en la plataforma de Infolab del InDRE y de NuTraVE-EDA se realizar de acuerdo al manual de uso de las plataformas. PANELES DE EFICIENCIA

Los laboratorios de la red Rotavirus reciben semestralmente en fechas previamente establecidas un panel de eficiencia, y con base en los resultados obtenidos, se evala su desempeo y se define si se continua con el diagnstico liberado (debe obtenerse al menos el 80% de calificacin aprobatoria).

Concordancia entre 80 y 100%. Se mantiene este tipo de evaluacin.

Concordancia menor al 70%. Se requiere comprar un nuevo panel y enviar las oportunidades de mejora.

Concordancia no aceptable en el segundo panel. Se requiere de capacitacin del personal y establecer nuevamente el envo de muestras para realizar el diagnstico en el InDRE.

ENVO DE PANELES DE EFICIENCIA

Se envan semestralmente dos paneles de evaluacin a la red con 10 muestras cada uno de ellos y dos controles positivos: e-tipo largo y e-tipo corto.

El envo de los paneles se realiza a travs de las guas pre-pagadas por el LESP.

Con cada panel se enva el oficio especfico, el formato para el informe de resultados y el formato para que los laboratorios notifiquen la recepcin del mismo.

Las muestras clnicas enviadas en los diferentes paneles son codificadas para cada regin geogrfica. Se notifica va electrnica a travs de la coordinacin de la RNLSP el envo de paneles de eficiencia.

RESULTADOS DE LOS PANELES DE EFICIENCIA

La RNLSP informa al laboratorio a travs de la coordinacin de la RNLSP los resultados obtenidos del anlisis, 7 das hbiles posteriores a la recepcin del panel.

Se informa a cada uno de los LESP correspondientes, de los resultados obtenidos del panel con la clave previamente asignada por el InDRE.


Se notifica a la RNLPS va electrnica y por oficio los resultados obtenidos por el InDRE, 10 das hbiles despus de haber recibido la informacin del LESP.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Es importante mencionar que el anlisis de los resultados va enfocado a identificar oportunidades de mejora en la RNLSP. Los criterios de evaluacin que deben identificar los analistas del LESP son los siguientes:

Muestra positiva: la prueba de Rotavirus se considera positiva cuando se

observa la presencia de los 11 segmentos de ARN viral o cualquiera de los

segmentos que conforman el primer bloque (bloque I, 4 bandas).

Muestra negativa: la prueba se considera negativa cuando hay ausencia de los 11

segmentos de ARN viral o bien de la observacin de segmentos inespecficos no

correspondientes al genoma de Rotavirus.

Rotavirus.- deteccin mayor del RNA viral en heces

Rotavirus.- deteccin menor del RNA viral en heces

Rotavirus.- deteccin escasa del RNA viral en heces

Rotavirus.- deteccin mnima del RNA viral en heces Todo lo anterior para alcanzar la mayor ponderacin en cada caso. PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED) El anlisis de los indicadores que a la fecha se utilizan en la evaluacin del Boletn Caminando a la Excelencia, cumplimiento, concordancia y el desempeo obtenido por los LESP en los paneles de eficiencia, permite contar con un panorama general y determinar el diagnstico situacional de esta red. Considerando los resultados obtenidos por la RNLSP en el boletn y PEED para el diagnstico de rotavirus, se han propuesto modificaciones al esquema actual, con la finalidad de privilegiar el envo de los paneles de eficiencia como una herramienta ms eficaz para la evaluacin del desempeo, considerando para ello los siguientes criterios: 1. Aquellos LESP que hayan obtenido 90% o ms de concordancia en el boletn

(rotavirus) y PEED, se clasificarn como sobresalientes. 2. Aquellos LESP que hayan obtenido menos de 90% y ms de 70% de

concordancia en el boletn (rotavirus) y PEED, se clasificarn como

satisfactorio.


3. Aquellos que obtengan 70% o menos de concordancia en el boletn (rotavirus) y

PEED, se clasificarn como mnimo.

Con base en la evaluacin se propone modificar el porcentaje de muestras que

actualmente envan los LESP para aseguramiento de la calidad como se muestra a

continuacin:

Cuadro 1. Evaluacin del PEED

Clasificacin de

laboratorio Porcentaje para aseguramiento de la calidad

Sobresaliente

Enviarn el 10% de muestras positivas y 5% de las

negativas a rotavirus y se les enviar panel de eficiencia

dos veces por ao.

Satisfactorio


negativas a rotavirus y se les enviar panel de eficiencia

dos veces por ao.

Mnimo


negativas a rotavirus, se deber solicitar un nuevo panel y

enviar medidas correctivas y plan de accin, y se les

enviar panel de eficiencia dos veces por ao.

BANCO DE MATERIAL BIOLGICO

Los LESP debern enviar el 100% de sus muestras positivas y negativas a

rotavirus para conformar el banco general de Rotavirus del InDRE, que

servir para la vigilancia en nuestro pas. Esta solicitud se deber enviar y notificar

con otro oficio diferente al de control de calidad (no existe costo alguno para este

envo). El laboratorio de virus gastrointestinales del InDRE, seleccionar slo el

25% de las muestras positivas a Rotavirus del banco, para la vigilancia basada en el

laboratorio, de las cuales se proporcionar resultado al LESP.

En el caso de las muestras enviadas para control de calidad, se realizar la

identificacin o tipificacin de rotavirus por RT-PCR.

Estudios de brotes de enfermedad diarreica aguda (EDA) asociados con

rotavirus

En caso de brotes por EDA asociados con rotavirus, se enviar al laboratorio de

virus gastrointestinales del InDRE el 50% de las muestras positivas a Rotavirus

para su tipificacin de cepas a VP7 y VP4 y 100% negativas para el diagnstico

diferencial de otros agentes virales: Norovirus, Sapovirus, Astrovirus y Adenovirus


entricos 40 y 41. En el caso de brotes, se realizar el algoritmo ampliado para

brotes y NuTraVE-EDA.

Secuenciacin en apoyo al anlisis filogentico de las cepas circulantes

para Rotavirus y otros virus gastrointestinales.

La secuenciacin de ampliaciones de cADN se realiza con el apoyo del laboratorio

de genoma de patgenos del InDRE, para lo cual el laboratorio de virus

gastrointestinales lo solicita va memorndum acompaado de la lista de productos

de cADN y sus respectivos oligonucletidos.

Se realizar el 10% de la secuenciacin a los productos de cADN de las

diferentes cepas a sus genotipos G y P circulantes durante la epidemia rotaviral

anual para la confirmacin de cepas emergentes o re-emergentes.

Se realizar el 15% de la secuenciacin a los productos de cADN de los

diferentes genotipos G y P circulantes de Rotavirus slo en caso de brotes

asociados con Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) para la confirmacin de

cepas emergentes o re-emergentes.

Se realizar el 5% de la secuenciacin a los productos de cADN de las cepas

circulantes para otros virus gastrointestinales slo en caso de brotes asociados

con EDA.

Se enviarn las muestras para NuTraVE: El envo de muestras clnicas para la

solicitud del estudio por NuTraVE, se realiza por oficio especfico acompaado

de la encuesta correspondiente de NuTraVE y muestra fsica diferente a la de

control de calidad, as como de su captura previa en la plataforma de NuTraVE.


CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES PARA LA RED DE ROTAVIRUS

ACTIVIDAD

EN

E

FE

B

MA

R

AB

R

MA

Y

JU

N

JU

L

AG

O

SE

P

OC

T

NO

V

DIC

Envo del primer panel

a la RNLSP xx

Recepcin de

resultados en el InDRE xx

Envo de resultados a la

RNLSP xx

Recepcin del Plan de

acciones de los LESP xx

Fecha lmite de

cumplimiento al Plan

de Accin

xx

Curso de actualizacin

para el diagnstico de

Rotavirus:

ELISA para

Diagnstico de

Rotavirus y

preparacin de

reactivos para

Rotaforesis, InDRE

xx

Envo del segundo

panel a la RNLSP xx

Recepcin de

resultados en el InDRE xx

Envo de resultados a la

RNLSP xx

Nota: Las fechas del cronograma pueden estar sujetas a cambio de da.

Si algn da coincide con fin de semana o da de asueto, la fecha se

mueve al da hbil siguiente.


REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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management standard. Brussels: CEN; 2011.

26. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual 3rd ed. Geneva:

WHO Press; 2004.


ANEXO I: DISPOSITIVOS MDICOS

1. Lindberg Termoagitador con temperatura y agitacin regulable

2. Potencimetro digital

3. Fuente de poder marca Bio Rad

4. Cmara de electroforesis Mini protean II marca Bio Rad

5. Agitador tipo vortex

6. Microcentrfuga para tubos eppendorf de 3,000 10,000 rpm


ANEXO II: PREPARACIN DE REACTIVOS

REACTIVOS PARA ROTAFORESIS

Solucin A 5X (Solucin de lisis)

Procedimiento:

1. Pesar: Tris base 1.6 g; EDTA 1.4 g; SDS 0.65 g y NaCl 2.0 g.

2. Disolver cada uno en 20 mL de agua bidestilada estril con agitacin constante,

hasta la completa disolucin.

3. Agregar 0.65 mL de -mercaptoetanol.

4. Llevar al volumen en un matraz aforado de 50 mL con agua bidestilada estril.

5. Guardar en una botella de vidrio o plstico.

6. Conservar a temperatura ambiente.

Solucin B 1X (Fenol saturado)

Procedimiento:

1. Tomar el frasco (s) del fenol ultra puro presentacin en cristales.

2. Poner a bao Mara (60 C) el frasco hasta disolver todos los cristales.

3. Preparar solucin reguladora 1(B1) Tris-Base, 1M, pH 7.6

4. Preparar solucin reguladora 2 (B2) Tris-base, 0.1M, pH 7.6

5. Hacer 4 lavados con 500 mL cada uno, con solucin reguladora 1 (B1). Por cada

lavado dejar en agitacin 24 h.

6. Cuando transcurran 24 h, dejar reposar 30 min y retirar la solucin reguladora

(fase superior).

7. Hacer dos lavados de 400 mL con solucin reguladora, dos por cada lavado

dejar en agitacin por 24 h.

8. Cuando hayan pasado las 24 h, dejar reposar 30 min y retirar la solucin

reguladora.

9. Al volumen restante de la solucin B2, adicionar 0.2 mL de -mercaptoetanol

por cada 100 mL. Mezclar en un termoagitador durante 30 min.

10. Poner en un termoagitador y adicionar 0.5 g de 8-hidroxiquinolena en

cristales. Revisar la coloracin cada 5 min, hasta obtener el color deseado

(amarillo paja).

11. Dejar reposar el fenol con la solucin reguladora por dos das a 4 C.

12. Poner alcuotas de 35 mL de fenol fase de color amarillo y de 5 a 10 mL de

solucin reguladora fase transparente con un pipeteador automtico en tubos

cnicos de polipropileno (Corning) de 50 mL de capacidad.

13. Cubrir los tubos con papel aluminio y etiquetarlos.

14. Guardar el fenol en refrigeracin.


Solucin reguladora 1 Tris-Base, 1M, pH 7.6

Procedimiento:

1. Pesar 121.1 g de Tris-base

2. Disolver en 600 mL de agua bidestilada y ajustar el pH a 7.6 (si el pH queda

muy bsico, bajarlo con cido clorhdrico concentrado).

3. Aforar con agua bidestilada en un matraz volumtrico de 1.0 L.

Solucin reguladora 2 Tris-base, 0.1M, pH 7.6

Procedimiento:

1. Pesar 12.11 g de Tris-base.

2. Disolver en 700 mL de agua destilada y ajustar el pH a 7.6 (si el pH queda muy

bsico, bajarlo con cido clorhdrico concentrado).

3. Aforar con agua bidestilada en un matraz volumtrico de 1.0 L

Cloroformo

1. Utilizar el reactivo directamente como viene en su presentacin comercial.

2. Guardar a temperatura ambiente.

Solucin C 1X (Solucin de colorante xilen-cianol)

Procedimiento:

1. Pesar 0.5 g de Agarosa ultrapura.

2. Disolver la agarosa en 33 mL de agua bidestilada estril con ayuda de un

termoagitador.

3. Agregar 0.2 mL de Xilen-Cianol (50 mg/mL).

4. Dejar enfriar, tapar y etiquetar.

5. Guardar a temperatura ambiente.

Xilen-cianol 50 mg/mL

Procedimiento

1. Pesar 1.0 g de Xilencianol.

2. Disolverlo en 20 mL de agua bidestilada estril.

Solucin Acrilamida 30%/Bisacrilamida 0.8%

(Solucin de acrilamida-bisacrilamida)

Procedimiento


1. Pesar 30 g de acrilamida y disolver en agua bidestilada estril con ayuda de un

termoagitador. Posteriormente, adicionar 0.8 g de bisacrilamida y continuar la

agitacin hasta la disolucin completa de los polmeros.

2. Aforar con agua bidestilada estril en un matraz volumtrico para preparar 100

mL.

3. Cubrir los tubos con papel aluminio y etiquetar.

4. Almacenar la solucin en refrigeracin.

Solucin de Tris Abajo pH 8.8 (4X)

Procedimiento:

1. Pesar 18.17 g de tris base.

2. Disolver en 60 mL de agua bidestilada estril.

3. Agregar 4.0 mL de Dimetilsulfxido (DMSO) 10% a la solucin anterior.

4. Medir el pH de la solucin. El pH final debe ser de 8.8 (s el pH queda muy

bsico, ajustarlo con cido clorhdrico concentrado).

5. Llevar el volumen con agua bidestilada estril en un matraz volumtrico de 100

mL.

6. Almacenar en refrigeracin.

SDS 10%

Procedimiento:

1. Pesar 5.0 g de dodecil sulfato de sodio.


TEMED

1. Tetra-metil-etilen-diamino. Utilizar el reactivo directamente como viene en su

presentacin comercial.

2. Almacenar a 4 C.

Solucin de Persulfato de Amonio al 2%

Procedimiento

1. Pesar 0.4 g de persulfato de amonio.


3. Almacenar en refrigeracin.

Nota: para este reactivo se recomienda preparar poca cantidad ya que

su capacidad de polimerizacin disminuye en tres meses.


SOLUCIN D 10X (Solucin de corrimiento para electroforesis)

Procedimiento:

1. Pesar 12 g de Tris-base y 57.6 g de Glicina.

2. Disolver en agua bidestilada estril y completar el volumen con agua bidestilada

estril en un matraz volumtrico hasta 500 mL.

3. Almacenar a temperatura ambiente.

SOLUCIN E 10X (Solucin de etanol para fijacin)

Procedimiento:

1. Agregar 3.0 mL de cido actico glacial en 287 mL de etanol absoluto.


SOLUCIN F 100X (Solucin de nitrato de plata para la tincin)

Procedimiento:

1. Disolver 3.66 g de nitrato de plata en 20 mL de agua bidestilada estril.


SOLUCIN G 125X (Solucin de revelado)

1. Formaldehdo al 38%. Utilizar el reactivo directamente como viene en su

presentacin comercial.


SOLUCIN DE HIDRXIDO DE SODIO 3% (Solucin de revelado)

Procedimiento:

1. Pesar 3.0 g de NaOH

2. Disolver lentamente en 100 mL de agua bidestilada estril. Precaucin: el

contenedor puede calentarse mientras se prepara la solucin.


SOLUCIN H (Solucin de paro)

1. cido actico glacial grado reactivo. Utilizar el reactivo directamente como

viene en su presentacin comercial.


Nota: para la preparacin de los reactivos antes descritos deber

utilizarse agua bidestilada de calidad certificada y estril.


ANEXO III: ESPECIFICACIONES DE LOS REACTIVOS PARA

ROTAFORESIS

SOLUCIN A 5X

Tris, Tris-Base, Trizma-Base, cristales, peso molecular 121.1 (Roche, Promega,

Sigma).

EDTA, cido Etilen Diamino tetractico, peso molecular 372.26 (Bio-Rad,

Gibco, Boehringer-Manheim).

SDS, Dodecil Sulfato de Sodio, reactivo para electroforesis, peso molecular

288.38 (Bio-Rad).

NaCl, Cloruro de sodio, peso molecular 58.44 (Sigma).

-mercaptoetanol (Sigma).

SOLUCIN B 1X

Fenol, ultra puro, cristales, (Sigma, Invitrogen, Fluka-Biochemika).

Tris, Tris-Base, Trizma-Base, cristales, peso molecular 121.1 (Roche, Promega).

cido clorhdrico (Hycel, Reproqifin).

-mercaptoetanol, 2-mercaptoetanol (Sigma).

8-Hidroxiquinoleina, cristales, peso molecular 145.2, (Sigma).

CLOROFORMO

Cloroformo, grado analtico A.C.S., peso molecular 119.38, (Hycel, Fermont).

ACRILAMIDA

Acrilamida, grado electroforesis o biologa molecular, peso molecular 71.08,

(Sigma, Boehringer).

BIS-ACRILAMIDA

Bis-acrilamida, N, N, Metilen Bis acrilamida, grado electroforesis o grado

biologa molecular, peso molecular 154.2 (Sigma, MP Biomedicals, Bio-Rad).

PERSULFATO DE AMONIIO

Persulfato de amonio, grado electroforesis, (Gibco, ICN, Sigma).

TEMED

Temed, N, N, N, N, Tetra metil etilen diamino, grado electroforesis (Sigma,

Research-Organic, Bio-Rad).


SOLUCIN C 1X

Agarosa, ultra pura, grado analtico (Sigma).

Xilen-Cianol, grado electroforesis (Sigma, Bio-Rad).

SOLUCIN D 10X

Tris, Tris-Base, Trizma-Base, grado molecular cristales, peso molecular 121.1

(Roche, Promega).

Glicina, Glicina ultra pura, grado electroforesis, peso molecular 75.07 (Sigma,

Gibco, Research-Organic).

SOLUCIN E 10X

cido actico glacial, grado reactivo A.C.S. (Merck, Golen Bell)

Etanol absoluto (Hycel, Golen Bell)

SOLUCIN F 100X

Nitrato de plata, reactivo A.C.S. (Sigma, Fermont)

SOLUCIN G 125X

Formaldehdo, (J.T. Baker, Golen Bell)

Hidrxido de sodio, reactivo analtico, grado U.S.P., peso molecular 40.00

(Reproquifin, Quiromed, Fermont, J.T. Baker)

SOLUCIN H

cido actico glacial, grado reactivo A.C.S. (Merck, Golen Bell)


ANEXO IV: ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIN DE REACTIVOS PARA PAGE.

Cuadro 2. Almacenamiento y conservacin de los reactivos para el diagnstico de Rotavirus

Reactivos Temperatura de

conservacin Caducidad

Tipo de almacenamiento

Solucin A 1X Temperatura

ambiente 6 meses Frasco con tapn de rosca

Solucin B Refrigeracin 6 meses Tubo cnico tapn de rosca de policarbonato de 50 mL (Corning)

Solucin C Temperatura

ambiente 6 meses

Frasco de vidrio transparente con tapn de rosca

Solucin D 10X Temperatura

ambiente 6 meses Frasco con tapn de rosca

Solucin E 10X Temperatura

ambiente 6 meses


Solucin F 100X Temperatura

ambiente 6 meses

Frasco con tapn de rosca protegido de la luz

Solucin G 125X Temperatura

ambiente 6 meses


Solucin H Temperatura

ambiente No aplica


Cloroformo Temperatura

ambiente No aplica

Frasco de vidrio con tapn de rosca. Cubrir con papel aluminio

Solucin de hidrxido de sodio al 3%

Temperatura ambiente

6 meses Frasco de vidrio transparente con tapn de rosca

Acrilamida/Bisacrilamida Refrigeracin 3 meses Frasco de vidrio con tapn


de rosca. Cubrir con papel aluminio

Persulfato de amonio 2% Refrigeracin 3 meses Frasco con tapn de rosca protegido de la luz

TEMED Refrigeracin No aplica Frasco de vidrio mbar con tapn de rosca

Solucin tris Abajo Refrigeracin 3 meses Frasco de vidrio transparente con tapn de rosca


ANEXO V: LINEAMIENTOS PARA LA SOLICITUD DE INSUMOS

Poltica para la solicitud de insumos para el diagnstico de rotavirus

por rotaforesis

La Coordinacin de la RNLSP del InDRE, tiene como poltica, proporcionar un

servicio de calidad y respuestas oportunas para los laboratorios integrantes de

la red, la cual est integrada dentro del sistema de gestin de calidad y observa

los procedimientos vigentes y busca la mejora continua de su servicio. Para

cumplir con este propsito se requerir observar los siguientes lineamientos.

Los laboratorios estatales de salud pblica

Solicitar sus insumos para el diagnstico de Rotavirus a travs de un oficio

escrito dirigido al Director General Adjunto del InDRE; con atencin a la

coordinacin de la RNLSP.

Enviar su solicitud el da lunes de la semana anterior al envo.

Debern enviar su solicitud por correo normal, para poder darle trmite de

forma oficial, sin embargo, para asegurar una respuesta oportuna se les

solicita hacer el envo de sus oficios de solicitud escaneados (con nmero de

folios ya asignados y rubricados) por E-mail al correo

[email protected] con atencin a Dra. Herlinda Garca Lozano o

bien por va fax al (01 55) 53420670 o bien al correo

[email protected].

En caso de que no procese muestras o tenga problemas con el diagnstico

implementado deber informarlo va correo electrnico para justificar el no

uso de los reactivos.

Especificar en el oficio de solicitud, el nmero de kit que necesite (kit1, kit 2

o kit 3). No se proporcionan reactivos individuales.

Contar con fondos para cubrir su solicitud en la coordinacin de la RNLSP

del InDRE.

Asegurar que sus servicios de mensajeras tengan un tiempo de entrega de

24 horas para las solicitudes de reactivos.

Considerar que si el envo se planea en mircoles y no lo recolectan, este se

har hasta la semana siguiente.

Considerar las solicitudes de reactivos dos semanas antes de la fecha

estipulada del envo de paneles de evaluacin (ver cronograma). No se

suministrar peticiones de reactivos durante estas fechas.

En caso de tener solicitudes expeditas justificadas y que planee venir por los

insumos al instituto debido a la premura de tenerlos en existencia en su

estado; deber enviar su solicitud, con 48 horas de antelacin y en horario


laboral, en el InDRE es de 8:00 a 16:00 horas, para que se puedan gestionar

sus requerimientos.

Ser responsabilidad del LESP sancionar a la mensajera contratada y si

fuera el caso recuperar el costo de los daos ocasionados, en caso de retraso

y/o extravo del insumo solicitado.

El LESP deber informar a la coordinacin de la RNLSP, a travs de correo

electrnico de las siguientes situaciones relacionadas con el sistema de

diagnstico implementado, descompostura de equipo, reactivos caducos, y

derrame de reactivos durante el envo con la finalidad de darle seguimiento

a su problemtica.

Es responsabilidad del LESP, solicitar al rea de laboratorio de virus

gastrointestinales su Kit de reactivos, con un mes de anticipacin a las

fechas previamente programadas al envo de sus paneles de evaluacin.

rea tcnica: laboratorio de virus gastrointestinales

El tiempo de respuesta ser no mayor a 48 horas, una vez que se ha recibido

la solicitud de insumos por parte de la coordinacin de la RNLSP, considerar

que slo los das de entrega de mensajera son lunes, martes y mircoles.

Los insumos previamente autorizados de las solicitudes respectivas, debern

estar debidamente embalados en cajas de cartn.

Se rotularn las cajas de envo con los datos de la persona a quien se enva y

el lugar, sealando con flechas la orientacin/posicin en que debe

manejarse la caja durante el envo.

Entregar los paquetes a la coordinacin de la RNLSP a la hora acordada, la

cual depender de cada mensajera.

Los envos de reactivos se colocarn en caja de cartn para asegurar la

integridad de la misma y por tanto de los insumos.


ANEXO VII: FORMATO PARA LA VIGILANCIA DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) POR ROTAVIRUS

19LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA DE ROTAVIRUS POR LABORATORIO

Lineamientos Para La Vigilancia de Rotavirus (1)

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