DIVISIN DE BIOTECNOLOGA

MANUAL DE PROYECTOS DE INGENIERA

CONTENIDO:

PROYECTO. EXTRACCIN DE PROTEINAS TOTALESPROYECTO. TRANSFORMACIN BACTERIANAPROYECTO. CARIOTIPO PRCTICA. CROMATINA SEXUALANEXO1. PREPARACIN DE SOLUCIONES ANEXO2. EXTRACCIN DE DNA PLASMDICO

ELABOR:

BIOL. CRISTIAN GILBERTO LVAREZ CRDENAS

AL ALUMNO:

Unos de los principales retos de la ciencia es sin duda encontrar la verdad y la explicacin de los fenmenos que acontecen a nuestro alrededor, es por ello que en esta ocasin se te presentan tres retos o proyectos los cuales debes de conocer manipular y proporcionar su explicacin, jams estars solo en este andar, pues contaras en todo momento con el apoyo de tus maestros, libros, compaeros, entre otros. En este grado que cursas, es importante que comprendas que es el 90% tu responsabilidad el xito de tu proyecto.

Tres factores que debes considerar:a) Los equipos los formara el docente al igual que cuando entras a cualquier trabajo tu no eliges con quien trabajar con ello reafirmaras la tolerancia, el respeto de la opinin de tus compaeros y paciencia. b) En el proyecto, utiliza todo con esterilidad para una mejor calidad y resultado de tu trabajo. Recuerda que este manual es un apoyo ms para la realizacin de tu proyecto. c) El sentido comn es muy importante ya que te ayudara a resolver muchas situaciones que se te presente durante tu proyecto, recuerda que algunas cosas no te lo ensean los libros sino la experiencia propia en el laboratorio y esa misma experiencia es el legado que un servidor quiere que dejes.

Profr. Biol. CRISTIAN GILBERTO LVAREZ CRDENAS

PROYECTO 1. EXTRACCIN DE PROTEINAS TOTALES

Competencia: Conocer la tcnica de extraccin de protenas totales por medio de una tcnica establecida para determinar el peso molecular de cada una de ellas a travs de un marcador molecular.

I. INTRODUCCIN

La extraccin de protenas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los mtodos ms utilizados se basan esencialmente en la destruccin de los lmites celulares por medio de diferentes procedimientos fsicos y/o qumicos con la finalidad de maximizar la liberacin de las protenas de inters. El extracto obtenido es sometido a tratamientos que separan las protenas en diferentes fracciones basados en algunas propiedades tales como tamao o carga mediante tcnicas electroforticas las cuales son tecnologas robustas, verstiles y con alta capacidad de resolucin. La ms utilizadas son: electroforesis unidimensional (SDS-PAGE), bidimensional (2-D PAGE) y electroforesis capilar, entre otras. Uno de los avances ms importantes en los inicios de la Biologa Molecular, fue el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin. Fueron descubiertas en bacterias, y son enzimas que usan para destruir ADN que ingresa a ellas. La enzima EcoRI fue aislada de la bacteria Escherichia coli; constituida en ms del 50 % de su peso seco en protenas ha sido considerada como modelo de estudio en la identificacin y cuantificacin de la misma.Las enzimas de restriccin son protenas cuya funcin es cortar las hebras de ADN. Lo hacen en forma especfica, esto significa que cada enzima de restriccin corta solamente cuando encuentra una secuencia particular de nucletidos, por ejemplo EcoRI reconoce secuencias de seis pares de bases GAATTC/ CTTAAG; estos fragmentos de ADN originados pueden aplicarse para la clonacin celular, anlisis de ADN, mapas fsicos de restriccin, deteccin de polimorfismos, entre otros.II. MATERIAL Y EQUIPO Microcentrfuga refrigerada Tubos eppendorf de 1.5 ml Muestra de trabajo Incubadora Solucin de sulfato de amonio 85% y fosfato de potasio 15% Solucin de SDS 10%:NaCl 2M: y -mercaptoetanol al 2% Solucin de PEG 15% y fosfato de potasio 12% Solucin de Tris-HCl: glicina : SDS : -mercaptoetanol : azul de bromofenol Termmetro Micropipetas de 0.5 a 10 y de 100 a 1000 microlitros Hielo y gradilla para tubos eppendorf

III. METODOLOGA1. Obtener muestra de trabajo (clulas, tejido etc. + solucin buffer homogenizadora FRIO).

2. Centrifugar a 7,000 rpm por 5 min a 4c3. Tirar sobrenadante y resuspender en 400 microlitros de solucin homogenizadora con 15 segundos de Vortex y agregar 1 ml de solucin de lisis celular (SDS al 10% y NaCl al 2M y -mercaptoetanol al 2%) agitar por inversin a temperatura ambiente durante 2min evitando hacer espuma.4. Centrifugar a 5,000 rpm durante 3 min a 4c 5. Recuperar 800 microlitros de sobrenadante pasarlo a otro tubo eppendorf frio y agregar 600 microlitros de sulfato de amonio al 50% y fosfato de potasio al 15% o bien polietilenglicol (PEG) al 15% y fosfato de potasio al 12% pH 86. Recuperar la fase acuosa en caso de NO ser visibles las protenas ir directamente a centrifugacin a 10,000 g por 5 min a 4c7. Tirar sobrenadante y resuspender a las protenas en: Tris-HCl: Glicina: SDS: -mercaptoetanol: azul de bromofenol8. Guarde las protenas en refrigeracin a 4c para su posterior uso o bien a -20c para meses o bien a -80c para aos.9. Antes de cargar la mezcla de protena en solucin se debe de calentar a 40-50c por 10 min y se procede a colocar en el gel de electroforesis de poliacrilamida.

NOTA 1: Las protenas se observaran de color blanco de consistencia acuosa.NOTA 2: En el caso de utilizar bacterias es necesario preparar una solucin de lisis SDS 10%: NaOH 0.2N: -mercaptoetanol 2% en proporcin 3:2:1NOTA 3: En todo momento se recomienda utilizar los materiales estriles.

IV. RESULTADOS Y DISCUSINA) Discute con tus compaeros los errores presentados durante el proyecto y antalos en tu bitcora.B) Elabora un diagrama de flujo donde muestren los pasos de manera resumida con imgenes.C) Los das de entrega de los avances del proyecto lo determinara el docente, as como el contenido del mismo.D) Al finalizar el proyecto, el equipo entregara su informe final a manera de articulo al docente responsable y expondr sus resultados en un pequeo simposio.

V. REFERENCIASGriffiths, K.G, K. (2002). Detection Methods. En: Review of technologies for detecting genetically modified materials in commodities and food. Australian Govemment Analytical Laboratories; Australia. Pp. 122.

Gachet, E., Martn G. G., Vigneau F., Meyer G. 1999. Detection of genetically modified organisms (GMOs) by PCR: a brief of methodologies available. Trends in Food Science & Technology.9: 380-388.

Cumming and Klug, CONCEPTOS DE GENETICA, 2000

PROYECTO. TRANSFORMACIN BACTERIANA

Competencia:El alumno podr transformar una clula procariota (bacteria), por medio de la incorporacin de material gentico extrao para hacerla resistente ante un antibitico del cual no lo hera.

I. INTRODUCCIN

La transformacin gentica de clulas ocurre cuando un fragmento de DNA forneo o externo se introduce a una clula, el cual puede incorporarse a su genoma o permanecer de manera extracromosmico, de modo que al expresarse la informacin de los genes de la bacteria lo hagan tambin los genes incorporados. El organismo ms usado es la bacteria Echerichia coli, debido a su plasticidad fisiolgica por la que soporta fcilmente la produccin de proteinas meteorlogas, asimismo por la facilidad de su cultivo in vitro, entre otros factores.

En los experimentos de transformacin son necesarias dos condiciones, la primera que la bacteria sea capaz de incorporar DNA forneo, a esta condicin se le llama competencia y segundo se refiere a la manera como se presenta el DNA que se pretende introducir a la bacteria.

Algunas bacterias de manera natural son competentes, esto es porque tienen en sus paredes y membranas, proteinas dedicadas al transporte de cadenas de DNA del exterior hacia el citoplasma.

En las bacterias que de manera natural no son competentes, esta caracterstica puede inducirse de manera artificial utilizando una sal (cloruro de calcio). En 1970 dos cientficos desarrollaron un mtodo para dotar a E. coli de la capacidad para capturar y expresar DNA extrao.

II. MATERIAL Y EQUIPO

Cultivo en placa de bacterias resistentes a un antibiticoCultivo de bacterias No resistentes al antibitico seleccionado.Medio LBHieloCloruro de calcio (CaCl2) 0.1 MolarAmpicilina 50 g/ml o bien cualquier otro antibitico de su eleccin.Microcentrifuga refrigeradaMatraz Erlenmeyer de 250 mlTubos eppendorf de 1.5 mlCajas petri estrilesRefrigeradorMedio LB con Ampicilina 50 g/mlMechero bunsen o ficher Glicerol estril 100 %

III. METODOLOGA1. Elabora dos placas con medio de cultivo agar nutritivo, a uno de ellos le colocaras ampicilina 50 g/ml y a otro no.2. Toma una muestra del bao, haz una dilucin 1:10 para cultivar a las bacterias en un estriado cruzado, identifica que bacterias son resistentes al antibitico y cules no. 3. Extrae el plsmido de las bacterias que son resistentes al antibitico y gurdalo para su posterior uso.

Preparacin de clulas calcio competentesEste tratamiento se le hace a las bacterias que no son resistentes al antibitico. Inocula en 5 ml de caldo LB (Luria-Broth) bacterias libres de plsmido, a 37 grados Celsius por 24 horas. Transcurrido el tiempo enfra el matraz en hielo por 15 min, recuerda sacar antes el medio para que se vaya templando poco a poco. Posteriormente llena con cultivo de bacterias dos tubo eppendorf de 1.5 ml, centrifuga a 4650 g (7000 rpm) a 5 min/ 4c Tira el sobrenadante y resuspende el pellet o pastilla en 1ml de CaCl2 al 0.1M, la cual debe de estar fra mantn todo frio en hielo. De nuevo centrifuga a 7000 rpm a 4c por 5min tira el sobrenadante. Resuspende el pellet de nuevo con la solucin de CaCl2 al 0.1M (400l) y agrega 100l de glicerol al 100% estril guarda a las bacterias competentes para su posterior estudio.

Transformacin bacteriana. A uno de los tubos eppendorf adicinale 100 l del plsmido extrado todo debe de estar en hielo. A los dos tubos eppendorf, con y sin plsmido aplcales un choque trmico por incubacin a 42c durante 50 seg. Exactamente, transfiere los tubos a hielo inmediatamente e incbalos por 2 min. (en este paso se introduce el plsmido a la bacteria). Retralos del hielo y coloca los tubos eppendorf en una gradilla a temperatura ambiente durante 10 min. Debers tener 4 cajas de petri con medio de cultivo LB de la siguiente manera:

Tubo con bacterias sin plsmidoTubo con bacterias con plsmido

Una caja con LB-Agar-AgarUna caja con LB-Agar-Agar

Una caja con LB-Agar-Agar+Ampicilina50 g/mlUna caja con LB-Agar-Agar+Ampicilina 50 g/ml

Estriado masivoEstriado cruzado

Anota tus resultados en cuanto a:Forma y color de la colonia:Tincin GramMorfologa:Conteo de colonias

Anota tus conclusiones:

REFERENCIASDesmond S. T. Nicholl. 2008. An Introduction to Genetic Engineering vila, J. 2008. Universidad Nacional Autnoma de Mxico, tcnicas bsicas de biologa molecular, primera edicin, Mxico, D.F.

PROYECTO. CARIOTIPO

Competencia:Realizar un cariotipo humano a partir de linfocitos de sangre perifrica para conocer la existencia de aberraciones cromosmicas, comprendiendo los mecanismos que las producen y sus consecuencias.I. INTRODUCCIN.Los cromosomas son las estructuras formadas por la condensacin de la cromatina durante los procesos de divisin celular. Se tien intensamente con colorantes bsicos que interaccionan con el DNA. Los cromosomas mitticos humanos cuando estn duplicados tienen una forma similar a una X. Las cromtidas hermanas se mantienen unidas por una regin de constriccin primaria llamada centrmero. Su posicin es variable; si se encuentra en la parte media, los cromosomas son metacntricos; si se encuentra desplazado hacia un extremo (dando brazos de diferente tamao, p y q), produce cromosomas Submetacntricos; si est cerca del extremo final sern acrocntricos y si es terminal telocntricos. En el humano existen normalmente cromosomas de los tres primeros tipos, no existiendo telocntricos, los cuales se observan en otros organismos, como por ejemplo el ratn.

Una constriccin secundaria puede ser observada en cualquiera de los cromosomas, la ms frecuente es la que producen los satlites citolgicos en los cromosomas acrocntricos humanos. El trmino cariotipo se refiere al arreglo sistematizado del complemento cromosmico de una clula. Si el cariotipo es representado en forma diagramtica o matemtica se obtiene un ideograma.

La clasificacin bsica de los cromosomas humanos en metafase fue derivada de conferencias en Denver (1960), Londres (1963) y Chicago (1966). Se acord numerar los autosomas en pares del 1 al 22 de acuerdo al tamao decreciente y posicin del centrmero principalmente. Los 22 pares de autosomas se dividen en 7 grupos (A-G ) los cuales son fcilmente distinguibles con tinciones comunes. Los cromosomas sexuales fueron designados X y Y y se arreglan separadamente cuando es posible o en la vecindad de los grupos de autosomas que son similares en tamao y morfologa (el X en el grupo C y el Y en el G). El complemento cromosmico de la mujer es 46,XX y el del hombre 46,XY.

Para lograr la identificacin individual de los cromosomas es necesario recurrir a otros mtodos como autorradiografa o tinciones y tratamientos especiales que producen un patrn de bandas especfico a lo largo de cada cromosoma. Tales mtodos incluyen el uso de colorantes fluorescentes, enzimas proteolticas, detergentes, soluciones hipertnicas, calor, etc.

La mayora de los estudios citogenticos se realizan a partir de linfocitos de sangre perifrica. La divisin de estas clulas se induce in vitro mediante mitgenos como la fitohemaglutinina. Sin embargo, es posible utilizar cualquier clula en divisin. La acumulacin de metafases se logra inhibiendo la formacin del huso mittico con colchicina.

Una anormalidad cromosmica, ya sea en nmero o estructura que lleve a prdida o ganancia de material gentico, producir un desarrollo embrionario anormal. Esto conducir a diferentes malformaciones que dependern de los cromosomas implicados y de la cantidad de material cromosmico ganado o perdido, siendo la prdida mucho ms severa.

Las aberraciones cromosmicas numricas incluyen las aneuploidas (nmeros cromosmicos mltiplos exactos del nmero haploide) como las triploidas y las tetraplodas y las aneuploidas (mltiplos inexactos del nmero haploide) como las monosomas y trisomas. Las fallas en el proceso de divisin que llevan a estas anormalidades pueden ocurrir tanto durante la meiosis como durante la mitosis.

Las anomalas estructurales son rearreglos cromosmicos resultantes de rupturas en uno o ms cromosomas con la subsecuente reunin de los extremos en forma tal que se altera el orden lineal del material gentico. Entre las principales aberraciones estructurales estn las delecciones o prdidas, inversiones peri o paracntricas, anillos, duplicaciones, isocromosomas y translocaciones balanceada o no.

La frecuencia de aberraciones cromosmicas en recin nacidos vivos es de 1-2%, siendo similar la proporcin entre anomalas numricas y estructurales. No obstante la frecuencia de alteraciones citogentica se eleva considerablemente en productos de aborto espontneo hasta 20 - 50%. Combinando ambas se puede concluir que de 4 a 20% de todas las concepciones son cromosmicamente anormales. Las indicaciones para realizar un estudio citogenticos son principalmente cuando existen rasgos dismrficos, retraso mental y psicomotor, corta estatura, genitales ambiguos, falta de desarrollo puberal, amenorrea primaria o secundaria, aborto habitual, infertilidad, procesos malignos o ser padres de productos fallecidos no estudiados o con rearreglos estructurales.II. MATERIAL Y EQUIPO

1 mL de sangre venosa heparinizada.Jeringa desechable estril de 5 mL.Jeringa desechable estril de 10 mL con aguja 20x32 mm.1 Frasco vial con tapn estril.1 Pipeta graduada de 1 mL estril.1 Tubo cnico de centrfuga de 15 mL o 2 tubos de 13x 100 mm.1 pipeta de 10 mL.2 vasos de precipitados de 100 mL.5 Portaobjetos.2pipetas Pasteur con bulbo.Heparina.Medio de cultivo Mac Coy 5a suplementado con 10% suero fetal bovino, penicilina (2,000 U/ mL) y estreptomicina (275 g/mL).Fitohemaglutinina.Solucin de Colchicina 0.02% (en agua destilada estril).Solucin hipotnica de KCl 0.075 M (a 37C).Fijador Metanol-cido Actico Glacial 3:1. Este reactivo deber prepararse en el momento en que va a utilizarse y manejarse con extremo cuidado.Colorante de Giemsa.Aceite de inmersin.

III. METODOLOGA.1. Tomar 2 mL de sangre venosa con una jeringa de 5 mL heparinizada (0.2 mL de heparina) en condiciones mximas de asepsia. La muestra debe obtenerse 48-72 hr. antes de la prctica.2. Con la jeringa o la pipeta de 10 mL y en condiciones estriles, aadir a cada frasco vial, 5 mL de medio de cultivo suplementado, 0.2 mL de fitohemaglutinina y 7-9 gotas de sangre heparinizada. La sangre debe aadirse quitando la aguja de la jeringa. Incubar a 37C.3. Transcurridas 46-70 horas de incubacin, esto es, 2 horas antes de la prctica, aadir a cada vial 0.5 mL de la solucin de colchicina y continuar incubando a 37C hasta completar las 48-72 horas de incubacin.4. Se procede a la cosecha. Vaciar el contenido de cada frasco, agitndolo previamente, a un tubo de centrfuga (pueden utilizarse tubos de 13x100 mm). Centrifugar a 2500-3000 r.p.m. durante 5 min.5. Decantar el sobrenadante o eliminarlo con pipeta Pasteur. Resuspender el botn en el Vortex y aadir, con agitacin, 5 mL de solucin hipotnica de KCl, la cual deber estar a 37C. Dejar reposar a 37C durante 30 minutos.6. Centrifugar a 2500-3000 r.p.m. durante 5 minutos, eliminar el sobrenadante. Agitar directamente en el Vortex y entonces agregar GOTA A GOTA el fijador SIN DEJAR DE AGITAR, hasta completar 5 mL . Dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.7. Centrifugar 5 min. a 3000 r.p.m., eliminar el sobrenadante, resuspender el botn y agregar 5 mL de fijador como se seal anteriormente. Centrifugar nuevamente. Repetir esta operacin hasta obtener un botn blanco y un sobrenadante transparente (aprox. 4-5 veces).8. Decantar el sobrenadante y aadir unas gotas de fijador para resuspender el botn. Tomar todo el volumen con la pipeta Pasteur y dejar caer desde una altura de 10-15 cm una o dos gotas de la suspensin sobre cada portaobjetos perfectamente limpio, desengrasado y seco. Dejar reposar las laminillas al aire y teir con colorante de Giemsa durante 5 minutos. Lavar con agua corriente y dejar secar al aire.9. Observar al microscopio primero a bajo aumento para localizar las metafases. Una vez localizadas, observar a inmersin y proceder a contar e identificar los cromosomas con ayuda de un esquema adecuado.

IV. RESULTADOS Y DISCUSINA) Discute con tus compaeros los errores presentados durante el proyecto y antalos en tu bitcora.B) Elabora un diagrama de flujo donde muestren los pasos de manera resumida con imgenes.C) Los das de entrega de los avances del proyecto lo determinara el docente, as como el contenido del mismo.D) Al finalizar el proyecto, el equipo entregara su informe final a manera de articulo al docente responsable y expondr sus resultados en un pequeo simposio.

V.BIBLIOGRAFA.- Jacques Perrillat D, Cervantes Peredo A. 1982. Malformaciones congnitas secundarias anomalas cromosmicas. Rev Med Hosp Gen Mex XLV: 340-349.- King C. 1980. Cariotipo, Cuando solicitarlo y por qu. Tribuna Mdica XXXIX: 1-5.- Salamanca F. 1988. Citogentica humana. Mdica Panamericana. Mxico. pp 400- Therman E, Susman M. 1993. Human chromosomes. Structure, behavior and effects. Spinger- Verlag. New York. pp. 376.- Thompson MW, Mc Innes RR, Willard HF. 1991. Genetics in medicine. WB Saunders. Philadelphia. pp. 500.- Verma RS, Babu A. 1995. Human chromosomes, principles and thecniques. 2nd. ed Mc. Graw Hill USA. pp. 419.

PRACTICA. Cromatina sexualCompetencia: determinar la presencia del corpsculo de Barr y el palillo de tambor en clulas femeninas con tinciones utilizadas en qumica forense.0. Introduccin. La informacin gentica de una persona es llevada por los cromosomas, quienes contienen un ncleo celular. Los cromosomas son casi incoloros pese a su significado de cuerpo coloreado pero su nombre es por la capacidad de teirse oscuro con diversos pigmentos, la cromatina es un material complejo del cual estn formados los cromosomas. Villee (1998)Barr y Bertram (1949) al observar descubrieron diferencia entre macho y hembra en el proceso de la interfase de los ncleos somticos .Este descubrimiento es debido a la presencia de una pequea masa de cromatina sexual, el cual es llamado cuerpo de Barr, el cual es formado en la hembra normal pero no en el macho.Este descubrimiento ayudo bastante para relacionar con algunas anomalas sexuales y la determinacin del sexo entre el hombre y los mamferos.El cuerpo de Barr se puede identificar en gran cantidad de clulas de tejidos femeninos humanos en la mujer los leucocitos polimorfo nucleares muestran palillos de tambor lobulacion pedunculada del ncleo. Cuerpo de Barr 0. Clulas de hembra normal tienen cuerpo de Barr0. Clulas de macho carecen de cuerpo de Barr0. Personas con tres cromosomas x (sndrome XXX o XXXY) tienen dos cuerpos de BarrPalillo de TamborEs observado el 5% de los leucocitos polimorfo nucleares de la mujer normalComposicin y estructura de la cromatinaLa cromatina tiene la apariencia de masas de fibrillas de 100 A de dimetro, su forma es ms densa que compacta.La cromatina est compuesta de ADN, protenas histonicas, protenas no histonicas y ARN.El ADN en la cromatina se encuentra protegido probablemente de histonas, su estructura depende de interacciones inicas.Las histonas aisladas de la cromatina se agrupan en forma de ol gomeros, la estructura de la cromatina se basa en una unidad formada por dos de cada uno de los cuatro tipos importantes de histonas y cerca de 200 pares de bases de ADN.0. Materiales. Material biolgico Material qumico Equipos y otros

Mucosa bucalSangre Giemsa de pH neutroAlcohol etlicoAgua destilada Porta y cubre objetosMicroscopio compuestoGotero Esptula Aguja

0. Procedimiento.Corpsculo de Barr.0. Limpiar la boca con buches de agua, varias veces.0. Con la esptula raspe la mucosa y deseche el 1er material obtenido.0. Volver a raspar la mucosa, colocar el material obtenido en un porta objetos limpio y hacer un frotis delgado. Fijar durante 5 minutos con alcohol etlico al 95%.0. Realizar la tincin de la preparacin con Giemsa de pH neutro durante 5 a 8 min.0. Colocar un cubre objetos y eliminar el exceso del colorante mediante un pao absorbente. Observar.Palillo de Tambor.0. Obtener una muestra de sangre, pinchando un dedo y realizar el frotis correspondiente.0. Fijar con alcohol, hasta que este se evapore.0. Teir con Giemsa de pH neutro por 8 minutos. Lavar y dejar secar.0. Observar el palillo de tambor.0. Resultados.0. Discusin.El corpsculo de Barr es una pequea masa oscura que a veces se presenta en forma plana convexa la cual se comprime con la superficie interna de la cubierta nuclear.Mide aproximadamente 1 micra de dimetro y que es netamente visible en la muestra vista por el microscopio, no todos lo ncleos femeninos presentan cromatina sexual ya que puede hallarse arriba o abajo del ncleo aplanado.Algunos ncleos de clulas masculinas presentan pedacitos de cromatina condensada cerca de la membrana nuclear, que remeden cuerpos de Barr (Hamma 1972).Barr y Bertram (1949) al observar descubrieron diferencia entre macho y hembra en el proceso de la interface de los ncleos somticos.Este descubrimiento es debido a la presencia de una pequea masa de cromatina sexual, el cual es llamado cuerpo de Barr, el cual es formado en la hembra normal pero no en el macho.Este descubrimiento ayudo bastante para relacionar con algunas anomalas sexuales y la determinacin del sexo entre el hombre y los mamferos.El cuerpo de Barr se puede identificar en gran cantidad de clulas de tejidos femeninos humanos en la mujer los leucocitos polimorfo nucleares muestran palillos de tambor lobulacion pedunculada del ncleo. En la muestra de mucosa bucal usamos la de una compaera y esta presentaba solo un corpsculo o pequea mancha oscura que estaba adherida al ncleo de la clula lo cual apoyamos la deduccin del Barr. Ya que en esa deduccin el afirma que la mujer solo presenta un solo corpsculo. El palillo de tambor es un tamborcillo o lbulo adherido a la clula.Cuestionario:1. Qu importancia tiene el conocer el corpsculo de Barr y el palillo de tambor en un anlisis forense?2. Esquematiza lo observado en cada frotis.

Saliva sangre3. Qu funcin tiene el colorante Giemsa y que otros colorantes se podran utilizar?

Cardoso, Horacio: Citogentica bsica y biolgica de los cromosomas, 1973, Org. De los EE.UU.Montevideo Uruguay, Pg. 32 - 35

ANEXOS. Preparacin de soluciones

Solucin homogenizadora: para 10 ml agregar 50 microlitros de Tris-HCl (3 mM) pH 7.4 y 1.6 mililitros de Sacarosa (320 mM) aforar a 10 ml.Solucin de lisis: 10mM Tris; 400 mM NaCl; 2 mM Na2*EDTA, 30L SDS al 20% en TAE 1XPrepare cada una de las soluciones de manera independiente y posteriormente mezcle todas ellas.Solucin de carga para protenas: Tris-HCl 50mM: Glicina 80%: SDS10%: -mercaptoetanol 2%: azul de bromofenol 0.0125grBuffer TE; (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA) manejar una proporcin 3:1Prepare cada una de las soluciones de manera independiente y posteriormente mezcle todas ellas.Buffer GTE 1X pH 8.0:Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM y 10 mM de EDTAPrepare cada una de las soluciones de manera independiente y posteriormente mezcle todas ellas.PARA: SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)Gel separador

El volumen total es de 8 mL (suficiente para dos minigeles de 10 x 8 cm)

Para geles con concentracin de: - 12% - 10% - 8% - 6% -Mezcla de acrilamida/bis acrilamida - 4.32 mL - 3.6 mL - 2.884 mL - 2.16 mL -Tris-HCl 1 M pH 8.8 - 3 mL - 3 mL - 3 mL - 3 mL - Agua BD - 560 L - 1.28 mL - 1.996 mL - 2.72 mL - SDS al 10% - 80 L - 80 L - 80 L - 80 L - (APS) Persulfato de amonio al 10% - 40 L - 40 L - 40 L - 40 L TEMED - 5 L - 5 L - 5 L - 5 L -Gel concentradorEl volumen total es de 4.5 mL (suficiente para dos minigeles)~4.8% acrilamida/bis1). 1 mL mezcla de Acrilamida/Bisacrilamida2). 2.8 mL Agua BD3). 625 L Tris-HCl 1 M, pH 6.8 4). 50 L de SDS al 10% 5). 25 L de Persulfato de amonio al 10%6). 5 L TEMED

Acrilamida-Bisacrilamida (relacin 3:1) 1). 22.2 g acrilamida2). 0.6 g bis-acrilamida3). Aforar a 100 ml con agua BD.Buffer de corrida1). 57.6 g Glicina 2). 12 g Tris base 3). 4 g SDS 4). Aforar a 4 L con agua BDSolucin de tincin1). 2.5 g Azul Brillante Coomassie R-2502). 450 mL metanol 3). 100 mL cido actico glacial 4). Aforar a 1 L con agua BDSolucin destiidora1). 300 mL metanol 2). 400 mL cido actico 3). Aforar a 4 L con agua BD

Buffer de muestra 5X (10 mL)

1). 3.125 mL Tris-HCl 1 M, pH 6.8 2). 1 g de SDS3). 2.5 mL de glicerol 4). 75 L de azul de bromofenol al 2% disuelto en etanol puro. 5). 1 L de 2-mercaptoetanol 6). Aforar a 10 mL con agua BD

Preparacin de Solucin stock de Buffer TAE 10x.Tris Base48.4 gcido Actico11.42 mLEDTA (0.5M pH 8)20 mLAgua destilada c.b.p.1000 mL

1. Disolver el tris con calor en un vaso de p.p. de 1L.2. Agregar el cido actico.3. Agregar el EDTA (0.5M pH 8)4. Transferir la solucin a una probeta de 1000mL (Realizar 2 3 enjuagues con agua bidestilada estril).5. Llevar este volumen a 1000 mL con Agua bidestilada estril.6. Sellar la probeta con parafilm y agitar vigorosamente.7. Rotular como Buffer TAE 10X.8. Esterilizar en autoclave.9. Almacenar a T. A.NOTA: Para obtener una solucin de trabajo Buffer TAE 1X realizar una dilucin 1:10 en un volumen finales de 1000mL mediante la frmula: C1 V1 = C2 V2. Donde:C1 = Concentracin inicial (10XV1 = Volumen inicial (Incgnita)C2 = Concentracin final (1x)V2 = Volumen final (1000mL)

Despejando:V1 = C2 V2Sustituyendo:V1 = (1*)(1000Ml)=100mLC110*Por lo que hay que tomar 100mL de Buffer TAE 10x y llevar este volumen a 1000mL con Agua bidestilada estril.NOTA: La misma frmula aplica para obtener una solucin de trabajo de Buffer de carga Azul de bromofenol 2x a partir de la solucin stock 6x.

Anexo 2. Preparacin de Solucin stock de Buffer de Carga Azul de bromofenol 6x.Azul de Bromofenol0.25% 2XGlicerol30% Agua destilada c.b.p.100%

Para preparar 5mL de Solucin stock de Buffer de Carga Azul de bromofenol 6x:1. Pesar 0.0125 de Azul de Bromofenol y depositarlo en un vaso de p.p. de 10mL.2. Aadir 2mL de agua bidestilada estril.3. Medir y agregar 1.5 de glicerol con una pipeta sexolgica de 5mL con agua bidestilada estril. (Realizar 2 3 enjuagues con agua bidestilada estril).4. Llevar este volumen a 5mL con agua bidestilada estril.5. Sellar el vaso de p.p. con parafilm y agitar vigorosamente con Vortex hasta homogenizar.6. Alcuota la solucin obtenida en tubos de microcentrifuga de 1.5 mL y rotular como Buffer de carga 6x o Loading buffer 6x.7. Almacenar a 4.NOTA: Para obtener una solucin de trabajo Buffer de carga Azul de Bromofenol 2X realizar una dilucin 1:3 en un volumen final de 1.5 ml.

PREPARACIN DEL COLORANTE GIEMSACOLORANTE GIEMSA PURO CERTIFICADO 0.75 gr.ALCOHOL METILICO PURO 65 mlGLICERINA PURA 35 ml

A un frasco de vidrio de color mbar conteniendo perlas de vidrio de dimetro no mayor de 5 mm, se agrega la glicerina; luego se adiciona el colorante Giemsa, se va agitando. Finalmente, se adiciona el alcohol metlico.

Agitar el frasco intensamente varias veces al da, durante tres das como mnimo.

Extraer diariamente una pequea muestra del colorante preparad, filtrarla a travs de papel filtro # 2, y probar con frotis sanguneos recin preparado.Cuando los elementos de la sangre aparezcan con sus colores apropiados, entonces el colorante est listo para ser utilizado.El diluyente es una solucin amortiguadora y se usa en la preparacin decolorante diluido o solucin de trabajo. Las sustancias amortiguadoras actan como un adaptador que inactiva dentro de un margen limitado cantidades variables de cido o lcali.Frmula: Ortofosfato disodico anhidro 4 g Ortofosfato monopotsico 5 g Preparacin: Mezclar bien, y disolver 1g de la mezcla en un litro de agua destilada ajustar el pH a 7,2.Preparacin de la mezcla de trabajo:Solucin madre Giemsa 0.05 mLSolucin amortiguadora 0.95 mL

Anexo 2. Extraccin de DNA plasmdico.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO - Tubos Eppendorf, Micropipetas, puntas estriles, pipetas Pasteur, agua estril, Microcentrfuga. - Clulas E.coli transformadas: suspensin en medio LB/Amp 50 g/ml- Solucin de resuspensin - Solucin de lisis - Solucin 3M de acetato potsico 3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Cultivo de bacterias Paso 1. Se preparan frascos de cultivo o tubos con medio LB estril, a los que se aade en el momento de cultivar ampicilina a una concentracin final de 0,1 mg/ml (ya que estamos trabajando con plsmidos que poseen el gen de resistencia a este antibitico). Paso 2. Se toman colonias individuales de la placa de agar, pasndolas al medio lquido, y se incuba una noche a 37C, con agitacin. 3.2. Extraccin del DNA plasmdico

Si bien existen kits comerciales para preparar DNA plasmdico, la realizacin de este protocolo se considera formativo, sencillo y permite obtener de modo rutinario DNA plasmdico con un grado de pureza aceptable. El material que entre en contacto con el cultivo de bacterias deber desecharse en un recipiente con leja.

1. Se toma 1 ml del cultivo de bacterias y se centrifuga en un tubo eppendorf durante 2 min (14000 rpm). Se elimina el sobrenadante por inversin del tubo o con ayuda de una pipeta, dejando el sedimento lo ms seco posible.

2. Se resuspende el sedimento de bacterias en 250 l de tampn de resuspensin empleando una pipeta (aspirar y expulsar el lquido varias veces sobre el sedimento hasta que desaparezca ste). Se incuba 2 min a temperatura ambiente.

3. Se aaden al tubo 250 l de la solucin de desnaturalizacin NaOH/SDS (0.2N-10%) respectivamente. Se agita el tubo por inversin suave (observar el aspecto y viscosidad de la disolucin). Posteriormente se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.

4. Se aaden a continuacin 300 l de acetato potsico 3 M y se mezcla el contenido del tubo (observar el aspecto del tubo, aparecer una turbidez blanca al precipitar las protenas y el DNA cromosmico). Se incuba 10 min en hielo.

5. Se centrifuga 10 min (14000 rpm) a 4c.

6. Con ayuda de una pipeta se transfiere cuidadosamente la fase acuosa sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo. Si la fase acuosa no est suficientemente limpia, y contiene restos del precipitado blanco, volver a centrifugar los tubos.

7. En este sobrenadante se encuentra RNA y el DNA plasmdico. Estos cidos nucleicos se precipitan con 2 volmenes de etanol absoluto fro. Mezclar bien por inversin y guardar a -20C durante al menos 20 min (congelador).

8. Pasado este tiempo, se centrifuga durante 30 min a 14000 rpm.

9. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El precipitado se lava de nuevo con 0,5 ml de etanol 70% fro (20 min, centrifugacin).

10. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El precipitado casi invisible, que contiene DNA plasmdico y RNA, se debe secar completamente para eliminar los restos de etanol que pueden interferir con procesos posteriores. El precipitado se disuelve en 25 l agua estril.11. Finalmente se aaden 0,5 l de una solucin de RNasa (1 g/ml) y se incuba 20 min a temperatura ambiente. Este tratamiento con RNAasa, degrada el RNA quedando una preparacin purificada de DNA plasmdico. Una alternativa a este paso es incluir la RNasa en el tampn inicial de resuspensin o tampn de lisis

4. RESULTADOS ESPERADOS El mtodo empleado para la obtencin del plsmido se denomina de "lisis alcalina": se basa en la desnaturalizacin y precipitacin selectiva del DNA cromosmico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA plasmdico permanece intacto debido principalmente a su pequeo tamao y su naturaleza circular y superenrollada. El tratamiento con alta concentracin de sal (acetato potsico) y SDS produce la precipitacin de gran parte de las protenas. El tratamiento con RNasa elimina la contaminacin de RNA que puede ser importante. La purificacin del DNA plasmdico se completa entonces por precipitacin con etanol. Es posible obtener DNA plasmdico con diferente grado de superenrrollamiento que se puede visualiza tras la separacin por electroforesis y tincin con Bromuro de Etidio.