MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE MICROBIOLOGÍA

Nº 1. PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA DE MUESTRAS PARA CULTIVOS AERÓBICOSOBJETIVORealizar el procedimiento de siembra de las muestras microbiológicas que se reciben en laboratorio para cultivos aeróbicos en forma correcta para obtener resultados confiables. Esto permite obtener colonias aisladas de microorganismos para proceder a su estudio (identificación y susceptibilidad si corresponde).DESARROLLO DEL PROCESOInsumos: Medios de cultivos sólidos y/o líquidos de acuerdo a proceso a realizar, pipetas pasteur, asa de micron, gradilla de tubos, portaobjetos, guantes, mascarillasEquipos: estufa de incubación de atmósfera normal y de CO2, mechero, gabinete bioseguridad, vortex, centrífugaConsideraciones generales:Mantener durante todo el proceso las precauciones estándaresUtilizar técnica asépticaDurante el proceso mantener ventanas cerradasRealizar con mechero encendido, 5 centímetros proporciona un área no contaminadaReunir todos los materiales necesarios para la siembra (placas, portaobjetos etc.)Mantener área de trabajo despejada y cómoda para realizar procesos (solo con material necesario)Esterilizar las asas antes de usarlas y enfriarlas antes de tomar muestra.Entre cada placa siempre esterilizar el asaMarcar placas y porta objetos con el No de petición de la muestra antes de la siembra Procedimiento:1. Técnico paramédico de la sección de microbiología o urgencia (según el horario) es responsable de la recepción de la muestra, verificar el nombre en el frasco o torula con la orden de examen, ingreso al sistema informático, e impresión de las etiquetas con códigos de barra correspondientes para cada muestra (según procedimiento de recepción y almacenamiento de muestras biológicas en el laboratorio Clínico, Manual de Toma de Muestras)2. Prende el mechero, se coloca guantes de procedimiento y mascarilla.3. Verifica nuevamente el nombre del paciente con la orden de trabajo. Revisa las placas y los tubos de medios de cultivo que corresponde utilizar según el tipo de muestra, (revisar Tabla: Medios de cultivo para la siembra de muestras de microbiología (anexo 1) que se encuentra en área de siembra, frente a mechero.)4. Etiqueta con los códigos de barra las placas, tubo con caldo y portaobjeto (en caso necesario).5. El procesamiento de la muestra para su siembra dependerá del tipo de muestra y de cómo haya sido tomada, a saber, en torula, líquidos y secreciones en recipientes estériles y trozos de tejidoEl principio general es siempre sembrar primero el (los) medio(s) de cultivo solido, luego el medio de cultivo liquido y por ultimo realizar frotis para tinción.Para determinar la secuencia en que deben ser sembrados los medios de cultivo, siempre de debe empezar por el medio menos selectivo, para seguir con el medianamente selectivo y al final el más selectivo. 6. A continuación se describe la técnica de siembra según el tipo de medio de cultivo y de muestra.Siembra en placaSe obtiene colonia aisladas por medio del arrastre y separación. Con el asa ya esterilizada, se toma una gota de líquido o de una emulsión del producto patológico y se deposita en un costado del agar de una placa Petri, se estría a partir de ese. En caso de muestras que se reciben en torulas, se realiza con esta la primera de las estrías procediendo después a diseminar con el asa o pipeta.

a. Esterilización simple: Utilizada principalmente para la mayoría de las muestras. Se inocula en el primer cuadrante. Se esteriliza el asa solo una vez y luego se disemina el 2o y 3er cuadrante. Si tiene varias placas, inocule primero en el primer cuadrante todas las placas y luego disemine.b. Esterilización doble: Utilizada principalmente para muestras con mucho inoculo bacteriano, como deposición. La diferencia radica en agregar una segunda esterilización del asa entre el 2° y 3° cuadrante. Si tiene varias placas que sembrar, inocule primero en el primer cuadrante de cada una de las placas y luego disemine con asa.Siembra en tubos de agar tendidoEl borde del tubo debe ser flameado antes y después de ser sembrado. Con el asa previamente esterilizada a la llama, se toma una pequeña cantidad de la muestra y se lleva al fondo del tubo, luego se estría suavemente la superficie del medio en forma ondulante. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo, debe dejarse suelto el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. Ejemplo Agar Sabouraud, Agar Citrato Siembra en superficie y picaduraEl inoculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estría ondulada. Debe flamearse el borde del tubo antes y después de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. Ejemplo Agar TSI, Agar LIASiembra en profundidadEl inoculo se introduce como una picadura en el medio de cultivo cuidando que sea de manera recta y central hasta el fondo del tubo. Se debe hacer el mismo trayecto de entrada y salida. Ejemplo agar MIOSiembra de inoculo longitudinalmente y diseminación con estría únicaRecuento de colonias por siembra de un inoculo conocido a lo largo de la placa y diseminado posteriormente. Usado principalmente para orina y otras muestras respiratorias como Lavado broncooalveolar (LBA). Un inoculo determinado se siembra con una línea que atraviesa longitudinalmente la placa (en el caso de orina o 1/6 de la placa) y luego se disemina el inoculo primario con una estría única.Siembra en medio liquidoAl inocular un medio líquido, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo, cuando este se endereza el material se encuentra bajo la superficie del medio. Al inocular el medio liquido con torula o con inoculo liquido se deposita este en el fondo del tubo. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de efectuada la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. Ejemplos: thioglicolato, caldo soya7. El procedimiento específico de siembra para otras muestras se describe en los procedimientos correspondientes (ej. tejidos en Cultivos de secreciones de piel y tejidos blandos)

Nº 2. PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE TINCIONES DE MICROBIOLOGÍA OBJETIVORealizar técnicas que requieren tinciones simples y diferenciales para el estudio microscópico de las muestras clínicas y aislamientos microbiológicos de acuerdo a métodos estandarizados para un adecuado diagnostico microbiológico.En este Procedimiento se incluyen las Técnicas de ejecución de los siguientes exámenes:Tinción de GramTinción de KinyouTinta chinaTinción violeta-bicarbonato

Leucocitos fecalesTinción de azul de toluidina para Pneumocystis jiroveciLa tinción de Ziehl Neelsen modificado para Cryptosporidium y Examen de gota gruesa están incluidos en procedimiento no 17: P. Técnicos de diagnostico de parasitología clínica de este manual.La tinción con KOH para hongos está incluida en procedimiento n° 18: P. Técnico de diagnostico de micología clínica.DESARROLLO DEL PROCESOEl tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, capsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucléicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina acida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudan.Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el acido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora si podrá atacar el colorante.Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopia, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad esta en revelar la presencia de capsulas alrededor de las células bacterianas.Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.1 TINCION DE GRAM- Hacer extendido, fijar a temperatura ambiente o calor suave

- Colorear con cristal violeta al 1% o violeta genciana durante 60 segundos, cuidando que el colorante cubra toda la preparación.- Eliminar el exceso de colorante y lavar rápidamente con un chorro suave de agua, manteniendo la lámina en posición inclinada.- Cubrir la preparación con la solución de lugol (mordiente), dejándola actuar durante 60 segundos. Lavar nuevamente con agua.- Decolorar con alcohol - acetona (mezcla 1: 1) durante 10 segundos.- Lavar con agua- Colorear con el colorante de contraste que es la safranina durante 30 segundos.- Lavar con agua, secar y observar al microscopio utilizando el objetivo de inmersión.- Las bacterias que retienen el colorante se denominan GRAM POSITIVAS y se observan de color AZUL- Las bacterias que se decoloran con el alcohol – acetona y se tiñen con la safranina se denominan GRAM NEGATIVAS y se observan de color ROSADO.- La fase de decoloración con alcohol- acetona constituye la etapa más importante de la tinción de Gram y en ella reside su carácter diferencial.

2 TINCION DE KINYOUSe utiliza para diferenciar entre Actinomyces y NocardiaTécnica:- Hacer frotis, dejar secar a temperatura ambiente.- Cubrir la lamina con carbol-fucsina durante 3 minutos (no calentar)- Lavar y decolorar con agente decolorante durante 5 - 10 segundos.- Colocar azul de metileno como contraste por 30 segundos- Lavar con agua- Secar- Interpretación: Es positivo cuando se tiñe rosa fuerte (Nocardia)- Es negativo cuando se tiñe azul (Actinomyces)

3 TINCION DE TINTA CHINA PARA Cryptococcus neoformansTinción negativa o tinción de tinta china, que tiñe toda la preparación excepto la capsula y permite hacer un diagnóstico presuntivo de criptococosis. La ejecución de este examen es responsabilidad del Tecnólogo Medico- Se realiza a partir del sedimento del LCR, tras centrifugación, colocando en un portaobjetos una gota de sedimento y otra de tinta china comercial- Mezclar y poner un cubreobjetos - Observar al microscopio óptico con objetivo 40x. Hay que examinar el porta completo. La sensibilidad de la tinción oscila entre el 25-50% en los casos de meningitis, aunque en los pacientes con sida puede ser mayor. Pueden producirse falsos resultados positivos en presencia de levaduras de los géneros Rhodotorula y Cándida, de otras especies de criptococos, Klebsiella pneumoniae, así como por artefactos. Es importante diferenciar bien la célula con doble pared refringente, con su capsula, y hay que buscar células en fase de gemación. La técnica requiere personal entrenado y siempre hay que confirmar este diagnostico inicial con el cultivo.

4 TINCION VIOLETA – BICARBONATOTinción utilizada para detectar la presencia de Campylobacter sp.- Se realiza un extendido de la muestra de deposición (idealmente muestra fresca).- Luego es tenido con partes iguales de Cristal Violeta y Bicarbonato de Sodio al 1%, durante uno a dos minutos.

- Luego las laminas se leen con aumento de 100x y se considera positiva la presencia Bacilos Gram Negativos de formas espirilares o semejantes a gaviotas. Se informa como “Se observa morfología sugerente de Campylobacter”.- Si después de revisar 50 campos no se observan estas formas espirilares, se considera negativa.

5 LEUCOCITOS FECALES5.1 OBJETIVOS: Diferenciar una diarrea infecciosa de tipo no inflamatorio (enterotoxina) de una diarrea de tipo inflamatoria (citotoxina).5.2 FUNDAMENTO: La Tinción con Azul de Metileno, se usa en la búsqueda de leucocitos fecales, la cual permite una buena tinción de los núcleos de estas células (polimorfonucleares), y de esta manera se pueden visualizar al microscopio.5.3 MATERIALES E INSUMOS- Frasco plástico de tapa rosca, debe estar limpio no necesariamente estéril- Laminas portaobjetos desengrasados- Tinción de azul de metileno- Cubreobjetos.

5.4 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS: Microscopio binocular con lentes objetivos 40x, 50x y 100x.5.5 DESARROLLO DEL PROCESO- En la recepción de la muestra se debe revisar que venga identificada con nombre y dos apellidos del paciente, los cuales deben coincidir con la orden, además la muestra debe corresponder con el tipo de examen solicitado.- Una vez que el paramédico chequea la muestra debe procesarla, teniendo en cuenta medidas de bioseguridad: uso de guantes.- La muestra se extiende en una lámina portaobjeto en forma circular en el centro de esta.- Debe secarse a temperatura ambiente antes de ser tenida.- Luego, se tiñe con Azul de Metileno por tres minutos.- Para eliminar el exceso de colorante se lava con agua.- Dejar secar a temperatura ambiente por tres minutos.- La lámina con la preparación se lee al microscopio óptico con lentes de inmersión 50x o 100x.- Preparación al fresco:

- Se efectúa cuando la deposición es demasiado acuosa.- Se prepara entre lámina y laminilla, colocando 2 a 3 gotas de la deposición en un portaobjeto.- Agregar una gota de Azul de Metileno.- Colocar el cubreobjeto y mantener en una cámara húmeda (placa de Petri)- Leer en microscopio óptico con objetivo 40x- Informar si hay presencia de leucocitos a también de glóbulos rojos, estimando la cantidad.

5.6 INFORME- Si el resultado es negativo debe informarse: “leucocitos fecales negativo”- Si el resultado es positivo debe informarse:

- Mas de 25 por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales abundantes- Menos de 25 por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales regular cantidad.- Si hay uno que otro por campo, visto con objetivo de 40x: leucocitos fecales escasos

En el caso que se observe con lente de inmersión 50x, el informe es similar. Para registro interno del laboratorio se cuantifica en cruces, es decir, +, ++ y +++ para escaso, regular cantidad y abundantes respectivamente.5.7 REGISTROS: Se ingresa el resultado al sistema informático.

6 TINCIÓN DE AZUL DE TOLUIDINA PARA PNEUMOCYSTIS JIROVECI6.1 OBJETIVO: Identificar quistes o trofozoitos de Pneumocystis jiroveci (ex Pneumocystis carinii) en muestras de lavado broncoalveolar (y otras) con el objetivo de ayudar en el diagnostico diferencial de neumopatías en pacientes inmunodeprimidos.6.2 FUNDAMENTO:El diagnostico se basa en la demostración de la presencia del microorganismo en muestras de origen pulmonar o tejido pulmonar, principalmente se usa el lavado bronqueoalveolar, también pueden ser expectoraciones, muestras de cepillado transtraqueal y cepillado bronquial.Se utilizan diferentes técnicas tintoriales, tales como: Azul de Toluidina O, Naranja de Acridina, Metenamina Argentica de Gomori. En este laboratorio de parasitología se utiliza la tinción de Azul de Toluidina; es la tinción con colorante canónico más utilizada, sus efectos metacromáticos son fácilmente obtenidos y es una técnica muy sensible.6.3 MATERIALES E INSUMOS- Reactivos

- Reactivo de Sulfatación: Acido Acético GlacialAcido sulfúrico concentrado- Solución de Tinción de Azul de Toluidina O: Azul de Toluidina OAcido Clorhídrico concentradoAlcohol Etílico al 100%Tinción preparada según instructivo de tinciones

- Materiales: Coplin, portaobjetos, pipetas graduadas, pipetas Pasteur, mascarilla, guantes, aceite de inmersión6.4 INSTRUMENTOS O EQUIPOS Y ACCESORIO- Microscopio de luz con aumento objetivo 40x y 100x- Centrifuga6.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTELavado broncoalveolar: Es la muestra ideal. Se debe tomar en un tubo cónico de tapa rosca, el cual debe ser estéril.Cantidad mínima requerida 2 ml.6.6 DESARROLLO DEL PROCESO6.6.1 Procesamiento de la muestra:Tipo de muestra: Lavado Broncoalveolar.- Primero se debe verificar que los datos del paciente en la muestra coincidan con los de la orden.- Centrifugar la muestra a 2000 r.p.m por 5 minutos.- Eliminar el sobrenadante.- Luego realizar 4 frotis del sedimento, extendiendo la muestra en forma circular en el extremo de un portaobjeto previamente identificado.- Dejar secar a temperatura ambiente (no secar en estufa).- De los cuatro frotis realizados, dos se tiñen y los otros dos se guardan como respaldo.- Una vez secado teñir.

Nº 3. PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE MÉTODOS CONVENCIONALES Y RÁPIDOS DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS AEROBIASOBJETIVORealizar los procedimientos de identificación de bacterias de acuerdo a métodos estandarizados para obtener resultados confiables y reproducibles, que permitan identificar los agentes bacterianos obtenidos a partir de cultivos de muestras clínicas.

1. Métodos basados en criterios morfológicos (estructurales)2. Métodos basados en tinción diferencial3. Métodos basados en pruebas bioquímicas4. Métodos basados en pruebas serológicasEn la mayoría de los casos la identificación se realiza con la combinación de más de un método.1. Métodos basados en criterios morfológicos:Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos años a clasificar organismos, pero con respecto a los microorganismos, estos lucen bajo el microscopio tan similares que se dificulta su clasificación. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades bioquímicas, fisiológicas y/o serológicas. Sin embargo, aun cuando la morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización resulta de mucha utilidad en la identificación de bacilos esporulados.2. Métodos basados en tinción diferencial:Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología de una bacteria, examinando una lámina que fue sometida a un proceso de tinción diferencial. Estos criterios morfológicos encabezan las primeras etapas del proceso de identificación bacteriana. La mayoría de las bacterias, tenidas con Gram, las podemos clasificar como gram positivas o gram negativas. Otras tinciones diferenciales, como la acido resistente, se aplican a algunos tipos de bacterias, como por ejemplo micobacterias.Los procedimientos de tinción que nos permiten aplicar los métodos 1 y 2, están descritos en Procedimiento no 2: PT de tinciones de microbiología de este manual.3. Métodos basados en pruebas bioquímicas:Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azucares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias estrechamente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes en base a pruebas bioquímicas. Por ejemplo: las bacterias de familia Enterobacteriaceae.4. Métodos basados en pruebas serológicas:Son los métodos que utilizan anticuerpos específicos dirigidos contra antígenos de los microorganismos a identificar.Los más utilizados son aquellos en los anticuerpos están fijados a partículas de látex (test de aglutinación por látex)En nuestro laboratorio se emplean:- Kit de aglutinación por látex para Streptococcus- Kit de aglutinación por látex para Staphylococcus aureus- Antisueros para Salmonella- Antisueros para Shigella- Antisueros para Yersinia enterocolitica- Antisueros para E coli O26, O111, O157Técnicas a realizar según indicaciones del fabricanteA continuación se detallan una serie de pruebas bioquímicas que se realizan en el laboratorio para la identificación bacteriana:Catalasa:- Esta prueba se emplea para diferenciar el género Staphylococcus (catalasa positiva) del generoStreptococcus (catalasa negativa) y también en otros tipos bacterianos puede ser de utilidad (ej. bacilos gram positivos)- Prueba en portaobjeto: Transferir células bacterianas desde el centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjeto de vidrio con una pipeta Pasteur.

- Agregar una o dos gotas de peróxido de hidrogeno al 30 %.- La rápida aparición y sostenida producción de burbujas de gas o efervescencia constituyen un resultado positivo.- Precauciones: Si la colonia a estudiar esta sembrada en un medio con sangre debe tenerse la precaución de no arrastrar medio, pues los glóbulos rojos allí contenidos darían una reacción positiva falsa. Los cultivos para esta prueba deben ser de 18 a 24 horas, ya que colonias más viejas pueden perder su actividad, dando una reacción negativa falsa.Coagulasa:- Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positiva) del resto de especies deStaphylococcus que son coagulasa negativas.- Se puede realizar de dos maneras: técnica en portaobjeto (coagulasa ligada) y la técnica en tubo (coagulasa libre)- Prueba en tubo: En un tubo de Khan agregar 0.5 ml de una mezcla de plasma citratado mas caldo soya tripticasa en proporción 1:1, resuspender una colonia aislada hasta una turbidez visible, incubar a 37°C durante 3 horas.- Una prueba positiva está dada por la formación de un coagulo que no puede ser resuspendido por agitación. En caso de ser negativo (el medio continua liquido) incubar hasta las 24 horas, ya que algunas cepas requieren tiempo prolongado de incubación.- Prueba en portaobjetos: Preparar una suspensión densa de una colonia aislada en una gota de agua destilada o solución salina estéril situada en un portaobjeto, añadir una gota de plasma citratado, mezclar suavemente con un asa y observar si aparecen grumos (prueba positiva).

Sensibilidad a Bacitracina- Esta prueba permite identificar presuntivamente a Streptococcus Beta hemolítico Grupo A(Streptococcus pyogenes).- Para esta prueba se utiliza un sensidisco de Bacitracina de 0.04 unidades.- Se recomienda usar un inoculo puro abundante de la colonia sospechosa (beta hemolítica), a partir de un caldo soya tripticasa con unas 6 horas de incubación.- Sembrar en césped sobre una placa de agar sangre de cordero y depositar el sensidisco.- Incubar la placa a 37°C en una atmosfera de CO2 durante toda la noche.- Cualquier tamaño de halo de inhibición indica prueba positiva, es decir, corresponde presuntivamente a Streptococcus pyogenes, ya que son sensibles a la Bacitracina.Test de Camp- Este Test permite identificar a Streptococcus beta hemolítico del grupo B (Streptococcus agalactiae), tambien a Listeria monocytogenes y algunas especies de Corynebacterium.- Para realizar este test se debe disponer de una cepa de Staphylococcus aureus productor de una betalisina - Se debe trazar una franja del Streptococcus en estudio en forma perpendicular a una franja delStaphylococcus aureus productor de betalisina, sin tocarla, es decir, se debe tener 1 cm de distancia entre ambas trazas. Todo esto sobre una placa de agar sangre de cordero.- Incubar 18-24 horas a 37° C en atmosfera de 5-10% CO2.- Los estreptococos del grupo B y otras bacterias que dan este test positivo producen una sustancia (Factor de CAMP) que agranda la zona de hemolisis producida por el estafilococo, para formar una tipica cabeza o punta de flecha en la union de ambos microorganismos (Test de CAMP positivo).Sensibilidad a Optoquina- Esta prueba permite identificar a Streptococcus pneumoniae (diagnostico presuntivo)- Seleccionar 4 - 6 colonias sospechosas y sembrar en cesped directamente en un sector de una placa de agar sangre o agar sangre Mueller Hinton.

- Colocar el disco de Optoquina (etilhidrocupreina 7mm), luego incubar en una atmosfera de CO2 por 24 horas para estimular el desarrollo bacteriano.Leer el halo de inhibicion, si este mide 14 o mas milimetros corresponde a Streptococcus pneumoniae (diagnóstico presuntivo)Sensibilidad a Novobiocina- Esta prueba permite diferenciar a Staphylococcus saprophyticus de los demas Staphylococcus coagulasa negativos.- La técnica consiste en hacer un inoculo de la colonia sospechosa a una turbidez de 0.5 Mac Farland, después se debe sembrar a modo cesped en una placa de agar Mueller Hinton, posteriormente colocar el sensidisco de Novobiocina (5 ug) e incubar por 18 horas a 37° C.- Si el halo del sensidisco es menor de 5mm la bacteria es resistente.- Si el halo del sensidisco es mayor de 6mm la bacteria es sensible.- Staphylococcus saprophyticus es resistente a la Novobiocina.Test de bilis Esculina- Este test diferencia entre estreptococos grupo D y no grupo D. Tambien tiene otras aplicaciones.- Se debe disponer del medio bilis esculina tendido en tubos, el cual es de un color amarillento claro- El medio debe ser inoculado en forma de estrías o picadura con una o tres colonias sospechosas.- Incubar a 37° C por 24 a 48 horas a atmosfera normal.- Reaccion positiva: el medio se pone color negro (estreptococos grupo D)- Reaccion negativa: no hay aparicion de coloracion negra.Prueba de tolerancia a la sal- Permite evaluar la tolerancia a la sal de los Streptococcus bilis esculina positivo y otros Gram positivos(Aerococcus, Pediococcus y Staphylococcus. Dentro de los estreptococos grupo D, diferenciaEnterococcus spp de verdadero Streptococcus grupo D.- Se requiere de un medio de cultivo hipertonico que contiene 6.5% de cloruro de sodio, glucosa y purpura de bromocresol como indicador.- Se debe inocular dos o tres colonias de estreptococos en un tubo del medio de cultivo- Incubar el tubo de 24 - 48 horas a 37° C en atmosfera aerobica.- Los estreptococcos grupo D enterococo producen un viraje del indicador del purpura al amarillo, por lo tanto, son tolerantes a la sal.Prueba de Voges-Proskauer- El Test Voges-Proskauer se usa en la diferenciacion de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y tambien para diferenciar bacterias del grupo Streptococcus.- Preparar una suspension bacteriana en 0.25ml de cloruro de sodio (0.9%) en un tubo de Khan- Agregar una tableta diagnostica para VP y tapar el tubo con tapón de goma o algodon.- Incubar a 35-37°C por 4 horas- Leer la reaccion agregando 2 gotas de solucion de alpha-naphthol (5% en etanol) y después agregar una gota de Hidroxido de potasio (KOH) al 40% y mezclar.- Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.- Reaccion positiva: color rojo o rosado- Reaccion negativa: no hay cambio de colorOxidasa:- Esta prueba se utiliza para la identificacion de la enzima citocromoxidasa presente en algunas bacterias - La prueba se lleva a cabo por medio de dos metodos; uno de ellos es con un trozo de papel filtro o toalla de papel la cual se impregna con gotas del reactivo tetrametil-p-fenilendiamina, previamente preparado con agua destilada, una vez impregnado se debe inocular una colonia de la cepa en estudio en el papel.

- Otro metodo que se utiliza es con tiras reactivas comerciales en las cuales va impregnado el reactivo, las cuales deben ser inoculadas con la colonia a estudiar.- Las colonias bacterianas que tienen actividad de citocromoxidasa (oxidasa positiva) desarollan un color azul oscuro en el sitio de la inoculación en 10 segundos.- Las colonias oxidasa negativa no producen color.Test de fermentación de azúcares- El test de fermentacion de azucares se realiza mediante tabletas diagnosticas que contienen el azúcar especifico (glucosa, sacarosa, maltosa, arabinosa, fructosa etc.), el cual es ocupado por algunas bacterias como por ejemplo: Neisseria gonorrhoeae.- La técnica consiste: preparar una densa suspension bacteriana en 0.25 ml de suero fisiologico en un tubo de khan.- Agregar al tubo la tableta diagnostica del azucar que se quiere probar.- Incubar a 37°C por 4 horas o durante toda la noche (ver instrucciones del fabricante).- La reaccion positiva se caracteriza por el viraje del color rojo (indicador rojo fenol) a amarillo.- En la reaccion negativa no hay cambio de color.Prueba de O/F (oxidación y fermentación):- Se usa el medio basico de Hugh y Leifson con un pH de 7,1. Es un medio semisolido de color verde que se inocula por picadura. Contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%.Como indicador de pH tiene Azul de Bromotimol.- Se inoculan los dos tubos con la bacteria por picadura.- Uno de los tubos queda sin aceite y otro con aceite o vaselina sellandolo. Se incuban a 37°C por 24 horas.- Se lee la reaccion según siguiente tabla:Tipo de Metabolismo Tubo abierto ( sin vaselina )Tubo cerrado ( con vaselina )Oxidador fermentador Amarillo AmarilloOxidativo( BGN NF )Amarillo en superficie Verde ( sin viraje )Inactivo Verde ( sin viraje ) Verde ( sin viraje ) Medio M.I.O. ( Motilidad – Indol – Ornitina)El medio de Motilidad – Indol – Ornitina (M.I.O.) es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciacion de bacilos Gram negativos entericos, sobre la base de la produccion de Indol, la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa y la capacidad de motilidad.Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminoacidos y nutrientes esenciales, la dextrosa constituye una fuente de energia. El agar actua como agente gelificante.Los cambios en el pH se verifican gracias al indicador purpura de bromocresol. La actividad de la ornitina descarboxilasa se observa como un viraje hacia el color purpura, en tanto que la ausencia de la enzima produce un viraje hacia color amarillo. La motilidad se observa como un desplazamiento del desarrollo microbiano desde el inoculo. Se deben observar estas características antes de efectuar la evaluación del indol.La produccion de indol se verifica mediante la adicion de algunas gotas de reactivo de Kovacs en la superficie del medio de cultivo. La produccion de un compuesto color rojo fucsia es considerada como Indol positivo.- Inoculacion: sembrar las muestras mediante una picadura vertical y profunda en centro del tubo. Incubar por 24 horas a 37°C.

- Lectura e interpretacion de Resultados: una vez completado el periodo de incubación, observar motilidad y actividad de ornitina decarboxilasa, y luego realizar la prueba del Indol.a. Motilidad:- Resultado positivo: presencia de desarrollo microbiano que se observa como enturbiamiento del medio de cultivo en todo el tubo, o desplazado fuera de la picadura de inoculación.- Resultado negativo: el desarrollo microbiano esta restringido solo en el trayecto de la picadura de inoculación.b. Ornitina descarboxilasa:- Resultado positivo: se verifica como alcalinizacion del medio de cultivo con un viraje hacia el purpura.- Resultado negativo: se observa acidificacion con viraje hacia amarillo o no se observan cambios significativos en el pH.c. Produccion de indol:Agregar 3 a 4 gotas de Reactivo de Kovacs sobre la superficie del medio de cultivo y agite cuidadosamente.- Resultado positivo: produccion de un anillo de color rojo fucsia. Cualquier indicio de color es considerado positivo.- Resultado negativo: produccion de un anillo de color amarillo.Citrato- El agar citrato de Simmons es un medio diferencial utilizado para el estudio de bacilos Gram negativos entericos, sobre la base de la utilizacion del citrato como una fuente de carbono, y la utilizacion de sales de amonio inorganico como única fuente de nitrogeno. Estas reacciones metabólicas son dependientes del aporte de oxígeno.- El sulfato de magnesio aporta cofactor magnesio para diversas reacciones enzimaticas, en tanto que el fosfato de potasico actua como agente tamponante. Los cambios en pH se verifican gracias al indicador azul de bromotimol.- Inoculacion: sembrar las muestras mediante estría en superficie. El aporte de oxigeno es fundamental para observar una buena reaccion positiva, para mejorar los resultados se puede cambiar el tapón de goma por algodon carde. Incubar por 24 horas a 37° C.- Lectura e interpretacion de Resultados:Una vez completado el periodo de incubación, observar el desarrollo de colonias en la superficie del agar y el viraje de pH por alcalinizacion, de verde a azul.- Resultado positivo: solamente los microorganismos que pueden utilizar el citrato como fuente de carbono presentaran desarrollo. El medio cambiara de verde a azul.- Resultado negativo: no se observara desarrollo ni cambios en el colorUreasa- El agar urea de Christensen es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la identificacion de bacilos Gram negativos entericos sobre la base de la degradacion de urea en amonio. Esta cualidad es propia de bacterias del genero Proteus, Morganella, Providencia y tambien puede verificarse en otras como Klebsiella spp. Bordetella spp. y Brucella spp.- Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de rojo de fenol: la produccion de acido se ve como cambio del color de rojo anaranjado a amarillo, en tanto que la alcalinizacion se observa como viraje hacia el rojo fucsia. El valor del pH se eleva cuando existe degradacion de la urea y produccion de amonio.- Inoculacion: sembrar abundantemente las cepas mediante estría en la superficie tendida.- Incubar por 24 horas a 37° C.- Lectura e interpretacion de Resultados:Una vez completado el periodo de incubación, se debe observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y el viraje de pH por alcalinizacion a rojo fucsia.

-Resultado positivo: Degradacion de la urea, desarrollo y viraje del indicador de pH a color rojo fucsia.-Resultado negativo: medio de cultivo sin cambios, no hay viraje del indicador de pH.Medio L.I.A.- El medio de agar Lisina y hierro (L.I.A.) es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram negativos entericos, especialmente miembros del genero Salmonella con capacidad de fermentacion de lactosa, sobre la base de la produccion de H2S y la actividad de la enzima lisina descarboxilasa. Tambien es posible observar cambios debidos a la actividad de la enzima lisina deaminasa, características del genero Proteus y Providencia.- Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminoacidos y nutrientes esenciales, la dextrosa constituye una fuente de energia. El citrato de amonio ferrico y el tiosulfato de sodio actuan como marcadores de la produccion de H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro negro en el tubo. El agar actua como agente gelificante.- Los cambios de pH se verifican gracias al contenido de purpura de bromocresol: la produccion de acido se ve como cambio del color a amarillo con valores de pH inferiores a 5.2, en tanto que la alcalinizacion como cambio del indicador hacia el purpura con valores de pH sobre 6.8. La actividad de la lisina descarboxilasa se observa como un viraje hacia el color purpura en todo el medio de cultivo, o bien como medio de cultivo sin cambio (neutro) en la columna de agar, en tanto que la ausencia de la enzima produce un viraje hacia el color amarillo en la columna y neutro en la zona inclinada. La actividad de la lisina deaminasa, se observa como color rojizo en la zona inclinada, con fondo amarillo en el tubo. Tambien puede observarse produccion de gas por efecto de fermentacion de la glucosa.- Inoculacion: sembrar las muestras mediante estría en la superficie tendida y una picadura vertical y profunda en el centro del tubo.- Lectura e interpretacion de Resultados: Una vez completado el periodo de incubación, observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y en la columna del tubo. Considerar el viraje de pH por alcalinizacion (purpura) o acidificacion (amarillo). Ademas se debe observar la produccion de H2S como color negro en el tubo y la generacion de gas.a. Produccion de H2S:- Resultado positivo: el desarrollo microbiano produce coloracion negra en el medio de cultivo en todo el tubo.- Resultado negativo: ausencia de coloracion negra.b. Lisina descarboxilasa:- Resultado positivo: se verifica como alcalinizacion (K) del medio de cultivo con un viraje hacia el purpura en todo el tubo, o como medio de cultivo neutro- Resultado negativo: se observa acidificacion (A) con viraje hacia el amarillo en la columna del tubo y alcalinizacion (color purpura) en la zona inclinada.c. Lisina deaminasa:- Resultado positivo: produccion de color rojo granate (R) en la superficie inclinada.- Resultado negativo: ausencia de color rojo granate.Medio T.S.I.- El agar T.S.I. es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciacion de bacilos Gram negativos entericos en base a la fermentacion de carbohidratos y la produccion de H2S.- Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminoacidos y nutrientes esenciales, la dextrosa, lactosa y sacarosa constituyen fuentes de energia y sustratos para la diferenciacion basada en la actividad fermentativa sobre los azucares. El sulfato ferroso y el tiosulfato de sodio actuan como marcadores de la produccion de H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro negro en el tubo. El cloruro de sodio contribuye al equilibrio osmotico. El agar actua como agente gelificante.

- Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de rojo fenol: la produccion de acido se ve como cambio del color de rojo anaranjado a amarillo, en tanto que la alcalinizacion se observa como viraje hacia el rojo. Tambien puede observarse produccion de gas por efecto de fermentacion de la glucosa.- Inoculacion: sembrar las muestras mediante estría en la superficie tendida y una picadura vertical y profunda en el centro del tubo.- Lectura e interpretacion de Resultados: Una vez completado el periodo de incubación, observar el desarrollo microbiano en la superficie tendida y en la columna del tubo. Considerar el viraje de pH por alcalinizacion hacia el rojo (K) o acidificacion (A) hacia el amarillo. Ademas se debe observar la producción de H2S como color negro en el tubo y la generacion de gas por efecto de la fermentacion.a. Produccion de H2S:- Resultado positivo: el desarrollo microbiano produce coloracion negra en el medio de cultivo en todo el tubo.- Resultado negativo: ausencia de coloracion negra.b. Fermentacion de carbohidratos:- Resultado positivo: se observa acidificacion (A) con viraje hacia el amarillo en la columna del tubo, incluyendo o no la superficie inclinada.- Resultado negativo: se verifica como alcalinizacion (K) del medio de cultivo con un viraje hacia el rojo en todo el tubo o como medio de cultivo neutro.c. Produccion de gas:- Resultado positivo: burbujas de gas o rotura de la columna de agar en el tubo por presion de gas acumulada en los tubos cerrados.- Resultado negativo: no se observa gas.Prueba del Telurito de potasio- Esta prueba permite diferenciar entre especies del genero Enterococcus, ya que es positiva paraEnterococcus faecalis y negativa para Enterococcus faecium. La bacteria E. faecalis tiene la propiedad de reducir el telurito de potasio a telurio, dando colonias negras en el agar Telurito de Potasio, en cambio, E. faecium crece en el agar pero da colonias de color gris.- Esta prueba tambien es positiva para bacterias del genero Corynebacterium spp. por lo tanto, permite diferenciar entre bacilos gram positivos.- Se requiere para esta prueba de una placa de agar Telurito de Potasio.- Sembrar una pequeña estría de la colonia sospechosa, en una region de la placa de agar.- Incubar a 37 oC en atmosfera normal de 18 – 24 horas.- Si el crecimiento son colonias negras, la prueba es positiva.- Si crecen colonias grises, la prueba es negativa.Prueba Arginina dihidrolasa (ADH)- Esta prueba permite diferenciar a Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis (prueba positiva) de otros Enterococcus, tambien es positiva para algunos bacilos gram negativos no fermentadores comoPseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, entre otros.- Se basa en la actividad arginina dihidrolasa de la bacteria, donde el sustrato es la arginina y los productos de la ornitina, CO2 y amonio, produciendo una alcalinizacion del medio lo que provoca un cambio de color del indicador de amarillo a rojo.- Se debe preparar una suspension de la bacteria en estudio con suero fisiologico (0.25 ml) en tubo de khan. - Agregar una tableta diagnostica de ADH y 3 gotas de aceite de parafina esteril.- Cerrar el tubo.- Incubar a 37oC por 4horas, puede ser 24 horas.- Reaccion positiva: rojo.- Reaccion negativa: amarillo a blanco.

Nº 4. PROCEDIMIENTO DE UROCULTIVOOBJETIVORealizar procesamiento de las muestras de orina para urocultivo de acuerdo a metodos estandarizados para recuperar agentes patogenos en el diagnostico microbiologico de infeccion del tracto urinario (ITU).Urocultivo: es el cultivo de muestra de orina obtenida en forma aséptica, permite la recuperacion de bacterias no fastidiosas y hongos (levaduras). Tambien se puede realizar cultivo anaerobio de orina, para lo que se deben seguir las condiciones de toma de muestra y procesamiento especificas. (Ver Manual toma de muestras, Procedimiento de cultivo bacterias anaerobias).El urocultivo incluye un recuento de colonias, y debe ser correlacionado con la observacion microscopica del sedimento urinario o tinción de gram directa de la muestra para su interpretacion e informe final. Mas del 95% de las infecciones urinarias son monobacterianas y el microorganismo mas frecuente es Escherichia coli, principalmente en pacientes ambulatorios. En pacientes con infecciones recurrentes y de origen intrahospitalario, aumenta la frecuencia de otros microorganismos tales como Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Enterococcus y Staphylococcus.Placa agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos.Placa de agar cromógeno para orina: es un medio de cultivo que permite el desarrollo de bacterias gram positivas y negativas, ademas de levaduras, y diferencia por aspecto y color los distintos generos o grupos bacterianos.Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias habituales y levaduras.Asas calibradas: asas estériles usadas para la siembra de un inoculo conocido y estandarizado de la muestra de orina. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO1. Recepcion, ingreso y numeracion: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Siembra: responsable es el Técnico paramédico.La muestra debe ser sembrada dentro de 2 hrs de haber sido tomada, si se mantiene a to ambiente; si la muestra se ha mantenido refrigerada puede ser sembrada hasta dentro de 4 hrs.Orinas de 2a micción y por catéter permanente: primero se debe agitar bien la muestra con movimientos suaves para homogeneizarla, se introduce asa inmediatamente por debajo de la superficie liquida y se toma una gota con asa de 1 ]L, llevarla en forma vertical y sembrar en placa de agar cromogeno para orina, haciendo una linea central y luego pasando en forma horizontal el asa desde el inicio de la linea hasta el final de ella, sin cortar los trazos (como zigzag). Se siembran de 4 a 6 muestras por placa.En forma paralela a la siembra de la muestra de orina se realiza frotis para tinción de gram, se puede fijar hasta 10 orinas en una lamina y se usa para ello el asa calibrada de 1 ]L. Estas se tinen y pueden ser observadas cuando exista discordancia entre el cultivo y el sedimento y cuando no exista sedimento.Orina por sondeo: proceder de la misma manera que orina de 2o chorro, y agregar ademas siembra con asa de 10 ]L, en placas de agar sangre y agar Mac Conkey, de la misma forma explicada anteriormente.Orina por punción vesical: Siembre con asa de 10 ]L, en placa de agar cromogeno para orina de la misma forma explicada anteriormente. Ademas sembrar con pipeta de vidrio aprox. 0,1 ml diseminando con bagueta de vidrio en rastrillo por toda la superficie de una placa de agar sangre y agar Mac ConkeyOrina tomada directamente de ureter o rinon (de pabellon)): se siembra con pipeta en agar sangre y agar Mac Conkey (como una secrecion), se disemina con bagueta de vidrio esteril en rastrillo, no se evalua recuento.3. Incubacion en estufa de cultivo a 35° a 37oC a atmosfera normal por 18 a 24 hrs.

4. Las muestras de orina deben guardarse refrigeradas hasta obtener el resultado del cultivo. En caso de resultados discordantes se recurrira a la muestra almacenada para repetir los analisis.5. Las placas de urocultivos incubadas “overnight” son examinadas por Tecnologo Medico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio. En los cultivos positivos se determina recuento de colonias, identificacion de microorganismo y estudio de susceptibilidad según criterios de interpretación mencionados a continuación y en Anexo 1: Interpretacion e informe de resultados de urocultivo.Las placas que tienen escaso desarrollo o que son de muestras obtenidas por metodos invasivos se reincuban.6. Recuento de colonias: no colonias x 1.000 (siembra con asa de 1 ]L) o no colonias x 100 (siembra con asa de 10 ]L)7. Interpretación del cultivo: Para la interpretacion del resultado, se debe relacionar el recuento de colonias con la clinica del paciente, con el sedimento urinario o tinción de Gram, con el metodo de recoleccion de la muestra y con antecedentes clinicos del paciente.Respecto a la tinción de gram directa, la presencia de una bacteria por campo de inmersion tiene buena correlacion con un recuento > 100.000 ufc/ml en el 85% de los casosPara interpretar e informar un urocultivo se compara con el sedimento, de manera que no haya discordancia en ambos resultados (sedimento sugerente de ITU: leucocitos o piocitos > 5 - 6 por campo de 40x y bacterias regular o abundante cantidad. La presencia de celulas descamativas y/o mucus, sugiere contaminacion vaginal).8. Conductas a seguir en discordancias entre cultivo y sedimentoAntes de informar el resultado, comparar con el sedimento, para evaluar si existe discordancia en ambos resultados Urocultivo positivo con sedimento normal: informar recuento y agente identificado para que el medico tome decision basandose en cuadro clinico.Urocultivo negativo sedimento alterado: se debe observar gram de muestra directa en busca de bacterias y celulas inflamatorias (leucocitos, piocitos); si Gram es sugerente de proceso infeccioso incubar por 48 horas para dar por negativo el urocultivo. Se debe agregar comentario en informe: “discordancia entre sedimento y urocultivo, evaluar según clinica”9. Tiempo de respuesta:a. Cultivo negativo a las 48 horasb. Cultivo positivo: 48 a 72 hrs. habiles10. Informe:a. Cultivo negativo a las 48 horasb. Cultivo polimicrobiano: si existe desarrollo de 3 o mas bacterias se informa “Resultado polimicrobiano”c. Cultivo positivo: se informa recuento de colonias aproximado hasta 100.000 unidades formadoras de colonia por mL (UFC/mL). Recuentos mayores de 100.000 se informan >100.000 UFC/mL

Nº 5. PROCEDIMIENTO DE COPROCULTIVOOBJETIVOCoprocultivo: es el cultivo de deposiciones en medios diferenciales y selectivos para la recuperacion de bacterias enteropatogenas. Los agentes buscados rutinariamente en coprocultivo realizado por nuestro laboratorio incluyen:Salmonella spp, Shigella spp, y Yersinia enterocolítica. En caso de solicitud especifica o según criterios mencionados en este protocolo se busca presencia de Escherichia coli 0157 / 0111/ 055/ 026 y Vibrio spp

Placa SS: medio de cultivo solido medianamente selectivo usado para el aislamiento de bacterias de los generosSalmonella y Shigella, inhibiendo en parte bacterias gram negativas coliformes y entericas no patogenas.Placa TCBS: agar selectivo para recuperar cepas de Vibrio spp a partir de muestras clínicas.Placa Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gran negativos.MATERIALESInsumos:Torula con medio de transporte Cary BlairAsa de siembraPlaca agar Mac ConkeyPlaca agar SSPlaca agar TCBS (en caso de vigilancia o busqueda de Vibrio spp).Medios de cultivo para pruebas bioquimicas (baterias)DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTOSe estudiaran los siguientes enteropatogenos:A. En adultos:De rutina: Salmonella spp.Shigella spp.Si se solicita: Yersinia spp.EHEC 0157 / 0111/ 055/ 026 (inmunodeprimidos)B. En niños:De rutina Salmonella spp.Shigella spp.Yersinia spp.EHEC 0157 / 0111/ 055/ 026 (en caso de disenteria, especialmente en menores de 5 anos)Tincion de Campylobacter (en ninos menores de 5 anos)C. Estudio de Vibrio sppSi la muestra tiene indicada busqueda de “Vibrio” o tiene antecedente de sospecha de intoxicacion alimentaria, debe adicionarse una placa de TCBS.Para efectos de vigilancia epidemiologica activa se estudiara en horario habil, según protocolo del Minsal (se siembra en placa de agar TCBS cada 10 coprocultivos de pacientes menores de 18 anos y cada 5 de pacientes mayores de 18 anos); cada muestra de coprocultivo debe marcarse en el registro Vigilancia Activa de Vibrio, para determinar las muestras que deben sembrarse en TCBS.Procedimiento:1. Recepcion, ingreso y numeracion: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Siembra: responsable es el Técnico paramédico. Se siembra en placa de agar Mac Conkey y una de agar SS (en ese orden), las cuales se identifican con sus respectivos códigos de barra. Se debe tener especial cuidado de realizar aislamiento en tres cuadrantes, esterilizando el asa entre cada uno. (VerProcedimiento no 1: Siembra de muestras para cultivos aerobicos, de este manual)Si la muestra tiene indicada busqueda de “Vibrio” o tiene antecedente de sospecha intoxicacion alimentaria, debe adicionarse una placa de TCBS; lo mismo si corresponde según vigilancia activa de Vibrio.3. Las placas sembradas se introducen en la estufa de incubación, incubandose a atmosfera normal entre 35 y 37o C.4. Despues de 18 a 24 horas de incubación, el TM procede a verificar crecimiento de cepas, realizar pruebas de identificacion y antibiograma según corresponda. Se incuba la placa de agar Mac Conkey por otras 24 horas a temperatura ambiente (aprox. 22o C) para la recuperacion de Yersinia enterocolítica.

Cuando se completan las pruebas para la identificacion y antibiograma, el tecnologo medico registra los resultados en hoja de trabajo y valida informe final en sistema informático.OBSERVACIONES:En el caso de aislar alguna de los siguientes agentes: Salmonella spp, Shigella spp, E coli presuntivamente enterohemorragico, Yersinia enterocolítica, y Vibrio spp, se debe guardar cepa para ser enviada posteriormente a ISP (según normativa ministerial de Vigilancia de Laboratorio)INFORME:Hubo desarrollo de flora habitual, escasa, regular o abundante cantidadNegativo para…..…. (Cada microorganismo investigado)Si se aisla patogeno, nombre de la bacteria (especie y serotipo si corresponde).Si hay desarrollo de Vibrio cholerae o Vibrio parahaemolyticus, se informa nombre y antibiograma de microorganismo, y se agrega comentario “identificacion presuntiva” Si se observa alguna alteracion de la microbiota intestinal, por ejemplo cultivo muy puro dePseudomonas aeruginosa, levaduras o ausencia de flora, puede informarse como observaciones.Informar antibiograma en: Salmonella, Shigella y Yersinia.TIEMPO DE RESPUESTA:Cultivo negativo: 48 a 72 horas habilesCultivo positivo: 3 a 4 dias habiles.

Nº 6. PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE HEMOCULTIVOSOBJETIVORealizar procesamiento de las muestras de sangre para hemocultivos de acuerdo a metodos estandarizados para el diagnostico de bacteriemias y fungemias.En este procedimiento se incluyen el proceso e interpretacion para el diagnostico de infecciones asociadas a catéter vascular:Tiempo diferencial de positividad de hemocultivos pareadosCultivo de punta de cateter vascularMATERIALES, EQUIPOS Insumos: Viales de hemocultivo Bactec aerobio adulto, aerobio pediatrico, anaerobioMedios de cultivo: agar sangre, agar chocolate suplementado, agar Mueller Hinton y Mueller Hinton sangre, medios de cultivo diferenciales para identificacion.Jeringas asa esterilKit para tinción de GramEquipos: Equipo de hemocultivos automatizado Bactec 9240, Becton DickinsonEstufa de incubación de CO2 5% microscopioDEFINICIONESHemocultivo: cultivo de muestra de sangre para el diagnostico de bacteriemias o fungemias, en medios de cultivo líquidos enriquecidos para la obtencion de microorganismos habituales y fastidiosos (la mayoría)Bacteriemia: paso a la via sanguinea de bacterias desde un foco infeccioso. Las bacteriemias pueden ser transitoria (paso desde un sitio colonizado que es manipulado o en etapa inicial de algunas infecciones sistemicas), intermitentes (paso a la sangre desde un foco infeccioso), y continuas (diseminacion sanguinea producida por infeccion que se localiza en torrente circulatorio como por ej endocarditis bacteriana)Fungemia: la misma definicion previa aplicada a hongos.Infección del torrente sanguíneo asociada a catéter vascular central (ITS asoc CVC): Bacteriemia o fungemia en un paciente con un dispositivo vascular generalmente con uno o mas hemocultivos

perifericos positivos, con manifestaciones clínicas de infeccion (fiebre, calofrios y/o hipotension) y sin otra fuente aparente de infeccion del torrente sanguineo. DESARROLLO DEL PROCESOFUNDAMENTOEl cultivo de sangre se realiza en medio con caldo enriquecido en vial aerobico, que permite el desarrollo de la mayoría de los agentes microbianos causantes de septicemia o bacteremia (bacterias u hongos) o en vial anaerobio cuando se sospecha de una bacteremia cuyo foco primario indica presencia de anaerobios (absceso, peritonitis, etc.)1.6. Procesamiento de los subcultivosDespues de incubadas las placas de subcultivo, se revisa si hay desarrollo. Se debe confirmar si es necesario con gram de las colonias si es concordante con lo observado con la tincion de gram directa del vial efectuada anteriormente.Proseguir el estudio segun corresponda de acuerdo a la morfologia y afinidad tintorial del microorganismo desarrollado, para su identificacion y correspondiente estudio de susceptibilidad.Los microorganismos aislados que se consideren significativos se identificaran en forma definitiva y se les realizara en caso necesario el antibiograma correspondiente.Los microorganismos considerados contaminantes se identificaran solo a nivel de genero. En general se consideraran contaminantes los siguientes microorganismos aislados en solo una muestra del set del paciente:Bacillus sppCorynebacterium sppOtros bacilos gram positivosStreptococcus grupo viridansStaphylococcus coagulasa negativaTambien se considerara contaminacion cuando hay desarrollo de distintos tipos bacterianos en una misma muestra y solo en una muestra del set1.7 Procesamiento de los viales negativos:Una vez cumplido el protocolo de incubacion, se extraeran los viales negativos y despues de revisar con ordenes de examenes, se eliminan siguiendo protocolo de eliminacion de desechos biologicos.Si al final del periodo de analisis un vial negativo parece positivo a simple vista, debe subcultivarse, realizar tinción de gram segun lo senalado anteriormente.1.8 Informe:1. Informe preliminar: tincion de Gram de muestras positivas, segun protocolo mencionado previamente. Si alguna de las muestras ha sido tomada por cateter vascular central (CVC) se informa tiempo de positividad.2. 2o informe preliminar: Cuando ya hay desarrollo bacteriano y se pueden realizar algunas pruebas rapidas de identificacion, se informa en sistema informatico de laboratorio (SIL), aun cuando cepa continue en estudio para antibiograma u otro. Esto aplica especialmente a algunos Streptococcus beta hemoliticos y Staphylococcus aureus.3. Informe definitivo de resultados positivos: se informa identificacion de microorganismo y antibiograma si corresponde. Tiempo de positividad si corresponde. El tiempo de respuesta del informe final en general sera de 48 a 72 hrs despues de hacerse positivo.Informe de resultados negativos: los hemocultivos negativos completaran su periodo de incubacion de 5 a 21 dias segun sea el caso (ver anexo 1) y transcurrido ese tiempo, se informaran como negativos ( a los 5 dias, a los 10 dias, etc)1.9 Registros:En SIL (Omega y Epicenter), en orden de examen.

Los preinformes de hemocultivos positivos ademas de quedar registrados en SIL, si es horario inhabil se imprime el informe y se deja en seccion de microbiologia2. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE ITS ASOCIADA A CVCEl objetivo es identificar la presencia de microorganismos causantes de bacteriemia asociada a CVC.Cuando se sospecha el diagnostico de ITS asoc CVC, se puede tomar la conducta de retirar o mantener el cateter, segun esto el estudio microbiologico a seguir sera segun los siguientes esquemas:2.1 Cuando hay sospecha de infección y se retira catéter- Cultivo semicuantitativo con tecnica de Maki. (punta de cateter)- Y tomar hemocultivos perifericos (2 muestras) (10 ml cada muestra en pacientes adultos)- Si hay secrecion purulenta en sitio de insercion tomar muestra con torula esteril para cultivo corriente. (indicar tipo de muestra sitio insercion CVC)2.2 Cuando hay sospecha y no se retira catéter: Técnica de tiempo diferencial- Hemocultivos pareados de muestras por puncion periferica y por CVC. Se compara el tiempo diferencial de positividad (si se ha aislado el mismo microorganismo en ambas muestras)- Primero se toma muestra periferica y luego por CVC (para saber cuanto volumen se debe extraer)- Debe ser mismo volumen y simultaneos (no mas de 10 minutos de diferencia). Si no tienen el mismo volumenno se puede aplicar criterio de tiempo diferencial.- Rotular frasco por via periferica y por CVC (o central)- En CVC de mas de un lumen se debe obtener de puerta mas distal o el mas usado, o por el que esta pasando nutricion parenteral, o de todos los lumenes (rotular muestra adecuadamente)- Si hay secrecion purulenta en sitio de insercion tomar muestra con torula esteril para cultivo corriente. (indicar tipo de muestra sitio insercion CVC)2.2.1 Muestra: Llegaran 2 muestras en viales de hemocultivos rotuladas, una como hemocultivo periferico y otra obtenida a traves de CVC (esta ultima la denominaremos muestra central).2.2.2 Procedimiento:Verificar rotulación Introducir a equipo Bactec 9240 los dos viales de hemocultivos al mismo tiempo. El protocolo de incubación sera 5 dias o en el caso de solicitud de hongos 10 diasEscribir en orden de examen al lado de cada etiqueta del codigo de barra si se trata de muestra periferica o por CVCEn caso de positividad trabajar como cualquier hemocultivo, con informe preliminar de tincion de Gram identificacion y estudio de suscceptibilidad segun corresponda.2.2.3 Interpretacion:Si ambos hemocultivos resultan positivos y el hemocultivo central se hace positivo por lo menos 2 horas antes que el periferico, se interpreta como diagnostico de infeccion asociada al cateter vascular (criterio microbiologico, siempre se debe correlacionar con clinica)2.2.4 Informe:Se sigue las mismas indicaciones senaladas anteriormente.Si no hay crecimiento en ambos viales: hemocultivo periferico o central negativo, en sus respectivos informes.Si la (s) muestras son positivas:Siempre escribir en tipo de examen: hemocultivo central o periferico, Cultivo corriente o cultivo hongos o ambos.Informar cada hemocultivo con su respectivo aislamiento bacteriano y susceptibilidad.Si la muestra periferica y central han resultado positivas al mismo microorganismo, informar tiempo de positividad de la siguiente forma: hemocultivo (periferico o central) positivo a las ….. horas3. Retiro del CVC por término de indicación y sin infección local ni sospecha de infección sistémica por catéter:

Retirar cateterNo realizar cultivo de rutina Protocolo Tiempo de incubaciónCultivo corriente 5 diasCutivo bacterias anaerobias 5 diasCultivo de hongos 10 diasSospecha de endocarditis bacteriana subaguda 14 dias ( por h.a.c.e.k) Gram y subcultivo a ciega a 7 y 14dias en agar chocolate y agar sangre manteniendo placas,por lo menos 72 horas a 37°C en estufa CO2Brucella se incuba por 21 dias , gram y subcultivo a ciegas a los 7, 14y 21 dias en agar sangre y agar chocolate.Anexo 2. Diagnostico microbiologico de ITS asociadas a CVCSospecha Infeccion torrente sanguineo asociado a Cateter VascularSí se decide retirar cateter No se retira cateterSe envia punta deCVC (5 cm.) para cultivoTomar 2 hemocultivos perifericos (10 cc cada uno)Se toman hemocultivos pareados por puncion periferica y por CVC, para comparar el tiempo diferencial de positividadPrimero tomar hemocultivo periférico (para determinar el volumen a extraer). Luego se toma por CVC.Ambos deben tener la MISMA cantidad de sangre (8-10 cc)Y deben ser simultáneos (no mas de 10 minutos de diferencia entre uno y otra toma)Rotular 1 frasco periferico y el otro por CVC(o central)Si CVC posee mas de un lumen, tomar del mas usado, o el que este pasando nutrición parenteral Nº 7. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE LÍQUIDOS DE CAVIDADES ESTÉRILES OBJETIVORealizar procesamiento de las muestras de liquidos esteriles de acuerdo a metodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de estas localizaciones. Esto incluye liquido cefalorraquideo (LCR), liquido articular, liquido pleural, liquido ascitico o peritoneal (estudio de peritonitis primaria), liquido de peritoneodialisis, liquido pericardico y amniotico..INTRODUCCIÓNEl cultivo microbiologico de liquidos biologicos, como LCR, liquido pleural, ascitico o articular, tiene como objetivo determinar la presencia o ausencia de microorganismos ante la sospecha clinica de un proceso infeccioso a nivel de cavidades, que en un individuo sano son estrictamente esteriles.Un diagnostico microbiologico precoz, es fundamental, ya que los procesos infecciosos en estas localizaciones son generalmente graves y con posibilidades de dejar secuelas en los pacientes afectados.Para el cultivo de estas muestras se utilizan medios de cultivo mejorados y enriquecidos (agar sangre cordero triptosa) y a veces es necesario utilizar medios con factores de crecimiento (agar chocolate suplementado), para la recuperación de bacterias fastidiosas.1. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)El procesamiento de las muestras de LCR siempre debe ser considerado como una urgencia clinica y microbiologica. Se deben realizar los procedimientos microbiologicos que proporcionen informacion clinica relevante en el menor tiempo posible.No se recomienda rechazar o no procesar ninguna muestra (por ejemplo, derramamiento durante el transporte) sin consultar previamente con el clinico responsable del paciente. Se procesara, indicando

en el informe sobre la posibilidad de contaminacion debida al estado de la muestra a la llegada al laboratorio.

Insumos: agar sangreagar chocolatecaldo thioglicolatopipeta esterilPortaobjetosKit tincion Gramasa esterilmedios de cultivos para identificacion bacteriana1.2 Procedimiento12. Recepcion, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.13. Siembra: responsable es el Tecnico paramedico.La muestra llegara en frasco esteril. Debe ser sembrada lo antes posible despues de haber sido tomada, mantenida a to ambiente (ver Manual de Toma de Muestras)- Centrifugar la muestra en eppendorf esteril a 2500 rpm por 5 min.- Tomar el sedimento de la muestra con pipeta pasteur- Colocar 2-3 gotas en un costado de la placa agar sangre y placa agar chocolate- Depositar 2-3 gotas en caldo thioglicolato hasta el fondo y luego retirar mezclando el liquido con el medio- Realizar 2 frotis, extendiendo una gota entre 1-2 cm de diametro; elegir un frotis para tenirlo inmediatamente.- diseminar siembra en las placas en 3 cuadrantes, sin esterilizar el asa entre el 1° - 2° cuadrante, terminar en estria.14. Incubacion: las placas de agar sangre y agar chocolate se incuban a 35-37 o C en estufa CO2, el caldo thioglicolato se incuba en estufa normal.15. Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnologo Medico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clinica en cada caso. Segun esto se realiza pruebas de identificacion de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Examinar las placas cada 24 horas, hasta un total de 72 hrs. Examinar el caldo cada 24 horas, para la deteccion de crecimiento macroscopico (turbidez)16. Si los cultivos presentan crecimiento:Correlacionar los aislados con los morfotipos observados en la tincion de Gram.Trasladar al facultativo peticionario un informe preliminar con la identificacion presuntiva.Identificar los aislados a nivel de especie y realizar pruebas de sensibilidad a los antibioticos segun las normas estandarizadas vigentesSi el crecimiento se produce solo en los caldos de cultivo y no en las placas, realizar subcultivo del caldo en medios solidos (agar sangre, agar chocolate) y correlacionar el aislado con el morfotipo observado en la tinción de Gram.Cuando en el caldo se observe por tincion de Gram microorganismos que no crecen en el subcultivo, proceder a subcultivar en medios nutricionalmente mas ricos y en diferentes condiciones de incubacion.17. Tincion de GramInmediatamente despues de recepcionar y sembrar muestra se debe tenir frotis para tincion de Gram. El T. Medico realiza su lectura, interpretacion e informe. Los resultados de la observacion de tincion de Gram directa quedaran registrados en la orden de trabajo correspondiente a la muestra y en el sistema informatico. En el caso de estar positivo a la presencia de microorganismos se informara lo antes posible a clinico responsable de paciente.

1.3 Informe:- Gram directo: Informar ausencia o presencia de leucocitos polimorfonucleares y ausencia o presencia de uno o varios morfotipos bacterianos y su cantidad en descripcion cualitativa (escasos, regular, abundante)- Cultivo:- negativo 72 horas de incubacion- hubo desarrollo de escasa, regular o abundante cantidad de….- antibiograma cuando corresponde.

1.4 Tiempo de respuesta- negativo, 72 horas de incubacion (informe a las 48 a 72 hrs habiles- positivo, 24 a 72 horas habiles1.5 Registros: Sistema informatico del laboratorio, en reverso de orden de examen, se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y ano, en archivos. 2. LÍQUIDOS ESTÉRILES NO LCR (LÍQUIDO PLEURAL, ASCÍTICO, ARTICULAR, AMNIÓTICO2.1 Materiales, equipos y softwareInsumos: agar sangreagar chocolatecaldo thioglicolatoVial de hemocultivo adulto (5 a 10 ml de muestra) o pediatrico (menos de 5 ml de muestra)pipeta esterilPortaobjetosKit tincion Gramasa esterilmedios de cultivos para identificacion bacterianaEquipos: Estufa de incubacion atmosfera de CO2, estufa de incubacion atmosfera normal, mechero.2.2 Muestra:Generalmente llegara en frasco esteril o jeringa esteril sin medio de transporte.Puede llegar inoculada en un vial de hemocultivo adulto y en tubo esteril para realizar gram2.3 Procedimiento1. Recepcion, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Siembra: responsable es el Tecnico paramedico.Debe ser sembrada lo antes posible despues de haber sido tomada, mantenida a to ambiente (ver Manual de Toma de Muestras)Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente segun tipo de muestra, segun técnica de siembra descrita en Procedimiento de Siembra de muestras para cultivos aerobicos de este manual.centrifugar a 2500 rpm por 5 min. (tubo esteril)realizar 2 frotis del sedimento de la muestra en tubo.elegir un frotis para tenirlo inmediatamente.colocar vial en el equipo de hemocultivo, sacando la etiqueta del codigo de barra y pegarla en la orden de examen (segun procedimiento habitual)3. Incubacion: las placas de agar sangre y agar chocolate se incuban a 35-37 o C en estufa CO2, el caldo thioglicolato se incuba en estufa normal.4. Diagnostico microbiologicoTincion de Gram: Inmediatamente despues de recepcionar y sembrar muestra se debe tenir frotis para tinción de Gram. El Tecnologo Medico realiza su lectura, interpretacion e informe. Los resultados de la

observacion de tincion de Gram directa) quedaran registrados en la orden de trabajo correspondiente a la muestra y en el sistema informatico. En el caso de estar positivo a la presencia de microorganismos se informara lo antes posible a clinico responsable de paciente.Cultivo: Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnologo Medico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clinica en cada caso. Segun esto se realiza pruebas de identificacion de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Examinar las placas cada 24 horas, hasta un total de 72 hrs. Examinar el caldo cada 24 horas, para la deteccion de crecimiento macroscopico (turbidez)2.4 Informe- gram directo,- informar presencia de leucocitos y cantidad o no se observan leucocitos- informar morfologia bacteriana y cantidad- cultivo negativo 72 horas de incubacion Si la muestra llego o se inoculo en vial de hemocultivo se completa incubacion de 5 dias- hubo desarrollo de….- antibiograma cuando corresponde.2.5 Tiempo de respuesta: negativo, 72 horas habiles, si muestra se inoculo en vial de hemocultivo 5 dias de incubación positivo, 48 a 72 horas2.6 Registros: Sistema informatico del laboratorio y en reverso de orden de examen. Esta se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y ano, en archivos.3. LIQUIDO DE PERITONEODIÁLISIS3.1 Introduccion:La peritonitis, inflamacion de la membrana peritoneal, es la complicacion mas frecuente en pacientes que deben someterse a peritoneo dialisis. El estudio microbiologico del liquido peritoneal tiene bajo rendimiento El cultivo del liquido abdominal obtenido de la primera bolsa en que se observa liquido turbio tiene mayor probabilidad de cultivo positivo.Los microorganismos mas frecuentes aislados son Staphylococcus coagulasa negativa, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Pseudomonas spp, entre otros. Sin embargo en este tipo de pacientes se pueden presentar infecciones por agentes inusuales, de lento crecimiento y distintos tipos de hongos.3.2 Insumos:Vial de hemocultivo adulto aerobioPlacas de agar sangre, chocolate y tubo agar SabouraudJeringaAlcohol 70°, torulas de algodon3.3 Equipos y software: Camara de flujo laminar, centrifuga, estufa de incubacion, equipo de hemocultivos automatizado.Software: Omega3.4 Procedimiento:3.4.1 Tecnico paramedico que recepciona debe:verificar rotulacion de bolsa.verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridadlavado de manos clinicoretire bolsa externacolocarse guantes3.4.2 desinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70° utilizando algodon. Las torulas de algodon se pasan solo una vez y se eliminan.Retire sello de vial de hemocultivos adulto aerobio y desinfecte goma con alcohol 70°

Con jeringa esteril puncione bolsa en el lugar desinfectado.Aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en el vial adulto.3.4.3 Vuelva a desinfectar una zona de la bolsa con alcohol 70° con algodon, puncione con jeringa y obtenga unos 5 cc de muestra. Inocule algunas gotas de muestra en una placa de agar sangre, agar chocolate y un tubo de agar sabouraud. Disemine en 3 cuadrantes en caso de las placas y en estria en el caso del tubo.3.4.4 Incube las placas de agar sangre y chocolate en estufa de CO2 a 5% a 35° C, y el tubo de agar Sabouraud en estufa normal a 35° C.3.4.5 Ingrese vial a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular el vial. 3.5 Diagnostico microbiologico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tincion de gram y siembra en placas de agar sangre y agar chocolate y posteriormente el estudio de identificacion bacteriana de los cultivos con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios, aerobios facultativos u hongos.3.6 Informe si no hay crecimiento, se informa como: negativo 5 y 10 dias de incubacion. si existe crecimiento: se informa el microorganismo aislado y antibiograma.3.7 RegistrosSistema informatico del laboratorio.Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente. Nº 8. PROCEDIMIENTO CULTIVOS DE SECRECIONES DEL APARATO RESPIRATORIO SUPERIOROBJETIVORealizar procesamiento de las muestras de secreciones del aparato respiratorio superior de acuerdo a métodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de esta localizacion, como faringoamigdalitis (muestra faringea), sinusitis (senos paranasales), otitis (secrecion otica), conjuntivitis (secreción ocular). Cabe considerar que la muestra faringea tambien se obtiene para estudio de portacion de S. aureus. Ademas tambien recordar que la secrecion nasal solo sirve para estudio de portacion.

DESARROLLO DEL PROCESO1. Recepcion, ingreso y etiquetado: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Siembra: responsable es el Tecnico paramedico.La muestra generalmente llegara en torula con medio de transporte Stuart o torula esteril sin medio de transporte. Debe ser sembrada lo antes posible despues de haber sido tomada, mantenida a to ambiente Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente segun tipo de muestra, segun técnica de siembra descrita en Procedimiento de Siembra de muestras para cultivos aerobicos de este manual.Secrecion nasofaringea: Agar sangre. Incubar en estufa normalSecrecion de senos paranasales: Agar sangre y agar chocolate. Incubar en estufa de CO2. Si se solicita busqueda de hongos se debe sembrar en agar Sabouraud e incubar por 5 diasSecrecion conjuntival: Agar sangre y agar chocolate. Incubar en estufa de CO2. Si se solicita busqueda de hongos se debe sembrar en agar Sabouraud e incubar por 5 diasSecrecion otica: Agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey. Incubar en estufa de CO2, MacConkey en estufa atmosfera normal. Si se solicita busqueda de hongos se debe sembrar en agarSabouraud e incubar por 5 dias 3. Incubacion en estufa de cultivo a 35° a 37oC a atmosfera con 5% CO2 por 48 hrs.

4. Las placas de cultivos ya incubadas 24 horas son examinadas por Tecnologo Medico para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clinica en cada caso. Segun esto se realiza pruebas de identificacion de microorganismo y estudio de susceptibilidad. Los mas frecuentes son:- Secrecion faringea: Streptococcus pyogenesStreptococcus beta hemolitico grupo C o G.- Secrecion senos paranasales: Streptococcus pneumoniaeHaemophilus influenzaeHaemophilus sp.Branhamella catharralisStaphylococcus aureus- Secrecion ocular: Streptococcus pneumoniaeHaemophilus influenzaeHaemophilus spp.Branhamella catharralisStaphylococcus aureusBacilos Gram negativos- Secrecion otica: Bacilos Gram negativos (Pseudomonas, Proteus, etc.)Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pyogenesHaemophilus spp.Staphylococcus aureus5. Las placas que tienen escaso desarrollo o que permanecen negativas se incuban hasta por 48 hrs., excepto aquellas en que se solicite cultivo de hongos en que se incubara hasta por 5 dias.6. En paralelo a la siembra se realiza frotis en lamina portaobjetos, para tincion de gram, excepto secreción faringea.Informe:Gram directo, excepto en secrecion faringeaInformar:- presencia de leucocitos y cantidad- o no se observan leucocitos- informar morfologia bacteriana y cantidadCultivo:- negativo 48 horas de incubacion- desarrollo de flora habitual- hubo desarrollo de escasa, regular o abundante cantidad de….- antibiograma cuando corresponde.Tiempo de respuesta- negativo, 48 horas habiles- positivo, 72 horas habilesRegistros: Sistema informatico del laboratorio, en reverso de orden de examen, se guarda en secuencia de ingreso en sobres marcados como secreciones y estos en caja indicando el mes y ano, en archivos. 9. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE SECRECIONES DEL APARATO RESPIRATORIO INFERIOROBJETIVORealizar estudio de secreciones del aparato respiratorio inferior de acuerdo a metodos estandarizados para identificar microorganismos causantes de infecciones en esta localizacion. Las infecciones del tracto respiratorio inferior comprometen traquea bronquios, bronquiolos, alveolos y parenquima

pulmonar. El diagnostico etiologico presenta dificultades porque depende de la calidad de la muestra, por lo que se debe evitar la posible contaminacion orofaringea.Las muestras para estudio de infecciones del tracto respiratorio bajo son generalmente expectoraciones, aspirados traqueales y lavados broncoalveolares. cultivo, identificacion de las cepas en desarrollo, de realizar los inoculos para antibiogramas si corresponde, y de la validacion del informe.

DESARROLLO DEL PROCESO1. Recepcion, ingreso y numeracion: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Para el procesamiento primero se realiza tincion de gram y luego la siembra.2.1 Evaluacion de calidad de la muestra: por medio de la Tincion de Gram, en donde se evalua la presencia de células epiteliales y de polimorfonucleares, lectura a objetivo 10X por lo menos 10 campos.- Celulas epiteliales: se evalua si hay presencia de 10 o mas celulas por campo.- Polimorfonucleares: se cuantifica mas de 25 pmn por campo, Entre 10 y 25 pmn por campo yMenos de 10 pmn por campoCriterio de rechazo de la muestra: está dado por la presencia de 10 o más células por campo lo que indica contaminación con flora respiratoria alta, siendo poco representativa del tracto respiratorio inferior.3. Siembra: responsabilidad de tecnicos paramedicos. Es de acuerdo al tipo de muestra y del volumen que llega al laboratorio. Debe ser sembrada lo antes posible. Se describen a continuacion las tecnicas para el procesamiento según muestra3.1 Expectoracion y aspirados endotraqueales con volumen menor a 0.5 mL, se realiza cultivo simple (o cualitativo)Aspirado endotraqueal en horario inhabil se realiza cultivo simpleVorterear muestra por lo menos 1 minuto o hasta que este homogenea.Seleccionar la porcion mas purulenta de la muestraCon pipeta recoger una porcion de la muestra e inocular en cada placa.Sembrar y aislar con asa esteril en tres cuadrantes.3.2 Aspirado endotraqueal, en horario habil, se realiza cultivo cuantitativo:1. Vorterear la muestra hasta que este homogenea2. Diluir con suero fisiologico 0.9% agregando igual cantidad de suero que volumen de la muestra.3. Agitar la muestra con las perlas de vidrio esteriles durante 2 a 3 minutos.4. Extraer con micropipeta 100 ]L (0,1 mL) de muestra y diluir con 9,9 mL de suero fisiologico 0.9%, agitar.(Dilucion 1:100)5. Sembrar 100 ]L (0,1 mL) de esta dilucion en placa de agar sangre y agar Mac Conkey. Marcar estas placas como D16. Sembrar 10 ]L (con asa esteril de 10) las placas de agar sangre y agar MacConkey marcadas como D2 con estria unidireccional.3.3. Lavado broncoalveolar: se realiza cultivo cuantitativoHomogeneizar la muestraEn mitad de cada placa sembrar con asa de 1 uL haciendo una linea central y luego pasando por la linea en forma de zig zag.En la otra mitad de la placa sembrar de igual modo pero con un asa de 10 uL.Si se solicita hongos sembrar cuatro tubos de sabouraud.4. Incubacion de las placas MacConkey es en atmosfera normal a 35 - 37 °C y las placas sangre y chocolate en atmosfera de 5% CO2 a 35°C. A las 24 horas de incubacion la mitad de los tubos sabouraud se deja incubando a temperatura ambiente y la otra mitad se mantiene a 35-37°C.5. Las muestras se almacenan en un contenedor destinado para tal fin hasta completar el estudio microbiologico y se realice el informe final.

6. Las placas de cultivo son observadas al dia siguiente por el profesional a cargo discriminando entre desarrollo de flora habitual del desarrollo de microorganismos patogenos, si corresponde se hara recuento de colonias, identificacion y estudio de susceptibilidad. Las muestras negativas se vuelven a incubar hasta completar su tiempo de estudio.Son de importancia clinica Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacilos gram negativos, Nocardia, Haemophilus spp, entre otros. Si es predominante se informa Moraxella spp. En los cultivos cuantitativos el recuento indica probabilidad de colonizacion o infeccion por el microorganismo aislado. Tambien se debe informar si hubo desarrollo de flora habitual.Se considera para la descripcion cualitativa de cantidad:Informe Desarrollo en las placas de cultivoMuy escaso desarrollo Crecimiento de muy pocas colonias aisladas (1 a 3 cols)Escaso desarrollo crecimiento en primera parte de la siembra en placaModerado desarrollo crecimiento en la primera y segunda parte de la siembra en placaAbundante desarrollo crecimiento en la primera, segunda y tercera parte de la siembra en Placa Interpretacion de recuento cuantitativo:Aspirado endotraquealPlacas dilucion 1(D1) Placas dilucion 2 (D2)1 colonia = 2.000 UFC/ mL (2 x 103) 1 colonia = 20.000 UFC/ mL (2 x 104)Ausencia colonias = <10 3 UFC/ mL Ausencia colonias = <10 4 UFC/ mL50 colonias = 100.000 UFC/ mL 50 o mas colonias en D2 = >106 UFC/ mLLavado broncoalveolarno colonias x 1.000 (siembra con asa de 1 ]L)no colonias x 100 (siembra con asa de 10 ]L)Tiempo de respuesta: Cultivo negativo a las 72 hrs.Cultivo positivo: 48 a 96 hrs. habilesCultivo no apto: dentro del dia habil.Informe:Tincion de gramCultivo no apto: Muestra respiratoria rechazada, Gram de screening alteradoCultivo negativo: Negativo a las 72 horas habiles.Cultivo positivo: se indica el recuento si corresponde. Hubo desarrollo ........... de .............. con sucorrespondiente antibiograma. El informe debe incluir un detalle de cada microorganismo aislado, con su recuento y antibiograma correspondiente.

Nº 10. PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE SECRECIONES DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS OBJETIVORealizar procesamiento de las muestras clinicas de acuerdo a metodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de infecciones de piel y tejidos blandos, incluyendo a todas aquellas que afectan a piel, tejidos subcutaneo y muscular.

Placa agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos.Placa de agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayoria de las bacterias habituales y levaduras.Caldo Thioglicolato: medio que contiene medios nutritivos para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobiasDESARROLLO DEL PROCESO1. Recepcion, ingreso y numeracion: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Siembra: responsable es el Tecnico Paramedico.

La muestra generalmente llegara en torula con medio de transporte Stuart o torula esteril sin medio de transporte. Debe ser sembrada lo antes posible despues de haber sido tomada, mantenida a to ambiente Si la muestra viene en torula seca se debe sembrar lo antes posible (2 horas), en caso que venga en un medio de transporte (Stuart) se puede mantener hasta 8 horas a temperatura ambiente. Se procede a realizar siembra en los medios de cultivo correspondiente segun tipo de muestra, segun tecnica de siembra descrita enProcedimiento de Siembra de muestras para cultivos aerobicos de este manual. Se siembra en tres cuadrantes cada placa de medio de cultivo y se realiza frotis para gram.En el caso de muestras de trozos de tejidos blandos (biopsia de piel, tejido subcutaneo, tejido muscular, fascia, etc) se procedera segun lo descrito en procedimiento no 11: Cultivos de tejido oseo. En un mortero esteril se coloca la muestra con un poco de caldo soya o tioglicolato y se macera hasta obtener una muestra homogenea. Luego por medio de pipeta pasteur se siembra en tres cuadrantes en placa agar sangre y placa agar MacConkey ademas de realizar dos frotis para gram.Despues de finalizada la siembra, las muestras se almacenan en un contenedor destinado para tal, hasta la obtencion del informe final.3. Las placas se incuban en estufa de cultivo a 35° a 37oC a atmosfera normal por 18 a 24 hrs.4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al dia siguiente por el Tecnologo Medico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clinica en cada caso (ver interpretacion de cultivo). Segun esto se realiza pruebas de identificación de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que esten negativas se dejaran en incubacion hasta un periodo de 48 horas.5. Se considera para la descripcion cualitativa de cantidad:Informe Desarrollo en las placas de cultivoMuy escaso desarrollo Crecimiento de muy pocas colonias aisladasEscaso desarrollo crecimiento en primera parte de la siembra en placaModerado desarrollo crecimiento en la primera y segunda parte de la siembra en placaAbundante desarrollo crecimiento en la primera, segunda y tercera parte de la siembra en placa6. Interpretacion del cultivo: el responsable es el Tecnologo Medico. Este tipo de muestra tiene una alta probabilidad de desarrollarse flora habitual que puede ser del mismo paciente como del ambiente. Se informa como desarrollo de flora habitual cuando hay presencia de Corynebacterium spp., Staphylococcus coagulasa negativo, Neisseria spp. no patogenas, y estreptococos alfa y no-hemolitico. Puede haber excepciones, se estudiaran cuando se encuentren en estado puro y se relacione con la clinica del paciente. Se informan como microorganismos patogenos a estreptococos beta-hemoliticos, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gramnegativos como las Enterobacteriaceae, tanto en las heridas agudas como en las cronicas.Tiempo de respuesta:Cultivo negativo a las 48 horas, (si muestra corresponde a tejido se incuba 72 hrs)Cultivo positivo: 48 a 96 hrs. habilesInforme: Tincion de Gram.Cultivo negativo a las 48 horas habilesCultivo positivo: se informa Hubo desarrollo de ........ cantidad de .............. con su antibiograma.

Nº 11. PROCEDIMIENTO CULTIVO DE TEJIDO ÓSEOPlaca Agar Mac Conkey: es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para el aislamiento y estudio de bacilos gram negativos.Placa de Agar sangre: medio de cultivo enriquecido y no selectivo que permite el crecimiento de la mayoria de las bacterias habituales y levaduras.

Caldo Tioglicolato: medio que contiene medios nutritivos para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobiasDESARROLLO DEL PROCESO1. Recepcion, ingreso y numeracion: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Siembra: responsable es el Tecnico paramedico y de acuerdo al horario de recepcion se realiza siguiente procedimiento:Horario habil:En un mortero esteril se coloca la muestra con un poco de caldo soya o tioglicolato y se macera hasta obtener una muestra homogenea.Luego por medio de pipeta pasteur se siembra en tres cuadrantes en placa agar sangre y placa agar MacConkey ademas de realizar dos frotis para gram.Si la muestra es un tejido que no se puede macerar (ej cartilago o hueso denso) se coloca caldo thioglicolato en el frasco de la muestra en cantidad suficiente para dejar la muestra totalmente inmersa.Horario inhabilSe agrega al frasco en que viene la muestra caldo tioglicolato, en cantidad suficiente para dejar la muestra totalmente inmersa en el caldo, (como alternativa se puede usar caldo soya)3. Incubacion en estufa de cultivo a 35° a 37oC a atmosfera normal por 18 a 24 hrs.4. Las muestras deben guardarse refrigeradas hasta obtener el resultado del cultivo.5. Las placas de cultivo incubadas son observadas al dia siguiente por el profesional a cargo. Aquellas muestras consideradas positivas se realiza identificacion microbiana y estudio de susceptibilidad. Las muestras negativas se mantienen en incubacion, hasta su informe final siendo revisadas cada dia. Las muestras que estan en caldo se siembran con el mismo procedimiento del horario habil, se observa si presenta turbidez cada dia y antes de completar los cinco dias de estudio se traspasa a placas de agar sangre y agar Mac Conkey.6. Interpretacion del cultivo: el responsable es el Tecnologo medicoLa presencia de microorganismo de flora habitual solo se informara si es clinicamente significativa. Se consideran patogenos a estreptococos beta-hemoliticos, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp.,Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gramnegativos como las Enterobacteriaceae. Aunque cabe considerar que por ser este tipo de muestras normalmente esteriles, cualquier microorganismo podria tener significado clinico.La presencia de bacterias anaerobias se puede observar por la presencia de turbidez en caldo tioglicolato, las placas incubadas en atmosfera normal seran negativas. En estos casos la tincion de gram del caldo turbio y el gram directo de la muestra pueden orientar a la presencia de anaerobios.7. Tiempo de respuesta:Cultivo negativo 5 dias habilesCultivo positivo: 48 a 72 hrs. habiles8. Informe:Tincion de Gram: si la muestra es sugerente de presencia de anaerobios agregar comentario.Cultivo negativo a los 5 dias de incubacionCultivo positivo: Hubo desarrollo de.................. con su correspondiente antibiograma9. Registros: El resultado quedara registrado en sistema informatico y en reverso de orden de examen.

Nº 12. PROCEDIMIENTO DE CULTIVOS DE SECRECIONES INTRAABDOMINALESOBJETIVORealizar procesamiento de las muestras de secreciones intraabdominales de acuerdo a métodos estandarizados, para identificar la presencia de microorganismos causantes de cuadros infecciosos de esta localizacion. Esto incluye secreciones de peritonitis secundaria y terciaria, colecciones intraabdominales y retroperitoneales, y bilis.

Se excluyen las muestras de liquido peritoneal o ascitico de peritonitis primaria (peritonitis bacteriana espontanea que se incluye en Cultivo de liquidos esteriles)INTRODUCCIÓNLa peritonitis bacteriana se produce por la contaminacion de la cavidad abdominal por materia intestinal o del tracto genito-urinario, puede ser secundaria a una apendicitis o a una diverticulitis u otro proceso en que se produzca perforacion del tracto intestinal, necrosis isquemica de la pared o por translocacion bacteriana. Los abscesos intraabdominales pueden corresponder a infecciones intraabdominales evolucionadas que se presentan ya como abscesos intraabdominales en el momento del diagnostico inicial. Las peritonitis secundarias tambien pueden ser postoperatorias (por dehiscencia de sutura o perforacion iatrogenica) o pueden aparecer tras un traumatismo abdominal penetrante o cerrado (peritonitis postraumaticas).La peritonitis bacteriana espontanea (PBE) en adultos se presenta en pacientes con cirrosis hepatica y ascitis.En general la peritonitis secundaria suele estar causada por una flora polimicrobiana mixta aerobia y anaerobia con predominio de enterobacterias, E.faecalis, Bacteroides fragilis y estreptococos anaerobiosMUESTRA: Liquido peritoneal, liquido abdominal, liquido biliar o bilis, liquido pancreatico, coleccion abdominal, absceso pared abdominal u otro contenido: hepatico, vesicular, mesenterico, renal. SIEMBRA:En los medios establecidos (placa de agar sangre y agar Mac Conkey) realizando aislamiento en tres cuadrantes y segun procedimiento descrito (Procedimiento no 1: Siembra de muestras para cultivos aerobicos). En caso de solicitar estudio de anaerobios se procedera de acuerdo a procedimiento descrito para ello (no 16: Cultivos de bacterias anaerobias).DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO:Informe de tincion de gramCultivo: Se estudiaran todos los microorganismos predominantes o microbiologicamente relevantes, desarrollados en los medios de cultivos, de acuerdo a evaluacion realizada por TM.TIEMPO DE RESPUESTA:a. Cultivo negativo a las 72 horasb. Cultivo positivo: preinforme a las 24 o 48 hrs. segun correspondaInforme definitivo de cultivo y antibiograma a las 48 o 72 horas hábiles (excepcionalmente puede requerir mas tiempo (cepas de lento crecimiento, cultivos mixtos, necesidad de repeticion de pruebas de identificacion y/o susceptibilidad)INFORMEa. Negativo a las 72 hrs.b. Cultivo positivo: Hubo desarrollo de: …… Antibiograma (si corresponde)REGISTROS: El resultado quedara registrado en sistema informatico Omega y en reverso de orden de examen.

13. CULTIVOS DE SECRECIONES DEL APARATO GENITALOBJETIVORealizar el procesamiento de muestras de secreciones del aparato genital de acuerdo a metodos estandarizados, para el diagnostico microbiologico de infecciones de esta localizacion. Tambien se aplica al estudio de portadores de algunos agentes (ejemplo: Streptococcus agalactiae en mujeres embarazadas)Procedimiento:1. Recepcion, ingreso y numeracion: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.

2. Siembra:2.1. Inocular con la torula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y placa agar chocolate.2.2. Sembrar en el Agar Sabouraud en estria.2.3. Inocular con la 2a torula en primer cuadrante de placa de agar Thayer Martin2.3. Realizar un frotis, girando suavemente (nunca frotar) en un area no mayor a 2 cm. con la torula.2.4. Diseminar todas las placas, en 3 cuadrantes, esterilizar el asa entre 1° - 2° cuadrante. Terminar en estria.3. Incubar a 35-37 °C en estufa CO2 las placas de agar sangre, agar thayer Martin y agar chocolate; y en estufa normal el agar Sabouraud.4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al dia siguiente por el Tecnologo Medico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clinica en cada caso. Segun esto se realiza pruebas de identificacion de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que esten negativas se dejaran en incubacion hasta un periodo de 48 horas. Si hay desarrollo de diplococos gram negativos, se realizan pruebas bioquimicas para Neisseria (oxidasa y sistema comercial pruebas bioquimicas).Informe:Tincion de Gram: Cuando existe sospecha de gonorrea, la tincion de Gram es suficiente para confirmar el diagnostico clinico, aunque igual debe realizarse el cultivo. En infecciones agudas por gonococo, se observan diplococos gran negativos, intra y extracelulares, con aspecto de granos de cafe. En las formas cronicas o en el inicio de la enfermedad, pueden hallarse diplococos gram negativos solo extracelulares.Cultivo corriente y gonococo: informe final 48 – 72 hrs habiles.2. FLUJO VAGINAL / SECRECION VAGINALLas infecciones vaginales son principalmente causadas por Trichomonas vaginalis, Candida albicans o se trata de una vaginosis bacteriana. En ninas prepuberes pude haber infecciones por otros agentes como Enterobacterias, Streptococcus pyogenes, entre otros.A estas muestras se realiza: cultivo corrienteCultivo de hongos (levaduras)Tincion de GramExamen al frescoCultivo de gonococo sólo a niñas prepuberes en caso de sospecha. En resto de pacientes siempre debe ser muestra cervicalMaterial:Agar Sangre – Agar Chocolate – Agar SabouraudAgar Thayer Martin (solo si se solicita cultivo de gonococo) Considerar que las muestras vaginales no son la muestra indicada para estudio de gonococo, solo se aplicara estudio para pacientes menores.Muestra:Debe venir con 2 torulas (para cultivo corriente, cultivo de hongos, gram y examen al fresco)Procedimiento:1. Recepcion, ingreso y numeracion: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Siembra:2.1. Inocular con la torula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y placa agar chocolate.2.2. Sembrar en el Agar Sabouraud en estria.2.3. Realizar un frotis, girando suavemente (nunca frotar) en un area no mayor a 2 cm. con la torula.2.4. Diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1° - 2° cuadrante. Terminar en estria.3. Incubar a 35-37 °C en estufa CO2 las placas de agar sangre y agar chocolate; y en estufa normal el agar Sabouraud4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al dia siguiente por el Tecnologo Medico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los

microorganismos de importancia clinica en cada caso. Segun esto se realiza pruebas de identificacion de microorganismo y estudio de susceptibilidad si corresponde. En cambio las muestras que esten negativas se dejaran en incubacion hasta un periodo de 48 horas.InformeTincion de gramExamen al fresco: en la observacion directa se informan celulas descamativas, leucocitos y bacterias, debe informarse la presencia o ausencia de elementos compatibles con Trichomonas vaginalis y levadurasCultivo corriente, de hongos y gonococo: informe final 48 – 72 hrs. habiles3. SECRECIÓN CERVICALLa secrecion cervical es aquella que proviene del cervix (cuello uterino); la infeccion cervical (cervicitis) es, por lo general, causado por Neisseria gonorrhoeae y Chlamidia trachomatis Procedimiento:1. Recepcion, ingreso y numeracion: se sigue el procedimiento comun de muestras microbiologicas.2. Siembra:2.1. Inocular con la torula en el primer cuadrante de la placa agar sangre y Thayer Martin.2.2. Diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1° - 2° cuadrante. Terminar en estria.3. Incubar a 35-37 °C en estufa CO2 las placas de agar sangre y agar Thayer Martin, y en estufa normal el agar Sabouraud.4. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al dia siguiente por el Tecnologo Medico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio, teniendo en cuenta los microorganismos de importancia clinica en cada caso. Segun esto se realiza pruebas de identificacion de microorganismo y estudio de susceptibilidad. En cambio las muestras que esten negativas se dejaran en incubacion hasta un periodo de 48 horas. Si hay desarrollo de diplococos gram negativos, se realizan pruebas bioquimicas para Neisseria (oxidasa y sistema comercial pruebas bioquimicas).Informe:Cultivo corriente y gonococo: informe final 48 – 72 hrs habiles.4. SECRECION INTROITO / SECRECION PERIANALConsiste en la pesquisa de la colonizacion vaginal y/o rectal de Streptococcus beta hemolitico grupo B (S agalactiae) a las mujeres embarazadas entre las 35 y 37 semanas para luego administrar antibioticos intraparto a aquellas con cultivos positivos.Materiales:Agar SangreCaldo Todd HewittTorula esteril con medio de transporte StuartMuestra:Debe venir en medio transporte stuartEn la orden de examen, vendra como: secrecion perianal, introito, o portacion de Streptococcus β hemolitico grupo B.Procedimiento:1. Introducir la torula del medio de transporte en caldo todd hewitt2. incubar por 3 hrs. a 37o C en estufa normal3. despues del periodo de incubacion, agite la torula en el caldo4. saque la torula del caldo y sembrar en la placa agar sangre5. diseminar en 3 cuadrante, esterilizar el asa entre 1° - 2° cuadrante, terminar en estria.6. incubar placa de agar sangre a 35-37 °C en estufa normal por 24 a 48 hrs.

7. Las placas de cultivo ya incubadas son observadas al dia siguiente por el Tecnologo Medico a cargo para determinar presencia o ausencia de crecimiento, y decidir estudio.Informe:Cultivo corriente: informe final 48 – 72 hrs habiles14. CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS DE INSUMOS CLÍNICOSOBJETIVORealizar procesamiento de acuerdo a metodos estandarizados, de muestras de soluciones preparadas que son administradas a pacientes por via oral o parenteral, con fines terapeuticos, para el estudio de eventos adversos asociados a contaminaciones de estas soluciones.Este documento incluye cultivo de:HemoderivadosNutricion parenteral.DESARROLLO DEL PROCESO1. CULTIVO DE HEMODERIVADOS1.1 Objetivo:Identificar presencia o ausencia de microorganismos en concentrado de globulos rojos, plasma, sangre total u otro hemoderivado.Se realiza en caso de presentarse alguna reaccion adversa en un paciente que este siendo transfundido.1.2 Materiales e insumos- vial de hemocultivo aerobio para adulto- placa de agar sangre- jeringas1.3 Instrumentacion o equipos y accesorios- estufa de incubacion atmosfera normal- campana de flujo laminar para siembra- Equipo automatizado de hemocultivos 1.4 Procedimiento:1.4.1 La via de infusion del hemoderivado al paciente, debe ser retirada por el tecnologo medico de banco de sangre y enviada al laboratorio de microbiologia con todos los datos del paciente.El estudio microbiologico incluye bacterias aerobias y hongos.1.4.2 Tecnico paramedico que recepciona debe:verificar rotulacion de bolsa.verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridadlavado de manos clinicoretire bolsa externacolocarse guantesdesinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70° utilizando algodon esteril. Las torulas de algodon se pasan solo una vez y se eliminan.Repita este procedimiento en a lo menos 2 oportunidades.retire sello de 1vial de hemocultivo adulto y desinfecte goma con alcohol 70°.con jeringa esteril atraviese bolsa en el lugar desinfectado.aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en un vial adulto.luego siembre en agar sangre unas gotas del conector de la bolsa. Disemine en 3 cuadrantes, sin esterilizar el asa entre cuadrantesincubar las placas en estufa CO2 a 35-37°.ingrese vial a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular el vial.

1.4.3 Diagnostico microbiologico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tincion de gram y siembra en placas de agar sangre y mac conkey y posteriormente se realiza el estudio de identificacion bacteriana con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios u hongos.1.5 Informe- si no hay crecimiento, se informa como: negativo a los 10 dias de incubacion.- si existe crecimiento: se informa el microorganismo aislado.1.6 RegistrosSistema informatico del laboratorio.Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente.2. CULTIVO DE NUTRICIÓN PARENTERAL2.1 Objetivo:Identificar presencia o ausencia de microorganismos en la nutricion parenteral.Se realiza en caso de sospecha de bacteremia asociada a nutricion parenteral (si proviene de un paciente), o como evaluacion indirecta de la tecnica aseptica, en la preparacion de dicha nutricion (como control de calidad).El estudio microbiologico de la nutricion parenteral incluye bacterias aerobias, anaerobias, anaerobias facultativas y hongos.2.4 Procedimiento:2.4.1 Tecnico paramedico que recepciona debe:verificar rotulacion de bolsa.verificar funcionamiento de gabinete de bioseguridadlavado de manos clinicoretire bolsa externacolocarse guantes2.4.2 desinfecte la superficie de la bolsa con alcohol a 70° utilizando algodon esteril. Las torulas de algodon se pasan solo una vez y se eliminan.Repita este procedimiento en por lo menos 2 oportunidades.Retire sello de vial de hemocultivos adulto aerobio y desinfecte goma con alcohol 70°Con jeringa esteril atraviese bolsa en el lugar desinfectado.Aspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en el vial adulto.2.4.3 Nuevamente realice desinfeccion de bolsaretire sello de hemocultivo anaerobio y desinfecte tapon de goma con alcohol 70oabra nueva jeringaaspire 8- 10 cc. e introduzca estos 8 a 10 cc en un vial anaerobio2.4.4 Luego siembre en agar sangre varias gotas del conector de la bolsa.Disemine en 3 cuadrantes, sin esterilizar el asa entre cuadrantes.Incubar placa en estufa CO2 a 35-37°.Nota: la nutricion parenteral proveniente de farmacia no llegara con conector o bajada de suero.2.4.5 Ingrese viales a equipo automatizado de hemocultivos. No olvide rotular los viales.2.5 Diagnostico microbiologico: Si el equipo entrega alarma de positividad, realizar tincion de gram y siembra en placas de agar sangre y mac conkey y posteriormente el estudio de identificacion bacteriana de los cultivos con procedimientos habituales ya sea en caso de aerobios, aerobios facultativos, anaerobios u hongos.2.6 Informe- si no hay crecimiento en ambos viales, se informa como: negativo- si existe crecimiento en uno o mas viales: se informa el microorganismo aislado.2.7 RegistrosSistema informatico del laboratorio.

Reverso de orden de examen guardada en sobre correspondiente. Nº 15. PROCEDIMIENTO DE ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOSOBJETIVODeterminar la susceptibilidad de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos, de acuerdo a métodos estandarizados, con el proposito de emplear en una primera aproximacion, su resultado como factor predictivo de la eficacia clinica de la terapia en el paciente.En este procedimiento se describen:Antibiograma por difusion en agar o Tecnica de Kirby-BauerAntibiograma por difusion-dilucion en agar (E-test).DESARROLLO DEL PROCESO1. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN EN AGAR (TÉCNICA DE KIRBY-BAUER)1.1 Fundamento:El antibiograma por difusion en agar consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel filtro impregnados con los diferentes antibioticos a testear. Tan pronto el disco se pone en contacto con la superficie humeda del agar, el antibiotico difunde al agar. Esta difusion es radial a traves del espesor del agar a partir del disco formandose un gradiente de concentracion. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibicion. La concentracion de antibiotico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentracion critica y se aproxima a la concentracion minima inhibitoria (CIM) obtenida por metodos de dilucion. Sin embargo, este metodo no permite una lectura directa del valor de la CIM. Por ello, se compara con valores definidos de punto de corte que se han extrapolado de un gran numero de cepas de CIM conocidas que han estado previamente determinadas por otros metodos de determinacion de la sensibilidad a los antimicrobianos (ej.: metodo de dilucion).Existen, por lo tanto, unos diametros de inhibicion, expresados en mm, estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura de los halos de inhibicion debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o resistente (R) segun las categorias establecidas por el CLSI , vigentes para cada ano.1.3 Procedimiento1.3.1 mantención de sensidiscos:Todos los discos deben almacenarse en desecadores a temperaturas de menos 20° C (freezer).Los cartridge que estan en uso permanecen refrigerados en el dispensador.Sensidiscos de betalactamicos como ampicilina, oxacilina, penicilina, cefazolina, cefalosporinas de 3° generacion, cefoperazona-sulbactam, deben permanecer refrigerado solo la cantidad que se usara durante la semana, el resto debe permanecer congelado.Imipenem debe siempre permanecer congelado para su uso.Deben abrirse solo despues de que la temperatura interior del contenedor se haya equilibrado con el medio ambiente, a fin de evitar la condensacion de humedad en los discos.Retire del refrigerador 15-20 minutos y del congelador 1 hora antes de ser utilizadosSolo aquellos discos con fecha de expiracion del fabricante dentro del plazo pueden ser usados.1.3.2 Preparación del inóculo:Esta es la variable que influye mas poderosamente en el tamano de la zona de inhibicion. Los inoculos muy concentrados daran zonas de inhibicion mas pequenas, y por el contrario, los muy diluidos daran zonas de diametros mayores, en ambos casos se falsean los resultados. El inoculo debe estandarizarse ajustando su turbidez a la de un estandar 0,5 Mac Farland. Existen 2 metodos de preparacion de inoculoMétodo directo se toman 3-4 colonias de iguales caracteristicas morfologicas de un cultivo de no mas de 24 horas, y que sea de un medio no selectivo, y ajustar el inoculo a una turbidez equivalente al 0.5 de

la escala de MacFarland 0.5 en suero fisiologico. Agitar en un vortex durante 15-20 segundos. La suspension directa se realizara para todas las bacterias, a menos que exista muy pocas colonias en ese caso se realizara metodo de crecimiento solo si es una enterobacteria, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosaMétodo de crecimiento:Se toman 3 a 5 colonias de iguales caracteristicas morfologicas, se suspenden en 4 a 5 ml. de caldo nutritivo (caldoMueller Hinton). Incube a 35° C por 2 a 6 horas, hasta que alcance o exceda la turbidez estandar 0.5 MacFarland.Ajuste turbidez a 0.5 Mac Farland, con caldo Mueller Hinton. Utilice el lector de turbidez.Solo puede ser utilizado para bacterias no fastidiosas Nº 17. PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE DIAGNÓSTICO DE PARASITOLOGÍA CLÍNICAOBJETIVORealizar procesamiento de las muestras clinicas para el diagnostico de enfermedades parasitarias de acuerdo a métodos estandarizados.Los parasitos que pueden provocar enfermedad en el ser humano, incluyen protozoos, helmintos y algunos artropodos.Son causa de enfermedades sistemicas y localizadas. Presentan diversas formas evolutivas como son huevos, larvas, quistes, trofozoitos, etc., y dependiendo del agente y cuadro clinico de sospecha, se emplearan determinados métodos de laboratorio para su diagnostico.En este Procedimiento se incluyen las Tecnicas de ejecucion de los siguientes examenes:Parasitologico seriado de deposicionesTest de GrahamGota gruesaAcarotestTincion de Cryptosporidium (Ziehl Neelsen modificado)DESARROLLO DEL PROCESO1. PARASITOLÓGICO SERIADO DE DEPOSICIONES (MÉTODO DE BURROWS)1.1.- OBJETIVO ESPECIFICO: Diagnosticar enteroparasitosis.1.2.- FUNDAMENTOEl metodo de Burrows otorga un buen rendimiento para el diagnostico de quistes y trofozoitos por ser un metodo de concentracion por sedimentacion en dos fases, una para determinar quistes y otra para trofozoitos. El método en si consiste en macerar la deposicion con el fijador (PAF) para asi formar una solucion homogenea la que despues es centrifugada varias veces, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo con suero fisiologico hasta lograr un sobrenadante limpio, el que finalmente tambien se elimina. El sedimento restante se analiza microscopicamente, colocando una gota de este con una gota de colorante entre lamina y laminilla; en este deberian aparecer formas evolutivas de algun parasito si lo hubiere.Los colorantes utilizados de preferencia son MIF y Tionina los cuales dan un buen contraste a las muestras y permiten ver mejor los quistes con sus estructuras internas, en caso necesario tambien se puede utilizar Lugol como colorante.5. TINCIÓN PARA CRYPTOSPORIDIUM (ZIEHL NEELSEN MODIFICADO)5.1 OBJETIVOS: Detectar ooquistes de Cryptosporidium parvum. Examen indicado para determinar la etiologia de una diarrea acuosa sin sangre en pacientes inmunocomprometidos.5.2 CAMPO DE APLICACION: Se solicita principalmente en pacientes inmunocomprometidos como personas infectadas con VIH, pacientes en quimioterapia, transplantados en tratamiento con inmunosupresores. Tambien se hace en todo nino menor de 2 anos en forma simultanea con el

parasitologico seriado, ya que pueden exponerse al parasito por tener contactos con animales y sus excretas o ingerir alimentos contaminados con ooquistes.5.3 FUNDAMENTO: La Tincion de Ziehl-Neelsen se basa en la capacidad que tienen algunos parasitos y bacterias de resistir a la decoloracion con alcohol-acido, despues de la tincion con colorantes basicos (fucsina). Esta propiedad se correlaciona con el alto contenido de lipidos en su envoltura celular, que confiere un ambiente hidrofobo. El colorante fucsina basica se compone de fenol, lo que facilita la penetracion de la fucsina en la envoltura celular; este proceso de tincion requiere de calentamiento, ya que el calor ayuda a que el colorante atraviese la pared celular que contiene ceras.En la etapa posterior se decolora con un decolorante organico que es una mezcla de acido y alcohol (HCl y alcohol etilico 95%), con lo cual se logra extraer el colorante (fucsina) a todas las celulas excepto a las alcohol-acido resistentes.La posterior tincion con el colorante de contraste (Azul de Metileno) tine a las celulas que no resistieron el tratamiento organico, por lo tanto, se tinen de azul, y de esta manera resaltan los organismos alcohol-acido resistentes los cuales estan tenidos de rosa. Dentro de los parasitos coccidios el Crytosporidium parvum, se caracteriza por sus propiedades de alcohol-acido resistencia.5.7 DESARROLLO DEL PROCESOSe debe corroborar que la muestra venga con nombre y apellidos, servicio y con su respectiva orden.Confeccion del frotis:Homogeneizar la muestra de deposicion tomada con fijador PAF, diluyendola con suero fisiologico si fuera necesario.Tamizar con malla fina de acero inoxidable.Centrifugar 5 minutos a 1500 r.p.m.Botar el sobrenadante.Con una gota del sedimento, hacer un extendido en un portaobjetos.Dejar secar a temperatura ambiente.Tincion:Cubrir la lamina con fucsina completamenteCalentar la lamina hasta la emision de vapores blancos (sin que hierva)Dejar 15 minutos y lavar con aguaDecolorar con alcohol acido durante 1 minuto.Lavar con agua.Cubrir la lamina con azul de metileno durante 7 minutosLavar con aguaSecar a temperatura ambiente.Lectura:Se debe recorrer el frotis completamente con objetivo de inmersion 100 x. Los ooquistes de cryptosporidium se tinen de color rojo y se puede reconocer pared y contenido. (Ver anexo 6)5.8 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Es imprescindible aplicar controles biologicos al preparar nuevos colorantes y al efectuar tinciones de muestras problemas, es decir, se debe tener muestras positivas con Cryptosporidium parvum, con las cuales se realiza un frotis para luego tenir con los nuevos colorantes junto a las muestras problemas para asi asegurar un resultado fidedigno y evitar falsos positivos y negativos. El resultado de este control se debe registrar en planilla correspondiente.5.9 INFORME:Se ingresa los resultados al sistema informatico:Si el resultado es positivo se debe informar:“Tincion Ziehl Neelsen modificado: Positiva al observar ooquistes de Cryptosporidium parvum”Si el resultado es negativo se debe informar:“Tincion Ziehl Neelsen modificado: Negativo al No observar ooquistes de Cryptosporidium parvum”

5.10 RESPONSABLE DIRECTO: Corresponde al Tecnologo Medico a cargo del laboratorio de parasitologia, quien efectua la lectura del examen.

Nº 18. PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE DIAGNÓSTICO DE MICOLOGÍA CLÍNICAOBJETIVO: Realizar procedimientos de diagnostico microbiologico de micosis superficiales y sistemicas, de acuerdo a metodos estandarizados y segun las recomendaciones nacionales e internacionales.DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTOSe describe proceso por separado para muestras clinicas de micosis superficiales y micosis sistemicas o profundas.I. Micosis superficialesEn las micosis superficiales estan involucrados principalmente: dermatofitos, Candida spp. y Fusarium (unas).1. TIPO DE MUESTRASPielCabello y PeloUnas2. TOMA DE MUESTRASConsideraciones generales:Cantidad suficienteBordes activos de las lesionesPaciente sin tratamiento antifungico previo (en caso contrario suspenderlo a lo menos 1 semana antes si es topico o 15 dias si es oral).Paciente limpio. Bano o limpieza solo con agua y jabon (no desinfectante)Antisepsia de piel con alcohol 70°PielRaspado del borde activo de la lesion con bisturi, espatula o portaobjetos esterilSi existen vesiculas debe cortarse el techo.Raspado y cinta adhesiva transparente (en Pitiriasis versicolor)IntértrigoRaspar escamasSi esta macerado tomar con torula humedecida en suero esterilUñasLas unas no deben estar pintadasTomar escamas mas profundas posibles, limite entre una sana y enferma.Raspado en la porcion distal del espacio subungueal donde se acumula la hiperqueratosis (areas blancas)En caso de onicomicosis superficial se raspa la cara externa de la unaPelosLimpiar cuero cabelludo con alcoholArrancar 10-20 pelos cortados del borde de la alopecia con pinzasMuestra de cuero cabelludo se raspa con bisturiOtras muestrasOjos :- conjuntival (torula esteril)- cornea (procedimiento medico)Oidos:- con torula esteril tomar material purulento o costrosoCavidad oral:

- aseo oral- raspar lesiones blanquecinasFlujo vaginal- con especuloGlande, prepucio, region anal y perianal- tomar con torula esterilTransporte de muestraEnvase limpio y secoLas escamas, pelos, costras o raspados se depositan: en placa de petri esterilRechazo de MuestraMuestra escasa.Paciente en tratamiento.Muestra sin orden de examen y/o diagnostico presuntivo.Muestra sin datos minimos del paciente y de la lesion.3. PROCEDIMIENTO3.1. Examen microscópico directo con KOH 10%El examen microscopico directo del material clinico es uno de los procedimientos mas simples y utiles en el diagnostico de infecciones fungicas.La observacion de elementos fungicos en escamas de piel, pelos unas pueden proporcionar una clara indicación del tipo de micosis superficiales envueltas: dermatofitosis, candidiasis o pitiriasis versicolor.1. Colocar el material a estudiar en un porta-objeto y se cubre con una a dos gotas de KOH al 10%.2. Luego cubrir la preparacion con un cubre-objeto. Nunca se debe presionar el cubre-objeto con los dedos, ya que los acidos grasos naturales de la piel dificultan la observacion. Cuando la muestra es muy espesa es aconsejable presionar el cubre-objeto con una pinza u otro objeto. De esta manera el hongo puede ser liberado del material biologico, lo que permite su visualizacion.3. Guardar en camara humeda hasta el momento de la lectura.4. Observar con objetivo 40 X 5. Informe de resultados:- Se observan levaduras en +, ++, +++- Se observan pseudohifas en +,++,+++- Se observan levaduras y pseudohifas en +, ++, +++- Se observan hifas y levaduras en +, ++, +++- Se observan hifas septadas en +, ++, +++- Se observan artroconidios en +, ++, +++- Se observan clamidosporas en +, ++, +++- No se observan elementos micoticos.3.2. Cultivo de hongos:1. Se siembra la muestra en Agar Sabouraud en placa y en tubo.2. Incubacion a 25oC.3. Tiempo de desarrollo: 4 semanas (dermatofitos).4. Luego se realiza un directo de la colonia con azul de metileno: se coloca una gota de azul de metileno en un porta objeto, se toma un trozo de cinta adhesiva se pasa se manera suave por encima de la colonia y despues se coloca sobre la gota de azul de metileno en el porta, se observa al microscopio con objetivo 40 x.Trichophyton rubrum Trichophyton mentagrophytesT. rubrum T. mentagrophytes CRITERIOS DE INTERPRETACION

II. Micosis invasivas o sistémicas1. INTRODUCCIONLas enfermedades fungicas invasivas son entidades cada vez mas frecuentes, dado el aumento de pacientes susceptibles por la utilizacion de farmacos inmunosupresores. Hay que tenerlas en cuenta en el diagnostico diferencial de las infecciones en los pacientes con factores de riesgo y solicitar las pruebas diagnosticas especificas, ya que el diagnostico precoz puede mejorar el pronostico de estas infecciones, de alta mortalidad.2. TIPO DE MUESTRASSangreLiquidos esterilesBiopsias3. TOMA DE MUESTRASExamen: HEMOCULTIVO TRADICIONAL con búsqueda de hongosPreparacionpaciente:AfebrilAntes uso de AntifungicosTecnica derecoleccion:Antisepsia de piel con OH 70%Desinfeccion de tapa con OH 70%Simultaneos, pero distintos sitios puncionMaterial: Frascos de hemocultivo (minimo 2),para adultos o pediatrico según correspondaTransporte: < 2 h, T o AmbienteCantidad: 10 mL adultos, 3-5 mL ninos, 1 mL neonatologia.4. PROCEDIMIENTOSiembra en Medio Sabouraud (tubo) muestras liquidas (LCR, biopsias).Hemocultivo tradicional Tincion de gramRealizar cultivo.III. CandidiasisLas candidiasis constituyen un grupo de infecciones causadas por un hongo oportunista del genero Candida, de los cuales Candida albicans es la mas frecuente. Pueden producir una infeccion clinica en practicamente en cualquier sistema organico. El espectro de infecciones abarca desde la enfermedad mucosa y cutanea superficial hasta la diseminacion hematogena extensa con afectacion de organos diana como el higado, bazo, rinon, corazon y cerebro.En la mujer, la mucosa vaginal tambien constituye un lugar frecuente de infeccion. Se puede transmitir por ropas, objetos y tambien por contacto sexual. Estos hongos estan siempre presentes en la piel y en la mucosa del tracto digestivo, genitourinario y respiratorio de la mayoria de las personas, pero se encuentran controlados por otros microorganismos no patogenos. Cuando se produce un desequilibrio, el aumento desmedido de la poblacion de hongos produce esta u otras micosis.1. Muestra clinicas:Raspados de piel y fanereosSecreciones (heridas, flujo vaginal)Sangre y liquidos esterilesLavado broncoalveolar (LBA)Dispositivos implantables (cateteres, protesis)2. Procesamiento2.1. Microscopia:

Examen directo: Pueden observarse blastoconidias y en algunos casos la presencia deMuestras Sistémicas (Sangre)Directo KOH 20% + Tinta Gram GiemsaTubos de SabouraudCon CAF25 C 35 CHemocultivosImportante observar*. Turbidez*. Gas*. Hemólisis*. Presencia de Colonias

pseudohifas.KOH 20% en muestras clinicas, principalmente procedentes de la piel, fanereos y mucosas.Blastoconidios PseudohifasTinción de Gram2.2. CultivosAgar Sabouraud: siembra primaria. Cuando hay desarrollo de levadura se siembra en otros medios para su identificacion.Agar cromógeno: Permite identificar presuntivamente algunas especies de Candida, pero fundamentalmente identifica C. albicans.Candida albicans Candida krusei 3. TEST DE GUAYACO, TEST DE HEMORRAGIAS OCULTAS3.1 OBJETIVOS: Detectar sangre en deposiciones, lo que apoya al diagnostico de enfermedades tales como: cancer de colon y determinar etiologias de anemia ferropenica de origen indeterminado.3.2 FUNDAMENTO: El “test de sangre oculta en deposicion” se fundamenta en la capacidad de las enzimas catalasa y peroxidasa presentes en la hemoglobina humana que frente al peroxido de hidrogeno oxida un compuesto fenolico incoloro (guayaco) a una estructura quinona provocando asi un viraje en su coloracion. La oxidacion del guayaco produce una coloracion azul. Este test cualitativo es el mas utilizado porque es un metodo rapido, pero tiene el siguiente inconveniente, ademas de detectar hemoglobina humana, detecta hemoglobina no humana, es decir, puede arrojar falsos positivos con la ingesta de determinados alimentos (carnes rojas, visceras, productos con peroxidasas) y fármacos (AINES, hierro), tambien da falsos negativos con el consumo de vitamina C, ahi radica la importancia que tiene la dieta previa.El Kit comercial de hemorragias ocultas que dispone el laboratorio es Hema screen R. Presenta tarjetas donde se hace la reaccion bioquimica, impregnadas con el guayaco, solucion reveladora que contiene peroxido de hidrogeno.3.3 MATERIALES E INSUMOSKit comercial HEMA SCREEN RTimer o reloj.3.4 INSTRUMENTACION O EQUIPOS Y ACCESORIOS: No requiere de equipos o instrumentos.3.5 REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA Y PACIENTELa muestra debe venir identificada con los datos del paciente (nombre, dos apellidos y servicio) con su orden respectiva.Tipo de muestra: Deposicion. Indicaciones de toma de muestra en Manual de Toma de muestras3.6 DESARROLLO DEL PROCESO

Revisar las muestras; que venga con los datos requeridos y condiciones adecuadas.Abrir la caja del Kit Hema screen R y sacar tres sobres para la reaccion de hemorragias ocultas, siempre y cuando sea seriado el examen.La muestra de deposicion se expande en la zona circular que esta en uno de los dos lados del sobre de reaccion.Luego se debe cerrar el sobre de reaccion, de modo que la superficie con la deposicion quede tapada.Al reverso de este sobre se agrega una gota de la solucion reveladora, justo en la zona donde dice Neg – Pos, con el objetivo de controlar la tecnica, agregar otra gota del revelador en la zona para la muestra problema, lo mismo se hace para las otras muestras.Despues de 30 segundos y antes de 2 minutos leer los resultados.Cualquier coloracion azul en la zona para la muestra problema se considera positiva.Si no da la coloracion azul se considera negativa.A veces puede resultar una coloracion verde azulada, la cual tambien se considera positiva.Para validar la tecnica el control positivo debe dar azul y el negativo incoloro despues de los treinta segundos, independientemente del resultado de la muestra problema.3.7 CONTROL DE CALIDAD INTERNO: El control de calidad se realiza en forma simultanea con una muestra problema, esto se realiza agregando gotas de peroxido de hidrogeno en una zona indicada en el sobre de reaccion.3.8 INFORMESe ingresa los resultados en el sistema informatico del laboratorio.Si el resultado es positivo se informa : “Test de Guayaco positivo”Si el resultado es negativo se informa: “Test de Guayaco negativo”3.9 RESPONSABLE DIRECTO: El responsable es el Tecnólogo Medico a cargo del laboratorio de parasitología y química de deposiciones, quien supervisa al técnico paramédico que realiza la técnica.