TEMA 4. NUTRICIÓN Y METABOLISMO

Una característica importante de las células es su capacidad para llevar a cabo reacciones químicas y organizar sus moléculas para formar estructuras específicas. La expresión final de esta organización es el crecimiento (replicación). Antes de que la célula se divida, ocurren diversas reacciones químicas en la ella que se denominan metabolismo:

Reacciones catabólicas: liberan energía. Reacciones anabólicas: consumen energía.

Necesidades nutricionales de los microorganismos

Los elementos esenciales para las células son las macromoléculas (compuestas por unidades más pequeñas que se denominan monómeros) y el agua. Por tanto, la nutrición microbiana consiste en suministrar a las células los ingredientes químicos necesarios para hacer monómeros, los cuales son nutrientes. Los diferentes organismos existentes necesitan diferentes tipos de nutrientes en distintas cantidades y, a veces, los requerimientos son específicos.

Los macronutrientes se precisan en cantidades importantes. Los que se necesitan en cantidad más elevada son C y N. en primer lugar muchas células procariotas necesitan algún tipo de compuesto orgánico como fuente de carbono. No obstante, hay algunas procariotas que son autótrofas, son capaces de construir todas sus estructuras orgánicas a partir del CO2 con la energía obtenida de la luz o de compuestos orgánicos. En peso seco, la célula contiene un 50% de C, lo que demuestra que es el principal elemento de las macromoléculas. El siguiente elemento más abundante es el nitrógeno (alrededor del 12% en seco de la célula), pues es importante en las proteínas, en los ácidos nucleicos, etc. El nitrógeno se puede encontrar como inorgánico u orgánico, pero la mayoría del mismo se encuentra como compuestos inorgánicos (NH3, NO3-, N3). La mayoría de las bacterias utilizan el amoniaco como fuente de nitrógeno y otras muchas pueden usar nitratos.

Otras macromoléculas que se pueden encontrar son:

Fósforo (P): se presenta en la naturaleza en forma de fosfatos inorgánicos y orgánicos. La célula lo necesita para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos.

Azufre (S): es el componente estructural de la cisteína y metionina, además, se presenta en diversas proteínas como la tiamina, la biotina, el ácido lipoico y la coenzima A.

Potasio (K): es requerido específicamente por una gran diversidad de enzimas, como por ejemplo las implicadas en la síntesis de proteínas.

Magnesio (Mg): funciona como estabilizador de los ribosomas, las membranas celulares y los ácidos nucleicos. También se necesita para la actividad de muchas enzimas.

Calcio (Ca): ayuda a estabilizar la pared bacteriana y tiene una función importante en la termorresistencia de las endoesporas.

Sodio (Na): es requerido por algunos microorganismos y no por todos. Su necesidad suele ser un reflejo del hábitat del microorganismo. Por ejemplo, el agua de mar tiene un alto contenido en sodio y los microorganismos marinos normalmente lo requieren para su crecimiento.

Hierro (Fe): es fundamental en la respiración celular y es también un elemento clave para los citocromos y para las proteínas que contienen hierro y azufre implicados en el transporte de electrones.

Por otro lado, se encuentran los micronutrientes, que se encuentran en menor cantidad que los anteriores (pero son igual de importantes); son elementos traza. Se trata de metales (Mo, Mn, Co, Zn, Cu, Ni) y muchos de ellos tienen una función estructural en varias enzimas (los catalizadores de las células). Cuando se cultivan microorganismos en laboratorio, a veces, no es necesario añadirlos a los medios de cultivo. No obstante, si un medio de cultivo contiene sustancias muy puras, disueltas en agua destilada de elevada pureza, puede darse una deficiencia en algún elemento traza, por ello, se debe añadir una pequeña cantidad de una solución de metales traza para suministrar los metales necesarios.

En cuanto a los factores de crecimiento, se trata de compuestos orgánicos que, al igual que los micronutrientes, se necesitan en cantidades muy pequeñas y solo por algunas células. Los factores de crecimiento son vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Aunque la mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, en algunos casos es necesario suministrarlos en el medio de cultivo. Las vitaminas se necesitan con mayor frecuencia.

Medios de cultivo

Se trata de las soluciones que se usan en el laboratorio para el cultivo de los microorganismos. Contienen todos los componentes nutricionales necesarios para soportar el crecimiento de los microorganismos.

Los medios de cultivo deben contener como mínimo:

Fuente de C: glucosa, etc. Fuente de N: sulfato amónico, péptidos, proteínas, etc. Sales minares: sales de Ca, Mg, Fe.

Pero, a veces, pueden incluir elementos traza u oligoelementos, factores de crecimiento y requerimientos especiales.

Tipos de medios de cultivo:

1. Composición a. Sintéticos o definidos: se conoce la formula química y la proporción de los

componentes que entran a forma parte del medio. Por ejemplo:Fuente de C: 2% (2 g de glucosa en 100 g del medio)Fuente de N: 1% (1 g de sulfato amónico en 100 g del medio)Sales (Ca, Mg, fe): 0.1%

b. Complejos: se desconoce la formula química y la proporción de algún c.d. componente. Por ejemplo:

Fuente de C: 2% (2 g de glucosa en 100 g del medio)Fuente de N: 1% (1 g de sulfato amónico en 100 g del medio)Sales (Ca, Mg, fe): 0.1%Adición de levaduras, caseína (proteína de la leche), soja y otras sustancias muy nutritivas que no están definidas químicamente.

2. Consistencia ( a T ambiente)a. Sólido: lleva los componentes nutricionales necesarios y un agente

solidificante. El que se utiliza mundialmente es el agar (polisacárido que se extrae de las algas). Este agente solidificante, en solución acuosa y por encima de 48 oC forma un sólido líquido, mientras que por debajo de esa temperatura, solidifica. El agar es inerte, no es atacable por la mayoría de los microorganismos, de manera que es difícil de degradar.

b. Semisólido: igual que antes pero con una proporción menor de agar. Su consistencia es gelatinosa.

c. Liquido: no contiene agar

Aunque se trate del mismo medio y de las mismas condiciones nutricionales, puede tener distinto estado físico.

3. Relación bacteria – medioa. Permisivos: llevan los compuestos necesarios para permitir el crecimiento de

cualquier tipo de microorganismo.b. Selectivos: en su composición lleva algún componente que inhibe el

crecimiento de algún tipo de microorganismo. Por ejemplo: utilizar un antibiótico para impedir el crecimiento de bacterias Gram (+).

c. Diferenciales: permite diferenciar unos microorganismos de otros en función de la actividad bioquímica o fisiológica.

d. De enriquecimiento: facilita el crecimiento de algunos microorganismos frente a otros. Por ejemplo:Fuente de C: 2% (2 g de glucosa en 100 g del medio)Sales (Ca, Mg, fe): 0.1%

No crece nada porque no hay fuente de N ya que, como se ha dicho anteriormente, la fuente de C, la fuente de N y las sales son componentes mínimos en el medio de cultivo. Sin embargo, hay microorganismos que pueden crecer sin N en el medio ya que lo pueden coger del aire. Se facilita el crecimiento de las bacterias que son capaces de fijar N frente a aquellas que no son capaces.

Catabolismo microbiano

En la primera etapa del catabolismo, las moléculas más grandes de nutrientes (proteínas, polisacáridos y lípidos) son hidrolizadas o descompuestas en sus partes constituyentes. Las reacciones químicas que tienen lugar durante esta etapa no liberan mucha energía. Los aminoácidos, los monosacáridos, los ácidos grasos, el glicerol y otros productos resultantes de esta primera etapa son degradados a una serie de moléculas más sencillas en la segunda etapa, formándose generalmente metabolitos tales como acetilcoenzima A, piruvato y

productos intermedios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El proceso de la segunda etapa puede operar de forma aerobia o anaerobia, y a menudo produce cierta cantidad de ATP así como NADH, FADH2 o ambos. Por último, durante la tercera etapa del catabolismo se incorpora un nutriente carbonado al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, y las moléculas son oxidadas completamente a CO2 con producción de ATP, NADH Y FADH2. El ciclo opera de forma aerobia y es responsable de la liberación de una gran cantidad de energía. Gran parte del ATP derivado del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (y de las reacciones de la segunda etapa) procede de la oxidación del NADH y el FADH2 por la cadena transportadora de electrones. El oxígeno, o a veces otra molécula inorgánica, es el aceptor final de electrones.

Cadena de transporte de electrones

Tiene lugar en la membrana mitocondrial. Durante este paso, los iones de hidrógeno (o un par de electrones) son transportados desde un soporte a otro y, finalmente, se utilizan para reducir el oxígeno a agua. Durante esta transferencia de electrones, se libera gran cantidad de energía que está en la forma de ATP, una rica molécula de energía que se puede llamar la moneda energética de la célula.

Balance energético de la respiración aeróbica

El balance del ATP sintetizado durante la respiración aeróbica a partir de una molécula de glucosa es el siguiente:

El número máximo teórico de ATP que es posible obtener al final de la respiración aeróbica es igual a 38.

Se obtienen 2 ATP por fosforilación a nivel de sustrato durante la glucólisis y 2 GTP por el mismo mecanismo durante el ciclo de Krebs. El GTP es fácilmente convertido en ATP, transfiriendo el grupo fosfato desde este último al GDP.Además, se contabilizan las moléculas de ATP sintetizadas por fosforilación oxidativa acoplada a la cadena respiratoria: 3 ATP por cada NADH y 2 ATP por cada FADH2 que ingresan a la cadena de transporte de electrones.

Sin embargo, en algunos casos, este balance puede verse reducido a 36 ATP. Esta merma obedece a que las coenzimas NADH producto de la glucólisis se generan en el citosol, a diferencia de las demás coenzimas reducidas durante la descarboxilación del piruvato y el ciclo de Krebs, que se encuentran en la matriz mitocondrial. Los electrones del NADH proveniente de la glucólisis deben llegar a la matriz mitocondrial, a fin de que puedan ser entregados a la cadena respiratoria. El pasaje de los electrones a través de ambas membranas mitocondriales se realiza mediante un mecanismo denominado“lanzadera”, en el que los electrones son transferidos a compuestos intermediarios y finalmente a una coenzima ubicada en la matriz de la mitocondria. Existen distintas lanzaderas, según el tipo celular. En un tipo de lanzadera, el aceptor de los electrones en la mitocondria es el NAD+; en otro tipo, el FAD. En el segundo caso, la cantidad de ATP obtenida por fosforilación oxidativa a partir de la glucólisis es de 4 en lugar de 6 ATP, lo que cambia el total de 38 a 36 ATP.

Catabolismo de heterótrofos quimioorganótrofos

Aerobios estrictos: respiración aerobiaDícese del microorganismo al que le es imprescindible el oxígeno libre, ya que su fuente de energía la obtiene de la respiración aeróbica, donde se requiere oxígeno molecular como oxidante terminal. El aceptor final es el O2.

Anaerobios facultativos: respiración aerobia o fermentaciónSon aquellos microorganismos aeróbicos que pueden desarrollarse en ausencia de oxígeno por medio de la fermentación.

Anaerobios: respiración anaerobiaEs un proceso metabólico que consiste en la oxidorreducción de diferentes compuestos. Los electrones liberados son aceptados por moléculas diferentes del oxígeno. Es decir, la respiración anaerobia es un proceso que se desarrolla sin oxígeno.

Bacterias anaerobias facultativas

Usos del piruvato

Respiración anaerobia

En este proceso no se usa oxígeno, sino otra sustancia oxidante distinta como el sulfato o el nitrato. En las bacterias con respiración anaerobia interviene también una cadena transportadora de electrones en la que se reoxidan los coenzimas reducidos durante la oxidación de los substratos nutrientes; es la análoga de la respiración aerobia, ya que se compone de los mismos elementos (citocromos, quinonas, proteínas ferrosulfúricas, etc.). La única diferencia, por lo tanto radica, en que el aceptor último de electrones no es el oxígeno.

Todos los posibles aceptores en la respiración anaeróbica tienen un potencial de reducción menor que el O2, por lo que, partiendo de los mismos sustratos (glucosa, aminoácidos, triglicéridos), se genera menos energía en este metabolismo que en la respiración aerobia convencional.

No hay que confundir la respiración anaeróbica con la fermentación, en la que no existe en absoluto cadena de transporte de electrones, y el aceptor final de electrones es una molécula; estos dos tipos de metabolismo tienen solo en común el no ser dependientes del oxígeno.

En la siguiente tabla se muestran distintos aceptores de electrones, sus productos y algunos ejemplos de microorganismos que realizan tales procesos:

Aceptor Producto final Microorganismo

Nitrato Nitritos, óxidos de nitrógeno y N2

Pseudomonas, Bacillus

Sulfato Sulfuros Desulfovibrio, Clostridium

Azufre Sulfuros Thermoplasma

Tiosulfato Sulfato y sulfuro Thermotogae, Thermoanaerobacteriales

CO2 Metano Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus

Fe3+ Fe2+ Shewanella, Geobacter, Geospirillum, Geovibrio

Mn4+ Mn2+ Shewanella putrefaciens

Selenato Selenito

Arsenato Arsenito Desulfotomaculum

Fumarato Succinato Wolinella succinogenes, Desulfovibrio, E.

coli

DMSO DMS Campylobacter, Escherichia

TMAO TMA

Clorobenzoato

Benzoato Desulfomonile

Utilización de nitrato como aceptor de electrones

Muchas bacterias anaeróbicas contienen las enzimas nitrato-reductasas que catalizan la reducción de nitrato a nitrito:2

NO3- + 2e− + 2H+ → NO2

− + H2O

No obstante, el producto resultante (nitrito) es muy tóxico por lo que algunas especies de Pseudomonas y Bacillus pueden reducir el nitrato más allá del nivel de nitrito, hasta nitrógeno:

2NO3- + 10e− + 12H+ → N2 + 6H2O

El resultado final, nitrógeno, es un gas inerte y no tóxico. Este proceso se conoce como desnitrificación que, si se produce en el suelo se considera perjudicial para la agricultura ya que ocasiona la pérdida de los nitratos, necesarios para el crecimiento de las plantas.

Las bacterias reductoras de nitratos son anaerobias facultativas ya que el uso de nitratos y nitritos como aceptores de electrones son procesos alternativos que pueden utilizar estas bacterias para crecer en ausencia de oxígeno. En presencia de él, aunque el nitrato esté presente, la respiración procede enteramente a través de la cadena aeróbica de transporte de electrones.

Utilización de sulfato como aceptor de electrones

La utilización de sulfato como aceptor de electrones es una habilidad rara, restringida al género Desulfovibrio y algunas especies de Clostridium. Todas estas bacterias son anaeróbicas estrictas, de modo que la reducción del sulfato no es una alternativa de su metabolismo, como lo es la reducción del nitrato. La reacción es la siguiente:

SO42– + 8e– + 8H+ → S2– + 4H2O

Las bacterias reductoras de sulfatos atacan solo unos pocos compuestos orgánicos, siendo el ácido láctico y los ácidos dicarboxílicos de 4 carbonos sus principales substratos.

Utilización de dióxido de carbono como aceptor de electrones

Un pequeño grupo de procariotas anaerobias estrictas, las arqueas productoras de metano, utilizan dióxido de carbono como aceptor de electrones; la reducción da lugar a metano (CH4). El caso más simple es la oxidación de hidrógeno molecular, reacción productora de energía:

4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O

El hidrógeno no es un gas común en la biosfera, de modo que estos microorganismos habitan lugares muy específicos como en sedimentos anaerobios del fondo de lagos y pantanos, o en el tubo digestivo de los rumiantes, donde otros microorganismos producen el H2 libre que precisan.

Utilización de ion férrico como aceptor de electrones

El ion férrico (Fe3+) puede ser utilizado por varias bacterias como aceptor de electrones, reduciéndolo a ion ferroso (Fe2+); este proceso lo realizan muchos de los microorganismos que reducen nitrato. El ion férrico se halla en el suelo y las rocas, muchas veces formando hidróxido férrico (Fe(OH)3) insoluble; en condiciones anaeróbicas, estas bacterias pueden reducirlo al estado ferroso. El ion ferrosos es mucho más soluble que el férrico, con lo cual el hierro se moviliza, siendo este un primer paso importante en la formación de un tipo de depósito mineral llamado hierro de los pantanos.

Alternativas catabólicas

Las células pueden generar energía mediante distintos métodos a la fermentación y a la respiración aeróbica. Estos son la respiración anaeróbica, la quimiolitotrofía y la fototrofía.

Respiración anaeróbicaSe trata de una modificación de la respiración en la que se usan aceptores de electrones diferentes del oxígeno. Los aceptores de electrones utilizados en la respiración anaeróbica son nitratos (NO3-), hierro férrico (Fe3+), sulfatos (SO42-), carbonatos (CO32-) e incluso algunos compuestos orgánicos. Se libera menos energía cuando se usan estos aceptores en vez de oxígeno. Sin embargo, el uso de estos aceptores alternativos permite a los microorganismos respirar en ambientes que carecen de oxígeno.

QuimiolitotrofíaSe utilizan compuestos inorgánicos en vez de orgánicos. Los organismos usan compuestos inorgánicos como donadores de electrones. Entre los donadores inorgánicos están el sulfuro de hidrógeno (H2S), gas hidrógeno (H2), hierro ferroso (Fe2+) y amoniaco (NH3). El metabolismo de los quimiolitotrofos implica normalmente procesos de respiración aeróbica pero que usan una fuente de energía inorgánica en vez de orgánica. Los quimiolitotrofos tienen componentes para el transporte de electrones similares a los de los quimiorganotrofos y originan una fuerza motriz de protones que dirige la síntesis de ATP. La diferencia entre estos es la fuente de C, pues los quimiorganotrofos suelen usar compuestos como la glucosa tanto para la fuente de C como para la de energía, mientras que los quimiolitotrofos suelen usar CO2 como fuente de C y, por tanto, son autótrofos.

Fototrofía Estos microorganismos utilizan la luz como fuente de energía en el proceso llamado fotosíntesis. Finalmente lo que se consigue es la creación de una fuerza motriz de protones que puede ser usada para la síntesis de ATP. La mayoría de los fototrofos usan la energía conservada en el ATP para la asimilación del CO2 como fuente de C, para la biosíntesis y son llamados fotoautótrofos. Sin embargo, algunos fototrofos emplean compuestos orgánicos como fuente de C y la luz como fuente de energía y se denominan fotoherotrofos.

Tipos nutricionales de microorganismos

Heterótrofos quimioorganótrofos:Obtienen energía y carbono de compuestos orgánicos Aceptores de electrones O2 (aerobios) u otros (anaerobios)

Autótrofos quimiolitótrofos:Obtienen energía de compuestos inorgánicosCO2 fuente carbono

Autótrofos fotolitótrofos:Luz fuente de energíaCompuesto orgánico o CO2 como fuente de carbono

TEMA 5. CRECIMIENTO MICROBIANO Y SU CONTROL

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que ocurre es un aumento de la población. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista:

A escala individual A escala poblacional

Fisión binaria

En la mayoría de los procariotas, el crecimiento de una célula individual continua hasta que se divide en dos células nuevas, es decir, se forman dos células a partir de una.

Las células se alargan hasta aproximadamente el doble de la longitud de la célula más pequeña y luego forma un tabique que acaba por separar la célula en dos células hijas. Dicho tabique se conoce como septo y es el resultado del crecimiento hacia dentro de la membrana citoplasmática y la pared celular desde direcciones opuestas hasta que las dos células hijas se separan.

Durante el ciclo de crecimiento, todos los constituyentes celulares aumentan, de modo que cada célula hija recibe un cromosoma completo y suficientes copias de todas las macromoléculas, monómeros e iones inorgánicos, como para existir como célula independiente.

El reparto del DNA replicado entre las dos células hijas depende de la unión del DNA a la membrana durante la división y la segregación real de las dos copias es facilitada por la formación del septo.

El tiempo necesario para completar un ciclo de crecimiento celular (tiempo de generación) en las bacterias es muy variable y depende de varios factores, tanto nutricionales como genéticos.

La bacteria E. coli puede completar un ciclo en 20 min. Hay bacterias que lo pueden hacer más rápidamente pero en general lo hacen más lentamente.

Proteínas Fts y el plano de la división celular

En el proceso de división celular se han identificado varias proteínas esenciales denominadas proteínas Fts (Filamentous temperature sensitive). Describen las propiedades de las células con mutaciones en los genes que las codifican. Estas proteínas están distribuidas universalmente entre procariotas y también se han encontrado en mitocondrias y cloroplastos.

Las proteínas Fts forman en la célula un aparato de división que se llama divisoma, cuya formación comienza con la unión de moléculas de FtsZ formando un anillo alrededor del cilindro celular hacia el centro de la célula. Esta área define el plano de división celular. Las moléculas de FtsZ polimerizan hasta formar un anillo continuo que luego atrae a otras proteínas FtsZ. El divisoma parece dirigir la síntesis de nuevos materiales de membrana y de pared celular en las dos direcciones hasta que la célula alcanza aproximadamente el doble de su longitud original; a continuación ocurre la constricción para formar las dos células hijas.

La replicación del DNA ocurre antes de que se forme el anillo de FtsZ. El cese de la síntesis del DNA parece ser la señal para la formación del anillo, y esta estructura aparece en el espacio situado entre los dos nucleoides duplicados

A medida que progresa la elongación celular, las dos copias del cromosoma se separan y cada uno termina en una célula hija. Cuando ocurre la constricción, el anillo de FtsZ comienza a despolimerizarse y se dispara hacia el interior de esa zona la síntesis de los materiales de la pared celular que llegan a sellar la región de unión de una célula con otra.

Las proteínas Fts constituyen el engranaje clave en la división celular de procariotas.

La proteína MreB es importante ya que, al igual que la pared celular, ayuda a mantener la estructura de algunas bacterias, es decir, determina la forma en procariotas. Si alguna bacteria no tiene este gen, se volvería redonda, es decir, coco, por tanto, las bacterias con forma de coco no necesitan esta proteína. Esta proteína forma bandas filamentosas en espiral en el interior de la célula.

Crecimiento de poblaciones

El crecimiento se define como un aumento en el número de células microbianas de una población; también puede medirse como un incremento de la masa celular. La velocidad de crecimiento es el cambio de número de células o de la masa celular por unidad de tiempo. El intervalo para la formación de dos células a partir de una supone una generación, y el tiempo transcurrido para que esto ocurra se llama tiempo de generación. De modo que, el tiempo de generación es el tiempo que se requiere para que la población se duplique. Durante cada generación, tanto el número de células como la masa celular se duplican. El tiempo de generación depende del tipo de microorganismo, del medio cultivo utilizado y de las condiciones de incubación empleadas.

Se representa un experimento de crecimiento iniciado con una sola célula que tiene un tiempo de generación de 30 min. Este modelo de incremento de la población, en el que en cada periodo fijo de tiempo se duplica el número de células, se denomina crecimiento exponencial. Si se representa aritméticamente el número de células de un experimento en función del tiempo transcurrido, se obtiene una curva cuya pendiente aumenta constantemente, pero de esta forma es difícil obtener información sobre el crecimiento, por ello, si se representa en escala semilogarítmica, se obtiene una línea recta, de manera que las determinaciones son sencillas.

Se representa el método de determinación de los tiempos de generación (g) de poblaciones creciendo exponencialmente. n es el número de generaciones que han ocurrido en el tiempo t.

Una característica del crecimiento exponencial es que la velocidad del aumento del número de células es inicialmente lenta pero incrementa cada vez más con el tiempo, por ello, cuando un producto no estéril se deja en condiciones que permiten el crecimiento microbiano unas cuantas horas, durante las primeras fases del crecimiento exponencial el efecto no es muy relevante, pero al dejarlo durante más horas, el resultado es desastroso para el producto.

La bacteria E. coli se duplica cada 20 min y pesa entre 10-12 g. Si esto lo hace durante 48 h, su peso será de aproximadamente 1025 T, que es 4000 veces la masa de la tierra. Sin embargo, esto no ocurre porque la bacteria crece solo durante una parte de su ciclo vital, pues deja de crecer cuando agote sus nutrientes.

Curva de crecimiento

El método de cultivo más simple es el cultivo discontinuo en el que el microorganismo crece a partir de una limitada cantidad de medio hasta que se agota un nutriente esencial o se acumulan productos tóxicos hasta niveles que inhiben el crecimiento. En un sistema discontinuo el cultivo pasará por una serie de fases:

1. Fase de latencia: se inocula una población microbiana en un medio fresco pero el crecimiento no comienza inmediatamente ya que las células deben adaptarse a las nuevas condiciones ambientales.

2. Fase exponencial: los microorganismos ya se adaptaron al medio, de modo que cada célula se divide para formar dos, comienza a duplicarse de forma exponencial por unidad de tiempo. Generalmente, los microorganismos procarióticos crecen más rápido que los eucarióticos; y los eucariotas más pequeños lo hacen más rápido que los de mayor tamaño.

3. Fase estacionaria: las bacterias no crecen de una forma indefinida sino que sucede algo: un nutriente esencial del medio de cultivo se usa y llega a ser un factor limitante del crecimiento, o bien, se acumulan en el medio algunos productos de desecho hasta niveles inhibitorios que hacen que cese en crecimiento exponencial. En esta fase, no hay aumento ni descenso neto en el número de células. También puede ocurrir que algunas células crecen y otras mueren, de modo que hay un equilibrio y no hay aumento ni disminución en el número de células (crecimiento críptico)

4. Muerte: las células pueden continuar vivas y metabólicamente activas tras la fase estacionaria pero también pueden morir, de modo que disminuye el número de las mismas. En algunos casos, la muerte se acompaña de una lisis celular real. En esta fase, la curva también

es exponencial; no obstante la velocidad en este caso suele ser menor que la velocidad de crecimiento.

Cultivo continuo

El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo que se compone de una cámara de cultivo de volumen constante a la que le llega un suministro de nutrientes y de la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (mediante un rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, es decir, que el número de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, se dice que el sistema está en estado estacionario, con las células creciendo exponencialmente. Las células se encuentran en crecimiento exponencial continuamente ya que no les falta ningún nutriente.

Una de las maneras de lograr un cultivo continuo es mediante el llamado quimiostato, a través del cual se puede controlar de modo independiente la densidad de la población celular y la velocidad de crecimiento del cultivo. La densidad celular en el equilibrio se controla ajustando el factor de dilución (D), mientras que la velocidad de crecimiento se controla variando la concentración del nutriente limitante en la cámara reservorio (SR).

Recuento de bacterias

Procedimiento de recuento microscópico directo utilizando una cámara de tipo Petroff-Hausseur.

Se trata de un método de recuento directo, es decir, se cuenta la muestra con el microscopio. En este caso se utilizan muestras liquidas, por ello se emplea una cámara

de recuento especial que es un porta sobre cuya superficie de vidrio está marcada una rejilla con pequeños cuadrados de área conocida.Es un método rápido pero presenta las siguientes limitaciones:

o No se distinguen las células vivas de las muertaso Las células pequeñas son difíciles de ver y algunas pueden perderse en el

recuentoo En ocasiones, la precisión es difícil.o Se requiere un microscopio especial cuando las muestras no se tiñeno Método no adecuado para suspensiones con baja densidad celularo Las células móviles se deben inmovilizar antes del recuento

Determinación de células viables mediante recuento en placaSe miden únicamente las células vivas, es decir, aquellas que son capaces de dividirse y dar lugar a una descendencia. En este caso, se cuenta el número de células de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio sólido adecuado. Hay dos maneras de realizar un recuento en placa para viables: el método de extensión en placa y el método de vertido en placa. En el método de extensión en placa un cierto volumen de cultivo diluido no superior a 0.1 mL (porque si no el exceso de líquido no se absorbe y origina problemas en el recuento al favorecer la extensión y mezcla de las colonias) se extiende sobre la superficie de una placa con medio solido utilizando un asa estéril de extensión. La placa se incuba después hasta que aparecen las colonias y se cuenta su número. Es importante que la superficie del medio esté seca de modo que el líquido de la muestra se absorba. Por otro lado, en el método del vertido en placa se pipetea un volumen conocido (0.1-1.0 mL) de cultivo en una placa Petri estéril sobre la que se añade el medio con agar fundido y se mezcla todo bien con suaves movimientos de la placa sobre la superficie de la mesa antes de dejar que se solidifique. En este método, el organismo debe ser capaz de resistir la temperatura del agar fundido a 45 oC.

En estos métodos es importante que el número de colonias que aparezcan en las placas no sean demasiado grandes, pues algunas se podrían fusionar dando estimaciones erróneas. Pero tampoco debe ser demasiado bajo para que el cálculo sea estadísticamente significativo.

Determinación de células viables utilizando diluciones seriadas de la muestraPara obtener el número apropiado de colonias se diluye la muestra con un líquido estéril.

Como no se suele saber de antemano el número de células viables, se realiza más de una dilución. Lo más frecuente es realizar diluciones decimales de la muestra.El líquido estéril a utilizar puede ser agua pero una solución salina equilibrada o medio de cultivo suele dar mejor recuperación. El factor de dilución es el inverso de la dilución.Consiste en coger 1 mL de la muestra inicial y añadirlo a un tubo que contiene 9 mL de líquido de medio de cultivo. A continuación, se coge 1 mL de este tubo y se añade a otro que

contiene 9 mL de líquido de medio de cultivo. Y así, sucesivamente. Cuando se han hecho todas las diluciones, se coge una cantidad de cada tubo y se añade a una placa Petri distribuyéndola por toda ella. Cada una de las placas se incuba y, en el caso de E. coli, se hace a 37 oC durante 24 h (condiciones óptimas).Una célula bacteriana da lugar a una colonia. Conforme se va diluyendo se tienen situaciones en las que se observan células aisladas de otras y dan lugar a colonias visibles.La ventaja de este método es que solo cuantifica las células vivas. Además, es el método habitual del recuento de bacterias.

Crecimiento en micelio

Es importante porque la mayoría de los antibióticos son producidos por Streptomyces.

Medida turbidimétrica del crecimiento

Una suspensión celular aparece turbia a la vista porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Cuantas más células estén presentes mayor será la luz dispersada y, por tanto, mayor la turbidez. La turbidez puede medirse con un fotómetro o espectrofotómetro que hacen pasar la luz a través de suspensiones celulares y detectan la cantidad de luz emergente no dispersada. La diferencia entre estos dos instrumentos es que un fotómetro utiliza un filtro simple para generar luz incidente de longitud de onda relativamente corta, mientras que un espectrofotómetro emplea un prisma o red de difracción para generar luz incidente en una banda muy estrecha de longitudes de onda. Las longitudes de onda más utilizadas para medir la turbidez son 540 nm (verde), 600 nm (naranja) y 660 nm (rojo).

Se realizan las medidas de turbidez mediante un fotómetro o mediante un espectrofotómetro. La célula fotoeléctrica mide la luz incidente no dispersada por las células en suspensión y da lecturas de densidad óptica o unidades fotométricas.

Para obtener la curva estándar se relaciona alguna medida directa del número de células (microscópica o recuento de viables) o de la masa (peso seco) con la medida indirecta obtenida por turbidez. Esta curva de calibración puede contener datos del número de células o de la masa celular, permitiendo la estimación de estos parámetros a partir de una simple lectura de la turbidez.

Factores que influyen en el crecimiento de las bacterias

Temperatura Es un factor importante. A temperaturas muy altas o muy bajas los microorganismos no crecerán.A medida que se eleva la temperatura, las reacciones químicas y enzimáticas de la célula son más rápidas y el crecimiento se acelera. Sin embargo, por encima de una cierta temperatura algunas proteínas particulares pueden sufrir daños irreversibles. En consecuencia, dentro de un cierto margen, un aumento de temperatura supone un incremento en el crecimiento y en el metabolismo hasta un punto en que tienen lugar

las reacciones de inactivación. Por encima de este punto, las reacciones celulares caen rápidamente a cero.

Entonces, para cada organismo existe una temperatura mínima (por debajo de ella no es posible el crecimiento), una temperatura optima (a la que se produce el crecimiento más rápido) y una temperatura máxima (por encima de la cual no es posible el crecimiento). Estas tres temperaturas se denominan cardinales y dependen de cada tipo de organismo y de los factores de

al ambiente como la composición del medio.

Cabe destacar que la temperatura óptima siempre está más cerca de la máxima que de la mínima.En función de estos puntos cardinales, las bacterias se clasifican:

o Psicrófilos. Son bacterias amantes del frío y se encuentran en los polos, de manera que las temperaturas óptimas son bajas.

o Mesófilos. Se trata de bacterias amantes de lo medio, de manera que las temperaturas óptimas son moderadas. Se encuentran en animales de sangre caliente y en medios acuáticos y terrestres de latitudes templadas y tropicales.

o Termófilos. Son bacterias amantes de la temperatura y las temperaturas óptimas son altas. Se trata de enzimas muy resistentes al calor.

o Hipertermófilos. Son bacterias amantes de las temperaturas elevadas y las temperaturas óptimas son muy elevadas. Se encuentran en fuentes termales, géisers y fuentes hidrotermales submarinas.

pHCada organismo tiene un rango de pH dentro del cual es posible el crecimiento y normalmente posee un pH óptimo bien definido. Existen dos agrupaciones:

o Acidófilos. Se trata de organismos que crecen mejor a bajo pH. Los hongos son más acidofilos que las bacterias. También existen bacterias que son acidófilas estrictas incapaces de crecer a pH neutro.Cuando el pH es neutro, la membrana citoplasmática de las bacterias muy acidófilas se disuelve y las células se lisan, por ello, para que dicha membrana sea estable, se requieren elevadas concentraciones de iones hidrógeno.

o Alcalófilos. Se trata de organismos que presentan un pH óptimo de crecimiento muy elevado. Generalmente se encuentran en hábitat muy básicos como lagos sódicos y suelos muy carbonatados.

Algunos microorganismos pueden vivir a pH muy alto o muy bajo. El pH intracelular está próximo a la neutralidad.

Concentración salinaLos microorganismos se agrupan en distintos grupos en función de este parámetro:

o No halófilos. Estos microorganismos apenas aguantan la presencia de sal, de modo que cuando no pueden soportar más cantidad de sal, dejan de crecer.

o Halotolerantes. Toleran la sal hasta un 6%. El agua de mar contiene un 3%.o Halófilos. Son amantes de la sal y la aguantan hasta un 15% aproximadamente.

Discretos: 1 – 6% Moderados: 6 – 15%

o Halófilos extremos. Son microorganismos que crecen en ambientes muy salinos por encima del 15% NaCl, por debajo de este valor no crecen. Estos se encuentran normalmente en las salinas. Para su crecimiento óptimo se requiere 15 – 30% de NaCl.

Muchas bacterias constan de solutos compatibles de tipo polimérico que ellas sintetizan o degradan para aumentar o disminuir la presión osmótica interior con respecto a la exterior para equilibrar el interior y el exterior. No alteran el metabolismo. La mayoría son carbohidratos como sacarosa, trealosa, etc.

Relación de los microorganismos con O2

Hay microorganismos que viven en presencia de oxígeno y otros que viven en ausencia del mismo. El oxígeno es poco soluble en agua y puede consumirse rápidamente debido a las actividades respiratorias de los microorganismos en los hábitat acuáticos y húmedos (especialmente cuando contienen abundancia de materia orgánica). Por ello, existen en el planeta abundantes hábitat microbianos anóxicos (libres de O 2), como los fangos y otros sedimentos, pantanos y ciénagas, suelos forestales inundados y muchos otros ambientes. En estos hábitat anóxicos proliferan microorganismos, particularmente procarióticos. Los microorganismos son muy variados en cuanto a la necesidad o tolerancia de oxígeno:

o Aerobios. Crecen en presencia de oxígeno en concentraciones normales (21% del aire) o en concentraciones más elevadas.

o Microaerófilos. Se trata de aerobios que pueden usar el O2 solo cuando está presente a niveles más bajos que el aire, debido a su limitada capacidad para respirar o a causa de que existe alguna molécula sensible al oxígeno, por ejemplo alguna enzima lábil.

o Aerobios facultativos. Pueden crecer tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas.

o Anaerobios. No pueden respirar O2. Anaerobios aerotolerantes. Toleran el oxígeno y crecen en su

presencia aunque no pueden usarlo. Anaerobios estrictos. Son inhibidos o incluso mueren en presencia de

oxígeno, lo que puede ser debido a que son incapaces de eliminar algunos productos tóxicos que se originan en el metabolismo del oxígeno.

Para el crecimiento de muchos microorganismos aeróbicos es necesario suministrar una fuerte aireación. Esto se debe a que el O2 es poco soluble en agua y el utilizado por los organismos durante el crecimiento no se reemplaza lo suficientemente rápido por difusión a partir del aire. Por tanto, es deseable la aireación forzada de los cultivos, bien sea por agitación de los matraces o tubos o mediante burbujeo de aire esterilizado a través del medio mediante un tubo fino de vidrio o un disco poroso. Normalmente, los aerobios crecen mejor con aireación forzada que cuando se suministra O2 por simple difusión.

Formas tóxicos del oxígeno

Se trata de la reducción del O2

por la adición secuencial de cuatro electrones. Los intermediarios que se forman son reactivos y tóxicos para la célula.

A partir de la reducción de O2 a H2O, se producen productos laterales que son formas altamente tóxicas como el anión superóxido (O2

-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH·). El superóxido es muy reactivo y puede oxidar prácticamente cualquier compuesto orgánico de la célula, como las macromoléculas. Los peróxidos pueden dañar los componentes celulares, pero generalmente no son tan tóxicos para la célula como el anión superóxido o los radicales hidroxilo. Estos últimos son los más reactivos de todas las especies tóxicas del oxígeno y pueden oxidar instantáneamente cualquier sustancia orgánica de la célula.

A partir del H2O2 se forman pequeñas cantidades de OH·, pero como los peróxidos no se acumulan en la célula, esta fuente de radicales hidroxilo prácticamente se elimina.

Enzimas que destruyen formas tóxicas de oxígeno

Las catalasas y las peroxidasas atacan al peróxido de hidrógeno; el segundo difiere del primero porque requiere un reductor, normalmente NADH, para originar H2O como producto. Las superóxido dismutasas son proteínas que contienen metales, fundamentalmente cobre y zinc, manganeso o hierro. La función conjunta de la superóxido dismutasa y de la catalasa puede convertir el superóxido en oxígeno. La superóxido reductasa cataliza la reducción por un electrón de O2 a H2O2 utilizando citocromo C reducido como donador de electrones.

Método de ensayo de la presencia de catalasa en un cultivo microbiano. Un asa de cultivo cargada con células recogidas de la superficie de un cultivo sólido se mezcla con

una gota de agua oxigenada al 30% sobre un portaobjetos. La inmediata aparición de burbujas indica la presencia de catalasa.

Las burbujas proceden del O2 generado en la reacción:

H2O2 + H2O2 →2 H2O + O2

Crecimiento de microorganismos frente al oxigeno

(a) Aerobio estricto. Este tipo de microorganismo está en contacto con el aire y solo crecen en la superficie, por eso penetra sólo una corta distancia en el tubo.

(b) Anaerobio. Son sensibles al oxígeno, sólo crecen lejos de la superficie ya que no están en contacto con el aire.

(c) Aerobio facultativo. Crecen tanto en presencia como en ausencia de oxígeno y por ello, crecen por todo el tubo.

(d) Microaerófilos. Crecen en la zona próxima al O2 pero no en contacto directo.

(e) Anaerobios aerotolerantes. Crecen por todo el tubo ya que el O2 no les importa.

Control del crecimiento microbiano

El control puede efectuarse limitando el crecimiento de los microorganismos, proceso llamado inhibición; o destruyendo los organismos por esterilización, muerte o eliminación de todos los organismos viables de un medio de cultivo. Los agentes que destruyen o matan las bacterias son bactericidas.

Si se desea esterilizar una población microbiana, se tardará más a bajas temperaturas que a temperaturas elevadas. Por tanto es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para conseguir la esterilización para cada serie especifica de condiciones. El tipo de calor también es importante: el calor húmedo tiene mayor poder de penetración que el calor seco y produce una reproducción más rápida del número de organismos vivos a una temperatura determinada.

El tiempo requerido para reducir 10 veces la densidad de población a una determinada temperatura, se denomina tiempo de reducción decimal. En el margen habitual de temperaturas usado en la preparación de alimentos, la relación entre el tiempo de reducción decimal y la temperatura es exponencial, entonces cuando se representa el logaritmo del tiempo frente a la temperatura se obtiene una línea recta. La pendiente de la recta proporciona una medida de la sensibilidad del organismo al calor en las condiciones empleadas y la gráfica puede usarse para calcular los tiempo del proceso para conseguir la esterilización.

El tiempo de muerte térmica es el tiempo que se necesita para matar todas las células a una temperatura determinada. Esto se hace simplemente calentando las muestras de una suspensión celular durante diferentes periodos de tiempo, mezclando las suspensiones calentadas con medio de cultivo e incubando. Si todas as células están muertas, no se observa crecimiento en las muestras incubadas.

Tipos de esterilización

Esterilización por calor seco. Es un proceso que se utiliza para esterilizar materiales y utensilios, de manera que se someten a 180 oC durante dos horas en un horno Pasteur y, así, se produce la muerte celular.

Esterilización por calor húmedo. Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, tampones, etc. Se realiza en un autoclave que es un dispositivo sellado que permite la entrada de vapor de agua bajo presión. El procedimiento consiste en aumentar la presión por encima de la atmosférica (1.1kg/cm2) y así alcanzar una temperatura de 121 oC. A esta temperatura el tiempo de esterilización es de 10 a 15 min.

Filtración. Hay materiales que pueden ser desnaturalizados a altas temperaturas, por ello se utiliza este proceso. Un filtro es un dispositivo con poros demasiado pequeños para que pasen los microorganismos pero suficientemente grandes para permitir el paso de un líquido o un gas.

Radiaciones. Se utiliza principalmente para esterilizar y descontaminar suministros médicos (suministros quirúrgicos, materiales de laboratorio de un solo uso, medicamentos e injertos de tejidos) y en la industria de alimentos durante cortos periodos de tiempo. Los dos isótopos radiactivos más empleados son 160Co y 137Cs; son relativamente baratos producidos por fisión nuclear.

Compuestos químicos: óxido de etileno. Se utilizan para esterilizar algunos componentes de tipo quirúrgico así como materiales termosensibles de laboratorio como material plástico.

Control químico del crecimiento

Un agente antimicrobiano es un compuesto químico, natural o sintético, que mata o inhibe el crecimiento de los microorganismos. Puede actuar de tres maneras:

Bacteriostático. Agente que inhibe el crecimiento pero las células no mueren.

Bactericida. Agente que mata las células pero no dan lugar a la lisis o rotura de ellas.

Bacteriolítico. Agente que provoca la muerte celular por lisis, la rotura celular se detecta por un descenso en número de células o en la turbidez, tras añadir el agente.

Desinfectante y antiséptico

Un desinfectante es un compuesto químico capaz de matar las formas vegetativas de los microorganismos pero no necesariamente las esporas (la esterilización mata también a las esporas). Un desinfectante mata microorganismos y se usa en objetos inanimados.

Por otro lado, los antisépticos son agentes químicos que pueden ser utilizados tópicamente, es decir, sobre la piel; por tanto, un desinfectante que puede ser utilizado sobre la piel. Un antiséptico mata o inhibe el crecimiento de los microorganismos y pueden aplicarse sobre tejidos vivos dada su escasa toxicidad para ellos.

Agentes quimioterapéuticos

Son compuestos químicos que pueden utilizarse por vía interna para controlar el crecimiento de microorganismos y así, controlarse las enfermedades infecciosas. Características:

Selectividad. Capacidad de inhibir las bacterias u otros agentes patógenos sin afectar al hospedador, es decir, atacar específicamente al microorganismo que se desea eliminar y que no tenga ningún efecto sobre nuestras células.

Carencia de toxicidad. Es decir, que no tenga efectos secundarios aunque todos lo tienen de manera que hay que hacer un equilibrio entre el daño que produciría el agente y el daño que tiene el paciente.

Los agentes quimioterapéuticos se agrupan en dos categorías generales:

Agentes sintéticos. Se obtienen mediante síntesis química. Antibióticos. Se producen debido a un microorganismo que actúa frente a otros. Semisintéticos. Parte de la molécula es natural y otra parte es modificada por síntesis

química.

Mecanismo de acción de los agentes quimioterapéuticos

Algunos antibióticos únicamente actúan en una determinada parte de las células:

Cuantificación de la actividad antimicrobiana

La actividad antimicrobiana se mide determinando la cantidad más pequeña que se necesita de un agente para inhibir el crecimiento de un organismo control, valor llamado concentración mínima inhibitoria (CMI). Para determinar este parámetro, se prepara una serie de tubos de cultivo, cada uno conteniendo un medio con una concentración diferente del agente, y después se inocula la serie de tubos. Tras la incubación, se observa si ha habido crecimiento (turbidez) en los tubos. El tubo que contiene la menor concentración de agente que inhibe completamente el crecimiento del organismo usado como referencia define la CMI.

Evaluación de un antibiótico mediante el método de dilución en tubo, que permite determinar la CMI. Se prepara una serie de tubos con concentraciones crecientes del antibiótico en el medio de cultivo; se inoculan todos los tubos y se incuban. El crecimiento (turbidez) tiene lugar en los tubos con concentraciones del antibiótico inferiores a la CMI.

Otro procedimiento comúnmente utilizado en el estudio de la acción antimicrobiana es el método de difusión en agar.

Se prepara una placa Petri con un medio con agar inoculado uniformemente (en césped) con el microorganismo a ensayar. Cantidades conocidas del agente antimicrobiano se añaden a discos de papel de filtro que se colocan en la superficie del agar. Durante la incubación, el agente difunde desde el papel de filtro al agar; la concentración del agente disminuye a medida que aumenta la distancia al papel de filtro. A una determinada distancia del disco se alcanza la CMI. A partir de ese punto hay crecimiento, pero en las proximidades del disco no lo hay. Se crea entonces una zona de inhibición; el diámetro de la zona es proporcional a la cantidad de antimicrobiano añadido al disco, la solubilidad del agente, el coeficiente de difusión y la eficacia del agente.

Este método se utiliza normalmente para ensayar la sensibilidad a los antibióticos en patógenos.